BR102015017256A2 - COMPOSITION OF LIGNOCELLULOLYTIC ENZYMES, ENZYMATIC CONVERSION METHOD AND EXPRESSION VECTOR OF A SUPEROXIDE DISMUTASE - Google Patents
COMPOSITION OF LIGNOCELLULOLYTIC ENZYMES, ENZYMATIC CONVERSION METHOD AND EXPRESSION VECTOR OF A SUPEROXIDE DISMUTASE Download PDFInfo
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Abstract
a presente invenção se refere a uma composição de enzimas lignocelulolíticas que compreende uma superóxido dismutase, a um método de conversão enzimática de material lignocelulósico com dita composição e a urn vetor de expressão da referida superóxido disrnutase. a presente invenção tern aplicação nos processos de aproveitamento do material lignocelulósico, tais corno na produção de etanol de segunda geração ou de outros subprodutos de alto valor agregado.The present invention relates to a lignocellulolytic enzyme composition comprising a superoxide dismutase, a method of enzymatic conversion of lignocellulosic material with said composition and an expression vector of said superoxide disnutrition. The present invention has application in processes of utilization of lignocellulosic material, such as in the production of second generation ethanol or other high added value byproducts.
Description
COMPOSIÇÃO DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS, MÉTODO DE CONVERSÃO ENZIMÁTICA E VETOR DE EXPRESSÃO DE UMA SUPERÓXIDO DISMUTASECOMPOSITION OF LIGNOCELLULYTIC ENZYMES, ENZYMATIC CONVERSION METHOD AND EXPRESSION VECTOR OF A SUPEROXIDE DISMUTASE
CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF INVENTION
[001] A presente invenção refere-se a uma composição enzimas lignocelulolíticas, a um método de conversão enzimática e a um vetor de expressão de uma superóxido dismutase. Mais especificamente, a presente invenção se refere a uma composição de enzimas lignocelulolíticas que compreende uma superóxido dismutase, um método de conversão enzimática de material lignocelulósico com dita composição e a um vetor de expressão da referida superóxido dismutase.The present invention relates to a lignocellulolytic enzyme composition, an enzyme conversion method and an expression vector of a superoxide dismutase. More specifically, the present invention relates to a lignocellulolytic enzyme composition comprising a superoxide dismutase, a method of enzymatic conversion of lignocellulosic material with said composition and an expression vector of said superoxide dismutase.
[002] A presente invenção tem aplicação nos processos de aproveitamento e conversão de materiais lignocelulósicos para a produção de etanol de segunda geração ou de outros subprodutos de alto valor agregado.[002] The present invention has application in the processes of recovery and conversion of lignocellulosic materials for the production of second generation ethanol or other high added value byproducts.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICATECHNICAL BACKGROUNDS
[003] Os materiais lignocelulósicos são compostos basicamente por cadeias de celulose (polissacarídeo formado por unidades de glicose ligadas através de ligações β-l,4-glicosídicas), recobertas por hemiceluloses (polissacarídeos ramificados formados principalmente por D-xilose, com pequenas quantidades de L-arabinose, D-glicose, D-manose, D-galactose, ácido glucurônico e ácido manurônico) e ligninas (redes poliméricas formadas por unidades fenilpropano interligadas).Lignocellulosic materials are basically composed of cellulose chains (polysaccharide formed by glucose units linked through β-1,4-glycosidic bonds), covered by hemicelluloses (branched polysaccharides formed mainly by D-xylose, with small amounts of L-arabinose, D-glucose, D-mannose, D-galactose, glucuronic acid and manuronic acid) and lignins (polymeric networks formed by interconnected phenylpropane units).
[004] Nos processos de aproveitamento da biomassa vegetal, realiza-se uma etapa de pré-tratamento com o objetivo de desestruturar o complexo lignina e/ou hemicelulose. Após o pré-tratamento, as cadeias de celulose e de hemicelulose tornam-se mais suscetíveis aos efeitos da hidrólise, sendo convertidas em um licor rico em açúcares monoméricos que podem, posteriormente, passar por uma etapa de fermentação microbiana a etanol e a outros subprodutos de alto valor agregado.In the processes of harnessing the vegetal biomass, a pretreatment stage is carried out with the objective of destroying the lignin and / or hemicellulose complex. After pretreatment, the cellulose and hemicellulose chains become more susceptible to the effects of hydrolysis and are converted to a liqueur rich in monomeric sugars which may subsequently undergo a microbial fermentation step with ethanol and other byproducts. high added value.
[005] Os processos de hidrólise podem ser catalisados por ácido ou por enzimas. No caso da hidrólise catalisada por ácido, seu ambiente corrosivo demanda o uso de reatores construídos com materiais especiais. Além disso, produtos de degradação como fragmentos de lignina, furfural e ácido acético, atuam como inibidores da fermentação microbiana e devem ser removidos previamente a essa etapa. Desta forma, o processo torna-se oneroso não só do ponto de vista econômico, mas também do ponto de vista técnico, dada a necessidade de um maior tempo de operação e uma possível redução de rendimento de produto final em virtude das etapas adicionais de operação. Com isso, a viabilização dos processos de hidrólise catalisada por ácidos torna-se mais difícil do ponto de vista da prática industrial.Hydrolysis processes may be catalyzed by acid or enzymes. In the case of acid catalysed hydrolysis, its corrosive environment demands the use of reactors built with special materials. In addition, degradation products such as lignin, furfural and acetic acid fragments act as inhibitors of microbial fermentation and must be removed prior to this step. Thus, the process becomes costly not only economically but also technically, given the need for longer uptime and possible reduction of end product throughput due to additional operating steps . Thus, the viability of acid-catalyzed hydrolysis processes becomes more difficult from the point of view of industrial practice.
[006] Em relação à hidrólise catalisada por ácidos, a hidrólise enzimática apresenta as vantagens de não necessitar do uso de materiais anticorrosivos e de não promover a formação de compostos inibitórios da fermentação microbiana. No entanto, como os materiais lignocelulósicos são de composição extremamente complexa, é necessária uma grande variedade de enzimas lignocelulolíticas para uma quebra efetiva dos diferentes polissacarideos em açúcares monoméricos.In relation to acid catalyzed hydrolysis, enzymatic hydrolysis has the advantages of not requiring the use of anti-corrosive materials and not promoting the formation of microbial fermentation inhibiting compounds. However, since lignocellulosic materials are extremely complex in composition, a wide variety of lignocellulolytic enzymes are required for effective breakdown of different polysaccharides into monomeric sugars.
[007] Na procura por composições enzimáticas cada vez mais eficientes, bactérias e fungos decompositores da madeira figuram como boas fontes de enzimas lignocelulósicas. Como exemplo, o documento US20130337508, de 29/05/2013, que trata-se de um método de hidrólise de material lignocelulósico com uma composição compreendendo todas as celulases do fungo Trichodermã reesei suplementada com uma beta-glicosidase.In the search for increasingly efficient enzyme compositions, wood-decomposing bacteria and fungi are good sources of lignocellulosic enzymes. As an example, US20130337508 of 05/29/2013, which is a method of hydrolysis of lignocellulosic material with a composition comprising all Trichoderma reesei fungal cellulases supplemented with a beta-glycosidase.
[008] Os cupins, insetos da ordem Isoptera, também são tidos como boas fontes de enzimas lignocelulósicas por se alimentarem de todo tipo de materiais que contenham celulose, uma vez que o digestoma dos cupins pode degradar até 90% do material lignocelulósico ingerido. O documento WO2013126230, de 11/02/2013, apresenta um sistema para gerar um produto fermentescivel a partir de material vegetal lignificado, em que dito sistema apresenta uma série de enzimas compreendendo, ao menos, duas enzimas cooperativas. Estas enzimas são obtidas a partir do cupim Reticulitermes flavipes e de protozoários ditos simbiontes intestinais. Ainda nesta mesma linha, o documento W02010117843, depositado em 31/03/2010, visa à proteção de um método de conversão de um material vegetal lignificado a um produto fermentescivel compreendendo as etapas de (i) obtenção de uma série de polipeptideos isolados de um cupim e (ii) incubação da série de polipeptideos com o material vegetal lignificado para a produção do produto fermentescivel.Termites, insects of the order Isoptera, are also considered to be good sources of lignocellulosic enzymes because they feed on all types of cellulose-containing materials, as termite digestoma can degrade up to 90% of ingested lignocellulosic material. WO2013126230 of 02/11/2013 discloses a system for generating a fermentable product from lignified plant material, wherein said system comprises a series of enzymes comprising at least two cooperative enzymes. These enzymes are obtained from the termite Reticulitermes flavipes and from protozoa called intestinal symbionts. Along the same lines, document W02010117843, filed March 31, 2010, aims at protecting a method of converting a lignified plant material to a fermentable product comprising the steps of (i) obtaining a series of polypeptides isolated from a termites and (ii) incubation of the polypeptide series with lignified plant material for the production of the fermentable product.
[009] É fato que bactérias, fungos e cupins produzem complexos enzimáticos relativamente completos, porém nem sempre todas as atividades necessárias estão presentes nestes complexos para efeitos de degradação do material lignocelulósico com a finalidade de aproveitamento industrial, o que pode levar à necessidade de suas suplementações com outras enzimas e/ou substâncias com atividades complementares. Nesta complementação, a resistência a temperaturas superiores à ambiente e a manutenção da atividade durante o maior período possível do processo de hidrólise são características fundamentais para a incorporação de novas enzimas no processo atual, de forma a gerar avanços técnicos na eficiência de catálise.It is a fact that bacteria, fungi and termites produce relatively complete enzyme complexes, but not always all the necessary activities are present in these complexes for the purpose of degradation of lignocellulosic material for the purpose of industrial use, which may lead to the need for their use. supplements with other enzymes and / or substances with complementary activities. In this complementation, the resistance to temperatures above ambient and the maintenance of the activity during the longest possible period of the hydrolysis process are fundamental characteristics for the incorporation of new enzymes in the current process, in order to generate technical advances in catalysis efficiency.
[0010] As composições enzimáticas atualmente disponíveis apresentam, em geral, enzimas responsáveis pela degradação da cadeia principal (celulases e/ou hemicelulases) e, opcionalmente, enzimas com atividade auxiliar que, por exemplo, removam grupos laterais.Currently available enzyme compositions generally contain enzymes responsible for main chain degradation (cellulases and / or hemicellulases) and optionally enzymes with auxiliary activity which, for example, remove side groups.
[0011] Aguiar e Ferraz (Quim. Nova, Vol. 34, No. 10, 1729-1738, 2011) descrevem que, dentre as hemicelulases, as xilanases rompem ligações entre unidades monoméricas de xilose, enquanto as mananases atuam sobre ligações entre moléculas de manose, respectivamente. Outras enzimas importantes são as a-glicuronidases e acetil-esterases, que atuam sobre ligações de ácidos urônicos e grupos acetila com moléculas de açúcares, respectivamente.Aguiar and Ferraz (Quim. Nova, Vol. 34, No. 10, 1729-1738, 2011) describe that among hemicellulases, xylanases break bonds between monomeric xylose units, while mannanases act on bonds between molecules. of mannose, respectively. Other important enzymes are α-glucuronidases and acetyl esterases, which act on bonds of uronic acids and acetyl groups with sugar molecules, respectively.
[0012] Com relação às celulases, as celobiohidrolases e as endoglucanases atuam na liberação de moléculas de celobiose e celo-oligossacarídeos de tamanhos variados respectivamente. As beta-glicosidases, que hidrolisam celo-oligossacarideos a glicose, formam um grupo finalizador da hidrólise. Ainda dentro das composições, enzimas que realizam reações de oxido-redução, como a celobiose-desidrogenase, possuem o papel de oxidar vários açúcares. Canella et al. (Biotechnology for Biofuels 2012, 5:26 doi:10.1186/1754-6834-5-26) descrevem que enzimas oxidantes tais como AA9 aumentam o rendimento global de preparações de enzimas hidroliticas. Segundo os autores, a recente descoberta de proteínas acessórias aumentou a eficiência econômica e técnica de processamento de celulose em bioetanol.With respect to cellulases, cellobiohydrolases and endoglucanases act on the release of cellobiose and celloligosaccharide molecules of varying sizes respectively. Beta-glycosidases, which hydrolyze celloligosaccharides to glucose, form a hydrolysis terminator group. Also within the compositions, enzymes that perform oxido-reduction reactions, such as cellobiose dehydrogenase, have the role of oxidizing various sugars. Canella et al. (Biotechnology for Biofuels 2012, 5:26 doi: 10.1186 / 1754-6834-5-26) describe that oxidizing enzymes such as AA9 increase the overall yield of hydrolytic enzyme preparations. According to the authors, the recent discovery of accessory proteins increased the economic and technical efficiency of cellulose processing in bioethanol.
[0013] Como aceptor de elétrons, para fechar o seu ciclo catalítico, a celobiose-desidrogenase pode utilizar quinonas, citocromos, radicais orgânicos, O2 molecular, íons Fe3+ e Cu2+. Ao reduzir Fe3+ a Fe2+, a celobiose-desidrogenase pode gerar radicais hidroxila via reação de Fenton, os quais podem despolimerizar polissacarídeos e modificar a estrutura da lignina. A própria celobiose-desidrogenase ou outras enzimas oxidativas geram o H2O2 envolvido na reação.As an electron acceptor, to close its catalytic cycle, cellobiose dehydrogenase may use quinones, cytochromes, organic radicals, molecular O2, Fe3 + and Cu2 + ions. By reducing Fe3 + to Fe2 +, cellobiose dehydrogenase can generate hydroxyl radicals via the Fenton reaction, which can depolymerize polysaccharides and modify lignin structure. Cellobiose dehydrogenase itself or other oxidative enzymes generate the H2O2 involved in the reaction.
[0014] Estratégias de oxido-redução para promover o aumento da hidrólise do material lignocelulósico são encontradas no estado da técnica. Estas estratégias estão relacionadas ao emprego de agentes redcx químicos (íons metálicos), enzimáticos (oxirredutases), ou ambos. O documento WO201219151, de 05/08/2011, apresenta um método de degradação de um polissacarídeo, preferencialmente celulose ou quitina, caracterizado por compreender o contato do polissacarideo com uma ou mais enzimas óxido-hidroliticas na presença de pelo menos um agente redutor e um ion metálico divalente adicionados ao meio reacional. Já o documento US20030186036, de 05/02/2003, visa à proteção de um método não enzimático de oxidação de um material lignocelulósico usando radicais hidroxila formados via reação de Fenton. Este método envolve a geração de espécies reativas de oxigênio pelo contato de um quelante redox com um oxidante que contenha oxigênio e um metal de transição, preferencialmente ferro ou cobre. Uma desvantagem nestes tipos de metodologias é o fato de que pode haver a necessidade de tratamento dos resíduos gerados antes do descarte devido à presença dos agentes redox químicos, que podem ocasionar um risco ambiental quando não descartados corretamente.Oxide-reduction strategies to promote increased hydrolysis of lignocellulosic material are found in the state of the art. These strategies are related to the use of chemical reductants (metal ions), enzymatic agents (oxirreductases), or both. WO201219151, of 05/08/2011, discloses a method of degradation of a polysaccharide, preferably cellulose or chitin, comprising contacting the polysaccharide with one or more oxide hydrolytic enzymes in the presence of at least one reducing agent and one divalent metal ion added to the reaction medium. US20030186036, dated 02/05/2003, aims to protect a non-enzymatic method of oxidation of a lignocellulosic material using hydroxyl radicals formed via the Fenton reaction. This method involves the generation of reactive oxygen species by contacting a redox chelator with an oxygen-containing oxidant and a transition metal, preferably iron or copper. A disadvantage of these types of methodologies is the fact that there may be a need to treat waste generated prior to disposal due to the presence of chemical redox agents, which may cause an environmental hazard when not disposed of properly.
[0015] Em uma abordagem puramente enzimática, o documento WO201268236, de 16/11/2011, apresenta uma gama de enzimas oxi-redutases fúngicas, um método de degradação de material lignocelulósico com ditas oxi-redutases e composições genéricas que as compreendem. É sabido, no entanto, que nem sempre as enzimas atuam de forma sinérgica: em alguns casos, a adição de uma nova enzima a uma composição estabelecida pode, inclusive, reduzir a atividade inicial da composição, o que não é vantajoso do ponto de vista da eficiência degradação do material lignocelulósico.In a purely enzymatic approach, WO201268236, 11/16/2011, discloses a range of fungal oxy reductase enzymes, a method of degradation of lignocellulosic material with said oxy reductase and generic compositions comprising them. It is known, however, that enzymes do not always act synergistically: in some cases, adding a new enzyme to an established composition may even reduce the initial activity of the composition, which is not advantageous from the point of view. degradation efficiency of lignocellulosic material.
[0016] De maneira semelhante, o documento US2010159509, de 15/12/2009, versa sobre métodos de degradação ou conversão de um material lignocelulósico na presença de um polipeptídeo com atividade peroxidase ou composição que compreenda esta enzima. 0 próprio documento descreve que o termo "atividade peroxidase" é definido como a atividade da enzima que converte um peróxido, por exemplo o peróxido de hidrogênio, em espécies menos oxidativas, como a água. 0 polipeptideo que possui "atividade peroxidase", segundo este mesmo documento, abrange uma enzima de decomposição de peróxido, definido como sendo da classe E.C. number 1.11.1.x. Opcionalmente, a composição pode apresentar enzimas que aumentem sua atividade lignocelulolitica, podendo a dita composição ser adicionada de enzimas "geradoras de peróxido" tais como, dentre uma lista de exemplos, superóxidos dismutases (classe EC 1.15.1.1). Novamente, cabe ressaltar que, não necessariamente, qualquer enzima adicionada apresentará efeito sinérgico e estabilidade em uma composição nas condições de uso, sendo essas características necessárias para o avanço da técnica de hidrólise enzimática. Ainda nesse sentido, destaca-se que o grande gargalo atual na plena viabilização emprego de métodos puramente enzimáticos trata-se de uma limitação técnico-econômica: ao mesmo tempo em que a adição de múltiplas enzimas a uma composição pode não torná-la tecnicamente mais eficaz, a elevação do seu custo devido a essa multiplicidade torna-a desvantajosa do ponto de vista econômico da aplicação industrial. Portanto, carece-se de composições que possuam um conjunto enzimático capaz de fechar o ciclo da hidrólise de biomassas vegetais com eficácia ampliada, mantendo sua atividade na temperatura do processo durante o maior período e com o mínimo de carga enzimática possíveis.Similarly, US2010159509, of 15/12/2009, deals with methods of degradation or conversion of a lignocellulosic material in the presence of a peroxidase activity polypeptide or composition comprising this enzyme. The document itself describes that the term "peroxidase activity" is defined as the activity of the enzyme that converts a peroxide, for example hydrogen peroxide, to less oxidative species such as water. The "peroxidase activity" polypeptide according to the same document comprises a peroxide decomposing enzyme, defined as class E.C. number 1.11.1.x. Optionally, the composition may have enzymes that increase its lignocellulolytic activity, and said composition may be added with "peroxide generating" enzymes such as, among a list of examples, superoxide dismutases (EC class 1.15.1.1). Again, it should be noted that, not necessarily, any enzyme added will have synergistic effect and stability in a composition under the conditions of use, these characteristics being necessary for the advancement of the enzymatic hydrolysis technique. Also in this regard, it is noteworthy that the current major bottleneck in fully enabling the use of purely enzymatic methods is a technical and economic limitation: while the addition of multiple enzymes to a composition may not make it technically more complex. effective, the increase in its cost due to this multiplicity makes it economically disadvantageous for industrial application. Therefore, they lack compositions that have an enzymatic set capable of closing the hydrolysis cycle of vegetable biomasses with increased efficiency, maintaining their activity at process temperature for the longest period and with the least possible enzymatic load.
[0017] Ademais, alguns métodos de pré-tratamento de materiais lignocelulósicos, tais como os tratamentos à vapor com súbita descompressão (explosão a vapor), fazem com que uma quantidade bastante substancial de lignina remanescente persista no meio em que a etapa de hidrólise é realizada. É bastante conhecido pelo estado da técnica que a lignina possui afinidade pelas enzimas lignocelulolíticas, em um fenômeno designado como "adsorção improdutiva". Neste fenômeno, as enzimas lignocelulolíticas são adsorvidas irreversivelmente, tornando-as indisponíveis para a hidrólise enzimática. Sendo assim, outro problema técnico a ser transposto é a constituição de composições de enzimas lignocelulolíticas com eficiência aumentada e que viabilize a hidrólise das cadeias de celulose e de hemicelulose mesmo na presença de lignina remanescente.In addition, some pre-treatment methods for lignocellulosic materials, such as steam treatments with sudden decompression (steam explosion), cause a very substantial amount of remaining lignin to persist in the medium in which the hydrolysis step is performed. fulfilled. It is well known from the state of the art that lignin has affinity for lignocellulolytic enzymes in a phenomenon called "unproductive adsorption". In this phenomenon, lignocellulolytic enzymes are irreversibly adsorbed, making them unavailable for enzymatic hydrolysis. Thus, another technical problem to be overcome is the constitution of lignocellulolytic enzyme compositions with increased efficiency and that enables the hydrolysis of the cellulose and hemicellulose chains even in the presence of remaining lignin.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃOBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0018] A presente invenção refere-se a uma composição de enzimas lignocelulolíticas, a um método de conversão enzimática e a um vetor de expressão de uma superóxido dismutase. Mais especificamente, a presente invenção se refere a uma composição de enzimas lignocelulolíticas que compreende uma superóxido dismutase, um método de conversão enzimática de material lignocelulósico com dita composição e a um vetor de expressão da referida superóxido dismutase.The present invention relates to a lignocellulolytic enzyme composition, an enzyme conversion method and an expression vector of a superoxide dismutase. More specifically, the present invention relates to a lignocellulolytic enzyme composition comprising a superoxide dismutase, a method of enzymatic conversion of lignocellulosic material with said composition and an expression vector of said superoxide dismutase.
[0019] A composição de enzimas lignocelulolíticas da presente invenção é caracterizada por compreender a superóxido dismutase de sequência definida pela SEQ ID NO: 1 e celulases.The lignocellulolytic enzyme composition of the present invention is characterized in that it comprises the sequence superoxide dismutase defined by SEQ ID NO: 1 and cellulases.
[0020] Opcionalmente, a composição da presente invenção é caracterizada por compreender proteínas selecionadas dentre hemicelulases, enzimas com atividade auxiliar ou combinações entre ditas proteínas.Optionally, the composition of the present invention is characterized in that it comprises proteins selected from hemicellulases, enzymes with auxiliary activity or combinations between said proteins.
[0021] Comparativamente a uma composição base composta por celulases, a composição da presente invenção apresenta atividade aumentada a 30 e a 50°C, com estabilidade superior a 24 h nas condições do processo de conversão enzimática do material lignocelulósico.Compared to a base composition composed of cellulases, the composition of the present invention exhibits increased activity at 30 and 50 ° C, with stability greater than 24 h under the conditions of the enzymatic conversion process of the lignocellulosic material.
[0022] O método de conversão enzimática da presente invenção é caracterizado por compreender as etapas de (i)pré-tratamento do material lignocelulósico e (ii) incubação do material lignocelulósico pré-tratado com a composição da presente invenção. O método da presente invenção apresenta a vantagem de permitir a maior liberação de açúcares monoméricos para a produção de etanol de segunda geração ou de outros subprodutos de valor agregado em relação ao mesmo método executado com a composição base composta por celulases, mesmo quando o pré-tratamento realizado permita um teor substancial de lignina remanescente.The enzyme conversion method of the present invention is characterized in that it comprises the steps of (i) pretreating the lignocellulosic material and (ii) incubating the pretreated lignocellulosic material with the composition of the present invention. The method of the present invention has the advantage of allowing greater release of monomeric sugars for the production of second generation ethanol or other value-added byproducts over the same method performed with the base composition composed of cellulases, even when treatment carried out permits a substantial remaining lignin content.
[0023] O vetor de expressão do presente invento é caracterizado por compreender a sequência definida como SEQ ID NO: 2 ligada de modo operativo às sequências promotora e terminadora heterólogas. A vantagem do vetor do presente invento é o de permitir que a SEQ ID NO: 2 seja expressa heterologamente com uma produtividade adequada da proteína superóxido dismutase definida pela SEQ ID NO: 1 em uma célula hospedeira.The expression vector of the present invention is characterized in that it comprises the sequence defined as SEQ ID NO: 2 operatively linked to the heterologous promoter and terminator sequences. The advantage of the vector of the present invention is that it allows SEQ ID NO: 2 to be expressed heterologously with an appropriate productivity of the superoxide dismutase protein defined by SEQ ID NO: 1 in a host cell.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
[0024] A Figura 1 mostra o mapa do vetor pET-28a (Novagen), que contém entre outros sítios, o promotor T7 (370-386), iniciador de transcrição T7 (369), sequência codificadora para His*Tag (270-287), sequência codificadora para T7»Tag (207-239), múltiplos sítios de clonagem , dentre eles os sítios Nhel e BamHI, sequência codificadora para His»Tag (140-157), terminador T7 (26-72), sequência codificadora para lacl (773-1852), pBR322 origin (3286), sequência codificadora Kan (kanamicina) (3995-4807) e fl origin (4903-5358).Figure 1 shows the pET-28a vector map (Novagen), which contains among other sites the T7 promoter (370-386), T7 transcription primer (369), His * Tag coding sequence (270- 287), T7 coding sequence »Tag (207-239), multiple cloning sites, including Nhel and BamHI sites, His» Tag coding sequence (140-157), T7 terminator (26-72), coding sequence for lacl (773-1852), pBR322 origin (3286), Kan coding sequence (kanamycin) (3995-4807) and fl origin (4903-5358).
[0025] A Figura 2 mostra o percentual de inibição da autoxidação do pirogalol pela superóxido dismutase de sequência definida como SEQ ID NO: 1 em diferentes concentrações (A) , em diferentes valores de pH (B) e a diferentes temperaturas (C) . Também mostra a atividade de SEQ ID NO: 1 em diferentes temperaturas (15 a 85 °C) por ensaio de riboflavina-azul de nitro tetrazólio em gel nativo (NBT-PAGE) (D) . Halos brancos correspondem a atividade positiva. As análises foram realizadas em triplicata.Figure 2 shows the percent inhibition of pyrogalol autoxidation by sequence superoxide dismutase defined as SEQ ID NO: 1 at different concentrations (A), at different pH values (B) and at different temperatures (C). It also shows the activity of SEQ ID NO: 1 at different temperatures (15 to 85 ° C) by native gel nitro tetrazolium blue riboflavin assay (NBT-PAGE) (D). White halos correspond to positive activity. Analyzes were performed in triplicate.
[0026] A Figura 3 mostra o grau de sinergismo entre a endo-β-Ι,4-glicosidase do cupim Coptotermes gestroi (CgEGl) e a superóxido dismutase de sequência definida como SEQ ID NO: 1. No ensaio, 0,5% de β -glucana foi utilizada como substrato em tampão fosfato 50 mmol pH 6,0. A reação foi conduzida a 30°C durante 3C min. Um total de 100 ng da CgEGl foi usada em todos os ensaios, enquanto diferentes quantidades da superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 foram testadas (100, 500, 750 e 2000 ng). O grau de sinergismo (GS) foi calculado como ab/ (a+b), em que ab é o resultado do sinergismo (pmol .min*1) , enquanto que a e b são os resultados das enzimas isoladas..Figure 3 shows the degree of synergism between Coptotermes gestroi termite endo-β-Ι, 4-glycosidase (CgEGl) and sequence superoxide dismutase defined as SEQ ID NO: 1. In the assay, 0.5% β-glucan was used as substrate in phosphate buffer 50 mmol pH 6.0. The reaction was conducted at 30 ° C for 3C min. A total of 100 ng CgEG1 was used in all assays, while different amounts of superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 were tested (100, 500, 750 and 2000 ng). The degree of synergism (GS) was calculated as ab / (a + b), where ab is the result of synergism (pmol .min * 1), while a and b are the results of isolated enzymes.
[0027] A Figura 4 representa o comportamento, a 30°C, das composições contendo SEQ ID NO: 1, nas concentrações de 2 e 20 pg, e Celluclast® (Novozymes) a 1 (A) , 5 (B) e 10 FPU (C) . As amostras foram retiradas nos tempos de 1, 3, 6 e 24 horas e os açúcares redutores totais (ART) foram medidos pelo método de DNS (3,5-ácido dinitrosalicilico)e expressos no eixo y do gráfico em gramas por litro. O grau de sinergismo da combinação de duas enzimas (GS) foi calculado como: ART (Celluclast® + SEQ ID NO: 1) /ART Celluclast®. Não foi detectada a liberação de açúcares redutores totais (ART) após incubação de bagaço de cana explodido não deslignifiçado (BEX) puro ou apenas na presença da superóxido dismutase SEQ ID NO: 1. Além disso, não houve grau de sinergismo ao se fazer os experimentos com a enzima desnaturada.Figure 4 depicts the behavior at 30 ° C of compositions containing SEQ ID NO: 1 at concentrations of 2 and 20 pg, and Celluclast® (Novozymes) at 1 (A), 5 (B) and 10 FPU (C). Samples were taken at 1, 3, 6 and 24 hours and total reducing sugars (ART) were measured by the DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) method and expressed in the y-axis of the graph in grams per liter. The degree of synergism of the two enzyme combination (GS) was calculated as: ART (Celluclast® + SEQ ID NO: 1) / ART Celluclast®. Release of total reducing sugars (ART) was not detected after incubation of pure non-delignified blown sugarcane bagasse (BEX) or only in the presence of superoxide dismutase. SEQ ID NO: 1. In addition, there was no degree of synergism in making the experiments with the denatured enzyme.
[0028] A Figura 5 mostra o comportamento, a 50°C, da composição contendo Celluclast® e a superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 na hidrólise de bagaço de cana explodido não deslignifiçado (BEX). Condições: pH 5,5; 100 mmol tampão Acetato; 2% de BEX, 1 FPU/g BEX de Celluclast® e 1,34 mg/ g BEX de SEQ ID NO: 1 purificada. Agitação: 1000 rpm. Os açúcares redutores totais (ART) foram medidos pelo método de DNS (3,5-ácido dinitrosalicilico)e o tempo de reação foi de 3 e 6 horas.Figure 5 shows the behavior at 50 ° C of the Celluclast®-containing composition and superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 in hydrolysis of non-delignified blown sugarcane bagasse (BEX). Conditions: pH 5.5; 100 mmol buffer Acetate; 2% BEX, 1 FPU / g Celluclast® BEX and 1.34 mg / g BEX of purified SEQ ID NO: 1. Agitation: 1000 rpm. Total reducing sugars (ART) were measured by the DNS method (3,5-dinitrosalicylic acid) and the reaction time was 3 and 6 hours.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0029] A presente invenção refere-se a uma composição de enzimas lignocelulolíticas, a um método de conversão enzimática e a um vetor de expressão de uma superóxido dismutase. Mais especificamente, a presente invenção se refere a uma composição de enzimas lignocelulolíticas que compreende uma superóxido dismutase, um método de conversão enzimática de material lignocelulósico com dita composição e a um vetor de expressão da referida superóxido dismutase.The present invention relates to a lignocellulolytic enzyme composition, an enzyme conversion method and an expression vector of a superoxide dismutase. More specifically, the present invention relates to a lignocellulolytic enzyme composition comprising a superoxide dismutase, a method of enzymatic conversion of lignocellulosic material with said composition and an expression vector of said superoxide dismutase.
[0030] A composição de enzimas lignocelulolíticas da presente invenção é caracterizada por compreender a superóxido dismutase de sequênica definida como SEQ ID NO: 1 e celulases.The composition of lignocellulolytic enzymes of the present invention is characterized in that it comprises the sequential superoxide dismutase defined as SEQ ID NO: 1 and cellulases.
[0031] Entende-se "celulases" por enzimas responsáveis pela degradação da celulose, tais como as exoglucanases, as endo glucanases e as beta-glucosidases. As celulases da composição do presente invento são caracterizadas por serem selecionadas dentre o grupo que compreende exoglucanases, endoglucanases, beta-glucosidases ou combinações entre elas."Cellulases" are enzymes responsible for cellulose degradation, such as exoglucanases, endo glucanases and beta-glucosidases. Cellulases of the composition of the present invention are characterized in that they are selected from the group comprising exoglucanases, endoglucanases, beta-glucosidases or combinations thereof.
[0032] Ainda, as celulases da composição do presente invento podem ser provenientes de bactérias, fungos ou insetos, porém não se restringindo a esses, sendo essas celulases de origem natural ou heteróloga, com ou sem mutações, provenientes ou não de evolução dirigida.Further, the cellulases of the composition of the present invention may be derived from, but not limited to, bacteria, fungi or insects, such cellulases being of natural or heterologous origin, with or without mutations, whether or not derived from directed evolution.
[0033] Opcionalmente, a composição da presente invenção é caracterizada por compreender, também, proteínas selecionadas dentre hemicelulases, enzimas com atividade auxiliar ou combinações entre ditas proteínas.Optionally, the composition of the present invention is characterized in that it also comprises proteins selected from hemicellulases, enzymes with auxiliary activity or combinations between said proteins.
[0034] Entende-se "hemicelulases" por enzimas que atuam quebrando as ligações químicas nos diferentes tipos de hemicelulose, tais como as xilanases, β-xilosidases, endoarabinases, arabinofuranosidases, mannanases, β-manosidases, xiloglucanases, pectinases e β-glucuronidases, porém não se restringindo a essas, e suas combinações."Hemicellulases" are enzymes that act to break chemical bonds in different types of hemicellulose, such as xylanases, β-xylosidases, endoarabinases, arabinofuranosidases, mannanases, β-manosidases, xyloglucanases, pectinases and β-glucuronides. but not restricted to these and their combinations.
[0035] Entende-se "enzimas de atividade auxiliar" por enzimas classificadas dentro da família "Auxiliary Activity" no banco de dados CAZY (http://www.cazy.org/), dentre estas as AA3, AA9 e AA10."Auxiliary activity enzymes" are enzymes classified within the "Auxiliary Activity" family in the CAZY database (http://www.cazy.org/), among which are AA3, AA9 and AA10.
[0036] As hemicelulases e as enzimas de atividade auxiliar da composição da presente invenção também podem ser provenientes de bactérias, fungos ou insetos, porém não se restringindo a esses, sendo de origem natural ou heteróloga, com ou sem mutações, provenientes ou não de evolução dirigida.Hemicellulases and auxiliary activity enzymes of the composition of the present invention may also be derived from, but not limited to, bacteria, fungi or insects, whether of natural or heterologous origin, with or without mutations, whether or not derived from directed evolution.
[0037] O método de conversão enzimática da presente invenção é caracterizado por compreender as etapas de: (i) pré-tratamento do material lignocelulósico, e (ii) incubação do material lignocelulósico pré-tratado com a composição da presente invenção.The enzymatic conversion method of the present invention is characterized by the steps of: (i) pretreatment of the lignocellulosic material, and (ii) incubation of the pretreated lignocellulosic material with the composition of the present invention.
[0038] O material lignocelulósico pode ser pré-tratado de acordo com quaisquer métodos constantes no estado da técnica. Preferencialmente, o material lignocelulósico é pré-tratado por explosão a vapor.The lignocellulosic material may be pretreated according to any prior art methods. Preferably, the lignocellulosic material is steam blast pretreated.
[0039] O vetor de expressão da presente invenção, que contém a sequência de origem de replicação, sequência marcadora de seleção e sítios múltiplos de clonagem, é caracterizado por compreender a sequência definida como SEQ ID NO: 2 ligada de modo operativo às sequências promotora e terminadora heterólogas. Em uma configuração da presente invenção, o vetor de expressão é caracterizado por compreender a sequência SEQ ID NO: 2 inserida entre os sítios de clonagem Nhel e BamHI do vetor que contém o promotor T7 (370-386), iniciador de transcrição T7 (369), sequência codificadora para His*Tag (270-287), sequência codificadora para T7*Tag (207-239), múltiplos sítios de clonagem , dentre eles os sítios Nhel e BamHI, sequência codificadora para His»Tag (140-157), terminador T7 (26-72), sequência codificadora para lacl (773-1852), origem de replicação pBR322 origin (3286), sequência codificadora Kan (kanamicina) (3995-4807) e fl origin (4903-5358), tal qual apresentado na Figura 1.The expression vector of the present invention, which contains the origin of replication sequence, selection marker sequence and multiple cloning sites, is characterized in that it comprises the sequence defined as SEQ ID NO: 2 operatively linked to the promoter sequences. and heterologous terminator. In one embodiment of the present invention, the expression vector is characterized by the sequence SEQ ID NO: 2 inserted between the Nhel and BamHI cloning sites of the vector containing the T7 promoter (370-386), T7 transcription primer (369 ), coding sequence for His * Tag (270-287), coding sequence for T7 * Tag (207-239), multiple cloning sites including Nhel and BamHI sites, coding sequence for His »Tag (140-157) , T7 terminator (26-72), lacl coding sequence (773-1852), pBR322 origin of replication origin (3286), Kan (kanamycin) coding sequence (3995-4807) and fl origin (4903-5358) as such shown in Figure 1.
[0040] O vetor de expressão da presente invenção é passível de expressão heteróloga em células hospedeiras, preferencialmente em células de E. coli.The expression vector of the present invention is capable of heterologous expression in host cells, preferably in E. coli cells.
[0041] EXEMPLO: [0042] A sequência SEQ ID NO: 2 foi inserida entre os sítios Nhel e BamHI do vetor pET-28a conforme instruções do fabricante (Novagen, Figura 1), permitindo a inserção de um Tag 6X-His na posição N-terminal, gerando o vetor pET28a /SEQ ID NO:2. Após clonagem e sequenciamento, a caracterização da sequência foi realizada nas plataformas Protparam, SignalP e SecretomeP.EXAMPLE: The sequence SEQ ID NO: 2 was inserted between the Nhel and BamHI sites of the pET-28a vector according to the manufacturer's instructions (Novagen, Figure 1), allowing the insertion of a 6X-His Tag at the position. N-terminal, generating the vector pET28a / SEQ ID NO: 2. After cloning and sequencing, sequence characterization was performed on the Protparam, SignalP and SecretomeP platforms.
[0043] Células competentes de E. coli ArticExpress (Novagen) foram transformadas com o vetor pET28a /SEQ ID NO: 2 e plaqueadas em meio LB sólido contendo kanamicina (50 μς mg-1) . As células de uma colônia isolada foram cultivadas em meio LB-kanamicina liquido, com a kanamicina na mesma concentração do meio sólido, por 16 h a 37°C e 200 rpm. Em seguida, a cultura foi diluída em 800 mL de meio LB-kanamicina líquido e crescida a 30°C, por 4 h, a 200 rpm. Após 1 h de aclimatação, MnCl2 e CuClz a 2,5 mmol L'1 cada, foram adicionados ao meio e a expressão da enzima recombinante foi induzida pela adição de IPTG 1 mmol L"1. Após 24 h, as células foram centrifugadas a 8500 g.Competent E. coli ArticExpress (Novagen) cells were transformed with vector pET28a / SEQ ID NO: 2 and plated on solid LB medium containing kanamycin (50 μς mg-1). Cells from an isolated colony were cultured in liquid LB-kanamycin medium, with kanamycin at the same concentration as the solid medium, for 16 h at 37 ° C and 200 rpm. The culture was then diluted in 800 mL of liquid LB-kanamycin medium and grown at 30 ° C for 4 h at 200 rpm. After 1 h of acclimation, 2.5 mmol L -1 MnCl2 and CuClz each were added to the medium and expression of the recombinant enzyme was induced by the addition of 1 mmol L "1 IPTG. After 24 h the cells were centrifuged at 8500 g.
[0044] As células foram ressuspendidas em tampão de lise (fosfato de sódio 20 mmol L'1 pH 7,5, NaCl 500 mmol L"1, imidazol 5 mmol L_1, egg lysozyme 80 g mL"1 e PMSF 5 mmol L'1) e, em seguida, rompidas em banho de gelo em um processador ultrassônico. A proteína expressa presente no sobrenadante (superóxido dismutase, definida como SEQ ID NO: 1) foi purificada por cromatografia, utilizando-se um sistema AKTA FPLC (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA) e uma coluna HiTrap Chelating HP column (GE Healthcare) carregada com Ni2+, seguida de uma coluna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). O rendimento desta purificação foi de aproximadamente 8 mg de superóxido dismutase por mL.Cells were resuspended in lysis buffer (20 mmol L1 sodium phosphate pH 7.5, 500 mmol L "1 NaCl, 5 mmol L_1 imidazole, 80 g mL" 1 egg lysozyme and 5 mmol L 'PMSF 1) and then broken into ice bath in an ultrasonic processor. The expressed protein present in the supernatant (superoxide dismutase, defined as SEQ ID NO: 1) was purified by chromatography using an AKTA FPLC system (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA) and a HiTrap Chelating HP column (GE Healthcare). ) loaded with Ni2 +, followed by a Superdex 200 10/300 GL column (GE Healthcare). The yield of this purification was approximately 8 mg superoxide dismutase per mL.
[0045] A superóxido dismutase purificada (SEQ ID NO: 1) teve sua atividade enzimática testada por um procedimento de auto-oxidação do pirogalol modificado (Marklund and Marklund, 1974). Diferentes concentrações da solução de SEQ ID NO: 1 (0,25 a 2,5 μg) foram adicionadas ao tampão Tris 50 mmol L-1, pH 8,2, contendo EDTA 1 mmol L_1. A reação se deu em placas de 96 poços e foi iniciada com a adição de pirogalol 0,2 mmol L'1 (concentração final). A mudança da absorbância a 325 nm foi medida a cada 30 s, por 10 min, a 25 °C. Os resultados foram expressos em quantidade de enzima (pg) requeridos para a inibição de 50 % da auto-oxidação do pirogalol (IC 50). Quanto aos resultados, a proteína SEQ ID NO:l apresentou um IC 50 de 1,17 pg (4,8 pg/mL) , muito inferior aos valores reportados para as superóxido-dismutases de Thermus filiformis (410 pg) e de Telypocladium sp (1,3 mg/mL) [0046] Para avaliar a estabilidade, 2,5 pg da superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 foram incubadas entre os pH 4 e 11 (25 °C) e entre as temperaturas de 20 e 70 °C antes da realização do ensaio de auto-oxidação do pirogalol. A atividade enzimática da proteína SEQ ID NO: 1 sob diferentes temperaturas também foi avaliada pelo ensaio NBT-PAGE (Boonmee et al., 2011). Os ensaios mostraram que a proteína SEQ ID NO: 1 é ativa nos pH 4-11, com atividade ótima a pH 5. Além disso, SEQ ID NO: 1 inibiu a auto-oxidação do pirogalol em mais de 80% após incubação nas temperaturas entre 30 e 65 °C, com atividade ótima a 35 °CPurified superoxide dismutase (SEQ ID NO: 1) had its enzymatic activity tested by a modified pyrogalol self-oxidation procedure (Marklund and Marklund, 1974). Different concentrations of the solution of SEQ ID NO: 1 (0.25 to 2.5 μg) were added to the Tris 50 mmol L-1 pH 8.2 buffer containing 1 mmol L_1 EDTA. The reaction was in 96-well plates and was started by the addition of 0.2 mmol L -1 pyrogalol (final concentration). The change in absorbance at 325 nm was measured every 30 s for 10 min at 25 ° C. Results were expressed as enzyme amount (pg) required for 50% inhibition of pyrogalol self-oxidation (IC 50). As for the results, the protein SEQ ID NO: 1 had an IC 50 of 1.17 pg (4.8 pg / mL), much lower than the reported values for Thermus filiformis (410 pg) and Telypocladium sp superoxide dismutases. (1.3 mg / mL) To assess stability, 2.5 pg of superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 were incubated between pH 4 and 11 (25 ° C) and between 20 and 70 ° C. C prior to performing the pyrogallol self-oxidation assay. The enzymatic activity of protein SEQ ID NO: 1 at different temperatures was also assessed by the NBT-PAGE assay (Boonmee et al., 2011). Assays have shown that SEQ ID NO: 1 protein is active at pH 4-11, with optimal activity at pH 5. In addition, SEQ ID NO: 1 inhibited pyrogallol self-oxidation by more than 80% after incubation at temperatures between 30 and 65 ° C, with optimum activity at 35 ° C
[0047] Ensaios de sinergismo com outras enzimas foram realizados com a superóxido dismutase SEQ ID NO:l. Em um primeiro teste, avaliou-se a sinergia da superóxido dismutase SEQ ID NO:l com uma endo-B-l,4-glicosidase de Coptotermes gestroi. O grau de sinergismo (GS) foi calculado como ab/(a+b) , em que ab é o resultado do sinergismo (pmol .min'1) , enquanto que a e b são os resultados das enzimas isoladas. A reação foi conduzida com 100 pl de β-glucan 0,5% em 50 mmol L'1 of tampão acetato pH 5,5, 100 ng de endo-β-Ι,4-glicosidase de C. gestroi e diferentes concentrações da superóxido dismutase SEQ ID N0:1 (100, 500, 750 e 2000 ng) . Todas as reações foram realizadas em quintuplicata a 30 °C durante 30 min em placas de PCR. Após a hidrólise, 100 μΐ da reação foram transferidos para uma nova placa e 100 μΐ de DNS (3,5-ácido dinitrosalicilico) foram adicionados. As reações foram incubadas a 99 °C por 5 min e as absorbâncias foram medidads a 540 nm. Os resultados foram expressos em glicose equivalente (pmol) . Por este ensaio, 100 ng de SEQ ID NO:l conseguiu aumentar a hidrólise do β-glucan em um GS de 1,46 (Figura 3).Synergism assays with other enzymes were performed with superoxide dismutase SEQ ID NO: 1. In a first test, the synergy of superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 was assessed with an Coptotermes gestroi endo-B-1,4-glycosidase. The degree of synergism (GS) was calculated as ab / (a + b), where ab is the result of synergism (pmol .min'1), while a and b are the results of isolated enzymes. The reaction was conducted with 100 µl 0.5% β-glucan in 50 mmol L'1 of acetate buffer pH 5.5, 100 ng C. gestroi endo-β-Ι, 4-glycosidase and different superoxide concentrations dismutase SEQ ID NO: 1 (100, 500, 750 and 2000 ng). All reactions were performed in quintuplicate at 30 ° C for 30 min in PCR plates. After hydrolysis, 100 μΐ of the reaction was transferred to a new plate and 100 μΐ of DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) was added. Reactions were incubated at 99 ° C for 5 min and absorbances were measured at 540 nm. Results were expressed as glucose equivalent (pmol). By this assay, 100 ng of SEQ ID NO: 1 was able to increase β-glucan hydrolysis by a GS of 1.46 (Figure 3).
[0048] Em um segundo momento, a atividade da superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 foi mensurada na hidrólise do material lignocelulósico bagaço de cana-de-açúcar explodido não deslignifiçado (BEX). A dosagem de proteínas totais foi realizada segundo o método de Bradford (1976) utilizando-se Albumina de Soro Bovino (BSA) como padrão. A mistura reacional constitui-se de 1,5 ml em solução de 2% de BEX em tampão acetato 100 mM, pH 5,5. Cargas de 10, 5 e 1 Unidades de papel filtro (FPU) por grama de BEX do coquetel comercial Celluclast® (Novozymes, constituído basicamente de celulases) e concentrações da superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 entre 2 e 20 pg por grama de BEX foram combinadas. A mistura foi incubada sob agitação de 1000 rpm a 30 °C e 50 °C (Figura 4) e após 1, 3 ,6 e 24 horas, teve alíquotas retiradas. Os açúcares redutores foram quantificados pelo método de DNS, e as leituras foram realizadas em espectrofotômetro a 575 nm, conforme descrito por Miller (1959). O grau de sinergismo (GS) foi determinado comparando a hidrólise da combinação enzimática (ab) pela hidrólise das enzimas separadas (a+b), ou seja, ab/(a+b). As amostras foram retiradas nos tempos de 1, 3, 6 e 24 horas e os açúcares redutores totais (ART) foram medidos pelo método de DNS. A tabela 1, bem como a figura 4, apresentam os resultados obtidos.Secondly, the activity of superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 was measured in the hydrolysis of non-delignified exploded sugarcane bagasse (BEX) lignocellulosic material. Total protein dosage was performed by the Bradford method (1976) using Bovine Serum Albumin (BSA) as standard. The reaction mixture consists of 1.5 ml in 2% BEX solution in 100 mM acetate buffer, pH 5.5. Loads of 10, 5 and 1 Filter Paper Units (FPU) per gram of BEX from the Commercial Celluclast® cocktail (Novozymes, consisting primarily of cellulases) and superoxide dismutase concentrations SEQ ID NO: 1 between 2 and 20 pg per gram of BEX were combined. The mixture was incubated with shaking at 1000 rpm at 30 ° C and 50 ° C (Figure 4) and after 1, 3, 6 and 24 hours, aliquots were taken. Reducing sugars were quantified by the DNS method, and readings were taken on a spectrophotometer at 575 nm, as described by Miller (1959). The degree of synergism (GS) was determined by comparing the hydrolysis of the enzyme combination (ab) by the hydrolysis of the separated enzymes (a + b), ie ab / (a + b). Samples were taken at 1, 3, 6 and 24 hours and total reducing sugars (ART) were measured by the DNS method. Table 1, as well as figure 4, present the results obtained.
[0049] Tabela 1: Suplementação de Celluclast® (Novozymes) com a superóxido dismutase SEQ ID NO : 1. As quantidades de 10, 5 e 1 FPU de Celluclast® (Novozymes)por grama de BEX foram testadas versus as concentrações de 2 e 20 pg de SEQ ID NO: 1 por grama de BEX. Os resultados foram expressos em açúcares redutores totais (g/L) (ART).Table 1: Celluclast® (Novozymes) Supplementation with Superoxide Dismutase SEQ ID NO: 1. The 10, 5 and 1 FPU amounts of Celluclast® (Novozymes) per gram of BEX were tested versus concentrations of 2 and 20 pg SEQ ID NO: 1 per gram BEX. Results were expressed as total reducing sugars (g / L) (ART).
[0050] Cabe salientar que a superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 não apresentou atividade sobre BEX quando incubado isoladamente .It should be noted that superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 showed no activity on BEX when incubated alone.
[0051] Como a hidrólise ideal da biomassa encontra-se em temperaturas mais elevadas (50 °C, temperatura ótima de atividade das composições para a hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos), novos parâmetros foram formulados a fim de demonstrar o efeito positivo adicionando-se a superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 a Celluclast®.Since optimal biomass hydrolysis is at higher temperatures (50 ° C, optimal activity temperature of compositions for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials), new parameters have been formulated to demonstrate the positive effect by adding superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 to Celluclast®.
[0052] A hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar explodido não deslignifiçado (BEX) se deu com a composição Celluclast® e a superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 nas seguintes condições: pH 5,5; 100 mmol tampão Acetato; 2% de BEX, 1 FPU/g de Celluclast® e 1,34 mg da superóxido dismutase SEQ ID NO: 1 purificada. A temperatura de reação foi de 50 Cea agitação foi de 1000 rpm. Os açúcares redutores foram medidos pelo método de DNS nos tempos de reação de 3 e 6 horas. O efeito positivo de SEQ ID NO: 1 sobre Celluclast® foi demonstrado pelo GS de 1,15 (3 h) e 1,19 (6 h de reação), conforme retratado na figura 5.Non-delignified blown sugarcane bagasse hydrolysis (BEX) was carried out with the composition Celluclast® and superoxide dismutase SEQ ID NO: 1 under the following conditions: pH 5.5; 100 mmol buffer Acetate; 2% BEX, 1 FPU / g Celluclast® and 1.34 mg of purified superoxide dismutase SEQ ID NO: 1. The reaction temperature was 50 ° C and the stirring was 1000 rpm. Reducing sugars were measured by the DNS method at reaction times of 3 and 6 hours. The positive effect of SEQ ID NO: 1 on Celluclast® was demonstrated by the GS of 1.15 (3h) and 1.19 (6h reaction), as depicted in Figure 5.
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