BR102015012622A2 - METHOD AND KIT FOR DIAGNOSIS OF LEISHMANIOSES USING SYNTHETIC PEPTIDE DERIVED FROM THE ENCODERATED GENE KINETIC PROTEIN ENGINE BY MITOGEN - Google Patents
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Abstract
método e kit para diagnóstico das leishmanioses utilizando peptídeos sintéticos derivados do gene codificador da proteína quinase ativada por mitógeno" a presente invenção deicreve peptídeos, um método e kit para imunodiagnóstico das leishmanioses, doença causada por protozoários do gênero leishmania, seja a infecção e/ou a doença, em seres humanos e/ou cães. a invenção trata-se da síntese e uso de peptídeos derivados da proteína quinase ativada por mitógeno (mapk) para sererm utilizados na identificação de indivíduos e animais infectados pela leishmaniose visceral e tegumentar, visando o desenvolvimento de um método e um kit diagnóstico com maior sensibilidade e especificidade, permitindo o aperfeiçoamento da reatividade dos testes sorológicos.Method and Kit for Diagnosing Leishmaniasis Using Synthetic Peptides Derived from the Mitogen-Activated Protein Kinase Encoding Gene "The present invention discloses peptides, a method and kit for immunodiagnosis of leishmaniasis, a disease caused by protozoa of the genus Leishmania, whether infection and / or Disease in humans and / or dogs The invention is a synthesis and use of peptides derived from the mitogen-activated protein kinase (MAPK) to be used in the identification of individuals and animals infected with visceral and integumentary leishmaniasis. development of a method and a diagnostic kit with greater sensitivity and specificity, allowing the improvement of the reactivity of serological tests.
Description
MÉTODO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DAS LEISHMANIOSES UTILIZANDO PEPTÍDEOS SINTÉTICOS DERIVADOS DO GENE CODIFICADOR DA PROTEÍNA QUINASE ATIVADA POR MITÓGENOMETHOD AND KIT FOR DIAGNOSIS OF LEISHMANIOSIS USING SYNTHETIC PEPTIDES DERIVED FROM THE MYTHOGEN ACTIVATED PROTEIN KINASE ENCODER
[001] A presente invenção descreve peptídeos, um método e kit para imunodiagnóstico das leishmanioses, doença causada por protozoários do gênero Leishmania, seja a infecção e/ou a doença, em seres humanos e/ou cães. A invenção trata da síntese e uso de peptídeos derivados da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) para serem utilizados na identificação de humanos e animais infectados pela leishmaniose visceral e tegumentar, visando o desenvolvimento de um método e um kit diagnóstico com maior sensibilidade e especificidade, permitindo o aperfeiçoamento da reatividade dos testes sorológicos.The present invention describes peptides, a method and kit for immunodiagnosis of leishmaniasis, disease caused by protozoa of the genus Leishmania, either infection and / or disease, in humans and / or dogs. The invention is concerned with the synthesis and use of mitogen-activated protein kinase (MAPK) derived peptides for use in the identification of humans and animals infected with visceral and integumentary leishmaniasis, with the aim of developing a method and diagnostic kit with greater sensitivity and specificity. , allowing the improvement of the reactivity of serological tests.
[002] As leishmanioses englobam um complexo grupo de doenças parasitárias causadas por protozoários do gênero Leishmania com estimativas de que cerca de 12 milhões de pessoas estejam infectadas, com uma incidência anual de 1-1,5 milhões de casos de leishmaniose tegumentar e 500.000 casos de leishmaniose visceral (Desjeux P et al. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2004 Sep; 27(5): 305-18).[002] Leishmaniasis encompasses a complex group of parasitic diseases caused by protozoa of the genus Leishmania with estimates that about 12 million people are infected, with an annual incidence of 1-1.5 million cases of cutaneous leishmaniasis and 500,000 cases. of visceral leishmaniasis (Desjeux P et al. Comp. Immunol Microbiol Infect Dis. 2004 Sep; 27 (5): 305-18).
[003] A família de proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK) são um grupo de serina/proteína quinases altamente conservados entre as espécies de eucariotos e importantes reguladores de diversos processos celulares, tais como controle transcricional, apoptose, respostas a stress, desenvolvimento e diferenciação durante o ciclo celular, e também como possíveis alvos de drogas para protozoários (Grupta CL et al. Interdiscip Sei. 2013; 5 (2): 136-144). MAPK, quando ativadas, podem fosforilar uma grande variedade de alvos, inclusive outras proteínas quinases e fatores de transcrição de genes regulados por essas proteínas, exercendo importante papel em vias de sinalização e na regulação da estabilidade de RNAm de vários genes, além de estar associado ao processo patológico de várias doenças (Davis RJ. J Biol Chem. 1993 Jul; 268 (20): 14553-6).The Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK) family is a highly conserved serine / protein kinases group among eukaryote species and important regulators of various cellular processes such as transcriptional control, apoptosis, stress responses, development and differentiation during the cell cycle, and also as possible drug targets for protozoa (Grupta CL et al. Interdiscip Sci. 2013; 5 (2): 136-144). MAPK, when activated, can phosphorylate a wide range of targets, including other protein kinases and gene transcription factors regulated by these proteins, playing an important role in signaling pathways and in regulating the mRNA stability of various genes, and is associated the pathological process of various diseases (Davis RJ. J Biol Chem. 1993 Jul; 268 (20): 14553-6).
[004] Na busca de novos alvos para diagnósticos, análises de epitopos antigênicos de proteínas de microrganismos patogênicos têm ampliado o número de epitopos-alvo e dado indícios para melhorar a antigenicidade de peptídeos. Entre os métodos proteômicos de seleção, o mapeamento de epitopos é um procedimento muito útil, que tem vastas aplicações na área de biotecnologia, como por exemplo, na produção de anticorpos, desenvolvimento de testes para imunodiagnóstico e design de vacinas baseado em epitopos.. A identificação desses alvos foi facilitada pela publicação do genoma dos parasitos em conjunto com a disponibilidade de algoritmos para prediçáo de epitopos, que permite a utilização em larga escala de abordagens para a identificação de novos antígenos (Bryson CJ et ai BioDrugs. 2010; 24 (1):1-8).[004] In the search for new diagnostic targets, analyzes of antigenic epitopes of pathogenic microorganism proteins have increased the number of target epitopes and provided evidence to improve peptide antigenicity. Among the proteomic selection methods, epitope mapping is a very useful procedure that has wide applications in the field of biotechnology, such as antibody production, development of immunodiagnostic tests, and epitope-based vaccine design. Identification of these targets has been facilitated by the publication of the parasite genome in conjunction with the availability of epitope prediction algorithms, which allows for the large-scale use of novel antigen identification approaches (Bryson CJ et al BioDrugs. 2010; 24 (1 ): 1-8).
[005] No estado da técnica foram encontrados documentos de patente que sugerem o uso de peptídeos no diagnóstico de leishmanioses, como exemplos, o documento PI1020120335522 e PI1320120335599 que descrevem o uso de polipeptídeos derivados do proteoma de Leishmania infantum para o diagnóstico da infecção. No entanto, todos os documentos encontrados no estado da técnica, dentre os quais se encontram os acima citados, apresentam proteínas e peptídeos diferenciados dos apresentados nessa invenção. Ademais, os que são encontrados no estado da arte não permitem um diagnóstico tão eficaz como na presente tecnologia, através do qual se faz a distinção de outras infecções causadas por parasitos presentes em áreas endêmicas para leishmaniose tegumentar e visceral humana e leishmaniose visceral canina, como a espécie de protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas,. Além do mais, não está descrito na literatura métodos que fazem diagnóstico da forma tegumentar e visceral, humana e canina, utilizando mesmo antígeno mapeado no proteoma de parasitos do gênero Leishmania. Assim, apesar dos avanços obtidos nos últimos anos, os métodos de diagnóstico disponíveis das leishmanioses ainda possuem diversas limitações. Além disso, na ausência de métodos de diagnóstico efetivos, a eficiência do tratamento e de qualquer iniciativa de bloqueio da transmissão ou vacinação fica comprometida (Ministério da Saúde. Doenças Infecciosas e Parasitárias: guia de bolso. Brasília. 2006).In the prior art patent documents have been found suggesting the use of peptides in the diagnosis of leishmaniasis, as examples, document PI1020120335522 and PI1320120335599 which describe the use of Leishmania infantum proteome derived polypeptides for the diagnosis of infection. However, all documents found in the state of the art, including those mentioned above, present proteins and peptides different from those presented in this invention. Furthermore, those found in the state of the art do not allow as effective a diagnosis as in the present technology, by which we distinguish other infections caused by parasites present in endemic areas for human cutaneous and visceral leishmaniasis and canine visceral leishmaniasis such as the protozoan species Trypanosoma cruzi, etiological agent of Chagas disease ,. Furthermore, methods that diagnose the human and canine integumentary and visceral forms using the same antigen mapped on the Leishmania parasite proteome are not described in the literature. Thus, despite advances in recent years, the available diagnostic methods for leishmaniasis still have several limitations. Moreover, in the absence of effective diagnostic methods, the effectiveness of treatment and any initiative to block transmission or vaccination is compromised (Ministry of Health. Infectious and Parasitic Diseases: pocket guide. Brasília. 2006).
[006] Apesar da extensiva busca em desenvolver imunobiológicos para testes de diagnósticos mais sensíveis e específicos contra leishmanioses, ainda são necessárias melhorias na eficácia destes métodos em diagnosticar a doença em todos hospedeiros envolvidos no ciclo de vida do parasito. Assim, a presente invenção apresenta uma alternativa para solucionar este problema. Trata-se de peptídeos sintéticos desenhados a partir de epitópos de linfócitos B preditos por imunoinformática no gene codificador da MAPK de L. braziliensis e 0 uso dos mesmos em método e kit para diagnosticar leishmanioses em cães e/ou humanos.Despite extensive efforts to develop immunobiologicals for more sensitive and specific diagnostic tests against leishmaniasis, improvements in the effectiveness of these methods in diagnosing the disease in all hosts involved in the parasite life cycle are still needed. Thus, the present invention provides an alternative to solve this problem. These are synthetic peptides designed from B-lymphocyte epitopes predicted by immunoinformatics in the L. braziliensis MAPK coding gene and their use in a method and kit to diagnose leishmaniasis in dogs and / or humans.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
[007] A Figura 1 apresenta a análise por imunoinformática do gene codificador da proteína Mitogen-activated protein kinase (MAPK) e do peptídeo- 1 (DPAEEADAP), localizado no cromossomo 19, que apresenta score de prediçáo para epitópo de linfócitos B de 1,88.[007] Figure 1 shows the immunoinformatic analysis of the gene encoding Mitogen-activated protein kinase (MAPK) and peptide-1 (DPAEEADAP), located on chromosome 19, which has a prediction score for B lymphocyte epitope of 1. 88
[008] A Figura 2 apresenta gráficos comparativos referentes à reatividade humoral contra peptídeo-1 e contra o antígeno solúvel bruto da Leishmania braziliensis (AgSLb), em soro de indivíduos portadores da Leishmaniose Tegumentar Humana (LTH). O eixo X representa os grupos avaliados: indivíduos controle (CT, n=50), indivíduos portadores da Doença de Chagas (DC, n=20) indivíduos portadores da Leishmaniose Tegumentar Humana (LTH) forma clínica cutânea (LTH-C, n=45) e muco-cutânea (LTH-MC, n=20). O eixo Y representa os valores médios de absorbància (450 nm) pela técnica de ELISA utilizando-se soros diluídos 1:100. *0 cut off foi estabelecido utilizando curva ROC.[008] Figure 2 presents comparative graphs relating to humoral reactivity against peptide-1 and against crude soluble Leishmania braziliensis antigen (AgSLb) in serum from individuals with Human Tegumentary Leishmaniasis (LTH). The X axis represents the evaluated groups: control individuals (TC, n = 50), individuals with Chagas Disease (CD, n = 20) individuals with Human Tegumentary Leishmaniasis (LTH) cutaneous clinical form (LTH-C, n = 45) and mucocutaneous (LTH-MC, n = 20). Y-axis represents mean absorbance values (450 nm) by ELISA using diluted 1: 100 sera. * Cut off was established using ROC curve.
[009] A Figura 3 apresenta gráficos comparativos referentes à reatividade humoral contra o peptídeo-1 e contra e o antígeno solúvel bruto da Leishmania braziliensis (AgSLb), em soro de indivíduos portadores da Leishmaniose Visceral Humana (LVH). O eixo X representa os grupos avaliados: indivíduos controle (CT, n=50), indivíduos portadores da Doença de Chagas (DC, n=20) indivíduos portadores da Leishmaniose Visceral Humana (LVH, n=55). O eixo Y representa os valores médios de absorbància (450 nm) pela técnica de ELISA utilizando-se soros diluídos 1:100. *0 cut off foi estabelecido utilizando curva ROC.[009] Figure 3 presents comparative graphs for humoral reactivity against peptide-1 and against and soluble crude Leishmania braziliensis antigen (AgSLb) in serum from individuals with Human Visceral Leishmaniasis (LVH). The X axis represents the evaluated groups: control individuals (TC, n = 50), individuals with Chagas Disease (CD, n = 20) individuals with Human Visceral Leishmaniasis (LVH, n = 55). Y-axis represents mean absorbance values (450 nm) by ELISA using diluted 1: 100 sera. * Cut off was established using ROC curve.
[010] A Figura 4 apresenta gráficos comparativos referentes à reatividade humoral contra o peptídeo-1 e contra e o antígeno solúvel bruto da Leishmania braziliensis (AgSLb), em soro de cães portadores da Leishmaniose Visceral canina (LVC). O eixo X representa os grupos avaliados: cáes controle (CT, n=30), indivíduos portadores da Doença de Chagas (DC, n=15) indivíduos portadores da Leishmaniose Visceral Canina (LVC, n=30). O eixo Y representa os valores médios de absorbância (450 nm) pela técnica de ELISA utilizando-se soros diluídos 1:100. *0 cut off foi estabelecido utilizando curva ROC.[010] Figure 4 presents comparative graphs regarding humoral reactivity against peptide-1 and against and soluble crude Leishmania braziliensis antigen (AgSLb) in serum of dogs with canine Visceral Leishmaniasis (LVC). The X axis represents the evaluated groups: control dogs (TC, n = 30), individuals with Chagas Disease (CD, n = 15) individuals with Canine Visceral Leishmaniasis (LVC, n = 30). The Y axis represents the mean absorbance values (450 nm) by ELISA using diluted 1: 100 sera. * Cut off was established using ROC curve.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIADETAILED DESCRIPTION OF TECHNOLOGY
[011] A presente invenção descreve peptídeos, um método e kit para imunodiagnóstico das leishmanioses, doença causada por protozoários do gênero Leishmania, seja a infecção e/ou a doença, em seres humanos e/ou cães. A invenção trata da síntese e uso de peptídeos derivados da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) para serem utilizados na identificação de humanos e animais infectados pela leishmaniose visceral e tegumentar, visando o desenvolvimento de um método e um kit diagnóstico com maior sensibilidade e especificidade, permitindo o aperfeiçoamento da reatividade dos testes sorológicos.[011] The present invention describes peptides, a method and kit for immunodiagnosis of leishmaniasis, a disease caused by protozoa of the genus Leishmania, either infection and / or disease, in humans and / or dogs. The invention is concerned with the synthesis and use of mitogen-activated protein kinase (MAPK) derived peptides for use in the identification of humans and animals infected with visceral and integumentary leishmaniasis, with the aim of developing a method and diagnostic kit with greater sensitivity and specificity. , allowing the improvement of the reactivity of serological tests.
[012] Na presente invenção foi identificado um peptídeo a partir do gene codificador para a MAPK, derivado de epitopos de célula B, consistindo da sequência representada pela SEQ ID N°1, modificados ou não em suas extremidades, por exemplo, pela adição de outras sequências ou outros grupos químicos que não alterem a estrutura básica e que garantam a especificidade do peptídeo, visando contribuir para melhorar o sorodiagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) e das Leishmanioses Tegumentar (LTH) e Visceral humana (LVH).In the present invention a peptide has been identified from the MAPK coding gene derived from B cell epitopes consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 whether or not modified at its ends, for example by the addition of other sequences or other chemical groups that do not alter the basic structure and guarantee the specificity of the peptide, aiming to contribute to improve the serodiagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis (LVC) and Cutaneous Leishmaniasis (LTH) and Human Visceral Leishmaniasis (LVH).
[013] O método para imunodiagnóstico de leishmaniose pode ser selecionado do grupo compreedendo ELISA, Western blot, Dot blot, imunodifusáo, imunocromatografia e apresentar os seguintes etapas: a) ligação de anticorpos antileishmaniais de uma amostra a um ou mais peptídeos consistindo da sequência de aminoácido SEQ ID N° 1, ligados a um suporte sólido ou um carreador; b) contactar os anticorpos da etapa “a” com um anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador, e que se ligam especificamente aos anticorpos da etapa “a”; c) detecção dos anticorpos antileishmaniais da amostra da etapa “a" a partir da detecção do anticorpo secundário ou proteína especificamente ligados ao anticorpo anti-leishmanial.[013] The method for immunodiagnosis of leishmaniasis may be selected from the group comprising ELISA, Western blot, dot blot, immunodiffusion, immunochromatography and the following steps: a) binding of antileishmanial antibodies of a sample to one or more peptides consisting of the sequence of amino acid SEQ ID NO: 1, attached to a solid support or carrier; b) contacting the antibodies of step "a" with a secondary antibody or protein, conjugated to an enzyme or label and specifically binding to antibodies of step "a"; c) detecting the antileishmanial antibodies of the sample from step "a" from detecting the secondary antibody or protein specifically bound to the anti-leishmanial antibody.
[001] O método pode ser realizado utilizando-se amostras de sangue, soro, plasma ou outro fluído corporal do animal ou humano a ser testado. O peptídeo SEQ ID N° 1 pode ser usado de forma associada (concatenada) ou isoladamente e pode ser modificado em suas extremidades. O carreador descrito na etapa “a” deve ser, preferencialmente, partícula de ouro.The method may be performed using samples of blood, serum, plasma or other body fluid from the animal or human to be tested. Peptide SEQ ID NO: 1 may be used in combination (concatenated) or alone and may be modified at its ends. The carrier described in step "a" should preferably be gold particle.
[014] Na etapa “b”, a proteína pode ser selecionada do grupo consistindo de proteína A ou proteína G. Já as enzimas podem ser selecionadadas do grupo compreedendo fosfatase alcalina, peroxidase, β-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase e o marcador pode ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.[014] In step "b", the protein may be selected from the group consisting of protein A or protein G. Enzymes may be selected from the group comprising alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase and the marker may be selected from the group comprising enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescent.
[015] A tecnologia também descreve um kit para teste imunodiagnóstico das leishmanioses que compreende: a) pelo menos um peptídeo consistindo da sequência SEQ ID N° 1; b) suporte sólido ou carreador; c) um anticorpo secundário ou uma proteína conjugados a um enzima ou marcador; d) um reagente para detectar a enzima ou marcador do item anterior.The technology also describes a leishmaniasis immunodiagnostic test kit comprising: a) at least one peptide consisting of the sequence SEQ ID NO: 1; b) solid support or carrier; c) a secondary antibody or protein conjugated to an enzyme or marker; d) a reagent for detecting the enzyme or label of the preceding item.
[016] O Peptídeo-1 (SEQ ID N° 1), pode ser usado de forma associada (concatenada) ou isoladamente e pode ser modificado em suas extremidades.Peptide-1 (SEQ ID NO: 1) may be used in association (concatenated) or singly and may be modified at its ends.
[017] No kit os peptídeos estarão ligados a um suporte sólido ou carreador, sendo que esse suporte sólido poderá ser de nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e poliestireno e o carreador consistir, preferencialmente, de partículas de ouro.[017] In the kit the peptides will be attached to a solid support or carrier, which solid support may be nitrocellulose, nylon, latex, polypropylene and polystyrene and the carrier preferably consist of gold particles.
[018] O anticorpo secundário ou a proteína (proteína A ou G), devem estar conjugados a um enzima (como fosfatase alcalina, peroxidase, β-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase) ou marcador (como enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes). O kit ainda deve conter um reagente para detectar a dita enzima ou marcador.The secondary antibody or protein (protein A or G) must be conjugated to an enzyme (such as alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase) or marker (such as enzymes, radioisotopes). , biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescent). The kit must further contain a reagent to detect said enzyme or label.
[019] A tecnologia também propõe a proteção do peptídeo sintético, bem como o seu uso e o uso do kit para o diagnóstico das leishmanioses.[019] The technology also proposes the protection of synthetic peptide as well as its use and the use of the kit for the diagnosis of leishmaniasis.
[020] A presente invenção pode ser melhor compreendida, mas de modo não limitante, com os exemplos a seguir.[020] The present invention may be better understood, but not limited to, by the following examples.
Exemplo 1 - Identificação in silico de epitopos lineares de células BExample 1 - In silico identification of linear B cell epitopes
[021] Inicialmente, epitopos lineares de célula B foram preditos em todo o proteoma da cepa M2904 de Leishmania braziliensis utilizando o programa BepiPred (Larsen JE, Lund O e Nielsen M. Immunome Res. 2006 Apr 24;2:2). Nesta análise foi utilizada uma abordagem conservativa com valor de corte igual a 1,3 que fornece 96% de especificidade e 13% de sensibilidade, minimizando a seleção de muitos epitopos falso-positivos. Sequências com o somatório dos scores de polimorfismo acima de 6 e score médio de predição do Bepipred acima de 1,3 foram consideradas como epitopos polimórficos. Sequências de 15 aminoácidos com score médio de predição de epitopo igual entre as duas sequências e acima de 1,3 e score de polimorfismo igual a zero foram considerados epitopos conservados. Para minimizar a chance de reação cruzada com outros parasitos filogeneticamente relacionados, sequências de peptídeos com alta similaridade com proteínas de outros parasitos foram identificadas utilizando o algoritmo BLAST (Altschul SF et al. J Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-10) e descartadas. A versão do algoritmo denominada blastp foi utilizada para comparar epitopos polimórficos e conservados com o proteoma predito de L. braziliensis, L. infantum, H. sapiens, C. familiaris e T. cruzi. Epitopos com mais de 70% de identidade ao longo de mais de 70% da sequência foram eliminados das análises subsequentes.Initially, linear B-cell epitopes were predicted throughout the Leishmania braziliensis strain M2904 proteome using the BepiPred program (Larsen JE, Lund O and Nielsen M. Immunome Res. 2006 Apr 24; 2: 2). In this analysis we used a conservative approach with a cutoff value of 1.3 that provides 96% specificity and 13% sensitivity, minimizing the selection of many false positive epitopes. Sequences with the sum of polymorphism scores above 6 and mean Bepipred prediction score above 1.3 were considered as polymorphic epitopes. 15 amino acid sequences with mean epitope prediction score between the two sequences and above 1.3 and zero polymorphism score were considered conserved epitopes. To minimize the chance of cross-reacting with other phylogenetically related parasites, peptide sequences with high protein similarity to other parasites were identified using the BLAST algorithm (Altschul SF et al. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215 (3): 403 -10) and discarded. The blastp version of the algorithm was used to compare polymorphic and conserved epitopes with the predicted proteome of L. braziliensis, L. infantum, H. sapiens, C. familiaris and T. cruzi. Epitopes with more than 70% identity over more than 70% sequence were eliminated from subsequent analyzes.
[022] Avaliando os dados obtidos, foi identificado um peptídeo presente na (MAPK), avaliando o proteoma predito de Leishmania braziliensis, com potencial uso para imunodiagnóstico das leishmanioses. Na Figura 1 está demonstrada a análise por imunoinformática do peptídeo-1 (DPAEEADAP), localizado na MAPK, no cromossomo 19, que apresenta score de predição para epitópo de linfócitos B de 1,88. O peptídeo foi sintetizado em fase sólida para posteriomente ser analisado o desempenho como antígeno para imunodiagnóstico das leishmanioses.[022] Evaluating the data obtained, a peptide present in (MAPK) was identified, evaluating the predicted Leishmania braziliensis proteome, with potential use for leishmaniasis immunodiagnosis. Figure 1 shows the immunoinformatic analysis of peptide-1 (DPAEEADAP), located in MAPK, on chromosome 19, which has a prediction score for B lymphocyte epitope of 1.88. The peptide was synthesized in solid phase for later performance analysis as an antigen for leishmaniasis immunodiagnosis.
Exemplo 2: Síntese do peptídeo solúvel [023] O peptídeo selecionado foi sintetizado em fase sólida pelo método de N-9-fluorenilmetoxicarbonil (Wellings DA e Atherton E. Methods Enzymol. 1997;289:44-67) na escala de 20-30 umol. Fmoc-aminoácidos foram ativados por 30-60 minutos com 1 equivalente de HObt (1-Hidroxibenzotriazol) e 2 equivalentes de DIC (diisopropilcarbodiimida). Após este tempo, os aminoácidos ativados foram colocados em contato com a resina Rink amidada com grau de substituição de 0,61 por 45-60 minutos. Os grupos Fmoc foram então removidos com solução de 4-metilpiperidina 25%. A ativação, incorporação na resina e desproteção do grupo Fmoc foram então repetidas até síntese completa da cadeia dos peptídeos. Após a síntese, os peptídeos foram clivados da resina juntamente com a desproteção da cadeia lateral com uma mistura contendo 9,4% de TFA, 2,4% de água e 0,1% de triisopropilsilano. O peptídeo foi precipitado do material bruto com éter diisopropílico por 16 horas a 4 °C, seguido de centrifugação a 3000 G por 5-10 minutos. Os peptídeos sintetizados, Peptídeo-1 (SEQ ID N°1 - DPAEEADAP), foram purificados por cromatografia em fase reversa utilizando-se a coluna Sephasil Peptide C18 (Shimadzu) acoplada a sistema de HPLC (Shimadzu) utilizando-se gradiente de 0 a 25% de acetonitrila durante 75-90 minutos com 0-10 minutos até 10% de acetonitrila. Após a purificação, o peptídeo foi submetido à espectrometria de massa em equipamento Autoflex Speed MALDI/TOF (Bruker) para confirmação de sua massa molecular.Example 2: Synthesis of Soluble Peptide The selected peptide was synthesized in solid phase by the N-9-fluorenylmethoxycarbonyl method (Wellings DA and Atherton E. Methods Enzymol. 1997; 289: 44-67) in the 20-30 scale. umol. Fmoc-amino acids were activated for 30-60 minutes with 1 equivalent of HObt (1-Hydroxybenzotriazole) and 2 equivalents of DIC (diisopropylcarbodiimide). After this time, the activated amino acids were placed in contact with the 0.61 substitution grade amidated Rink resin for 45-60 minutes. The Fmoc groups were then removed with 25% 4-methylpiperidine solution. Activation, incorporation into the resin and deprotection of the Fmoc group were then repeated until complete synthesis of the peptide chain. After synthesis, the peptides were cleaved from the resin along with side chain deprotection with a mixture containing 9.4% TFA, 2.4% water and 0.1% triisopropylsilane. The peptide was precipitated from the crude material with diisopropyl ether for 16 hours at 4 ° C, followed by centrifugation at 3000 G for 5-10 minutes. The synthesized peptides Peptide-1 (SEQ ID NO: 1 - DPAEEADAP) were purified by reverse phase chromatography using the Sephasil Peptide C18 (Shimadzu) column coupled to the HPLC system (Shimadzu) using 0 to 25% acetonitrile for 75-90 minutes with 0-10 minutes to 10% acetonitrile. After purification, the peptide was subjected to mass spectrometry in Autoflex Speed MALDI / TOF (Bruker) equipment to confirm its molecular mass.
Exemplo 3 - Validação do Peptídeo-1 frente a soro de indivíduos portadores de LTH, LVH e cães portadores de LVCExample 3 - Validation of Peptide-1 against serum from individuals with LTH, LVH, and dogs with LVC
[024] Ensaios de ELISA foram realizados para validar e caracterizar a reatividade do peptídeo-1 frente a parasitos do gênero Leishmania. A técnica de ELISA foi escolhida na presente invenção por ser menos invasiva, de fácil execução e automação, permitindo estudos e aplicação em grande número de amostras.[024] ELISA assays were performed to validate and characterize peptide-1 reactivity to Leishmania parasites. The ELISA technique was chosen in the present invention because it is less invasive, easy to perform and automate, allowing studies and application in large number of samples.
[025] Foram testados soros de indivíduos portadores de LTH, LVH e cães portadores de LVC. Os ensaios foram realizados em placas PVC flexíveis de 96 poços (Costar) para peptídeo-1. Nesta etapa, cada poço foi sensibilizado com 2-10 pg de peptídeo sintético e em seguida a placa foi bloqueada com PBS acrescido de 1,0-5,0% de BSA durante 30-60 minutos, a 25-37°C. Após o bloqueio, toda a solução dos poços foi removida por aspiração. A seguir, 50-100 pL dos soros diluídos 1:100 em PBS com 1,0-2,5% de BSA foram adicionados aos poços e incubados a 25-37°C por 30-60 minutos. As placas foram lavadas 4 vezes com a solução de lavagem (PBS-0,05% Tween20) e, em seguida, foi adicionado aos poços 50-100 pL do anticorpo anti-lgG humano ou canino diluído 1:5000 em PBS-BSA 1,0-2,5%. Após incubação a 37°C por 30-60 minutos, as placas foram novamente lavadas por quatro vezes com a solução de lavagem, e 100 pL da solução reveladora, contendo ácido cítrico 0,1 M, Na2P04 0,2 Μ, TMB 0,05% e H202 0,1%, foram adicionados. As placas foram incubadas a 25-37°C ao abrigo de luz por 10 a 30 minutos com a solução reveladora, quando a reação foi interrompida pela adição de 50-100 pL de H2S04 2M. A absorbância resultante foi lida em leitor de ELISA a 450 nm. Os valores obtidos pela ELISA utilizando peptídeo-1 para diagnóstico da LTH e LVH foram comparados a ELISA utilizando antígeno solúvel de L. braziliensis (AgSLb) que é comumente utilizado para diagnóstico sorológico das leishmanioses. Para ELISA utilizando Peptídeo-1 para diagnóstico da LVC, os valores foram comparados com o teste de referência atualmente recomendado pelo Ministério da Saúde do Brasil, EIE-LVC Kit (Biomanguinhos, FIOCRUZ).Sera from individuals with LTH, LVH and dogs with LVC were tested. Assays were performed on 96-well flexible PVC plates (Costar) for peptide-1. At this stage each well was sensitized with 2-10 pg synthetic peptide and then the plate was blocked with PBS plus 1.0-5.0% BSA for 30-60 minutes at 25-37 ° C. After blockage, all solution from the wells was removed by aspiration. Then 50-100 µl of the sera diluted 1: 100 in PBS with 1.0-2.5% BSA were added to the wells and incubated at 25-37 ° C for 30-60 minutes. The plates were washed 4 times with the wash solution (PBS-0.05% Tween20) and then 50-100 µl of the 1: 5000 human or canine anti-IgG antibody diluted 1: 5000 in PBS-BSA 1 was added to the wells. .0-2.5%. After incubation at 37 ° C for 30-60 minutes, the plates were again washed four times with the wash solution, and 100 µl of the developer solution containing 0.1 M citric acid, 0.2 Μ Na2P04, TMB 0, 05% and 0.1% H2 O were added. The plates were incubated at 25-37 ° C in the dark for 10 to 30 minutes with the developer solution when the reaction was stopped by the addition of 50-100 µl 2M H 2 SO 4. The resulting absorbance was read on an ELISA reader at 450 nm. ELISA values using peptide-1 for diagnosis of LTH and LVH were compared to ELISA using soluble L. braziliensis antigen (AgSLb) which is commonly used for serological diagnosis of leishmaniasis. For ELISA using Peptide-1 for diagnosis of CVL, the values were compared with the reference test currently recommended by the Brazilian Ministry of Health, EIE-LVC Kit (Biomanguinhos, FIOCRUZ).
[026] Na Tabela 1 está descrita a identidade no epitopo linear de linfócito B presente na sequência do gene MAPK entre as sequências de ortólogos de L. infantum, agente causador da. LV, do parasito T. cruzi, e entre as sequências dos hospedeiros H. sapiens e C. familiaris.Table 1 describes the identity in the linear epitope of B lymphocyte present in the MAPK gene sequence among the ortholog sequences of L. infantum, causative agent of. LV of the T. cruzi parasite and between the sequences of the hosts H. sapiens and C. familiaris.
Tabela 1: Identidade no epitopo linear de Linfócito B (peptídeo-1) presente no gene Mitogen-activated protein kinase de L. braziliensis.Table 1: Identity in the linear epitope of Lymphocyte B (peptide-1) present in the L. braziliensis Mitogen-activated protein kinase gene.
[027] Conforme apresentado, a sequência de L. infantum apresenta alta similaridade (88,90%) com a sequência de L. braziliensis, permitindo uso para diagnóstico múltiplo das leishmanioses. Em relação às sequências de T. cruzi, foi observado alta divergência (22,40%), fato que impede a reatividade cruzada com pacientes portadores de DC elevando os valores de especificidade. Em relação aos ortólogos dos hospedeiros H. sapiens (44,40%) e C. familiaris (44,40%), foi observado também alta divergência com estas sequências, fato que permite que os valores de sensibilidade sejam elevados. Esse fato aumenta a probabilidade de reconhecer indivíduos infectados, já que não tem similaridade com antígenos próprios do hospedeiro.[027] As presented, the sequence of L. infantum has high similarity (88.90%) with the sequence of L. braziliensis, allowing use for multiple diagnosis of leishmaniasis. Regarding T. cruzi sequences, a high divergence (22.40%) was observed, which prevents cross-reactivity with patients with CD, increasing the specificity values. Regarding the orthologs of the hosts H. sapiens (44.40%) and C. familiaris (44.40%), a high divergence with these sequences was also observed, which allows the sensitivity values to be high. This fact increases the likelihood of recognizing infected individuals, as it has no similarity to the host's own antigens.
[028] Avaliando os dados descritos na Figura 2, a ELISA utilizando o Peptídeo-1 apresentou excelente desempenho e maior capacidade simultânea de detectar resultados positivos para LTH (forma cutânea e muco-cutânea) e negativos (indivíduos controles e portadores da Doença de Chagas), avaliados pela sensibilidade e especificidade (Peptídeo-1: Se=98,46% e Ep=95,71%; AgSLb: Se=70,77% e Ep-68,57%, dados apresentados na Tabela 2), quando comparada aos testes diagnósticos disponíveis no mercado.[028] Evaluating the data described in Figure 2, the ELISA using Peptide-1 showed excellent performance and increased simultaneous ability to detect positive LTH (cutaneous and mucocutaneous form) and negative (Chagas disease control and carriers) results. ), evaluated by sensitivity and specificity (Peptide-1: Se = 98.46% and Ep = 95.71%; AgSLb: Se = 70.77% and Ep-68.57%, data presented in Table 2), when compared to commercially available diagnostic tests.
Tabela 2: Performance de diagnóstico em amostras de soro de indivíduos portadores de LTH, LVH e cães portadores de LVC utilizando o Peptídeo-1 e AgSLb.Table 2: Diagnostic performance in serum samples from individuals with LTH, LVH, and dogs with LVC using Peptide-1 and AgSLb.
Parâmetros foram calculados utilizando todas as amostras apresentadas neste trabalho para LT (CT+DC+LC+LM, n=135), VL (CT+DC+LV, n=125) e LVC (CT+DC+LVC, n=75). Abreviações: LTH: Leishmaniose Tegumentar Humana; LVH: Leishmaniose Visceral Humana; LVC: Leishmaniose Visceral Canina; Se: sensibilidade; Ep: especificidade; IC: intervalo de confiança; VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo; AC: acurácia. * Cut-off obtido pela curva ROC. * Cut-off obtido de acordo com o fabricante.Parameters were calculated using all samples presented in this work for LT (CT + DC + LC + LM, n = 135), VL (CT + DC + LV, n = 125) and LVC (CT + DC + LVC, n = 75). ). Abbreviations: LTH: Human Cutaneous Leishmaniasis; LVH: Human Visceral Leishmaniasis; LVC: Canine Visceral Leishmaniasis; Se: sensitivity; Ep: specificity; CI: confidence interval; PPV: positive predictive value; NPV: negative predictive value; AC: accuracy. * Cut-off obtained by the ROC curve. * Cut-off obtained according to the manufacturer.
[029] Conforme descrito na Tabela 2, os resultados dos valores preditivos positivos (VPP) e negativos (VPN) apresentaram-se elevados (Peptídeo-1: VPP=95,52% e VPN=98,53%; AgSLb: VPP=67,65% e VPN=71,64%), assim como a acurácia (Peptídeo-1: AC=97,04%; AgSLb: AC=69,63%), comparado a ELISA AgSLb, sendo assim, a probabilidade de um resultado positivo ou negativo obtido pelo teste ser verdadeiro é elevado, classificando como uma excelente opção para diagnóstico da LTH. Avaliando a área abaixo da curva (AUC)(Tabela 3), observou-se que o teste utilizando Peptídeo-1 apresentou elevada AUC comparado a AgSLb (Peptídeo-1: AUC=0,989; AgSLb: AUC=0,753), indicando que náo houve incidência significativa de resultados falsos positivos e falsos negativos, sendo então, eficiente em discriminar indivíduos doentes de sadios.[029] As described in Table 2, the results of positive (PPV) and negative (NPV) predictive values were high (Peptide-1: PPV = 95.52% and NPV = 98.53%; AgSLb: PPV = 67.65% and NPV = 71.64%), as well as the accuracy (Peptide-1: AC = 97.04%; AgSLb: AC = 69.63%), compared to the AgSLb ELISA, thus, the probability of A positive or negative result obtained by the test being true is high, classifying it as an excellent option for diagnosing LTH. Evaluating the area under the curve (AUC) (Table 3), it was observed that the test using Peptide-1 showed high AUC compared to AgSLb (Peptide-1: AUC = 0.989; AgSLb: AUC = 0.753), indicating that there was no a significant incidence of false positive and false negative results, thus being efficient in discriminating sick and healthy individuals.
[030] Avaliando os dados descritos na Figura 3, a ELISA utilizando o Peptídeo-1 apresentou excelente desempenho e maior capacidade simultânea de detectar resultados positivos para LVH e negativos (indivíduos controles e portadores da Doença de Chagas), avaliados pela sensibilidade e especificidade (Peptídeo-1: Se=90,91% e Ep=92,86%; AgSLb: Se=52,73% e Ep=50,00%, dados apresentados na Tabela 2), quando comparada aos testes diagnósticos disponíveis no mercado. Conforme descrito na Tabela 2, os resultados dos valores preditivos positivos (VPP) e negativos (VPN) apresentaram-se elevados (Peptídeo-1: VPP=90,91% e VPN=92,86%; AgSLb: VPP=45,31% e VPN=57,38%), assim como a acurácia (Peptídeo-1: AC=92,00%; AgSLb: AC=51,20%), comparado a ELISA AgSLb, sendo assim, a probabilidade de um resultado positivo ou negativo obtido pelo teste ser verdadeiro é elevado, classificando como uma excelente opçáo para diagnóstico da LVH. Avaliando a área abaixo da curva (AUC)(Tabela 3), observou-se que o teste utilizando Peptídeo-1 apresentou elevada AUC comparado a AgSLb (Peptídeo-1: AUC=0,968; AgSLb: AUC=0,510), indicando que não houve incidência significativa de resultados falsos positivos e falsos negativos, sendo então, eficiente em discriminar indivíduos doentes de sadios. Tabela 3: Análise da curva ROC obtida em amostras de soro de indivíduos portadores de LTH, LVH e cães portadores de LVC utilizando o Peptídeo-1.[030] Evaluating the data described in Figure 3, the ELISA using Peptide-1 showed excellent performance and greater simultaneous ability to detect LVH positive and negative results (control individuals and Chagas disease carriers), assessed for sensitivity and specificity ( Peptide-1: Se = 90.91% and Ep = 92.86%; AgSLb: Se = 52.73% and Ep = 50.00%, data presented in Table 2), when compared to commercially available diagnostic tests. As described in Table 2, the results of positive (PPV) and negative (NPV) predictive values were high (Peptide-1: PPV = 90.91% and NPV = 92.86%; AgSLb: PPV = 45.31). % and NPV = 57.38%), as well as the accuracy (Peptide-1: AC = 92.00%; AgSLb: AC = 51.20%), compared to the AgSLb ELISA, thus, the probability of a positive result or negative obtained by the test to be true is high, classifying as an excellent option for diagnosis of LVH. Evaluating the area under the curve (AUC) (Table 3), it was observed that the test using Peptide-1 showed high AUC compared to AgSLb (Peptide-1: AUC = 0.968; AgSLb: AUC = 0.510), indicating that there was no a significant incidence of false positive and false negative results, thus being efficient in discriminating sick and healthy individuals. Table 3: Analysis of the ROC curve obtained from serum samples from individuals with LTH, LVH, and dogs with LVC using Peptide-1.
Abreviações: LTH: Leishmaniose Tegumentar Humana; LVH: Leishmaniose Visceral Humana; LVC: Leishmaniose Visceral Canina; AUC: área abaixo da curva; IC: intervalo de confiança. * Cut-off obtido pela curva ROC. * Cut off obtido de acordo com o fabricante.Abbreviations: LTH: Human Cutaneous Leishmaniasis; LVH: Human Visceral Leishmaniasis; LVC: Canine Visceral Leishmaniasis; AUC: area below the curve; CI: confidence interval. * Cut-off obtained by the ROC curve. * Cut off obtained according to the manufacturer.
[031] Avaliando os dados descritos na Figura 4, a ELISA utilizando o Peptídeo-1 apresentou excelente desempenho na capacidade simultânea de detectar resultados positivos para LVC e negativos (indivíduos controles e portadores da Doença de Chagas), avaliados pela sensibilidade e especificidade (Peptídeo-1: Se=93,33% e Ep=77,78%; EIE-LVC kit: Se=100,00% e Ep=53,33%; dados apresentados na Tabela 2). Conforme descrito na Tabela 2, o resultado dos valores preditivos positivos (VPP) e negativo (VPN) apresentou elevado (Peptídeo-1: VPP=73,68% e VPN=94,59%; EIE-LVC kit: VPP=58,82% e VPN=100,00%), assim como a acurácia (Peptídeo-1: AC=84,00%; Peptídeo-1: AC=72,00%), sendo assim, a probabilidade de um resultado positivo ou negativo obtido pelo teste ser verdadeiro é elevado, classificando como uma excelente opçáo para diagnóstico da LVC. Avaliando a área abaixo da curva (AUC)(Tabela 3), observou-se que o teste utilizando Peptídeo-1 apresentou elevada AUC (Peptídeo-1: AUC=0,883), indicando que não houve incidência significativa de resultados falsos positivos e falsos negativos, sendo então, eficiente em discriminar indivíduos doentes de sadios.[031] Evaluating the data described in Figure 4, ELISA using Peptide-1 showed excellent performance in the ability to simultaneously detect positive and negative results (controls and Chagas disease carriers), evaluated for sensitivity and specificity (Peptide-1). -1: Se = 93.33% and Ep = 77.78%; EIE-LVC kit: Se = 100.00% and Ep = 53.33% (data shown in Table 2). As described in Table 2, the result of positive (PPV) and negative (NPV) predictive values was high (Peptide-1: PPV = 73.68% and NPV = 94.59%; EIE-LVC kit: PPV = 58, 82% and NPV = 100.00%), as well as the accuracy (Peptide-1: AC = 84.00%; Peptide-1: AC = 72.00%), thus the probability of a positive or negative result obtained by the test to be true is high, classifying as an excellent option for diagnosis of CVL. Evaluating the area under the curve (AUC) (Table 3), it was observed that the test using Peptide-1 showed high AUC (Peptide-1: AUC = 0.883), indicating that there was no significant incidence of false positive and false negative results. being efficient in discriminating sick individuals from healthy ones.
[032] O ganho de sensibilidade obtido com o Peptídeo-1 se dá, possivelmente, por apresentar epitopos com alta imunogenicidade e polimórficos, conforme descrito na Figura 1, fato que é importante para realizar o correto diagnóstico das leishmanioses possibilitando o tratamento de humanos infectados pela leishmaniose (LTH e LVH). Adicionalmente, o correto diagnóstico é importante para prevenir a manutenção de cães infectados (LVC) em áreas endêmicas e evitar o sacrifício desnecessário de animais por limitações na especificidade do teste devido à infecção por outros microrganismos, resultando em resultados falsos positivos, comumente observados em testes de diagnósticos que utilizam antígeno bruto do parasito. Avaliando a alta capacidade de detectar infecções causadas por diferentes espécies de Leishmania, os dados permitem concluir pela validade das reações sorológicas utilizando o Peptídeo-1 para imunodiagnóstico com elevada acurácia das leishmanioses tegumentar e visceral humana e canina.[032] The sensitivity gain obtained with Peptide-1 is possibly due to its high immunogenicity and polymorphic epitopes, as described in Figure 1, a fact that is important for the correct diagnosis of leishmaniasis allowing the treatment of infected humans. by leishmaniasis (LTH and LVH). Additionally, correct diagnosis is important to prevent the maintenance of infected dogs (CVL) in endemic areas and to avoid unnecessary animal sacrifice due to limitations in test specificity due to infection by other microorganisms, resulting in false positive results commonly observed in tests. of diagnoses using crude parasite antigen. Evaluating the high ability to detect infections caused by different species of Leishmania, the data allow us to conclude that the serological reactions are valid using Peptide-1 for high accuracy immunodiagnosis of human and canine tegumentary and visceral leishmaniasis.
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