BR102014013193A2

BR102014013193A2 - Method and Kit for Diagnosing Leishmaniasis Using Synthetic Peptides Derived from the Mitogen-Activated Protein Kinase 3 Encoding Gene (Putative)

Info

Publication number: BR102014013193A2
Application number: BR102014013193A
Authority: BR
Inventors: Daniel Menezes Souza; Daniella Castanheira Bartholomeu; Ricardo Toshio Fujiwara; Tiago Antônio De Oliveira Mendes
Original assignee: Univ Minas Gerais
Priority date: 2014-05-30
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2019-02-26

Abstract

método e kit para diagnóstico das leishmanioses utilizando peptídeos sintéticos derivados do gene codificador da proteína quinase ativada por mitógeno 3 (putativa). a presente invenção descreve peptideos, um método e kit para imunodiagnóstico das ieishmanioses, doença causada por protozoários do gênero leishmania, seja a infecção e/ou a doença, em seres humanos e/ou cães. a invenção trata da síntese e uso do peptídeo-1 derivados de epitopos de célula b na identificação de individuos e animais infectados por ieishmaniose visceral e tegumentar, visando o desenvolvimento de um método diagnóstico e um kit diagnótico com maior especificidade, permitindo o aperfeiçoamento da reatividade dos testes sorológicos.Method and kit for diagnosis of leishmaniasis using synthetic peptides derived from the gene coding for mitogen-activated protein kinase 3 (putative). The present invention describes peptides, a method and kit for immunodiagnosis of ieishmaniasis, a disease caused by protozoa of the genus leishmania, either infection and / or disease, in humans and / or dogs. The invention deals with the synthesis and use of peptide-1 derived from B-cell epitopes to identify individuals and animals infected with visceral and integumentary ieishmaniasis, aiming at the development of a more specific diagnostic method and diagnostic kit, allowing the improvement of reactivity. of serological tests.

Description

“MÉTODO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DAS LEISHMANIOSES UTILIZANDO PEPTÍDEOS SINTÉTICOS DERIVADOS DO GENE CODIFICADOR DA PROTEÍNA QUINASE ATIVADA POR MITÓGENO 3 (PUTATIVA)” [001] A presente invenção descreve peptídeos derivados da proteína quinase ativada por mitógeno 3 (Putativa), um método e Kit para ímunodiagnóstico das leishmanioses, doença causada por protozoários do gênero Leishmania, seja a infecção e/ou a doença, em seres humanos e/ou cães. A invenção trata-se da síntese e uso destes peptídeos na identificação de indivíduos e animais infectados pela leishmaniose visceral e tegumentar, visando o desenvolvimento de um método e um Kit diagnóstico com maior sensibilidade e especificidade, permitindo o aperfeiçoamento da reatividade dos testes sorológicos. [002] Em parasites do gênero Leishmania, aproximadamente 2% do genoma é constituído de proteínas quinases com número em torno de 200 genes, fato que sugere que esta família de genes está associada a uma grande demanda de processos dependente de fosforilação de proteínas nestes parasites (Parsons, M. et al. BMC Genomics. 2005; 6: 127). As proteínas quinases ativadas por mitógenos representam uma família de serina-treonina quinases envolvidas na regulação de uma ampla variedade de respostas celulares (Cross, T. et ai. Serine/threonine protein kinases and apoptosis. Experimental Cell Research. 2000; 256: 34-41). Essas proteínas transmitem sinais extracelulares captados por receptores de membrana após variados estímulos, inclusive estresse e, através da fosforilação de substratos específicos em resíduos de serina e treonina (SU, B. et ai. Mitogen-activated protein kinase cascades and regulation of gene expression. Current Opinion in Immunology. 1996; 8: 402-11), essas enzimas podem regular positiva ou negativamente o substrato, modulando, assim, a expressão gênica, mitose, motilidade, metabolismo, proliferação, diferenciação, sobrevivência, interrupção do ciclo celular e apoptose (Wada, T. et ai. Mitogen-activated protein kinases in apoptosis regulation. Oncogene. 2004; 23, 2838-49). [003] As leishmanioses englobam um complexo grupo de doenças parasitárias causada por parasites do gênero Leishmania com estimativas de que cerca de 12 milhões de pessoas estejam infectadas, com uma incidência anual de 1-1,5 milhões de casos de Ieishmaniose tegumentar e 500.000 casos de leishmaniose visceral (Desjeux P et ai Comp Immunol Microbiol infect Dis. 2004 Sep; 27(5): 305-18). [004] Na busca de novos alvos para diagnósticos, análises de epitopos antigênicos de proteínas de microrganismos patogênicos têm ampliado o número de epitopos-alvo e dado indícios para melhorar a antigenicidade de peptídeos. Entre os métodos proteômicos de seleção, mapeamento de epitopos é um procedimento muito útil, que tem vastas aplicações na área de produção de anticorpos, imunodiagnóstico, design de vacinas baseado em epitopos, seletiva de-imunização de proteínas terapêuticas e associadas a doenças autoimunes. A identificação desses alvos foi facilitada pela publicação do genoma dos parasitos em conjunto com a disponibilidade de algoritmos para predição de epitopos, que permite a utilização em larga escala de abordagens para a identificação de novos antígenos (Bryson CJ et ai BioDrugs. 2010; 24 (1):1-8). [005] No estado da técnica foram encontrados documentos de patente que sugerem o uso de peptídeos no diagnóstico de ieishmanioses, como exemplos, os documentos PI1020120335522 e PI1320120335599 que descrevem o uso de polipeptídeos derivados do proteoma de Leishmania infantum para o diagnóstico da infecção. No entanto, todos os documentos encontrados no estado da técnica, dentre os quais se encontram os acima citados, apresentam proteínas e peptídeos diferenciados dos apresentados nessa invenção e, ainda, não permitem um diagnóstico tão eficaz, através do qual se faz a distinção de outras infecções causadas por parasitos presentes em áreas endêmicas para leishmaniose tegumentar e visceral humana e leishmaniose visceral canina, como a espécie de protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, como na presente tecnologia. Além do mais, não está descrito na literatura métodos que fazem diagnóstico da forma tegumentar e visceral, humana e canina, utilizando mesmo antígeno mapeado no proteoma de parasitos do gênero Leishmania. Assim, apesar dos avanços obtidos nos últimos anos, os métodos de diagnóstico disponíveis das leishmanioses ainda possuem diversas limitações. Além disso, na ausência de métodos de diagnóstico efetivos, a eficiência do tratamento e de qualquer iniciativa de bloqueio da transmissão ou vacinação fica comprometida (Ministério da Saúde. Doenças Infecciosas e Parasitárias: guia de bolso. Brasília. 2006). [006] Apesar da extensiva busca em desenvolver imunobiológicos para testes de diagnósticos mais sensíveis e específicos contra leishmanioses, ainda são necessárias melhorias na eficácia destes métodos em diagnosticar a doença em todos hospedeiros envolvidos no ciclo de vida do parasito. Assim, a presente invenção apresenta uma alternativa para solucionar este problema. Trata-se de peptídeos sintéticos desenhados a partir de epitópos de linfócitos B preditos por imunoinformática no gene codificador da proteína quinase ativada por mitógeno 3 (putativa), de L. braziliensis e o uso dos mesmos em método e kit para diagnosticar leishmanioses em cães e/ou humanos."METHOD AND KIT FOR DIAGNOSTIC DIAGNOSIS OF LEISHMANIOSIS USING SYNTHETIC PEPTIDES FROM THE MITOGEN-ENABLED PROTEIN KINASE ENCODING KINASE (PUTATIVE)" [001] The present invention describes peptides derived from the Put Activated Protein Kinase Method 3 for immunodiagnosis of leishmaniasis, a disease caused by protozoa of the genus Leishmania, either infection and / or disease, in humans and / or dogs. The invention deals with the synthesis and use of these peptides in the identification of individuals and animals infected with visceral and cutaneous leishmaniasis, aiming at the development of a diagnostic method and kit with greater sensitivity and specificity, allowing the improvement of the reactivity of serological tests. In parasites of the genus Leishmania, approximately 2% of the genome consists of protein kinases numbering around 200 genes, suggesting that this gene family is associated with a high demand for protein-dependent processes in these parasites. (Parsons, M. et al. BMC Genomics. 2005; 6: 127). Mitogen-activated protein kinases represent a family of serine-threonine kinases involved in the regulation of a wide variety of cellular responses (Cross, T. et al. Serine / threonine protein kinases and apoptosis. Experimental Cell Research. 2000; 256: 34- 41). These proteins transmit extracellular signals captured by membrane receptors after various stimuli, including stress, and by phosphorylation of specific substrates on serine and threonine residues (SU, B. et al. Mitogen-activated protein kinase cascades and regulation of gene expression. Current Opinion in Immunology 1996; 8: 402-11), these enzymes can positively or negatively regulate the substrate, thereby modulating gene expression, mitosis, motility, metabolism, proliferation, differentiation, survival, cell cycle arrest, and apoptosis. (Wada, T. et al. Mitogen-activated protein kinases in apoptosis regulation. Oncogene. 2004; 23, 2838-49). Leishmaniasis encompasses a complex group of parasitic diseases caused by parasites of the genus Leishmania with estimates that about 12 million people are infected, with an annual incidence of 1-1.5 million cases of cutaneous leishmaniasis and 500,000 cases. of visceral leishmaniasis (Desjeux P et al Comp Immunol Microbiol infect Dis. 2004 Sep; 27 (5): 305-18). [004] In the search for new diagnostic targets, analyzes of antigenic epitopes of pathogenic microorganism proteins have increased the number of target epitopes and provided evidence to improve peptide antigenicity. Among proteomic selection methods, epitope mapping is a very useful procedure that has wide applications in the field of antibody production, immunodiagnosis, epitope-based vaccine design, selective protein de-immunization and associated autoimmune diseases. Identification of these targets has been facilitated by the publication of the parasite genome in conjunction with the availability of epitope prediction algorithms, which allows for the large-scale use of novel antigen identification approaches (Bryson CJ et al BioDrugs. 2010; 24 ( 1): 1-8). In the prior art patent documents have been found suggesting the use of peptides in the diagnosis of ieishmaniasis, as examples PI1020120335522 and PI1320120335599 describing the use of Leishmania infantum proteome derived polypeptides for the diagnosis of infection. However, all the documents found in the state of the art, among which are the ones mentioned above, present differentiated proteins and peptides from those presented in this invention and, still, do not allow such an efficient diagnosis, by which one distinguishes them from other ones. infections caused by parasites present in endemic areas for human cutaneous and visceral leishmaniasis and canine visceral leishmaniasis, such as the protozoan species Trypanosoma cruzi, an etiological agent of Chagas disease, as in the present technology. Furthermore, methods that diagnose the human and canine integumentary and visceral forms using the same antigen mapped on the Leishmania parasite proteome are not described in the literature. Thus, despite advances in recent years, the available diagnostic methods for leishmaniasis still have several limitations. Moreover, in the absence of effective diagnostic methods, the effectiveness of treatment and any initiative to block transmission or vaccination is compromised (Ministry of Health. Infectious and Parasitic Diseases: pocket guide. Brasília. 2006). Despite extensive efforts to develop immunobiologicals for more sensitive and specific diagnostic tests against leishmaniasis, improvements in the effectiveness of these methods in diagnosing the disease in all hosts involved in the parasite life cycle are still needed. Thus, the present invention provides an alternative to solve this problem. These are synthetic peptides designed from B lymphocyte epitopes predicted by immunoinformatics in the L. braziliensis mitogen-activated protein kinase 3 (putative) coding gene and their use in a method and kit to diagnose leishmaniasis in dogs and / or humans.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [007] FIGURA 1 - A FIGURA 1 apresenta a análise por imunoinformática do gene codificador da proteína quinase ativada por mitógeno 3 (putativa) e do peptídeo-1 (VGGGNSKNG/ SEQ ID N°1), localizado no cromossomo 10, que apresenta score de predição para epitópo de linfócitos B de 1,56 com score de desordem estrutural de 0,73. [008] FIGURA 2 - A FIGURA 2 apresenta gráficos comparativos referentes à reatividade humoral contra o peptídeo-1 (SEQ ID N°1) e contra o antígeno solúvel bruto da Leishmania braziliensis (AgSLb), em soro de indivíduos portadores da Leishmaniose Tegumentar Humana (LTH). O eixo X representa os grupos avaliados: indivíduos controle (CT, n=50), indivíduos portadores da Doença de Chagas (DC, n=20) indivíduos portadores da Leishmaniose Tegumentar Humana (LTH) forma clínica cutânea (LTH-C, n=45) e muco-cutânea (LTH-MC, n=20). O eixo Y representa os valores! médios de absorbância (450 nm) pela técnica de ELISA utilizando-se soros djluídos 1:100. *0 cut off foi estabelecido utilizando curva ROC. [009] FIGURA 3 - A FIGURA 3 apresenta gráficos comparativos referentes à reatividade humoral contra o peptídeo-1 e contra o antígeno solúvel bruto da Leishmania braziliensis (AgSLb), em soro de indivíduos portadores da Leishmaniose Visceral Humana (LVH). O eixo X representa os grupos avaliados: indivíduos controle (CT, n=50), indivíduos portadores da Doença de Chagas (DC, n=20) indivíduos portadores da Leishmaniose Visceral Humana (LVH, n=55). O eixo Y representa os valores médios de absorbância (450 nm) pela técnica de ELISA utilizando-se soros diluídos 1:100. *0 cut off foi estabelecido utilizando curva ROC. [010] FIGURA 4 - A FIGURA 4 apresenta gráficos comparativos- referentes à reatividade humoral na reação de ELISA utilizando o peptídeo-1 e o kit diagnóstico EIE-LVC em soro de cães portadores da Leishmaniose Visceral Canina (LVC). O eixo X representa os grupos avaliados: cães controle (CT, n=30), indivíduos portadores da Doença de Chagas (DC, n=15) indivíduos portadores da Leishmaniose Visceral Canina (LVC, n=30). O eixo Y representa os valores médios de absorbância (450 nm) pela técnica de ELISA utilizando-se soros diluídos 1:100. *0 cut off foi estabelecido utilizando curva ROC. [011] FIGURA 5 - A FIGURA 5 apresenta um gráfico comparando as curvas ROC obtidas da ELISA para Peptídeo-1 no imunodiagnóstico da LTH, LVH e LVC. Essas curvas foram utilizadas para determinar o cut off, sensibilidade (Se), especificidade (Ep) e área abaixo da curva (AUC) da técnica de ELISA. [012] FIGURA 6 - A FIGURA 6 apresenta gráficos comparativos referentes à reatividade humoral na reação de ELISA utilizando o peptídeo-1 e o kit diagnóstico EIE-LVC, em soro de cães imunizados com a vacina comercial Leishmune®. O eixo X representa os grupos avaliados utilizando dez indivíduos vacinados. O eixo Y representa os valores médios de absorbância (450 nm) pela técnica de ELISA utilizando-se soros diluídos 1:100. *0 cut off foi estabelecido utilizando curva ROC.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES [007] FIGURE 1 - FIGURE 1 shows immunoinformatic analysis of the gene encoding mitogen-activated protein kinase 3 (putative) and peptide-1 (VGGGNSKNG / SEQ ID NO: 1) located on chromosome 10 , which has a prediction score for B lymphocyte epitope of 1.56 with a structural disorder score of 0.73. [008] FIGURE 2 - FIGURE 2 presents comparative graphs relating to humoral reactivity against peptide-1 (SEQ ID NO: 1) and against crude soluble Leishmania braziliensis antigen (AgSLb) in serum of individuals with Human Tegumentary Leishmaniasis (LTH). The X axis represents the evaluated groups: control individuals (TC, n = 50), individuals with Chagas Disease (CD, n = 20) individuals with Human Tegumentary Leishmaniasis (LTH) cutaneous clinical form (LTH-C, n = 45) and mucocutaneous (LTH-MC, n = 20). The Y axis represents the values! absorbance (450 nm) by ELISA using 1: 100 diluted sera. * Cut off was established using ROC curve. [009] FIGURE 3 - FIGURE 3 presents comparative graphs relating to humoral reactivity against peptide-1 and crude soluble Leishmania braziliensis antigen (AgSLb) in serum from individuals with Human Visceral Leishmaniasis (LVH). The X axis represents the evaluated groups: control individuals (TC, n = 50), individuals with Chagas Disease (CD, n = 20) individuals with Human Visceral Leishmaniasis (LVH, n = 55). The Y axis represents the mean absorbance values (450 nm) by ELISA using diluted 1: 100 sera. * Cut off was established using ROC curve. [010] FIGURE 4 - FIGURE 4 presents comparative graphs relating to humoral reactivity in ELISA using peptide-1 and the EIE-LVC diagnostic kit in dogs with Canine Visceral Leishmaniasis (LVC) serum. The X axis represents the evaluated groups: control dogs (TC, n = 30), individuals with Chagas Disease (DC, n = 15) individuals with Canine Visceral Leishmaniasis (LVC, n = 30). The Y axis represents the mean absorbance values (450 nm) by ELISA using diluted 1: 100 sera. * Cut off was established using ROC curve. FIGURE 5 - FIGURE 5 is a graph comparing ROC curves obtained from ELISA for Peptide-1 in the immunodiagnosis of LTH, LVH, and LVC. These curves were used to determine the cut off, sensitivity (Se), specificity (Ep) and area below the curve (AUC) of the ELISA technique. [012] FIGURE 6 - FIGURE 6 presents comparative graphs relating to humoral reactivity in ELISA using peptide-1 and the EIE-LVC diagnostic kit in dog serum immunized with the commercial Leishmune® vaccine. The X axis represents the groups evaluated using ten vaccinated individuals. The Y axis represents the mean absorbance values (450 nm) by ELISA using diluted 1: 100 sera. * Cut off was established using ROC curve.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA [013] Na presente invenção foi identificado um peptídeo a partir da proteína quinase ativada por mitógeno 3 (putativa), derivada de um gene codificador do parasito causador da Doença de Chagas, T. cruzi que é conservado entre as diferentes espécies do gênero Leishmania, e polimórfico em relação aos hospedeiros humanos e caninos. . Esse peptíaeo é derivado de epitopo de célula B, consistindo da sequência representada pela SEQ ID N°1, modificado ou não em suas extremidades. A presente tecnologia visa contribuir para melhorar o sorodiagnóstico da Leishmaniose visceral canina e das Leishmanioses tegumentar e visceral humana. O método para imunodiagnóstico de leishmaniose pode ser selecionado do grupo compreedendo ELISA, Western blot, dot blot, imunodifusão, imunocromatografia e apresentar os seguintes passos: a) ligação de anticorpos antileishmaniais de uma amostra a pelo menos um polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos SEQ ID N° 1, ligado a um suporte sólido ou um carreador, preferencialmente partícula de ouro; b) contactar os anticorpos do passo (a) com um anticorpo secundário ou uma proteína (proteína A ou G), conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se ligam aos anticorpos do passo (a); sendo que as enzimas podem ser selecionadada do grupo compreedendo fosfatase alcalina, peroxidase, β-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase e o marcador pode ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes; c) detectar os anticorpos antileishmaniais na amostra supracitada pela detecção do anticorpo secundário ou proteína especificamente ligados ao dito anticorpo anti-leishmaníal. [014] O método pode ser realizado utilizando-se amostras de sangue, soro, plasma ou outro fluído corporal do animal ou humano infectado. [015] A tecnologia compreende ainda um Kit para teste imunodiagnóstico das leishmanioses que compreende o Peptídeo-1 consistindo da sequência SEQ ID N° 1 associado ou isolado e um anticorpo secundário ou uma proteína (proteína A ou G), onde o anticorpo secundário ou a proteína está conjugado a um enzima (como fosfatase alcalina, peroxidase, β-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase) ou marcador (como enzimas, redioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes) , e um reagente para detectar a dita enzima ou marcador. No Kit os peptídeos estarão ligados a um suporte sólido ou carreador, sendo que esse suporte sólido poderá ser de nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e poliestireno e o carreador consistir de partículas de ouro. [016] A técnica de ELISA foi escolhida na presente invenção por ser menos invasiva, de fácil execução e automação, permitindo estudos e aplicação em grande número de amostras. [017] A presente invenção pode ser melhor compreendida, mas de modo não limitante, com os exemplos a seguir.DETAILED DESCRIPTION OF THE TECHNOLOGY In the present invention a peptide was identified from the mitogen-activated protein kinase 3 (putative), derived from a gene encoding the Chagas disease parasite T. cruzi which is conserved among the different species. of the genus Leishmania, and polymorphic in relation to human and canine hosts. . This peptide is derived from cell B epitope, consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 1, whether or not modified at its ends. The present technology aims to contribute to improve the serodiagnosis of canine visceral leishmaniasis and human cutaneous and visceral leishmaniasis. The method for immunodiagnosis of leishmaniasis may be selected from the group comprising ELISA, Western blot, dot blot, immunodiffusion, immunochromatography and the following steps: a) binding of antileishmanial antibodies from a sample to at least one polypeptide consisting of the amino acid sequence SEQ ID No. 1 attached to a solid support or carrier, preferably gold particle; b) contacting the antibodies of step (a) with a secondary antibody or protein (protein A or G), conjugated to an enzyme or label and binding to the antibodies of step (a); wherein the enzymes may be selected from the group comprising alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase and the marker may be selected from the group comprising enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescent; c) detecting antileishmanial antibodies in the above sample by detecting the secondary antibody or protein specifically bound to said anti-leishmanial antibody. The method may be performed using samples of blood, serum, plasma or other body fluid from the infected animal or human. The technology further comprises a Leishmaniasis Immunodiagnostic Test Kit comprising Peptide-1 consisting of the sequence SEQ ID No. 1 associated or isolated and a secondary antibody or protein (protein A or G), where the secondary antibody or the protein is conjugated to an enzyme (such as alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase) or marker (such as enzymes, redioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescent), and a reagent to detect said enzyme or marker. In the Kit the peptides will be attached to a solid support or carrier, which solid support may be nitrocellulose, nylon, latex, polypropylene and polystyrene and the carrier consist of gold particles. [016] The ELISA technique was chosen in the present invention because it is less invasive, easy to perform and automate, allowing studies and application in large number of samples. [017] The present invention may be better understood, but not limited to, with the following examples.

Exemplo 1 - Identificação in silico de epitopos lineares de células B [018] Iniciaimente, epitopos lineares de célula B foram preditos em todo o proteoma da cepa M2904 de Leishmania braziliensis utilizando o programa BepiPred (Larsen JE, Lund O e Nielsen M. Immunome Res. 2006 Apr 24;2:2). Nesta análise foi utilizada uma abordagem conservativa com valor de corte igual a 1,3 que fornece 96% de especificidade e 13% de sensibilidade, minimizando a seleção de muitos epitopos falso-positivos. Sequências com o somatório dos scores de polimorfismo acima de 6 e score médio de predição do Bepipred acima de 1,3 foram consideradas como epitopos polimórficos. Sequências de 15 aminoácidos com score médio de predição de epitopo igual entre as duas sequências e acima de 1,3 e score de polimorfismo igual a zero foram considerados epitopos conservados. Para minimizar a chance de reação cruzada com outros parasitos filogeneticamente relacionados, sequências de peptídeos com alta similaridade com proteínas de outros parasitos foram identificadas utilizando o algoritmo BLAST (Altschul SF et at. J Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-10) e descartadas. A versão do algoritmo denominada blastp foi utilizada para comparar epitopos polimórficos e conservados com o proteoma predito de L braziliensis, L. infantum, H. sapiens, C. familiaris e T. cruzi. Epitopos com mais de 70% de identidade ao longo de mais de 70% da sequência foram eliminados das análises subsequentes. [019] Avaliando os dados obtidos, foi identificado um peptídeo presente na proteína quinase ativada por mitógeno 3 (putativa), avaliando o proteoma predito de Leishmania braziliensis, com potencial uso para imunodiagnóstico das leishmanioses. Na Figura 1 está demonstrada a análise por imunoinformática do peptídeo-1 (VGGGNSKNG), localizado na proteína quinase ativada por mitógeno 3 (putatuva), no cromossomo 10, que apresenta score de predição para epitópo de linfócitos B de 1,56 com score de desordem estrutural de 0,73. O peptídeo foi sintetizado em fase sólida para posteriomente ser analisado o desempenho como antígeno para imunodiagnóstico das leishmanioses.Example 1 - In silico identification of linear B-cell epitopes [018] Initially, linear B-cell epitopes were predicted throughout the Leishmania braziliensis M2904 strain proteome using the BepiPred program (Larsen JE, Lund O and Nielsen M. Immunome Res 2006 Apr 24; 2: 2). In this analysis we used a conservative approach with a cutoff value of 1.3 that provides 96% specificity and 13% sensitivity, minimizing the selection of many false positive epitopes. Sequences with the sum of polymorphism scores above 6 and mean Bepipred prediction score above 1.3 were considered as polymorphic epitopes. 15 amino acid sequences with mean epitope prediction score between the two sequences and above 1.3 and zero polymorphism score were considered conserved epitopes. To minimize the chance of cross-reacting with other phylogenetically related parasites, peptide sequences with high protein similarity to other parasites were identified using the BLAST algorithm (Altschul SF et al. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215 (3): 403 -10) and discarded. The blastp version of the algorithm was used to compare polymorphic and conserved epitopes with the predicted proteome of L. braziliensis, L. infantum, H. sapiens, C. familiaris and T. cruzi. Epitopes with more than 70% identity over more than 70% sequence were eliminated from subsequent analyzes. [019] Evaluating the data obtained, a peptide present in the putative mitogen-activated protein kinase 3 was identified, assessing the predicted Leishmania braziliensis proteome, with potential use for leishmaniasis immunodiagnosis. Figure 1 shows the immunoinformatic analysis of peptide-1 (VGGGNSKNG), located on mitogen-activated protein kinase 3 (putatuva), on chromosome 10, which has a prediction score for B lymphocyte epitope of 1.56 with a score of structural disorder of 0.73. The peptide was synthesized in solid phase for later performance analysis as an antigen for leishmaniasis immunodiagnosis.

Exemplo 2: Síntese do peptídeo solúvel [020]O peptídeo selecionado foi sintetizado em fase sólida pelo método de N-9-fluorenilmetoxicarbonil (Wellings DA e Atherton E. Methods Enzymol. 1997;289:44-67) na escala de 20-30 umol. Fmoc-aminoácidos foram ativados por 30-60 minutos com 1 equivalente de HObt (l-Hidroxibenzotriazol)e 2 equivalentes de DIC (diisopropilcarbodiimida). Após este tempo, os aminoácidos ativados foram colocados em contato com a resina Rink amidada com grau de substituição de 0,61 por 45-60 minutos. Os grupos Fmoc foram então removidos com solução de 4-metilpiperidina 25%. A ativação, incorporação na resina e desproteção do grupo Fmoc foram então repetidas até síntese completa da cadeia dos peptídeos. Após a síntese, os peptídeos foram clivados da resina juntamente com a desproteção da cadeia lateral com uma mistura contendo 9,4% de TFA, 2,4% de água e 0,1% de triisopropilsilano. O peptídeo foi precipitado do material bruto com éter diisopropílico por 16 horas a 4 °C, seguido de centrifugação a 3000 G por 5-10 minutos. Os peptídeos sintetizados, Peptídeo-1 (SEQ ID N°1 - VGGGNSKNG), foram purificados por cromatografia em fase reversa utilizando-se a coluna Sephasil Peptide C18 (Shimadzu) acoplada a sistema de HPLC (Shimadzu) utilizando-se gradiente de 0 a 25% de acetonitrila durante 75-90 minutos com 0-10 minutos até 10% de acetonitrila. Após a purificação, o peptídeo foi submetido à espectrometria de massa em equipamento Autoflex Speed: MALDl/TOF (Bruker) para confirmação de sua massa molecular.Example 2: Synthesis of Soluble Peptide The selected peptide was synthesized in solid phase by the N-9-fluorenylmethoxycarbonyl method (Wellings DA and Atherton E. Methods Enzymol. 1997; 289: 44-67) in the 20-30 scale. umol. Fmoc-amino acids were activated for 30-60 minutes with 1 equivalent of HObt (1-Hydroxybenzotriazole) and 2 equivalents of DIC (diisopropylcarbodiimide). After this time, the activated amino acids were placed in contact with the 0.61 substitution grade amidated Rink resin for 45-60 minutes. The Fmoc groups were then removed with 25% 4-methylpiperidine solution. Activation, incorporation into the resin and deprotection of the Fmoc group were then repeated until complete synthesis of the peptide chain. After synthesis, the peptides were cleaved from the resin along with side chain deprotection with a mixture containing 9.4% TFA, 2.4% water and 0.1% triisopropylsilane. The peptide was precipitated from the crude material with diisopropyl ether for 16 hours at 4 ° C, followed by centrifugation at 3000 G for 5-10 minutes. The synthesized peptides, Peptide-1 (SEQ ID NO: 1 - VGGGNSKNG), were purified by reverse phase chromatography using the Sephasil Peptide C18 (Shimadzu) column coupled to the HPLC system (Shimadzu) using a 0 through gradient. 25% acetonitrile for 75-90 minutes with 0-10 minutes to 10% acetonitrile. After purification, the peptide was subjected to mass spectrometry in Autoflex Speed: MALD1 / TOF (Bruker) equipment to confirm its molecular mass.

Exemplo 3 - Validação do Peptídeo-1 frente a soro de indivíduos portadores de LTH, LVH e cães portadores de LVC [021] Ensaios de ELISA foram realizados para validar e caracterizar a reatividade do peptídeo-1 frente a parasitos do gênero Leishmania. Foram testados soros de indivíduos portadores de LTH, LVH e cães portadores de LVC. Os ensaios foram realizados em placas PVC flexível de 96 poços (Costar) para peptídeo-1. Nesta etapa, cada poço foi sensibilizado com 2-10 pg de peptídeo sintético e em seguida a placa foi bloqueada com PBS acrescido de 1,0-5,0% de BSA durante 30-60 minutos, a 25-37°C. Após o bloqueio, toda a solução dos poços foi removida por aspiração. A seguir, 50-100 pL dos soros diluídos 1:100 em PBS com 1,0-2,5% de BSA foram adicionados aos poços e incubados a 25-37°C por 30-60 minutos. As placas foram lavadas 4 vezes com a solução de lavagem (PBS-0,05% Tween20) e, em seguida, foi adicionado aos poços 50-100 pL do anticorpo anti-lgG humano ou canino diluído 1:5000 em PBS-BSA 1,0-2,5%. Após incubação a 37°C por 30-60 minutos, as placas foram novamente lavadas por quatro vezes com a solução de lavagem, e 100 pL da solução reveladora, contendo ácido cítrico 0,1 M, Na2P04 0,2 Μ, TMB 0,05% e H202 0,1% foram adicionados. As placas foram incubadas a 25-37°C ao abrigo de luz por 10 a 30 minutos com a solução reveladora, quando a reação foi interrompida pela adição de 50-100 pL de H2S04 2M. A absorbância resultante foi lida em leitor de ELISA a 450 nm. Os valores obtidos pela ELISA utilizando peptídeo-1 para diagnóstico da LTH e LVH foram comparados a ELISA utilizando antígeno solúvel de L. braziliensis (AgSLb) que é comumente utilizado para diagnóstico sorológico das leishmanioses. Para ELISA utilizando Peptídeo-1 para diagnóstico da LVC, os valores foram comparados com o teste de referência atualmente recomendado pelo Ministério da Saúde do Brazil, ElE-LVC Kit (Biomanguinhos, FIOCRUZ).Example 3 - Validation of Peptide-1 against Serum from LTH, LVH, and LVC Dogs [021] ELISA assays were performed to validate and characterize peptide-1 reactivity to Leishmania parasites. Sera from individuals with LTH, LVH and dogs with LVC were tested. Assays were performed on 96-well flexible PVC plates (Costar) for peptide-1. At this stage each well was sensitized with 2-10 pg synthetic peptide and then the plate was blocked with PBS plus 1.0-5.0% BSA for 30-60 minutes at 25-37 ° C. After blockage, all solution from the wells was removed by aspiration. Then 50-100 µl of the sera diluted 1: 100 in PBS with 1.0-2.5% BSA were added to the wells and incubated at 25-37 ° C for 30-60 minutes. The plates were washed 4 times with the wash solution (PBS-0.05% Tween20) and then 50-100 µl of the 1: 5000 human or canine anti-IgG antibody diluted 1: 5000 in PBS-BSA 1 was added to the wells. .0-2.5%. After incubation at 37 ° C for 30-60 minutes, the plates were again washed four times with the wash solution, and 100 µl of the developer solution containing 0.1 M citric acid, 0.2 Μ Na2P04, TMB 0, 05% and 0.1% H2 O were added. The plates were incubated at 25-37 ° C in the dark for 10 to 30 minutes with the developer solution when the reaction was stopped by the addition of 50-100 µl 2M H 2 SO 4. The resulting absorbance was read on an ELISA reader at 450 nm. ELISA values using peptide-1 for diagnosis of LTH and LVH were compared to ELISA using soluble L. braziliensis antigen (AgSLb) which is commonly used for serological diagnosis of leishmaniasis. For ELISA using Peptide-1 for diagnosis of CVL, the values were compared with the reference test currently recommended by the Brazilian Ministry of Health, ElE-LVC Kit (Biomanguinhos, FIOCRUZ).

Na Tabela 1 está descrito a identidade no epitopo linear de linfócito B presente na sequência do gene da proteína quinase putativa mitógeno-ativada 3, entre as sequências de ortólogos de L. infantum, agente causador da LV, do parasito T. cruzi, e entre as sequências dos hospedeiros H. sapiens e C. familiarís.Table 1 describes the identity in the linear epitope of B lymphocyte present in the mitogen-activated putative protein kinase 3 gene sequence, between the sequences of L. infantum, causative agent of the LV, of the parasite T. cruzi, and between the host sequences H. sapiens and C. familiarís.

Tabela 1: Identidade no epitopo linear de Linfócito B (peptídeo-1) presente no gene da proteína quinase ativada por mitógeno 3 (putativa), de L. braziliensis. [022] Conforme apresentado, a sequência de L. infantum apresenta alta similaridade (66,70%) com a sequência de L. braziliensis, permitindo uso para diagnóstico múltiplo das leishmanioses. Em relação às sequências de T. cruzi, foi observado alta divergência (0,00% de identidade), fato que impede a reatividade cruzada com pacientes portadores de DC elevando os valores de especificidade. Em relação aos ortólogos dos hospedeiros H. sapiens (0,00% de identidade) e C. familiaris (0,00% de identidade), foi observado também alta divergência com estas sequências, fato que permite que os valores de sensibilidade sejam elevados. Esse fato aumenta a probabilidade de reconhecer indivíduos infectados, já que não tem similaridade com antígenos próprios do hospedeiro. [023] Avaliando os dados descritos na Figura 2, a ELISA utilizando o Peptídeo-1 apresentou excelente desempenho e maior capacidade simultânea de detectar resultados positivos para LTH (forma cutânea e muco-cutânea) e negativos (indivíduos controles e portadores da Doença de Chagas), avaliados pela sensibilidade e especificidade (Peptídeo-1: Se=98,46% e Ep=95,71%; AgSLb: Se=70,77% e Ep=68,57%, dados apresentados na Tabela 2), quando comparada aos testes diagnósticos disponíveis no mercado.Table 1: Identity in the linear epitope of lymphocyte B (peptide-1) present in the L. braziliensis mitogen-activated protein kinase 3 (putative) gene. [022] As presented, the sequence of L. infantum presents high similarity (66.70%) with the sequence of L. braziliensis, allowing use for multiple diagnosis of leishmaniasis. Regarding T. cruzi sequences, a high divergence (0.00% of identity) was observed, a fact that prevents cross-reactivity with CD patients by increasing specificity values. Regarding the orthologists of the hosts H. sapiens (0.00% identity) and C. familiaris (0.00% identity), a high divergence with these sequences was also observed, which allows the sensitivity values to be high. This fact increases the likelihood of recognizing infected individuals, as it has no similarity to the host's own antigens. [023] Evaluating the data described in Figure 2, the ELISA using Peptide-1 showed excellent performance and increased simultaneous ability to detect positive LTH (cutaneous and mucocutaneous form) and negative (Chagas disease control and carriers) results. ), evaluated for sensitivity and specificity (Peptide-1: Se = 98.46% and Ep = 95.71%; AgSLb: Se = 70.77% and Ep = 68.57%, data presented in Table 2), when compared to commercially available diagnostic tests.

Tabela 2: Performance de diagnóstico em amostras de soro de indivíduos portadores de LTH, LVH e cães portadores de LVC utilizando o Peptídeo-1 e AgSLb.Table 2: Diagnostic performance in serum samples from individuals with LTH, LVH, and dogs with LVC using Peptide-1 and AgSLb.

Parâmetros calculados utilizando todas as amostras apresentadas neste trabalho para LT (CT+DC+LC+LM, n=135), VL (CT+DC+LV, n=125) e LVC (CT+DC+LVC, n=75). Abreviações: LTH: Leishmaniose Tegumentar Humana; LVH: Leishmaniose Visceral Humana; LVC: Leishmaniose Visceral Canina; Se: sensibilidade; Ep: especificidade; 1C: intervalo de confiança; VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo; AC: acurácia. * Cut-off obtido pela curva ROC.# Cut-off obtido de acordo com o fabricante. [024] Conforme descrito na Tabela 2, os resultados dos valores preditivos positivos (VPP) e negativos (VPN) apresentaram-se elevados (Peptídeo-1: VPP=95,52% e VPN=98,53%; AgSLb: VPP=67,65% e VPN=71164%), assim como a acurácia (Peptídeo-1; AC=97,04%; AgSLb: AC=69,63%), comparado a ELISA AgSLb, sendo assim, a probabilidade de um resultado positivo ou negativo obtido pelo teste ser verdadeiro é elevado, classificando como uma excelente opção para diagnóstico da LTH. Avaliando a área abaixo da curva (AUC) (Tabela 3 e Figura 5), observou-se que o teste utilizando Peptídeo-1 apresentou elevada AUC comparado a AgSLb (Peptídeo-1; AUC=0,988; AgSLb: AUC=0,753), indicando que não houve incidência significativa de resultados falsos positivos e falsos negativos, sendo então, eficiente em discriminar indivíduos doentes de sadios. [025] Avaliando os dados descritos na Figura 3, a ELISA utilizando o Peptídeol apresentou excelente desempenho e maior capacidade simultânea de detectar resultados positivos para LVH e negativos (indivíduos controles e portadores da Doença de Chagas), avaliadas pela sensibilidade e especificidade (Peptídeo-1: Se=90,91% e Ep=92,86%; AgSLb: Se=52,73% e Ep=50,00%, dados apresentados na Tabela 2), quando comparada aos testes diagnósticos disponíveis no mercado. Conforme descrito na Tabela 2, os resultados dos valores preditivos positivos (VPP) e negativos (VPN) apresentaram-se elevados (Peptídeo-1: VPP=90,91% e VPN=92,86%; AgSLb: VPP=45,31% e VPN=57,38%), assim como a acurácia (Peptídeo-1: AC=92,00%; AgSLb: AC=51,20%), comparado a ELISA AgSLb, sendo assim, a probabilidade de um resultado positivo ou negativo obtido pelo teste ser verdadeiro é elevado, classificando como uma excelente opção para diagnóstico da LTH. Avaliando a área abaixo da curva (AUC) (Tabela 3 e Figura 5), observou-se que o teste utilizando Peptídeo-1 apresentou elevada AUC comparado a AgSLb (Peptídeo-1: AUC=0,954; AgSLb: AUC=0,510), indicando que não houve incidência significativa de resultados falsos positivos e falsos negativos, sendo então, eficiente em discriminar indivíduos doentes de sadios.Parameters calculated using all samples presented in this work for LT (CT + DC + LC + LM, n = 135), VL (CT + DC + LV, n = 125) and LVC (CT + DC + LVC, n = 75) . Abbreviations: LTH: Human Cutaneous Leishmaniasis; LVH: Human Visceral Leishmaniasis; LVC: Canine Visceral Leishmaniasis; Se: sensitivity; Ep: specificity; 1C: confidence interval; PPV: positive predictive value; NPV: negative predictive value; AC: accuracy. * Cut-off obtained by the ROC curve. # Cut-off obtained according to the manufacturer. [024] As described in Table 2, the results of positive (PPV) and negative (NPV) predictive values were high (Peptide-1: PPV = 95.52% and NPV = 98.53%; AgSLb: PPV = 67.65% and NPV = 71164%), as well as the accuracy (Peptide-1; AC = 97.04%; AgSLb: AC = 69.63%), compared to the AgSLb ELISA, so the probability of a result positive or negative obtained by the test being true is high, classifying it as an excellent option for diagnosing LTH. Evaluating the area under the curve (AUC) (Table 3 and Figure 5), it was observed that the test using Peptide-1 showed high AUC compared to AgSLb (Peptide-1; AUC = 0.988; AgSLb: AUC = 0.753), indicating that there was no significant incidence of false positive and false negative results, thus being efficient in discriminating sick and healthy individuals. [025] Evaluating the data described in Figure 3, the ELISA using Peptideol showed excellent performance and greater simultaneous ability to detect LVH positive and negative results (control individuals and carriers of Chagas Disease), assessed by sensitivity and specificity (Peptide- 1: Se = 90.91% and Ep = 92.86%, AgSLb: Se = 52.73% and Ep = 50.00%, data presented in Table 2) when compared to commercially available diagnostic tests. As described in Table 2, the results of positive (PPV) and negative (NPV) predictive values were high (Peptide-1: PPV = 90.91% and NPV = 92.86%; AgSLb: PPV = 45.31). % and NPV = 57.38%), as well as the accuracy (Peptide-1: AC = 92.00%; AgSLb: AC = 51.20%), compared to the AgSLb ELISA, thus, the probability of a positive result or negative obtained by the test being true is high, classifying as an excellent option for diagnosing LTH. Evaluating the area under the curve (AUC) (Table 3 and Figure 5), it was observed that the test using Peptide-1 showed high AUC compared to AgSLb (Peptide-1: AUC = 0.954; AgSLb: AUC = 0.510), indicating that there was no significant incidence of false positive and false negative results, thus being efficient in discriminating sick and healthy individuals.

Tabela 3: Análise da curva ROC obtida em amostras de soro de indivíduos portadores de LTH, LVH e cães portadores de LVC utilizando o Peptídeo-1.Table 3: Analysis of the ROC curve obtained from serum samples from individuals with LTH, LVH, and dogs with LVC using Peptide-1.

Abreviações: LTH: Leishmaniose Tegumentar Humana; LVH: Leishmaniose Visceral Humana; LVC: Leishmaniose Visceral Canina; AUC: área abaixo da curva; IC: intervalo de confiança. * Cut-off obtido pela curva ROC. * Cut off obtido de acordo com o fabricante. [026] Avaliando os dados descritos na Figura 4, a ELISA utilizando o Peptídeo-1 apresentou excelente desempenho na capacidade simultânea de detectar resultados positivos para LVC e negativos (indivíduos controles e portadores da Doença de Chagas), avaliados pela sensibilidade e especificidade (Peptídeo-1; Se=100,00% e Ep=97,78%; EIE-LVC kit: Se=100,00% e Ep=53,33%; dados apresentados na Tabela 2). Conforme descrito na Tabela 2, o resultado dos valores preditivos positivos (VPP) e negativo (VPN) apresentou elevado (Peptídeo-1; VPP=96,67% e VPN=100,00%; EIE-LVC kit: VPP=58,82% e VPN=100,00%), assim como a acurácia (Peptídeo-1; AC=98,67%; EIE-LVC kit: AC=72,00%), sendo assim, a probabilidade de um resultado positivo ou negativo obtido pelo teste ser verdadeiro é elevado, classificando como uma excelente opção para diagnóstico da LVC. Avaliando a área abaixo da curva (AUC) (Tabela 3 e Figura 5), observou-se que o teste utilizando Peptídeo-1 apresentou elevada AUC (Peptídeo-1: AUC=0,997), indicando que não houve incidência significativa de resultados falsos positivos e falsos negativos, sendo então, eficiente em discriminar indivíduos doentes de sadios. [027] A análise da especificidade também foi realizada em cães sem histórico de infecção por Leishmania e imunizados com a vacina comercial Leishmune® para verificar a reatividade cruzada (Tabela 4 e Figura 6). Nesta etapa, os valores de reatividade cruzada para Leishmune® para os antígenos peptídeo-1 e EIE-LVC Kit foram de 10 e 60%, respectivamente, Esses valores indicam que o teste de ELISA utilizando o Peptídeo-1 apresenta menor reatividade cruzada com indivíduos imunizados com a vacina comercial Leishmune®, que é um importante requisito para implementar metodologias de diagnóstico da LVC no mercado, já que evita sacrifício de cães imunizados com estas vacinas devido a resultados falso positivos.Abbreviations: LTH: Human Cutaneous Leishmaniasis; LVH: Human Visceral Leishmaniasis; LVC: Canine Visceral Leishmaniasis; AUC: area below the curve; CI: confidence interval. * Cut-off obtained by the ROC curve. * Cut off obtained according to the manufacturer. [026] Evaluating the data described in Figure 4, ELISA using Peptide-1 performed excellently in the ability to detect positive and negative CVV (control and Chagas disease patients), evaluated for sensitivity and specificity (Peptide-1). -1 = Se = 100.00% and Ep = 97.78%; EIE-LVC kit: Se = 100.00% and Ep = 53.33%; data presented in Table 2). As described in Table 2, the result of positive (PPV) and negative (NPV) predictive values was high (Peptide-1; PPV = 96.67% and NPV = 100.00%; EIE-LVC kit: PPV = 58, 82% and NPV = 100.00%), as well as the accuracy (Peptide-1; AC = 98.67%; EIE-LVC kit: AC = 72.00%), thus, the probability of a positive result or The negative result obtained by the test being true is high, classifying it as an excellent option for diagnosing CVL. Evaluating the area under the curve (AUC) (Table 3 and Figure 5), it was observed that the test using Peptide-1 showed high AUC (Peptide-1: AUC = 0.997), indicating that there was no significant incidence of false positive results. and false negatives, thus being efficient in discriminating sick and healthy individuals. [027] Specificity analysis was also performed on dogs with no history of Leishmania infection and immunized with the commercial Leishmune® vaccine to verify cross-reactivity (Table 4 and Figure 6). At this stage, Leishmune® cross-reactivity values for peptide-1 and EIE-LVC Kit antigens were 10 and 60%, respectively. These values indicate that the ELISA test using Peptide-1 has lower cross-reactivity with individuals. Immunized with the commercial Leishmune® vaccine, which is an important requirement to implement diagnostic methodologies for CVL in the market, as it avoids sacrificing dogs immunized with these vaccines due to false positive results.

Tabela 4. Reatividade cruzada em cães imunizados com vacinas comerciais para LVC utilizando o peptídeo-1 e EIE-LVC Kit.Table 4. Cross-reactivity in dogs immunized with commercial LVC vaccines using peptide-1 and EIE-LVC Kit.

Reatividade cruzada foi calculada utilizando amostras de cães vacinados com Leishmune® (LM, n=10) ou LeishTec® (LT, n=10). O ganho de sensibilidade obtido pelo Peptídeo-1 se dá, possivelmente, por apresentar epítopos com alta imunogenicidade e polimórficos, conforme descrito na Figura 1, fato que é importante para realizar o correto diagnóstico das leishmanioses possibilitando o tratamento de indivíduos infectados pela leishmaniose (LTH e LVH). Adicionalmente, o correto diagnóstico é importante para prevenir a manutenção de cães infectados (LVC) em áreas endêmicas e evitar o sacrifício desnecessário de animais por limitações na especificidade do teste devido à infecção por outros microrganismos, resultando em resultados falsos positivos, comumente observados em testes de diagnósticos que utilizam antigeno bruto do parasito. Avaliando a alta capacidade de detectar infecções causadas por diferentes espécies de Leishmania, os dados permitem concluir pela validade das reações sorológicas utilizando o Peptídeo-1 para imunodiagnóstico com elevada acurácia das leishmanioses tegumentar e visceral humana e canina.Cross-reactivity was calculated using samples from dogs vaccinated with Leishmune® (LM, n = 10) or LeishTec® (LT, n = 10). The sensitivity gain obtained by Peptide-1 is possibly due to its high immunogenicity and polymorphic epitopes, as described in Figure 1, a fact that is important for the correct diagnosis of leishmaniasis allowing the treatment of individuals infected with leishmaniasis (LTH). and LVH). Additionally, correct diagnosis is important to prevent the maintenance of infected dogs (CVL) in endemic areas and to avoid unnecessary animal sacrifice due to limitations in test specificity due to infection by other microorganisms, resulting in false positive results commonly observed in tests. of diagnoses using crude parasite antigen. Evaluating the high ability to detect infections caused by different species of Leishmania, the data allow us to conclude that the serological reactions are valid using Peptide-1 for high accuracy immunodiagnosis of human and canine tegumentary and visceral leishmaniasis.

Claims

1. A synthetic peptide comprising the sequence represented by SEQ ID NO: 1.

2- Use of synthetic peptide characterized by being in the diagnosis of canine visceral leishmaniasis and human cutaneous and visceral leishmaniasis.

Method for immunodiagnostic testing of leishmaniasis comprising: a) binding antileishmanial antibodies of a sample to one or more polypeptides consisting of the amino acid sequence SEQ ID Nos 1, attached to a solid support or a carrier; b) contacting the antibodies of step (a) with a secondary antibody or protein, conjugated to an enzyme or label and binding to the antibodies of step (a); c) detecting antileishmanial antibodies in the above sample by detecting the secondary antibody or protein specifically bound to said anti-leishmanial antibody;

Method for immunodiagnostic testing of leishmaniasis according to claim 3, step "a", characterized in that the polypeptide SEQ ID NO: 1 may be modified at its ends.

Method for Immunodiagnostic Testing of Leishmaniasis according to Claim 3, step "a", characterized in that the samples are selected from the group consisting of blood, serum, plasma and other body fluid.

Method for immunodiagnostic testing of leishmaniasis according to claim 3, step "a", characterized in that the carrier is preferably a gold particle.

Method for immunodiagnostic testing of leishmaniasis according to claim 3, step "b", characterized in that the protein is selected from the group consisting of protein A and protein G.

Method for the immunodiagnostic test of leishmaniasis according to claim 3, step "b", characterized in that the enzyme is selected from the group consisting of alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase.

A method for immunodiagnostic testing of leishmaniasis according to claim 3, step "b", characterized in that the marker is selected from the group consisting of enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescent.

A kit for the immunodiagnostic test of leishmaniasis, characterized in that it comprises: - at least one peptide consisting of the sequence SEQ ID No. 1 associated or isolated; A secondary antibody or protein, wherein the secondary antibody or protein is conjugated to an enzyme or marker, and a reagent for detecting said enzyme or marker.

An immunodiagnostic test kit for leishmaniasis according to claim 10, characterized in that the peptides are attached to a solid support or carrier.

Leishmaniasis immunodiagnostic test kit according to claim 10, characterized in that the solid support is selected from the material group consisting of nitrocellulose, nylon, latex, polypropylene and polystyrene.

An immunodiagnostic test kit for leishmaniasis according to claim 10, characterized in that the carrier consists of gold particles.

A kit for the immunodiagnostic test of leishmaniasis according to claim 10, characterized in that the protein is selected from the group consisting of protein A and protein G.