BR102014031331A2 - proteína multiepitopo recombinante, seu processo de obtenção e suas aplicações relacionadas à leishmaniose - Google Patents

Abstract

proteína multiepitopo recombinante, seu processo de obtenção e suas aplicações relacionadas à leishmaniose a presente invenção refere-se a uma proteína multiepitopo recombinante, seu processo de obtenção e suas aplicações relacionadas à leishmaniose. a proteína multiepitopo sintética é construída a partir de regiões conservadas e imunogênicas entre espécies de leishmania, contendo dois ou mais epitopos de proteínas desse parasito, contendo uma seleção preferencial de até 4 epitopos conservados. seu processo de obtenção está baseado em procedimentos de engenharia genética, utilizando-se um gene especificamente produzido para a expressão da proteína de interesse. os epitopos selecionados para produção da proteína de interesse envolvem as seguintes sequências: cadeia a da tubulina, proteína do choque térmico de 83.1 kda (hsp 83.1), proteína do choque térmico de 70 kda (hsp 70) e cinesina 39 (k39). a proteína multiepitopo preferencial é a representada pela seq id no: 1, que é codificada, por exemplo, pela sequência de nucleotídeos seq id no: 2 que contem os 4 epitopos mencionados sendo 3 deles duplicados, também separados por conectores flexíveis. a proteína multiepitopo da presente invenção é utilizada como insumo na produção de diferentes produtos tais como kits de diagnóstico de leishmaniose, composições imunogênicas, vacinas, medicamentos ou biofármacos para prevenir e tratar essa doença, e na produção de anticorpos monoclonais.

Description

PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE, SEU PROCESSO DE OBTENÇÃO E SUAS APLICAÇÕES RELACIONADAS À LEISHMANIOSE

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção trata da construção biotecnológica e da utilização de uma proteína imunogênica recombinante contendo epítopos imunogênicos e conservados de proteínas de Leishmania, mais especificamente epítopos imunogênicos selecionados das regiões: Cadeia α da tubulina, Proteína do choque térmico de 83.1 kDa (HSP 83.1), Proteína do choque térmico de 70 kDa (HSP 70) e Cinesina 39 (k39). Esta proteína apresenta atividade imunogênica, sendo utilizada como insumo para kits de diagnósticos in vitro para Leishmaniose Visceral, especialmente, Leishmaniose Visceral Canina ou Leishmaniose Visceral Humana, a partir de amostras fisiológicas para identificar cães ou indivíduos que já tiveram contato com o parasito. Seu processo de obtenção está baseado na clonagem e expressão heteróloga em microorganismos, utilizando um gene especialmente elaborado, contendo epítopos ou regiões conservadas, imunogênicas e selecionadas entre as espécies de Leishmania de ocorrência no Brasil e no mundo. Esta proteína é utilizada como ingrediente de uma composição imunogênica útil na produção de vacinas, medicamentos ou biofármacos para prevenir e tratar essa doença. Adicionalmente, esta proteína também é utilizada em métodos de detecção de Leishmaniose Visceral Canina ou Leishmaniose Visceral Humana e na produção de anticorpos monoclonais.

ESTADO DA TÉCNICA

[002] As leishmanioses são doenças causadas por mais de 20 espécies do parasito protozoário Leishmania capazes de infectar os seres humanos e é transmitida pela picada de flebotomíneos. Os três tipos principais são: leishmaniose visceral (LV), forma mais grave da doença; leishmaniose cutânea (LC), o mais comum; e leishmaniose mucocutânea (LM) (WHO, World Health Organization. Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases. WHO technical report series., n. 949, p. 22 -26, 2010). A diferença no avanço da doença está relacionada com a espécie do parasito infectante, bem como a suscetibilidade do hospedeiro, podendo variar entre distintas manifestações cutâneas até a forma visceral da doença (REY, L. Parasitologia Médica. 3a edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001). A LV é causada pelos parasitos intracelulares Leishmania donovani, Leishmania chagasi e Leishmania infantum, e é caracterizada pela imunidade mediada por células, e quando não tratada adequadamente pode ser fatal. A doença acomete principalmente pessoas de classe econômica baixa na África, Ásia e América Latina, e está associada à desnutrição, ao deslocamento da população, às condições precárias de habitação, ao sistema imunológico fraco e à falta de recursos. Análises demonstram que mais de 98 países e territórios são endêmicos, com mais de 90% dos casos mundiais de LV no Bangladesh, Brasil, Etiópia, índia, Sudão do Sul e Sudão. Estima-se cerca de 1,3 milhões de novos casos e 20 mil para 30 mil mortes anualmente (WHO, World Health Organization. Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases. WHO technical report series., n. 949, p. 22 -26, 2010). No Brasil, a LV inicialmente tinha um caráter eminentemente rural, mais recentemente, vem se expandindo para as áreas urbanas de médio e grande porte (Brasil, Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual de Controle da Leishmaniose Visceral. Série A. Normas e Manuais Técnicos, 2006).

[003] A leishmaniose tem como vetores dois gêneros do mosquito areia, Lutzomyia no Novo Mundo e Phlebotomus no Velho Mundo. Estudos em áreas endêmicas brasileiras demonstram a ocorrência do Lutzomyia longipalpis durante todos os meses do ano e constata que ocorre um aumento populacional após período das chuvas, podendo atingir o seu pico populacional máximo. A leishmaniose tem como hospedeiro definitivo cães. Assim o mosquito mantém o ciclo de transmissão da LV devido ao contato contínuo com o cão infectado (NASCIMENTO, B. W. L. et al. Study of sand flies (Diptera: Psychodidade) in visceral and cutaneous leishmaniasis areas in central western of Minas Gerais State - Brazil. Acta Tropica., v. 125, n. 3, p. 262-268, 2013). Os cães são considerados principais reservatórios urbanos e representam a maior fonte de contágio para o vetor em virtude de sua alta prevalência de infecção e intenso parasitismo cutâneo (MOHEBALI, M. et al. Epidemiological aspects of canine visceral leishmaniosis in the Islamic Republic of Iran. Veterinary Parasitology., v. 129, n. 3-4, p. 243-251,2005).

[004] O controle da LV no Brasil é realizado através de medidas específicas para o controle da disseminação da doença, que incluem o diagnóstico precoce e tratamento dos casos humanos, identificação e eliminação de cães infectados soropositivos, controle de insetos vetores e educação para a saúde, a fim de diminuir ou interromper o ciclo de transmissão (Brasil, Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual de Controle da Leishmaniose Visceral. Série A. Normas e Manuais Técnicos, 2006). Para reduzir o risco de transmissão da doença algumas medidas preventivas podem ser adotadas, como manter * os cães em canis fechados durante períodos de atividade intensa do vetor, eliminar os microambientes que favorecem o desenvolvimento do vetor na residência, e nos cães utilizar coleiras impregnadas com inseticida repelente (ALEXANDER, B.; MAROLI, M. Control of phlebotomine sandflies. Medicai and Veterinary Entomology., v. 17, η. 1, p. 1-18, 2003). O Programa de Controle da Leishmaniose Visceral (PCLV) tem encontrado várias dificuldades, incluindo: altas taxas de infecção e infecciosidade canina; gestão ambiental ineficaz para o controle de vetores; grande intervalo entre o diagnóstico e a eliminação de cães infectados; insatisfação da população humana com a eliminação de cães infectados; precisão insuficiente dos kits de diagnóstico para a detecção da doença, permitindo assim que os cães assintomáticos persistam como fonte de infecção para o vetor; substituição dos cães abatidos por uma nova população canina sensível e o controle químico do vetor (COURA-VITAL, W. et al. Prevalence and factors associated with Leishmania infantum infection of dogs from an urban area of Brazil as identified by molecular methods. PLoS Neglected Tropical Diseases, v. 5, n. 8, p.1291, 2011).

[005] Os antimoniais pentavalentes têm sido os fármacos recomendados para o tratamento da LV e LVC no decorrer de vários anos. O antimônio pentavalente - antimoniato de meglumina (Glucantime, Sanofi-Aventis) e o stiboglucanato de sódio (Pentostan, GlaxoSmithKline) possuem uma eficácia impermanente e requerem uma administração injetável, podendo ser por via intravenosa (IV), intramuscular (IM) ou intralinfática (IL). Os pacientes devem ser hospitalizados e monitorados, como também o tratamento pode ser suspenso devido aos efeitos colaterais como, por exemplo, pancreatite, elevada toxidade e nefrotoxidade (MATOUSSI, N. et al. Cardiotoxicity of n-methyl-glucamine antimoniate (Glucantime). A case report. Médecine et Maladies Infectieuses., v. 37, n. 3, p. S257-S259, 2007). Nos últimos anos, algumas medicações alternativas ou novas fórmulas de medicamentos antigos tomaram-se acessíveis. Porém, nenhum deles é ideal para o tratamento em decorrência da alta toxicidade, problemas de resistência, custos proibitivos, duração do tratamento de longo prazo ou modo inadequado de administração não adaptado ao campo. Além disso, há um aumento no risco de desenvolvimento de resistência aos medicamentos, uma vez que vários pacientes não são capazes de concluir todo o tratamento. Resultados positivos podem ser alcançados através da combinação de drogas, podendo ser uma solução em curto prazo para retardar ou impedir o surgimento da resistência, resultando em um aumento da eficácia ou até mesmo diminuindo o curso do tratamento (SUNDAR, S. et al. Comparison of short-course multidrug treatment with standard therapy for visceral leishmaniasis in índia: an open-label, non-inferiority, randomized controlled trial. Lancet., v. 377, n. 9764, p. 477-486, 2011).

[006] Há esforços atualmente no sentido de diminuir a toxicidade e melhorar a entrega do antimônio (FREZARD, F.; DEMICHELI, C.; RIBEIRO, R. R. Pentavalent antimonials: new perspectives for old drugs. Molecules, v. 14, n. 7, p. 2317-2336, 2009), bem como tentativas incluindo as formulações à base de lipossomas para o tratamento de LV (SCHETTINI, D. A. et al. Improved targeting of antimony to the bone marrow of dogs using liposomes of reduced size. International Journal of Pharmaceutics., v. 315, n. 1-2, p. 140-147, 2006) e a formulação à base de ciclodextrina, com a finalidade de administração oral (DEMICHELI, C. et al. Oral delivery of meglumine antimoniate-betacyclodextrin complex for treatment of leishmaniasis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy., v. 48, η. 1, p. 100-103, 2004).

[007] O diagnóstico sorológico de doenças tropicais é limitado quando se utiliza antígenos brutos, pois a produção destes em grandes quantidades é muito difícil. Para contornar esse problema, técnicas de biologia molecular que permitem a produção de antígenos como proteínas recombinantes de uma forma padronizada e com uma vantagem sobre os extratos brutos tomam-se mais viáveis (ΜΑΙΑ, Z. et al. Comparative Study of rK39 Leishmania Antigen for Serodiagnosis of Visceral Leishmaniasis: Systematic Review with Meta-Analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases., v. 6, η. 1, p. el484, 2012). Dentre as diversas proteínas descritas na literatura e que podem elicitar uma resposta imunológica e com isso servir como ferramentas para o diagnóstico por ELISA, pode-se citar: as cinesinas (MOHAPATRA, T. M. et al. Compararative evaluation of rK9, rK26 and rK39 antigens in the serodiagnosis of Indian visceral leishmaniasis. J Infect Dev Ctries., v.4, p.l 14-117, 2010.), proteínas do choque térmico (SKEIKY, Y. A. W. et al. Immune responses of leishmaniasis patients to heat shock proteins of Leishmania species and humans. Infection and Immunology, v. 63, n. 10, p. 4105-4114, 1995), cadeias alfa da tubulina (KUMAR, A. et al. Proteome mapping of overexpressed membrane-enriched and cytosolic proteins in sodiumantimony gluconate (SAG) resistant clinicai isolate of Leishmania donovani. British Journal of Clinicai Pharmacology, v. 70, n. 4, p. 609-617, 2010), cadeia beta da tubulina (ABÁNADES, D. R. et al. Immunodominant Antigens of Leishmania chagasi Associated with Protection against Human Visceral Leishmaniasis. PLoS Negl Trop Dis., v.6, n.6, p. el687, 2012), fator de elongação da tradução 1-BETA (VICKERS, T. J. et al. Leishmania major elongation factor 1B complex has trypanothione Stransferase and peroxidase activity. The Journal of Biology Chemistry, v.279, n. 47, p. 49003-49009, 2004), fator de iniciação de eucarioto 4A (SKEIKY, Y. A. W. et al. Immune responses of leishmaniasis patients to heat shock proteins of Leishmania species and humans. Infection and Immunology, v. 63, n. 10, p. 4105-4114, 1995), S-metiladenosina sintetase (DRUMMELSMITH, J. et al. Differential protein expression analysis of Leishmania major reveals novel roles for methionine adenosyltransferase and S-adenosylmethionine in methotrexate resistance. The Journal of Biology Chemistry., v. 279, n. 32, p. 33273-33280, 2004), dissulfeto isomerase LmPDI (BEN ACHOUR Y. et al. Identification of a disulfide isomerase protein of Leishmania major as a putative virulence factor. Infect Immun.; v. 70, p. 3576-3585, 2002), subunidade B da ATP sintase vacuolar (SKEIKY, Y. A. W. et al. Immune responses of leishmaniasis patients to heat shock proteins of Leishmania species and humans. Infection and Immunology, v. 63, n. 10, p. 4105-4114, 1995) e enolase (GUPTA, S. K. et al. Proteomic approach for Identification and characterization of novel immunostimulatory proteins from soluble antigens of Leishmania donovani promastigotes. Proteomics., n. 7,p. 816-823, 2007). As proteínas de L. chagasi a- tubulina, HSP70, HSP83.1 e Enolase apresentaram um bom sinal no ELISA e podem ser utilizadas para diagnóstico de LVH (ABÁNADES, D. R. et al. Immunodominant Antigens of Leishmania chagasi Associated with Protection against Human Visceral Leishmaniasis. PLoS Negl Trop Dis., v.6, n.6, p. el687, 2012). Cinesinas, proteínas de Leishmania envolvidas na divisão celular do parasito, formação flagelar, tráfego e reorganização do citoesqueleto (PENA, M. S. Identificação de ligantes da metacaspase de Leishmania (Leishmanais) amazonenses pela técnica de “Phage Display. 2012. 69 f. Dissertação (Mestrado em Parasitologia) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, 2010) são regiões promissoras usadas para diagnóstico. As cinesinas recombinantes rK39 e rK26 apresentam boa sensibilidade e especificidade de 100% nos estudos realizados por Mohapatra e colaboradores (2010) (MOHAPATRA, T. M. et al. Compararative evaluation of rK9, rK26 and rK39 antigens in the serodiagnosis of Indian visceral leishmaniasis. J Infect Dev Ctries., v.4, p. 114—117, 2010). Além dessas, a cinesina recombinante K9 apresentou 95% de sensibilidade e 100% de especificidade (MOHAPATRA, T. M. et al. Compararative evaluation of rK9, rK26 and rK39 antigens in the serodiagnosis of Indian visceral leishmaniasis. J Infect Dev Ctries., v.4, p.l 14—117, 2010). Dentre as cinesinas, a região conhecida como epitopo recombinante rK39 (rk39) é conservada entre as espécies de Leishmania, servindo de diagnóstico tanto para a LVC como para a LVH (BADARÓ, R. et al. A cloned antigen of Leishmania chagasi that predicts active visceral leishmaniasis. The Journal of Infectious Diseases, v. 173, n. 3, p. 758-761, 1996) . Por este motivo, essa região é considerada o antígeno sorológico mais promissor para diagnóstico (ROSÁRIO, E. Y. et al..; Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay using crude Leishmania and recombinant antigens as a diagnostic marker for canine visceral leishmaniasis. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 100, n. 2, p. 197-203, 2005). As proteínas de choque térmico têm sido amplamente estudadas (SRIVIDYA, G. et al. Diagnosis of visceral leishmaniasis: developments over the last decade. Parasitology Research, v. 110, n. 3, p. 1065-1078, 2012), pois são altamente conservadas e protegem as células contra os efeitos nocivos como o choque térmico (chaperonas) (HAHN, G. M., LI, G. C. Thermotolerance and heat shock proteins in mammalian cells. Radiat.Res, v. 92, p. 452-457, 1982. LI, G. C.; HAHN, G. M. Thermotolerance, thermoresistance and thermosensitization. In Stress proteins in Biology and Medicine. Cold Spring Harbor., p. 79-100, 1990). Estas proteínas também apresentam função anti-apoptótica (BEERE, Η. M.; GREEN, D. R. Stress Management - heat shock protein-70 and the regulation of apoptosis. Trends Cell Biol., v. 11, p. 6-10, 2001). As proteínas HSP70 e HSP83 demonstraram o potencial de estimularem uma resposta humoral em camundongos (RICO, A. I. et al. The heat shock proteins, Hsp70 and Hsp83, of Leishmania infantumare mitogens for mouse B cells. Cell Stress Chaperones., v. 7, p. 339-346. 2002). A rHSP70 de L. braziliensis, quando usada em diagnóstico de Leishmaniose cutânea e mucocutânea apresentou uma sensibilidade variando de 89 a 100%, e especificidade de 100% (AMORIM, A. G. et al. Identification of the C-terminal region of 70 kDa heat shock protein from Leishmania (Viannia) braziliensis as a target for the humoral immune response. Cell Stress Chaperon. p. 177-187, 1996.). As proteínas HASPB são expressas na superfície de promastigotas infectantes e amastigotas de Leishmania (ALCE, T. M. et al. Expression of hydrophilic surface proteins in infective stages of Leishmania donovani. Mol Biochem Parasitol., v. 102, p. 191-196, 1999). Em experimentos de vacinação com camundongos, o antígeno recombinante de L. donovani HASPB foi reconhecido como alvo por anticorpos naturais (STAGER, S. et al. Natural antibodies and complement are endogenous adjuvants for vaccine-induced CD8(+) T-cell responses. Nature Medicine., v. 9, n. 10, p. 1287-1292, 2003.). HASPB 1 e HASPB2 são proteínas de L. donovani homólogas às proteínas K26 e K.9 de L. infatum, respectivamente (BHATIA, A. et al. Cloning, characterization and serological evaluation of K9 and K26: two related hydrophilic antigens of Leishmania chagasi. Molecular and Biochemical Parasitology., v. 102, n. 2, p. 249-261, 1999). A tubulina é um constituinte essencial do citoesqueleto dos kinetoplastidae e está presente na maquinaria da divisão celular e organelas de motilidade (GULL, K. Protist tubulins: new arrivals, evolutionary relationships and insights to cytoskeletal function. Current Opinion in Microbiology., v. 4, n. 4, p. 427-432, 2001). Evidências recentes sugerem que a expressão de tubulina varia muito durante os ciclos de vida de Trypanosoma e Leishmania sp., causada possivelmente pela demanda dos tripanossomatídeos por essas estruturas (URMENYI, T. P. et al. Transcriptional and post-transcriptional control of tubulin gene-expression in Trypanosoma cruzi. DNA and Cell Biology., v. 11, n. 2, p. 101-109, 1992). Existe uma variedade de proteínas tubulina, mas ο α/β heterodímero é o material de construção imprescindível para o citoesqueleto microtubular (MCKEAN, P. G.; VAUGHAN, S.; GULL, K. The extended tubulin superfamily. Journal of Cell Science., v. 114, p. 2723-2733, 2001). As Leishmania sp. possuem α-tubulina e β-tubulina em diferentes cromossomos (BELLOFATTO, V.; CROSS, G. A. Characterization of RNA transcripts from the alpha tubulin gene cluster of Leptomonas seymouri. Nucleic Acids Research, v. 16, n. 8, p. 3455-3469, 1988. DAS, S.; ADHYA, S. Organization and chromosomal localization of beta-tubulin genes in Leishmania donovani. Journal of Biosciences., v. 15, n. 4, p. 239-248, 1990). Estudos realizados demonstraram que os três loci β-tubulina e um locus α-tubulina encontrados em L. major estão presentes em L. infantum e L. braziliensis (JACKSON, A. P. et al. Comparative genomics and concerted evolution of β-tubulin paralogs in Leishmania spp. BMC genomics., v. 7, n. 137, p. 1-12, 2006). Um epitopo correspondente à proteína da cadeia alfa da tubulina apresentou um bom sinal no ELISA e poderia ser usada em diagnóstico (ABÁNADES, D. R. et al. Immunodominant Antigens of Leishmania chagasi Associated with Protection against Human Visceral Leishmaniasis. PLoS Negl Trop Dis., v.6, n.6, p. el687,2012).

[008] Os ensaios imunoenzimáticos (EIA) para detecção de IgM ou IgG anti-Leishmania são as metodologias usadas de rotina para detecção de LV. No entanto, esses ensaios têm limitações pela não-correlação das taxas de IgM e IgG com a presença do parasito. Dentre os ensaios imunoenzimáticos usados com mais frequência para detecção de LV destaca-se o ELISA. É o teste mais utilizado para imunodiagnóstico de LV, pois além de sensível, o que permite a detecção de baixos títulos de anticorpos, é rápido, fácil de manipular e de fazer leitura, mas é pouco preciso na detecção de casos subclínicos ou assintomáticos (EL-AMIN, E. R. et al. Serodiagnosis of Sudanese visceral and mucosal leishmaniasis: comparison of ELISA-immunofluorescence and indirect haemagglutination. Trans R Soc Trop Med Hyg., v. 80,p. 271-274, 1986). Existe uma limitação em termos de especificidade no uso de antígenos totais, resultando em reações cruzadas não apenas com outras espécies da família Trypanosomatidae, como também com organismos filogeneticamente distantes (TAVARES, C. A. P.; FERNANDES, A. P.; MELO, Μ. N. Molecular diagnosis of leishmaniasis. Expert Review of Molecular Diagnostic., v. 3, n. 5, p. 657-667, 2003). Sua especificidade e sensibilidade são estritamente dependentes das características do antígeno e podem ser melhoradas através do uso de tecnologia recombinante, a qual dirige à expressão e purificação de proteínas diagnosticamente relevantes e em elevadas quantidades (SUNDAR, S., RAI, M. Laboratory diagnosis of visceral Leishmaniasis.Clin. diagn. lab.Immunol., v. 9, n. 951, 2002). Dessa forma, um dos principais aspectos de limitação tecnológica de sistemas de diagnóstico de LV está relacionada a necessidade de se empregar uma composição elaborada contendo diferentes compostos antigênicos recombinantes (mais de um tipo de proteína antigênica) que seja conservado em várias espécies de Leishmania para resolver problemas de falhas de sensibilidade de detecção. Este problema também se reflete na dificuldade de elaboração de composições imunogênicas, vacinas e medicamentos para tratar ou prevenir esta doença. Diante disso, o desenvolvimento de composições imunogênicas mais simplificadas ou o emprego de insumos com funcionalidades ampliados é bastante promissor, e por isso foi desenvolvido na presente invenção, na qual apenas uma proteína multiepitopo recombinante apresenta a finalidade para que se presta.

[009] Muitos dos antígenos da LV usados atualmente em ensaios sorológicos são preparações brutas de antígenos solúveis obtidos a partir da lise da célula do parasito. Este tipo de preparação exibe uma variação muito grande e requer uma cuidadosa padronização antes do uso. Antígenos sintéticos são também relativamente caros para serem produzidos. Antígenos recombinantes produzidos separadamente apresentam problema de padronização da quantidade de proteína no teste. E algumas quimeras proteicas (polipeptídeos) recombinantes feitos por fusão de determinantes antigênicos do parasito podem apresentar problemas de reconhecimento por parte do antígeno devido a um antígeno ser de uma espécie específica de Leishmania ou mesmo problema de impedimento estérico com os anticorpos devido ao tamanho da proteína produzida. A presente invenção realizou a produção de uma proteína multiepitopo eficaz no reconhecimento de anticorpos de várias espécies de Leishmania circulantes em cães ou humanos infectados para diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canica (LVC) e da Leishmaniose Visceral humana (LVH).

[010] A produção de um polipeptídeo recombinante multiepitopo, objeto da presente invenção, é eficaz no reconhecimento de marcadores moleculares por possuir alta sensibilidade e especificidade ao substrato, o que possibilita o diagnóstico da Leishmaniose em hemocentros ou por agentes de saúde pública como uma forma de direcionamento de um tratamento mais específico e precoce. Na maioria dos casos, os kits de diagnósticos para Leishmaniose são importados. Sendo assim, o objeto da presente invenção é de interesse para as indústrias farmacêuticas e biotecnológicas para a fabricação de kits de diagnósticos com baixos custos para sua exequibilidade industrial.

[011] Diversos pedidos de patentes apresentam diferentes propostas para o uso de peptídeos solúveis visando detectar e elicitar anticorpos anti-LV. Este é o caso das patentes BRPI06058892 e US7740859, que desenvolveram técnicas para preparação de antígenos solúveis para detecção da LV. No caso específico da patente US7740859, visa isolar e caracterizar uma região imunodominante e relacionada à cinesina. O problema desta tecnologia é a falta de padronização da concentração de cada determinante antigênico no teste e a possibilidade de reações cruzadas com outras doenças. Já as patentes BRPI08048592 e BRPI10066462 descrevem a obtenção de peptídeos sintéticos para imunização contra Leishmania e diagnóstico da LV. O problema destas tecnologias é devido ao alto custo para a síntese química dos determinantes antigênicos. Algumas tecnologias descrevem o uso separado de um ou vários antígenos recombinantes para diagnóstico da LV. É o caso das patentes BRPI10050337, BRPI 10037446, EP0679259, BRPI94057133 e EP1422238. O uso de apenas um antígeno recombinante resolve o problema da padronização relativo a concentração do epitopo no teste. Entretanto, apresenta especificidade comprometida uma vez que possui apenas um antígeno para o teste. Aquelas tecnologias que apresentam o uso de vários antígenos recombinantes resolve o problema da especificidade, entretanto, apresenta problemas de concentração de cada epitopo recombinante no teste. Para tentar resolver estes problemas algumas tecnologias relativas as patentes ES2133236, US20060211056, US20100136046, WO02072792, W02006058243, W02010108245 e US2013071862 investiram no desenvolvimento de proteínas de fusão contendo 3 ou mais determinantes antigênicos fusionados e muitas vezes formadas apenas por um único tipo de proteína repetida em sequência. É o caso da proteína de fusão K-28 formado pelas cinesinas k-26, k-39 e K-9 (patente US2013071862). Outro exemplo é uma proteína quimérica formado pelas t proteínas LIP2a, LIP2b, LÍP2A e LIP0 (patente ES2133236). Essa tecnologia tem resolvido o problema da concentração dos epitopos no teste, entretanto, o fato dessas tecnologias usarem apenas uma única classe de determinantes antigênicos pode não ser a melhor forma de melhorar a sensibilidade do teste. Outro ponto que pode ser destacado é que muitas proteínas de fusão usadas em kits de diagnósticos são muito grandes, apresentando em solução, problemas de conformação da proteína causando impedimento estérico e diminuindo a avidez entre as imunoglobulinas IgM e IgG e os antígenos da proteína de fusão. Para contornar todos esses problemas, a presente invenção desenvolveu uma proteína multiepitopo recombinante na qual cada epitopo foi escolhido de forma racional por seu grande potencial como proteína imunogênica resolvendo o problema de sensibilidade do teste. Além disso, três dos quatro epitopos usados foram repetidos duas vezes para aumentar a imunogenicidade. A produção desses epitopos na forma de uma única cadeia multiepitopo resolve o problema de padronização da concentração de proteína no teste. Além disso, visando diminuir o impedimento estérico que essa proteína podería ter em solução, foi proposto um conector de Glicina e Serina entre cada um dos epitopos. Isso deixa a proteína de forma mais linear. Também com o objetivo de aumentar mais ainda a sensibilidade do kit, foram escolhidos epitopos conservados entre várias espécies de Leishmania e que possuem menor reação cruzada possível. E por último, visando fazer com que essa proteína tenha um potencial de detectar tanto a LVC quanto a LVH, dois antígenos escolhidos tem potencial cientificamente demostrado para ser utilizado em kits de diagnóstico para LVH. O resultado de todo esse desenho racional foi o desenvolvimento de uma proteína multiepitopo denominada rMELEISH que é capaz de apresentar um bom sinal de ELISA (através da medida da absorbância a 405 nm) e diagnosticar amostra de cães assintomáticos que apresentavam um resultado falso negativo em outros ELISAS.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[012] A presente invenção refere-se a uma proteína multiepitopo denominada rMELEISH construída a partir de proteínas de Leishmania, correspondendo a epitopos conservados e imunogênicos de espécies de Leishmania presentes no Brasil e no mundo.

[013] O termo “proteína multiepitopo” se refere a uma proteína que apresenta dois ou mais epitopos. Entende-se por “epitopo” ou determinante antigênico a representação de uma pequena configuração estrutural de uma molécula do antígeno capaz de se combinar com um local estereoespecífico complementar de uma imunoglobulina (1 mol do determinante/1 mol receptor), ou de se combinar com um receptor funcional análogo na superfície de um linfócito.

[014] Os epitopos selecionados para a construção da proteína rMELEISH (contendo dois ou mais epitopos) são apresentados na Tabela 1. A figura 1 mostra a sequência de aminoácidos dessa proteína mostrando os epitopos (sublinhados) e os conectores (retângulo). Estes epitopos derivam de regiões conservadas de espécies de Leishmania de abrangência no Brasil e no mundo, sendo responsáveis por elicitarem uma resposta imune de amplo espectro em indivíduos portadores de Leishmaniose. Na Tabela 1 encontra-se a representação usual dos epitopos selecionados da proteína viral, juntamente com o código de sequência descrito na Listagem de Sequência, referentes às sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10, as quais são codificadas, por exemplo, pelas sequências de nucleotídeos representadas pelas SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO 9. [015] Os epítopos presentes na cadeia da proteína de interesse são unidos por um peptídeo conector de 2 a 10 resíduos de aminoácidos, sendo tal peptídeo, preferencialmente um conector flexível de conhecimento pela técnica, como por exemplo, os conectores do tipo GSGSG e GGGG. Este espaçamento é importante para que os anticorpos consigam reconhecer o antígeno e para que vários anticorpos possam reconhecer partes diferentes da molécula ao mesmo tempo. Preferencialmente, são utilizados os conectores de resíduos de aminoácidos glicina e serina para permitir a distenção da proteína deixando-a linear (Dipti, C. A. et al. A novel recombinant multiepitope protein as a hepatites C diagnostic intermediate of high sensibility ans specificity Protein Expres Purif. 47: 319-328, 2006).

[016] Para a proteína multiepitopo contendo os 4 epítopos representada pela SEQ ID NO: 1, os epítopos selecionados 1, 2 e 3 (Tabela 1) encontram-se duplicados e espaçados por um peptídeo conector flexível de 5 resíduos de aminoácidos de glicina-serina, preferencialmente a representada pela SEQ ID NO: 11. Isto toma essas regiões mais expostas no contato com anticorpos presentes em amostras fisiológicas, principalmente em amostras sorológicas de cães ou pacientes infectados. Esta característica estrutural da proteína multiepitopo propicia sua aplicação em diferentes tipos de kits de diagnósticos, ou ainda, para diferentes metodologias de detecção de anticorpos de cães ou humanos estimulados por Leishmaniose. A duplicação dos epítopos e uso de conectores também é usada para facilitar a manipulação e caracterização da proteína de interesse, facilitando sua produção em escala industrial e sua aplicação pretendida. TABELA 1 - Epitopos usados para a construção da proteína multiepitopo rMELEISH.

[017] A presente invenção refere-se à obtenção de um ácido nucléico recombinante (gene sintético) que irá ser clonado em vetores de expressão heteróloga em microrganismos para a produção da proteína multiepitopo. Tal ácido nucléico recombinante compreende dois ou mais epitopos selecionados entre as sequências de nucleotídeos representadas por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9, sendo unidos por peptídeos conectores flexíveis mencionados anteriormente. O caso exemplificado foi dado pela sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1.

[018] A presente invenção refere-se também ao processo de obtenção da proteína multiepitopo. A síntese dessa proteína envolve a utilização dos epitopos selecionados a partir de proteínas imunogênicas de Leishmania (Tabela 1) na construção de um ácido nucléico recombinante que irá expressar a proteína multiepitopo através de procedimentos de expressão heteróloga em microrganismos. Estes ácidos nucléicos são especialmente engenheirados biotecnologicamente, contendo sítios de restrição para enzimas adequadas para a sua delimitação.

[019] Nos exemplos citados, a sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 2 contém os sítios de restrição da enzima Ndel na região 5’ e o sítio de restrição da enzima Xho\ na região 3’. Esse gene foi clonado no vetor comercial pET21a, já contendo uma cauda de histidina, para facilitar a purificação da proteína de interesse por técnica de cromatografia utilizando níquel. Estas condições foram utilizadas para a expressão da proteína multiepitopo com sequência de aminoácidos exemplificada por SEQ ID NO: 1 ilustrada na Figura 2, em bactéria Escherichia coli, principalmente de linhagens BL21. A escolha desse microorganismo foi devido à sua praticidade, facilidade de manipulação laboratorial, baixo custo e conhecimento a cerca do bom rendimento. A linhagem BL21 possui vetores de expressão muito conhecidos e utilizados, como o pET21a, que facilitam a expressão heteróloga.

[020] Outros organismos que expressam proteínas heterólogas podem ser utilizados na produção da proteína multiepitopo recombinante da presente invenção. Leveduras são muito utilizadas devido ao bom rendimento e certa facilidade de manipulação. Entretanto, para usar outro organismo é necessário digerir o vetor que contém o gene de interesse com as enzimas Nde e Xho. Desta forma o inserto estaria livre para ser inserido em outro vetor de expressão (que deve ser específico para o organismo a ser utilizado). As características desejáveis para a escolha do microorganismo são justamente a facilidade de manipulação, bom rendimento para produção em larga escala e baixo custo para viabilizar a comercialização.

[021] De forma geral, o processo de obtenção de proteína multiepitopo da presente invenção compreende as seguintes etapas: a) Clonagem do ácido nucléico recombinante de interesse em um vetor de expressão em microrganismos; b) Indução da expressão da proteína no vetor de expressão; c) Purificação da proteína multiepitopo.

[022] Na etapa a, o ácido nucléico recombinante de interesse compreende multiepitopos de Leishmania unidos por peptídeos conectores capazes de resultar na proteína multiepitopo da presente invenção (SEQ ID NO: 1). Estes epitopos e os conectores (preferencialmente conectores de 2 a 10 resíduos de aminoácidos e tidos como conectores flexíveis) são compostos como descritos anteriormente e utilizados na construção desse gene sintético que codifica a proteína multiepitopo recombinante. Os sítios de restrição para enzimas e partes estruturais que facilitam a etapa de purificação da proteína de interesse dependem do tipo de microorganismo utilizado para a expressão, do vetor utilizado e da técnica de purificação disponível. Os microorganismos preferenciais são bactérias. Nos exemplos, a clonagem permite a incorporação de cauda de histidina proveniente do vetor de expressão heteróloga utilizado, no caso pET21a, para propiciar a purificação da proteína compreendo técnicas de cromatografia utilizando níquel. As sequências de cada um dos epitopos selecionados também foram otimizadas para expressão na bactéria Escherichia coli, visando um aumento na expressão da proteína multiepitopo de interesse, principalmente na linhagem BL21. Para este exemplo, o vetor pET21a foi bastante adequado, conforme descrito nos EXEMPLOS 1 a 4.

[023] Na etapa b, a indução da proteína de interesse ocorre por meios conhecidos pela técnica em um período na faixa de aproximadamente 1 a 10 horas. Nos exemplos, após o período de indução (etapa b), a fração celular resultante, passa por um tratamento prévio à etapa de purificação (etapa c). Este tratamento compreende a centrifugação do sistema entre 5000 a 10000 xg e a adição de tampão de lise, com ou sem sonicação. O tampão de lise compreende uma mistura homogênea de uréia de concentração na faixa de 6 a 10 M, NaH2PO4 de 30 a 70 mM, NaCl de 100 a 500 mM e imidazol de 5 a 15 mM em PH básico, por exemplo, na faixa de 8 a 10.

[024] Também nos exemplos, a purificação da proteína de interesse (etapa c) compreende condições desnaturantes e o uso de técnicas de separação por cromatografia, sendo preferidas as baseadas em coluna de afinidade, por exemplo, coluna de níquel. A purificação da proteína multiepitopo, compreendida pela SEQ ID NO: 1, foi feita por coluna de afinidade resina de Ni-NTA, devido a cauda de histidina marcada pelo sublinhado do ácido nucléico precursor, como a compreendida pela SEQ ID NO: 2.

[025] A presente invenção também se refere a um método de diagnóstico de Leishmaniose Visceral Canina ou Leishmaniose Visceral Humana ou de detecção de sorologia positiva ou negativa em cães ou indivíduos portadores do parasito da doença compreendendo o uso de uma proteína multiepitopo recombinante da presente invenção, preferencialmente a proteína representada por SEQ ID NO: 1.

[026] A composição imunogênica para indução de uma resposta imune à Leishmania, compreende a proteína multiepitopo recombinante preferencialmente representada pela SEQ ID NO: 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Esta composição é caracterizada ainda por conter adicionalmente um adjuvante.

[027] Outro aspecto da presente invenção está relacionado a um kit de diagnóstico compreendendo uma proteína multiepitopo recombinante preferencialmente representada pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, e um anticorpo secundário anti-IgG humano marcado com uma substância ou enzima para a detecção de anticorpos Leishmania. Para a detecção são utilizadas amostras fisiológicas de cães e seres humanos, preferencialmente, sangue.

[028] De uma forma geral, todas as metodologias sorológicas se baseiam na detecção de anticorpos (primário) ex&i-Leishmania presentes em amostras fisiológicas, que irá se ligar na proteína multiepitopo da presente invenção. A formação desse complexo (proteína e anticorpo) é detectada por um outro anticorpo (secundário) marcado com uma substância (por exemplo fluoróforo) ou uma enzima (por exemplo, peroxidase, fosfatase alcalina) que irão permitir a visualização por técnicas adequadas, por exemplo, através de microscópio de fluorescência quando se utiliza fluoróforo ou espectrofotômetro.

[029] A proteína recombinante da presente invenção substituiu a proteína dos kits comerciais, em uma única etapa, com resultados semelhantes. Os testes de atividade imunológica foram mostrados no Exemplo 5, comprovando a aplicação da proteína multiepitopo da presente invenção, preferencialmente a representada pela SEQ ID NO: 1 em kits de diagnósticos, e ainda, ser aplicável a métodos de diagnóstico ou de detecção de anticorpos anti-IgG humano estimulado por Leishmania, relacionados a outras modalidades da presente invenção.

[030] A presente invenção refere-se também ao uso da proteína multiepitopo recombinante representada pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, e ainda, ao uso da composição imunogênica. Esta proteína apresenta atividade imunogênica, uma vez que os epitopos selecionados para a sua construção são imunodominantes, responsáveis por elicitarem uma resposta imune de amplo espectro em cães ou indivíduos humanos portadores de Leishmaniose Visceral. Isto implica no seu uso para a preparação de composições imunogênicas e vacinas para a indução de uma resposta imune a esta doença, e ainda, o uso dessa composição na preparação de medicamentos ou biofármacos para prevenção ou tratamento dessa doença, incluindo vacinas anti Leishmania. As proteínas multiepitopos recombinantes também são utilizadas na preparação de anticorpos monoclonais. Esses anticorpos monoclonais podem ter aplicações terapêuticas devido a sua alta especificidade com poucos efeitos colaterais, por exemplo, nas pesquisas de doenças que necessitam de tratamento clínico.

[031] As variantes biológicas ou variações na sequência primária da proteína multiepitopo de interesse também fazem parte do escopo dessa invenção. O termo “modificações peptídicas” se refere a modificações que ocorrem após a síntese da proteína dentro da célula, que são provocadas por modificações químicas nas cadeias laterais de alguns resíduos de aminoácidos. As mais comuns são: acetilação, oxidação, glicosilação e metilação.

[032] A utilização de variantes biológicas da proteína multiepitopo e dos fragmentos proteicos formulados a partir do mesmo também está incluída na invenção, sendo essas variações em sua estrutura capazes de realizar a atividade biológica pretendida. O termo “variante biológica” refere-se a moléculas com sequência de aminoácidos contendo uma ou mais substituições, onde um aminoácido com determinada propriedade física e/ou química é trocado por outros aminoácidos com propriedades físicas, químicas e funcionais iguais ou semelhantes, ou as modificações pós-traducionais, resultando em resíduos de aminoácidos metilados, lipidizados, glicosilados, fosforilados, esterificados, carboxilados, ribosilados, hidroxilados, sulfatados, acetilados, amidados, polimerizados e/ou conjugados em qualquer parte da molécula. Também pode compreender um análogo retroinverso de qualquer um dos peptídeos ou fragmentos funcionais descritos aqui. Os peptidomiméticos também podem ser compreendidos na mesma definição, sendo referente a compostos que tem essencialmente a mesma estrutura do peptídeo correspondente com modificações que aumentam a estabilidade ou a função biológica.

Adicionalmente, “peptidomiméticos” podem envolver aminoácidos sintéticos ou construções com compostos químicos que mimetizem a estrutura dos peptídeos originais. O termo “retroinverso” refere-se a moléculas que contém a sequência de aminoácidos inversa ao do inibidor ou fragmento proteico parental (quando lida da porção N- para a C-terminal). EXEMPLOS: [033] Os procedimentos experimentais envolvidos estão detalhados em cada um dos exemplos a seguir, sendo importante destacar que a invenção não se limita aos exemplos citados, nem pelas figuras apresentadas, sendo utilizada em todas as aplicações descritas ou em quaisquer outras variações equivalentes.

EXEMPLO 1: SÍNTESE QUÍMICA DOS GENES E CLONAGEM NO VETOR DE EXPRESSÃO

[034] A proteína recombinante produzida nessa invenção foi codificada por sequências de DNA sintetizadas em indústrias especializadas na síntese química de genes. No desenho dos genes, feito pelos autores da invenção, foi considerado os seguintes critérios: a) Codon usage dos organismos onde os genes serão expressos; b) Adição de sítios de restrição apropriados nas extremidades dos genes para facilitar as clonagens; c) Os genes sintetizados codificam uma proteína multiepitopo clonada no vetor de expressão heteróloga compatível com o microorganismo utilizado.

[035] Quatro epitopos foram selecionados para desenhar o gene codificador da proteína multiepitopo (Tabela 1). A SEQ ID NO: 2 compreende a sequência de nucleotídeos que refere-se ao ácido nucléico recombinante (exceto pelas terminações, que compõem as estratégias de síntese, por exemplo, o ATG) e a SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de aminoácidos da proteína multiepitopo recombinante denominada rMELEISH. Neste caso, cada um dos epitopos foram separados por linkers ou conectores flexíveis de resíduos de aminoácidos glicina e serina (SEQ ID NO: 11), compondo, assim, uma proteína de aproximadamente 14.4 kDa. Para facilitar a manipulação dessa proteína, três dos epitopos foram repetidos duas vezes, originando uma proteína de aproximadamente 25 kDa (SEQ ID NO: 1). A partir de análises in silico foram selecionados códons preferenciais para E. coli e foram quantificadas as bases nitrogenadas citosina e guanina (CG), sendo observado um total de 59,8% das bases para rMELEISH, apresentada pela sequência de DNA da SEQ ID NO: 2, que possui 588 pb.

[036] Neste exemplo, o gene sintético foi clonado no vetor pET21a (um vetor comercial, largamente utilizado) contendo uma cauda de histidina na extremidade C-terminal. O gene foi inserido em E. coli BL21 (XDE3) pLysS, para indução da expressão da proteína recombinante rMELEISH (representada pela SEQ ID NO: 1). Em seguida, a proteína foi purificada por cromatografia de afinidade.

EXEMPLO 2: EXPRESSÃO HETERÓLOGA DAS PROTEÍNAS MULTIEPITOPOS RECOMBINANTES

[037] O gene que codifica para a proteína multiepitopo a ser expresso em E. coli foi clonado no vetor pET21a que já possui um tag de purificação composto por seis histidinas (His-Tag), o que possibilitará a purificação da proteína recombinante em colunas de afinidade Ni-NTA. A clonagem do gene foi realizada de forma orientada de acordo com os sítios de restrição que foram adicionados na sequência primária dos genes (SEQ ID NO: 2). O vetor resultante foi utilizado para a transformação de E. coli cepa BL21 (XDE3) pLysS. A expressão pode ser feita em pequena escala ou em escalas maiores em frascos sob agitação ou em reatores adequados de acordo com a necessidade. A indução da expressão foi feita pela adição de 1 mM do agente indutor IPTG por duas horas e meia (2h e 30 min), seguindo-se da coleta de amostras e a análise das mesmas através de SDS-PAGE. Após um processo de otimização da produção da proteína multiepitopo, os clones com maiores níveis de expressão, assim como o melhor tempo de indução, foram selecionados para a continuidade do processo de produção. Dados da indução são mostrados na Figura 2, resultando em uma proteína de aproximadamente 25 kDa representada por rMELEISH (SEQ ID NO: 1). Nestes ensaios o marcador de massa molecular utilizado foi o Unstained Protein Molecular Weight Marker - Fermentas Life Science.

EXEMPLO 3: OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO

[038] Os clones selecionados de acordo com o Exemplo 2 podem ser cultivados em fermentadores, monitorando-se os seguintes parâmetros: crescimento, inóculo inicial, pH e aeração. A análise do perfil proteico é realizada por metodologias já estabelecidas pela técnica, por exemplo, por meio da eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), identificando-se deste modo, a presença e integridade das proteínas multiepitopo recombinantes. A quantificação dessas proteínas multiepitopo produzidas neste caso, foi obtida pelo método de Bradford para quantificação de proteínas totais (Bradford MMA. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein 15 utilizing principie of protein dye binding. Anal Biochem 72: 248-254, 1976).

EXEMPLO 4: PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE

[039] As células foram coletadas ao final da indução e centrifugadas, o pellet ressuspendido em tampão desnaturante (tampão de lise, contendo uréia 8M, 20 NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM e imidazol 10 mM, pH 8) ou congelado a - 20 °C. Foi usado somente tampão de lise para liberação do conteúdo intracelular da E. coli, diferente dos outros trabalhos descritos no estado da técnica que usam uma etapa adicional de sonicação, dispensada na presente invenção. A sonicação é utilizada para o rompimento das células visando a liberação de uma maior quantidade da proteína de interesse na fração solúvel. Entretanto, a presente tecnologia foi otimizada de modo a dispensar essa etapa que, em alguns casos, dependendo do tempo de exposição ao ultra-som, pode desnaturar a proteína de interesse. O extrato total foi clarificado por centrifugação (6000 x g por 30min) e o sobrenadante, contendo as proteínas solúveis, foi utilizado para as etapas subsequentes de purificação. A purificação da proteína recombinante, que contém a cauda de histidina, foi conduzida em condição desnaturante. O extrato total de proteína foi incubado por 1 h e 30 min, 4°C, sob agitação orbital com a resina Ni-NTA para ligação da proteína recombinante por afinidade. A lavagem e remoção das proteínas não ligadas ou fracamente ligadas à resina foi feita com tampão de lavagem contendo ureia 8 M, NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM e imidazol 20 mM, pH 8.0, por 4 vezes utilizando 1 mL do tampão em cada etapa. A eluição da proteína recombinante ligada à resina de níquel foi feita com tampão NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM contendo imidazol 50 mM, pH 8.0 em 3 etapas de 500 mL cada uma. As análises de purificação por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) das alíquotas da etapa de eluição (15 mL) resultaram nos dados mostrados na Figura 3, sendo a proteína indicada por rMELEISH, representada por SEQ ID NO: 1.

EXEMPLO 5: AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE IMUNOLÓGICA

[040] A análise de atividade imunológica foi realizada por meio dc um teste baseado na interação anticorpo-antígeno empregando-se a técnica ELISA. Este método de diagnóstico se baseia na interação anticorpo-antígeno. Normalmente, é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidos os antígenos de interesse juntamente com um tampão de carbonato. Este processo é conhecido como sensibilização e pode ser do antígeno ou do anticorpo. Para a sensibilização, nas placas de ELISA foram adicionados de 35 ng de rMELEISH diluída em tampão Bicarbonato de sódio pH 8,5. Para a adsorçâo das proteínas, essas placas foram incubadas a 4°C overnight. Em seguida, a placa foi lavada três vezes com 200 pL/poço com tampão de lavagem PBS (Phosphate Buffer Saline) + tween 20% para uma concentração final de 0,05%. Após as lavagens foi feito o bloqueio com 200 pL de uma solução de PBS acrescido de 5% de leite molico durante 1 hora a 37° C para que esta ocupe os espaços livres (sítios inespecíficos que podem gerar resultados falso positivo ou negativo). Novamente, a placa foi lavada três vezes com 200 pL de tampão de lavagem. Após as lavagens, esta placa foi vertida sobre papel absorvente para retirar o excesso de tampão. Em seguida, a superfície da placa foi então tratada com solução de anticorpo primário, cujo conteúdo é soro de cães ou pacientes com anticorpos contra Leishmania ou soros controles positivos e negativos comerciais. Para esta finalidade, o soro das amostras foi diluído em solução de bloqueio na proporção 1: 20.000 e em seguida incubou-se a placa por 1 hora a 37° C. A superfície foi lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foram incorporados em nenhuma proteína. Em seguida, adicionou-se 200 pL do anticorpo secundário diluído na solução de bloqueio, que irá se ligar ao anticorpo primário (anti-lgG humana conjugado com peroxidase). Após adição do anticorpo secundário a placa foi incubada por 1 hora a 37° C. A enzima acoplada irá produzir uma substância corada quando adicionado o substrato de revelação. Em seguida a superfície da placa foi lavada novamente para a retirada do anticorpo secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Posteriormente, adicionou-se 200 pL de tampão de revelação (TMB) para a enzima produzir a substância corada. Após a adição do revelador, a placa foi incubada por 30 minutos a temperatura ambiente protegida da luz. Em seguida a placa foi lida em espectofotômetro a 405 nm para quantificar a capacidade da proteína adsorvida na placa em reconhecer os anticorpos primários presentes no soro de pacientes.

[041] Os resultados apresentados na Figura 4 ilustram a capacidade desta proteína se ligar aos anticorpos IgG presentes nos soros de cães. Estes resultados confirmam a aplicação da proteína multiepitopo na preparação de kits de diagnóstico e método de diagnóstico de Leishmaniose ou de detecção de anticorpos anti-lgG humano estimulado pelo protozoário Leishmania.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[042] A invenção poderá ser mais compreendida côm base nas Figuras de 1 a 4, cuja descrição segue abaixo: [043] A Figura 1 mostra um esquema ilustrativo da sequência primária da proteína multiepitopo MELEISH (SEQ ID NO: 1), onde os linkers ou conectores flexíveis estão destacados por um retângulo e os epitopos selecionados estão sublinhados.

[044] A Figura 2 mostra a análise da cinética de indução em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12%. Material coletado após a indução de expressão da MELEISH (representada pela SEQ ID NO: 1). Legenda: 1) Marcador de massa molecular. 2) Tempo Oh de indução; 3) indução por 30 minutos; 4) indução por lh 30 min; e 5) indução por 2h 30 min.

[045] A Figura 3 mostra a análise do gel SDS-PAGE das frações da coluna de afinidade de Ni-NTA obtidas no processo de purificação. Legenda: M: Marcador de massa molecular; 1: flowthrough-, Ll, L2 e L3: etapas de lavagem da resina com tampão de lavagem; El e E2: frações da eluição da proteína MELEISH (SEQ ID NO: 1) pura.

[046] A Figura 4 mostra o teste de imunoensaio (ELISA) para a Leishmaniose Visceral Canina (LVC). Legenda: Branco, Ong: não há proteína adsorvida na placa; 35 ng + PBS: há 35 ng de proteína adsorvida sem usar o soro de pacientes, apenas o anticorpo secundário; Ong + Soro não há proteína adsorvida, há somente soro negativo para LVC; Ong + Soro +: não há proteína adsorvida, há somente soro positivo para LVC; 35ng, CS1+ e 35ng, CS2+: há 35 ng de proteína adsorvida com soro positivos para LVC. 35 ng, CA4+ e 35ng + CA14+: há 35 ng de proteína adsorvida com soro de cães assintomáticos para a LVC. 35 ng, CO1-; 35ng CO2-; 35ng; CO3-; 35 ng, CO4- e 35 ng CO5-: há 35 ng de proteína adsorvida com soros negativos para LVC.

REINVIDICAÇÕES

Claims (23)

1. PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE caracterizada por compreender a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, composta pela união das porções imunogênicas da cadeia α da tubulina (SEQ ID NO: 4), proteína do choque térmico de 70 kDa (SEQ ID NO: 6), proteína do choque térmico de 83 kDa (SEQ ID NO: 8) e Cinesina 39 (SEQ ID NO: 10).

2. PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser imunogênico contra Leishmania.

3. PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada por compreender variações na combinação dos epitopos selecionados e conter pelo menos duas das sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10.

4. PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE de acordo as reivindicações 1 a 3, caracterizada por compreender variantes biológicas de modificações em sua sequência primária, como adição, deleção ou substituição de aminoácidos ou outros grupos químicos, principalmente uma ou mais substituições, onde um aminoácido com determinada propriedade física e/ou química é trocado por outros aminoácidos com propriedade física e/ou química e funcionais ou semelhantes, ou ainda, modificações pós-traducionais, resultando em resíduos de aminoácidos metilados, lipidizados, glicosilados, fosforilados, esterificados, carboxilados, ribosilados, hidroxilados, sulfatados, acetilados, amidados, polimerizados e/ou conjugados em qualquer parte.

5. PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE de acordo com as reivindicações de 1 e 2, caracterizada por ser codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 2.

6. PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE de acordo com as reivindicações de 1 e 2, caracterizada pelos epitopos serem unidos por um peptídeo conector, preferencialmente flexível, de 2 a 10 resíduos de aminoácidos.

7. PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato do peptídeo conector compreender preferencialmente os aminoácidos glicina e serina, e ser consistido pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11.

8. ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE caracterizado por compreender a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2, composta pela união das sequências de nucleotídeos da cadeia α da tubulina (SEQ ID NO: 3), proteína do choque térmico de 70 kDa (SEQ ID NO: 5), proteína do choque térmico de 83 kDa (SEQ ID NO: 7), e Cinesina 39 (SEQ ID NO: 9).

9. ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por compreender variações na combinação dos epitopos selecionados entre as sequências de nucleotídeos representadas por SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9.

10. PROCESSO DE OBTENÇÃO DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE, caracterizado por compreender as etapas: (a) Clonagem do ácido nucléico recombinante definido na SEQ ID NO: 2 em um vetor de expressão em microrganismos; (b) Indução da expressão da proteína no vetor de expressão; (c) Purificação da proteína multiepitopo.

11. PROCESSO DE OBTENÇÃO DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato da clonagem permitir a incorporação de cauda de histidina proveniente do vetor de expressão heteróloga utilizado, para propiciar a purificação da proteína.

12. PROCESSO DE OBTENÇÃO DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 10 e 11, caracterizada pela indução da proteína de interesse ocorrer em um período na faixa de aproximadamente 1 a 10 horas;

13. PROCESSO DE OBTENÇÃO DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 10 a 12, caracterizado pelos microrganismos serem preferencialmente bactérias;

14. PROCESSO DE OBTENÇÃO DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE, de acordo com uma das reivindicações de 10 a 13, caracterizado pela purificação da proteína compreender técnicas de cromatografia utilizando níquel.

15. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO de Leishmaniose Visceral Canina ou Leishmaniose Visceral Humana ou de detecção de sorologia positiva ou negativa em cães ou indivíduos portadores de Leishmaniose Visceral caracterizado por compreender o uso da Proteína Multiepitopo Recombinante representada pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

16. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA caracterizada por compreender a Proteína Multiepitopo Recombinante representada pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

17. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por adicionalmente apresentar um adjuvante.

18. KIT DE DIAGNÓSTICO caracterizado por compreender a Proteína Multiepitopo recombinante apresentada pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, e um anticorpo secundário anti-lgG humano marcado com uma substância ou enzima para a detecção de anticorpos anti-Leishmania.

19. KIT DE DIAGNÓSTICO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender a utilização de amostras fisiológicas de cães ou seres humanos, preferencialmente sangue.

20. USO da proteína multiepitopo recombinante caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 e ser utilizada na preparação de um kit de diagnóstico para a detecção de Leishmaniose Visceral Canina ou Leishmaniose Visceral humana.

21. USO da proteína multiepitopo recombinante caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 e ser utilizada na preparação de anticorpos monoclonais.

22. USO da composição imunogênica caracterizado por compreender a Proteína Multiepitopo Recombinante apresentada pela SEQ ID NO: 1 e ser utilizada na preparação de um medicamento ou biofármaco para prevenir ou tratar a Leishmaniose Visceral Canina ou Humana.

23. USO da composição imunogênica caracterizado por compreender a Proteína Multiepitopo Recombinante apresentada pela SEQ ID NO: 1 e ser utilizada na preparação de uma vacina anti-Leishmaniose.