BR102014020266B1 - Processo de interesterificação enzimática para obtenção de composição lipídica interesterificada e uso - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE INTERESTERIFICAÇÃO ENZIMÁTICA, COMPOSIÇÃO LIPÍDICA INTERESTERIFICADA, SEUS USOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, PRODUTO ALIMENTÍCIO E COMPOSIÇÃO COSMÉTICA. A presente invenção descreve um processo de interesterificação enzimática compreendendo a combinação do óleo de patauá e da gordura de estearina de palma e do óleo de buriti e da gordura de murumuru, bem como as composições lipídicas interesterificadas obtidas por este processo, substâncias inéditas ao estado da técnica. Além disso, tem como avanço técnico a potencialização de suas atividades como antimicrobiano, e/ou antioxidante, além de apresentar redução nos tipos de triacilgliceróis, quando comparados à mesma composição não-interesterificada. Também são descritos: composição farmacêutica, produto alimentício e composição cosmética compreendendo tais composições lipídicas interesterificadas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[1] A presente invenção se insere no campo de aplicação da química, biotecnologia, farmácia, mais especificamente, na área de química de materiais e processos, uma vez que se refere ao processo de interesterificação enzimática de óleos e gorduras provenientes de espécies de plantas amazônicas e seus usos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[2] Os lipídeos são um amplo grupo de compostos quimicamente diversos, cuja característica em comum que os define é sua solubilidade em solventes orgânicos e a sua insolubilidade ou fraca solubilidade em água. Nos alimentos, os lipídeos são responsáveis por características como textura e sabor; já as funções biológicas são tão diversas quanto à sua química. Estes ingredientes são portadores de vitaminas solúveis em óleo, contêm ácidos graxos essenciais, são elementos estruturais das membranas biológicas, são cofatores enzimáticos, agentes emulsificantes no trato digestivo, oferecem proteção contra agentes agressores externos, entre outros.

[3] Dentre os lipídeos, os óleos e gorduras vegetais são largamente utilizados como matéria-prima para as indústrias de alimentos, cosmética e farmacêutica. A maior fonte destes óleos e gorduras vegetais é obtida das sementes de plantas cultivadas em climas relativamente temperados. Outras fontes destes óleos e gorduras vegetais também são obtidas de árvores oleaginosas de climas quentes, em que o óleo é extraído em sua maioria da polpa do fruto.

[4] Muitas vezes os óleos e gorduras vegetais apresentam propriedades físicas, nutricionais e químicas pouco atrativas para aplicá-los diretamente em maior escala. Por estas razões, diferentes técnicas têm sido utilizadas para superar as limitações destas matérias-primas. Em particular, tem-se procurado modificar a composição ou a distribuição dos ácidos graxos destes óleos e gorduras; sabendo que essas mudanças irão influenciar nas propriedades físicas, nutricionais e químicas destes óleos e gorduras. A produção de lipídeos que apresentem simultaneamente características físico-químicas mais apropriadas para aplicação industrial e com melhores propriedades biológicas e nutricionais é uma necessidade eminente com grandes possibilidades de aplicações nas indústrias de alimentos, farmacêutica e cosmética. Dentre as técnicas disponíveis para a produção destes lipídeos, têm-se as reações de interesterificação. Estas reações são utilizadas para reestruturar triacilgliceróis (TAGs), induzindo a troca de ácidos graxos na estrutura do glicerol. As mudanças na composição do TAG original, comparado a uma simples combinação de óleo e gordura, modifica as propriedades físicas e nutricionais do TAG reestruturado, aumentando assim as possíveis aplicações deste lipídio.

[5] A interesterificação pode ser química ou enzimática, sendo que na química, apesar de o processo ser mais barato e mais rápido, a redistribuição dos ácidos graxos no glicerol ocorre de forma aleatória, não sendo possível controlar os produtos da reação. Na interesterificação enzimática, devido à alta especificidade da enzima em relação ao tipo de ácido graxo e/ou sua posição no glicerol, maior controle dos produtos da reação é obtido, sendo possível estruturar composições lipídicas interesterificadas que não poderiam ser sintetizadas utilizando métodos químicos. Além disso, a reação de interesterificação enzimática ocorre em condições mais brandas, o que pode ser uma grande vantagem para a produção de composições lipídicas interesterificadas com melhores propriedades nutricionais e funcionais.

[6] Na interesterificação enzimática, as principais enzimas utilizadas como catalisadores são as lipases. Estas enzimas atuam nestas reações na interface óleo/água, em um meio com baixo teor de umidade, suficiente apenas para manter a estrutura proteica da enzima e a sua estrutura espacial. Apesar de todas estas vantagens, a utilização de lipases na modificação de óleos e gorduras ainda é limitada, provavelmente devido ao elevado investimento necessário e o alto custo da enzima. A utilização da interesterificação enzimática é restrito a produtos de alto valor agregado, como na produção de substitutos de gordura de leite materno, gordura com reduzido teor calórico, substituto de manteigas de cacau, margarinas zero trans, lipídeos ricos em w-3, entre outros.

[7] Embora na literatura seja possível encontrar trabalhos com óleos e gorduras que apresentem potencial biológico, como atividades antioxidante, antimicrobiana e anti-inflamatória, quase não existem trabalhos que avaliem o potencial biológico de composições lipídicas interesterificadas produzidas com estes óleos e gorduras. No Brasil, a grande disponibilidade de óleos e gorduras vegetais pouco exploradas e com excelentes propriedades nutricionais favorece o desenvolvimento de composições lipídicas interesterificadas com alto valor agregado. Dentre as regiões brasileiras, a amazônica se destaca.

[8] A Amazônia é a maior floresta tropical do mundo, onde o desconhecimento de sua biodiversidade ainda é uma realidade. Estima-se que a região amazônica apresente mais de 150 árvores oleaginosas dos quais mais da metade são palmeiras, que podem servir como fonte de matérias-primas (óleos e gorduras) de interesse comercial. Os poucos trabalhos disponíveis indicam que estes óleos e gorduras são ricos em compostos bioativos com propriedades biológicas já comprovadas, como os carotenóides, tocóis e esteróis. Os carotenóides são pigmentos naturais amplamente distribuídos na natureza, conhecidos por apresentar elevada capacidade antioxidante. Destes, o β-caroteno é o mais abundante nos alimentos e apresenta potencial como anti- inflamatório em células, além da capacidade de inibir respostas alérgicas em ratos. Os tocóis (tocoferóis mais tocotrienóis) são considerados os antioxidantes solúveis em lipídicos mais eficazes, impedem a peroxidação lipídica, agindo como sequestrantes dos radicais peroxil. Além das propriedades antioxidantes, os tocóis também possuem propriedades anti-inflamatória e antialérgica. Os esteróis são conhecidos por apresentarem atividade anti- inflamatória, além de suas propriedades imunomodulatórias. Assim, a utilização de óleos e gorduras da região amazônica com elevada concentração destes compostos minoritários, pode ser importante na prevenção e tratamento de doenças, na produção de alimentos com melhores qualidades nutricionais e na produção de cosméticos que previnam o envelhecimento e protejam dos efeitos nocivos do sol. Muitos destes óleos e gorduras já são utilizados pela população local da região amazônica como cicatrizante, filtro solar, no tratamento de queimaduras, como antienvelhecimento da pele, anti- inflamatório e antibiótico, sendo muitas vezes incorporados em formulações de sabões e cremes por suas propriedades bactericidas. Entretanto existem poucos estudos com metodologias cientificamente estruturadas que comprovem o potencial terapêutico destes óleos e gorduras.

[9] Além da busca por novas fontes de óleos e gorduras, a busca por novas lipases capazes de catalisar estas reações de interesterificação enzimática é fundamental. O número de lipases disponíveis para estas reações é bastante restrito, na literatura a grande maioria dos trabalhos de interesterificação enzimática utilizam as mesmas poucas enzimas comerciais. A utilização de novas lipases com diferentes especificidades possibilita a formação de novas estruturas de TAG com características físico-químicas e biológicas únicas e muitas vezes a um menor custo.

[10] Desta forma, a proposta desta invenção foi produzir composições lipídicas interesterificadas por lipases microbianas utilizando óleos e gorduras da Amazônia e avaliar o efeito nas características físico-químicas e antimicrobianas destas composições lipídicas. Foram selecionadas duas combinações diferentes para serem estudadas: a primeira delas composta pelo óleo de buriti e a gordura de murumuru; e a segunda composta pelo óleo de patauá e a gordura de estearina de palma. Estas duas combinações foram interesterificadas por três diferentes sistemas enzimáticos: lipase comercial TL-IM (Novozymes), lipase de Rhizopus SP e a mistura de ambas as lipases (comercial + Rhizopus SP).

[11] A interesterificação enzimática, por ser uma técnica que pode melhorar as características físico-químicas, nutricionais e biológicas de óleos e gorduras, justifica-se como alternativa para ampliar o potencial de aplicação de óleos e gorduras da Amazônia. Estes óleos e gorduras por apresentarem a composição em ácidos graxos e em compostos minoritários bastante atrativa podem produzir composições lipídicas interesterificadas com características almejadas pelas indústrias de alimentos, cosmética e farmacêutica.

[12] O desenvolvimento de novas matérias-primas a partir de óleos e gorduras da região amazônica, com propriedades funcionais mais amplas, é uma oportunidade de se agregar valor a estas matérias-primas tão pouco exploradas.

[13] O óleo extraído do fruto da palmeira oleaginosa de buriti, cujo nome científico é Mauritia flexuosa Mart (Arecaceae) apresenta elevada concentração de ácidos graxos monoinsaturados, sendo superior ao azeite de oliva e ao óleo de castanha do Brasil. A fração insaponificável do óleo de buriti apresenta alta concentração de tocóis e carotenóides. O efeito sinérgico destes compostos reduz a formação de radicais livres que causam o envelhecimento da pele. O efeito fotoprotetor em células (fibroblastos e queratinócitos) de loções tópicas formuladas com diferentes surfactantes comerciais e óleo de buriti foi avaliado e os resultados indicaram que a emulsão preparada com mono-oleato de sorbitol e PEG-40 óleo de rícino hidrogenado, foi capaz de reduzir os danos causados pela radiação quando comparado com as células não-tratadas. Foi concluído que a emulsão de óleo de buriti pode ser considerada um potente veículo de transporte de precursores de antioxidantes, podendo ser utilizado como adjunto de protetores solar, especialmente em formulações pós-sol. A atividade antimicrobiana e cicatrizante do óleo de buriti também foi avaliada e os resultados mostraram que houve inibição do crescimento bacteriano de espécies gram-positivas e gram- negativas. Em relação à cicatrização, os resultados indicaram redução no tamanho de feridas cutâneas dos ratos tratados com o óleo.

[14] A palmeira Oennocarpus bataua Mart (Arecaceae), conhecida como patauá, tem grande potencial para a produção de óleos comestíveis. O óleo extraído da fruta é utilizado como medicamento, como cosmético e na culinária. Existem relatos da população local que mencionam que este óleo, por apresentar sabor semelhante ao do azeite de oliva, já foi utilizado pelos europeus como substituto deste durante a segunda guerra mundial. Realmente os resultados de caracterização do óleo indicam o seu potencial como uma nova fonte de óleo monoinsaturado, sendo comparável ao azeite de oliva e ao óleo de girassol com alto teor de ácido oleico. Na sua fracção insaponificável, este óleo é rico em esteróis (Δ5-avenasterol, β-citosterol e cicloartenol), β- caroteno, α-tocoferol, além da presença de flavonoides e ácidos fenólicos. A capacidade antioxidante do óleo de patauá foi avaliada utilizando o radical DPPH (2,2-difenil-1- picril- hidrazil) e obtiveram-se bons resultados. O óleo de patauá, devido à presença de antioxidantes naturais, pode ser mantido por vários meses no ambiente úmido e quente da região amazônica sem sofrer oxidação.

[15] Outra palmeira produtora de gordura que merece destaque é o murumuru, cujo nome científico é Astrocaryum murumuru Mart (Arecaceae). A gordura obtida da noz do fruto é rica nos ácidos graxos láurico e mirístico. Estes ácidos graxos são conhecidos por inibirem o crescimento de patógenos microbianos, uma vez que estes ácidos afetam a membrana celular e a produção de toxinas e enzimas destes micro-organismos. Popularmente, o uso do óleo de murumuru é indicado para o benefício da pele e dos cabelos. A gordura de murumuru é considerada altamente nutritiva, emoliente, hidratante e possibilita a recuperação da umidade e elasticidade natural da pele. O murumuru é utilizado em pequenas proporções em xampus (0,5% até 1%) e em formulações de condicionadores, cremes e loções hidratantes, sabonetes, batons e desodorantes (0,5% até 8%).

[16] A palma (Elaeis guineensis Jacq. - Arecaceae) está sendo cultivada extensivamente no norte do país e produz mais óleo por área do que qualquer outra planta. Quase 90% de óleo de palma do mundo é usado para fins comestíveis. O óleo de palma e suas frações, como a estearina de palma, são usados na fabricação de óleo de cozinha, margarinas e cremes, sorvetes e produtos lácteos. A estearina de palma é rica nos ácidos graxos palmítico e oleico, além de conter uma quantidade significativa do ácido linoleico. O óleo de palma e suas frações também contêm componentes minoritários, com propriedades nutricionais e funcionais, incluindo: tocoferóis, tocotrienóis, carotenóides, fitoesteróis, compostos fenólicos e outros fitonutrientes essenciais para a saúde humana.

[17] A caracterização físico-química dos óleos de patauá e buriti e das gorduras de murumuru e estearina de palma indicam o potencial biológico dos mesmos para as indústrias de alimentos, cosmética e farmacêutica. Para viabilizar a utilização destes óleos e gorduras, a produção de composições lipídicas interesterificadas utilizando lipases, pode favorecer o desenvolvimento de composições com maior aplicação comercial, maior estabilidade e com maior potencial biológico e nutricional.

[18] O óleo buriti é rico em ácido oleico, além de apresentar uma concentração elevada de carotenóides e tocoferol; enquanto que a gordura de murumuru é rica em ácidos graxos de cadeia média. As composições lipídicas interesterificadas produzidas, devido às características das matérias-primas e lipases, podem ser aplicadas em áreas como a cosmética e farmacêutica.

[19] O óleo de patauá é rico em ácido oleico, além de ser rico em tocoferóis; enquanto que a estearina de palma é rica em ácido palmítico. As composições lipídicas interesterificadas produzidas, devido ao elevado ponto de fusão da estearina de palma e a forma de ação das lipases, apresentam características semissólidas, característica desejada em diversas aplicações de diferentes áreas.

ESTADO DA TÉCNICA

[20] O uso da interesterificação enzimática para a produção de composições lipídicas interesterificadas com maior potencial biológico ainda é bastante restrito. Os poucos trabalhos disponíveis indicam o potencial desta técnica e sugerem a necessidade de mais estudos.

[21] O artigo “Effect of blending and lipase catalyzed interesterification reaction on the cholesterol lowering properties of palm oil with rice bran oil in rats” sugere que a distribuição dos ácidos graxos no TAG influenciam na expressão dos genes que causam a circulação de LDL-colesterol (lipoproteína de baixa densidade) em ratos. Após a administração de óleos interesterificados em ratos, os autores obtiveram resultados de LDL-colesterol na circulação sanguínea bastante inferior, quando comparado com os resultados obtidos após a administração de óleos que sofreram apenas mistura física.

[22] No artigo “Hypolipidemic effect of oils with balanced amounts of fatty acids obtained by blending and interesterification of coconut oil with rice bran oil or sesame oil” óleos interesterificados com efeito hipolipidêmico em ratos foram produzidos. Os óleos foram produzidos pela reação entre os óleos de coco e o óleo de farelo de arroz ou óleo de gergelim utilizando a lipase de Rhizomur miehei. O objetivo foi produzir composições com igual proporção de ácidos graxos saturados, monoinsaturados e polinsaturados, para que apresentassem estabilidade oxidativa e maior qualidade nutricional. Os constituintes minoritários presentes nas composições, como o orizanol presente no óleo de farelo de arroz e a sesamina (tipo de lignana) presente no óleo de gergelim, também contribuíram para a produção de uma composição com maior qualidade nutricional. Os resultados indicaram que após a reação de interesterificação, as composições apresentaram maior estabilidade, além de reduzir em ratos os índices de colesterol sérico e de lipídios no fígado.

[23] Já no artigo “Hypocholesterolemic effects of low calorie structured lipids on rats and rabbits fed on normal and atherogenic diet” foram produzidas composições lipídicas interesterificadas com baixo teor de calorias e com efeito hipocolesterolêmico em ratos e coelhos. As composições lipídicas interesterificadas foram produzidas através de reações de interesterificação enzimática entre etil behenato (éster metílico do ácido behênico) e óleos de soja ou de girassol. Os ácidos graxos de cadeia muito longa, como o ácido behênico, apresentam absorção limitada, em partes devido ao fato destes ácidos terem ponto de fusão mais elevado do que a temperatura do corpo, e terem baixa capacidade de formar emulsão e de se solubilizar. As composições lipídicas interesterificadas formadas apresentaram aproximadamente 29% de ácido behênico, além de apresentar quantidade elevada do ácido linoleico. As composições lipídicas interesterificadas sintetizadas apresentaram menor teor de calorias, reduziram o acúmulo de lipídeos nas artérias dos coelhos, além de reduzir os teores de colesterol séricos e o depósito de gordura no fígado destes coelhos e dos ratos.

[24] Os pedidos de patentes EP0245076, CA2723166, US2011091946 e CN102776077, descrevem o uso de reações de interesterificação enzimática para a produção de composições lipídicas interesterificadas e a caracterização físico-química do lipídio original e/ou das composições lipídicas interesterificadas. Porém, nenhum destes documentos utiliza a lipase de Rhizopus SP e a combinação de óleo/gordura proposta pela presente invenção.

[25] A inovação desenvolvida diz respeito ao emprego da reação de interesterificação mediada por diferentes sistemas de lipases microbianas em 2 sistemas de óleo naturais da Amazônia: a reação conferiu à composição lipídica interesterificada formada propriedades biológicas inusitadas e não relatadas na literatura: -atividade antimicrobiana - ambas as composições após a reação apresentam maior potencial antimicrobiano do que a mistura simples; atividade antioxidante - ambas as composições após a reação apresentam maior potencial antioxidante do que a mistura simples.

OBJETIVO E VANTAGENS DA INVENÇÃO

[26] A presente invenção tem por objetivo produzir composições lipídicas interesterificadas de óleos e gorduras da região amazônica com possíveis propriedades nutricionais, biológicas e melhores características físico-químicas. Estas composições serão produzidas por interesterificação enzimática, utilizando lipases produzidas em laboratório e enzimas comercialmente disponíveis.

[27] Apesar dos óleos e gorduras da região amazônica serem ricos em compostos bioativos, estes óleos e gorduras são pouco estudados e, por isso, pouco explorados do ponto de vista biológico e nutricional. Estratégias de melhoramento destes óleos e gorduras para aplicação em escala industrial não são exploradas. O desenvolvimento de composições lipídicas interesterificadas com propriedades bioativas utilizando enzimas para produzi-las, permite a valorização e aplicação destas riquezas naturais pouco exploradas e com enorme potencial comercial.

[28] Dessa forma, a presente invenção também avalia as características físico-químicas das composições antes e após a interesterificação, comparando os diferentes sistemas de enzima utilizados e verifica o potencial bioativo das composições antes e após a interesterificação.

[29] A utilização de óleos com possíveis propriedades funcionais para a produção de composições lipídicas interesterificadas, é uma estratégia que aumenta o potencial de aplicação destas composições. Entretanto, trabalhos que utilizam estes óleos funcionais, para a produção de composições lipídicas interesterificadas, não são encontrados. Uma das razões para isto, está no fato de que, os compostos que proporcionam qualidades funcionais aos óleos são perdidos durante o processo de refino dos mesmos. Assim, os óleos com propriedades funcionais, são óleos não refinados, o que dificulta a ação dos catalisadores para a produção de composições lipídicas interesterificadas. Os óleos amazônicos não refinados sofrem oxidação mais rapidamente, o que faz com que eles tenham maior acidez que os óleos refinados. Por esta razão, a utilização de catalisadores químicos tradicionais (metóxidos) torna-se difícil, uma vez que, estes catalisadores reagem com os ácidos presentes no óleo. A busca de enzimas capazes de atuar neste sistema é um desafio grande. Muitas vezes a alteração do pH no sistema, impede a ação da enzima. Portanto, os resultados obtidos com as enzimas testadas nesta invenção, mostram que, mesmo utilizando óleos não refinados, as enzimas foram capazes de atuar e com resultados satisfatórios. O resultado utilizando a enzima bruta e produzida pelo fungo de Rhizopus SP, foi ainda melhor, uma vez que, além de ser produzida com menor investimento, esta enzima foi específica nestes sistemas; característica que possibilita prever o principal produto formado.

[30] As características físico-químicas e nutricionais obtidas utilizando esta tecnologia indicam que estas composições apresentam características que podem ser utilizadas na fabricação de produtos cosméticos, alimentos e medicamentos. Observou-se majoritariamente a formação de TAG S2U e SU2, espécies com grande potencial de aplicação, uma vez que este tipo de TAG têm propriedades de estruturação e lubrificação. Em alimentos, a utilização pode ser feita para produtos com redução de gorduras saturados e trans, demanda atualmente necessária na produção de alimentos. Podem ser usadas ainda em fórmulas infantis como alternativa à gordura do leite materno; substitutos para a manteiga de cacau; lipídeos com baixa caloria; gorduras plásticas para aplicação em recheios de biscoito e coberturas, assim como para margarinas; lipídeos ricos em ômega 3 e em compostos fenólicos. Além disso, estas composições têm grande potencial de aplicação em formulações cosméticas e farmacêuticas, uma vez que, os óleos que compõem a composição (buriti e murumuru e patauá e estearina de palma) são utilizados pela população amazônica como cicatrizante, anti-inflamatório, antimicrobiano, protetor solar, repelente e antioxidante. Assim, a interesterificação deste óleo e desta gordura já amplia a aplicação dos mesmos, uma vez que houve o aumento dos ácidos graxos insaturados e formação de TAG mais homogêneos e com melhores características técnicas.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[31] A presente invenção descreve um processo de interesterificação enzimática de óleos e gorduras provenientes de quatro espécies de plantas amazônicas. Além disso, tem como avanço técnico a potencialização de sua atividade como antimicrobianoe/ou antioxidante, além de apresentar maior quantidade de TAGs insaturados, quando comparado à mesma composição não- interesterificada.

[32] Foram utilizados para a produção das composições uma combinação compreendendo um óleo de patauá e uma gordura de estearina de palma e composições compreendendo um óleo de buriti e uma gordura de murumuru. Para a produção e caracterização quanto ao potencial biológico destas composições lipídicas interesterificadas utilizaram-se, para efeito de concretização da presente invenção, três sistemas de enzimas: lipase não comercial (Rhizopus SP) produzida por fermentação em estado sólido; lipase comercial Lipozyme TL-IM (Novozymes) e mistura das lipases comercial e não-comercial.

[33] Os resultados obtidos dos exemplos de concretização quanto a análise do comportamento térmico mostraram que a quantidade de picos de fusão das composições após a interesterificação foi reduzida, indicando que houve a homogeneização dos lipídios formados, isto é, a formação de espécies de TAGs semelhantes, característica importante quando se aplica estes óleos e gorduras em matrizes mais complexas. Os resultados de distribuição regiões específicas e de composição em triacilgliceróis indicaram que estas composições lipídicas interesterificadas apresentaram aumento no teor TAGs S2U e SU2 e redução TAG S3 e U3, características bastante desejada do ponto de vista nutricional, biológico e de aplicação. Determinados ácidos graxos saturados, como os ácidos palmíticos e mirísticos, estão relacionados com diversas síndromes metabólicas, especialmente no aumento do TAG plasmático, colesterol total e do LDL-colesterol. Sabe-se também que a estabilidade e as propriedades de estruturação dos TAGs U3 é bastante baixa, assim, a conversão destes TAGs em monoinsaturados e di-insaturados, além de conservar os efeitos positivos dos ácidos graxos insaturados, garante melhor aplicação destas composições. Assim, além do processo de interesterificação destes óleos ter aumentado à possibilidade de aplicação dos mesmos, a utilização de uma enzima bruta e não imobilizada nesta reação, faz com que estes produtos obtidos tenham custo final reduzido, ampliando a possibilidade de aplicação destas composições lipídicas interesterificadas. Esta enzima apresentou especificidade para as posições sn-1,3 do TAG na combinação buriti/murumuru, a principal característica que justifica a substituição dos catalisadores químicos tradicionais pelas enzimas; e apresentou especificidade para o tipo de ácido graxo (insaturado) na combinação patauá/estearina de palma.

[34] Além disso, podem-se contar como diferenciais: a estruturação de uma composição lipídica interesterificada inédita, resultante da interesterificação de uma gordura e um óleo amazônico. Essa composição resultante apresenta uma taxa maior de TAGs mono e di-insaturados (e menor de tri-Saturados) que a simples composição não-interesterificada dos lipídeos originais; a maior quantidade de TAGs insaturados implica em uma temperatura de fusão e cristalização menor, e uma região endotérmica mais homogênea, o que garante maior estabilidade para as possíveis aplicações comerciais e para aplicações em alimentos funcionais, uma vez que TAGs tri-saturados estão associados à produção de colesterol LDL (ruim) e doenças coronárias; e a emulsão com tamanho de gota menor para a composição lipídica interesterificada, que é responsável por uma maior superfície de interação e ao qual se credita à ampliação do potencial antibacteriano e antioxidante desses óleos, como comprovado nos resultados expostos a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[35] A Figura 1 representa graficamente a distribuição regioespecífica de ácidos graxos na posição sn-2 das composições lipídicas não-interesterificadas e interesterificadas de buriti e murumuru catalisadas por sistemas enzimáticos diferentes.

[36] A Figura 2 representa graficamente a distribuição regioespecífica de ácidos graxos nas posições de sn-1,3 das composições lipídicas não-interesterificadas e interesterificadas de buriti e murumuru catalisadas por sistemas enzimáticos diferentes.

[37] A Figura 3 representa graficamente a distribuição regioespecífica de ácidos graxos na posição sn-2 das composições lipídicas não-interesterificadas e interesterificadas de patauá e estearina de palma catalizadas por sistemas enzimáticos diferentes.

[38] A Figura 4 representa graficamente a distribuição regioespecífica de ácidos graxos nas posições de sn-1,3 das composições lipídicas não-interesterificadas e interesterificadas de patauá e estearina de palma catalisadas por sistemas enzimáticos diferentes.

[39] A Figura 5 representa graficamente o efeito das composições lipídicas não-interesterificadas e interesterificadas em diferentes concentrações (2, 6, 10, 14, 18 ou 22%) sobre a atividade antimicrobiana de B.cereus e E.coli.

[40] A Figura 6 representa graficamente a relação entre inibição microbiana de B.cereus e E.coli e a área de superfície específica das emulsões produzidas com as composições lipídicas de buriti e murumuru não-interesterificadas e interesterificadas.

[41] A Figura 7 representa graficamente a relação entre inibição microbiana de B.cereus e E.coli e a área de superfície específica das emulsões produzidas com as composições lipídicas de patauá e estearina de palma não-interesterificadas e interesterificadas.

[42] A Figura 8 representa graficamente a relação entre inibição microbiana de B.cereus e E.coli e a área de superfície específica das emulsões produzidas com as composições lipídicas não-interesterificadas e interesterificadas na concentração de 2%.

[43] A Figura 9 representa graficamente os resultados do ensaio de DPPH para as composições compreendendo um óleo de Buriti e uma gordura de Murumuru, na concentração de amostra de 100μL/ml no sistema reacional, sendo a sequência das colunas seguindo respectivamente a lista das composições da presente invenção.

[44] A Figura 10 representa graficamente resultados do ensaio de DPPH para as composições compreendendo um óleo de Buriti e uma gordura de Murumuru, na concentração de amostra de 50μL/ml no sistema reacional, sendo a sequência das colunas seguindo respectivamente a lista das composições da presente invenção.

[45] A Figura 11 representa graficamente resultados do ensaio de DPPH para as composições compreendendo um óleo de Buriti e uma gordura de Murumuru, na concentração de amostra de 10μL/ml no sistema reacional, sendo a sequência das colunas seguindo respectivamente a lista das composições da presente invenção.

[46] A Figura 12 representa graficamente os resultados do ensaio de DPPH para as composições compreendendo um óleo de Buriti e uma gordura de Murumuru, na concentração de amostra de 5μL/ml no sistema reacional, sendo a sequência das colunas seguindo respectivamente a lista das composições da presente invenção.

[47] A Figura 13 representa graficamente os resultados do ensaio de DPPH para as composições compreendendo um óleo de Patauá e uma gordura de Estearina de Palma, na concentração de amostra de 100μL/ml no sistema reacional, sendo a sequência das colunas seguindo respectivamente a lista das composições da presente invenção.

[48] A Figura 14 representa graficamente os resultados do ensaio de DPPH para as composições compreendendo um óleo de Patauá e uma gordura de Estearina de Palma, na concentração de amostra de 50μL/ml no sistema reacional, sendo a sequência das colunas seguindo respectivamente a lista das composições da presente invenção.

[49] A Figura 15 representa graficamente os resultados do ensaio de DPPH para as composições compreendendo um óleo de Patauá e uma gordura de Estearina de Palma, na concentração de amostra de 10μL/ml no sistema reacional, sendo a sequência das colunas seguindo respectivamente a lista das composições da presente invenção.

[50] A Figura 16 representa graficamente os resultados do ensaio de DPPH para as composições compreendendo um óleo de Patauá e uma gordura de Estearina de Palma, na concentração de amostra de 5μL/ml no sistema reacional, sendo a sequência das colunas seguindo respectivamente a lista das composições da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Processo de interesterificação enzimática

[51] A presente invenção descreve um processo de interesterificação enzimática que compreende as etapas de: a) Alimentação do sistema com uma matéria-prima compreendendo uma combinação de óleo de patauá e de uma gordura de estearina de palma ou de óleo de buriti e de gordura de murumuru; b) Adição de uma enzima para promover a interesterificação; c) Agitação sob temperatura e pressão controlados, e d) Separação da composição lipídica interesterificada e enzima.

Exemplos de concretização da invenção Interesterificação enzimática de uma composição lipídica compreendendo a combinação Buriti/Murumuru

[52] A interesterificação enzimática de uma combinação compreendendo um óleo de buriti e uma gordura de murumuru foi realizada, como exemplo de concretização, sem entretanto restringir o escopo, e o processo na forma como consta, em banho termostatizado com agitação a 150 rpm por 24 h a 40° C (35° C - 55° C), a vácuo. A proporção em peso de óleo: gordura foi de preferencialmente, sem entretanto restringir nesta proporção, 70: 30. No exemplo, a concentração de enzima final variou entre 2,5 e 10% (p/p). Para garantir a padronização, para efeito de exemplo de concretização, sem entretanto ser uma etapa restritiva, antes da reação, as enzimas foram secas sob vácuo a 40° C durante 30 minutos. Após a conclusão da reação, a composição lipídica interesterificada foi filtrada. Neste exemplo de concretização, sem entretanto restringir, usou-se um filtro de membrana de 0,45 μm. A composição lipídica não-interesterificada (mistura física) também sofreu as mesmas condições de reação.

Interesterificação enzimática de uma composição lipídica compreendendo a combinação Patauá/Estearina de palma

[53] A interesterificação enzimática de uma combinação compreendendo um óleo de patauá e uma gordura de estearina de palma foi realizada sob agitação e temperatura controladas (sendo no presente exemplo de concretização 150 rpm por 24 h a 50° C, a vácuo). A proporção em peso de óleo: gordura foi de 70: 30, sem entretanto restringir para esta proporção. Em todos os sistemas, a concentração de enzima final variou entre 2,5 e 10% (p/p). Para garantir a padronização, para efeito de exemplo de concretização, sem entretanto ser uma etapa restritiva, antes da reação, as enzimas foram secas a vácuo a 40° C durante 30 minutos. Após a conclusão da reação, a composição lipídica interesterificada foi filtrada. Neste exemplo de concretização, sem entretanto restringir, usou-se um filtro de membrana de 0,45 μm. A composição lipídica não-interesterificada (mistura física) também sofreu as mesmas condições de reação.

[54] Devido às condições suaves da reação, a interesterificação enzimática provou ser uma estratégia adequada para a produção de óleos novos e alternativos com distribuições melhoradas de ácidos graxos.

[55] A interesterificação de uma combinação compreendendo um óleo de buriti e uma gordura de murumuru, usando sistemas de enzimas diferentes, produziu composições lipídicas interesterificadas com triglicerídeos mais homogêneos, especialmente os triglicerídeos mono e diinsaturados. As lipases usadas nesta invenção mostraram diferentes especificidades nestas composições. A lipase de Rhizopus SP, até mesmo como uma enzima bruta, mostrou a especificidade para as posições sn-1 e sn-3 de triacilglicerol, indicando o seu potencial para a produção de composições lipídicas interesterificadas a um custo reduzido.

[56] A interesterificação de uma combinação compreendendo um óleo de patauá e uma gordura de estearina de palma, usando sistemas de enzimas diferentes, produziu composições lipídicas interesterificadas com triglicerídeos mais homogêneos, especialmente os triglicerídeos mono e diinsaturados. As lipases usadas nesta invenção mostraram diferentes especificidades nestas composições. A lipase de Rhizopus SP, produzida pela fermentação de estado sólido utilizando resíduos agroindustriais, mostrou especificidade por ácidos graxos insaturados, indicando o seu potencial para a produção de composições lipídicas interesterificadas a um custo reduzido. As composições lipídicas interesterificadas obtidas nesta invenção atendem a crescente demanda da indústria por novas fontes de lipídeos.

Caracterização físico-química

[57] Para ambas as composições lipídicas, foram determinadas as classes dos lipídeos, distribuição de regiões específicas, composição em triacilgliceróis, isotermas de cristalização e o comportamento térmico na fusão e cristalização.

Composição lipídica compreendendo a combinação Buriti/Murumuru Composição em ácidos graxos

[58] Os resultados na Tabela 1 mostram que o óleo de buriti é composto principalmente de ácido oleico e também é muito rico em ácido linolênico, um precursor de w-3. A gordura de murumuru inclui grandes quantidades de ácidos graxos láurico e mirístico. A combinação de óleo de buriti com gordura de murumuru apresenta concentração semelhante de ácidos graxos saturados e monoinsaturados; indicando a produção de uma composição que mostra os efeitos positivos do ácido oleico e ácido láurico, além de maior estabilidade de oxidação. Tabela 1: Composição em ácidos graxos (%) de buriti e murumuru

* Composta por 70% de óleo de buriti e 30% de gordura de murumuru.

Distribuição regioespecífica

[59] As Figuras 1 e 2 mostram que todos os três sistemas de enzimas usados para interesterificação causaram mudanças na distribuição dos ácidos graxos no triacilglicerol (TAG). A redistribuição dos ácidos graxos variou dependendo do sistema de enzima utilizado. Composições lipídicas interesterificadas produzidas utilizando apenas a lipase de Rhizopus SP mostraram uma ligeira mudança na posição sn-2 do TAG, indicando a baixa especificidade desta enzima para esta posição; considerando que na posição sn-1,3 do TAG houve várias mudanças significativas na distribuição dos ácidos graxos. É possível observar um aumento nos níveis de ácidos graxos insaturados nestas posições, mostrando que a enzima é específica para reesterificar os ácidos graxos insaturados nestas posições do TAG. Os ácidos graxos insaturados, principalmente o ácido oleico, estavam presentes em níveis mais elevados nas composições lipídicas interesterificadas após a reação de interesterificação com esta enzima. Lipases específicas tornam possível a produção de gorduras e óleos com uma estrutura de TAG personalizada.

[60] As composições lipídicas interesterificadas produzidas utilizando a enzima comercial mostraram mudanças nas três posições de TAG. As composições lipídicas interesterificadas formadas com esta enzima mostraram níveis elevados de ácidos graxos insaturados em todas as três posições da TAG. Portanto, esta enzima é específica para o tipo de ácido graxo, mas não específica para a posição do ácido graxo no TAG. A especificidade de uma lipase depende em grande parte da estrutura do substrato, a interação com o sítio ativo e as condições de reação. Assim, a presença de TAGs com ácidos graxos de cadeias curtas e médias, a presença de ácidos graxos livres no meio e o tempo de reação podem impedir a exclusividade da ação desta enzima nas posições de sn-1,3 do TAG. Além disso, as condições de reação podem ter induzido a migração de acila, que é a migração de ácidos graxos de posições sn-1,3 a sn-2 ou da posição sn-2 para a sn-1,3.

[61] As composições lipídicas interesterificadas formadas usando ambas as enzimas (comerciais e de Rhizopus SP) apresentam um comportamento intermediário, em comparação com as outras composições lipídicas interesterificadas: um aumento de ácidos graxos insaturados em três posições do TAG, especialmente em posições sn-1 e sn-3. Neste caso, o sistema enzimático não era específico para a posição no TAG, mas para o tipo de ácido graxo. Aparentemente não se observou efeito sinérgico da combinação das enzimas.

Composição em triacilgliceróis

[62] A composição em triacilgliceróis é a chave para entender as várias propriedades físicas de um óleo ou gordura. No óleo de buriti, os tipos principais de TAGs encontrados são palmítico- oleico-oleico (OOP), representando 25% dos TAGs totais; e oleico- oleico-oleico (OOO), representando 29% dos TAGs totais presentes neste óleo. Na gordura de murumuru, os TAGs mais comuns encontrados são o láurico-láurico-mirístico (LaLaM), representando 21% dos TAGs totais, láurico-mirístico-mirístico (LaMM), representando 16% dos TAGs totais e láurico-láurico-láurico (LaLaLa), representando 14% dos TAGs totais presentes na gordura. A interesterificação causou alteração significativa na composição dos TAGs das composições estudadas (Tabela 2). Na composição catalisada pela lipase de Rhizopus SP em uma concentração de 2,5%, houve reduções nas proporções de TAGs dos tipos tri-saturados (S3) e tri- insaturados (U3), em 72% e 38%, respectivamente. Enquanto isso, os níveis de TAGs disaturados-insaturados (S2U) e TAGs saturados- diinsaturados (SU2) aumentaram em 100% e 52%, respectivamente. Um comportamento semelhante foi observado quando se usou esta mesma enzima em uma concentração de 10%.

[63] Os resultados obtidos com a enzima comercial em uma concentração de 2,5%, assim como aconteceu com as composições lipídicas interesterificadas produzidas com a enzima de Rhizopus SP, indicaram reduções em TAGs S3 e TAGs U3, de 90% e 24%, respectivamente e aumento em TAGs S2U e TAGs SU2, de 63% e 66%, respectivamente.

[64] Os resultados obtidos com a composição lipídica interesterificada produzida com uma mistura de ambas as enzimas obtiveram o mesmo comportamento que as outras duas composições lipídicas interesterificadas: diminuição dos TAGs S3 e TAGs U3 e aumento dos TAGs S2U e TAGs SU2. Portanto, todas as composições lipídicas interesterificadas após a interesterificação apresentaram principalmente TAGs SU2, seguido por TAGs S2U e TAGs U3. Todas as composições lipídicas interesterificadas mostraram uma concentração muito reduzida de TAGs S3 quando comparado com a composição não-interesterificada. A redução na quantidade de TAGs S3 mostra uma grande vantagem em uma perspectiva de saúde. Certos ácidos graxos saturados, incluindo ácido palmítico e ácidos mirístico, estão relacionados com várias síndromes metabólicas, especialmente aumento da concentração de triglicerídeos no plasma, de colesterol total e de lipoproteína de baixa densidade de colesterol (LDL-C).

[65] Do ponto de vista tecnológico, a conversão de TAGs S3 e U3 em S2U e SU2 também é de grande interesse. A formação desses TAGs aumenta a aplicação das composições lipídicas interesterificadas resultantes, porque eles podem fornecer estrutura e lubricidade aos produtos. O TAG S3 só fornece estrutura para os produtos, enquanto o TAG U3 só proporciona lubricidade e tem baixa estabilidade. Além disso, ácidos graxos saturados promovem a cristalização, que é considerada indesejável em muitas aplicações tecnológicas. Os TAGs tipo S2U têm pontos de fusão entre 27 e 42 ° C, enquanto TAGs tipo SU2 têm pontos de fusão entre 1 e 23 ° C. Estes mesmos perfis de TAGs podem ser observados nas reações de interesterificação com diferentes tipos de catalisadores e óleos. Tabela 2: Classe de triacilglicerol em óleo de buriti, gordura de murumuru, e composições lipídicas não-interesterificadas e interesterificadas catalisadas por sistemas enzimáticos diferentes

1lipase específica de Sn-1,3 (padrão não aleatório) 2nenhuma lipase(s) específica (padrão aleatório)

Propriedades térmicas

[66] A avaliação do comportamento térmico utilizando calorimetria de varredura diferencial (DSC) mede a energia envolvida na fusão (endotérmica) e processo de cristalização (exotérmica) de óleos e gorduras. As curvas de fusão e cristalização podem ser subdivididas em regiões diferentes, refletindo que os diferentes tipos de TAGs presentes na composição antes e depois da interesterificação. A interesterificação pode alterar os tipos de TAGs inicialmente presentes na composição, alterando assim suas propriedades térmicas. Esta análise é considerada uma ferramenta importante para caracterizar os produtos interesterificados.

[67] Na presente invenção, os resultados do comportamento de fusão térmico (Tabela 3) mostraram que todas as composições lipídicas interesterificadas produzidas utilizando sistemas enzimáticos diferentes mostraram reduções na temperatura de início de fusão (T0m) e na temperatura final de fusão (Tfm) e terminaram com apenas o pico de fusão (pico 1) de TAGs mais insaturados. O segundo pico, de TAGs mais saturados com pontos de fusão mais elevados, desapareceu. Este efeito também pode ser visto no aumento do valor de ΔH1, mostrando o aumento da participação dos TAGs mais altamente insaturados em composições lipídicas interesterificadas e a eliminação de ΔH2, um resultado da eliminação dos TAGs mais saturados em composições lipídicas interesterificadas. Os ensaios de comportamento de fusão térmico indicaram a formação de uma única região endotérmica com TAGs mais homogêneos. Essa característica facilita o uso das composições lipídicas interesterificadas formadas, já que impede a separação do óleo e da gordura a uma dada temperatura. Tabela 3: Temperatura de início de fusão (Tom), temperatura de pico de fusão (Tpm), entalpia de fusão(AHm) e temperatura final de fusão (Tfm) das composições lipídicas não-interesterificadas e interesterificadas catalisadas por sistemas enzimáticos diferentes

[68] Observa-se o mesmo tipo de modificação no comportamento térmico da cristalização, porque os fenômenos de fusão e cristalização são revertidos no scan avaliado. Na cristalização das composições (Tabela 4), observou-se uma redução dos valores de entalpia para o primeiro pico (ΔHf1), indicando uma menor participação de TAGs mais altamente saturados em composições lipídicas interesterificadas, e observou-se um aumento nos valores de entalpia para o segundo pico (ΔHf2), indicando uma maior participação de TAGs SU2 e S2U nas composições lipídicas interesterificadas. Estes resultados confirmam os obtidos para a composição de TAGs na seção anterior. Tabela 4: Temperatura de início de cristalização (Toc), temperatura de pico de cristalização (Tpc), entalpia de cristalização (AHc) e temperatura final de cristalização (Tfc) das composições lipídicas não-interesterificadas e interesterificadas catalisadas por sistemas enzimáticos diferentes

[69] Os resultados de DSC confirmaram as alterações nas características físico-químicas das composições após interesterificação, indicando que as composições lipídicas interesterificadas obtidas exibiram características que melhoram a sua utilidade.

Composição lipídica compreendendo a combinação Patauá/Estearina de palma Composição em ácidos graxos

[70] Os resultados na Tabela 5 indicam que o óleo de patauá é muito rico em ácido oleico (74,5%). A composição de ácidos graxos também indica que este óleo apresenta ácido palmítico como o principal ácido graxo saturado (16%). Quanto ao ácido linoleico poli-insaturado, a concentração neste óleo não excede 6,0%, o que garante uma boa estabilidade oxidativa. Em relação à estearina de palma, o ácido palmítico é o seu principal ácido graxo (47%), seguido por ácido oleico (28%) e ácido linoleico poli-insaturado (13%). Tabela 5: composição em ácidos graxos (%) de patauá e estearina de palma

* Composta por 70% de óleo de patauá e 30% de estearina de palma.

Distribuição regioespecífica

[71] A distribuição regioespecífica de ácidos graxos no TAG tem implicações para as qualidades nutricionais e tecnológicas de óleos e gorduras. Na presente invenção, a redistribuição de ácidos graxos no TAG foi diferente dependendo da enzima usada (Figuras 3 e 4).

[72] A enzima de Rhizopus SP em ambas as concentrações testadas, 2,5% e 5,0% (p/p), exibiram essencialmente o mesmo comportamento, indicando que concentrações menores da enzima foram suficientes para saturar o substrato. As composições lipídicas interesterificadas formadas com esta enzima exibiram uma maior concentração de ácidos graxos saturados na posição sn-2 do TAG e ácidos graxos insaturados na posição sn-1,3 do TAG. Estes resultados indicaram que a enzima foi específica para ácidos graxos insaturados, principalmente ácido oleico, tanto na hidrólise quanto na síntese de ácidos graxos no glicerol.

[73] Durante a síntese, a enzima também foi específica para a posição de sn-1,3 do TAG. A formação de TAGs ricos em ácidos graxos saturados na posição sn-2 e ácidos graxos insaturados na posição sn-1,3 é bastante oportuna, uma vez que produtos tais como a gordura do leite humano apresentam este perfil de TAG; a ação da lipase pancreática no corpo humano, uma enzima que é sn-1,3 específica, faz com que os ácidos graxos localizados na posição sn-2 do TAG sejam mantidos sob a forma de 2-MAG, e portanto, possam ser mais facilmente liberados.

[74] Na natureza, óleos vegetais são geralmente ricos em ácidos graxos insaturados na posição sn-2 do TAG e ácidos graxos saturados na posição sn-1,3 do TAG. Métodos para produzir TAGs ricos em ácido palmítico na posição sn-2 são, portanto, de grande interesse industrial, já que esses TAGs não são produzidos em níveis industriais.

[75] Quanto à reação catalisada por lipase comercial, não houve alteração na distribuição de ácidos graxos saturados e insaturados nas três posições do perfil do TAG, mas sim alterações ocorridas nos tipos de TAGs (descritos na próxima seção). Provavelmente o que ocorreu foi a substituição de certos ácidos graxos saturados por outros ácidos graxos saturados na mesma posição, que é o mesmo que ocorreu com os ácidos graxos insaturados.

[76] Na reação catalisada pela mistura de ambas as lipases (Rhizopus SP + comercial), o mesmo comportamento foi observado em comparação com o uso de Rhizopus SP sozinha. Aparentemente, os resultados indicam que a mistura de enzimas não exibe qualquer efeito sinérgico, e a lipase de Rhizopus SP em uma concentração de 1,5% foi capaz de catalisar a reação de interesterificação sozinha.

Composição em triacilgliceróis

[77] A interesterificação causou alteração significativa na composição dos TAGs das composições estudadas (Tabela 6). Em todas as composições lipídicas interesterificadas produzidas com as diferentes enzimas, a interesterificação produziu um aumento significativo das percentagens do conteúdo de TAGs disaturados- monoinsaturados (S2U), com uma diminuição correspondente no conteúdo de TAGs tri insaturados (U3). As composições lipídicas interesterificadas produzidas com a lipase de Rhizopus SP e a mistura das lipases produziram um aumento de cerca de 80% do conteúdo de TAGs S2U e uma diminuição de aproximadamente 60% da concentração de TAGs U3. A lipase de Rhizopus SP, em ambas as concentrações testadas, produziu composições com tipos de TAGs muito semelhantes, indicando novamente que um aumento na concentração de enzima não altera as características das composições lipídicas interesterificadas obtidas.

[78] As composições lipídicas interesterificadas produzidas com a lipase comercial exibiram um aumento de cerca de 110% no conteúdo de TAGs S2U e uma diminuição de aproximadamente 70% da concentração de TAGs U3. A concentração de TAGs monoinsaturados- diinsaturados (SU2) e TAGs trisaturados (S3) ligeiramente aumentaram após a reação em todas as composições lipídicas interesterificadas produzidas.

[79] Portanto, os principais TAGs da composição lipídica não- interesterificada foram do tipo U3 seguido por SU2, enquanto que os principais TAGs presentes em composições lipídicas após interesterificação foram do tipo SU2, seguido por S2U. Nestes TAGs, o principal ácido graxo insaturado é o ácido oleico, sendo o principal ácido graxo saturado o ácido palmítico. Os TAGs do tipo SU2 e S2U formados na reação pelos sistemas de três enzimas têm propriedades de estrutura e de lubricidade, tornando assim possível alterar a aplicação das composições lipídicas interesterificadas produzidas. Embora TAGs U3 estejam relacionados com a redução de doenças cardiovasculares, esses TAGs têm baixa estabilidade oxidativa e baixa capacidade de estruturação, tornando difícil implementá-los em produtos semissólidos. Tabela 6: Classes de triacilglicerol em óleo de patauá, gordura de estearina de palma, e composições lipídicas não-interesterificadas e interesterificadas catalisadas por sistemas enzimáticos diferentes.

1Redistribuição aleatória.

Propriedades térmicas

[80] A diminuição na temperatura de cristalização do primeiro pico (T0C1) (mais TAGs saturados) nas composições lipídicas interesterificadas em comparação com a composição não- interesterificada pode ser devido a um aumento na concentração de TAGs S2U e SU2 e a redução dos TAGs mais saturados (Tabela 7). Este efeito também pode ser observado ao avaliar a diminuição da entalpia do pico da cristalização (AHc1). No segundo pico de cristalização (mais TAGs insaturados), houve um aumento da temperatura de cristalização (Toc), que indica que a redução de TAGs mais insaturados. Neste pico, também deve ser notado que as composições lipídicas interesterificadas produzidas com a enzima de Rhizopus SP exibiram uma menor redução no conteúdo de TAGs saturados quando comparado com as composições lipídicas interesterificadas produzidas com a enzima comercial. Portanto, esta análise indicou uma redução nos tipos de TAGs, restando predominantemente TAGs SU2 e S2U após a reação. Tabela 7: Temperatura de início da cristalização (Toc), temperatura de pico da cristalização (Tpc), entalpia da cristalização (AHc) e temperatura final de cristalização (Tfc) das composições lipídicas não-interesterificadas e interesterificadas catalisadas por sistemas enzimáticos diferentes

[81] Observa-se o mesmo tipo de modificação no comportamento térmico da fusão (Tabela 8), porque os fenômenos de fusão e cristalização são revertidos no scan avaliado. Em todas as composições lipídicas interesterificadas produzidas, foi reduzido o número de picos, indicando uma redução nos tipos de TAGs presentes. Estes resultados confirmam os obtidos na composição de TAGs no item anterior.

[82] Os resultados de DSC confirmaram as alterações nas características físico-químicas das composições após interesterificação, indicando que as composições lipídicas interesterificadas obtidas exibiram características que melhoram a sua aplicabilidade. Tabela 8: Temperatura de início de fusão (Tom), temperatura de pico de fusão (Tpm), entalpia de fusão(AHm) e temperatura final de fusão (Tfm) das composições lipídicas não-interesterificadas e interesterificadas catalisadas por sistemas enzimáticos diferentes

Compostos Minoritários

[83] Foi determinado o conteúdo de tocoferóis totais, carotenos totais e compostos fenólicos totais.

Determinação de tocoferóis

[84] Tocoferóis são antioxidantes naturais e inibem a oxidação lipídica em óleos e gorduras, modificando o processo de auto-oxidação da cadeia radical. Eles têm um lado da cadeia saturada e ocorrem em quatro formas relacionadas, designadas alpha (α), beta (β), gama (Y) e delta (δ). Estudos anteriores mostraram que o tocoferol tem benefícios de saúde substanciais como hipocolesterêmico, hipolipidêmico, antineoplásico, anti- inflamatório e propriedades antioxidantes e abrandar o processo de envelhecimento.

[85] Os óleos de Buriti e patauá são naturalmente ricos em tocoferóis e como as misturas são ricas nestes óleos (70%), as composições lipídicas não-interesterificadas também são ricas em tocoferóis (Tabela 9).

[86] A composição buriti/murumuru manteve a concentração de α e Y-tocoferóis depois da interesterificação com ambas as enzimas. Considerando que os isómeros β e δ-tocofer0is, já estão presentes em baixas concentrações na composição inicial, foram eliminados após a reação. A produção de composições lipídicas interesterificadas relativamente ricas em α e Y-tocoferóis é bastante oportuna, uma vez que estes isômeros têm atividades biológicas diferentes, com diferentes graus de ação.

[87] Os valores obtidos para os tocoferóis totais em composições lipídicas interesterificadas sintetizadas com óleo de Buriti podem ser ainda maiores. O óleo utilizado nesta invenção pode ter perdido uma parcela significativa de seus tocoferóis. Em estudos prévios publicados com este óleo, o teor de tocoferol atinge 1500 mg/kg, próximo ao valor de soja (1800 mg/kg) e de óleo de milho (1618 mg/kg), conhecido por ser rico em óleo de tocoferol. Tal variação pode ser causada por vários fatores incluindo: variedade, região em que o buriti é cultivado, maturidade da fruta na colheita, o processo de extração e condição de armazenamento.

[88] A composição patauá/estearina de palma depois da interesterificação com ambas as enzimas, manteve a concentração de α e Y-tocoferol praticamente constante, enquanto que os isômeros β e δ-tocofe^is não foram detectados nesta composição. As composições lipídicas interesterificadas sintetizadas mostraram uma concentração relativamente alta de α-tocoferol, mesmo depois de interesterificação com a estearina de palma, pobre neste composto. Tabela 9: Teor de tocoferol em buriti, murumuru, patauá, estearina de palma; misturas físicas (buriti/murumuru e patauá/estearina de palma) e composições lipídicas interesterificadas

ND= não detectado.

Determinação do conteúdo de carotenos totais

[89] Carotenóides são conhecidos por influenciar diversos processos moleculares e celulares, que podem fornecer a base para os efeitos de carotenóides na saúde humana e prevenção de doenças.

[90] O óleo de Buriti, uma das maiores fontes conhecidas de carotenóides, nos poucos estudos disponíveis, apresenta foto proteção contra a radiação UV, além de capacidade antibacteriana e cicatrizante. Na tabela 10 é possível avaliar o efeito de interesterificação de óleo de buriti com gordura de murumuru em relação ao conteúdo de carotenóides. Observa-se que a interesterificação desta composição não altera significativamente a concentração final de carotenóides, ou seja, o conteúdo de carotenos do buriti na composição inicial, ainda está presente após a interesterificação.

[91] O processo de interesterificação com a enzima de Rhizopus SP aumentou o teor de carotenóides; este efeito pode ter sido devido ao fato de que esta enzima é bruta e compostos presentes nele influenciaram a análise dos carotenóides.

[92] Tal como aconteceu com a concentração de tocoferóis, a concentração de carotenos da amostra de óleo de buriti utilizada nesta invenção foi menor do que outros estudos publicados com este óleo. Em outros estudos publicados com óleo de buriti, o conteúdo de carotenos determinado foi perto de 1700 mg/Kg, indicando que no caso de combinação buriti/murumuru, o teor de caroteno das composições lipídicas interesterificadas sintetizadas poderia ser ainda maior.

[93] A estearina de palma contém 301,2 mg/Kg de caroteno e está ausente no óleo de patauá (Tabela 10). Na composição de patauá/estearina de palma, o teor de caroteno varia entre 83.8 e 89,4 mg/Kg. Depois da interesterificação com ambas as lipases, a concentração de carotenóides nas composições lipídicas interesterificadas sintetizadas permaneceu praticamenteconstante.

[94] Em estudos clínicos, os carotenóides apresentaram capacidade foto protetores, responsável pela prevenção do envelhecimento prematuro da pele, elevado grau de proteção antioxidante e foto proteção contra radiação UV. Assim, tais composições lipídicas interesterificadas podem ser sintetizadas para uso como nutracêuticos e podem ser aplicadas em vários produtos cosméticos e farmacêuticos. Além disso, estas composições lipídicas interesterificadas sintetizadas apresentaram após a reação de interesterificação, triglicerídeos mais homogêneos (menos tipos de TAGs) e apenas uma fase, o que melhora as características dessas composições lipídicas interesterificadas para serem usadas em emulsões. Tabela 10: Conteúdo de caroteno em buriti, murumuru, patauá, estearina de palma; misturas físicas (buriti/murumuru e patauá/estearina de palma) e composições lipídicas interesterificadas

ND= não detectado.

Determinação do conteúdo de fenóis totais

[95] Os compostos fenólicos apresentam um potencial biológico significativo, especialmente na prevenção de estresse oxidativo, inflamação e infecção bacteriana, onde todos eles têm um papel de promotor no desenvolvimento de muitas doenças crônicas graves. Entre os benefícios potenciais, o uso destes compostos em formulações cosméticas e nutracêuticas, ofereceram proteção contra os danos causados ao DNA por radiação solar.

[96] Além de seus efeitos na saúde, tais compostos fenólicos devido à atividade anti-radicais podem proteger os tocoferóis presentes nos óleos durante o armazenamento e manipulação. Também, como os compostos fenólicos atuam como sequestradores de radicais livres podem proteger contra auto-oxidação de ácidos graxos insaturados, aumentando a vida útil do óleo.

[97] Os resultados na Tabela 11 mostram que os óleos de buriti e patauá são fontes de compostos fenólicos. Embora a concentração destes compostos nestes óleos não seja tão alta como no azeite de oliva (equivalentes de ácido gálico 170-210 mg) / kg), a mesma é superior a de muitos outros óleos vegetais. Tabela 11: Índice de fenol em buriti, murumuru, patauá, estearina de palma; misturas físicas (buriti/murumuru e patauá: estearina de palma) e composições lipídicas interesterificadas

ND= não detectado.

[98] As composições de buriti/murumuru interesterificadas e não interesterificadas têm praticamente a mesma concentração de compostos fenólicos, indicando que a interesterificação em si não teve efeito sobre a concentração de fenol. No entanto, devido às condições de reação, estas composições com e sem a presença de enzimas, sofreram uma perda de cerca de 30% de compostos fenólicos. Mesmo após a perda, o conteúdo de fenóis em composições lipídicas interesterificadas sintetizadas mostrou valores perto do óleo de soja (60-80 mg/kg) e superior ao óleo de girassol (3-4 mg/kg) e óleo de milho.

[99] A respeito da composição de patauá/estearina de palma as mesmas perdas ocorridas com a composição buriti/murumuru puderam ser observadas. No entanto, nesta composição, as perdas de compostos fenólicos atingiram 40%, o que pode ser explicado pela temperatura mais elevada (50° C) utilizada nesta reação.

[100] Os resultados indicam o potencial dos óleos da Amazônia para a produção de composições lipídicas interesterificadas com alto valor biológico. Essas composições lipídicas interesterificadas formadas usando combinações de buriti/murumuru e patauá/estearina de palma apresentam em suas composições tocoferóis, carotenóides e compostos fenólicos, assim mostrando o grande potencial para aplicações nas áreas cosméticas e farmacêuticas. As diferentes enzimas utilizadas para a produção de composições lipídicas interesterificadas não influenciaram na concentração final de compostos minoritários.

Teste de bioatividade

[101] A atividade antimicrobiana e antioxidante das composições lipídicas foi testada (antes e depois da interesterificação).

Atividade antimicrobiana de composições lipídicas interesterificadas emulsionadas

[102] Os patógenos usados para avaliar a atividade antimicrobiana destas emulsões foram Bacillus cereus e Escherichia coli, bactérias que podem causar intoxicação alimentar, infecções crônicas de pele, contaminação de produtos farmacêuticos, alimentos e água. As bactérias do gênero Bacillus são Gram- positivas e formam esporos estáveis que são resistentes às duras condições e temperaturas extremas. B.cereus é um patógeno comum envolvido em doenças transmitidas por alimentos, sepsias locais e feridas e infecções sistêmicas. As bactérias do gênero Escherichia são Gram-negativas e resistentes a muitos antibióticos. E.coli é um patógeno comum responsável por várias infecções extras intestinais ou intestinais.

[103]Nesta invenção, observou-se que as composições lipídicas interesterificadas produzidas utilizando lipases diferentes foram capazes de inibir o crescimento de microrganismos B.cereus e E.coli quando emulsionadas com Triton X-100. As bactérias foram testadas com diferentes concentrações de composições lipídicas não- interesterificadas e interesterificadas em emulsão (entre 2 e 22% v/v), a fim de observar o efeito sobre o crescimento bacteriano. Todas as composições foram avaliadas em uma concentração de 2% em emulsão. As outras concentrações (entre 6 e 22%), variaram de acordo com a composição.

[104] Observou-se um efeito diferente para cada tipo de composição usada, embora em todas elas a menor concentração de óleo na emulsão (2% v/v) teve maior efeito antimicrobiano, independentemente se a composição foi interesterificada ou não (Figura 5). No entanto, observou-se que as emulsões formuladas com composições lipídicas interesterificadas nessa concentração (2% v/v) apresentaram efeitos bactericidas após 24 horas, enquanto as emulsões formuladas com composições não-interesterificadas compartilharam os efeitos bacteriostáticos. Além disso, emulsões preparadas com composições lipídicas interesterificadas obtiveram maior atividade antimicrobiana na maioria das concentrações testadas.

[105]Assim, pode-se concluir que a composição dos óleos não era responsável pela atividade antimicrobiana, já que os melhores resultados foram observados em concentrações inferiores de óleo, o que significa que não apresenta um efeito dose-resposta. No entanto, as emulsões preparadas com composições lipídicas interesterificadas mostraram maior atividade antimicrobiana, sugerindo que a interesterificação destes óleos pode ser responsável por alterações nas características da emulsão, influenciando nos resultados da atividade antimicrobiana.

Características das emulsões

[106]Em ordem de verificar se a interesterificação de óleos mudou as características das emulsões foram avaliados o diâmetro (D32) e área de superfície específica das gotas na emulsão (Tabelas 12 e 13).

[107] Os resultados mostraram que existem diferenças entre esses parâmetros quando usando a mesma concentração dos óleos testados nas emulsões (2%). As emulsões preparadas com as composições lipídicas interesterificadas mostraram um menor diâmetro da gota e uma maior área de superfície específica. Estas características podem ser observadas em ambas as composições, com todos os três sistemas enzimáticos utilizados.

[108]Assim, os resultados indicam que de fato a modificação química, causada pela interesterificação enzimática, foi a responsável para a alteração das características das emulsões. Tabela 12: Diâmetro médio e área de superfície específica de gotas de emulsões produzidas com composições lipídicas de óleo de buriti e gordura de murumuru não-interesterificadas e interesterificadas

Tabela 13: Diâmetro médio e área de superfície específica de gotas de emulsões produzidas com composições lipídicas não- interesterificadas e interesterificadas de óleo de patauá óleo e gordura de estearina de palma

Emulsão, tamanho da gota e atividade antimicrobiana

[109]A fim de verificar se as características da emulsão estão relacionadas com a atividade antimicrobiana, um gráfico de correlação desses parâmetros é mostrado abaixo (Figuras 6 e 7). Os resultados confirmam que a atividade antimicrobiana das emulsões está mais intimamente relacionada com o tamanho da gota do que com as características químicas dos óleos. Em emulsões, em que a área de superfície específica foi maior, o efeito antimicrobiano foi mais eficaz para ambos os microrganismos testados.

[110] Composições lipídicas interesterificadas mostraram maior atividade antimicrobiana, provavelmente porque permitem a formação de uma emulsão com tamanho de gotas reduzido. A reação de interesterificação pode produzir composições lipídicas interesterificadas que não têm ou têm reduzido comportamento eutético, isto é, não ocorre fase separação devido à incompatibilidade entre as frações de gorduras e óleos. Após interesterificação, a composição lipídica produzida apresenta uma única fase completamente homogênea, enquanto que, nas composições não-interesterificadas, a separação dos triglicerídeos pode ser devido a diferenças nos pontos de fusão. Essa separação de fase que ocorre na composição não-interesterificada pode influenciar no tamanho das gotas da emulsão.

[111]Esta invenção apenas mostra resultados das composições lipídicas interesterificadas pela enzima comercial, não obstante o mesmo comportamento foi observado para as outras composições lipídicas interesterificadas (dados não mostrados).

[112]A interesterificação enzimática induz a troca de ácidos graxos na estrutura do glicerol, e essa mudança está relacionada com a especificidade da enzima. As composições lipídicas interesterificadas com enzimas diferentes mostram comportamento diferente em emulsão, desse modo, apresentando tamanhos da gota, hidrofobicidade e eficácia como agentes antimicrobianos diferentes. Composições lipídicas interesterificadas utilizadas nesta invenção mostraram uma mudança significativa na relação entre os ácidos graxos saturados e insaturados. Houve um aumento significativo de ácidos graxos insaturados, especialmente nas posições sn-1 e sn-3 do triacilglicerol e a predominância de triglicerídeos mono e di-insaturados. A produção de triglicerídeos com pontos de fusão intermediários apresentam características de lubricidade e estrutura, características importantes para a estabilidade da emulsão. Este perfil de triglicerídeos obtidos pode ter influenciado as propriedades físico-químicas da emulsão formada.

[113]A característica das composições lipídicas interesterificadas utilizadas nesta invenção é de grande interesse, uma vez que estudos recentes têm indicado que a interesterificação pode influenciar a atividade biológica. A estrutura do triacilglicerol intramolecular pode influenciar a digestão e absorção de lipídeos, afetando algumas respostas metabólicas. Assim, o uso destas composições lipídicas interesterificadas para a produção de emulsões para aplicações biológicas parece ser mais vantajoso do que o uso da simples mistura desses óleos e gorduras. Apresentando as gotas com maior área de superfície específica, o desempenho desta composição emulsionada torna-se mais eficaz em sistemas biológicos.

[114] Para facilitar a visualização, a Figura 8 mostra apenas os resultados das emulsões que produziram maior inibição microbiana (formulada com uma concentração de 2% de óleo). Observa- se claramente que as emulsões produzidas com composições lipídicas interesterificadas mostram maior área de superfície específica e maior inibição de patógenos.

[115]Esta invenção verificou que a atividade antimicrobiana das composições lipídicas interesterificadas emulsionadas é influenciada pelos tamanhos de gotas dos óleos nas emulsões e estes tamanhos são determinados pelas propriedades dos óleos usados. As emulsões produzidas com as composições lipídicas não- interesterificadas de óleos amazônicos mostrou um maior tamanho de gotas de óleo e apresentou um efeito bacteriostático contra os agentes patogênicos B.cereus e E.coli, enquanto as emulsões produzidas com composições lipídicas interesterificadas mostrou o menor tamanho de gotas de óleo e apresentou efeito bactericida. O uso destas composições lipídicas interesterificadas para aplicações biológicas parece ser mais vantajoso do que o uso de simples mistura dos mesmos.

Atividade antioxidante

[116] De acordo com as Figuras de 9 a 16, em que as colunas seguem a mesma ordem da legenda lateral, é possível observar os resultados de concretização que demonstram a atividade antioxidante das composições do presente invento. Avaliando-se a atividade antioxidante da composição Buriti/Murumuru com o radical DPPH, observa-se que a composição lipídica não-interesterificada teve menor atividade antioxidante nas concentrações de óleo de 5, 10 e 50μL/mL no sistema de reação. Nestas concentrações de óleo a atividade antioxidante das composições lipídicas interesterificadas foi maior em 10%, 43% e 56%, quando se utilizou a composição produzida pela enzima comercial; 42%, 39% e 55%, quando se utilizou a composição produzida pela enzima de Rhizopus SP; e 26%, 28% e 24%, quando se utilizou a composição produzida pela mistura das enzimas comercial e Rhizopus SP. Assim, nas três concentrações de óleo testado, as composições lipídicas interesterificadas apresentaram atividade antioxidante maior quando comparadas com a composição não-interesterificada. Nos ensaios com o radical trolox (ORAC) observa-se que a atividade antioxidante da composição lipídica não-interesterificada é praticamente igual ao da composição lipídica interesterificada pela enzima comercial, 76 e 79 μmol trolox/g de amostra, respectivamente. Porém, quando se avalia a atividade antioxidante da composição lipídica interesterificada pela enzima Rhizopus SP observa-se o aumento bastante significativo da atividade antioxidante, que sobe para 133 μmol trolox/g de amostra. A mistura produzida pelas enzimas comercial e Rhizopus SP teve resultado intermediário, com o valor de 103 μmol trolox/g de amostra. Assim, utilizando-se este radical, a atividade antioxidante foi maior na composição lipídica interesterificada pela enzima de Rhizopus SP.

[117]Avaliando-se a atividade antioxidante da composição Patauá/Estearina de palma através dos ensaios de ORAC, a composição lipídica não-interesterificada obteve o valor de atividade antioxidante de 50 μmol trolox/g de amostra, enquanto que as composições lipídicas interesterificadas pela enzima comercial, pela enzima Rhizopus SP e pela mistura de ambas as enzimas, os valores de atividade antioxidante foram de 60, 103 e 137 μmol trolox/g de amostra, respectivamente. Assim, a maior atividade antioxidante foi obtida nas composições produzidas pela enzima Rhizopus SP, entretanto, em todas as composições lipídicas interesterificadas a atividade antioxidante foi maior que na composição não-interesterificada. Tabela 14. Concentração equivalente de Trolox e faixas de linearidade dos testes de ORAC (Área líquida (net AUC) vs. concentração) nas amostras com óleo de Buriti e gordura de Murumuru em que letras iguais designam médias que não diferem estatisticamente entre si, pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

Tabela 15. Concentração equivalente de Trolox e faixas de linearidade dos testes de ORAC (Área líquida (net AUC) vs. concentração) nas amostras com óleo de Patauá e gordura de Estearina de Palma em que letras iguais designam médias que não diferem estatisticamente entre si, pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

Claims (2)

1. Processo de interesterificação enzimática para obtenção de composição lipídica interesterificadaCARACTERIZADO por compreender as etapas de: a) Alimentação do sistema com uma combinação de óleo de patauá e de gordura de estearina de palma ou de óleo de buriti e de gordura de murumuru na proporção em peso de óleo:gordura de 70:30; b) Adição entre 2,5 e 10% (p/p) de lipase proveniente da Rhizopus SP; c) Agitação entre 100 e 250 rpm; por um período entre 12 e 96 horas mantido a vácuo: - Se óleo de buriti e gordura de murumuru, a temperatura é de 40°C; - Se óleo de patauá e uma gordura de estearina de palma, a temperatura é de 50°C; e d) Separação da composição lipídica interesterificada e enzima por filtração com membrana entre 0,22 a 0,45 μm.

2. Uso da composição lipídica interesterificada obtida pelo processo descrito na reivindicação 1, CARACTERIZADO por ser como antimicrobiano, antioxidante, cosméticos e/ou alimentos.

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