BR102014009679B1 - Esporos de bacillus sp. adsorvidos com oligonucleotídeos e/ou ácidos nucleicos, método de preparo dos esporos e método de preparo de cartuchos de biobalística contendo os esporos - Google Patents

Abstract

ESPOROS DE Bacillus sp. , MÉTODO DE PREPARO DOS ESPOROS, MÉTODO DE PREPARO DE CARTUCHOS DE BIOBALÍSTICA, E USOS DOS ESPOROS A presente invenção se refere a uma metodologia de adsorção de oligonucleotídeos e/ou ácidos nucleicos a esporos purificados de Bacillus sp., preferencialmente Bacillus subtilis após tratamento com diferentes agentes catiônicos e método de preparo de cartuchos de biobalística contendo os referidos esporos e aos possíveis usos dos ditos esporos enquanto micropartículas para biobalística ou para administração parenteral ou por via de mucosa para fins médicos ou veterinários.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[1] A presente invenção se insere nas áreas de Biologia Molecular, Genética e Vacinologia, e, mais especificamente na área de Biobalística, uma vez que se refere a uma metodologia de adsorção de oligonucleotídeos e/ou ácidos nucleicos a esporos purificados de Bacillus sp., preferencialmente os da espécie B. subtilis, após tratamento com diferentes agentes catiônicos, aos esporos gerados, ao método de preparo de cartuchos de biobalística contendo os referidos esporos e aos possíveis usos dos ditos esporos enquanto micropartículas para biobalística ou para administração parenteral.

APLICAÇÃO INDUSTRIAL

[2] A aplicação industrial da invenção se refere ao fato da mesma ser passível de ser produzida (esporo) e utilizada (método de preparo dos esporos e método de preparo dos cartuchos de biobalística) no ambiente industrial. DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA

[3] Bacillus subtilis é uma bactéria ubíqua e de grande relevância em estudos de diferenciação celular por sua capacidade de formar endosporos resistentes a situações adversas extremas de pH, temperatura e nutrientes. Apresenta baixo tempo de geração, multiplica-se em meios simples e relativamente baratos e, sendo uma bactéria gram-positiva, não possui membrana externa lipopolissacarídica, características que a tornam uma opção vantajosa e de baixo custo para produção em larga escala. Além disso, são desprovidas de patogenicidade, sugerindo um forte apelo para sua utilização como vetores de expressão de antígenos heterólogos em formulações vacinais (DUC et al., 2003) e como probióticos (HONG et al., 2005).

[4] Recentemente observou-se que a superfície do esporo apresenta propriedades hidrofóbicas e é carregada negativamente, promovendo uma plataforma adequada para adsorção de diferentes moléculas. A adsorção de metais pesados, como o níquel, possibilitou a utilização de esporos recombinantes de B. subtilis como ferramenta de biorremediação (HINC et al., 2010).

[5] No ramo da vacinologia, estudos demonstraram que esses esporos são capazes de adsorver partículas virais e proteínas antigênicas sob determinadas condições de pH, podendo então ser entregues sob a forma de vacinas particuladas por via parenteral (SONG et al., 2012; HUANG et al., 2010).

Biobalística

[6] Uma abordagem de vacinas particuladas que tem ganhado destaque na vacinologia é o método da biobalística. Nela, microesferas de ouro são impregnadas com o DNA plasmidial e administradas através do gene gun, que direciona as partículas para as células da pele sob alta pressão de gás hélio.

[7] A administração intradérmica por biobalística representa uma alternativa de imunização à via intramuscular para entrega de vacinas de DNA e tem se mostrado eficiente na geração de resposta humoral e celular. Além do maior número de células apresentadoras de antígeno no local da inoculação, a via intradérmica apresenta outras vantagens de grande importância clínica como a redução significativa da dose utilizada e o aumento da eficiência de transfecção plasmidial.

[8] Vacinas de DNA representam uma atraente estratégia de vacinação uma vez que não provocam resposta imune antivetorial no paciente imunizado, possibilitando administrações repetidas que podem ser necessárias para atingir e manter a resposta imune desejada. São também simples, seguras, estáveis e fáceis de serem produzidas em larga escala.

Documentos do Estado da Técnica

[9] O documento WO 2011/033275A1 descreve o uso de esporos bacterianos com antígenos adsorvidos em sua superfície como agentes terapêuticos. Tal documento propõe uma estratégia de adsorção em que esporos são misturados a antígenos (proteínas, enzimas e derivados proteicos) em uma solução tamponada. A presente invenção propõe uma estratégia diferente de adsorção onde os esporos são previamente tratados com agentes catiônicos antes da adsorção propriamente dita. Além disso, provê a adsorção de ácidos nucleicos e derivados, como plasmídeos e oligonucleotídeos, exclusivamente para a administração intradérmica pelo método da biobalística ou para administração parenteral.

[10] A patente US 20030147923 descreve um método de utilização de esporos de B. subtilis para estimular ou aumentar a resposta imune em mamíferos. A presente invenção, por outro lado, tem como proposta a utilização dos esporos como micropartículas carregadoras para aplicação na biobalística, excluindo possíveis efeitos imunomoduladores após sua administração. Referências utilizadas para construção do estado da técnica e do exemplo de concretização da invenção

[11] DINIZ, M. O.; FERREIRA, L. C. Sequência de ácido nucléico isolada, vetor de expressão, composição imunogênica sinérgica que compreende um vetor de expressão que codifica a proteína E7 do vírus do papiloma humano (HPV) fusionada a proteína gD do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) e um vetor de expressão que codifica uma citocina e seus usos. Número do depósito no PCT: PCT/BR2010/000290, 2010. Número da publicação: WO2011026206 A1.

[12] DUC, L. H.; HONG, H. A.; FAIRWEATHER, N.; RICCA, E.; CUTTING, S. M. Bacterial spores as vaccine vehicles. Infect. Immun., v. 71, p. 2810-2818, 2003.

[13] FELTKAMP, M. C.; SMITS, H. L.; VIERBOOM, M. P.; MINNAAR, R. P.; DE JONGH, B. M.; DRIJFHOUT, J. W.; TER SCHEGGET, J.; MELIEF, C. J.; KAST, W. M. Vaccination with cytotoxic T lymphocyte epitope-containing peptide protects against a tumor induced by human papillomavirus type 16- transformed cells. Eur. J. Immunol., v. 23, p. 2242-2249, 1993.

[14] FOERSTER, H. F.; FOSTER, J. W. Endotrophic calcium, strontium, and barium spores of Bacillus megaterium and Bacillus cereus. Journal of Bacteriology, v. 91, n. 3, p. 1333-1344, 1966.

[15] HINC, K; GHANDILI, S; KARBALAEE, G; SHALI, A; NOGHABI, K. A; RICCA, E; AHMADIAN, G. Efficient binding of nickel ions to recombinant Bacillus subtilis spores. Res Microbiol., v.161, n. 9, p.757-764, 2010.

[16] HONG, H.A.; DUC, L.H.; CUTTING, S.M. The use of bacterial spore formers as probiotics. FEMS Microbiol Rev., v. 29, p.813-835, 2005.

[17] HUANG, J-M.; HONG, H. A.; TONG, H. V.; HOANG, T. H.; BRISSON, A. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine, v. 28, p. 1021-1030, 2010.

[18] LIN, K. Y.; GUARNIERI, F. G.; STAVELEY-O'CARROLL, K. F.; LEVITSKY, H. I.; AUGUST, J. T.; PARDOLL, D. M.; WU, T. C. Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class II presentation of tumor antigen. Cancer Research, v. 56, n. 1, p. 21-26, 1996.

[19] O'HAGAN, D.; SINGH, M.; UGOZZOLI, M.; WILD, C.; BARNETT, S.; CHEN, M.; SCHAEFER, M.; DOE, B.; OTTEN, G. R.; ULMER, J. B. Induction of potent immune responses by cationic microparticles with adsorbed human immunodeficiency virus DNA vaccines. Journal of Virology, v. 75, n. 19, p. 90379043, 2001.

[20] SONG, M.; HONG, H. A.; HUANG, J. M.; COLENUTT, C.; KHANG, D. D.; NGUYEN,T. V. A.; PARK, S. M.; SHIM, B. S.; SONG, H. H.; CHEON, I. S.; JANG, J. E.; CHOI, J.; CHOI, Y. K.; STADLER, K.; CUTTING, S. M. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine, v. 30, p.3266-3277, 2012.

[21] TAVARES , M. B.; SOUZA, R. D.; LUIZ, W. B.; CAVALCANTE , R. C. M.; CASAROLI , C.; MARTINS , E. G.; FERREIRA , R. C. C.; FERREIRA, L. C. S. Bacillus subtilis Endospores at High Purity and Recovery Yields: Optimization of Growth Conditions and Purification Method. Curr Microbiol, v. 66, p. 279-285, 2013.

[22] TRIMBLE, C.; LIN, C.T.; HUNG, C.F.; PAI, S.; JUANG, J.; HE, L.; GILLISON, M.; PARDOLL, D.; WU, L.; WU, T.C. Comparison of the CD8+ T cell responses and antitumor effects generated by DNA vaccine administered through gene gun, biojector, and syringe. Vaccine, v. 21(25-26), p.40364042, 2003.

[23] VIEIRA, D. B.; CARMONA-RIBEIRO, A. M. Cationic lipids and surfactants as antifungal agents: mode of action. J Antimicrob Chemother., v. 58, n. 4, p. 760-767, 2006.

Objetivos da Invenção

[24] Apesar de serem capazes de transfectar células de modo eficiente, as micropartículas de ouro usualmente empregadas para entrega de macromoléculas por biobalística são obtidas apenas por comercialização e costumam ser bem dispendiosas. Para a administração de 1.000 (mil) doses são necessários 500 mg de micropartículas de ouro, podendo chegar a custar R$ 1.600,00 (reais). Já esporos de Bacillus sp., preferencialmente de B. subtilis, podem ser obtidos através de preparação com meios simples e baratos e podem ser purificados de forma rápida e eficaz e utilizando água, levando a um custo de apenas R$ 0,30 (aproximadamente) para a obtenção de 500 mg (1.000 doses).

[25] Ainda, os Bacillus sp., especialmente os B. subtilis, são considerados agentes não-patogênicos e designados como microrganismos GRAS (Generally recognized as safe) pelo FDA (American Food and Drug Administration (HONG et al., 2005), garantindo segurança em sua manipulação e maior acessibilidade à tecnologia de obtenção de esporos e utilização como micropartículas para biobalística.

[26] Dessa forma, a presente invenção teve como objetivos principais a padronização de um método de adsorção de plasmídeos a esporos de Bacillus sp., preferencialmente de Bacillus subtilis, e sua utilização como micropartículas carregadoras para biobalística como substituto de partículas de ouro usualmente empregadas para este fim.

[27] Os resultados obtidos comprovam que esporos de B. subtilis são capazes de adsorver ácidos nucleicos e oligonucleotídeos em sua superfície após tratamento com reagentes catiônicos e substituir as micropartículas de ouro mantendo a capacidade de transfecção de células eucarióticas in vitro e a indução de respostas imunológicas (produção de anticorpos específicos) em animais, como demonstrado experimentalmente com camundongos C57BL/6 imunizados com o plasmídeo vacinal pgDE7h que codifica para uma forma mutante da oncoproteína E7 do vírus papiloma humano tipo 16.

[28] Os resultados demonstram que, pelas metodologias apresentadas pela presente invenção, é possível substituir as micropartículas de ouro por esporos bacterianos na biobalística com redução de aproximadamente 5.000 vezes nos custos de produção do reagente. Portanto, a presente invenção descreve uma metodologia de adsorção de ácidos nucleicos e oligonucleotídeos aos esporos de Bacillus sp., preferencialmente B. subtilis, e sua utilização em substituição às micropartículas de ouro, visando uma redução do custo e maior acessibilidade a esta tecnologia vacinal. BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[29] A presente invenção refere-se a esporos de Bacillus sp., preferencialmente Bacillus subtilis, adsorvidos com plasmídeos (ácidos nucleicos) e oligonucleotídeos, método de preparo dos esporos, método de preparo de cartuchos de biobalística contendo esporos, e uso dos esporos.

[30] Quanto ao método de preparo de cartuchos contendo esporos de B. subtilis impregnados com DNA plasmidial, os mesmos são utilizados preferencialmente para administração intradérmica pelo método da biobalística (gene gun).

[31] A invenção se refere ainda ao uso de esporos de B. subtilis como micropartículas carregadoras de vacinas de DNA e sua aplicação na técnica de biobalística. Adicionalmente, a presente invenção destina-se ao uso de esporos de B. subtilis impregnados com plasmídeos (ácidos nucleicos) e/ou oligonucleotídeos em formulações farmacêuticas para administração parenteral ou como carregadores para biobalística.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[32] A figura 1 se refere a uma micrografia de contraste de fase que possibilita a visualização de esporos de B. subtilis 1012. Barra de escala: 10 μm.

[33] A figura 2A se refere a uma representação gráfica de dispersão de luz dinâmica (DLS) para determinação do diâmetro de partículas, cuja distribuição de tamanho indica uma média da medida do raio (nm) de esporos vivos igual a 916,9.

[34] A figura 2B se refere a uma representação gráfica de dispersão de luz dinâmica (DLS) para determinação do diâmetro de partículas, cuja distribuição de tamanho indica uma média da medida do raio (nm) de esporos inativados igual a 826,8.

[35] A figura 3A se refere à análise do sobrenadante das reações de adsorção de DNA em esporos na presença de CTAB a 0,01 % (p/v) utilizando na adsorção 1μg de DNA (pgDE7h) e variando-se a quantidade de esporos.

[36] A figura 3B se refere à análise do sobrenadante das reações de adsorção de DNA em esporos na presença de CTAB a 0,01 % (p/v) utilizando na adsorção 5x108 esporos e variando-se a quantidade de DNA (pgDE7h) adicionada.

[37] A figura 4A se refere à análise do sobrenadante das reações de adsorção de DNA em esporos com fragmentos de DODAB BF a 2 mM utilizando na adsorção 1 μg de DNA (pgDE7h) e variando-se a quantidade de esporos.

[38] A figura 4B se refere à análise do sobrenadante das reações de adsorção de DNA em esporos com fragmentos de DODAB BF a 2 mM utilizando na adsorção 5x108 esporos e variando-se a quantidade de DNA (pgDE7h) adicionada.

[39] A figura 5 se refere à adsorção de CpG em esporos de B. subtilis na presença de DODAB BF a 2 mM, utilizando 5x108 esporos vivos e variando-se a quantidade de CpG.

[40] A figura 6 demonstra a marcação de DNA plasmidial adsorvido na superfície dos esporos, sendo que os B. subtilis foram impregnados ou não com 1 μg de pgDE7h e incubados com solução diluída de DAPI para marcação do DNA, sendo: Imagens do campo claro (A) e com fluorescência (C) dos esporos com DNA adsorvido em sua superfície; Imagens do campo claro (B) e com fluorescência (D) de esporos não impregnados com DNA e utilizados como controle neste experimento.

[41] A figura 7 se refere à análise do potencial-zeta de esporos de B. subtilis 1012 vivos (EV) ou inativados (EI) em diferentes etapas da reação de adsorção sendo “E” apenas esporos purificados, “E+Reagente” esporos tratados com o reagente catiônico e “E+Reagente+DNA” esporos com DNA adsorvido após tratamento catiônico.

[42] A figura 8 se refere à avaliação do perfil do DNA plasmidial recuperado nos cartuchos de biobalística, tendo sido resultado de análise por eletroforese em gel de agarose 0,8 % (p/v) dos sobrenadantes obtidos após procedimento realizado com tampão TE (Tris-EDTA) e agitação vigorosa dos cartuchos contendo 1 μg de plasmídeo adsorvido aos esporos com CTAB 0,01 % ou fragmentos de DODAB BF 2 mM.

[43] A figura 9A se refere à média da radiância (p/s/cm2/sr) obtida a partir das imagens de bioluminescência obtidas de células eucarióticas COS7 transfectadas com pLuc por biobalística utilizando CTAB como reagente catiônico para o tratamento dos esporos.

[44] A figura 9B se refere à média da radiância (p/s/cm2/sr) obtida a partir das imagens de bioluminescência obtidas de células eucarióticas COS7 transfectadas com pLuc por biobalística utilizando DODAB como reagente catiônico para o tratamento dos esporos.

[45] A figura 10A se refere ao fluxo total (p/s) obtida a partir das imagens de bioluminescência obtidas de camundongos C57BL/6 transfectados com pLuc por biobalística utilizando CTAB como reagente catiônico para o tratamento dos esporos.

[46] A figura 10B se refere ao fluxo total (p/s) obtida a partir das imagens de bioluminescência obtidas de camundongos C57BL/6 transfectados com pLuc por biobalística utilizando DODAB como reagente catiônico para o tratamento dos esporos.

[47] A figura 11A se refere à indução de células T CD8+ produtoras de IFN-y E7 específicas obtida individualmente de camundongos C57BL/6 imunizados com pgDE7h por biobalística.

[48] A figura 11B se refere à indução de células T CD8+ produtoras de IFN-y E7 específicas de forma representativa correspondente a um animal por grupo imunizado com pgDE7h por biobalística.

[49] A figura 12 se refere à determinação dos títulos de IgG total E7-específicos após imunização por biobalística, sendo:

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[50] A presente invenção refere-se a esporos de Bacillus sp., preferencialmente de Bacillus subtilis, adsorvidos com oligonucleotídeos e/ou ácidos nucleicos (podendo estes ser referentes tanto a DNA quanto a RNA), ao método de preparo dos esporos, ao método de preparo de cartuchos de biobalística contendo esporos, e ao uso dos esporos. Esporos de Bacillus sp. adsorvidos com ácidos nucleicos e/ou oligonucleotídeos

[51] Esporos são estruturas inertes, refringentes e de maior complexidade, compostas principalmente por ácido dipicolínico, íons cálcio e proteínas que se associam ao material genético; além disso, possuem em sua composição apenas 20 % de água, sendo seu citoplasma denso e com pH levemente ácido. Tais fatores lhe conferem características de resistência a temperaturas extremas, agentes químicos, radiação UV, dessecação, calor seco e à inativação por enzimas.

[52] Esporos com oligonucleotídeos e/ou ácidos nucleicos adsorvidos por meio dos reagentes catiônicos citados anteriormente mantêm suas propriedades nativas de resistência, mas apresentam certo aumento da carga elétrica total de superfície, tornando-se menos negativa ou podendo alcançar a neutralidade. Seu tamanho varia entre 1,6 e 1,8 μm de diâmetro, com ou sem moléculas adsorvidas. Além disso, baseando-se no fato anteriormente mencionado que 5x108 esporos (vivos ou inativados) são capazes de adsorver até 1 μg de ácidos nucleicos ou oligonucleotídeos é possível sugerir que cada esporo possui no máximo 2 fg (femtogramas) de moléculas adsorvidas em sua superfície.

Método de Preparo dos Esporos

[53] O método de preparo dos esporos compreende as seguintes etapas: a)Esporulação de Bacillus sp.; b)Centrifugação dos esporos; c)Lavagem dos esporos; e d)Adsorção de DNA plasmidial/oligonucleotídeos na superfície dos esporos.

[54] O referido processo pode conter ainda uma etapa opcional de aquecimento dos esporos a ser realizada após a lavagem.

[55] O referido processo pode conter ainda uma etapa opcional de visualização de esporos viáveis a ser realizada antes da etapa “d”. A etapa opcional de aquecimento dos esporos só ocorre quando for ocorrer esta etapa de visualização/quantificação.

[56] Antes da etapa “d” e após a realização do aquecimento dos esporos (se for o caso) e após a realização da visualização de esporos viáveis (se for o caso), o processo pode conter ainda uma etapa opcional de autoclavagem dos esporos, caso se desejar que os esporos a serem utilizados estejam inativados. Para a produção de esporos vivos esta etapa não é necessária. Etapa “a”

[57] A esporulação de Bacillus sp., preferencialmente de B. subtilis foi realizada por meio da exaustão de nutrientes com o meio Foerster (FOERSTER; FOSTER, 1966) de acordo com o protocolo modificado descrito por Tavares e colaboradores (2013). Etapas “b” e “c”

[58] As culturas foram centrifugadas até a precipitação dos esporos após 6-10 dias de esporulação e sujeitas a 1-3 lavagens com água destilada. As lavagens incluem a adição de água destilada, agitação vigorosa até a ressuspensão e centrifugação até se obter novamente o precipitado contendo esporos. Etapa opcional de aquecimento dos esporos

[59] Por fim, os esporos foram incubados por 30-60 min a 60-70 °C (para remover possíveis contaminantes como células vegetativas) para, opcionalmente, ser realizada a quantificação. Etapa opcional de visualização de esporos viáveis

[60] Opcionalmente, os esporos viáveis são visualizados ao microscópio e titulados para determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC/ml). Etapa opcional de autoclavagem de esporos

[61] Quando se deseja obter esporos inativados se realiza o método de esterilização por autoclavação dos esporos viáveis preparados por meio das etapas anteriores. Etapa “d”

[62] Uma alíquota de esporos é ressuspensa utilizando- se diferentes reagentes: brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) na concentração 0,01 % (p/v) ou brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) na forma de fragmentos de bicamada lipídica (BF) a 2 mM ou Espermidina a 0,05 M na proporção 5x108-2x109 esporos / 200μl-1000μl de reagente (qualquer um dos mencionados acima) e permaneceram em agitação moderada (60-80 rpm) por 30-60 min, a 20-25 °C.

[63] Em seguida, a suspensão foi centrifugada até a obtenção dos esporos precipitados, como, por exemplo, a 800010000 rpm por 10-15 min; seguido de lavagem com água destilada, lembrando que quanto maior a velocidade utilizada, menor será o tempo necessário para formar o precipitado. Ao final da lavagem, os mesmos foram ressuspensos - preferencialmente em 100 a 300 μl - em solução aquosa contendo o plasmídeo ou oligonucleotídeo na concentração de interesse, sendo esta concentração preferencialmente na proporção de aproximadamente 5x108 esporos/1 μg de ácidos nucleicos ou oligonucleotídeos. A mistura permaneceu a 20-25 °C durante um tempo 30-60 min e agitando-se frequentemente ou apenas homogeneizada (sem incubação) no caso de DODAB BF 2 mM. A suspensão foi então centrifugada até a obtenção do precipitado contendo os esporos com o plasmídeo adsorvido em sua superfície, como, por exemplo, a 8000-10000 rpm por 10-15 min, lembrando que quanto maior a velocidade utilizada, menor será o tempo necessário para formar o precipitado.

[64] O sobrenadante pode opcionalmente ser armazenado, quando necessário, para posterior análise, que pode ocorrer, por exemplo, por eletroforese em gel de agarose e os volumes de reação ajustados proporcionalmente, segundo quantidades de interesse de esporos ou do plasmídeo em questão.

[65] É válido ressaltar que os fragmentos de bicamada de DODAB (DODAB BF) foram produzidos por meio de sonicação por 20 min, a 20 % de potência do sonicador de uma solução de DODAB LV (vesículas lipídicas) preparada a partir do pó de DODAB e posterior incubação a 70 °C sob agitação leve e eventual. Método de preparo de cartuchos de biobalística contendo esporos

[66] O método de preparo de cartuchos de biobalística contendo esporos compreende as seguintes etapas: a)Ressuspensão dos esporos; b)Armazenagem em tubo fechado; c)Secagem; e d)Obtenção dos Cartuchos; Etapas “a” e “b”

[67] Para a administração por biobalística, o plasmídeo de interesse foi adsorvido aos esporos de Bacillus sp., preferencialmente de B. subtilis, de acordo o método de adsorção mencionado acima. Ao final da reação, o precipitado foi ressuspenso em solução de PVP (polivinilpirrolidona) em concentração de 0,005 a 0,05 mg/mL em etanol 100 % e adicionado a um tubo cilíndrico de polietileno apropriado para cartuchos de biobalística com o auxílio de uma seringa, por exemplo, onde permaneceu, fechado, por 8-20 h a 20-25 °C, seguindo a seguinte proporção: 5x108-2x109 esporos/60- 300 μl de solução de PVP/1-5 cm de tubo. Etapa “c” e “d”

[68] Após o período mencionado acima, o tubo contendo a camada aderida de esporos seca foi cortado adequadamente para obtenção dos cartuchos com 1 cm de comprimento ou conforme o tamanho apropriado para o tipo de carregador de cartuchos utilizado. Uso dos esporos

[69] Conforme demonstrado nos exemplos de concretização da invenção, esporos de Bacillus sp., preferencialmente de B. subtilis, podem ser utilizados como micropartículas para imunização por biobalística, sendo capazes de transfectar células in vitro e in vivo e gerar respostas imunes específicas do tipo humoral e celular quando utilizada em vacinas ou terapias gênicas (nesse caso, exemplificativamente, foi utilizada a vacina de DNA contra o HPV-16).

[70] Além disso, a invenção se refere ao fato de que esporos de Bacillus sp., preferencialmente de B. subtilis, podem adsorver plasmídeos, oligonucleotídeos e também outros tipos de moléculas derivadas de ácidos nucleicos, podendo ser utilizados como micropartículas carregadoras aptas a transfectar células epiteliais, fibroblásticas, tecidos vegetais entre outros tipos celulares através do gene gun ou por outros meios para administração pela via parenteral ou por via de mucosas, como a via oral, nasal, intra-vaginal, sublingual ou retal para fins médicos ou veterinários. Exemplo de Concretização da Invenção Preparo dos esporos

[71] A esporulação de B. subtilis foi realizada por meio da exaustão de nutrientes com o meio Foerster (FOERSTER; FOSTER, 1966) de acordo com o protocolo modificado descrito por Tavares e colaboradores (2013). As culturas foram centrifugadas até a precipitação dos esporos após 7 dias de esporulação e sujeitas a três lavagens com água destilada. Por fim, os esporos foram ressuspensos em água e incubados por 60 min a 60 °C antes da quantificação. Os esporos viáveis foram visualizados no microscópio digital EVOS® (AMG) e titulados para determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC/ml). Os esporos inativados utilizados neste trabalho foram obtidos a partir da autoclavação (121 °C/15 min) dos esporos viáveis preparados por meio da metodologia anteriormente descrita. Adsorção de DNA plasmidial na superfície dos esporos

[72] Uma alíquota de esporos foi ressuspensa utilizando-se diferentes reagentes: (1) CTAB; (2) DODAB BF e (3) Espermidina e permaneceram em agitação moderada por 60 min, a 25 °C. Em seguida, a suspensão foi centrifugada a 10000 rpm por 10 min para a obtenção dos esporos precipitados seguida de uma lavagem com água destilada. Ao final da lavagem e após centrifugação (10000 rpm/10 min), os mesmos foram ressuspensos em 125 μl de solução aquosa contendo o 1 μg de DNA plasmidial. A mistura permaneceu a 25 °C durante 60 min agitando-se a cada 15 min ou apenas homogeneizada (sem incubação) no caso de DODAB BF 2 mM. A suspensão foi então centrifugada (10000 rpm/10 min) para obtenção do precipitado contendo os esporos com o plasmídeo adsorvido em sua superfície. O sobrenadante foi armazenado, quando necessário, para posterior análise por eletroforese em gel de agarose e os volumes de reação ajustados proporcionalmente, segundo quantidades de interesse de esporos ou do plasmídeo em questão.

[73] Os fragmentos de bicamada de DODAB (DODAB BF) foram produzidos por meio de sonicação por 20 min a 20 % de potência do sonicador de uma solução de DODAB LV (vesículas lipídicas) preparada a partir do pó de DODAB e posterior incubação a 70 °C sob agitação leve e eventual.

Preparo dos cartuchos utilizados no gene gun

[74] Para a administração por biobalística, 10 μg do plasmídeo de interesse foram adsorvidos a 5x109 esporos de B. subtilis de acordo com o protocolo padronizado de adsorção. Ao final da reação, o precipitado foi ressuspenso em 600 μl de solução de PVP (polivinilpirrolidona) a 0,05 mg/mL em etanol 100 % e adicionado ao tubo de Tefzel® com o auxílio de uma seringa, onde permaneceu, fechado, por aproximadamente 16 h a 25 °C. Ao término da incubação, o líquido contendo PVP foi descartado ou armazenado quando necessário para posterior quantificação dos esporos (perda). O tubo contendo a camada aderida de esporos foi seco com gás hélio e cortado para obtenção dos cartuchos com cerca de 1 cm de comprimento por meio do cortador de tubos adquirido da BIORAD. Proporcionalmente, para o preparo de 10 cartuchos utilizou-se 5 mg (ou 5x109) de esporos, 10 cm de tubo e 10 μg de plasmídeo adsorvido em sua superfície. Os cartuchos preparados foram armazenados sob refrigeração a 4 °C, -20 °C ou -80 °C para testes de quantificação de esporos.

[75] Para a administração por biobalística com as micropartículas de ouro, utilizou-se protocolo padronizado pelo fabricante (BIORAD). Para o preparo de 10 cartuchos, 5 mg de ouro (aproximadamente 5x10* 8 partículas de 1μm) foram impregnados com 10 μg de DNA plasmidial através de solução de espermidina 0,05 M e CaCl2 1 M e, após três lavagens sucessivas com etanol 100 %, foram ressuspensos em 600 μL de solução de PVP 0,05 mg/mL e adicionados no tubo de Tefzel® com o auxílio de uma seringa, onde permaneceram a 25 °C por 10 min. O líquido remanescente contendo PVP foi então descartado e o tubo foi seco com gás hélio e cortado para obtenção dos cartuchos de 1cm de comprimento, permanecendo a 4 °C até o momento de sua utilização. Vetores vacinais

[76] O plasmídeo que expressa a proteína E7 de HPV-16 fusionada à gD de HSV-1 foi construído após clonagem do gene sintético que codifica a proteína híbrida gD com a sequência gênica otimizada para códons de humanos e denominado pgDE7h (DINIZ; FERREIRA, 2010). Além disso, na sequência de E7 presente no gene sintético foram realizadas duas mutações pontuais que nocauteiam a atividade oncogênica da proteína via interação com a proteína pRb. Tais mutações consistiram na troca de uma cisteína por uma glicina na posição 24 de E7 e de um ácido glutâmico por uma glicina na posição 26 de E7 e foram descritas anteriormente (TRIMBLE et al., 2003). O gene sintético foi desenhado com as sequências dos sítios de BglII e PstI nas extremidades, que foram os sítios utilizados para subsequente clonagem da sequência no plasmídeo pUMVC3 (Aldevron, EUA) que possui gene que codifica resistência à canamicina e promotor de CMV.

[77] O plasmídeo que expressa a proteína luciferase (pLuc) foi construído após clonagem do gene sintético da luciferase (luc2) - extraído do vetor pGL4 (Promega) - nos sítios de BamHI e XbaI do plasmídeo pcDNA3.0 (Invitrogen). Este possui gene que codifica resistência a ampicilina/neomicina e promotor de CMV.

[78] A obtenção dos plasmídeos, para serem usados nas transfecções/imunizações foi realizada através de propagações em larga escala em linhagens de Escherichia coli DH5α transformadas com os diferentes vetores, em meio LB suplementado com ampicilina (100 mg/mL) ou canamicina (50 mg/mL), seguido da purificação dos plasmídeos utilizando o kit de purificação de plasmídeos de “Giga Prep” (QIAGEN Endo Free Plasmid Giga, QIAGEN), seguindo instruções do fabricante. As amostras de DNA foram quantificadas em espectrofotômetro a 260 nm e confirmadas por inspeção visual em gel de agarose 0,8 %, corado com brometo de etídeo, utilizando para comparação fragmentos de DNA padrões com concentrações conhecidas (Invitrogen). Os plasmídeos foram mantidos a -20 °C até o momento de sua utilização. Linhagem celular

[79] A linhagem celular tumoral TC-1 (LIN et al., 1996) é derivada de células primárias do epitélio pulmonar de C57BL/6 transformadas com v-Ha-ras e os genes de E6 e E7 do HPV-16 (gentilmente cedida pelo Dr. T.C. Wu, Universidade Johns Hopkins, EUA). As células TC-1 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 2 mM aminoácidos não essenciais, 10 mM tampão HEPES, 50 U/mL penicilina/streptomicina, 10 % de soro fetal bovino (SFB) e mantidas a 37 °C e 5 % de CO2. No dia do desafio tumoral as células foram tratadas com tripsina, lavadas duas vezes, e suspensas em meio sem soro na concentração apropriada para a inoculação.

[80] A linhagem celular COS7 é do tipo fibroblástica, derivada do tecido de rim do macaco verde africano e obtida a partir de células CV-1 (transformadas por um mutante do vírus SV-40). As células COS7 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 2 mM aminoácidos não essenciais, 10mM tampão HEPES, 50 U/mL penicilina/streptomicina, 10 % de soro fetal bovino (SFB) e mantidas a 37 °C e 5 % de CO2 até sua utilização. Determinação do tamanho e do potencial-zeta dos esporos

[81] A determinação do diâmetro médio dos esporos foi realizada através da curva de distribuição de tamanho obtida pela técnica de DLS (Dynamic Light Scattering). O potencial- zeta, carga elétrica total da superfície dos esporos, foi obtido a partir da mobilidade eletroforética, medida pela frequência da luz espalhada (Electrophoretic Light Scattering, ELS). As amostras foram suspensas em 1 mL de água destilada estéril e as leituras feitas no equipamento ZetaPlus Zeta Potential Analyzer (Brookhaven Instruments Corporation, USA). Microscopia de fluorescência de esporos impregnados com DNA plasmidial

[82] Esporos (5x108) de B. subtilis foram impregnados com 1 μg DNA plasmidial (pgDE7h), segundo metodologia descrita anteriormente. Em seguida, foram incubados por 30 min à temperatura ambiente com solução de DAPI (4'6'- diamidino-2-fenilindol) a 2 mg/mL diluída 1:1000. As suspensões de esporos foram lavadas e ressuspensas em água, adicionadas em lâminas para microscopia e fixadas por calor. As imagens foram visualizadas no microscópio digital EVOS® (AMG). O controle negativo do experimento utilizou a mesma quantidade de esporos, sob as mesmas condições de marcação, porém sem o plasmídeo vacinal adsorvido. Quantificação de esporos/DNA plasmidial nos cartuchos

[83] Para mensurar a quantidade de DNA plasmidial por cartucho, utilizou-se protocolo descrito no manual do fabricante (BIORAD). Um cartucho foi colocado em um tubo de microcentrífuga juntamente com 100 μl de tampão TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) e levado à agitação vigorosa até desprendimento de todo o conteúdo presente (esporos ou ouro). O material foi centrifugado por 10 min (esporos) ou 15 s (ouro). O sobrenadante foi analisado por eletroforese em gel de agarose e o precipitado quantificado para determinação do número de esporos efetivamente obtido por cartucho. Detecção da atividade do gene repórter (luc2) em culturas de células e em camundongos após transfecção por gene gun

[84] Células eucarióticas COS7 dispostas em monocamada e a 80 % de confluência foram transfectadas com um cartucho contendo esporos ou ouro e 1 μg do plasmideo pLuc. O gene gun foi colocado o mais próximo possível à cultura e aplicada uma pressão de hélio igual a 100 psi. Em seguida foram adicionados 5 mL de meio de cultura e as células incubadas por 48 h a 37 °C e 5 % CO2. Os resultados de bioluminescência foram obtidos após adição de luciferina (Promega) no meio de cultura, na concentração final de 150 μg/mL, e visualização no equipamento IVIS® Spectrum (Caliper).

[85] Para detecção da atividade da luciferase in vivo, foram utilizados camundongos C57BL/6, machos, de 6-8 semanas. Para cada animal foram administrados um ou dois cartuchos sob alta pressão de gás hélio (500 psi) na região abdominal depilada. Os resultados de bioluminescência foram obtidos após inoculação por via intraperitoneal de luciferina (Promega), na concentração de 150 mg/kg de peso corpóreo, e visualização no equipamento IVIS® Spectrum (Caliper) 48 h após a transfecção. Imunização dos camundongos por biobalística e desafio com as células tumorais

[86] Os experimentos de imunização foram realizados com camundongos machos C57BL/6 com idade entre 8-10 semanas adquiridos do Biotério de Experimentação do Departamento de Parasitologia da USP e manuseados segundo as normas estabelecidas pela comissão de ética do ICB-USP.

[87] A imunização utilizando o processo de biobalística foi realizada através de uma pistola acoplada a um cilindro de hélio de acordo com as instruções do fabricante (Biorad). Ouro e esporos de B. subtilis, em quantidades padronizadas, foram revestidos pelo vetor vacinal. As micropartículas com o DNA foram aceleradas por uma alta pressão de gás hélio (500 psi) e entregues à região abdominal depilada do animal. Grupos de cinco animais foram imunizados por biobalística com regime de duas doses com uma semana de intervalo entre as doses.

[88] A inoculação das células tumorais TC-1 foi realizada por via subcutânea, na concentração de 7,5 x 104/animal suspensas em 100 μL de meio sem soro e inoculadas na região dorsolateral do animal uma semana depois da primeira imunização em regime profilático. O acompanhamento da evolução dos tumores nos ensaios de proteção antitumoral foi feito três vezes a cada semana por um período de 60 dias. Os tumores, quando presentes, foram medidos com o auxílio de um paquímetro e os animais que apresentaram tumores maiores que 1,5 cm de diâmetro foram sacrificados. Ensaio de marcação intracelular de citocinas (Intracellular Cytokine Staining - ICS)

[89] A marcação de IFN-y intracelular foi realizada com células do sangue periférico de camundongos imunizados 14 dias após a administração da segunda dose vacinal. As células foram tratadas por 5 min no gelo com Ack Lising Buffer (BioSource International) até ruptura das hemácias e então centrifugadas a 1500 rpm por 5 min. As células foram incubadas a uma concentração de 106 células/poço por 6 h a 37 °C 5 % CO2 na presença de Brefeldin A (1 μg/poço) (GolgiPlug; BD Biosciences) e ausência ou presença do peptídeo específico de E7 (aminoácidos 49-57; RAHYNIVTF; 300 ng/poço) (FELTKAMP et al., 1993). Após este período, as células foram incubadas por 30 min a 4 °C com anticorpo anti- CD8+ conjugado com fluorocromo (BD Biosciences). Após permeabilização com Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) por 20 min a 4 °C, as células foram tratadas com anticorplino anti- IFN-y conjugado com diferente fluorocromo (BD Biosciences) por 30 min a 4 °C. As células foram ressuspensas em PBS e examinadas por citometria de fluxo utilizando o aparelho FACS Canto (BD Biosciences). Os dados foram analisados com o auxílio do programa FlowJo para a determinação das porcentagens de células CD8 + /INF-y+ sobre o total de células CD8+. Resposta de anticorpos séricos em animais imunizados por meio do ensaio de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

[90] Os títulos de anticorpos anti-E7 dos animais imunizados foram medidos em ensaios de ELISA feitos com a proteína E7. Os ensaios de ELISA foram realizados com 250 ng/poço da proteína E7 dispostos em placas MaxiSorp (Nunc). Após incubação de 16 h a 4 °C, as placas foram bloqueadas com 3 % gelatina em PBS 1X incubando-as a 37 °C durante 2 h. Em seguida, os soros provenientes dos animais imunizados (pool) foram adicionados na diluição inicial 1:25 nas placas, que foram incubadas a 37 °C por 1 h. Após a incubação, anticorpos anti-IgG de camundongo conjugados à peroxidase foram diluídos em PBS-Tween 0,05 % com 1% gelatina na concentração de 1:3000 e incubados a temperatura ambiente por 1 h nas placas previamente lavadas com PBS-Tween 0,05 %. A presença de anticorpos ligados aos antígenos foi visualizada com a solução de revelação (12,5 mL de tampão Citrato-Fosfato 33 mM, pH 5.0; 5 mg de O- Fenilenodiaminadihidrocloreto (OPD); e 5 μL de H2O2 por placa) por 20 min a temperatura ambiente e protegida da luz. A reação foi interrompida com 50 μL/poço de H2SO4 9 N. As densidades óticas das reações foram determinadas a 492 nm no espectrofotômetro modelo Epoch™ Multi-Volume Spectrophotometer (Bio Tek Instruments). Caracterização biofísica dos esporos

[91] Os esporos purificados foram obtidos após cultivo de B. subtilis da linhagem 1012, em meio Foerster durante um período de 7 dias. Após centrifugação inicial (10000 rpm/10- 15 min), o precipitado foi lavado (3x) com água destilada para retirada do meio de cultura e rompimento das células vegetativas eventualmente presentes. A quantificação foi realizada através da determinação do número de UFC/mL e confirmada por meio da contagem na câmara de Petroff-Hausser (esporos/mL) para obtenção dos esporos de B. subtilis purificados (Figura 1) utilizados neste trabalho. A figura 1 se refere aos esporos de B. subtilis 1012 visualizados por microscopia de contraste de fase. Aumento de 1000 x.

[92] Os esporos foram obtidos a partir do cultivo da bactéria em meio Foerster durante 7 dias, utilizando a estratégia de exaustão de nutrientes.

[93] Para caracterização dos esporos purificados como micropartículas carregadoras, foram analisados parâmetros físicos como tamanho e carga elétrica de superfície. O raio médio das partículas foi determinado através da técnica de DLS (Dynamic Light Scattering) a partir dos gráficos de distribuição de tamanho obtidos para esporos vivos (Figura 2A) e inativados (Figura 2B), resultando em um diâmetro médio de 1,83 μm e 1,65 μm, respectivamente.

[94] As figuras 2A e 2B se referem aos gráficos de dispersão de luz dinâmica (DLS) para determinação do diâmetro de partículas, sendo a distribuição de tamanho indicando a medida do raio (nm) de esporos vivos demonstrada na figura 2A e dos esporos inativados demonstrada na figura 2B utilizando a água como dispersante.

[95] Na figura 2A, a média do raio das partículas foi de 916,9 nm.

[96] Na figura 2B, a média do raio das partículas foi de 826,8 nm.

[97] A carga elétrica total de superfície foi mensurada a partir de valores de potencial-zeta obtidos por meio da técnica de ELS (Electrophoretic Light Scattering). Esporos vivos e inativados apresentaram carga média negativa de -42 mV e -36 mV respectivamente e, assim como os dados de diâmetro, mostraram-se coerentes com dados anteriormente descritos para esporos de B. subtilis: 1,63 μm de comprimento e potencial-zeta igual a -50 mV (HUANG et al., 2010). Padronização do protocolo de adsorção de DNA à superfície dos esporos

[98] Após caracterização como micropartículas, os esporos foram testados quanto a sua capacidade de adsorção de DNA plasmidial, necessária para sua utilização como carregador vacinal para biobalística. Atualmente, a técnica da biobalística utiliza partículas de ouro de 1 μm de diâmetro impregnadas com DNA plasmidial após adsorção com espermidina 0,05 M e precipitação com CaCl2 1 M. Para adsorção aos esporos, foram testados diferentes reagentes e concentrações, sob temperaturas e tempos de incubação variáveis, baseados nos protocolos de adsorção de plasmídeo nas partículas de ouro e em partículas de ácido poli(láctico- co-glicólico), PLGA (O'HAGAN et al., 2001), e também da adsorção de proteínas em esporos de B. subtilis (HUANG et al., 2010).

[99] A escolha dos reagentes foi baseada na carga elétrica negativa presente na superfície dos esporos e de sequências de DNA. Neste caso foi necessária a utilização de compostos catiônicos capazes de interagir tanto com os esporos quanto com o DNA (espermidina, CaCl2, CTAB e DODAB BF) ou soluções que apresentassem cátions livres, como no caso da solução de PBS em pH ácido ou neutro.

[100] Esporos purificados (5x108) foram incubados com 500 μ l-1mL de diferentes reagentes durante 30-60 min à temperatura ambiente e lavados (1x) com água destilada através de agitação vigorosa. Em seguida adicionou-se uma solução contendo 1 μg de DNA plasmidial (pgDE7h) variando o tempo e a temperatura de incubação (Tabela 1). A quantidade de DNA adsorvida aos esporos foi obtida após centrifugação da suspensão de esporos com DNA a 10000 rpm/10-15 min e análise eletroforética em gel de agarose da solução sobrenadante contendo ou não DNA remanescente. Tabela 1 - Resumo das reações de adsorção testadas com esporos purificados de B. subtilis.

(+) adsorção de até 20 % da quantidade de DNA adicionada (++) adsorção de até 80 % da quantidade de DNA adicionada (+++) adsorção de 90-100 % da quantidade de DNA adicionada (n.a.) não se aplica

[101] Com base nessa análise, foram selecionados dois reagentes, com os quais se obteve adsorção total do plasmídeo nas melhores condições de reação: tratamento dos esporos com CTAB 0,01 % (p/v) ou DODAB BF a 2 mM durante 1 h a temperatura ambiente, com agitação constante e adição do DNA aos esporos tratados mantendo a suspensão à temperatura ambiente e agitação frequente por 1 h.

[102] Curvas de adsorção do DNA plasmidial aos esporos de B. subtilis foram realizadas utilizando CTAB 0,01 % (Figuras 3A e 3B) e DODAB BF 2 mM (Figuras 4A e 4B), de acordo com o protocolo padronizado descrito acima. Como resultado, uma alíquota de 5x108 esporos (vivos ou inativados) foi capaz de adsorver no máximo 1 μg de DNA com ambos reagentes.

[103] As figuras 3A e 3B se referem à análise do sobrenadante das reações de adsorção de DNA em esporos na presença de CTAB a 0,01 %.

[104] A figura 3A se refere à adsorção utilizando 1 μg de DNA (pgDE7h) e variando-se a quantidade de esporos. Em gel de agarose 0,8 % foram aplicados volumes iguais para todas as amostras, correspondentes a um quinto da reação de adsorção. Amostras: (1) DNA; (2) DNA + 1x107 esporos; (3) DNA + 5x107 esporos; (4) DNA + 1x108 esporos; (5) DNA + 2x108 esporos; (6) DNA + 5x108 esporos; (7) DNA + 1x109 esporos.

[105] A figura 3B se refere à adsorção utilizando 5x108 esporos e variando a quantidade de DNA (pgDE7h) adicionada. Em gel de agarose 0,8 % foram aplicados volumes iguais para todas as amostras, correspondentes a um vigésimo da reação de adsorção. Amostras: (1) 1 μg DNA; (2) 1 μg DNA + esporos; (3) 1,5 μg DNA; (4) 1,5 μg DNA + esporos; (5) 2 μg DNA; (6) 2 μg DNA + esporos; (7) 2,5 μ g DNA; (8) 2,5 μg DNA + esporos; (9) 3 μg DNA; (10) 3 μg DNA + esporos; (11) 4 μg DNA; (12) 4 μg DNA + esporos.

[106] As figuras 4A e 4B se referem à análise do sobrenadante das reações de adsorção de DNA em esporos com fragmentos de DODAB BF a 2 mM.

[107] Na figura 4A utiliza-se na adsorção 1 μg de DNA (pgDE7h) e varia-se a quantidade de esporos. Em gel de agarose 0,8 % foram aplicados volumes iguais para todas as amostras, correspondentes a um quinto da reação de adsorção. Amostras: (1) DNA; (2) DNA + 1x107 esporos; (3) DNA + 5x107 esporos; (4) DNA + 1x108 esporos; (5) DNA + 2x108 esporos; (6) DNA + 5x108 esporos.

[108] Na figura 4B utiliza-se na adsorção 5x108 esporos e variando a quantidade de DNA (pgDE7h) adicionada. Em gel de agarose 0,8 % foram aplicados volumes iguais para todas as amostras, correspondentes a um décimo da reação de adsorção. Amostras: (1) 200 ng; (2) 200 ng DNA + esporos; (3) 500 ng DNA; (4) 500 ng DNA + esporos; (5) 1 μg DNA; (6) 1 μg DNA + esporos; (7) 2 μg DNA; (8) 2 μg DNA + esporos; (9) 3 μg DNA; (10) 3 μg DNA + esporos; (11) 4 μg DNA; (12) 4 μg DNA + esporos; (13) 5 μg DNA; (14) 5 μg DNA + esporos.

[109] Esporos purificados de B. subtilis também foram capazes de adsorver, além de plasmídeos, oligonucleotídeos como o CpG, na mesma proporção obtida para DNA plasmidial, isto é, 5x108 esporos (vivos ou inativados) para 1 μg de CpG (Figura 5). A metodologia utilizada foi a mesma descrita anteriormente utilizando tanto CTAB a 0,01 % (p/v) como DODAB BF a 2 mM.

[110] A figura 5 se refere à adsorção de CpG em esporos de B. subtilis na presença de DODAB BF a 2 mM. A adsorção utiliza 5x108 esporos vivos e variando a quantidade de CpG. Em gel de agarose 0,8 % foram aplicados volumes iguais para todas as amostras, correspondentes a um quinto da reação de adsorção. Amostras: (1) Esporos + 1 μg CpG; (2) Esporos + 2 μg CpG; (3) Esporos + 3 μg CpG; (4) Esporos + 4 μg CpG; (5) Esporos + 5 μg CpG; (6) Esporos + 6 μg CpG.

[111] A fim de complementar as evidências já existentes quanto à capacidade de adsorção de DNA aos esporos, 5x108 esporos foram impregnados com 1 μg de DNA e incubados com solução diluída de DAPI e, em seguida, visualizados ao microscópio de fluorescência. A presença de DNA adsorvido resultou em fluorescência da suspensão de esporos, a qual não foi detectada para a suspensão de esporos sem o DNA impregnado (Figura 6).

[112] A figura 6 demonstra a marcação de DNA plasmidial adsorvido na superfície dos esporos. B. subtilis foram impregnados ou não com 1 μg de pgDE7h e incubados com solução diluída de DAPI para marcação do DNA. Imagens do campo claro (A) e com fluorescência (C) dos esporos com DNA adsorvido em sua superfície. B e D correspondem às imagens obtidas em campo claro e com fluorescência, respectivamente, de esporos não impregnados com DNA e utilizados como controle neste experimento. Magnitude: 1000 x. Padronização do procedimento de preparo dos cartuchos utilizados na biobalística

[113] Após padronização da adsorção de DNA, a próxima etapa foi elaborar um protocolo de preparo dos cartuchos de esporos recobertos com DNA plasmidial. Para isso, testou-se o procedimento comumente empregado na biobalística para as partículas de ouro, onde se utiliza PVP 0,05 mg/mL para impregnação das mesmas no tubo de Tefzel® e posterior obtenção dos cartuchos após 10 min à temperatura ambiente. Para os esporos de B. subtilis, padronizou-se a mesma solução de PVP, porém deixando o tubo fechado por 16-18 h - tempo necessário para a sedimentação e impregnação dos esporos no tubo. Após este período, o sobrenadante contendo PVP foi recolhido e quantificado na câmara de Petroff-Hausser através do número de esporos/mL. Para 5x108 esporos (1 μg de DNA adsorvido) por cartucho, houve uma perda de aproximadamente 0,4 % da quantidade inicial de esporos adicionada ao tubo.

[114] Os cartuchos também foram quantificados quanto ao número de esporos impregnados, após armazenamento em diferentes temperaturas. Os esporos foram recuperados manualmente do cartucho após agitação vigorosa com tampão TE. Para 5x108 esporos adicionados por cartucho, a média do número de esporos recuperada foi de 1,6x108, 2,2x108 e 2,7x108 para as temperaturas de 4 °C, -20 °C e -80 °C testadas. Portanto, padronizou-se para os cartuchos de esporos uma temperatura de armazenamento de -80 °C, até sua utilização. CTAB versus DODAB BF: Análise do perfil de adsorção de DNA plasmidial à superfície dos esporos

[115] Após padronização do protocolo de adsorção de DNA aos esporos com CTAB e DODAB BF, realizou-se a análise do perfil de adsorção através de duas estratégias. A primeira delas foi a determinação do potencial-zeta resultante das etapas de adsorção: tratamento dos esporos com o reagente e adsorção propriamente dita do DNA plasmidial aos esporos tratados (Figura 7).

[116] A figura 7 se refere à análise do potencial zeta de esporos de B. subtilis 1012 vivos (EV) ou inativados (EI) em diferentes etapas da reação de adsorção.

[117] Etapas de adsorção: (E) em água; (E+Reagente) após incubação com CTAB 0,01 % ou fragmentos de DODAB BF 2 mM e (E+Reagente+DNA) após adsorção de 1 μg de DNA (pgDE7h), de acordo com o protocolo de adsorção padronizado neste trabalho.

[118] A determinação da carga elétrica das partículas ao final de cada etapa sugere que tipo de interação esporo- reagente-DNA ocorreu. Esporos (vivos ou inativados) não mostraram alteração significativa do potencial-zeta após tratamento com CTAB e nem com DNA adsorvido em sua superfície, permanecendo com uma carga elétrica líquida negativa em ambas as situações. Já os esporos tratados com os fragmentos de DODAB apresentaram uma inversão total de cargas em relação ao potencial-zeta nativo e uma diminuição substancial da carga de superfície após adsorção com o DNA plasmidial, ficando próxima à neutralidade (com esporos inativados) ou negativa como inicialmente (com esporos vivos).

[119] Diante do fato de que os esporos adsorvem a mesma quantidade de DNA com ambos reagentes e analisando os resultados de potencial-zeta anteriormente demonstrados, é possível dizer que há perfis diferentes de interação entre esporos, DNA e os dois reagentes. De acordo com o protocolo de adsorção padronizado neste trabalho, pode-se sugerir que a interação dos esporos com o DODAB BF é baseada na distribuição de cargas entre a superfície particulada e o reagente, assim como a interação entre o reagente e o DNA. Entretanto, nas ligações esporos-CTAB e CTAB-DNA provavelmente há predominância de interações mais fortes que não se baseiam meramente em cargas, mas também em ligações hidrofóbicas - comprovadamente existentes nas interações entre esporos e proteínas heterólogas adsorvidas (HUANG et al., 2010). Por causa deste e de outros resultados apresentados no presente trabalho, pode-se sugerir que os dois reagentes em questão mostram interações diferentes com DNA, como já observado por Vieira e Carmona-Ribeiro (2006).

[120] Para confirmar tal hipótese, utilizamos uma segunda estratégia de avaliação dos perfis de adsorção: a quantificação e análise em gel de agarose do DNA plasmidial presente nos cartuchos preparados para biobalística (Figura 8).

[121] A figura 8 se refere à avaliação do perfil do DNA plasmidial recuperado nos cartuchos de biobalística. Análise por eletroforese em gel de agarose 0,8 % dos sobrenadantes obtidos após procedimento realizado com tampão TE e agitação vigorosa dos cartuchos contendo 1 μg de plasmídeo adsorvido aos esporos com CTAB 0,01 % ou fragmentos de DODAB BF 2 mM. Foram aplicados volumes iguais para todas as amostras, correspondentes a um quinto da reação de adsorção. O cartucho preparado com ouro foi considerado um controle desse procedimento. (1) DNA; (2) DNA+CTAB+esporos vivos; (3) DNA+CTAB+esporos inativados; (4) DNA+DODAB+esporos vivos; (5) DNA+DODAB+esporos inativados; (6) DNA+Ouro.

[122] Visualmente, é possível notar que a quantidade de DNA recuperada em todas as amostras (Figura 8, colunas 2 a 6) foi menor do que a esperada (Figura 8, coluna 1). Porém, vale ressaltar que, diferentemente do ouro, cartuchos preparados com esporos mostraram um perfil diferente de DNA plasmidial recuperado, apresentando inclusive certo grau de fragmentação. Não foi possível visualizar o DNA adsorvido com CTAB, podendo-se concluir que, por esta metodologia, o DNA adsorvido não foi liberado dos esporos vivos nem dos inativados e, portanto, sugerindo uma interação mais forte entre eles. Já o DNA adsorvido com DODAB BF mostrou-se uma alternativa mais promissora em relação à sua recuperação frente à mesma metodologia. Entretanto, com esporos vivos o DNA mostrou-se de forma diferente da esperada, apresentando uma banda mais forte e posicionada mais acima no gel de agarose, correspondente a formas mais instáveis do plasmídeo (linear ou “cortado”). Com os esporos inativados, o perfil visualizado foi ainda mais promissor, bem semelhante ao obtido com o cartucho preparado com ouro, mostrando-se como uma boa e possível estratégia para substituição das partículas de ouro na biobalística. Transfecções in vitro e in vivo com o gene repórter codificando luciferase (luc2) em cartuchos preparados com esporos

[123] Para comprovar a utilização dos esporos na biobalística foram realizadas transfecções in vitro e in vivo com objetivo de detectar a atividade do gene repórter luc2 após administração com gene gun. O plasmídeo pLuc, que codifica o gene em questão, foi adsorvido à superfície de esporos de B. subtilis vivos e inativados utilizando tanto CTAB a 0,01 % como DODAB BF a 2 mM. Como controle positivo de transfecção foram utilizadas partículas de ouro de 1 μm impregnadas com o mesmo plasmídeo, segundo protocolo padrão existente.

[124] As figuras 9A e 9B se referem às imagens de bioluminescência de células eucarióticas COS7 transfectadas com pLuc por biobalística. Os cartuchos para transfecção foram preparados com 1 μg de pLuc adsorvido em partículas de ouro e nos esporos, em quantidades padronizadas, utilizando (A) CTAB 0,01 % e (B) DODAB BF 2 mM. O controle negativo corresponde a células COS7 não-transfectadas. Os resultados de luminescência foram obtidos 48 h após a transfecção.

[125] Também foram realizadas transfecções in vivo, em camundongos C57BL/6, com os mesmos cartuchos preparados para os testes in vitro contendo 1 μg pLuc. Todos os animais foram administrados pela via intradérmica com dois cartuchos cada, totalizando doses de 2 μg pLuc por animal e, assim como nos testes de transfecção in vitro, a transfecção ocorreu de maneira satisfatória, similar ao padrão (ouro), apenas quando foram utilizados esporos inativados adsorvidos através de DODAB BF 2mM.

[126] As figuras 10A e 10B se referem às imagens de bioluminescência de camundongos C57BL/6 transfectados com pLuc por biobalística. Significância estatística: (*) p<0,05; (**) p<0,01 (ANOVA).

[127] Os dados de transfecção in vitro e in vivo com o plasmídeo pLuc apresentados foram coerentes à hipótese colocada anteriormente sobre os diferentes perfis de interação entre esporos, DNA e os dois reagentes utilizados na adsorção (CTAB e DODAB BF). Esporos impregnados com pLuc através de CTAB não se mostraram eficientes nas transfecções plasmidiais com gene gun. Esporos vivos impregnados com pLuc através de DODAB BF, apresentaram resultados inferiores de luminescência nas transfecções in vivo em relação aos esporos inativados e ao ouro, e não se mostram eficientes na transfecção in vitro. Já as transfecções com pLuc adsorvido aos esporos inativados com DODAB BF apresentaram resultados satisfatórios, semelhantes aos obtidos com as partículas de ouro, consolidando dessa maneira a possibilidade de sua utilização na biobalística. Imunização de camundongos C57BL/6 com gene gun

[128] Como prova de conceito da utilização de esporos inativados de B. subtilis como micropartículas para biobalística utilizando DODAB BF para impregnação plasmidial, grupos de cinco animais foram imunizados com a vacina de DNA pgDE7h, em regime profilático. Paralelamente, realizou-se a imunização com micropartículas de ouro (protocolo padrão de preparo dos cartuchos) para fins de comparação.

[129] Neste caso, foram utilizados 2 μg de pgDE7h adsorvidos em 109 esporos inativados por bala, o dobro da quantidade de plasmídeo impregnada nas micropartículas de ouro.

[130] Os animais imunizados receberam duas doses contendo 4 μg pgDE7h/2x109 esporos ou 2 μg pgDE7h/ouro por dose e desafiados uma semana depois da 2a imunização. Nos dias 7, 14 e 28 foram feitas coletas de sangue para avaliação da resposta humoral e celular através dos ensaios de ELISA e ICS, respectivamente. Após 40 dias do desafio tumoral, todos os animais foram sacrificados.

[131] Apesar de não haver diferença estatística na média entre os grupos “Controle” e “Esporos” (Figura 11A), a avaliação da resposta celular realizada individualmente mostra que alguns animais imunizados com esporos por biobalística apresentaram uma quantidade significativa de células T CD8+ E7-específicas produtoras de IFN-y em relação ao grupo controle (Figura 11B). De fato, diferentemente do grupo não imunizado (controle) que não apresentou qualquer tipo de regressão tumoral, 20 % dos camundongos imunizados com esporos tiveram seu volume tumoral controlado (aproximadamente 5 mm3) até o final do experimento. Em relação à resposta de anticorpos, esse grupo também apresentou resultados promissores, com títulos de IgG E7- específicos significativos após a 1a dose (Figura 12) próximos ao grupo imunizado com ouro (o qual apresentou 100 % de proteção antitumoral).

[132] As figuras 11A e 11B se referem à indução de células T CD8+ produtoras de IFN-y E7 específicas em camundongos C57BL/6 imunizados por biobalística. A detecção das células T CD8+ E7 específicas foi realizada com PBMCs individuais incubados com o peptídeo E7-MHC classe I (49RAHYNIVTF57) e marcadas com os anticorpos anti-CD8 (FITC) e anti-IFN-y intracelular (PE). A, representação das porcentagens de células T CD8+IFN-y+ sobre o total de células T CD8+ obtidas para cada animal e a média por grupo. B, gráfico representativo de um animal por grupo com as porcentagens de células T CD8+IFN-y+ sobre o total de células T CD8+ indicadas no quadrante superior direito dos gráficos. Significância estatística: (**) p<0,01 (ANOVA).

[133] A figura 12 se refere à determinação dos títulos de IgG total E7-específicos após imunização por biobalística. O soro dos animais foi coletado uma semana após a 1a e a 2a dose (dias 7 e 14) e o título obtido após ensaio de ELISA. Os animais do grupo controle receberam o desafio tumoral com as células TC-1, porém não foram imunizados. Os dados mostrados representam a média do resultado obtido com grupos de cinco animais analisados de forma individual e em duplicata. Significância estatística: (**) p<0,01; (***) p<0,005, (****) p<0,0001, versus grupo Controle (ANOVA).

[134] Embora a invenção tenha sido amplamente descrita, é óbvio para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas visando aprimoramento do projeto sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção.

Claims (12)

1- Esporos de Bacillus sp. adsorvidos com oligonucleotídeos e/ou ácidos nucleicos, caracterizados pelo fato de apresentarem 5x108 esporos vivos ou inativados adsorvidos a cada 1 μg de ácidos nucleicos ou oligonucleotídeos resultando em no máximo 2 fg (femtogramas) de moléculas adsorvidas em sua superfície, de tamanho entre 1,6 e 1,8μm de diâmetro.

2- Esporos de Bacillus sp. adsorvidos com oligonucleotídeos e/ou ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de preferencialmente ser utilizado o Bacillus subtilis.

3- Método de Preparo dos Esporos, definidos nas reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) Esporulação de Bacillus sp.; b) Centrifugação dos esporos; c) Lavagem dos esporos; e d) Adsorção de DNA plasmidial/oligonucleotídeos na superfície dos esporos; sendo os esporos aquecidos após a etapa de lavagem (c) e, opcionalmente visualizados e autoclavados os esporos viáveis antes da etapa de adsorção (d).

4- Método de Preparo dos Esporos, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de nas etapas “b” e “c” as culturas serem centrifugadas até a precipitação dos esporos, após 6-10 dias de esporulação e sujeitas a 1-3 lavagens com água destilada e agitação vigorosa até ressuspensão e obtenção do precipitado com esporos.

5- Método de Preparo dos Esporos, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de na etapa de aquecimento os esporos serem incubados por 30-60 min a 6070 °C.

6- Método de Preparo dos Esporos, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de na etapa opcional os esporos viáveis serem visualizados ao microscópio e titulados para determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC/ml).

7- Método de Preparo dos Esporos, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de na etapa “d” uma alíquota de esporos ser ressuspensa utilizando-se um dos seguintes reagentes escolhido dentre brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) na concentração 0,01 % (p/v) ou brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) na forma de fragmentos de bicamada lipídica (BF) a 2 mM ou Espermidina a 0,05M; sendo utilizada a proporção de 5x108-2x109 esporos/200-1000 μl de reagente; permanecendo em agitação moderada (60-80 rpm) por 30-60 min, a 20-25 °C; seguida de centrifugação até a obtenção dos esporos precipitados; seguido de lavagem com água destilada.

8- Método de Preparo dos Esporos, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de na etapa “d” ao final da lavagem, os esporos serem ressuspensos em solução aquosa contendo o plasmídeo ou oligonucleotídeo na concentração de interesse, permanecendo a mistura a 20-25 °C durante um tempo 30-60 min e agitando-se frequentemente ou apenas homogeneizando sem incubação; seguindo de centrifugação da suspensão até a obtenção do precipitado contendo os esporos com o plasmídeo adsorvido em sua superfície.

9- Método de Preparo dos Esporos, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de na etapa “d” o sobrenadante ainda ser armazenado.

10- Método de Preparo de Cartuchos de Biobalística caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) Ressuspensão dos esporos preparados conforme o método definido nas reivindicações 2 a 9; b) Armazenagem em tubo fechado; c) Secagem; e d) Obtenção dos Cartuchos.

11- Método de Preparo de Cartuchos de Biobalística, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de nas etapas “a” e “b” o plasmídeo de interesse adsorvido aos esporos de Bacillus sp. ser ressuspenso em solução de PVP (polivinilpirrolidona) com concentração de 0,005 a 0,05 mg/mL em etanol 100 %, sendo o material ressuspendido adicionado a um tubo apropriado para cartuchos de biobalística onde permanece fechado por 8-20 h a 20-25 °C, seguindo a seguinte proporção: 5x108-2x109 esporos/60-300 μl de solução de PVP/1-5 cm de tubo.

12- Método de Preparo de Cartuchos de Biobalística, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de nas etapas “c” e “d” o tubo contendo a camada aderida de esporos seca ser cortado de forma a serem obtidos cartuchos com 1 cm de comprimento ou conforme o tamanho apropriado para o tipo de carregador de cartuchos utilizado.

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