BR102014006002A2 - biomateriais para enxertia óssea e processo para sua obtenção - Google Patents

Abstract

biomateriais para enxertia óssea e processo para sua obtenção - biomateriais confeccionados a partir do pó e extrato orgânico proteico do nácar do mexilhão perna perna combinados com alginatos, glicerol e água, com aplicação de biomaterial ou como arcabouço em enxertia óssea. inicialmente, as conchas (fonte de nácar) são higienizadas em água e detergente neutro. o nácar é submetido a processo de particulação. as partículas são esterilizadas e colocadas em solução ácida quelante na qual se obtem um extrato orgânico proteico, novamente esterilizado. biomateriais e arcabouços são obtidos separadamente ou agregando-se os particulados ou o extrato orgânico à água destilada, glicerol e alginatos (dois destes ou mais, em quantidades/formas distintas). os particulados são submetidos a diferentes avaliações fisico-químicas. os resultados mostram a viabilidade da particulação do nácar da concha, e a presença de proteína como constituinte do mesmo, sendo a extração proteica obtida pela solubilização em ácido acético ou edta. in vitro, a presença do extrato orgânico proteico com sais de cloreto de cálcio, fosfato de sódio, e bicarbonato de sódio sugere uma potencial aplicação para enxertia óssea. os arcabouços desenvolvidos com o extrato orgânico e/ou particulados do nácar associado aalginatos, glicerol e água demonstram aplicação na área da reconstrução óssea.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO BIOMATERIAIS para enxertia óssea e processo para sua obtenção Campo da aplicação A presente invenção trata da confecção de biomateriais comaplicação na enxertia óssea, incluindo o tratamento de defeitos ósseos críticos (não auto-reparáveis) de qualquer parte do esqueleto humano ou intrabucais, a partir do pó e extrato proteico do nácar do mexilhão Perna perna combinados com alginatos, glicerol e água, como arcabouço para a proliferação celular e manutenção de volume durante o processo de reparo ósseo.

Histórico da inovação e análise do estado da técnica Apesar da reconstrução óssea ter evoluído significativamente nas últimas quatro décadas (BAK, M.; JACOBSON, A. S.; BUCHBINDER, D.; URKEN, M. L. Contemporary reconstruction of the mandible. Oral Oncol. 2010, 46(2):71-6), o reparo de defeitos ósseos causados por trauma, infecção, câncer ou malformações congênitas permanece um desafio para a medicina reconstrutiva. Por isso o desenvolvimento de biomateriais e o estudo histofisiológico ósseo com a intenção de reproduzir tecidos são imprescindíveis para a área da saúde (HAILER, J. R.; SULLIVAN, M. J. Contemporary Techniques of Mandibular Reconstruction. Am J Otolaryngology 1995, 16(1):19-23. YUAN, J.; CUI, L.; ZITANG, W. J.; LIU, W.; CAO, Y. Repair of canine mandibular bone defects with bone mar-row stromal cells and porous b-tricalcium phosphate. Biomaterials.2007, 28:1005-13. LAN LEVENGOOD, S. K.; POLAK, S. J.; POELMANN, M. J.; HOELZE, D. J.; MAKI, A. J.; CLARK, S. G.; WHEELER, Μ. B.; JOHNSON, A. J. W. The effect of BMP-2 on micro- and macroscaleosteointegration of bi-phasic calcium phosphate scaffolds with multiscale porosity. Acta Biomaterialia. 2010, 6:3283-3291) Aplicação Atualmente, tem-se,entre as técnicasmais modernas e eficientes, a aplicação de proteínas morfogenéticas ósseas (bone morphogenetic proteins — ou BMP) re-combinantes (rhBMP), produzidas em laboratório para aplicação clínica em defeitos críticos da face ou não. Apesar de se saber que a BMP-2 é um osteoindu-tor potente, efeitos indesejáveis foram relacionados ao seu uso, como a formação de cistos ósseos que diminuem a qualidade do osso formado e reações in-flamatórias com risco de morte (ZARA, J. N.;SIU, R. K., ZHANG, X.; SHEN, J.; NGO, R.; LEE, M.; LI, W.; CPIIANG, M.; CHUNG, J.; KWAK, J.; WU, B. M.; TING, K.; SOO, C. High Doses of Bone Morphogenetic Protein 2 Induce Structurally Abnormal Bone and Inflammation In Vivo. Tissue Eng Part A. 2011;17(9-10): 1389-1399). Alguns autores também relatam que os efeitos adversos podem atingir de 10% a 50% dos indivíduos em algumas aplicações da BMP-2 comercial nas cirurgias de coluna (CARRAGEE, E. J.; HURWITZ, E. L.; WEINER, B. K. A criticai review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons lear-ned. The Spine Journal. 2011;11:471-491). Mesmo a rhBMP-7, também disponível comercialmente, efeitos inflamatórios indesejáveis também podem ocorrer após sua aplicação (LEE, K. B.; TAGHAVI, C. E.; MURRAY, S. S.; SONG, K. J.; KEOROCITANA, G.; WANG, J. C. BMP induced inflammation: a compari-son of rhBMP-7 and rhBMP-2. J Orthop Res. 2012;30(12):1985-94), bem como formação ectópica, e portanto, indesejável, de osso, segundo a própria bula do produto (Anexo I, Resumo das características do medicamento. Disponível em: http ://w wvv. ema. europa. eu/docs/pt_PT/document_library/EP AR_Productlnfor mation/human/000819/WC500046179.pdf. Acessado em 25 de Fevereiro de 2014). Outros efeitos colaterais podem ser relacionados ao uso de BMP recom-binantes, como o aparecimento de câncer. A rhBMP-2 foi relacionada a câncer pancreático. Além destes, tem-se um alto custo de obtenção das BMP. Portanto, sugere-se que o uso de BMP em doses menores, mais semelhantes às fisiológicas, o uso de substâncias que estimulem a produção de BMP localmente, e o uso de metodologias mais econômicas para a produção de BMP sejam estratégias adequadas para melhorar os resultados das técnicas de enxerto ósseo com BMP(LISSENBERG-THUNNISSEN, S. N.; GORTER, D. J. J.; SffiR, C. F. M.; SCHIPPER, I. B. Use and efficacy of bone morphogenetic proteins in fracture healing. Int Orthop. 2011; 35(9): 1271-1280).

Biomateríais Dados econômicos podem ajudar a entender a importância dos biomateríais disponíveis. Segundo a consultoria americana “Markets and Markets”, o mercado global de biomateríais lucrou 25,6 bilhões de dólares em 2008, apresentando uma taxa de crescimento anual de 15%, devendo alcançar 64,7 bilhões de dólares em 2015 (Global Biomateríais Market (2010-2015). May 2011. Report Code: BT 1608. Disponível em: www.marketsandmarkets.com/Market- Reports/biomaterials-393.html. Acessado em 15 de Novembro de 2012).

Entre as técnicas de reconstrução óssea humana, faz-se uso de biomateríais diversos (HAILER, J. R.; SULLIVAN, M. J. Contemporary Techniques of Mandibular Reconstruction. Am J Otolaryngology. 1995,16(1):19-23. BAK, M.; JACOBSON, A. S.; BUCHBINDER, D.; URKEN, M. L. Contemporary reconstruction of the mandible.Oral Oncol. 2010,46(2):71-6. FUTRAN, N. D. Maxil-lofacial Trauma Reconstruction Facial Plast.Surg Clin N Am. 2009,17:239— 251). O uso de biomateríais de origem autógena (do próprio indivíduo) tem sido considerado como ‘padrão ouro’ (melhor opção de escolha da origem do bioma-terial), no entanto, devido a dificuldades, como aumento das complexidades cirúrgicas, do tempo de cirurgia, do risco de infecção e dos custos, outras fontes vem sendo utilizadas (ALMEIDA, U.; ZIELAK, J. C.; FILIETAZ, M.: GIO-VANINI, A. F.; DEL1BERADOR, T. M.; ULBRICH, L. M.; GONZAGA, C. C. Análise e utilização de biomaterial confeccionado a partir das conchas de cras-sostrea gigas em defeito periodontal em ratos. Odontol Clín-Cient. 2011, 10(3):259-263).

Dentre a grande quantidade de biomateríais comercializados estão os xenogênicos (provenientes de um organismo de outra espécie). Organismos marinhos como esponjas, bivalvos e algas, são considerados muito promissores na obtenção de matéria-prima para o desenvolvimento de biomateriais, uma vez que avanços científicos têmrevelado substâncias com grande aplicabilidade industrial e medicinal nestes organismos (ALI, S.; LLEWELLYN, C. Marine Chemical and Medicine Resources. Encyclopedia of Ocean Sciences, 2a ed., 2009:567-575). Do próprio descarte de animais marinhos, por exemplo, podem-se encontrar altas concentrações de minerais, lipídios, polissacarídeos e proteínas (FERRARO, V.; CRUZ, I. B.; FERREIRA, J. R.; MALCATA, F. X.; PINTADO, Μ. E.; CASTRO, P. M. L. Valorization of natural extracts from marine source focused on marine by-products. Food Res Int. 2010,43(9):2221-33). Mariscos Os mariscos (mexilhões) são usados na fabricação de colas e cimentos para a engenharia de tecidos (GROSS-AVIV, T.; DICARLO, B. B.; FRENCFI, Μ. M.; ATHANASIOU, K. A.; VAGO, R. A study of crystalline biomateriais for articular cartilage bioengineering. Mater Sei Eng. 2008,28(8):1388-1400. WILKET, J. J. Marine bioinorganic material: mussel pumping iron. Curr Opin Chem Biol. 2010,14(2):276-83). Sabe-se que a quantidade de resíduo sólido atual do comércio de mexilhões é enorme. No Brasil, o tipo de mexilhão mais comumente cultivado é o Perna perna. Dados de Assis apontam para uma produção brasileira atual deste molusco de aproximadamente 12 mil toneladas por ano, sendo estas geralmente comercializadas in natura, com a concha - mais tecnicamente chamada de nácar - que normalmente é descartada como resíduo (ASSIS, M. R. Viabilidade financeira da miticultura no litoral norte de São Paulo — um estudo de caso. VIII Congresso Nacional de Excelência em Gestão, 12-13 Ago 2011. ISSN: 1984-9354). Dados referentes ao município de Penha, SC, Brasil, revelam que, somente em 2003, 12 toneladas por dia de nácar são descartadas durante os períodos de safra (MARENZI, A. W. C.; BRANCO, J. O. O cultivo do mexilhão Perna perna no município de Penha, SC. Bases ecológicas para um desenvolví- mento sustentável: estudos de caso em Penha, UN1VALI, Itajaí. 2006; 227-244). O nácar possui peculiaridades no processo de mineralização, apresentando em sua constituição a aragonita, além de possuir em sua estrutura orgânica BMP, em especial a BMP-2 de humanos (HERPIN, C.; LELONG, T.; BECKER, F. M.; ROSA, P.; FAVRE, CUNNINGHAM, C. Structural and functional eviden-ces for a type 1 TGF-β sensu stricto receptor in the lophotrochozoan Crassostrea gigas suggest conserved molecular mechanisms controlling mesodermal patter-ning across bilateria. Mechanisms of Development. 2005;122:695-705. MIYASHITA, T.; HANASHITA, T.; TORIYAMA, M.; TAKAGI, R.; AKASHIKA, T.; FIIGASHIKUBO, N. Gene cloning and biochemical character-ization of the BMP-2 of Pinctadafiicata.BiosciBiotechnol Bio-chem. 2008;72( 1):37-47. OLIVEIRA, B. J. N. A. de. Isolamento e cultivo de células-tronco mesenquimais: Revisão de literatura. Universidade Federal de Goiás, Escola de Veterinária. Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, Disciplina: Seminários Aplicados. Goiânia. 2009), o que aumenta consideravelmente o potencial de uso desta fonte como biomaterial para enxerto ósseo.

No entanto, para que ocorra a neoformação óssea através de sinais químicos, como as BMP, há necessidade de um arcabouço, ou seja, um suporte tridimensional que possa servir como um molde para a reconstituição tecidual, devendo apresentar química de superfície apropriada e micro arquitetura que facilitem e permitam a fixação, proliferação e diferenciação celular. Além disso, é imprescindível que este arcabouço apresente resistência mecânica e manutenção de volume e não gere subprodutos indesejáveis (LIU, C.; ΧΙΑ, Z.; CZERNUSZKA, J. T. Design and Development of Three-Dimensional Scaffols for Tissue Enginee-ring. Chemical Engineering Research and Design. 2007; 85(7):1051-1064). Arcabouço de um biomaterial Um biomaterial de arcabouço é um material constituído a partir de fontes biológicas para oferecer suporte às células reparadoras, servindo também como material de enxerto. Deve ter excelente biocompatibilidade e biodegradabilida- de, fornecendo uma superfície semelhante a uma matriz extracelular capaz de induzir atividades celulares e orientar o reparo. Assim, o arcabouço deve possuir uma estrutura tridimensional. A arquitetura, o tamanho e a distribuição de poros na superfície de um arcabouço também podem influenciar o crescimento de células sobre este (LIU, C.; ΧΙΑ, Z.; CZERNUSZKA, J. T. Design and Deve-lopment of Three-Dimensional Scaffols for Tissue Engineering. Chemical Engin Res and Design. 2007;85(7):1051-1064. WEI, G.; MA, P. X. Partially nano-fíbrous architecture of 3D tissue engineering scaffolds.Biomaterials. 2009;30(32):6426-34. LU, H. F.; NARAYANAN, K.; LIM, S. X.; GAO, S.; LEONG, M. F.; WAN, A. C. A 3D microfíbrous scaffold for long-term human pluripotent stem cell self-renewal under chemically defíned conditions. Bioma-terials. 2012;33(8):2419-30). Vários fatores podem ser considerados em um arcabouço: 1) preferencialmente, este deve se degradar à medida que ocorre a neoformação tecidual; 2) deve ser biocompatível, assim como seus produtos de degradação; 3) uma vez implantado, deve possuir propriedades mecânicas necessárias para oferecer apoio estrutural até a formação do novo tecido; 4) faz-se necessário possuir características morfológicas como alta porosidade e interconexões viáveis para a difusão de nutrientes, acarretando um crescimento tecidual interno e, além disto, 4) deve propiciar a angiogênese (MA, T.; YANG, S. T.; KNISS, D. A. Development of an in vitro human placenta model by the cultivation of human trophoblasts in a fíber-based bioreactor system. Tissue Eng. 1999;5(2):91-102. ALMEIDA, U. DE; ZIELAK. J. C.; FILIETAZ, M.; GIOVANINI, A. F.; DELIBERADOR, T. M.; ULBRICH, L. M.; GONZAGA, C. C. BiomateriaPs analysis and use, made of crassostreagigas shells in rats’ periondontal defects. Odontol. Clín.-Cient. 2011 ;10(3):259-263). Assim, frequentemente, os arcabouços são desenhados para imitar a estrutura de uma matriz extracelular natural, sendo este um grande desafio para a atual engenharia de tecidos (SMITH, I. O.; LIU, X. H.; SMITH, L. A.; MA, P. X. Nanostructured poly-mer scaffolds for tissue engineering and regeneralive medicine. Wiley Interdiscip Rev NanomedNanobiotechnol. 2009;1 (2):226-36. ALMEIDA, U. DE; ZEELAK. J. C.; FILIETAZ, M.; GIO-V AN INI, A. F.; DELIBERADOR, T. M.; ULBRICH, L. M.; GONZAGA, C. C. BiomateriaFs analysis and use, made of crassostreagigas shells in rats’ perion-dontal defects. Odontol. Clín.-Cient. 2011; 10(3):259-263).

Al gin ato Também de origem marinha, um material conhecido como alginato, proveniente de algas marrons, vem sendo utilizado como biomaterial com aplicações diversas. (ALSBERG, E., ANDERSON, K.W., ALBEIRUTI, A., FRANCESCHI, R.T., MOONEY, D. J. Cell-ínteractive Alginate Hydrogels for Bone Tissue En-gineering.Biomaterials & Bioengineering. J Dent Res. 2001 ;80(11):2025-2029. WANG, L.; SHELTON, R.M.; COOPER, P.R;, LAWSON, M.; TRIFITT, J.T.; BARRALET, J.E. Evaluation of sodium alginate for bone marrow cell tissue engineering. Biomaterials. 2003; 24:3475—3481). O alginato é um material encontrado nas algas marrons do gênero Phae-ophyceae, tanto na parede quanto no interior celular, oferecendo flexibilidade a estas. Ao alginato podem ser incorporados sais e substâncias, como o propileno-glicol. Por ser um material não tóxico, é amplamente utilizado na indústria de alimentos, bebidas, papel e gráfica e farmacêutica, além de ser usado como biomaterial na engenharia de tecidos. Este polissacarídeo gelificante se apresenta como um co-polímero não ramificado de composição química 1,4 ligado ao ácido alfa-1 gulurônico e ácido-manurônico d-beta (LAKSHMI, S. N.; LAUREN-C1N, C. T. Biodegradable polymers as biomaterials. Prog Polym Sei. 2007;32(8-9):762-98). O alginato pode ser associado a íons de cálcio e sódio. Em engenharia de tecidos, costuma-se usar o alginato adicionado a íons de cálcio (ALSBERG, E., ANDERSON, K.W., ALBEIRUTI, A., FRANCESCHI, R.T., MOONEY, D. J. Cell-interactive Alginate Hydrogels for Bone Tissue Engineering. Biomaterials & Bioengineering. J Dent Res. 2001;80(11):2025-2029. WANG, L.; SHELTON, R.M.; COOPER, P.R;, LAWSON, M.; TRIFITT, J.T.; BARRALET, J.E. Evalu-ation of sodium alginate for bone marrow cell tissue engineering. Biomaterials. 2003;24:3475-3481. LAKSHMI, S. N.; LAURENCIN, C. T. Biodegradable polymers as biomaterials.ProgPolym Sei. 2007;32(8—9):762-98).

Wang et al. (WANG, L.; SHELTON, R. M; COOPER, P. R;, LAWSON, M.; TRIFITT, J. T.; BARRALET, J. E. Evaluation of sodium alginate for bone mar-row cell tissue engineering. Biomaterials. 2003;24:3475-3481) discutem algumas propriedades do alginato, como a baixa degradabilidade e a capacidade de manutenção de volume. A partir disso, conclui-se que ele pode ser usado como biomaterial auxiliador na reconstrução de grandes defeitos. No referido trabalho, os autores demonstram a proliferação de células da medula óssea de ratos em uma matriz de alginato de cálcio.

Nguyen et al. (NGUYEN, PI.; QIAN, J. J.; BHATNAGAR, R. S.; LI, S. Enhanced cell attachment and osteoblastic activity by P-15 peptide-coated ma-trix in hydrogels. Biochem Biophys Res Commun. 2003;7;311(1):179-86) sugeriram o uso de partículas minerais e colágeno tipo I em hidrogéis de alginato de sódio como matriz injetável na osteopromoção. Connelly et al. (CONNELLY, J. T.; GARCIA, A. J.; LEVENSTON, Μ. E. Inhibition of in vitro chondrogenesis in RGD-modiíied three-dimensional alginate gels. Biomaterials. 2007; 28(6):1071-83) demonstraram a diferenciação de células da medula óssea em condroblastos, dispostos em um arcabouço de alginato de sódio.

Assim, buscaramse na biotecnologia, métodos de desenvolvimento de biomateriais com potencial osteopromotor a partir do nácar do mexilhão Perna perna associado a compostos contendo alginato, com o objetivo de formar um arcabouço, levando-se em conta o baixo custo destas matérias-primas.

Estado da arte Atualmente, algumas soluções para a reconstrução tecidual são disponíveis, entre as quais, especialmente referente ao tecido ósseo, estão: uso de biomaterial alógeno (ex.: Banco de Tecido) (RENTSCH, C.; RENTSCH, B.; SCHAR- NWEBER, D.; ZWIPP, EL; RAMMELT, S. [Bone substitute : Transplants and replacement materiais - an update]. Unfallchirurg. 2012;115(10):938-49. BA-VETTA, G.; LICATA, Μ. E. The use of Human Allogenic Graft (HBA) for Maxillary Bone Regeneration: Review of Literature and Case Reports. Curr Pharm Des. 2012;18(34):5559-68), biomaterial sintético (ex.: hidroxiapatitasin-tética, materiaispoliméricosdiversos) (DUNG, S. Z.; TU, Y. K. Effect of differ-ent alloplast materiais on the stability of vertically augmented new tissue. Int J Oral Maxillofac Implants. 2012;27(6): 1375-81. KIM, S. W.; HAN, Η. H.; OH, D. Y.; MOON, S. H.; LEE, J. H.; RHIE, J. W.; AHN, S. T. Orbital roof recon-struction using porous polyethylene sheet with embedded titanium. J Craniofac Surg. 2012;23(6):e64-6.), e biomaterial xenogênico (ex.: ossobovino) (DEGIDI, M.; PIATTELLI, A.; PERROTTI, V.; IEZZI, G. Histologic and histomorpho-metric evaluation of an implant retrieved 8 years aíter insertion in a sinus augmented with anorganic bovine bone and anorganic bovine matrix associated with a cell-binding peptide: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 2012 Aug;32(4):451-7. KRUSE, A.; JUNG, R. E.; NICHOLLS, F.; ZWAHLEN, R. A.; ITÂMMERLE, C. II.; WEBER, F. E. Bone regeneration in the presence of a synthetic hydroxyapatite/silica oxide-based and a xenogenic hydroxyap-atite-based bone substitute material. Clin Oral Implants Res. 2011;22(5):506-11). Vários autores descrevem o uso de fontes marinhas no desenvolvimento de biomateriais com aplicações em engenharia tecidual (SILVE, C.; LOPEZ, E.; VEDAL, B.; SMITH, D. C.; CAMPRASSE, S.; CAMPRASSE, G.; COULY, G. Nácar initiates biomineralization by human osteoblasts maintained in vitro. Cal-cif Tissue Int. 1992;51(5):363-9. SUN C, LUCAS, J. M.; WAITE, J. H. Colla-gen-binding matrix proteins from elastomeric extraorganismicbyssal fi-bers.Biomacromolecules. 2002;3(6): 1240-8. GREEN, D.; HOWARD, D.; YANG, X.; KELLY M.; OREFFO, R. O. Natural marine sponge fiber skeleton: a biomimetic scaffold for human osteoprogenitor cell attachment, growth, and differentiation. Tissue Eng. 2003; 9(6):1159-66. SONG, E.; YEON KIM, S.; CHUN, T.; BYUN, H. J.; LEE, Y. M. Collagen scaffolds derived firam a marine source and their biocompatibility. Biomaterials. 2006; 27(15):2951-61). Existem ainda polímeros de origem marinha aplicados como biomateriais. Busca-se, nesses polímeros, características de biodegradação compatíveis com as reações de reparo do tecido a ser reconstituído (LAKSLGVTI, S.; LAURENCIN, C. Biode-gradable polymers as biomaterials.Prog Pol Sei. 2007;32(8-9):762-798).

Wang et al. (WANG, J.; L1U, C.; LU, X.; YIN, M. Co-polypeptides of 3,4-dihydroxyphenylalanine and L-lysine to mimic marine adhesive protein. Biomaterials. 2007;28(23):3456-68) estudam o desenvolvimento de adesivos com aplicação em tecido ósseo, produzidos a partir de fontes marinhas, com o intuito de melhorar as características de reparo nos tecidos, especialmente os mineraliza-dos.

Gross-Aviv et al. (GROSS-AVIV T.; DICARLO B. B.; FRENCH Μ. M.; ATHANASIOU K. A.; VAGO R.A study of crystalline biomaterials for articular cartilage bioengineering.Materials Science and Engineering: C. 2008; 28(8):1388-1400) descrevem o uso de matrizes marinhas usadas para crescimento de células-tronco mesenquimais para utilização em engenharia tecidual. Em uma revisão de literatura, Astachov et al. (ASTACHOV, L.; NEVO, Z.; AVIV, M.; VAGO, R. Crystalline calcium carbonate and hydrogels as microenviron-ment for stem cells. Front Biosci. 2011;1 (16):458-71) descrevem o uso de vários biomateriais de origem marinha associados à cultura de células-tronco.

Kinugawa et al. (K1NUGAWA M, FUKUZAWA S, TACHIBANA K. Skeletal protein protection: the mode of action of an anti-osteoporotic marine alkaloid, norzoanthamine. J Bone Miner Metab. 2009;27(3):303-14) relatam o uso de um alcalóide marinho, chamado de norzoanthamina, capaz de acelerar a deposição óssea, pela ligação de sítios com o colágeno, protegendo desta forma a matriz orgânica. Constitui-se, portanto, em um fármaco interessante para o tratamento de lesões ósseas.

Derivados da quitina, também presentes em muitos organismos marinhos, são utilizados para produção de géis, particulados, compósitos, biofilmes e outros biomateriais, com várias aplicações, incluindo em tecidos ósseos (MUZZA-RELLI, R. A. A. Chitins and chitosans for the repair of wounded skin, nerve, cartilage and bone. Review Carbohydrate Polymers. 2009;76:167-18).

Walsh et al. (WALSH, P. J.; WALKER, G. M.; MAGGS, C. A.; BUCHANAN, F. J. Thermal preparation of highly porous calcium phosphate bone filler derived from marine algae. J Mater Sei Mater Med. 2010;21(8):2281-6) descrevem o uso de algas marinhas no desenvolvimento de um substituto ósseo poroso à base de fosfato de cálcio. Born et al. (BORN, R.; HERMANN, E.; ΒΑΖΗΕΝΟ, V.; SHAPKFN P. N. Investigation of nanoorganized biomateriais of marine origin. Arabian Journal of Chemistry. 2010;3(1 ):27-32) relatam a utilização de esponjas e corais na susbtituição de tecidos ósseos e cartilaginosos. Cunningham et al. (CUNNINGHAM, E.; DUNNE, N.; WALKER, G.; MAGGS, C.; WILCOX, R.; BUCHANAN, F. Hydroxyapatite bone substitutes developed via replication of natural marine sponges. J Mater Sei Mater Med. 2010;21(8):2255-61) também demonstram o uso de esponjas marinhas para produção de biomaterial para substituição estrutural óssea.

Em 2011, Clarke et al. (CLARKE, S. A.; WALSH, P.; MAGGS, C. A.; BUCHANAN, F. Designs from the deep: marine organisms for bone tissue en-gineering. Biotechnol Adv. 2011; 29(6):610-7) citaram organismos marinhos, como corais, algas, poríferos, moluscos, equinodermos e artrópodes como seres mineralizadores, constituídos principalmente de carbonato de cálcio sob a forma de aragonita, fosfato de cálcio, magnésio e quitina, que, segundo os autores, são considerados fontes potenciais para a produção de biomateriais na engenharia óssea. A combinação de sílica e colágeno foi identificada em compostos marinhos, sendo recentemente reconhecida como um sistema de interesse à preparação de biomateriais com aplicações ósseas (HEINEMANN, S.; HEINEMANN, C.; JÀGER, M.; NEUNZEHN, J.; WIESMANN, Η. P.; HANKE T. Effect of silica and hydroxyapatite mineralization on the mechanical properties and the bio-compatibility of nanocomposite collagen scaffolds. ACS Appl Mater Interfaces. 2011:3(11):4323-31). Pallela et al. (PALLELA, R.; VENKATESAN, J.; JANA-PALA, V. R.; KIM, S. K. Biophysicochemical evaluation of chitosan-hydroxyapatite-marine sponge collagen composite for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A.-2012;100A(2):486-95) associam colágeno, quitosana e hidroxiapatita provenientes de esponja marinha (Ircinia fusca) e do atum (Thunnus obesus) na produção de matriz com potencial osteopromotor. Venkatesan et al. (VENKATESAN, J.; KIM, S. K. Stimulation of minerais by carbon nanotube grafted glucosamine in mouse mesenchymal stem cells for bone tissue engineering. J Biomed Nanotechnol. 2012;8(4):676-85.) descrevem o desenvolvimento de um biomaterial a partir de quitosana associada a nanotu-bos de carbono, obtendo resultados interessantes à aplicação óssea. Já em 1992, o nácar da ostra marinha Pinctada maxima foi testado na presença de osteoblastos humanos, indicando boa proliferação celular e produção de osso (SILVE, C.; LOPEZ, E.; VIDAL, B.; SMITH, D. C.; CAMPRASSE, S.; CAM-PRASSE, G.; COULY, G. Nacre initiates biomineralization by human os-teoblasts maintained in vitro. Calcif Tissue Int. 1992;51(5):363-9).

Kim et al. (KIM, Y. W.; KIM, J. J.; KIM, Y. H.; RHO, J. Y. Effects of organic matrix proteins on the interfacial structure at the bone-biocompatible nacre interface in vitro. Biomaterials. 2002;23(9):2089-96) estudam as relações entre osso e extrato proteico obtido a partir do nácar, in vitro, enfatizando a mediação do extrato na ligação do nácar com uma superfície óssea. Concluem que tanto o extrato como o nácar possuem biocompatibilidade, o que pode auxiliar durante a neoformação do tecido. No entanto, os autores não demonstram um arcabouço carreador do extrato ou do nácar no intuito de facilitar a aplicação clínica.

Tang et al. (TANG, Z.; KOTOV, N. A.; MAGONOV, S.; OZTURK, B. Nanostructured artificial nacre. Nat Mater. 2003;2(6):413-8) descrevem o de- senvolvimento de um osso artificial em camadas, no qual apresentam uma estrutura intercalando nácar nanoestruturado, argila e polieletrólitos. Em testes mecânicos, o biomaterial apresentou características semelhantes ao osso. Neste caso, pensando-se na viabilidade econômica regional, a fabricação de um nácar artificial pode representar um gasto desnecessário, caso um arcabouço conhecido e de matéria-prima abundante seja utilizado.

Bahar et al. (BAHAR, H.; YAFFE, A.; BINDERMAN, I. The influence of nacre surface and its modifícation on bone apposition: a bone development model in rats. J Periodontol. 2003;74(3):366-71) testam biomateriais ósseos desenvolvidos a partir de nácar natural particulado tratado ou não com ácido clorídrico, tampão fosfato e hidróxido de cálcio, separadamente. Demonstram em estudo in vivo ectópico em ratos, propriedades favoráveis à osteopromoção do nácar tratado ou com tampão fosfato ou com hidróxido de cálcio - resultados que corroboram a presente invenção no sentido de auxiliar na obtenção de substratos que possuam composição potencial para a confecção de arcabouço. Além disto, estes autores não consideram as características físicas que podem facilitar a aplicação clínica do biomaterial testado.Penel et al. (PENEL, G.; POTTIER, E. C.; LEROY, G. R. Investigation of calcium carbonate bone substitutes and related biomateriais. Bull Group Int Rech Sei Stomatol Odontol. 2003;45(2-3):56-9) comparam diferentes biomateriais de carbonato de cálcio, analisando nácar e corais por espectroscopia, concluindo que o nácar compreende uma mistura de calcita e argonita, e o coral, argonita apenas. De análises químicas como esta pode-se confirmar componentes favoráveis àutilização do nácar no desenvolvimento de biomateriais de enxerto ósseo, como os da presente invenção.

Liu et al. (LIU, J. B.; LI AN, W.; CHEN, J. T.; JIN, D. D.; QUAN, Y.; PAN, X. M. Diaphyseal defect repair with nacre/polylactic acid composite artificial bone in rabbits. Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. 2004;24(9): 1029-32, 1036) associam o nácar e um polímero do ácido polilático, aplicando a mistura em defeitos ósseos cirúrgicos em rádio de coelhos. Descrevem considerável biocompatibilida- de, biodegradabilidade e atividade osteoeondutora deste biomaterial. Aqui, o polímero utilizado como arcabouço pode representar um custo mais elevado, além de reações de degradação sem elucidação totalmente conhecida.

Berland et al. (BERLAND, S.; DELATTRE, O.; BORZEDC, S.; CATONNÉ, Y.; LOPEZ, E. Nacre/bone interface changes in durable nacre endosseous implants in sheep. Biomaterials. 2005;26(15):2767-73) aplicam o nácar puro em ossos de ovelhas in vivo, relatando que a biodegrabilidade pode ser maior ou menor, conforme o local do implante e a interação do nácar com o tecido ósseo. A ovelha representa um modelo interessante de teste, uma vez que se encontra em uma escala dimensional mais semelhante à do ser humano. O maior problema do estudo em questão é a estabilidade do nácar puro no local enxertado, daí a necessidade da associação a um arcabouço.

Em 2007, Lee e Choi (LEE, S. W.; CHOI, C. S.The correlation between organic matrices and biominerals (myostracal prism and folia) of the adult oyster shell, Crassostreagigas.Micron. 2007;38:58-64) avaliaram a correlação entre as matrizes orgânicas e biominerais da concha de ostra Crassostrea gigas, relatando a presença de proteínas solúveis e aminoácidos.

Ainda neste ano, Kenneth et al. (KENNETH S. VECCHIO, XING ZHANG, JENNEFER B. MASSIE, MARK WANG, CHOLL W. KIM Conversion of bulk seashells to biocompatible hydroxyapatite for bone implants.Acta Biomateria-lia.2007;3(6):910-918) convertem o nácar das conchas de Strombus gigass e Tridacna gigas em hidroxiapatita, com obtenção de propriedades mecânicas semelhantes às de osso compacto, indicando que estes nácares podem ser utilizados na confecção de biomateriais necessários ao suporte de carga. Em estudo in vivo, demonstram estabilidade dos enxertos, neoformação óssea ao redor dos mesmos, biocompatibilidade e bioatividade favoráveis à osteopromoção. Yang et al. (YANG, Y.; YAO, Q.; PU, X.; HOU, Z.; ZHANG, Q. Biphasic calcium phosphate macroporous scaffolds derived from oyster shells for bone tissue en-gineering. Chem Engin J. 2011 ;173(3):837-845) demonstram um arcabouço ma- croporoso desenvolvido a partir do nácar da ostra Crassostrea angulata. Convertem o nácar em nanocristais de hidroxiapatita e preparam arcabouços de estrutura bifásica com o fosfato tricálcico beta, semeando células pré-osteoblastos nestes, e observam resultados promissores para engenharia de tecidos ósseos. Diferentemente destes trabalhos, na presente invenção não há gastos energéticos com a conversão do nácar em hidroxiapatita — uma vez que o estado cristalino da hidroxiapatita obtida pode representar uma barreira na substituição completa e total do biomaterial de enxerto por osso.

Furuhashi et al. (FURUHASHI, T.; SCHWARZINGER, C., MIKSIK I, SMRZ M., BERAN A. Molluscan shell evolution with review of shell calcification hy-pothesis. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 2009;154(3):351-371) e Joubert et al. (JOUBERT, C.; PIQUEMAL, D.; MARIE, B.; MANCHON, L.; PEERRAT, F.; ZANELLA-CLÉON, 1.; COCHENNEC-LAUREAU, N.; GUEGUEN, Y.; MONTAGNANI, C. Transcriptome and proteome analysis of Pinctadamargaritifera calcifying mantle and shell: focus on biomineralization. BMC Genomics. 2010;1(11):613) estudam geneticamente a matriz orgânica da concha do molusco Pinctada mar-garitifera, demonstrando que esta matriz é semelhante às conchas de outras espécies, composta principalmente de quitina, fibroína e macromoíéculas ácidas — composição importante nos processos de biomineralização.

Lee et al. (LEE, S-W.; JANG, Y-N.; RYU, K-W.; CPIAE, S-C.; LEE, Y-H., JEON, C-W. Mechanical characteristics and morphological effect of complex crossed structure in bíomaterials: Fracture mechanics and microstructure of chalky layer in oyster shell. Micron. 2011;42(1 ):60-70) analisam o complexo estrutural da Ostra do Pacífico (Crassostrea gigas), descrevendo características estruturais e químicas de compostos sofisticados de densidade relativamente alta e de baixa dureza.

Almeida et al. (ALMEIDA, U. DE; ZIELAK. J. C.; FILIETAZ, M.; GIO-VANINI, A. F.; DELIBERADOR, T. M.; ULBRICH, L. M.; GONZAGA, C. C.

Biomaterial’s analysis and use, made of Crassostreagigas shells in rats’ periondontal defects. Odontol. Clín.-Cient. 2011;10(3):259-263) também utilizam o nácar de Crassostrea gigas como biomaterial para enxertia óssea em defeitos mandibulares em ratos, obtendo resultados clínicos aceitáveis quanto à manipulação e facilidade de incorporação do material a um defeito cirúrgico. Relatam que as partículas do nácar propiciam a neoformação óssea e a proliferação de células em microporosidades das mesmas. Este teste inicial representa um forte indício da aplicação do nácar em defeitos ósseos, no entanto, e novamente, aqui não é descrito um arcabouço, uma vez que em humanos os defeitos são muito maiores, o que representa um desafio à reconstrução tecidual.

Yang et al. (YANG, Y.; YAO, Q.; PU, X.; HOU, Z.; ZHANG, Q. Biphasic calcium phosphate macroporous scaffolds derived from oyster shells for bone tissue engineering. Chemical Engin J. 2011;173(3):837-845) sinalizam que o nácar de ostra Crassostrea angulata também pode ser usado na confecção de biomateriais em engenharia tecidual. Apesar da falta de apresentação de arcabouço, estes resultados corroboram com a presente invenção. Vale lembrar que a presente invenção descreve o uso de um nácar proveniente de espécie cultivada em grande escala comercial local {Pernaperna).

Em 2002, Liao et al. (LIAO, H.; MUTVEI, H.; HAMMARSTRÕM, L.; WURTZ, T.; LI, J. Tissue responses to nacreous implants in rat femur: an in situ hybridization and histochemical study. Biomateriais. 2002;23( 13):2693-701) avaliam a interface osso-biomaterial produzido a partir do nácar do mexilhão Margaritifera, em estudo in vivo em fêmur de ratos. Os autores focalizam seus resultados na formação óssea a partir das bordas do biomaterial, com absorção gradativa do mesmo e reconstituição medular. Mais uma vez, este tipo de trabalho corrobora com o uso do nácar, independentemente da espécie de origem. No entanto, e mais uma vez, em aplicações industriais é preciso avaliar a cadeia produtiva da matéria-prima, por isto, a espécie utilizada na presente invenção é outra, bem como a aplicação clínica em defeitos de humanos - o que normal- mente exige uma manutenção de volume, característica que um arcabouço pode fornecer.

Benthien et al. (BENTHIEN, J. P; RUSSLIES, M.; BEE1RENS, P. Investigating the effects of bone cement, cyanoacrylate glue and marine mussei adhesive pro-tein írom Mytilusedulis on human osteoblasts and fibroblasts in vitro. Ann Ana-tomy. 2004;186:561-566) comparam os efeitos de um cimento ósseo, uma cola de cianoacrilato e um adesivo produzido a partir de extrato proteico obtido do mexilhão Mytilus edulis (mesma ordem do mexilhão Perna perna) sobre os-teoblastos humanos e fíbroblastos in vitro, obtendo resultados favoráveis do extrato em relação ao crescimento celular. Mais uma vez, a viabilidade econômica das possíveis aplicações clínicas deste trabalho não foi o enfoque dos autores. O uso de um material de descarte pode se tornar muito mais vantajoso, como é o caso da presente invenção.

Para Khang et al. (KHANG, G.; KIM, S. Μ.; K1M, M. S.; LEE, Η. B. Hybrid, Composite, and Complex Biomaterials for Scaffolds.In Principies of Regenera-tive Medicine, Elsevier, SanDiego, 2006:636-655.) a reconstrução de um novo tecido depende primordialmente de: células, arcabouço para manutenção destas e fatores de crescimento, responsáveis por inibir ou potencializar a proliferação de tipos celulares específicos.

Em 2002, Jianqi et al. (JIANQI, H.; HONG, H.; LIEPING, S.; GENGHUA, G. Polymer/alginate amalgam for cartilage-tissue engineering.Ann N Y Acad Sei. 2002;961:134-8) comparam o uso de uma membrana de alginato de cálcio com uma membrana de colágeno na técnica chamada de regeneração óssea guiada. O estudo foi realizado na mandíbula de coelhos e a membrana de alginato foi capaz de induzir à formação de um tecido ósseo denso. Neste trabalho não há associação entre o nácar e um arcabouço de alginato.

Nguyen et al. (NGUYEN, H.; QIAN, J. J.; BHATNAGAR, R. S.; LI, S. Enhanced cell attachment and osteoblastic activity by P-15 peptide-coated ma-trix in hydrogels. Biochem Biophys Res Commun. 2003;311(1):179-86) suge- rem o uso de partículas minerais e colágeno tipo I em hidrogéis de alginato de sódio como matriz injetável na osteopromoção.

Em 2004, Lawson et al. (LAWSON, Μ. A.; BARRALET, J. E.; WANG, L.; SEKLTON, R. M.; TREFFITT, J. T. Adhesion and growth of bone marrow stromal cells on modifíed alginate hydrogels. Tissue Eng. 2004;10(9-10):1480-91) relatam o uso de hidrogel de alginato associado ao fosfato tricálcico beta no crescimento e diferenciação de células ósseas in vitro.

Gaissmaier et al. (GAISSMAIER C.; FRITZ, J.; KRACKHARDT, T.; FLESCH, I.; AICHER, W. K.; ASHAMMAKHI, N. Effect of human platelet supematant on proliferation and matrix synthesis of human articular chondrocytes in mono-layer and three-dimensional alginate cultures. Biomaterials. 2005;26(14):1953-60) descrevem a deposição de colágeno tipo I e II, e proteoglicanas em condró-citos colocados em gel de alginato.

Connelly et al. (CONNELLY, J. T.; GARCIA, A. J.; LEVENSTON, Μ. E. Inhibition of in vitro chondrogenesis in RGD-modified three-dimensional aígi-nate gels. Biomaterials. 2007;28(6):1071-83) demonstram a diferenciação de células da medula óssea em condroblastos, dispostos em um arcabouço de alginato de sódio.

Abbah et al. (ABBAH, S. A.; LU, W. W.; CHAN, D.; CHEUNG, K. M.; LIU, W. G.; ZHAO, F.; LI, Z. Y.; LEONG, J. C.; LUK, K. D. Osteogenic behavior of alginate encapsulated bone marrow stromal cells: an in vitro studv. J Mater Sei Mater Med. 2008;19(5):2113-9) demonstram o uso de alginato de cálcio durante processos de proliferação e diferenciação de células da medula óssea, em cultura, em osteoblastos.

Bemhardt et al. (BERNHARDT, A.; DESPANG, F.; LODE, A.; DEMMLER, A.; HANKE, T.; GELINSKY, M. Proliferation and osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells on alginate-gelatine-hydroxyapatite scaftolds with anisotropic pore structure.J Tissue Eng Regen Med. 2009;3(1 ):54-62) relatam com sucesso o uso de um arcabouço de alginato-gel-hidroxiapatita, também em cultura de células de medula óssea.

Zeng e Chen (ZENG, Q.; CHEN, W. The functional behavior of a macro-phage/fibroblast co-culture model derived írom normal and diabetic mice with a marine gelatin-oxidízed alginate hydrogel Original Research Article Biomateri-als. 2010;31(22):5772-5781) descrevem o uso de um hidrogel à base de alginato associado à gelatina marinha em cultura celular de macrófagos e fibroblastos, com intuito de desenvolver uma aplicação clínica de curativo externo de feridas. Encontram que, na presença do hidrogel, há um aumento na proliferação e migração de fibroblastos.

Nwe et al. (NWE, N.; FURUIKE, T.; TAMURA, H. Selection of a biopolymer based on attachment, morphology and proliferation of fibroblast ΝΓΗ/3Τ3 cells for the development of a biodegradable tissue regeneration template: Alginate, bacterial cellulose and gelatin. Process Biochemistry. 2010;45(4):457-466) demonstram o uso do alginato combinado ao cálcio, mais celulose e gelatina no desenvolvimento de um biomaterial para regeneração de pele.

Em 2010, Suárez González et al. (SUÁREZ-GONZÁLEZ, D.; BARNHART, K.; SA1TO, E; VANDERBY, R. JR.; HOLLISTER, S.J; MURPHY, W.L. Con-trolled nucleation of hydroxyapatite on alginate scaffolds for stem cell-based bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2010;95( 1):222-34) mostram a proliferação de células-tronco em arcabouços de alginato e hidroxiapatita, oriunda da nucleação de minerais ósseos presentes em fluidos corporais. Afirmam que este pode ser um novo biomaterial de arcabouço para células e moléculas bioativas.

Wu et al. (WU, C.; FAN, W.; GELINSKY, Μ.; X1AO, Y.; CHANG, J.; FRIIS, T.; CUNIBERTI, G. In situ preparation and protein delivery of silicate-alginate composite microspheres with core-shell structure.J R Soc Interfa-ce.2011 ;8(65):1804-14) relatam o uso de nácar, silicato de cálcio e alginato no desenvolvimento de esferas bioativas, adicionadas também de material proteico, no intuito de promover a reconstituição óssea. Resultados promissores são apre- sentados. Porém, as esferas bioativas possuem uma limitação quando se necessita reconstruir volumes maiores de osso.

Erol et al. (EROL, Μ. M.; MOURINO, V.; NEWBY, P.; CHATZISTAVROU, X.; ROETHER, J. A.; HUPA, L.; BOCCACCINI, A. R. Copper-releasing, bo-ron-containing bioactive glass-based scaffolds coated with alginate for bone tis-sue engineering.Acta Biomater.2012;8(2):792-801) estudam a síntese de um novo arcabouço contendo vidro bioativo com boro e revestido de alginato e íons de cobre. Relatam boa estabilidade mecânica do arcabouço, tomando-o mais favorável ao reparo ósseo.

Valenzueía et al. (VALENZUELA, F.; COVARRUBIAS, C.; MARTÍNEZ, C.; SMITH, P.; DÍAZ-DOSQUE, Μ.; YAZDANI-PEDRAM, M. Preparation and bioactive properties of novel bone-repair bionanocomposites based on hydroxyapatite and bioactive glass nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2012; 100(6): 1672-82) também incorporam alginato a nanopartículas de vidro bioativo e hidroxiapatita. Em cultura com células ósseas (osteoblastos), o arcabouço desenvolvido permitiu a adesão das células sugerindo uma aplicação no reparo in vivo, principalmente no sentido de acelerar a biomineralização óssea.

As patentes relacionadas a seguir são soluções semelhantes para os mesmos problemas que a presente invenção pretende resolver, a saber, o uso de extratos de mexilhões com fins medicinais e/ou odontológicos e a produção de enxertos ósseos e/ou dentários. A patente US20060039992 trata da produção de compostos a partir de mexilhões marinhos e de ácidos graxos com fins anti-inflamatórios, diferentemente da atuai, que visa a produção de biomaterial de enxertia óssea. Semelhantemente, a patente WO2001001976 relata o uso de compostos de mexilhões combinados com sais e outros compostos para o tratamento de desordens con-juntivas (tecido mole). A patente W02010085158 se refere a um composto produzido à base de mexilhões e anti-inflamatórios não-esteroidais para tratamento veterinário também de desordens conjuntivas. A CN102204932 relata o uso de nácar em pó do mexilhão para o uso oral na prevenção de osteoporose. A US20100143271 trata da obtenção de fosfato de cálcio amorfo a partir de ostras, com intuito da aplicação em dentifrícios e bochechos bucais com função anticariogênica, além da aplicação em gomas de mascar, bebidas e comidas com cálcio para diminuição da acidez bucal. A W02007113451 trata da extração de moléculas da madrepérola de moluscos para a produção de suplementos de cálcio e aplicação em cosméticos. A W02005115414 relata a extração de fosfato de cálcio amorfo a partir de lagostins, com finalidade de suplemento alimentar. A patente W02009029734 trata da produção de cimento resinoso quimicamente polimerizável, injetável, com diferentes graus de absorção, com aplicações na ortopedia e odontologia. Neste caso, um cimento não serviria para manter volume em uma reconstrução óssea bucal — por ser absorvido, talvez pudesse ser utilizado apenas para aglutinação de biomaterial particulado. A patente BR9905363 relata a produção de cerâmica com finalidade de restauração dentária. Assim como a patente BRPI0501331, que trata de materiais à base de aglomerados de vidro para restauração dentária. Na maiorira dos casos, as cerâmicas ou os vidros não são absorvidos pelo organismo, diferentemente da presente invenção, que apresenta biomateriais para substituição por osso. A patente BRPI0605628 trata de um biomaterial de enxerto ósseo composto de alumina, hidroxiapatita e biovidro. A patente BRPI0605760 descreve a produção de um substituto ósseo à base de osso bovino para enxertia óssea. A patente BRPI0701285 descreve um cimento bioativo produzido à base de hidroxiapatita. A patente BRPI0702965 descreve o recobrimento de parte (cicatriza-dor) de um sistema de implante dental por composto antimicrobiano (a partir de ácido graxo clorexidínico) associado a agente antiinflamatório, a fim de evitar a interferência de bactérias e da reação inflamatória indesejável durante o processo de osteointegração. A patente W02004074199 relata a produção de biossili- cato bioativo ou absorvível, para uso do tratamento de hipersensibilidade denti-nária, fissuras dentárias ou xerostomia. A patente US20070225328 demonstra a produção de biominerais sintéticos, mimetizando morfologicamente o nácar natural - mas não moléculas bioativas como as semelhantes às BMP ósseas — diferentemente da presente invenção, que utiliza compostos naturais, trabalhados de forma a produzirem biomateriais ab-sorvíveis. A patente US20110004218 utiliza extrato de ostras para produção de um biomaterial particulado para enxerto ósseo e/ou dentário; a patente W02005077388 utiliza extrato de moluscos para produção de um fármaco com objetivo de corrigir fraturas ósseas e/ou dentárias; a patente FR2827478 utiliza o extrato de um molusco (Cassostrea gigas) associado a compostos para produção de um particulado a ser utilizado na correção de defeitos ósseos e/ou dentários,diferentemente da presente invenção, que demonstra a produção de um arcabouço com finalidade de uso no preenchimento de grandes perdas ósseas. Definições Biomateriais, segundo a ANVISA são lentes, próteses, enxertos, stents, catéteres, tubos de circulação extra-corpórea e arcabouços (.scaffols) empregados na engenharia de tecidos, entre outros (Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Biomateriais. Centro de gestão e estudos estratégicos: ciência, tecnologia e inovação. Responsável técnica: Glória de Almeida Soares. Rio de Janeiro, 2005. Disponível em: http://www.anbio.org.br/pdf72/trl0 biomateriais.pdf. Acessado em 02 de Abril de 2012). Também são materiais destinados a interagir com um sistema biológico, a fim de avaliar, tratar, aumentar ou substituir qualquer órgão, tecido ou função, apresentando como característica importante biocompatibili-dade, ou seja, a reatividade do tecido vivo na presença deste material, desde que esta não comprometa o tecido do hospedeiro (MERCERON, C.; VINATIER, C.; CLOUET, J.; COLLIEC-JOUAULT, S.; WEISS, P.; GUICHEUX, J. Adipose-derived mesenchymal stem cells and biomateriais for cartilage tissue enginee-ring. Joint Bone Spine. 2008;75(6):672-4. WATAHA, J. C. Predicting clinicai biological responses to dental materiais,Dent Mater.2012;28(l):23-40). Arcabouço ou scaffold é um substrato sintético ou natural, matriz tridimensional ou material de suporte poroso que forma uma estrutura, ambiente ou microambi-ente de suporte para armazenamento de substâncias químicas, farmacológicas ou protéicas que podem ser liberadas progressivamente para o organismo ou servirem como bioindutoras. Deve ser biodegradável, biocompatível e bioabsorvível, além de manter a estrutura quando utilizado em enxertia óssea (LIU, C.; XIA, Z.; CZERNUSZKA, J. T. Design and Development ofThree-Dimensional Scaf-folds for Tissue Engineering. ChemEngin Res Design. 2007;85(7):1051-1064. WEI, G.; MA, P. X. Partially nanofibrous architecture of 3D tissue engineering scaffolds.Biomaterials. 2009;30(32):6426-34. LU, H. F.; NARAYANAN, K.; LIM, S. X.; GAO, S.; LEONG, M. F.; WAN, A. C. A 3D microfibrous scaffold for long-term human pluripotent stem cell self-renewal under chemically de-fined conditions. Biomaterials. 2012;33(8):2419-30).

Xenogênico ou xenógeno é um biomaterial que tem sua origem em um organismo de espécie diferente daquele em que se aplica o biomaterial (Merri-em-Webster. Disponível em: http://www.merriam- webster.com/medical/xenogeneic. Acessado em 30 de Novembro de 2012). BMP ou bone morphogenetic proteins ou proteínas morfogenéticas ósseas são moléculas encontradas no tecido ósseo com função sinalizadora, sendo envolvidas nos processos de formação do tecido (MIYASFIITA, T.; HANASHITA, T.; TORÍYAMA, M.; TAKAGI, R.; AKASHIKA, T.; HIGASHIKUBO, N. Gene cloning and biochemical characterization of the BMP-2 of Pinctada fucata. Biosci Biotechnol Bio-chem. 2008;72(1 ):37-47). Estas proteínas pertencem à superfamília do fator de crescimento transformador β (ou TGF-β). Esta super-família TGF-β inclui proteínas envolvidas em processos reguladores do desenvolvimento do organismo, além da proliferação, crescimento e diferenciação celulares. Também são expressas pela maioria das células do corpo, e alterações de expressão estão relacionadas não somente com processos biológicos normais como organogênesis, embriogênesis, consolidação de fraturas e cicatrização de feridas, mas também com estados patológicos como câncer, aterosclerose, doenças fibróticas e doenças de desenvolvimento. (CHENARD, K. E.; TEVEN, C. M.; HE, T. C.; REID, R. R. Bone morphogenetic proteins in craniofacial sur-gery: current techniques, clinicai experiences, and the future of personalized stem cell therapy. J Biomed Biotechnol. 2012:601549).

Alogênico ou alógeno é um biomaterial que tem a sua origem em um organismo da mesma espécie daquele em que se aplica o biomaterial (RENTSCH, C.; RENTSCII, B.; SCHARNWEBER, D.; ZWIPP, H.; RAMMELT, S. [Bone substitute: Transplants and replacement materiais - an update]. Unfallchirurg. 2012;115(10):938-49. BAVETTA, G.; LICATA, ME. The use of Human Allo-genic Graft (HBA) for Maxillary Bone Regeneration: Review of Literature and Case Reports. Curr Pharm Des. 2012; 18(34):5559-68.) Biomaterial sintético ou aloplástico é um biomaterial sintetizado a partir de compostos obtidos em laboratório. Diferem quanto à composição, formato, textura e tamanho; incluem metais e suas ligas, carbonato de cálcio, sulfato de cálcio, cerâmicas de fosfato de cálcio (ex.: trifosfato de cálcio e hidroxiapatita), polímeros de reposição de tecidos duros e biovidro. Tais materiais podem ser classificados quanto à porosidade (denso, micro ou macroporoso), cristalinidade (cristalino ou amorfo) e solubilidade (absorvível ou não (Salgado, P. C.; Sathler, P. C.; Castro, H. C.; Alves, G. G.; Oliveira, A. M.; Oliveira R. C.; Maia, M. D. C.; Rodrigues, C. R.; Coelho, P. G.; Fuly, A.; Cabral, L. M.; Granjeiro, J. M. Bone Remodeling, Biomaterials and Technological Applications: Revisiting Basic Concepts. J Biomat and Nanobiotechnology. 2011:2:318-328) Relação das figuras A Figura ilustra o fluxograma geral da confecção dos biomateriais da presente invenção, onde: 1 = Concha do mexilhão; 2 = Higienização; 3 = Produção de particulados; 4 = Extração do conteúdo orgânico (EOP); 5 = Confecção de arcabouços. A Figura 2 ilustra o fluxograma da obtenção dos particulados, onde: 1 = Concha do mexilhão; 2 = S, particulado integral da concha; 3 = L, particulado sem a crosta externa da concha; 3.1 = LP60, particulado L peneirado em 60 meshes; 4 = Cl, particulado da camada mais interna da concha; 5 = C2, particulado da camada intermediária da concha; 6 = C3, particulado da camada mais externa da concha. A Figura 3 ilustra o fluxograma da obtenção do extrato orgânico proteico (EOP), a partir dos particulados, onde: 1 = Cl, particulado da camada mais interna da concha; 2 = C2, particulado da camada intermediária da concha; 3 = C3, particulado da camada mais externa da concha; 4 = L, particulado sem a crosta externa da concha; 5 = LP60, particulado L peneirado em 60 mesh; 6 = Ácido acético 1M em pPI 5,0, 6,0 e 7,0; e EDTA 0,1M a 5%; 7 = Tempos de extração de 1, 24, 48 e 72 horas. A Figura 4 ilustra o fluxograma inicial da obtenção do extrato orgânico proteico (EOP) a partir dos particulados, onde: 1 = S, particulado integral da concha; 2 = L, particulado sem a crosta externa da concha; 2.1 = LP60, particulado L peneirado em 60 mesh; 2.2 = LP150, particulado L peneirado em 150 mesh; 2.3 = LP32, particulado L peneirado em 32 mesh; 2.4 = LP16, particulado L peneirado em 16 mesh; 2.5 = Ld, particulado L diverso (moagem sem passagem por peneira); 3 = Ácido acético 1M em pH 6,0; 4 = Tempo de extração de 30 dias. A Figura 5 ilustra o fluxograma da obtenção do extrato orgânico proteico (EOP) a partir da amostra LP60 (1), onde: 2 = Ácido acético 1M em pH 6,0; 3 = Tempos de extração de 24, 48, 72, 96 e 120 horas.

Descrição da inovação Ante as lacunas apresentadas na arte, propõe-se, como inovação, um processo para a produção de materiais para reposição e/ou reconstrução de tecidos ósseos a partir do extrato proteico de mexilhões, incluindo os da espécie Perna perna, assim como os biomateriais e/ou arcabouços produzidos desta forma. As aplicações com finalidades médicas e/ou odontológicas também estão previstas nesta invenção.

Ante as lacunas apresentadas na arte, propõe-se, como inovação, as aplicações, com finalidades médicas ou odontológicasde biomateriais arcabouços contendo BMP marinhas para a reconstrução do tecido ósseo, especialmente em defeitos críticos,utilizando o extrato proteico de mexilhões (Perna perna), bem como seu nácar particulado e alginato. Tais biomateriais podem ser moldados aos defeitos durante as suas aplicações, preenchendo totalmente os defeitos ósseos, e mantidos em posição apenas por reposicionamento dos tecidos moles circundantes sobre eles. Eventualmente, e se necessário, dependendo do tipo de defeito, estes biomateriais podem ser imobilizados com auxílio de pequenas quantidades de cola cirúrgica. Diferentemente dos produtos que carreiam as BMP em arcabouços de colágeno bovino, já disponíveis comercialmente, que normalmente, e principalmente nas aplicações odontológicas, necessitam de telas de titânio para manutenção do posicionamento e do volume local, o que pode encarecer consideravelmente o procedimento de enxertia, além da imposição de um procedimento cirúrgico a mais, com grande área de exposição, e, portanto, com risco aumentado a infecções, para remoção da tela antes da instalação de implantes dentários, quando este for o objetivo final.Logo, as demandas intrabucais por qualidade óssea comumente podem atingir maiores patamares do que no restante do corpo, uma vez que áreas pequenas ou circunscritas precisam de altas resistências devido à biomecânica que os implantes dentários são naturalmente submetidos.

Assim, além das aplicações supracitadas, a invenção descrita a seguir compreende um processo de produção de biomateriais de enxerto ósseo, compreendendo as seguintes etapas: - Higienização da matéria-prima; — Obtenção dos materiais particulados; — Extração do conteúdo orgânico; - Confecção dos arcabouços.

Higienização A primeira etapa do processo consiste na higienização da matéria-prima utilizada, que inclui conchas (fonte de nácar) do mexilhão Perna perna. Deve-se realizar a remoção do molusco a uma temperatura entre 15°C e 25°C. As conchas são então lavadas, normalmente com detergente neutro, e suas impurezas sólidas removidas fisicamente, por escovação ou processo semelhante. Após, efetua-se o enxágue com solvente, incluindo água.

Obtenção dos materiais particulados O nácar, já higienizado, é separado em 3 partes diferentes, por meio de um desgaste, normalmente utilizando instrumento rotatório (brocas esféricas acopladas em motor, por exemplo), incluindo uma centrífuga a uma rotação mínima de lO.OOOrpm e máxima de 40.000rpm, produzindo os seguintes particulados: Cl = camada mais interna; C2 = camada intermediária; C3 = camada mais externa. Este processo deve gerar partículas menores que lpm, em agregados. O nácar inteiro, com a crosta externa, é particuiado por moagem, podendo ser utilizado um moedor tipo pilão de aço e produz o particuiado integral (S) — partículas de tamanhos variáveis com espículas. O nácar inteiro, sem a crosta externa (L), da mesma forma que o S, produz partículas menores que 0,2 mm — o L é peneirado em diferentes peneiras produzindo diferentes granulações (LP). Por análise em raio X de Fluorescência por Energia Dispersiva (EDXRF), os particulados demonstram compostos sob a forma de óxidos, ricos em cálcio (96%), bem como quantidades menores de outros componentes químicos básicos do osso humano e da constituição celular geral básica de outros tecidos (fósforo, manganês e ferro; enxofre e zinco; todos presentes em ppm). Por termogravime-tria, em linhas gerais, os particulados apresentam estabilidade de massa até 600°C. Os componentes Cl e C2 apresentam perda de massa mais gradativa com o aumento da temperatura, sendo a perda de até 10% a 400°C. Por calorimetria exploratória diferencial (DSC) os particulados podem apresentar mudança de estado ou cristalinidade a partir de 170°C. Quando submetidos àesterilização (121°C por 30 minutos), não apresentam mudanças perceptíveis dos particula-dos. Os particulados podem ser usados isoladamente ou combinados a outros biomateriais sob a forma cápsulas duras ou moles, granulados, tabletes, pílulas, soluções orais, suspensões, líquidos, injetáveis, géis, colóides, cremes, adesivos, compactados e comprimidos, para aplicação em animais e humanos especialmente nas seguintes áreas: alimentícia, estética, farmacêutica, médica e odonto-lógica.

Extração do Conteúdo Orgânico Cada material particulado obtido na etapa anterior é colocado em solução com ácido acético 1M ou EDTA 0,1M a 5%, para extração do extrato orgânico, por um período não superior a 72 horas. Por cromatografia por camada delgada (CCD) demonstra-se a presença de uma solução proteica homogênea, com proteínas de peso molecular semelhante. A partir de 0,05 g de particulado em 5ml de solução, por Bradford, a velocidade de extração proteica, de hora em hora, até 120h, atinge em média 9pg/h. O extrato orgânico pode ser usado isoladamente ou combinado a outros biomateriais sob a forma cápsulas duras ou moles, granulados, tabletes, pílulas, soluções orais, suspensões, líquidos, injetáveis, géis, colóides, cremes, adesivos, compactados e comprimidos, para aplicação em animais e humanos especialmente nas seguintes áreas: alimentícia, estética, farmacêutica, médica e odontológica.

Confecção de Arcabouços Os particulados (2550mg) são agregados a um ou mais solventes polares, incluindo água (2000pL) e glicerol (2000pL), alginatos (2400mg ou 600pL) e ao extrato orgânico (lOOOpL), a fim de produzirem corpos de prova moldáveis, en-xertáveis e que podem prover meios de sustentação para a migração celular, incluindo as células-tronco.

Em testes in vivo, os arcabouços demonstram potencial como biomateriais de enxerto ósseo, uma vez que propiciam a manutenção de volume, possuem bio-compatibilidade e propriedades de osteocondução e osteoindução.

Esta inovação não se limita às representações aqui comentadas ou ilustradas, devendo ser compreendida em seu amplo escopo. Muitas modificações e outras representações da inovação virão à mente daquele versado na técnica à qual essa inovação pertence, tendo o benefício do ensinamento apresentado nas descrições anteriores e desenhos anexos. Além disso, é para ser entendido que a inovação não está limitada à forma específica revelada, e que modificações e outras formas são entendidas como inclusas dentro do escopo das reivindicações anexas. Embora termos específicos sejam empregados aqui, eles são usados somente de forma genérica e descritiva, e não como propósito de limitação.

Claims (14)

1. Biomaterial para enxertia óssea em aplicações, médicas e odontológicasca- racterizado porser formado por uma combinação de componentes, incluindo o extrato proteico de mexilhões {Perna perna), bem como seu nácar par-ticulado e outros materiais, tais como alginato.

2. Biomaterial, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de con- terproteínas morfogenéticas ósseas em sua composição.

3. Processo para obtenção de biomateriais da reivindicação 1 caracterizado porcompreender as seguintes etapas: a. higienização da matéria-prima, compreendendo a remoção dos moluscos e duas etapas de lavagem com solventes; b. obtenção de materiais particulados, compreendendo a formação de diferentes tipos de materiais particulados, incluindo o nácar integral, nácar sem a crosta externa, particulado da camada interna, intermediária e externa da concha; c. extração do conteúdo orgânico, compreendendo extração com solventes orgânicos; d. confecção dos arcabouços, compreendendo a mistura dos particulados com solventes e materiais capazes de prover meios de sustentação.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de a higi- enização compreender as etapas de: (i) remoção dos moluscos, a uma temperatura que pode variar de 15°C a 25°C; (ii) lavagem com detergente neutro e remoção de impurezas sólidas, incluindo processo de escovação; (iii) lavagem com solventes polares, incluindo água.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os materiais particulados são obtidos a partir da concha integral por meio de um processo de fragmentação.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os materiais particulados são obtidos a partir do nácar integral por um processo de moagem.

7. Processo, de acordo com quaisquer das reivindicações 3 a 6, caracterizado peio fato do nácar, sem a crosta externa, passar por um processo de filtração antes de compor o biomaterial.

8. Processo, de acordo com quaisquer das reivindicações de 3 a 7, caracteriza- do pelo fato de que a extração do conteúdo orgânico dos particulados ocorrer com a adição de solventes orgânicos, incluindo ácido acético, de 0,1M a 3M, em pH variando de 5 a 7, e posterior lavagem com EDTA, de 0,1M a 1M, em um período de 1 hora a 72 horas.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os particulados, em concentração de 9% a 75% (m/v) são agregados a pelo menos um solvente polar em proporção de 4% a 65%(m/v), incluindo água e glicerol, alginatos em concentração de 9% a 75% (m/v) e ao extrato orgânico em proporção de 10% a 30% (v/v).

10. Biomaterialsegundo a reivindicação 1 obtido segundo o processo da reivindicação 3, caracterizado por possuir em sua composição material particulado oriundo de nácar de mexilhão, tendo pelo menos 96% de cálcio em sua composição, além de menores quantidades de fósforo, manganês, ferro, enxofre e zinco.

11. Biomaterial, de acordo com as reivindicações 1, 2 elO, caracterizado pelo fato de o mexilhão utilizado compreender os da espécie Perna perna.

12. Biomaterial, de acordo com as reivindicações 1,2 elO, caracterizado pe-lofato de o material oriundo do mexilhão, utilizado na composição compreende, ao menos parcialmente, a sua concha.

13. Biomaterial, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de poder ser associado a componentes que modifiquem sua forma de aplicação, tais como agentes estabilizantes para cápsulas, granulados, tabletes, pílulas, soluções, suspensões, injetáveis, géis, colóides, cremes e adesivos.

14. Biomaterial, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de poder ser aplicado em humanos e animais, para fins de enxertia óssea.