BR102013032585B1 - PROCESS FOR OBTAINING BIOETHANOL, HESPERIDIN AND NANOCELLULOSE FROM ORANGE BASEMENT - Google Patents
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Abstract
PROCESSO DE OBTENÇÃO DE BIOETANOL, ESPERIDINA E NANOCELULOSE A PARTIR DE BAGAÇO DE LARANJA. A presente invenção refere-se a um processo de produção de bioetanol a partir de resíduos obtidos em indústrias que processam derivados de laranja. Ainda, este processo pode oferecer outros produtos de interesse do mercado atual, nanocelulose e esperidina. Além disso, a presente invenção se, refere ao uso de um novo coquetel de enzimas para realização da etapa de hidrólise e de uma nova composição de leveduras para realização da etapa de fermentação do dito processo.PROCESS FOR OBTAINING BIOETHANOL, ESPERIDINE AND NANOCELLULOSE FROM ORANGE PAMACE. The present invention refers to a process for the production of bioethanol from residues obtained in industries that process orange derivatives. Still, this process can offer other products of interest in the current market, nanocellulose and speridin. Furthermore, the present invention refers to the use of a new cocktail of enzymes to carry out the hydrolysis step and a new yeast composition to carry out the fermentation step of said process.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um processo de produção de bioetanol, hesperidina e nanocelulose a partir de resíduos obtidos em indústrias que processam derivados de laranja. A presente invenção se refere, ainda, ao uso de uma nova composição de leveduras isoladas do bagaço de laranja para a realização da etapa de fermentação do dito processo, como também, ao uso de um coquetel de enzimas isoladas da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri para a realização da etapa da hidrólise do processo proposto.[001] The present invention relates to a process for the production of bioethanol, hesperidin and nanocellulose from residues obtained in industries that process orange derivatives. The present invention also refers to the use of a new composition of yeasts isolated from orange pomace to carry out the fermentation step of said process, as well as the use of a cocktail of enzymes isolated from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri to carry out the hydrolysis step of the proposed process.
[002] O Brasil é atualmente o maior produtor e exportador mundial de laranja. Porém, um dos principais problemas enfrentados pelas indústrias processadoras de derivados de laranja é o grande volume de resíduos, já que após a extração do suco, o bagaço da laranja ainda representa 50% do total da fruta. O bagaço da laranja apresenta baixo custo, alta quantidade de carboidratos e alta susceptibilidade à hidrólise enzimática.[002] Brazil is currently the world's largest producer and exporter of oranges. However, one of the main problems faced by the processing industries of orange derivatives is the large volume of residues, since after extracting the juice, the orange pomace still represents 50% of the total fruit. Orange pomace has low cost, high amount of carbohydrates and high susceptibility to enzymatic hydrolysis.
[003] Ainda, o Brasil se destaca na produção de etanol apresentando resultados interessantes, desde a pesquisa de variedades de matéria-prima de maior rendimento até a fabricação de motores que funcionam com qualquer mistura de gasolina e etanol. No entanto, com a elevação dos preços das matérias primas agrícolas e dos alimentos nos últimos anos, passou-se a questionar a demanda de produtos agrícolas na obtenção de biocombustíveis. Neste sentido, a utilização de outras fontes de energia vem sendo investigada como, por exemplo, os resíduos de óleo de soja, gordura vegetal hidrogenada oriunda de frituras, gorduras de várias procedências e bagaços de frutas.[003] Still, Brazil stands out in the production of ethanol, presenting interesting results, from the research of higher yielding raw material varieties to the manufacture of engines that run on any mixture of gasoline and ethanol. However, with the rise in prices of agricultural raw materials and food in recent years, the demand for agricultural products to obtain biofuels began to be questioned. In this sense, the use of other sources of energy has been investigated, such as, for example, soybean oil residues, hydrogenated vegetable fat from frying, fats from various sources and fruit pomace.
[004] O bioetanol representa a segunda geração de biocombustíveis. A primeira geração requer a utilização de produtos agrícolas como matéria-prima. Já a segunda geração utiliza resíduos agrícolas e agroindustriais como insumo na produção de biocombustíveis. Algumas empresas e instituições de pesquisa vêm estudando esta nova frente a fim de utilizar biomassa e resíduos agrícolas das empresas para produção de novos produtos e ainda reduzir o impacto que estes resíduos podem causar no meio ambiente.[004] Bioethanol represents the second generation of biofuels. The first generation requires the use of agricultural products as raw material. The second generation uses agricultural and agro-industrial waste as an input in the production of biofuels. Some companies and research institutions have been studying this new front in order to use biomass and agricultural waste from companies to produce new products and also reduce the impact that these wastes can have on the environment.
[005] Um dos documentos que descreve processo de produção de etanol a partir de resíduos de processamento de cítricos é o US 2006/0177916. Este documento apresenta impregnação de ácido sulfúrico diluído na fase hidrolítica. Ainda, utiliza somente uma cepa de levedura comercial na etapa de fermentação. Este processo provoca liberação de fragmentos de lignina e ainda necessita de uma etapa adicional para detoxicação da biomassa hidrolisada.[005] One of the documents describing the process of producing ethanol from citrus processing residues is US 2006/0177916. This document shows dilute sulfuric acid impregnation in the hydrolytic phase. Furthermore, it only uses a commercial yeast strain in the fermentation stage. This process causes the release of lignin fragments and still requires an additional step to detoxify the hydrolyzed biomass.
[006] Outro documento que trata de assunto similar a presente invenção é o US 8,252,566. Este documento se refere à produção de etanol a partir de resíduos de processamento de cítricos por meio da redução da quantidade do d-limoneno. Este processo apresenta etapa de detoxicação e ainda com uso de catalisador. Além disso, utiliza micro-organismo contendo o DNA recombinante.[006] Another document dealing with a similar subject to the present invention is US 8,252,566. This document refers to the production of ethanol from citrus processing residues by reducing the amount of d-limonene. This process has a detoxification step and also uses a catalyst. In addition, it uses microorganism containing recombinant DNA.
[007] Outra solução encontrada é descrita no documento US 8,372,614. Este documento descreve uma produção de etanol a partir de resíduos de processamento de cítricos que apresenta etapa necessária de remoção de d-limoneno e uso de micro-organismo geneticamente modificado.[007] Another solution found is described in document US 8,372,614. This document describes an ethanol production from citrus processing residues that presents a necessary step of d-limonene removal and the use of a genetically modified microorganism.
[008] Por fim, os documentos BR0704708 e BR1001761 se referem a um processo que utiliza metanol para extração de hesperidina a partir de polpa cítrica peletizada e resíduos de polpa cítrica, notadamente casca de laranja.[008] Finally, documents BR0704708 and BR1001761 refer to a process that uses methanol for the extraction of hesperidin from pelleted citrus pulp and citrus pulp residues, notably orange peel.
[009] Desta maneira, não existe no estado da técnica, um processo de produção de bioetanol que apresenta as vantagens técnicas e econômicas presentes no processo da presente invenção.[009] In this way, there is no state of the art, a bioethanol production process that presents the technical and economic advantages present in the process of the present invention.
[0010] É um dos objetivos da presente invenção prover um processo de produção de bioetanol que proporciona bom rendimento em tempo inferior ao que é conhecido, além de apresentar baixo custo para realização.[0010] It is one of the objectives of the present invention to provide a bioethanol production process that provides good yield in less time than is known, in addition to having a low cost for implementation.
[0011] É outro objetivo da presente invenção proporcionar um excelente substituto para combustíveis clássicos como aqueles oriundos de petróleo e derivados.[0011] It is another objective of the present invention to provide an excellent substitute for classic fuels such as those derived from petroleum and derivatives.
[0012] É ainda outro objetivo da presente invenção proporcionar um processo que utiliza biomassa e resíduos oriundos da indústria de processamento de derivados de laranja a fim de produzir biocombustível de alta qualidade.[0012] It is yet another objective of the present invention to provide a process that uses biomass and waste from the orange derivatives processing industry in order to produce high quality biofuel.
[0013] É um objetivo adicional da presente invenção proporcionar um processo que oferece outros produtos além de bioetanol, de forma a reaproveitar os resíduos sólidos obtidos após as etapas tanto de hidrólise e de fermentação, com destaque para obtenção de nanocelulose obtida pela primeira vez a partir desta biomassa.[0013] It is an additional objective of the present invention to provide a process that offers other products in addition to bioethanol, in order to reuse the solid residues obtained after both the hydrolysis and fermentation steps, with emphasis on obtaining nanocellulose obtained for the first time from from this biomass.
[0014] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma produção sustentável de etanol de fonte renovável que minimize a geração de resíduos.[0014] Another objective of the present invention is to provide a sustainable production of ethanol from a renewable source that minimizes waste generation.
[0015] É também objetivo da presente invenção propiciar o uso de um extrato compreendendo proteínas (enzimas) da Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) em etapa de hidrólise enzimática de bagaço da laranja para obtenção de bioetanol ou simplesmente etanol.[0015] It is also an object of the present invention to provide the use of an extract comprising proteins (enzymes) from Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) in the enzymatic hydrolysis step of orange pomace to obtain bioethanol or simply ethanol.
[0016] Adicionalmente, a presente invenção tem como objetivo apresentar uma composição compreendendo co-culturas de uma levedura comercial (Saccharomyces cerevisiae) com ao menos uma levedura isolada do bagaço da laranja selecionada dentre Candida parapsilosis IFM 48375 e Candida parapsilosis NRRL Y-12969.[0016] Additionally, the present invention aims to present a composition comprising co-cultures of a commercial yeast (Saccharomyces cerevisiae) with at least one yeast isolated from orange pomace selected from Candida parapsilosis IFM 48375 and Candida parapsilosis NRRL Y-12969.
[0017] É ainda objetivo da presente invenção o uso de uma composição compreendendo co-culturas de uma levedura comercial (Saccharomyces cerevisiae) com ao menos uma levedura isolada do bagaço da laranja selecionada dentre Candida parapsilosis IFM 48375 e Candida parapsilosis NRRL Y-12969 em processos de fermentação.[0017] It is also an object of the present invention to use a composition comprising co-cultures of a commercial yeast (Saccharomyces cerevisiae) with at least one yeast isolated from orange pomace selected from among Candida parapsilosis IFM 48375 and Candida parapsilosis NRRL Y-12969 in fermentation processes.
[0018] Ainda, é objetivo da presente invenção a produção de pelo menos quatro produtos principais: bioetanol de segunda geração, óleo essencial, hesperidina e nanocelulose.[0018] Still, it is the objective of the present invention to produce at least four main products: second-generation bioethanol, essential oil, hesperidin and nanocellulose.
[0019] O processo de produção de bioetanol, hesperidina e nanocelulose a partir de resíduos obtidos em indústrias que processam derivados de laranja compreende as seguintes etapas de: a) Triturar bagaço da laranja; b) Submeter o produto da etapa (a) à destilação por arraste de vapor, obtendo-se óleo essencial e um resíduo sólido; c) Submeter o resíduo sólido obtido na etapa (b) à extração após uso de éter de petróleo para retirada de componentes lipídicos, utilizando um componente alcoólico C1-2, obtendo-se hesperidina e um resíduo sólido; d) Submeter o resíduo sólido obtido na etapa (c) à hidrólise enzimática adicionando extrato protéico de Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), obtendo-se um resíduo sólido e uma parte líquida; e) Fermentar a parte líquida obtida na etapa (d) usando as co-culturas com a razão de 1:1 (v v-1) entre a levedura comercial, Saccharomyces cerevisiae, e a levedura isolada do bagaço da laranja, selecionada dentre Candida parapsilosis IFM 48375 e Candida parapsilosis NRRL Y-12969, obtendo-se produtos de fermentação e um resíduo sólido; f) Tratar o resíduo sólido obtido nas etapas (d) e (e), realizando as etapas de branqueamento, delignificação, tratamento alcalino, neutralização, tratamento de ultrassom, centrifugação e secagem, obtendo-se nanocelulose; e g) Destilar os produtos da fermentação obtidos na etapa (e), obtendo-se bioetanol-2G.[0019] The production process of bioethanol, hesperidin and nanocellulose from residues obtained in industries that process orange derivatives comprises the following steps: a) Grinding orange bagasse; b) Submit the product from step (a) to steam distillation, obtaining essential oil and a solid residue; c) Submit the solid residue obtained in step (b) to extraction after using petroleum ether to remove lipid components, using a C1-2 alcoholic component, obtaining hesperidin and a solid residue; d) Submit the solid residue obtained in step (c) to enzymatic hydrolysis by adding protein extract of Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), obtaining a solid residue and a liquid part; e) Ferment the liquid part obtained in step (d) using co-cultures with a ratio of 1:1 (v v-1) between the commercial yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the yeast isolated from orange pomace, selected from Candida parapsilosis IFM 48375 and Candida parapsilosis NRRL Y-12969, yielding fermentation products and a solid residue; f) Treat the solid residue obtained in steps (d) and (e), carrying out the bleaching, delignification, alkaline treatment, neutralization, ultrasound treatment, centrifugation and drying steps, obtaining nanocellulose; and g) Distill the fermentation products obtained in step (e), obtaining 2G-bioethanol.
[0020] A etapa (d) é conduzida a uma temperatura de 45 °C por 24 horas.[0020] Step (d) is conducted at a temperature of 45 °C for 24 hours.
[0021] A etapa (e) é conduzida a uma a uma temperatura de 35 °C durante um período de 6 horas.[0021] Step (e) is conducted at a temperature of 35 °C for a period of 6 hours.
[0022] A etapa (b) de obtenção de óleo essencial compreende as sub etapas: - Transferir o destilado seguindo a extração com solvente empregando um solvente orgânico apolar selecionado dentre éter de petróleo, n-hexano, éter etílico, sendo que a fase polar (água) pode ser reutilizada; - Secagem do solvente apolar para retirada da água residual; - Evaporação do solvente; e - Obtenção do óleo essencial puro.[0022] Step (b) of obtaining essential oil comprises the sub-steps: - Transfer the distillate following solvent extraction using an apolar organic solvent selected from petroleum ether, n-hexane, ethyl ether, with the polar phase (water) can be reused; - Drying of the non-polar solvent to remove residual water; - Evaporation of the solvent; and - Obtaining pure essential oil.
[0023] O solvente orgânico apolar empregado é etílico.[0023] The non-polar organic solvent used is ethyl.
[0024] A etapa (c) de obtenção de hesperidina compreende as sub etapas de: - Secagem do bagaço da laranja a uma temperatura suficiente para a remoção da água; - Extração com éter de petróleo a uma temperatura compreendida na faixa compreendida de 40 a 60 °C e por um período compreendido entre 3 a 6 horas; - Extração com um componente alcoólico C1-2 selecionado dentre metanol ou etanol; - Evaporação do componente alcoólico C1-2 até a consistência de xarope; - Adição de ácido acético em uma faixa de concentração compreendida entre 4 a 8%; - Obtenção de um precipitado sólido de cor amarela, sendo que o dito precipitado contém hesperidina; - Recristalização da hesperidina empregando uma solução da hesperidina isolada e crua, em uma faixa de concentração compreendida entre 4 a 12%, em um solvente ou uma solução selecionada dentre dimetilformamida, formamida, dimetilsulfóxido e dimetilsulfóxido:metanol (1:1, v v-1); - Aquecimento da solução obtida na etapa anterior a uma temperatura compreendida na faixa de 60 a 80 °C; - Adição de água destilada à solução obtida na etapa anterior, gota a gota e sob agitação constante; - Repouso da solução resultante obtida na etapa anterior para a precipitação dos cristais brancos; e - Obtenção da hesperidina recristalizada.[0024] Step (c) of obtaining hesperidin comprises the sub-steps of: - Drying the orange pomace at a temperature sufficient to remove the water; - Extraction with petroleum ether at a temperature between 40 and 60 °C and for a period between 3 and 6 hours; - Extraction with a C1-2 alcoholic component selected from methanol or ethanol; - Evaporation of the alcoholic component C1-2 until the consistency of syrup; - Addition of acetic acid in a concentration range between 4 to 8%; - Obtaining a solid yellow precipitate, said precipitate containing hesperidin; - Recrystallization of hesperidin using a solution of isolated and crude hesperidin, in a concentration range between 4 to 12%, in a solvent or a solution selected from among dimethylformamide, formamide, dimethylsulfoxide and dimethylsulfoxide:methanol (1:1, v v- 1); - Heating the solution obtained in the previous step to a temperature in the range of 60 to 80 °C; - Adding distilled water to the solution obtained in the previous step, drop by drop and under constant agitation; - Rest of the resulting solution obtained in the previous step for the precipitation of white crystals; and - Obtaining recrystallized hesperidin.
[0025] A etapa de secagem é realizada a uma temperatura compreendida na faixa de 70 a 80 °C.[0025] The drying step is carried out at a temperature in the range of 70 to 80 °C.
[0026] A etapa de extração com éter de petróleo é conduzida a uma temperatura de 60 °C por um período de 4 horas, na presença do componente alcoólico é conduzida por um período compreendido entre 1 e 3 horas, na presença do componente alcoólico é conduzida por um período de 3 horas.[0026] The extraction step with petroleum ether is carried out at a temperature of 60 °C for a period of 4 hours, in the presence of the alcoholic component it is carried out for a period between 1 and 3 hours, in the presence of the alcoholic component it is conducted over a period of 3 hours.
[0027] A etapa (f) de obtenção de nanocelulose compreende as sub etapas de: - Separar o resíduo sólido por filtração; - Submeter o resíduo sólido a uma etapa de branqueamento utilizando primeiramente uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) em uma concentração compreendida na faixa de 3 a 5%; - Submeter a suspensão obtida na etapa anterior a autoclavagem a uma temperatura compreendida na faixa de 100 a 130 °C e por um período compreendido na faixa de 15 a 30 minutos; - Filtração; - Lavagem com água destilada; - Adição de uma solução de clorito de sódio (NaClO2), em uma concentração compreendida na faixa de 1 a 2% e em um pH compreendido entre 3 a 5; - Lavagem da amostra sólida com água destilada; - Submeter a suspensão obtida na etapa anterior a autoclavagem a uma temperatura compreendida na faixa de 100 a 130 °C e por um período compreendido na faixa de 15 a 30 minutos; - Filtração; - Lavagem com água destilada; - Suspensão das fibras obtidas em água destilada e sonicação por um período de pelo menos 10 minutos utilizando, preferencialmente, 40% de pulso de 750 W e de 20 kHz; - Centrifugação, preferencialmente a 15000 rpm por 15 minutos; - Secagem por liofilização; e - Obtenção das nanofibras de coloração branca e de massa ultra-leve.[0027] Step (f) of obtaining nanocellulose comprises the sub-steps of: - Separate the solid residue by filtration; - Submit the solid residue to a bleaching step using firstly a sodium hydroxide solution (NaOH) in a concentration comprised in the range of 3 to 5%; - Submit the suspension obtained in the previous step to autoclaving at a temperature comprised in the range of 100 to 130 °C and for a period comprised in the range of 15 to 30 minutes; - Filtration; - Washing with distilled water; - Addition of a sodium chlorite solution (NaClO2), in a concentration comprised in the range of 1 to 2% and in a pH comprised between 3 to 5; - Washing of the solid sample with distilled water; - Submit the suspension obtained in the previous step to autoclaving at a temperature comprised in the range of 100 to 130 °C and for a period comprised in the range of 15 to 30 minutes; - Filtration; - Washing with distilled water; - Suspension of the obtained fibers in distilled water and sonication for a period of at least 10 minutes using, preferably, 40% pulse of 750 W and 20 kHz; - Centrifugation, preferably at 15000 rpm for 15 minutes; - Drying by lyophilization; and - Obtaining ultra-lightweight, white-colored nanofibers.
[0028] Figura 1: é um esquema de uma concretização preferida do processo objeto da presente invenção.[0028] Figure 1: is a schematic of a preferred embodiment of the process object of the present invention.
[0029] A presente invenção atinge esses e outros objetivos por meio de um processo de produção de bioetanol a partir de bagaço de laranja que compreende as etapas de: a) Triturar bagaço da laranja; b) Submeter o resultado da etapa (a) à hidrólise enzimática adicionando extrato protéico de Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), obtendo-se um primeiro resíduo sólido e uma parte líquida; c) Fermentar a parte líquida usando co-culturas de uma levedura comercial (Saccharomyces cerevisiae) com ao menos uma levedura isolada do bagaço da laranja selecionada dentre Candida parapsilosis IFM 48375 e Candida parapsilosis NRRL Y-12969, obtendo-se produtos de fermentação e um segundo resíduo sólido; e d) Destilar os produtos da fermentação, obtendo-se bioetanol-2G.[0029] The present invention achieves these and other objectives through a bioethanol production process from orange pomace that comprises the steps of: a) Grinding orange pomace; b) Submit the result of step (a) to enzymatic hydrolysis by adding protein extract of Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), obtaining a first solid residue and a liquid part; c) Ferment the liquid part using co-cultures of a commercial yeast (Saccharomyces cerevisiae) with at least one yeast isolated from orange pomace selected among Candida parapsilosis IFM 48375 and Candida parapsilosis NRRL Y-12969, obtaining fermentation products and a second solid residue; and d) Distill the fermentation products, obtaining bioethanol-2G.
[0030] Em uma concretização preferencial, a presente invenção atinge esses e outros objetivos por meio de um processo de produção de bioetanol a partir de bagaço de laranja que compreende as seguintes etapas: e) Triturar bagaço da laranja; f) Separar bagaço triturado em uma primeira parte, uma segunda parte e uma terceira parte; g) Submeter a primeira parte a destilação por arraste de vapor, obtendo-se óleo essencial; h) Submeter a segunda parte à extração utilizando um componente alcoólico C1-2, obtendo-se hesperidina; i) Submeter a terceira parte à hidrólise enzimática adicionando extrato protéico de Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), obtendo-se um primeiro resíduo sólido e uma parte líquida; j) Tratar o primeiro resíduo sólido, obtendo-se nanocelulose; k) Fermentar a parte líquida usando as co-culturas de uma levedura comercial (Saccharomyces cerevisiae) com ao menos uma levedura isolada do bagaço da laranja selecionada dentre Candida parapsilosis IFM 48375 e Candida parapsilosis NRRL Y-12969, obtendo-se produtos de fermentação e um segundo resíduo sólido; l) Destilar os produtos da fermentação, obtendo-se bioetanol-2G; e m) Tratar o segundo resíduo sólido, obtendo-se nanocelulose.[0030] In a preferred embodiment, the present invention achieves these and other objectives through a bioethanol production process from orange pomace that comprises the following steps: e) Grinding orange pomace; f) Separate crushed bagasse into a first part, a second part and a third part; g) Submit the first part to steam distillation, obtaining essential oil; h) Submit the second part to extraction using an alcoholic component C1-2, obtaining hesperidin; i) Submit the third part to enzymatic hydrolysis adding protein extract of Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), obtaining a first solid residue and a liquid part; j) Treat the first solid residue, obtaining nanocellulose; k) Ferment the liquid part using co-cultures of a commercial yeast (Saccharomyces cerevisiae) with at least one yeast isolated from orange pomace selected among Candida parapsilosis IFM 48375 and Candida parapsilosis NRRL Y-12969, obtaining fermentation products and a second solid residue; l) Distill the fermentation products, obtaining bioethanol-2G; and m) Treat the second solid residue, obtaining nanocellulose.
[0031] Em uma concretização preferencial, a presente invenção se refere a um processo de produção de bioetanol a partir de bagaço de laranja que compreende as seguintes etapas: (i) isolamento de microrganismos oriundos do bagaço da laranja; (ii) determinação da composição química do bagaço de laranja (conteúdo de água, cinzas, pectina, celulose, hemicelulose, lignina, proteínas e sais); (iii) realização de hidrólise enzimática aplicando um coquetel de enzimas provenientes da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) de modo a obter monossacarídeos fermentáveis; e (iv) realização de fermentação submersa por meio de aplicação de leveduras conhecidas comercialmente e isoladas do próprio bagaço da laranja em co-culturas, resultando em bioetanol.[0031] In a preferred embodiment, the present invention refers to a bioethanol production process from orange pomace that comprises the following steps: (i) isolation of microorganisms from orange pomace; (ii) determination of the chemical composition of orange pomace (content of water, ash, pectin, cellulose, hemicellulose, lignin, proteins and salts); (iii) carrying out enzymatic hydrolysis applying a cocktail of enzymes from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) in order to obtain fermentable monosaccharides; and (iv) carrying out submerged fermentation through the application of commercially known yeasts isolated from the orange pomace itself in co-cultures, resulting in bioethanol.
[0032] A presente invenção tem por objetivo um processo de obtenção de: (1) etanol de segunda geração, e opcionalmente, (2) nanocelulose, (3) óleo essencial e (4) hesperidina,[0032] The present invention aims at a process for obtaining: (1) second-generation ethanol, and optionally, (2) nanocellulose, (3) essential oil and (4) hesperidin,
[0033] Sendo que todos estes produtos são oriundos do uso de bagaço de laranja.[0033] Since all these products come from the use of orange pomace.
[0034] A presente invenção propõe conversão de bagaço de laranja em bioetanol de segunda geração ou bioetanol-2G baseada na hidrólise enzimática e a fermentação utilizando leveduras pré-selecionadas visando baratear o custo da produção do bioetanol-2G e possibilitar que o processo como um todo seja mais verde.[0034] The present invention proposes the conversion of orange pomace into second-generation bioethanol or bioethanol-2G based on enzymatic hydrolysis and fermentation using pre-selected yeasts in order to lower the cost of producing bioethanol-2G and enable the process as a everything is greener.
[0035] A biomassa de bagaço de laranja pode ter novo e alto valor agregado devido à geração de quantidades significativas de hesperidina, um potente bioativo, nanocelulose, um valioso bionanomaterial, e bioetanol de excelente qualidade. De acordo com o processo objeto da presente invenção, o bagaço é convertido em uma mistura de açúcares de 5- e 6- carbonos pela hidrólise, aplicando-se enzimas oriundas da Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Os açúcares fermentáveis serão fermentados usando co-culturas de levedura comercial e micro-organismos isolados do bagaço da laranja formando etanol. Os resultados apresentam ótimos rendimentos de açúcares e de bioetanol nos processos de fermentação.[0035] The orange pomace biomass can have new and high added value due to the generation of significant amounts of hesperidin, a potent bioactive, nanocellulose, a valuable bionanomaterial, and bioethanol of excellent quality. According to the process object of the present invention, the bagasse is converted into a mixture of 5- and 6-carbon sugars by hydrolysis, applying enzymes derived from Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Fermentable sugars will be fermented using co-cultures of commercial yeast and microorganisms isolated from orange pomace, forming ethanol. The results show excellent yields of sugars and bioethanol in the fermentation processes.
[0036] Em uma concretização preferencial, o processo de produção de bioetanol de segunda geração a partir de bagaço de laranja compreende as seguintes etapas: (v) isolamento de microrganismos oriundos do bagaço da laranja; (vi) determinação da composição química do bagaço de laranja (conteúdo de água, cinzas, pectina, celulose, hemicelulose, lignina, proteínas e sais); (vii) isolamento de óleo essencial oriundo do bagaço de laranja por meio de arraste a vapor e isolamento de hesperidina; (viii) realização de hidrólise enzimática aplicando um coquetel de enzimas provenientes da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) de modo a obter monossacarídeos fermentáveis; (ix) realização de fermentação submersa por meio de aplicação de leveduras conhecidas comercialmente e isoladas do próprio bagaço da laranja em co-culturas; (x) produção e isolamento de nanocelulose a partir dos resíduos sólidos da hidrólise enzimática e do processo fermentativo do bagaço da laranja. Vantagens de destaque alcançadas com o processo da presente invenção[0036] In a preferred embodiment, the second-generation bioethanol production process from orange bagasse comprises the following steps: (v) isolation of microorganisms from orange bagasse; (vi) determination of the orange pomace chemical composition (content of water, ashes, pectin, cellulose, hemicellulose, lignin, proteins and salts); (vii) isolation of essential oil from orange pomace using steam dragging and isolation of hesperidin; (viii) carrying out enzymatic hydrolysis applying a cocktail of enzymes from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) in order to obtain fermentable monosaccharides; (ix) carrying out submerged fermentation by applying commercially known yeasts isolated from orange pomace in co-cultures; (x) production and isolation of nanocellulose from solid residues from the enzymatic hydrolysis and fermentation process of orange pomace. Outstanding advantages achieved with the process of the present invention
[0037] O processo objeto da presente invenção apresenta algumas vantagens, a saber: Aspectos estratégicos: - É um excelente substituto de combustíveis clássicos como aqueles oriundos de petróleo e derivados; - Apresenta como resultado não só o bioetanol por meio de fermentação dos produtos obtidos após hidrólise enzimática do bagaço da laranja, mas também óleo essencial, hesperidina e nanocelulose, produtos de alto valor agregado, a partir do bagaço da laranja; - O processo objeto da presente invenção utiliza enzimas obtidas do extrato protéico do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) o que possibilita a aplicação das condições brandas na hidrólise do bagaço de laranja e altos rendimentos de açúcares fermentáveis sem gerar substâncias tóxicas aos microrganismos. Este fato evita a realização de uma etapa de detoxicação; - Aplicação de micro-organismos isolados do próprio bagaço de laranja em mono e co-culturas com o micro-organismo tradicionalmente usado em fermentação alcoólica, possibilitando a redução do tempo da fermentação para 6 horas; que comumente dura de 24-48 horas. - Este processo causa a redução de custo no tratamento enzimático da biomassa por utilizar enzimas do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). - Aspectos Econômicos e Sociais - Permite desenvolvimento da indústria para produção de etanol de segunda geração e geração de empregos; - Não apresenta competitividade de preços com os produtos alimentícios e espaços físicos na agricultura. - Aspectos Ambientais e Energéticos - Trata-se de produção sustentável do bioetanol-2G de fonte renovável; - Promove crescimento regional sustentável; - Atenuam impactos ambientais e promove a saúde ambiental do planeta. Com relação ao bagaço de laranja[0037] The process object of the present invention has some advantages, namely: Strategic aspects: - It is an excellent substitute for classic fuels such as those derived from oil and derivatives; - Presents as a result not only bioethanol through fermentation of products obtained after enzymatic hydrolysis of orange pomace, but also essential oil, hesperidin and nanocellulose, products with high added value, from orange pomace; - The process object of the present invention uses enzymes obtained from the protein extract of the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) which allows the application of mild conditions in the hydrolysis of orange pomace and high yields of fermentable sugars without generating toxic substances to microorganisms. This fact avoids carrying out a detoxification stage; - Application of microorganisms isolated from orange pomace in mono and co-cultures with the microorganism traditionally used in alcoholic fermentation, allowing the reduction of fermentation time to 6 hours; which commonly lasts 24-48 hours. - This process causes cost reduction in the enzymatic treatment of biomass by using enzymes from the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). - Economic and Social Aspects - Allows development of the industry for the production of second generation ethanol and job creation; - Does not present price competitiveness with food products and physical spaces in agriculture. - Environmental and Energy Aspects - This involves the sustainable production of bioethanol-2G from a renewable source; - Promotes sustainable regional growth; - Mitigate environmental impacts and promote the planet's environmental health. Regarding orange pomace
[0038] Resíduos cítricos sólidos e úmidos como o bagaço da laranja contém entre 76-82% de água e a sua estrutura esponjosa tem elevada presença de polissacarídeos na forma de pectina, celulose e hemicelulose que se ligam à água. Sabe-se, de maneira geral, que o bagaço da laranja contém, em geral: açúcares solúveis (16,9%), amido (3,75%), fibras, tais com celulose (9,21%), hemicelulose (10,50%), lignina (0,84%) e pectina (42,50%), cinzas (3,5%), gorduras (1,95%) e proteínas (6,50%), sendo que todas as quantidades estão expressas considerando-se o peso do bagaço da laranja seco. Ainda, contém pequenas quantidades de vários compostos orgânicos como os ácidos cítrico, malônico, oxálico além de vitamina C (ácido ascórbico).[0038] Solid and wet citric waste such as orange pomace contains between 76-82% water and its spongy structure has a high presence of polysaccharides in the form of pectin, cellulose and hemicellulose that bind to water. It is generally known that orange pomace contains, in general: soluble sugars (16.9%), starch (3.75%), fiber, such as cellulose (9.21%), hemicellulose (10 .50%), lignin (0.84%) and pectin (42.50%), ash (3.5%), fat (1.95%) and protein (6.50%), with all amounts are expressed considering the weight of dry orange bagasse. Still, it contains small amounts of various organic compounds such as citric, malonic, oxalic acids in addition to vitamin C (ascorbic acid).
[0039] Ainda, várias frutas cítricas contêm diferentes bioativos, tais como a hesperidina e naringina, que são glicosídeos da flavona, e β-criptoxantina, um carotenoide, podendo também apresentar compostos fenólicos, terpenos como d-limoneno e mirceno, cálcio e potássio.[0039] Also, several citrus fruits contain different bioactives, such as hesperidin and naringin, which are flavone glycosides, and β-cryptoxanthin, a carotenoid, and may also contain phenolic compounds, terpenes such as d-limonene and myrcene, calcium and potassium .
[0040] O resíduo bagaço de laranja compreende açúcares facilmente fermentáveis, tais como: a glicose, a frutose e a sacarose e polissacarídeos insolúveis como celulose e pectina. Ainda, compreende baixos níveis de lignina tornando esta matéria prima adequada para realização de fermentação alcoólica para obtenção de etanol.[0040] The orange bagasse residue comprises easily fermentable sugars, such as: glucose, fructose and sucrose and insoluble polysaccharides such as cellulose and pectin. Furthermore, it comprises low levels of lignin making this raw material suitable for carrying out alcoholic fermentation to obtain ethanol.
[0041] Entende-se que a hesperidina pode ter várias propriedades farmacêuticas importantes e atuar como um antioxidante, anti-inflamatório e anticancerígeno, pode reduzir o colesterol, a pressão sanguínea e reduzir a perda da densidade óssea. Ainda, possui propriedades protetoras contra sepse, apresenta potencial sedativo.[0041] It is understood that hesperidin can have several important pharmaceutical properties and act as an antioxidant, anti-inflammatory and anticancer, can lower cholesterol, blood pressure and reduce the loss of bone density. Furthermore, it has protective properties against sepsis and has a sedative potential.
[0042] A biomassa lignocelulose é um material complexo e composto por celulose, hemicelulose e lignina. A combinação da hemicelulose com a lignina resulta em uma camada protetora ao redor da celulose, que pode ser modificada ou removida para então ser realizada a etapa de hidrólise. Os processos típicos de conversão da lignocelulose em etanol compreendem pelo menos em quatro etapas: 1. pré-tratamento para se aumentar a capacidade de degradação da biomassa; 2. hidrólise da celulose em açúcares monoméricos; 3. fermentação de açúcares em etanol; 4. recuperação do etanol por meio da destilação/evaporação.[0042] Lignocellulose biomass is a complex material composed of cellulose, hemicellulose and lignin. The combination of hemicellulose with lignin results in a protective layer around the cellulose, which can be modified or removed to then carry out the hydrolysis step. Typical processes for converting lignocellulose into ethanol comprise at least four steps: 1. pre-treatment to increase the biomass degradation capacity; 2. hydrolysis of cellulose into monomeric sugars; 3. Fermentation of sugars into ethanol; 4. recovery of ethanol through distillation/evaporation.
[0043] O efeito do pré-tratamento dos materiais lignocelulósicos tem sido reconhecido como importante passo em reduzir o tempo da hidrólise. Os principais objetivos do pré-tratamento são: - redução da cristalinidade da celulose; - remoção da lignina; - aumento da porosidade dos materiais; - tornar o substrato significativamente mais suscetível à ação enzimática do que em relação ao material original.[0043] The effect of pre-treatment of lignocellulosic materials has been recognized as an important step in reducing the hydrolysis time. The main objectives of pre-treatment are: - reduction of cellulose crystallinity; - removal of lignin; - increased porosity of materials; - make the substrate significantly more susceptible to enzymatic action than the original material.
[0044] O pré-tratamento deve acompanhar as seguintes exigências: - melhoria na liberação de açúcares ou na habilidade para a liberação subsequente de açúcares por meio da hidrólise enzimática; - evitar a degradação ou perda de carboidratos; - retenção de aproximadamente toda a celulose presente no material original; - evitar a formação de subprodutos inibitórios à hidrólise subsequente e aos processos fermentativos; - ser efetivo em termos de custo.[0044] The pretreatment must meet the following requirements: - improvement in the release of sugars or in the ability to subsequently release sugars through enzymatic hydrolysis; - prevent the degradation or loss of carbohydrates; - retention of approximately all the cellulose present in the original material; - to avoid the formation of by-products that inhibit subsequent hydrolysis and fermentation processes; - be cost-effective.
[0045] Após o processo de pré-tratamento, há dois procedimentos usados na hidrólise da biomassa. A hidrólise utiliza tecnologias complexas e multifásicas, com base no uso de ácidos e/ou enzimas em separações dos açúcares e remoção da lignina. A produção de etanol a partir da hidrólise enzimática é a opção de baixo impacto ambiental para produção do etanol e industrialmente, este processo poderá ser executado de modo descontínuo por hidrólise seguida de fermentação ou em um processo simultâneo, no qual a sacarificação e fermentação são contínuas.[0045] After the pretreatment process, there are two procedures used in the hydrolysis of biomass. Hydrolysis uses complex and multiphase technologies, based on the use of acids and/or enzymes in the separation of sugars and removal of lignin. Ethanol production from enzymatic hydrolysis is the low environmental impact option for ethanol production and industrially, this process can be performed discontinuously by hydrolysis followed by fermentation or in a simultaneous process, in which saccharification and fermentation are continuous .
[0046] A etapa de hidrólise enzimática para produção de bioetanol de segunda geração a partir de bagaço de laranja apresenta custos menores se comparado com o uso de hidrólise química e ainda é uma tecnologia mais verde.[0046] The enzymatic hydrolysis step for the production of second-generation bioethanol from orange pomace has lower costs compared to the use of chemical hydrolysis and is still a greener technology.
[0047] Antes da fermentação, os polímeros de celulose e hemicelulose são hidrolisados em monômeros, hexoses e pentoses. O bagaço de laranja pode ser hidrolisado em açúcares monoméricos aplicando-se a combinação de enzimas: pectinase, celulase e β-glicosidase. Preferencialmente, utiliza-se uma quantidade de enzimas de 5 mg de pectinase e 2 mg de celulase por 1 g de casca seca para provocar a formação de maior quantidade de D-glicose. De acordo com testes realizados, a pectinase foi mais eficiente na hidrólise do bagaço em comparação com a celulase, embora algumas celulases sejam indispensáveis em maximizar a produção de glicose e galactose. Sugere-se que a biomassa seja pré-tratada antes da hidrólise para separar possíveis inibidores das enzimas e facilitar a posterior degradação. Os compostos tóxicos como furfural, 5-hidroximetil furfural, ácidos mistos e monômeros fenólicos são liberados como resultado do procedimento de pré-tratamento a partir da celulose, hemicelulose e lignina e devem ser removidos por vários métodos de desintoxicação.[0047] Before fermentation, cellulose and hemicellulose polymers are hydrolyzed into monomers, hexoses and pentoses. Orange pomace can be hydrolyzed into monomeric sugars by applying a combination of enzymes: pectinase, cellulase and β-glucosidase. Preferably, an amount of enzymes of 5 mg of pectinase and 2 mg of cellulase per 1 g of dry peel is used to cause the formation of greater amounts of D-glucose. According to tests carried out, pectinase was more efficient in the hydrolysis of bagasse compared to cellulase, although some cellulases are indispensable in maximizing the production of glucose and galactose. It is suggested that the biomass be pre-treated before hydrolysis to separate possible enzyme inhibitors and facilitate subsequent degradation. Toxic compounds such as furfural, 5-hydroxymethyl furfural, mixed acids and phenolic monomers are released as a result of the pretreatment procedure from cellulose, hemicellulose and lignin and must be removed by various detoxification methods.
[0048] Na presente invenção, utiliza-se na etapa de hidrólise enzimática proteínas provenientes da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Esse patógeno, Gram-negativo, causa cancro cítrico entrando no seu hospedeiro (laranja) através dos estômatos e utilizando um impressionante arsenal de proteínas, incluindo pectinases e celulases, provocando severa necrose no tecido vegetal. Apesar de relatos sobre o uso de muitas bactérias e fungos para produzir coquetéis de enzimas hidrolíticas, geralmente, os fungos são considerados uma opção melhor em termos de variedade de enzimas e de rendimentos de açúcares fermentáveis após a hidrólise da lignocelulose. No entanto, a Xac também produz um coquetel de enzimas que pode ajudar na degradação da biomassa, devido às diferentes atividades hidrolíticas de suas enzimas. Esta etapa apresenta alguns pontos de destaque: - O uso de extrato de proteínas das enzimas da Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) dispensa o controle de pH do meio (isto é, o uso de tampões) uma vez que o pH do meio que diminui de pH 4,1 no início da hidrólise para o pH de 3,1 sem provocara queda na produção de açúcares fermentáveis, mostrando-se estáveis em baixos valores de pH; - O uso do extrato das ditas enzimas permite obter uma grande quantidade dos principais açúcares fermentáveis nos hidrolisados enzimáticos, neste caso, 11,5 g L-1 de D-glicose e 13,2 g L-1 de D-frutose, o que representa uma ótima concentração de açúcares para o processo de fermentação conduzida na fase posterior quando comparada às concentrações obtidas por enzimas comerciais (respectivamente, 11,0-13,7 g L-1); - O coquetel de enzimas pode ser preparado utilizando cultura de células da Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) em meio de cultura (Luria-Bertani modificado) a 32 °C durante 16 horas. A cultura de células da Xac pode-se então ser centrifugada e lisada por sonicação, sendo que sobrenadante deste lisado que contém as proteínas totais da Xac após ser dialisado contra água, é liofilizado e armazenado a -20 °C até ser usado. - Adicionalmente, é importante salientar que as referidas enzimas que foram utilizadas na hidrólise do bagaço da laranja demonstram alta afinidade com tal substrato e alta resistência aos traços de óleo essencial de laranja, quando presente.[0048] In the present invention, proteins from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). This Gram-negative pathogen causes citrus canker by entering its host (orange) through the stomata and utilizing an impressive arsenal of proteins, including pectinases and cellulases, causing severe necrosis in plant tissue. Despite reports of the use of many bacteria and fungi to produce cocktails of hydrolytic enzymes, fungi are generally considered to be a better option in terms of variety of enzymes and yields of fermentable sugars after lignocellulose hydrolysis. However, Xac also produces a cocktail of enzymes that can help with biomass degradation, due to the different hydrolytic activities of its enzymes. This step presents some highlights: - The use of enzyme protein extract from Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) does not need to control the pH of the medium (i.e., the use of buffers) since the pH of the medium decreases from pH 4.1 at the beginning of hydrolysis to pH 3.1 without causing a drop in production of fermentable sugars, showing stability at low pH values; - The use of the extract of said enzymes allows obtaining a large amount of the main fermentable sugars in enzymatic hydrolysates, in this case, 11.5 g L-1 of D-glucose and 13.2 g L-1 of D-fructose, which represents an optimal concentration of sugars for the fermentation process carried out in the posterior phase when compared to the concentrations obtained by commercial enzymes (respectively, 11.0-13.7 g L-1); - The enzyme cocktail can be prepared using cell culture of Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) in culture medium (modified Luria-Bertani) at 32 °C for 16 hours. The Xac cell culture can then be centrifuged and lysed by sonication, the supernatant of this lysate which contains the total Xac proteins after being dialyzed against water, is lyophilized and stored at -20°C until used. - Additionally, it is important to point out that the aforementioned enzymes that were used in the hydrolysis of orange pomace demonstrate high affinity with such substrate and high resistance to traces of orange essential oil, when present.
[0049] A levedura Saccharomyces cerevisiae é o micro-organismo mais utilizado na produção de etanol, considerado não patogênico (Gras), proporciona uma eficiente e rápida fermentação da D-glicose com obtenção de alta concentração de etanol.[0049] The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most used microorganism in the production of ethanol, considered non-pathogenic (Gras), provides an efficient and fast fermentation of D-glucose with obtaining a high concentration of ethanol.
[0050] Neste processo, é fundamental considerar vários fatores que podem influenciar na adaptação do microrganismo ao meio, tais como: - temperatura, que afeta diretamente a taxa de crescimento; - composição do bagaço de laranja; - concentração de açúcares fermentáveis na matéria-prima; - pH, que pode variar de 2,75 a 4,25.[0050] In this process, it is essential to consider several factors that can influence the adaptation of the microorganism to the environment, such as: - temperature, which directly affects the growth rate; - composition of orange pomace; - concentration of fermentable sugars in the raw material; - pH, which can vary from 2.75 to 4.25.
[0051] Esta etapa apresenta alguns pontos de destaque: - A presença de D-glicose, D-frutose e de outros açúcares fermentáveis em quantidades adequadas e a baixa quantidade da lignina nos hidrolisados da Xac do bagaço da laranja possibilitam seu uso direto na produção do bioetanol-2G sem necessidade da etapa da detoxicação; - O uso de co-culturas de uma levedura comercial (Saccharomyces cerevisiae) com ao menos uma cepa de levedura isolada do bagaço da laranja selecionada dentre Candida parapsilosis IFM 48375 e Candida parapsilosis NRRL Y-12969 para fermentar os hidrolisados. Em concretizações preferidas, utilizou-se uma quantidade de cada tipo de levedura inoculada em fermentador em torno de 1 x 108 células por mL. Não é encontrado no estado da técnica referências sobre exploração de uso de cepas de leveduras isoladas da própria matéria prima (neste caso, do bagaço da laranja); - O uso de co-fermentação aplicando-se leveduras comerciais e as isoladas do bagaço da laranja em co-culturas resultou em rendimentos altos do bioetanol-2G em um período de 6 horas.[0051] This step presents some highlights: - The presence of D-glucose, D-fructose and other fermentable sugars in adequate amounts and the low amount of lignin in the hydrolysates of Xac from orange pomace enable its direct use in production of 2G-bioethanol without the need for the detoxification step; - The use of co-cultures of a commercial yeast (Saccharomyces cerevisiae) with at least one yeast strain isolated from orange pomace selected among Candida parapsilosis IFM 48375 and Candida parapsilosis NRRL Y-12969 to ferment the hydrolysates. In preferred embodiments, an amount of each fermenter pitched yeast type of around 1 x 10 8 cells per ml was used. There are no references in the state of the art on exploring the use of yeast strains isolated from the raw material itself (in this case, from orange pomace); - The use of co-fermentation applying commercial yeasts and those isolated from orange pomace in co-cultures resulted in high yields of bioethanol-2G in a period of 6 hours.
[0052] Destacam-se alguns pontos, a saber: - Utilização de grande quantidade de resíduos da indústria dos cítricos (bagaço da laranja) e dos bioresíduos gerados na fermentação para obtenção de produtos nobres: bioetanol-2G, nanocelulose, hesperidina e de óleo essencial; - O nano-biomaterial (nanocelulose e nanofibras) apresenta largura média de 200 nm e rendimento total cerca de 3% (g g-1 do bagaço da laranja seco), sendo que um rendimento de 2,5% (g g-1 do bagaço da laranja seco) é obtido para a nanocelulose cristalina e um rendimento de 0,5% (g g-1 do bagaço da laranja seco) para as nanofibras de celulose; - A hesperidina isolada do bagaço da laranja compõe 1,8% (g g-1) do bagaço da laranja seco. Análises foram realizadas e demonstraram alta pureza da hesperidina e comprovaram a sua estrutura.[0052] Some points are highlighted, namely: - Use of large amounts of waste from the citrus industry (orange pomace) and biowaste generated in fermentation to obtain noble products: bioethanol-2G, nanocellulose, hesperidin and oil essential; - The nano-biomaterial (nanocellulose and nanofibers) has an average width of 200 nm and a total yield of about 3% (g g-1 of dried orange bagasse), with a yield of 2.5% (g g-1 of dried orange bagasse) is obtained for crystalline nanocellulose and a yield of 0.5% (g g-1 of dried orange bagasse) for cellulose nanofibers; - Hesperidin isolated from orange pomace makes up 1.8% (g g-1) of dried orange pomace. Analyzes were performed and demonstrated high purity of hesperidin and confirmed its structure.
[0053] O bagaço da laranja que compreende casca, sementes e endocarpo é representado pelos referidos três tipos de resíduos semi-sólidos. Todos os resíduos são guardados a uma temperatura de -20 °C. As amostras de bagaço de laranja homogeneizadas são analisadas para a determinação de quantidades de proteínas e pectina, cinzas e de fibras do tipo NDF (Neutral Detergent Fiber), ADF (Acid Detergent Fiber) e ADL (Acid Detergent Lignins). Desta forma, são determinadas as quantidades de celulose, hemicelulose e lignina. A umidade e os sólidos totais de bagaço de laranja são determinados pelo procedimento padrão recomendado pela NREL. Estes resíduos são triturados em um processador para a obter partículas com diâmetros menores do que 2 a 3 mm.[0053] Orange pomace comprising peel, seeds and endocarp is represented by the aforementioned three types of semi-solid waste. All waste is stored at -20 °C. Samples of homogenized orange pomace are analyzed to determine amounts of proteins and pectin, ash and NDF (Neutral Detergent Fiber), ADF (Acid Detergent Fiber) and ADL (Acid Detergent Lignins) fibers. In this way, the amounts of cellulose, hemicellulose and lignin are determined. Moisture and total solids of orange pomace are determined by the standard procedure recommended by NREL. These residues are crushed in a processor to obtain particles with diameters smaller than 2 to 3 mm.
[0054] Foram isolados 20 micro-organismos a partir do bagaço da laranja in natura e destes, dois tiveram habilidade em fermentar e produzir o bioetanol de segunda geração durante o processo de fermentação como será apresentado mais adiante. As duas leveduras foram identificadas por sequenciamento de genes do operon de RNA ribossomal (18S) e análise filogenética, conduzidos no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA, Campinas, SP) como Candida parapsilosis IFM 48375 e Candida parapsilosis NRRL Y-12969.[0054] 20 microorganisms were isolated from fresh orange pomace and of these, two were able to ferment and produce second-generation bioethanol during the fermentation process, as will be presented later. The two yeasts were identified by gene sequencing of the ribosomal RNA operon (18S) and phylogenetic analysis, conducted at the Pluridisciplinary Center for Chemical, Biological and Agricultural Research (CPQBA, Campinas, SP) as Candida parapsilosis IFM 48375 and Candida parapsilosis NRRL Y- 12969.
[0055] O óleo essencial do bagaço da laranja é extraído por meio da técnica de arraste a vapor. O vapor produzido no balão de destilação é passado por cerca de 20 minutos pelo frasco contendo 20 g do bagaço da laranja triturado e coletado em forma de destilado líquido. O óleo é separado da água em um funil de separação utilizando-se éter etílico como solvente. O extrato orgânico é seco com sulfato de sódio anidro e o éter é evaporado. O óleo extraído é analisado por cromatografia gasosa acoplada e espectrometria de massas (GC-MS).[0055] The essential oil of orange pomace is extracted using the steam dragging technique. The steam produced in the distillation flask is passed for about 20 minutes through the flask containing 20 g of crushed orange pomace and collected in the form of liquid distillate. The oil is separated from the water in a separatory funnel using ethyl ether as the solvent. The organic extract is dried over anhydrous sodium sulfate and the ether is evaporated. The extracted oil is analyzed by coupled gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS).
[0056] Sendo que: - O solvente orgânico apolar é selecionado dentre éter de petróleo, n-hexano, éter etílico, preferivelmente éter etílico.[0056] Wherein: - The apolar organic solvent is selected from petroleum ether, n-hexane, ethyl ether, preferably ethyl ether.
[0057] 200 g do bagaço da laranja são secos em forno a uma temperatura de em torno de 70 °C para remoção da água e 20 g desse bagaço são postos em um cartucho de extração no extrator de Soxhlet. O extrator de Soxhlet é equipado com um balão de fundo redondo de 500 mL contendo 250 mL de metanol e a extração é conduzida por 3 horas. O metanol é evaporado no evaporador rotativo até a consistência de xarope e, então, são adicionados 50 mL de ácido acético 6%. O precipitado sólido de cor amarela contém hesperidina. A hesperidina é recristalizada utilizando-se uma solução de 5% da hesperidina isolada e crua em dimetilsulfóxido. Após aquecer a solução a uma temperatura de em torno de 70 °C, é adicionada água destilada gota a gota, sob agitação constante. A solução resultante é deixada à temperatura do ambiente e os cristais brancos são precipitados. A hesperidina recristalizada é analisada por espectroscopia no infra-vermelho (FT-IR) e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR).[0057] 200 g of orange pomace are dried in an oven at a temperature of around 70 °C to remove the water and 20 g of this pomace are placed in an extraction cartridge in the Soxhlet extractor. The Soxhlet extractor is equipped with a 500 mL round bottom flask containing 250 mL of methanol and the extraction is conducted for 3 hours. The methanol is evaporated on the rotary evaporator to syrup consistency and then 50 mL of 6% acetic acid is added. The yellow colored solid precipitate contains hesperidin. Hesperidin is recrystallized using a 5% solution of isolated and crude hesperidin in dimethylsulfoxide. After heating the solution to a temperature of around 70 °C, distilled water is added drop by drop, under constant stirring. The resulting solution is left at room temperature and white crystals are precipitated. The recrystallized hesperidin is analyzed by infrared spectroscopy (FT-IR) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy.
[0058] Sendo que: - A secagem do bagaço da laranja é realizada a uma temperatura suficiente para a remoção da água, compreendida em uma faixa de 70 a 80 °C, preferencialmente 70 °C. - A extração com éter de petróleo é realizada a uma temperatura compreendida na faixa compreendida de 40 a 60 °C, preferencialmente 60 °C, e por um período compreendido entre 3 a 6 horas, preferencialmente 4 horas. - a extração com um componente alcoólico C1-2 selecionado dentre metanol ou etanol, preferencialmente metanol. - O ácido acético é adicionado em uma faixa de concentração compreendida entre 4 a 8%, preferencialmente 6%. - A solução da hesperidina isolada e crua empregada na etapa de recristalização compreende uma concentração na faixa de 4 a 12%, preferencialmente 5%. - O solvente ou solução empregada na etapa da recristalização é selecionado dentre dimetilformamida, formamida, dimetilsulfóxido, e dimetilsulfóxido:metanol (1:1, v v-1), preferencialmente dimetilsulfóxido. - O aquecimento da solução obtida após a etapa de recristalização é realizado a uma temperatura compreendida na faixa de 60 a 80 °C.[0058] Wherein: - The drying of the orange pomace is carried out at a temperature sufficient to remove the water, comprised in a range of 70 to 80 °C, preferably 70 °C. - Extraction with petroleum ether is carried out at a temperature between 40 and 60 °C, preferably 60 °C, and for a period between 3 and 6 hours, preferably 4 hours. - extraction with a C1-2 alcoholic component selected from methanol or ethanol, preferably methanol. - Acetic acid is added in a concentration range comprised between 4 to 8%, preferably 6%. - The isolated and crude hesperidin solution used in the recrystallization step comprises a concentration in the range of 4 to 12%, preferably 5%. - The solvent or solution used in the recrystallization step is selected from among dimethylformamide, formamide, dimethylsulfoxide, and dimethylsulfoxide:methanol (1:1, v v-1), preferably dimethylsulfoxide. - Heating the solution obtained after the recrystallization step is carried out at a temperature in the range of 60 to 80 °C.
[0059] As enzimas bacterianas da Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) contendo glicosidase, pectinase e celulase são utilizadas na hidrólise do bagaço de laranja. Utilizando a cultura de células da Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é produzido o extrato de proteínas dessa bactéria, o qual é dialisado e liofilizado. O bagaço é hidrolisado usando esse extrato (30 mg para cada 100 g do bagaço in natura) durante o tempo de 24 horas, a uma temperatura de 45 °C, a uma agitação de 10 a 15 rpm e sem adição de tampão. O pH inicial é de pH 4,8 e o final, em torno de pH 4,0.[0059] Bacterial enzymes from Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) containing glycosidase, pectinase and cellulase are used in the hydrolysis of orange pomace. Using cell culture of Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) the protein extract of this bacterium is produced, which is dialyzed and lyophilized. The bagasse is hydrolyzed using this extract (30 mg for each 100 g of bagasse in natura) for 24 hours, at a temperature of 45 °C, stirring at 10 to 15 rpm and without adding a buffer. The initial pH is pH 4.8 and the final one, around pH 4.0.
[0060] A concentração inicial de açúcares totais é determinada e a fermentação é conduzida em um equipamento de 5 L (fermentador) mantendo a temperatura constante em 35 °C. A presença de D-glicose, D-frutose e de outros açúcares fermentáveis (totalizando 24 g L-1) em quantidades adequadas e a baixa quantidade da lignina nos hidrolisados da Xac do bagaço da laranja possibilitam seu uso direto na produção de bioetanol de segunda geração sem necessidade da etapa da detoxicação. É importante ressaltar que tendo em vista uma conversão total dos açúcares fermentáveis em bioetanol de segunda geração, pode-se esperar obter até 12,3 g L-1 do etanol, apresentando um rendimento de 100%. As proteínas presentes nestes hidrolisados podem atuar como nutrientes orgânicos que permitam o crescimento de leveduras favorecendo o processo da fermentação submersa. O bagaço hidrolisado é filtrado por meio de fibra de filtro de vidro 1,2 mm e em seguida fermentado. Nos ensaios da produção do bioetanol-2G via fermentação com co-culturas, os hidrolisados do bagaço da laranja são inoculados com dois tipos de leveduras, sendo uma delas a levedura comercial e a outra uma das duas cepas isoladas. As leveduras (Saccharomyces cerevisiae e Candida parapsilosis sp.) são inoculadas em 5% v v-1 de cada uma e as quantidades de açúcares fermentáveis (D-glucose e D-frutose) e do bioetanol de segunda geração são monitoradas por HPLC usando curvas padrão.[0060] The initial concentration of total sugars is determined and the fermentation is conducted in a 5 L equipment (fermentor) maintaining a constant temperature at 35 °C. The presence of D-glucose, D-fructose and other fermentable sugars (totaling 24 g L-1) in adequate amounts and the low amount of lignin in the hydrolyzates of Xac from orange pomace enable its direct use in the production of second-rate bioethanol generation without the need for the detoxification step. It is important to point out that considering a total conversion of fermentable sugars into second-generation bioethanol, one can expect to obtain up to 12.3 g L-1 of ethanol, with a yield of 100%. The proteins present in these hydrolysates can act as organic nutrients that allow the growth of yeasts favoring the submerged fermentation process. The hydrolyzed bagasse is filtered through a 1.2 mm glass fiber filter and then fermented. In the tests for the production of 2G-bioethanol via fermentation with co-cultures, the orange pomace hydrolysates are inoculated with two types of yeast, one of which is the commercial yeast and the other one of the two isolated strains. Yeasts (Saccharomyces cerevisiae and Candida parapsilosis sp.) are inoculated at 5% v v-1 each and the amounts of fermentable sugars (D-glucose and D-fructose) and second generation bioethanol are monitored by HPLC using curves pattern.
[0061] A partir dos bioresíduos sólidos do bagaço da laranja obtidos após a hidrólise e a produção do bioetanol de segunda geração, pode-se obter mais um produto de alto valor agregado, a nanocelulose. O procedimento do isolamento deste nanobiomaterial é executado da seguinte maneira: os resíduos sólidos (5 g), separados por filtração (Merck Millipore, filtro de 0,2 mm) são processados na etapa do branqueamento utilizando primeiramente solução de 4% de hidróxido de sódio, NaOH. Esta suspensão é posta em autoclave (120 °C) por 20 minutos, filtrada e lavada com a água destilada. Em seguida, adiciona-se a solução de clorito de sódio, NaClO2, em concentração de 1,7% (m v-1) e pH 4,5. A suspensão é novamente autoclavada em uma temperatura de 120 °C por 20 minutos e filtrada. A amostra sólida é lavada com água destilada. Em seguida, as fibras são suspensas em água destilada e sonicadas durante 10 minutos utilizando 40% de pulso de 750 We de 20 kHz (Sonics Vibra Cell); centrifugadas a 15000 rpm por 15 minutos e secas em um liofilizador (Terroni). As nanofibras obtidas após a liofilização dos bioresíduos são de coloração branca e de massa ultra-leve.[0061] From the solid biowaste of orange bagasse obtained after hydrolysis and the production of second-generation bioethanol, it is possible to obtain another product of high added value, nanocellulose. The procedure for isolating this nanobiomaterial is carried out as follows: the solid residues (5 g), separated by filtration (Merck Millipore, 0.2 mm filter) are processed in the bleaching stage using firstly a 4% sodium hydroxide solution , NaOH. This suspension is placed in an autoclave (120 °C) for 20 minutes, filtered and washed with distilled water. Then, the sodium chlorite solution, NaClO2, is added at a concentration of 1.7% (m v-1) and pH 4.5. The suspension is again autoclaved at a temperature of 120 °C for 20 minutes and filtered. The solid sample is washed with distilled water. Next, the fibers are suspended in distilled water and sonicated for 10 minutes using a 40% pulse of 750 We at 20 kHz (Sonics Vibra Cell); centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes and dried in a lyophilizer (Terroni). The nanofibers obtained after lyophilizing the biowaste are white in color and have an ultra-light mass.
[0062] Sendo que: - A etapa de branqueamento utiliza uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) em uma concentração compreendida na faixa de 3 a 5%, preferencialmente 4%. - As etapas de autoclavagem são conduzidas a uma temperatura compreendida na faixa de 100 a 130 °C, preferivelmente 120 °C, e por um período compreendido na faixa de 15 a 30 minutos, preferivelmente 20 minutos. - A solução de clorito de sódio (NaClO2) é adicionada em uma concentração compreendida na faixa de 1 a 2%, preferivelmente 1,7% (m v-1) , e em um pH compreendido entre 3 a 5, preferivelmente pH 4,5. - o nanobiomaterial obtido pode ser usado na preparação de produtos alimentícios, produtos cosméticos, produtos de limpeza, compósitos de materiais, materiais de revestimento de papel e cartão, dentre outros.[0062] Where: - The bleaching step uses a sodium hydroxide solution (NaOH) at a concentration in the range of 3 to 5%, preferably 4%. - The autoclaving steps are carried out at a temperature comprised in the range of 100 to 130 °C, preferably 120 °C, and for a period comprised in the range of 15 to 30 minutes, preferably 20 minutes. - The sodium chlorite solution (NaClO2) is added in a concentration comprised in the range of 1 to 2%, preferably 1.7% (m v-1), and in a pH comprised between 3 to 5, preferably pH 4, 5. - the nanobiomaterial obtained can be used in the preparation of food products, cosmetic products, cleaning products, composite materials, coating materials for paper and cardboard, among others.
[0063] O processo é ilustrado conforme Figura 1.[0063] The process is illustrated as shown in Figure 1.
[0064] O bagaço da laranja é triturado e submetido ao arraste a vapor (H2O) para isolamento de óleo essencial que é separado usando um solvente orgânico apolar sendo que a fase polar (água) é reutilizada.[0064] The orange pomace is crushed and subjected to steam entrainment (H2O) for isolation of essential oil that is separated using a nonpolar organic solvent and the polar phase (water) is reused.
[0065] Em seguida, é usado etanol ou metanol para extração de hesperidina, constituindo uma fase alcoólica. Esta fase alcoólica é coletada e concentrada para cristalização da hesperidina. A hesperidina é re-cristalizada utilizando o seguinte procedimento.[0065] Then, ethanol or methanol is used to extract hesperidin, constituting an alcoholic phase. This alcoholic phase is collected and concentrated for hesperidin crystallization. Hesperidin is recrystallized using the following procedure.
[0066] O bagaço de laranja triturado é diluído com água e realiza-se a hidrólise em que são adicionadas enzimas em forma de coquetel proveniente da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac).[0066] The crushed orange pomace is diluted with water and hydrolysis is carried out in which enzymes are added in the form of a cocktail from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac).
[0067] A hidrólise é conduzida a uma temperatura de 45 °C durante um período de 24 horas em que uma parte líquida é gerada. Esta parte líquida que contém açúcares fermentáveis é inoculada com co-culturas de Saccharomyces cerevisiae e uma das leveduras isoladas. Realiza-se fermentação conduzida a uma temperatura de 35 °C durante um período de 6 horas.[0067] The hydrolysis is conducted at a temperature of 45 °C for a period of 24 hours in which a liquid part is generated. This liquid part, which contains fermentable sugars, is inoculated with co-cultures of Saccharomyces cerevisiae and one of the isolated yeasts. Fermentation carried out at a temperature of 35 °C for a period of 6 hours.
[0068] A fase líquida que contém bioetanol de segunda geração é destilada para isolar etanol em desejada concentração, dependendo do seu uso.[0068] The liquid phase containing second generation bioethanol is distilled to isolate ethanol in desired concentration depending on its use.
[0069] O resíduo sólido formado após a hidrólise e a fermentação é processado para o isolamento e obtenção da nanocelulose em forma de nanocristais e nanofibras. Toda água usada no processo é reciclada.[0069] The solid residue formed after hydrolysis and fermentation is processed to isolate and obtain nanocellulose in the form of nanocrystals and nanofibers. All water used in the process is recycled.
[0070] Uma tonelada do bagaço da laranja pode gerar até 3 kg de óleo essencial, 3,6 kg da hesperidina, 7 kg de nanocelulose e até 60 L de etanol de segunda geração.[0070] One ton of orange bagasse can generate up to 3 kg of essential oil, 3.6 kg of hesperidin, 7 kg of nanocellulose and up to 60 L of second-generation ethanol.
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