BR102013032585A2 - process of obtaining bioethanol, speridine and nanocellulose from orange pomace - Google Patents
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Abstract
processo de obtenção de bioetanol, esperidina e nanocelulose a partir de bagaço de laranja. a presente invenção refere-se a um processo de produção de bioetanol a partir de resíduos obtidos em indústrias que processam derivados de laranja. ainda, este processo pode oferecer outros produtos de interesse do mercado atual, nanocelulose e esperidina. além disso, a presente invenção se, refere ao uso de um novo coquetel de enzimas para realização da etapa de hidrólise ede uma nova composição de leveduras para realização da etapa de fermentação do dito processo.process of obtaining bioethanol, speridine and nanocellulose from orange pomace. The present invention relates to a process for producing bioethanol from residues obtained from industries processing orange derivatives. This process may also offer other products of interest to the current market, nanocellulose and speridine. furthermore, the present invention relates to the use of a novel enzyme cocktail for performing the hydrolysis step and a novel yeast composition for performing the fermentation step of said process.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PROCESSO DE OBTENÇÃO DE BIOETANOL, ESPERIDINA E NANOCELULOSE A PARTIR DE BAGAÇO DE LARANJA” [001 j A presente invenção refere-se ajum processo de produção de bioetanol, esperidina e nanocelulose a partir de resíduos obtidos em indústrias que processam ! derivados de laranja. A presente invenção se refere, ainda, ao uso de uma nova ] j composição de leveduras isoladas do bagaço de laranja para a realização da etapa de fermentação do dito processo como também, ao uso de um coquetel de enzimas j [ isoladas da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citrí para a realização da etapa da hidrólise do processo proposto.Invention Patent Report for "BIOETHANOL, SPERIDINE AND NANOCELLULOSE OBTAINING PROCESS FROM ORANGE PACK" This invention relates to a process for producing bioethanol, speridine and nanocellulose from industrially obtained residues. that process! orange derivatives. The present invention further relates to the use of a novel composition of yeast isolated from orange pomace for performing the fermentation step of said process as well as the use of a cocktail of enzymes isolated from the bacterium Xanthomonas axonopodis. pv. citrí for the hydrolysis step of the proposed process.
DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICADESCRIPTION OF TECHNICAL STATE
[002] O Brasil é atualmente o maior produtor e exportador mundial de laranja. Porém, um dos principais problemas enfrentados pelas indústrias processadoras de derivados de laranja é o grande volume de resíduos, já que após a extração do suco, o bagaço da laranja ainda representa 50% do total da fruta. O bagaço da laranja apresenta baixo custo, alta quantidade de carboidratos e alta susceptibilidade à hidrólise enzimática.[002] Brazil is currently the world's largest producer and exporter of oranges. However, one of the main problems faced by orange processing industries is the large volume of waste, since after the extraction of the juice, orange marc still represents 50% of the total fruit. Orange bagasse has low cost, high carbohydrate content and high susceptibility to enzymatic hydrolysis.
[003] Ainda, o Brasil se destaca na produção de etanol apresentando resultados interessantes, desde a pesquisa de variedades de matéria-prima de maior rendimento até a fabricação de motores que funcionam com qualquer mistura de gasolina e etanol. No entanto, com a elevação dos preços das matérias primas agrícolas e dos alimentos nos últimos anos, passou-se a questionar a demanda de produtos agrícolas na obtenção de biocombustíveis. Neste sentido, a utilização de outras fontes de energia vem sendo investigada como, por exemplo, os resíduos de óleo de soja, gordura vegetai hidrogenada oriunda de trituras, gorduras de várias procedências e bagaços de frutas.[003] Still, Brazil excels in ethanol production with interesting results, from researching varieties of higher yielding raw materials to manufacturing engines that work with any mixture of gasoline and ethanol. However, with the rise in the prices of agricultural raw materials and food in recent years, the demand for agricultural products for biofuels has been questioned. In this sense, the use of other energy sources has been investigated, such as soybean oil residues, hydrogenated vegetable fat from crumbs, fats of various origins and fruit cake.
[004] O bioetanol representa a segunda geração de biocombustíveis. A primeira geração requer a utilização de produtos agrícolas como matéria-prima. Já a segunda geração utiliza resíduos agrícolas e agroindustriais como ínsumo na produção de biocombustíveis. Algumas empresas e instituições de pesquisa vêm estudando esta nova frente a fim de utilizar biomassa e resíduos agrícolas das empresas para produção ü de novos produtos e ainda reduzir o impacto que estes resíduos podem causar no meio ambiente.[004] Bioethanol represents the second generation of biofuels. The first generation requires the use of agricultural products as raw material. Already the second generation uses agricultural and agro-industrial waste as input in the production of biofuels. Some companies and research institutions have been studying this new front in order to use companies' biomass and agricultural residues to produce new products and to reduce the impact that these residues can have on the environment.
[005J Um dos documentos que descreve processo de produção de etanol a partir de resíduos de processamento de citrus é o US 2006/0177916. Este documento apresenta impregnação de ácido sulfúrico diiuído na fase hidrolítica. Ainda, utiliza somente uma cepa de levedura comercial na etapa de fermentação. Este processo provoca liberação de fragmentos de lignina e ainda necessita de uma etapa adiciona! para detoxicação da biomassa hidrolisada.One of the documents describing ethanol production process from citrus processing residues is US 2006/0177916. This document discloses impregnation of diiuid sulfuric acid in the hydrolytic phase. Also, it uses only one commercial yeast strain in the fermentation step. This process causes release of lignin fragments and still needs an added step! for detoxification of hydrolyzed biomass.
[006] Outro documento que trata de assunto similar a presente invenção é o US 8,252,566. Este documento se refere a produção de etanol a partir de resíduos de processamento de citrus por meio de redução de quatidade do d-limoneno. Este processo apresenta etapa de detoxicação e ainda com uso de catalisador. Além disso, utiliza micro-organismo contendo o DNA recombinante.Another document dealing with a similar subject to the present invention is US 8,252,566. This document relates to the production of ethanol from citrus processing residues by reducing d-limonene quantity. This process has a detoxification stage and also using a catalyst. In addition, it uses microorganism containing recombinant DNA.
[007] Outra solução encontrada é descrita no documento US 8,372,614. Este documento descreve uma produção de etanol a partir de resíduos de processamento de citrus que apresenta etapa necessária de remoção de d-limoneno e uso de microorganismo geneticamente modificado.Another solution found is described in US 8,372,614. This document describes an ethanol production from citrus processing residues that has the necessary step of d-limonene removal and use of genetically modified microorganism.
[008] Por fim, os documentos BRQ7047G8 e BR1Q01761 se referem a um processo que utiliza metanol para extração de espiridina a partir de polpa cítrica peletizada e resíduos de polpa cítrica, notadamente casca de laranja.Finally, documents BRQ7047G8 and BR1Q01761 refer to a process using methanol for extracting spiridine from pelletized citrus pulp and citrus pulp residues, notably orange peel.
[009] Desta maneira, não existe no estado da técnica, um processo de produção de bioetanol que apresenta as vantagens técnicas e econômicas presentes no processo da presente invenção.Thus, there is no prior art bioethanol production process which has the technical and economic advantages present in the process of the present invention.
OBJETIVOS DA INVENÇÃOOBJECTIVES OF THE INVENTION
[0010] É um dos objetivos da presente invenção prover um processo de produção de bioetanol que proporciona bom rendimento em tempo inferior ao que é conhecido, além de apresentar baixo custo para realização.It is an object of the present invention to provide a bioethanol production process which provides good yield in less time than is known, and has low cost to perform.
[0011] É outro objetivo da presente invenção proporcionar um excelente substituto para combustíveis clássicos como aqueles oriundos de petróleo e derivados.It is another object of the present invention to provide an excellent substitute for classic fuels such as those derived from petroleum and derivatives.
[Ü012JÉ ainda outro objetivo da presente invenção proporcionar um processo que utiliza biomassa e resíduos oriundos da indústria de processamento de derivados de laranja a fim de produzir biocombustível de alta qualidade.It is yet another object of the present invention to provide a process that utilizes biomass and waste from the orange processing industry to produce high quality biofuel.
[0013] É um objetivo adicional da presente invenção proporcionar um processo que oferece outros produtos além de bioetanol, de forma a reaproveitar os resíduos sólidos obtidos após as etapas tanto de hidrólise e de fermentação, com destaque a obtenção de nanocelulose, obtida pela primeira vez a partir desta biomassa.It is a further object of the present invention to provide a process which offers products other than bioethanol in order to reuse solid residues obtained after both hydrolysis and fermentation steps, especially obtaining nanocellulose obtained for the first time. from this biomass.
[0014] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma produção j i sustentável de etanol de fonte renovável que minimiza a geração de resíduos. - [0015] E também objetivo da presente invenção propiciar o uso de um extrato compreendendo proteínas (enzimas) da Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) \\ em etapa de hidrólise enzimática de bagaço da laranja para obtenção de bioetanol ou simplesmente etanol.Another object of the present invention is to provide sustainable production of renewable source ethanol that minimizes waste generation. It is also an object of the present invention to provide the use of an extract comprising proteins (enzymes) of Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) \\ in enzymatic hydrolysis of orange pomace to obtain bioethanol or simply ethanol.
[0016] Adicionalmente, a presente invenção tem como objetivo apresentar uma composição compreendendo co-cuituras de uma levedura comercial (Saccharomyces cerevísiae) com ao menos uma levedura isolada do bagaço da laranja selecionada dentre Candida parapsilosis IFM 48375 e Candida parapsilosis NRRL Y-12969.Additionally, the present invention aims to provide a composition comprising co-sieves of a commercial yeast (Saccharomyces cerevísiae) with at least one isolated orange pomace yeast selected from Candida parapsilosis IFM 48375 and Candida parapsilosis NRRL Y-12969.
[0017] É ainda objetivo da presente invenção o uso de uma composição compreendendo co-culturas de uma levedura comercial (Saccharomyces cerevísiae) com ao menos uma levedura isolada do bagaço da laranja selecionada dentre Candida parapsilosis IFM 48375 e Candida parapsilosis NRRL Y-12969 em processos de fermentação.It is a further object of the present invention to use a composition comprising co-cultures of a commercial yeast (Saccharomyces cerevísiae) with at least one isolated orange pomace yeast selected from Candida parapsilosis IFM 48375 and Candida parapsilosis NRRL Y-12969 in fermentation processes.
[0018] Ainda, é objetivo da presente invenção a produção de pelo menos quatro produtos principais: bioetanol de segunda geração, óleo essencial, esperidina e nanocelulose.Further, it is an object of the present invention to produce at least four main products: second generation bioethanol, essential oil, speridine and nanocellulose.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO h [0019] A presente invenção se refere a um processo de produção de bioetanol a partir de bagaço de laranja que compreende as seguintes etapas: (i) isolamento de micro-organismos oriundos do bagaço da laranja;BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a process for producing bioethanol from orange pomace comprising the following steps: (i) isolating microorganisms from orange pomace;
H (ii) determinação da composição química do bagaço de laranja (conteúdo de li água, cinzas, pectina, celulose, hemiceluiose, lignina, proteínas e sais); (iii) realização de hidrólise enzimática aplicando um coquetel de enzimas provenientes da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) de modo a obter monossacarídeos fermentáveis; (iv) realização de fermentação submersa por meio de aplicação de leveduras conhecidas comercialmente e isoladas do próprio bagaço da laranja em co-culturas, resultando em bioetanol. L0020] Ainda, o processo da presente invenção pode compreender etapas adicionais que resultam na obtenção de óleo essencial de laranja, esperidina e nanocelulose.H (ii) determination of the chemical composition of orange marc (content of water, ash, pectin, cellulose, hemicelluiosis, lignin, proteins and salts); (iii) enzymatic hydrolysis by applying a cocktail of enzymes from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) to obtain fermentable monosaccharides; (iv) performing submerged fermentation by applying commercially known yeasts isolated from the orange pomace itself in co-cultures, resulting in bioethanol. In addition, the process of the present invention may comprise additional steps that result in obtaining orange essential oil, speridine and nanocellulose.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
[0021] A presente invenção será descrita a seguir com mais detalhes, com referência ao desenho anexo, no qual: Figura 1: é um esquema de uma concretização preferida do processo objeto da presente invenção.[0021] The present invention will be described in more detail below with reference to the accompanying drawing in which: Figure 1 is a schematic of a preferred embodiment of the process object of the present invention.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃOBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0022] A presente invenção atinge esses e outros objetivos por meio de um processo de produção de bioetanol a partir de bagaço de laranja que compreende as etapas de: a) Triturar bagaço da laranja; b) Submeter o resultado da etapa (a) à hidrólise enzimática adicionando extrato protéico de Xanthomonas axonopodis pv. citrí (Xac 306), obtendo-se um primeiro resíduo sólido e uma parte líquida; c) Fermentar a parte ííquida usando co-culturas de uma levedura comercial (Saccharomyces cerevisiae) com ao menos uma levedura isolada do bagaço da laranja selecionada dentre Candida parapsilosis IFM 48375 e Candida parapsiiosis NRRL Y-12969, obtendo-se produtos de fermentação e um segundo resíduo sólido; e d) Destilar os produtos da fermentação, obtendo-se bioetanol-2G.The present invention achieves these and other objects by a process of producing bioethanol from orange pomace comprising the steps of: a) grinding orange pomace; b) Subjecting the result of step (a) to enzymatic hydrolysis by adding protein extract of Xanthomonas axonopodis pv. citric (Xac 306) to give a first solid residue and a liquid part; (c) Ferment the liquid part using co-cultures of a commercial yeast (Saccharomyces cerevisiae) with at least one yeast isolated from orange marc selected from Candida parapsilosis IFM 48375 and Candida parapsiiosis NRRL Y-12969 to obtain fermentation products and a second solid residue; and d) Distilling the fermentation products to obtain 2G bioethanol.
[0023] Em uma concretização preferencial, a presente invenção atinge esses e outros objetivos por meio de um processo de produção de bioetanol a partir de bagaço de laranja que compreende as seguintes etapas: e) Triturar bagaço da laranja; f) Separar bagaço triturado em uma primeira parte, uma segunda parte e uma terceira parte; g) Submeter a primeira parte a destilação por arraste de vapor, obtendo-se óleo essencial; h) Submeter a segunda parte à extração utilizando um componente alcoólico Ci-2, obtendo-se esperidina; i) Submeter a terceira parte à hidrólise enzimática adicionando extrato protéico de Xanthomonas axonopodis pv. citrí (Xac 306), obtendo-se um primeiro resíduo sólido e uma parte líquida; j) Tratar o primeiro resíduo sólido, obtendo-se nanocelulose; k) Fermentar a parte líquida usando as co-culturas de uma levedura comercial (Saccharomyces cerevisiae) com ao menos uma levedura isolada do bagaço da laranja selecionada dentre Candida parapsilosis IFM 48375 e Candida parapsilosis NRRL Y-12969, obtendo-se produtos de fermentação e um segundo resíduo sólido; l) Destilar os produtos da fermentação, obtendo-se bioetanol-2G; e m) Tratar o segundo resíduo sólido, obtendo-se nanocelulose.In a preferred embodiment, the present invention achieves these and other objects by a process of producing bioethanol from orange pomace comprising the following steps: e) grinding orange pomace; (f) separate crushed pomace into a first part, a second part and a third part; (g) subject the first part to steam distillation to obtain essential oil; (h) subjecting the second part to extraction using a C1-2 alcohol component to give speridine; (i) subject the third part to enzymatic hydrolysis by adding protein extract of Xanthomonas axonopodis pv. citric (Xac 306) to give a first solid residue and a liquid part; j) Treat the first solid residue to obtain nanocellulose; (k) Ferment the liquid part using co-cultures of a commercial yeast (Saccharomyces cerevisiae) with at least one yeast isolated from the orange pomace selected from Candida parapsilosis IFM 48375 and Candida parapsilosis NRRL Y-12969 to obtain fermentation products and a second solid residue; l) Distill the fermentation products, obtaining bioethanol-2G; and m) Treat the second solid residue to obtain nanocellulose.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURASDETAILED DESCRIPTION OF THE FIGURES
[0024] As figuras ilustram uma concretização preferencial do processo objeto da presente invenção.The figures illustrate a preferred embodiment of the process object of the present invention.
[0025] Em uma concretização preferencial, a presente invenção se refere a um processo de produção de bíoetanoi a partir de bagaço de laranja que compreende as seguintes etapas: (i) isolamento de micro-organismos oriundos do bagaço da laranja; (ii) determinação da composição química do bagaço de laranja (conteúdo de água, cinzas, pectina, celulose, hemiceiulose, lignina, proteínas e sais); (iii) realização de hidrólise enzimática aplicando um coquetel de enzimas provenientes da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citrí (Xac 306) de modo a obter monossacarídeos fermentáveis; e (iv) realização de fermentação submersa por meio de aplicação de leveduras conhecidas comercialmente e isoladas do próprio bagaço da laranja em co-culturas, resultando em bioetanol.In a preferred embodiment, the present invention relates to a process for producing bioethane from orange pomace comprising the following steps: (i) isolating microorganisms from orange pomace; (ii) determination of the chemical composition of orange pomace (water, ash, pectin, cellulose, hemiceiulose, lignin, protein and salt content); (iii) enzymatic hydrolysis by applying a cocktail of enzymes from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) to obtain fermentable monosaccharides; and (iv) performing submerged fermentation by applying commercially known yeasts isolated from the orange pomace itself in co-cultures, resulting in bioethanol.
[0026] A presente invenção tem por objetivo um processo de obtenção de: (1) etanol de segunda geração, e opcionalmente, (2) nanocelulose, (3) óleo essencial e (4) esperidina, [0027] Sendo que todos estes produtos são oriundos do uso de bagaço da laranja.The present invention is directed to a process for obtaining: (1) second generation ethanol, and optionally, (2) nanocellulose, (3) essential oil and (4) speridine, [0027] they come from the use of orange pomace.
[0028] A presente invenção propõe conversão de bagaço de laranja em bíoetanoi de segunda geração ou bioetanol-2G baseada na hidrólise enzimática e a fermentação utilizando leveduras pré-selecionadas visando baratear o custo da produção do bioetanol-2G e possibilitar que o processo como um todo seja mais verde.[0028] The present invention proposes the conversion of orange pomace into second generation bioethane or bioethanol-2G based on enzymatic hydrolysis and fermentation using pre-selected yeasts to lower the cost of bioethanol-2G production and enable the process as a all be greener.
[0029] A biomassa de bagaço de laranja pode ter novo e alto valor agregado devido à geração de quantidades significativas de esperidina, um potente bioativo, nanocelulose, um valioso bionanomaterial, e bioetanol de excelente qualidade. De acordo com o processo objeto da presente invenção, o bagaço é convertido em uma mistura de açúcares de 5- e 6- carbonos pela hidrólise, aplicando-se enzimas oriundas H da Xanthomonas axonopodis pv. Citri (Xac 306). Os açúcares fermentáveis serão fermentados usando co-culturas de levedura comercial e micro-organismos isolados do bagaço da laranja formando etanol. Os resultados apresentam ótimos rendimentos de açúcares e de bioetanol nos processos de fermentação.Orange bagasse biomass may have new and high added value due to the generation of significant amounts of speridine, a potent bioactive, nanocellulose, a valuable bionanomaterial, and excellent bioethanol. According to the process object of the present invention, the bagasse is converted to a mixture of 5- and 6-carbon sugars by hydrolysis by applying enzymes from Xanthomonas axonopodis pv H. Citri (Xac 306). Fermentable sugars will be fermented using commercial yeast co-cultures and microorganisms isolated from orange pomace forming ethanol. The results show excellent yields of sugars and bioethanol in the fermentation processes.
[0030] Em uma concretização preferencial, o processo de produção de bioetanol de segunda geração a partir de bagaço de laranja compreende as seguintes etapas; (v) isolamento de micro-organismos oriundos do bagaço da laranja;In a preferred embodiment, the process of producing second generation bioethanol from orange pomace comprises the following steps; (v) isolation of microorganisms from orange pomace;
H (vi) determinação da composição química do bagaço de ! j laranja (conteúdo de água, cinzas, pectina, cefulose, hemiceiulose, lignina, proteínas e sais); (vii) isolamento de óleo essencial oriundo do bagaço de laranja por meio de arraste a vapor e isolamento de esperidina; (viii) realização de hidrólise enzimática aplicando um coquetel de enzimas provenientes da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) de modo a obter monossacarídeos fermentáveis; (ix) realização de fermentação submersa por meio de aplicação de leveduras conhecidas comercialmente e isoladas do próprio j ; bagaço da laranja em co-culturas; (x) produção e isolamento de nanoceluíose a partir dos resíduos sólidos da hidrólise enzimática e do processo fermentativo do bagaço da laranja.H (vi) determination of the chemical composition of the bagasse of! orange (content of water, ashes, pectin, cefulose, hemiceiulose, lignin, proteins and salts); (vii) isolation of essential oil from orange pomace by steam dragging and speridine isolation; (viii) enzymatic hydrolysis by applying a cocktail of enzymes from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) to obtain fermentable monosaccharides; (ix) performing submerged fermentation by applying commercially known yeasts isolated from the same; orange pomace in co-cultures; (x) production and isolation of nanocellulose from the solid residues of enzymatic hydrolysis and the orange bagasse fermentation process.
Vantagens de destaque alcançadas com o processo da presente invenção [0031] O processo objeto da presente invenção apresenta algumas vantagens, a saber: Aspectos estratégicos: — É um excelente substituto de combustíveis clássicos como aqueles oriundos de petróleo e derivados; — Apresenta como resultado não só o bíoetanol por meio de fermentação dos produtos obtidos após hidrólise enzimática do bagaço da laranja, mas também óleo essencial, esperidina e nanoceluíose, produtos de alto valor agregado, a partir do bagaço da laranja; — O processo objeto da presente invenção utiliza enzimas obtidas do extrato protéico do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) o que possibilita a aplicação das condições brandas na hidrólise do bagaço de laranja e altos rendimentos de açúcares fermentáveis sem gerar substâncias tóxicas aos micro-organismos. Este fato evita a realização de uma etapa de detoxicação; — Aplicação de micro-organismos isolados do próprio bagaço de laranja em mono e co-culturas com o micro-organismo tradicionalmente usado em fermentação alcoólica, possibilitando a redução do tempo da fermentação para 6 horas; que comumente dura de 24-48 h. —- Este processo causa a redução de custo no tratamento enzimático da biomassa por utilizar enzimas do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. Citri (Xac 306).Outstanding advantages achieved with the process of the present invention The process object of the present invention has some advantages, namely: Strategic Aspects: It is an excellent substitute for classic fuels such as those derived from petroleum and derivatives; - As a result, it presents not only bioethanol by fermentation of products obtained after enzymatic hydrolysis of orange pomace, but also essential oil, speridine and nanocellulose, high added value products from orange pomace; The process object of the present invention utilizes enzymes obtained from the phytopathogen protein extract Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) which allows the application of mild conditions in the orange cake hydrolysis and high yields of fermentable sugars without generating toxic substances to microorganisms. This fact avoids the completion of a detoxification step; - Application of microorganisms isolated from the orange pomace itself in mono and co-cultures with the microorganism traditionally used in alcoholic fermentation, allowing the reduction of the fermentation time to 6 hours; which commonly lasts 24-48 h. —- This process causes cost reduction in enzymatic treatment of biomass by using phytopathogen enzymes Xanthomonas axonopodis pv. Citri (Xac 306).
Aspectos Econômicos e Sociais — Permite desenvolvimento da indústria para produção de etanol de segunda geração e geração de empregos; — Não apresenta competitividade de preços com os produtos alimentícios e espaços físicos na agricultura. — Aspectos Ambientais e Energéticos — Trata-se de produção sustentável do bioetanoi-2G de fonte renovável; — Promove crescimento regional sustentável; — Atenuam impactos ambientais e promove saúde ambienta! do planeta.Economic and Social Aspects - Allows development of the industry for the production of second generation ethanol and job creation; - Does not have price competitiveness with food products and physical spaces in agriculture. - Environmental and Energy Aspects - Sustainable production of renewable bioethane-2G; - Promotes sustainable regional growth; - Mitigate environmental impacts and promote environmental health! of the planet.
Com relação ao bagaço de laranja [0032] Resíduos cítricos sólidos e úmidos como o bagaço da laranja contêm entre 76-82% de água e a sua estrutura esponjosa tem elevada presença de polissacarídeos na forma de pectina, celulose e hemicelulose que se ligam a água. Sabe-se, de maneira geral, que o bagaço da laranja contém, em geral: açúcares solúveis (16,9%), amido (3,75%), fibras, tais com celulose (9,21%), hemicelulose (10,50%), lignina (0,84%) e pectina (42,50%), cinzas (3,5%), gorduras (1,95%) e proteínas (6,50%), sendo que todas as quantidades estão expressas considerando-se o peso do bagaço da laranja seco. Ainda, contém pequenas quantidades de vários compostos orgânicos como os ácidos cítrico, malônico, oxálico além de vitamina G (ácido ascórbico).With respect to orange pomace Solid and humid citrus residues such as orange pomace contain between 76-82% of water and its spongy structure has high presence of water-binding pectin, cellulose and hemicellulose polysaccharides . It is generally known that orange pomace generally contains: soluble sugars (16.9%), starch (3.75%), fibers such as cellulose (9.21%), hemicellulose (10%). 50%), lignin (0.84%) and pectin (42.50%), ashes (3.5%), fat (1.95%) and protein (6.50%), all of which are expressed considering the weight of the dried orange pomace. It also contains small amounts of various organic compounds such as citric, malonic, oxalic acids as well as vitamin G (ascorbic acid).
[0033] Ainda, várias frutas cítricas contêm diferentes bioativos, tais como a esperidina e narirutina, que são glicosídeos da flavona, e β-criptoxantina, um carotenoide, podendo também apresentar compostos fenólicos, terpenos como D-limoneno e miraceno, cálcio e potássio.Also, various citrus fruits contain different bioactive substances, such as speridine and narirutin, which are flavone glycosides, and β-cryptoxanthin, a carotenoid, and may also have phenolic compounds, terpenes such as D-limonene and miracene, calcium and potassium. .
[0034] O resíduo bagaço de laranja compreende açúcares facilmente fermentáveis, tais como: a glicose, a frutose e a sacarose e polissacarídeos insolúveis como celulose e pectina. Ainda, compreende baixos níveis de lignina tornando esta matéria prima adequada para realização de fermentação alcoólica para obtenção de etanol.The orange pomace residue comprises easily fermentable sugars such as glucose, fructose and sucrose and insoluble polysaccharides such as cellulose and pectin. Furthermore, it comprises low levels of lignin making this raw material suitable for performing alcoholic fermentation to obtain ethanol.
Com relação à esperidina [0035] Entende-se que a esperidina pode ter várias propriedades farmacêuticas importantes e atuar como um antioxidante, anti-inflamatório e anticancerígeno, pode reduzir o colesterol, a pressão sanguínea e a perda da densidade óssea. Ainda, possui propriedades protetoras contra sepse, apresenta potencial sedativo.With regard to speridine It is understood that speridine may have several important pharmaceutical properties and act as an antioxidant, anti-inflammatory and anticancer, may reduce cholesterol, blood pressure and loss of bone density. Still, it has protective properties against sepsis, presents sedative potential.
Com relação à hidrólise enzimática [0036] A biomassa ligninocelulose é um material complexo e composto por celulose, hemicelulose e lignina. A combinação da hemicelulose com a lignina resulta em uma camada protetora ao redor da celulose, que pode ser modificada ou removida para então ser realizada a etapa de hidrólise. Os processos típicos de conversão da ligninocelulose em etanol compreendem pelo menos em quatro etapas: 1. pré-tratamento para se aumentar a capacidade de degradação da biomassa; 2. hidrólise da celulose em açúcares monoméricos; 3. fermentação de açúcares em etanol; 4. recuperação do etanol por meio da destilação/evaporação.With regard to enzymatic hydrolysis Ligninocellulose biomass is a complex material composed of cellulose, hemicellulose and lignin. The combination of hemicellulose and lignin results in a protective layer around the cellulose, which can be modified or removed for the hydrolysis step to be performed. Typical processes for converting ligninocellulose to ethanol comprise at least four steps: 1. pre-treatment to increase biomass degradation capacity; 2. hydrolysis of cellulose to monomeric sugars; 3. fermentation of sugars in ethanol; 4. ethanol recovery by distillation / evaporation.
[0037] O efeito do pré-tratamento dos materiais ligninocelulósicos tem sido reconhecido como importante passo em reduzir o tempo da hidrólise. Os principais objetivos do pré-tratamento são: — redução da cristalinidade da celulose; — remoção da lignina; — aumento da porosidade dos materiais; — tornar o substrato significativamente mais suscetível à ação enzimática do que em relação ao material original.The effect of pretreatment of ligninocellulosic materials has been recognized as an important step in reducing hydrolysis time. The main objectives of pretreatment are: - reduction of cellulose crystallinity; - removal of lignin; - increased porosity of materials; - make the substrate significantly more susceptible to enzymatic action than the original material.
[0038] O pré-tratamento deve acompanhar as seguintes exigências: — melhoria na liberação de açúcares ou na habilidade para a liberação subsequente de açúcares por meio da hidrólise enzimática; — evitar a degradação ou perda de carboidratos; — retenção de aproximadamente toda a celulose presente no material original; — evitar a formação de subprodutos inibitórios à hidrólise subsequente e aos processos fermentativos; — ser efetivo em termos de custo.Pretreatment should meet the following requirements: - improvement in sugar release or ability for subsequent release of sugars by enzymatic hydrolysis; - Avoid degradation or loss of carbohydrates; - Retention of approximately all cellulose present in the original material; - avoid the formation of inhibitory by-products to subsequent hydrolysis and fermentation processes; - be cost effective.
[0039] Após o processo de pré-tratamento, há dois procedimentos usados na hidróiise da biomassa. A hidrólise utiliza tecnologias complexas e multifásicas, com base no uso de ácidos e/ou enzimas em separações dos açúcares e remoção da lignina. A produção de etanol a partir da hidrólise enzimática é a opção de baixo impacto ambiental para produção do etanol e industrialmente, este processo poderá ser i executado de modo descontínuo por hidrólise; seguida de fermentação ou em um processo simultâneo, no qual a sacarifícação e fermentação são contínuas.Following the pretreatment process, there are two procedures used in biomass hydrolysis. Hydrolysis utilizes complex and multiphase technologies based on the use of acids and / or enzymes in sugar separation and lignin removal. Ethanol production from enzymatic hydrolysis is the low environmental impact option for ethanol production and industrially, this process may be carried out discontinuously by hydrolysis; followed by fermentation or in a simultaneous process in which saccharification and fermentation are continuous.
[0040] A etapa de hidrólise enzimática para produção de bioetanol de segunda geração a partir de bagaço de laranja apresenta custos menores se comparado com o uso de hidrólise química e ainda é uma tecnologia mais verde. j j [0041] Antes da fermentação, os polímeros de celulose e hemicelulose são hidrolisados em monômeros, hexoses e pentoses. O bagaço de laranja pode ser hidrolisado em açúcares monomérícos aplicando-se a combinação de enzimas: || pectinase, celuiase e β-giicosidase. Preferencialmente, utiliza-se uma quantidade de enzimas de 5 mg de pectinase e 2 mg de celuiase por 1 g de casca seca para provocar a formação de maior quantidade de d-glicose. De acordo com testes realizados, a pectinase foi mais eficiente na hidrólise do bagaço em comparação com a celuiase, embora algumas celulases sejam indispensáveis em maximizar a produção de glicose e galactose. Sugere-se que a biomassa seja pré-tratada antes da hidrólise para separar possíveis inibidores das enzimas e facilitar a posterior degradação. Os compostos i i tóxicos como furfural, 5-hidroximetil furfural, ácidos mistos e monômeros fenólicos são liberados como resultado do procedimento de pré-tratamento a partir da celulose, hemicelulose e lignina e devem ser removidos por vários métodos de desintoxicação.[0040] The enzymatic hydrolysis step for producing second generation bioethanol from orange pomace has lower costs compared to the use of chemical hydrolysis and is still a greener technology. Prior to fermentation, the cellulose and hemicellulose polymers are hydrolyzed to monomers, hexoses and pentoses. Orange marc may be hydrolyzed to monomeric sugars by applying the enzyme combination: || pectinase, celluase and β-glycosidase. Preferably, an amount of enzymes of 5 mg pectinase and 2 mg celluase per 1 g of dry shell is used to elicit the formation of the greatest amount of d-glucose. According to tests, pectinase was more efficient in bagasse hydrolysis compared to celluiasis, although some cellulases are indispensable in maximizing glucose and galactose production. It is suggested that the biomass be pretreated prior to hydrolysis to separate possible enzyme inhibitors and facilitate further degradation. Toxic compounds such as furfural, 5-hydroxymethyl furfural, mixed acids and phenolic monomers are released as a result of the pretreatment procedure from cellulose, hemicellulose and lignin and must be removed by various detoxification methods.
[0042] Na presente invenção, utiiiza-se na etapa de hidrólise enzimática proteínas provenientes da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac, cepa 306). Esse patógeno, Gram-negativo, causa cancro cítrico entrando no seu hospedeiro (laranja) através dos estômatos e utilizando um impressionante arsenal de proteínas, incluindo pectinases e celulases, provocando severa necrose no tecido vegetal. Apesar de relatos sobre o uso de muitas bactérias e fungos para produzir coquetéis de enzimas hidrolíticas, geralmente, os fungos são considerados uma opção melhor em termos de variedade de enzimas e de rendimentos de açucares fermentáveis após a hidrólise da ligninocelulose. No entanto, a Xac também produz um coquetel de enzimas que pode ajudar na degradação da biomassa, devido às diferentes atividades hidrolíticas de suas | i enzimas. Esta etapa apresenta alguns pontos de destaque: - O uso de extrato de proteínas das enzimas da Xanthomonas axonopodis pv, citri (Xac 306) dispensa o controle de pH do meio (isto é, o uso de tampões) uma vez que o pH do meto que diminui de pH 4,1 no início da hidrólise para o pH de 3,1 sem provocar a queda na produção de açúcares fermentáveis, mostrando-se estáveis em baixos valores depH; i - O uso do extrato das ditas enzimas permite obter uma grande quantidade dos principais açúcares fermentáveis nos hidrolisados enzimãticos, neste caso, 11,5 de D-glicose e 13,2 g L' de D-frutose, o que representa uma ótima concentração de açúcares para o processo de fermentação conduzida na fase posterior quando comparada às concentrações obtidas por enzimas comerciais (respectivamente, 11,0-13,7 g L"1); Π - O coquetel de enzimas pode ser preparado utilizando cultura de células da ii Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) em meio de cultura (Luria-Sertani modificado) a 32°C durante 16 h. A cultura de células da Xac 306 pode-se então ser centrifugada e lisada por sonicação, sendo que sobrenadante deste lisado que contém as proteínas totais da Xac após ser diaíisado contra água, é liofilizado e armazenado a -20°C até ser usado, - Adicionaímente, é importante salientar que as referidas enzimas que foram utilizadas na hidrólise do bagaço da laranja demonstram alta afinidade com tal substrato e alta resistência aos traços de óleo essencial de laranja, quando presente.In the present invention, proteins from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. Are used in the enzymatic hydrolysis step. citri (Xac, strain 306). This gram-negative pathogen causes citrus cancer by entering its host (orange) through the stomata and utilizing an impressive arsenal of proteins, including pectinases and cellulases, causing severe necrosis in plant tissue. Despite reports of using many bacteria and fungi to produce hydrolytic enzyme cocktails, fungi are generally considered a better option in terms of enzyme variety and fermentable sugar yields after hydrolysis of ligninocellulose. However, Xac also produces an cocktail of enzymes that may aid in biomass degradation due to the different hydrolytic activities of its | I enzymes. This step has some highlights: - The use of protein extract from the enzymes of Xanthomonas axonopodis pv, citri (Xac 306) does not require medium pH control (ie the use of buffers) since the pH of the metho which decreases from pH 4.1 at the beginning of hydrolysis to pH 3.1 without causing a drop in the production of fermentable sugars, which is stable at low depH values; i - The use of the extract of the said enzymes allows to obtain a large amount of the main fermentable sugars in the enzymatic hydrolysates, in this case, 11.5 D-glucose and 13.2 g L 'of D-fructose, which represents an excellent concentration. of sugars for the fermentation process conducted at a later stage when compared to the concentrations obtained by commercial enzymes (respectively, 11.0-13.7 g L "1); Π - The enzyme cocktail can be prepared using cell culture. Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac 306) in culture medium (modified Luria-Sertani) at 32 ° C for 16 h The Xac 306 cell culture can then be centrifuged and lysed by sonication, with supernatant from this lysate. containing the total proteins of Xac after dialysis against water, is lyophilized and stored at -20 ° C until use. - In addition, it is important to note that these enzymes that were used in the hydrolysis of the orange pomace show high affinity for such substrate and high resistance to traces of orange essential oil when present.
Com relação à fermentação [0043] A levedura Saccharomyces cerevisiae é o micro-organismo mais utilizado na produção de etanol, considerado não patogênico (Gras), proporciona uma eficiente e rápida fermentação da D-glicose com obtenção de alta concentração de etanol.Concerning fermentation Saccharomyces cerevisiae yeast is the most widely used microorganism in the production of ethanol, considered non-pathogenic (Gras), providing an efficient and rapid fermentation of D-glucose with high concentration of ethanol.
[0044] Neste processo, é fundamental considerar vários fatores que podem influenciar na adaptação do micro-organismo ao meio, tais como: - temperatura, que afeta diretamente a taxa de crescimento; - composição do bagaço de laranja; - concentração de açúcares fermentáveis na matéria-prima; - pH, que pode variar de 2,75 a 4,25.In this process, it is essential to consider several factors that may influence the adaptation of the microorganism to the environment, such as: - temperature, which directly affects the growth rate; - composition of orange pomace; - concentration of fermentable sugars in the raw material; - pH, which may range from 2.75 to 4.25.
[0045] Esta etapa apresenta alguns pontos de destaque: - A presença de D-glicose, D-frutose e de outros açúcares fermentáveis em quantidades adequadas e a baixa quantidade da iignina nos hidroiísados da Xacdo bagaço da laranja possibilitaram seu uso direto na produção do bioetano!-2G sem necessidade da etapa da detoxicação; - O uso de co-culturas de uma levedura comercial (Saccharomyces cerevisiae) com ao menos uma cepa de levedura isolada do bagaço da laranja selecionada dentre Candida parapsilosis IFM 48375 e Candida parapsilosis NRRL Y-12969 para fermentar os hidrolisados. Em concretizações preferidas, utilizou-se uma quantidade de cada tipo de levedura inoculada em fermentador em torno de 1 x 108 células por ml, Não é encontrado no estado da técnica referências sobre exploração de uso de cepas de leveduras isoladas da própria matéria prima (neste caso, do bagaço da laranja); - O uso de co-fermentação aplicando-se leveduras comerciais e as isoladas do bagaço da laranja em co-culturas resultou em rendimentos altos do bioetanol-2G em um período de 6 horas.This step has some highlights: - The presence of D-glucose, D-fructose and other fermentable sugars in adequate quantities and the low amount of iignin in the Xacdo hydromassage of orange bagasse allowed their direct use in the production of bioethane! -2G without detoxification step required; - The use of co-cultures of a commercial yeast (Saccharomyces cerevisiae) with at least one yeast strain isolated from the orange pomace selected from Candida parapsilosis IFM 48375 and Candida parapsilosis NRRL Y-12969 to ferment the hydrolysates. In preferred embodiments, an amount of each type of fermenter-inoculated yeast was used at about 1 x 10 8 cells per ml. No references are found in the prior art to exploit the use of yeast strains isolated from the raw material itself (in this embodiment). case of orange pomace); - The use of co-fermentation using commercial yeast and orange yeast isolates in co-cultures resulted in high yields of bioethanol-2G over a period of 6 hours.
Com relação ao resultado alcançado com a realização do processo objeto da presente invenção i i [0046] Destacam-se alguns pontos, a saber: Π - Utilização de grande quantidade de resíduos da indústria dos citrus (bagaço da laranja) e dos bioresíduos gerados na fermentação para obtenção de produtos nobres: bioetanol-2G, nanoceiulose, esperidina e de óleo essencial; i j - O nano-biomaterial (nanoceiulose e nanofibras) apresenta largura média de 200 nm e i| rendimento total cerca de 3% (g g~1 do bagaço da laranja seco), sendo que um rendimento de 2,5% (g g'1 do bagaço da laranja seco) é obtido para a nanoceiulose cristalina e um rendimento de 0,5 % (g g~1 do bagaço da laranja seco) para as nanofibras da celulose; - A esperidina isolada do bagaço da laranja compõe 1,8% (g g_1) do bagaço da laranja seco. Análises foram realizadas e demonstraram alta pureza da esperidina e comprovaram a sua estrutura.With regard to the result achieved by carrying out the process object of the present invention ii [0046] A few points to highlight are: Π - Use of large quantities of residues from the citrus (orange-pomace) industry and from the biogas generated in fermentation to obtain noble products: bioethanol-2G, nanocellulose, speridine and essential oil; i j - The nano-biomaterial (nanocellulose and nanofibers) has an average width of 200 nm and i | total yield about 3% (gg ~ 1 of dried orange pomace), with a yield of 2.5% (gg'1 of dried orange pomace) being obtained for crystalline nanocellulose and a yield of 0.5 % (gg ~ 1 of dried orange pomace) for cellulose nanofibers; - Isolated orange pomace speridine makes up 1.8% (g g_1) of dried orange pomace. Analyzes were performed and showed high purity of speridine and proved its structure.
Exemplos da presente invenção [0047] Os exemplos que descritos se referem a concretizações preferenciais da invenção e nao devem ser entendidos como limitantes do escopo da invenção. ί Μ Exemplo 01 Preparação de Bagaço de laranja [0048] O bagaço da laranja que compreende casca, sementes e endocarpo é representado pelos referidos três tipos de resíduos semi-sólidos. Todos os resíduos são guardados a uma temperatura de -20 °G. As amostras de bagaço de laranja homogeneizadas são analisadas para a determinação de quantidades de proteínas e pectina, cinzas e de fibras do tipo NDF (Neutral Detergent Fiber), ADF (Acid Detergent Fiber) e ADL (Acid Detergent Lignins). Desta forma, são determinadas as quantidades de celulose, hemicelulose e íignina. A umidadeie os sólidos totais de bagaço de laranja lj são determinados pelo procedimento padrão recomendado pela NREL. Estes resíduos sao triturados em um processador de foram a óbter partículas com diâmetros menores do que 2 a 3 mm. i i Preparação das Leveduras || [0049] Foram isolados 20 micro-organismos a partir do bagaço da laranja in natura e destes, dois tiveram habilidade em fermentar e produzir o bioetanol de segunda geração durante o processo de fermentação como será apresentado maia adiante. As duas leveduras foram identificadas por seqüenciamento de genes do operon de RNA ribosomal (18S) e análise filogenética, conduzidos no Centro Pfuridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA, Campinas, SP) como Candida parapsilosis IFM 48375 e Candida parapsilosis NRRL Y-12969.Examples of the present invention The examples described refer to preferred embodiments of the invention and are not to be construed as limiting the scope of the invention. Example 01 Preparation of Orange Bagasse Orange bagasse comprising peel, seeds and endocarp is represented by the three types of semi-solid waste. All residues are stored at a temperature of -20 ° C. Homogenized orange pomace samples are analyzed for protein and pectin, ash, and NDF (Neutral Detergent Fiber), ADF (Acid Detergent Fiber), and ADL (Acid Detergent Lignins) quantities. Thus, the amounts of cellulose, hemicellulose and ignin are determined. Moisture and total orange cake solids lj are determined by the standard procedure recommended by NREL. These residues are crushed in a processor to obtain particles with diameters smaller than 2 to 3 mm. i i Yeast Preparation || Twenty microorganisms were isolated from fresh orange pomace and of these, two had the ability to ferment and produce second generation bioethanol during the fermentation process as will be presented below. Both yeasts were identified by ribosomal RNA operon (18S) gene sequencing and phylogenetic analysis, conducted at the Pfuridisciplinary Center for Chemical, Biological and Agricultural Research (CPQBA, Campinas, SP) as Candida parapsilosis IFM 48375 and Candida parapsilosis NRRL Y- 12969.
Etapa de extração do óleo essencial do bagaço da laranja [0050] O óleo essencial do bagaço da laranja é extraído por meio da técnica de arraste a vapor. O vapor produzido no balão de destilação é passado por cerca de 20 minutos pelo frasco contendo 20 g do bagaço da laranja triturado e coletado em forma de destilado líquido. O óleo é separado da água em um funil de separação utilizando-se éter etílico como solvente. O extrato orgânico é seco com sulfato de sódio anidro e o éter é evaporado. O óleo extraído é analisado por cromatografia gasosa acoplada e espectrometria de massas (GC-MS).Extraction step of orange pomace essential oil The orange pomace essential oil is extracted using the steam drag technique. The steam produced in the distillation flask is passed for about 20 minutes through the flask containing 20 g of crushed orange pomace and collected as a liquid distillate. The oil is separated from water in a separatory funnel using ethyl ether as a solvent. The organic extract is dried with anhydrous sodium sulfate and the ether is evaporated. The extracted oil is analyzed by coupled gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS).
[0051] Sendo que: — o solvente orgânico apoiar é selecionado dentre éter de petróleo, n-hexano, éter etílico, preferivelmente éter etílico.Where: - the supporting organic solvent is selected from petroleum ether, n-hexane, ethyl ether, preferably ethyl ether.
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Etapa de extração de esperidina do bagaço da laranja || [0052] 200 g do bagaço da laranja são secos em forno a uma temperatura de em torno de 7Q°C para remoção da água e 20 g desse bagaço são postos em um cartucho de extração no extrator de Soxhlet. O. extrator de Soxhlet será equipado com um balão de fundo redondo de 500 mL contendo 250 mL de metanol e a extração é conduzida por 3 horas. O metanol é evaporado no evaporador rotativo até a consistência de xarope e, então, são adicionados 50 mL dé ácido acético 6%. O precipitado sólido I í de cor amarela contém esperidina. A esperidina é recristalizada utilizando-se uma solução de 5% da esperidina isolada e crua em dimetilsulfóxido. Após aquecer a solução a uma temperatura de em torno de 70"C, é adicionada água destilada gota a gota, sob agitação constante. A solução resultante é deixada à temperatura ambiente e os cristais brancos precipitarão. A esperidina recristalizada é analisada por espectroscopia de infra-vermelho (FT-IR) e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR).Orange Bagasse Speridine Extraction Step || [0052] 200 g of the orange pomace is oven dried at a temperature of around 7 ° C to remove water and 20 g of that pomace is placed in an extraction cartridge in the Soxhlet extractor. The Soxhlet extractor will be equipped with a 500 mL round bottom flask containing 250 mL methanol and extraction is conducted for 3 hours. Methanol is evaporated on the rotary evaporator to syrup consistency and then 50 mL of 6% acetic acid is added. The solid yellow precipitate contains speridine. Speridine is recrystallized using a 5% solution of isolated raw speridine in dimethyl sulfoxide. After heating the solution to a temperature of about 70 ° C, distilled water is added dropwise under constant stirring. The resulting solution is left at room temperature and white crystals will precipitate. Recrystallized speridine is analyzed by infra-spectroscopy. (FT-IR) and nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR).
[0053] Sendo que: — a secagem do bagaço da laranja é realizada a uma temperatura suficiente para a. remoção da água, compreendida em uma faixa de 70 a 80 -C, preferencialmente 70 SC, li — a extração com éter de petróleo é realizada a uma temperatura compreendida na faixa compreendida de 40 a 60 9G, preferencialmente 60 9C, e por um período compreendido entre 3 a 6 horas, preferencíalmente 4 horas. — a extração com um componente alcoólico C1-2 selecionado dentre metanol ou etanoi, preferencíalmente metanol. — o ácido acético é adicionado em uma faixa de concentração compreendida entre 4 a 8 %, preferencíalmente 6%. — a solução da esperidina isolada e crua empregada na etapa de recristalização compreende uma concentração na faixa de 4 a 12 %, preferencíalmente 5%. — o solvente ou solução empregada na etapa da recristalização é selecionado dentre dimetilformamida, formamida, dimetilsulfóxido, e dimetilsulfóxido:metanol (1:1, v/v), preferencíalmente dimetilsulfóxido. — o aquecimento da solução obtida após a etapa de recristalização é realizado a uma temperatura compreendida na faixa de 60 a 80 "G.Where: - the orange pomace is dried at a temperature sufficient for. removal of water, in a range of 70 to 80 ° C, preferably 70 ° C, - extraction with petroleum ether is carried out at a temperature in the range of 40 to 60 ° C, preferably 60 ° C, and for a period of time. 3 to 6 hours, preferably 4 hours. Extraction with a C1-2 alcohol component selected from methanol or ethanol, preferably methanol. Acetic acid is added over a concentration range of 4 to 8%, preferably 6%. The crude isolated speridine solution employed in the recrystallization step comprises a concentration in the range of 4 to 12%, preferably 5%. The solvent or solution employed in the recrystallization step is selected from dimethylformamide, formamide, dimethyl sulfoxide, and dimethyl sulfoxide: methanol (1: 1, v / v), preferably dimethyl sulfoxide. - heating of the solution obtained after the recrystallization step is carried out at a temperature in the range of 60 to 80 "G.
Etapa de hidrólise enzimática í H ]!Enzymatic Hydrolysis Step H]!
[0054] As enzimas baclerianas da Xanthomonas axonopodis pv. citri {Xac 306) contendo glicosidase, pectinase e celuiase são utilizadas na hidrólise do bagaço de laranja. Utilizando a cultura de células da Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) é produzido o extrato de proteínas dessa bactéria, o qual é dialisado e liofiiizado. O bagaço é hidrolisado usando esse extrato (30 mg para cada 100 g do bagaço in natura) durante o tempo de 24 horas, a uma temperatura de 45 °C, a uma agitação de 10 a 15 rpm e sem adição de tampão. O pH inicial é de pH 4,8 e o final, em tomo de pH 4,0.The baclerian enzymes of Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) containing glycosidase, pectinase and celluase are used for hydrolysis of orange pomace. Using Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) protein extract of this bacterium is produced, which is dialyzed and lyophilized. The bagasse is hydrolyzed using this extract (30 mg for every 100 g of fresh bagasse) over a period of 24 hours at a temperature of 45 ° C, agitation at 10 to 15 rpm and without the addition of buffer. The initial pH is pH 4.8 and the final pH around pH 4.0.
Etapa de fermentação alcoólica [0055] A concentração inicial de açúcares totais é determinada e a fermentação é conduzida em um equipamento de 5 L (fermentador) mantendo a temperatura constante em 35 °C. A presença de D-glicose, D-frutose e de outros açúcares íermentáveis (totalizando 24 g L'1) em quantidades adequadas e a baixa quantidade da lignina nos hidrolisados da Xac do bagaço da laranja possibilitam seu uso direto na produção de bioetanol de segunda geração sem necessidade da etapa da detoxicação. É importante ressaltar que tendo em vista uma conversão total dos açúcares íermentáveis em bioetanol de segunda geração, pode-se esperar obter até 12,3 g L'1 do etanol, apresentando um rendimento de 100%. As proteínas presentes nestes hidrolisados podem atuar como nutrientes orgânicos que permitam o crescimento de leveduras favorecendo o processo da fermentação submersa, O bagaço hidrolisado é filtrado por meio de fibra de filtro de vidro 1,2 mm e em seguida fermentado. Nos ensaios da produção do bioetanol-2G via fermentação com co-culturas, os hidrolisados do bagaço da laranja são inoculados com dois tipos de leveduras, sendo uma delas a levedura comerciai e a outra uma das duas cepas isoladas. As leveduras (Saccharomyces cerevisiae e Candida parapsilosis sp.) são inoculadas em 5 % v v~1 de cada uma e as quantidades de açúcares íermentáveis (o-glucose e D-frutose) e do bioetanol de segunda geração são monitoradas por HPLC usando curvas padrão.Alcoholic fermentation step The initial concentration of total sugars is determined and the fermentation is conducted in a 5 L equipment (fermenter) keeping the temperature constant at 35 ° C. The presence of D-glucose, D-fructose and other non-fermentable sugars (totaling 24 g L'1) in adequate quantities and the low amount of lignin in the orange bagasse Xac hydrolysates allow its direct use in the production of second bioethanol. generation without the detoxification step. Importantly, in view of the total conversion of non-fermentable sugars into second-generation bioethanol, up to 12.3 g L1 of ethanol can be expected to yield 100% yield. The proteins present in these hydrolysates can act as organic nutrients that allow the growth of yeast favoring the process of submerged fermentation. The hydrolyzed bagasse is filtered through 1.2 mm glass filter fiber and then fermented. In the trials of bioethanol-2G production via fermentation with co-cultures, orange marc hydrolysates are inoculated with two types of yeasts, one of them being commercial yeast and the other one of the two isolated strains. Yeasts (Saccharomyces cerevisiae and Candida parapsilosis sp.) Are inoculated in 5% vv ~ 1 each and the amounts of non-fermentable sugars (o-glucose and D-fructose) and second generation bioethanol are monitored by HPLC using standard curves. .
Etapa de obtenção da nanocelulose [0056] A partir dos bioresíduos sólidos do bagaço da laranja obtidos após a hidrólise e a produção do bioetanol de segunda geração, pode-se obter mais um produto de alto valor agregado, a nanocelulose, O procedimento do isolamento deste nanobiomaterial é executado da seguinte maneira: os resíduos sólidos (5 g), separados por filtração (Merck Millipore, filtro de 0,2 mm) são processados na etapa do : : ί |: branqueamento utilizando primeiramente solução de 4% de hidróxido de sódio, NaOH, h' Esta suspensão é posta em autoclave (120 °C) por 20 minutos, filtrada e lavada com a água destilada. Em seguida, adiciona-se a solução de clorito de sódio, NaCI02, em concentração de 1,7 % (m v1) e pH 4,5. A suspensão é novamente auíoclavada em uma temperatura de 120 °C por 20 minutos e filtrada. A amostra sólida é lavada com água destilada. Em seguida, as fibras são suspensas em água destilada e sonicadas durante 10 minutos utilizando 40% de pulso de 750 W e de 20 kHz (Sonics Vibra Cell); centrifugadas a 15000 rpm por 15 minutos e secas em um liofilizador (Terroni). As nanofibras obtidas após a liofilização dos bioresíduos são de coloração branca e de massa ultra-leve.Nanocellulose stage [0056] From the solid biomass residues obtained after hydrolysis and the production of second generation bioethanol, one more high value-added product, nanocellulose, can be obtained. nanobiomaterial is performed as follows: solid waste (5 g), separated by filtration (Merck Millipore, 0.2 mm filter) is processed in the step of:: ί |: bleaching using primarily 4% sodium hydroxide solution This suspension is autoclaved (120 ° C) for 20 minutes, filtered and washed with distilled water. Then the sodium chloride solution, NaCl 2, at a concentration of 1,7% (m v1) and pH 4,5 is added. The suspension is again washed at a temperature of 120 ° C for 20 minutes and filtered. The solid sample is washed with distilled water. Then the fibers are suspended in distilled water and sonicated for 10 minutes using 40% pulse of 750 W and 20 kHz (Sonics Vibra Cell); centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes and dried in a lyophilizer (Terroni). The nanofibers obtained after lyophilization of the bioresidues are white and of ultra-light mass.
[0057] Sendo que: — a etapa de branqueamento utiliza uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) em uma concentração compreendida na faixa de 3 a 5 %, preferencialmente 4%. — as etapas de autociavagem são conduzidas a uma temperatura ; I compreendida na faixa de 100 a 130 ”C, preferivelmente 120 “C, e por um período compreendido na faixa de 15 a 30 minutos, preferivelmente 20 minutos. — a solução de clorito de sódio (NaGIOs) é adicionada em uma concentração compreendida na faixa de 1 a 2.0 %, preferivelmente 1,7% (m V1) , e em um pH compreendido entre 3 a 5, preferivelmente pH 4,5. — o nanobiomaterial obtido pode ser usado na preparação de produtos alimentícios, produtos cosméticos, produtos de limpeza, compósitos de materiais, materiais de revestimento de papel e cartão, dentre outros.Where: - The bleaching step utilizes a sodium hydroxide (NaOH) solution in a concentration in the range of 3 to 5%, preferably 4%. - the autobraving steps are conducted at a temperature; It is in the range 100 to 130 ° C, preferably 120 ° C, and for a period in the range of 15 to 30 minutes, preferably 20 minutes. The sodium chlorite solution (NaGIOs) is added at a concentration in the range 1 to 2.0%, preferably 1.7% (m V1), and at a pH of 3 to 5, preferably pH 4.5. - The nanobiomaterial obtained can be used in the preparation of food products, cosmetics, cleaning products, composites of materials, paper and board coating materials, among others.
Instalação e operação de um sistema industrial [0058] O processo é ilustrado conforme Figura 1.Installation and operation of an industrial system [0058] The process is illustrated as shown in Figure 1.
[0059] O bagaço da laranja é triturado, e submetido ao arraste a vapor (H20) para isolamento de óleo essencial que é separado usando um solvente orgânico apoiar sendo que a fase polar (água) é reutilizada.The orange pomace is crushed, and steam-entrained (H20) for isolation of essential oil which is separated using an organic supporting solvent and the polar phase (water) is reused.
[0060] Em seguida, é usado etanol ou metanol para extração de esperidina, constituindo uma fase alcoólica. Esta fase alcoólica é coletada e concentrada para cristalização da esperidina. A esperidina é re-cristalizada utilizando seguinte procedimento. π ii ;i ! ii ; j [0061] O bagaço de laranja triturado é diluído com água e realiza-se a hidrólise em que são adicionadas enzimas em forma de coquetel proveniente da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306).Subsequently, ethanol or methanol is used for extraction of speridine, constituting an alcoholic phase. This alcoholic phase is collected and concentrated to crystallize speridine. Speridine is recrystallized using the following procedure. π ii; i! ii; Crushed orange pomace is diluted with water and hydrolysis is performed by adding cocktail-like enzymes from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306).
[0062] A hidrólise é conduzida a uma temperatura de 45 °C durante um período de 24 h em que uma parte líquida é gerada. Esta parte líquida que contém açúcares fermentáveis é inoculada com co-culturas de Saccharomyces cerevisie e uma das leveduras é isolada. Realiza-se fermentação conduzida a uma temperatura de 35 2C durante um período de 6 horas.Hydrolysis is conducted at a temperature of 45 ° C over a period of 24 h in which a liquid part is generated. This liquid part containing fermentable sugars is inoculated with Saccharomyces cerevisie cocultures and one of the yeasts is isolated. Conducted fermentation is performed at a temperature of 35 ° C over a period of 6 hours.
[0063] A fase líquida que contem bioetanol de segunda geração é destilada Π para isolar etanol em desejada concentração, dependendo do seu uso.The liquid phase containing second generation bioethanol is distilled to isolate ethanol at desired concentration, depending on its use.
[0064] O resíduo sólido formado após a hidrólise e a fermentação é processado para o isolamento e obtenção da nanocelulose em forma de nanocristais e nanofibras. Toda água usada no processo é reciclada.The solid residue formed after hydrolysis and fermentation is processed to isolate and obtain nanocellulose in the form of nanocrystals and nanofibers. All water used in the process is recycled.
[0065] Uma tonelada do bagaço da laranja pode gerar até 3 kg de óleo essencial, 3,6 kg da esperidína, 7 kg de nanocelulose e até 60 L de etano! de segunda geração.[0065] One ton of orange pomace can generate up to 3 kg of essential oil, 3.6 kg of speridine, 7 kg of nanocellulose and up to 60 L of ethane! second generation.
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