BR102013023217A2 - extratos, frações, compostos isolados e formulação farmacêutica de spondias mombin aplicados no tratamento da inflamação - Google Patents

Abstract

extratos, frações, compostos isolados e formulação farmacêutica de spondias mombin aplicados no tratamento da inflamação. a patente de invenção refere-se à obtenção de extratos, frações e compostos isolados de raiz, tronco, partes aéreas, flores, frutos e sementes assim como do suco dos frutos de spondias mombin, e de frações e compostos bioativos isolados da planta supracitada, com atividade anti-inflamatória, sendo a inflamação causada por qualquer agente etiológico. compreende, ainda, a obtenção de composições farmacêuticas que contenham o extrato, frações ou compostos bioativos isolados do extrato de raiz, tronco, partes aéreas, flores, frutos e sementes assim como do suco dos frutos de s. mombín, ricos em metabólitos secundários classificados como compostos fenólicos, compostos nitrogenados e compostos isoprenoides, bem como sua utilização para o tratamento de processos inflamatórios ocasionados por qualquer agente etiológico. os extratos, frações e substâncias isoladas da espécie vegetal apresentada foram testados e revelaram atividade anti-inflamatória sobre os efeitos biológicos induzidos pela inflamação com o indutor inflamatório carragenina no modelo animal de peritonite aguda. finalmente, a patente de invenção compreende também a utilização dos extratos, frações e substâncias isoladas da espécie vegetal para o tratamento de processos inflamatórios administrados pelas vias oral, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou transdérmica

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “Extratos, frações, compostos isolados e formulação farmacêutica de Spondias mombin aplicados no tratamento da inflamação”. A invenção refere-se à obtenção de extratos, frações e compostos isolados de raiz, tronco, partes aéreas, flores, frutos e sementes assim como do suco dos frutos de Spondias mombin, e de frações e compostos bioativos isolados da planta supracitada, com atividade anti-inflamatória. A invenção compreende, ainda, a obtenção de composições farmacêuticas que contenham o extrato, frações ou compostos bioativos isolados do extrato de raiz, tronco, partes aéreas, flores, frutos e sementes assim como do suco dos frutos de S. mombin, ricos em metabólitos secundários classificados como compostos fenólicos, compostos nitrogenados e compostos isoprenoides, bem como sua utilização para o tratamento de processos inflamatórios ocasionados por qualquer agente etiológico. Os extratos, frações e substâncias isoladas da espécie vegetal apresentada foram testados e revelaram atividade anti-inflamatória sobre os efeitos biológicos induzidos pela inflamação com o indutor inflamatório carragenina no modelo animal de peritonite aguda.

Nos últimos anos, um grande interesse tem sido demonstrado na tentativa de buscar respostas referentes à etiologia fisiopatológica e controle farmacológico do processo inflamatório. Este interesse, dentro da medicina experimental, deve-se à descoberta de que os danos teciduais que ocorrem em diversas doenças existentes resultam de uma resposta inflamatória. Os anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) e esteroidais constituem um grupo heterogêneo de moléculas com propriedades eficazes anti-inflamatórias. Desafortunadamente, a frequência dos efeitos adversos descritos em seu uso continuado é alta. Então, pode-se afirmar que ainda não foi descoberto um fármaco anti-inflamatório considerado ideal, com efeitos indesejáveis mínimos e que seja realmente eficaz nos transtornos inflamatórios. Existem várias moléculas, obtidas de fontes naturais, de grande diversidade química, que envolvem diferentes tipos de princípios ativos. Entre eles se encontram triterpenos, esteroides, lactonas sesquiterpênicas, flavonoides, taninos, cumarinas e alcalóides que têm demonstrado atividade anti-inflamatória em vários modelos de inflamação, atuando sobre distintos mediadores deste processo. Isto constitui uma fonte de descobrimento de novos agentes que poderíam exercer sua atividade anti-inflamatória por mecanismos distintos a dos fármacos já existentes.

Diante disso, as plantas medicinais se mostram como uma rica fonte para obtenção de moléculas para serem exploradas terapeuticamente. As plantas têm sido desde a antiguidade, um recurso ao alcance do ser humano. O uso de plantas no tratamento e na cura de enfermidades é tão antigo quanto a espécie humana, sendo às vezes o único recurso terapêutico de muitas comunidades. As primeiras descrições sobre plantas medicinais feitas pelo homem remontam ao papiro de Erbers, antigo Egito e é datado de aproximadamente 1.550 a.C. que descrevia o tratamento de mais de 100 doenças baseado na utilização de um grande número de drogas de natureza animal e vegetal. Neste campo de pesquisa envolvendo produtos naturais, destacaram-se alguns filósofos da civilização grega, como Hipócrates e Teofrasto, sendo esse último responsável pelo registro da utilização da espécie botânica Papa ver somniferum [papoula].

Apesar da existência de registros antigos que relatavam a ampla utilização dos vegetais como alternativa terapêutica, todo esse conhecimento era baseado somente no empirismo, ou seja, no conhecimento prático do emprego dos vegetais como medicamentos. Somente no início do século passado esses recursos passaram a ser estudados como instrumentos científicos da época e os princípios ativos começaram a ser identificados e utilizados pela medicina tradicional.

As plantas podem contribuir de diversas formas tanto para a medicina institucionalizada como na medicina popular. Na medicina institucionalizada elas poderão ser empregadas como: fornecedoras de substâncias ativas isoladas; matéria-prima para a preparação de medicamentos fitoterápicos ou poderão servir como protótipos para o desenvolvimento de novos fármacos. Já na medicina popular é utilizada como droga, íntegra, rasurada ou moída, destinada à preparação extemporânea de infusos ou decoctos aquosos [chás].

Segundos estimativas da Convenção da Diversidade Biológica (CDB), o Brasil é considerado o maior país do planeta em número de espécies endêmicas com 15 a 20% de toda biodiversidade mundial com cerca de 55 mil espécies de plantas. As regiões Norte e Nordeste do país são as que concentram a maior parte da biodiversidade existente, o que permite acesso a inúmeros tipos de plantas e espécies frutíferas.

Devido à biodiversidade, as plantas medicinais e os medicamentos fitoterápicos são atualmente as classes de produtos com maior potencial de crescimento no Brasil, onde as vendas têm crescido de 10 a 15% ao ano, porém ainda com participação de 2%, em média, no mercado de medicamentos. A espécie S. mombin é amplamente utilizada, especialmente na região Norte e Nordeste do país. As folhas são utilizadas popularmente em gargarejos, como adstringente nas inflamações de boca e de garganta. Também há relatos do uso oral em casos de prostatite e herpes labial. Diante disso, pode-se dizer que a S. mombin constitui-se como uma espécie vegetal promissora no descobrimento de fármacos e/ou desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos.

Relacionado ao estado da técnica, atividades biológicas de extratos, frações e compostos bioativos extraídos das folhas e dos sucos dos frutos de S. mombin, não há estudo já publicado demonstrando a atividade dessas plantas no modelo experimental proposto. Foram encontrados alguns documentos de patente descritos abaixo, que relacionam o uso da espécie S. mombin: A patente PI9603851-9 A2 de 12 de setembro de 1996 refere-se à preparação de um fitoterápico antivirótico. A patente PI9805479-1 A2 de 19 de novembro de 1998 refere-se à preparação de um gel fitoterápico a partir do extrato hidroalcoolico da espécie vegetal S. mombin utilizando-se como veículo e agente gelificante a quitosana, com propriedades antimicrobianas e antivirótica, notadamente contra o vírus do Herpes simplex. A patente US2003072820 de 17 de abril de 2003 refere-se a uma composição cosmética com atividade antiradical livre e antienvelhecimento. A patente PI0314104-7 A2 de 11 de setembro de 2003 refere-se à preparação de uma composição para tratamento da AIDS e condições associadas. A patente PI0404307-3 A2 de 19 de agosto de 2004 refere-se à preparação de um fitoterápico com atividade antiviral e antibactericida. A patente PI0506647-6 A2 de 25 de novembro de 2005 refere-se à preparação de um gel fitoterápico a partir do extrato hidroalcoolico da espécie vegetal S. mombin utilizando-se como veículo e agente gelificante a quitosana, com propriedades antimicrobianas e antiviróticas, notadamente contra o vírus do Herpes simplex. A patente JP2009167154 de 30 de julho de 2009 refere-se ao uso de uma composição contendo S. mombin para a inibição da elevação da glicose no sangue. A patente W02009018363 de 05 de fevereiro de 2009 refere-se a um método de inibição da COX 2 e NF-Kappa B e uso de um medicamento a partir de S. mombin formulado para tratamento da inflamação e Cancro, utilizando vários tipos de solventes nos processos extrativos. A patente AU2011219481 de 22 de setembro de 2011 refere-se ao uso de um medicamento a partir do extrato ou um éster de glicerol, alcalóide, saponina, uma gordura, um açúcar obtido do extrato de S. mombin para o uso do tratamento da AIDS. O uso de extratos, frações e compostos bioativos extraídos de folhas, cascas e frutos de S. mombin como anti-inflamatório apresentado neste documento pode proporcionar uma opção importante na obtenção de extratos, frações e compostos bioativos e uma formulação farmacêutica capazes de auxiliar direta ou indiretamente no tratamento de processos inflamatórios.

Desta forma, o objeto da presente invenção, refere-se à obtenção de uma formulação farmacêutica, extratos, frações e compostos bioativos extraídos da planta S. mombin com aplicação como anti-inflamatório, com a finalidade de auxiliar direta ou indiretamente no tratamento de processos inflamatórios.

Com relação à forma de obtenção dos extratos de S. mombin, compreende: a) Coletar a raiz, tronco, partes aéreas, flores, frutos e sementes de S. mombin. b) Secar a raiz, tronco, partes aéreas, flores, frutos e sementes de S. mombin ao abrigo da luz com ventilação e temperatura controladas. c) Triturar, após secagem, a raiz, tronco, partes aéreas, flores, frutos e sementes de S. mombin. d) Extrair a parte de interesse da planta (a raiz, tronco, partes aéreas, flores, frutos e sementes) por infusão com água quente (70-110°C) por 10-100 minutos e) Extrair a parte de interesse da planta (a raiz, tronco, partes aéreas, flores, frutos e sementes) por decocção com água quente (70-110°C) por 10-100 minutos. f) Extrair a parte de interesse da planta (a raiz, tronco, partes aéreas, flores, frutos e sementes) por turbólise seguida ou não de maceração em água, etanol, metanol, água: etanol ou água: metanol em proporções variadas, por 3-20 dias. g) Extrair por turbólise os frutos inteiros frescos de S. mombin com água (quantidade suficiente para proceder a trituração), a 15-100°C. h) Filtrar o extrato obtido. i) Secar o solvente orgânico, à 20-60Χ.

Liofilizar o extrato aquoso obtido ou o resíduo aquoso após eliminação do solvente orgânico.

Gom relação à forma de obtenção das frações das plantas S. mombin, compreende: a) Ressuspender o extrato obtido em água (200 - 2000 mL); b) Realizar a extração líquido-líquido (partição) do extrato ressuspendido em água com solventes orgânicos de polaridades crescentes (éter de petróleo, clorofórmio, hexano, diclorometano, acetato de etila, /?-butanol) com auxílio de um funil de decantação; c) Separar as fases orgânicas da fase aquosa após processo de partição supracitado, obtendo-se a fração desejada; d) Levar à secura as frações, obtidas após processo de partição e separação das fases de acordo com procedimentos supracitados, sob pressão reduzida em evaporador rotatório, a 20-60°C.

Com o auxílio de processos cromatográficos foi possível verificar que o extrato hidroetanólico e as frações que foram obtidos após a realização dos passos descritos acima contêm em maior quantidade flavonoides e taninos, metabólitos secundários pertencentes à classe dos compostos fenólicos. Foi possível identificar os flavonoides: quercetina, canferol e um derivado glicosilado da quercetina e em relação aos taninos foi observada a presença do ácido elágico.

De acordo com os resultados obtidos das avaliações de atividade biológica, as frações mais ativas serão submetidas ao processo de fracionamento e isolamento dos compostos ativos. As frações éter de petróleo, clorofórmio, hexano, diclorometano, acetato de etila, n-butanol, serão submetidas a sucessivos ensaios cromatográficos clássicos (cromatografia preparativa, cromatografia em coluna, cromatografia líquida a vácuo), empregando diferentes fases estacionárias (sílica de fase normal e reversa e Sephadex LH-20). Os extratos/frações com atividades estabelecidas ou comprovadas serão fracionados a fim de se proceder a caracterização dos metabólitos bioativos. Adicionalmente, as frações serão monitoradas por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAEj, para avaliar a composição química dos extratos e as características químicas dos metabólitos secundários presentes. A partir da fração mais ativa, serão isolados os compostos ativos pelos métodos cromatográficos já citados. A elucidação estrutural dos compostos isolados das frações mais ativas dos extratos obtidos das folhas e do suco dos frutos será realizada por meio de técnicas espectroscópicas e espectrométricas.

Será realizada também a análise quantitativa dos compostos ativos identificados da fração mais ativa e dos extratos, por CLAE. A validação do método analítico desenvolvido para determinação dos Compostos ativos nos extratos e frações ativos será realizado por meio da determinação dos parâmetros de: seletividade (especificidade), sensibilidade, linearidade (curva de calibração), faixa de concentração de trabalho, exatidão, precisão e recuperação.

Com relação à atividade biológica anti-inflamatória de S. mombin, compreende: a) Preparação dos extratos, frações, compostos bioativos e formulação farmacêutica da planta S. mombin. b) Quanto às doses dos extratos, frações, compostos bioativos e formulação farmacêutica, podem variar entre 1 e 1000 mg/kg, em um volume de solução finai administrada de 50 a 2000 μΙ_. c) Quanto às doses da carragenina, podem variar entre 0,001 e 1 mg/kg, em um volume de solução final administrada de 50 a 2000 μΙ_; d) Administrar de 50 a 2000 μΐ_ dos extratos, frações, compostos bioativos e formulação farmacêutica, por via oral, endovenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea ou intradérmica. e) Administrar de 50 a 2000 μΙ_ da carragenina por via intramuscular, intraperitoneal, subcutânea ou intradérmica; f) A avaliação de atividade anti-inflamatória deve ser realizada após 4 a 24 horas de administração das amostras e da carragenina;

Para a preparação e fracionamento dos extratos, as folhas foram secas e moídas, os frutos foram usados in natura triturados e submetidos à extração sob decocção, na qual o material vegetal foi deixado em contato com água fervente por 1 a 60 minutos, na proporção droga vegetal: solvente (1:10, p/v) A maceração consistiu em deixar os materiais vegetais em contato com etanol: H20 (70:30 v/v) durante um a 30 dias. Após a obtenção dos extratos os mesmos foram filtrados. Parte do decocto foi utilizada para as análises fitoquímica e outra parte foi liofilizada para a realização dos estudos in vivo e in vitro e posterior processo de fracionamento. Os extratos obtidos foram previamente congelados por 12-240 h a -20 a -85 °C e em seguida liofilizadas (Christ, modelo Alpha 1-2 LD). Para o processo de fracionamento foi utilizado o extrato hidroetanólico, sendo repetido o processo de preparação desse extrato, e o volume dos obtidos foi reduzido a 300-1500 ml.

Em seguida, os extratos foram particionados com solventes de polaridade crescente (/7-hexano, diclorometano, acetato de etila e n-butanol). A caracterização do extrato aquoso e hidroetanólico foi realizada através das análises: triagem fitoquímica e cromatografia em camada delgada (CCD). Na triagem fitoquímica, o extrato bruto foi submetido a diversos téstes qualitativos de mudança de coloração, formação de espuma e precipitação, para identificação de diversos metabólitos secundários. Foi pesquisada a presença de saponinas, taninos, flavonoides, quinonas, esteroides, triterpenos e alcalóides. Para a CCD, foram utilizadas cromatoplacas de alumínio com gel de sílica 60 com indicador de fluorescência UV 254, como adsorvente. A fase móvel e o revelador utilizado foram escolhidos de acordo com a triagem prévia para detecção dos compostos majoritários das espécies.

Um aspecto importante e inovador da presente invenção é a obtenção de extratos, frações e compostos bioativos, como também de uma formulação farmacêutica que apresente a capacidade de agir como anti-ínflamatório. Estudos desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa constataram que os extratos e frações da espécie S. mombin apresentaram uma ação anttinflamatória em modelo experimental de perítonite aguda. A Figura 1 apresenta a atividade anti-inflamatória do extrato hidroetanólico de S. mombin em modelo experimental de perítonite aguda, induzido pela carragenina, em camundongos. A indicação “A” corresponde ao grupo de animais que receberam apenas solução salina 0,9% e não foi administrada a carragenina, “B” representa o grupo que recebeu apenas a carragenina, as indicações “C”, “D” correspondem aos grupos de animais que receberam o extrato a 300 mg e 500 mg . Os extratos e frações apresentaram a capacidade de inibir a inflamação de forma dose dependente, reduzindo de forma significativa a migração celular para o local onde foi inoculada a carragenina.

Claims (2)

1. Extratos, frações, compostos isolados e formulação farmacêutica de Spondias mombin aplicados no tratamento da inflamação, caracterizados por processo de obtenção dos extratos, frações e compostos bioativos isolados de raiz, tronco, partes aéreas, flores, frutos e sementes assim como o suco dos frutos de S. mombin, utilizados no tratamento de processos inflamatórios com agentes etiológicos diversos, incluindo microrganismos e parasitos, compreendendo excipientes inertes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis, apresentando atividade anti-inflamatória, e utilizado no tratamento de pacientes humanos acometidos de processos inflamatórios com etiologia diversa (endógena, exógena ou relacionada a parasitos e patógenos), administrada pelas vias oral, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou transdérmica.

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