BR102013018051A2

BR102013018051A2 - Bifunctional enzyme used in biomass degradation for xylose production in a single operation

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Publication number: BR102013018051A2
Application number: BRBR102013018051-3A
Authority: BR
Inventors: Roberto Ruller; José Alberto Diogo; Zaira Bruna Hoffman; Junio Cota Silva; Fabio Marcio Squina; José Geraldo Da Cruz Pradella
Original assignee: Cnpem Ct Nac De Pesquisa Em En E Materiais
Priority date: 2013-07-15
Filing date: 2013-07-15
Publication date: 2015-09-01
Also published as: WO2015006843A3; WO2015006843A2

Abstract

Enzima bifuncional utilizada na degradação de biomassa para produção de xilose em uma única operação. A presente invenção refere-se a uma nova enzima bifuncional com atividade de xilanase e xilosidase, obtida a partir de bacillus subtilis que catalisam a degradação de hemiceluloses. A invençâo também aborda uma sequência de ácidos nucléicos que codificam a enzima bem como um processo para produção de xiíose, mediante a hidrólise da biomassa, preferencialmente bagaço ou palha da cana-de-açúcar. Ainda, a presente invençâo refere-se ao processo de tratamento de um licor rico em hemicelulose, advindo do bagaço de cana-de-açúcar tratado, preferencialmente, com água quente ou explosâo a vapor. Em continuidade a presente invenção também trata de uma enzima utilizada na suplementação de outros coquetéis enzimáticos, por exemplo, aqueles conhecidos comercialmente, com o intuito de melhorar suas performances.Bifunctional enzyme used in biomass degradation for xylose production in a single operation. The present invention relates to a novel bifunctional enzyme with xylanase and xylosidase activity, obtained from bacillus subtilis that catalyze the degradation of hemicelluloses. The invention also addresses a sequence of nucleic acids encoding the enzyme as well as a process for producing xiosis by hydrolysis of the biomass, preferably sugarcane bagasse or straw. Further, the present invention relates to the process of treating a hemicellulose rich liquor from sugar cane bagasse preferably treated with hot water or steam blast. In continuity the present invention also deals with an enzyme used in the supplementation of other enzymatic cocktails, for example those known commercially, in order to improve their performances.

Description

ΈΝΖΙΜΑ BIFUNCIONAL UTILIZADA NA DEGRADAÇÃO DE BIOMASSA PARA PRODUÇÃO DE XILOSE EM UMA ÚNICA OPERAÇÃO” CAMPOS DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma nova enzima bifuncional com atividade de xilanase e xilosidase, obtida a partir de Bacillus subtilis que catalisam f a degradação de hemiceluloses. A invenção também aborda uma sequência de ácidos nucléicos que codificam a enzima bem como um processo para produção de xilose, mediante a hidrólise da biomassa, preferencialmente bagaço ou palha da cana-de-açúcar.FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a novel bifunctional enzyme with xylanase and xylosidase activity, obtained from Bacillus subtilis that catalyzes the degradation of hemicelluloses. The invention also addresses a sequence of nucleic acids encoding the enzyme as well as a process for producing xylose by hydrolyzing the biomass, preferably sugarcane bagasse or straw.

Ainda, a presente invenção refere-se ao processo de tratamento de um licor rico em hemicelulose, advindo do bagaço de cana-de-açúcar tratado, preferencialmente, com água quente ou explosão a vapor.Further, the present invention relates to the process of treating a hemicellulose rich liquor from sugar cane bagasse preferably treated with hot water or steam blast.

Adicionalmente a invenção fornece métodos para quebrar a hemicelulose e obtenção de xilose.Additionally the invention provides methods for breaking hemicellulose and obtaining xylose.

Em continuidade a presente invenção também trata de uma enzima utilizada na suplementação de outros coquetéis enzimáticos, por exemplo, aqueles conhecidos comercialmente, com o intuito de melhorar suas performances.In continuity the present invention also deals with an enzyme used in the supplementation of other enzymatic cocktails, for example those known commercially, in order to improve their performances.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION

Diante da crescente demanda por energia uma das maiores preocupações da sociedade moderna tem sido a ampliação da produção desse recurso. Tendo em vista os problemas resultantes da dependência de um número restrito de fontes energéticas não renováveis, como ocorre atualmente (IEA, 2011), além da demanda por um modelo de desenvolvimento sustentável, a busca por alternativas para produção de energia mais limpas tem se tornado constante (BNDES & CGEE, 2008; Soares e Andreozzi, 2011).Given the growing demand for energy one of the major concerns of modern society has been the expansion of production of this resource. Given the problems resulting from reliance on a limited number of non-renewable energy sources, as is currently the case (IEA, 2011), in addition to the demand for a sustainable development model, the search for cleaner energy alternatives has become increasingly constant (BNDES & CGEE, 2008; Soares and Andreozzi, 2011).

Dentre as opções para uma maior diversificação das fontes de energia tem se enfatizado nos últimos anos o uso de biocombustíveis, onde o Brasil ocupa uma posição de destaque devido a tradição na produção de etanol a partir de cana de açúcar, além de possuir vastas áreas disponíveis para essa cultura e de outras oleaginosas úteis para produção de biodiesel (Kohlhepp, 2010).Among the options for greater diversification of energy sources, the use of biofuels has been emphasized in recent years, where Brazil occupies a prominent position due to the tradition of ethanol production from sugar cane, besides having vast areas available. for this crop and other oilseeds useful for biodiesel production (Kohlhepp, 2010).

Além da produção do etanol a partir da fermentação do caldo de cana tem-se como perspectiva a utilização do bagaço resultante desse processo para a produção do chamado etanol de segunda geração, ou seja, transformação da biomassa vegetal em açúcares fermentescíveis adequados a produção de etanol, o que pode aumentar a eficiência no aproveitamento do potencial energético e incrementar a produção desse biocombustível. Contudo, essa perspectiva se depara com desafios técnicos devido a natureza estrutural dos componentes da biomassa vegetal e a necessidade de enzimas adequadas a um processo rápido e barato.In addition to the production of ethanol from the fermentation of sugarcane juice, the perspective is the use of bagasse resulting from this process for the production of so-called second generation ethanol, ie, transformation of plant biomass into fermentable sugars suitable for ethanol production. , which can increase efficiency in harnessing energy potential and increase the production of this biofuel. However, this perspective faces technical challenges due to the structural nature of plant biomass components and the need for adequate enzymes for a fast and inexpensive process.

Desta forma, um dos gargalos na produção de etanol de segunda geração é desenvolvimento de processos economicamente viáveis, dentre as quais, destaca-se a hidrólise enzimática, mais especificamente o uso de uma série de enzimas com ação sinérgica, capazes de degradar a estrutura complexa da parede lignocelulósica, permitindo a liberação de açúcares fermentescíveis. A necessidade de um grande número de diferentes enzimas atuando sinergicamente para a conversão da biomassa em açúcares adequados, a produção do bioetanol constitui um desafio no sentido de otimizar e baixar os custos desse processo. Sendo assim, os maiores problemas técnicos a serem superados, dizem respeito ao aumento da atividade dessas enzimas e a redução da quantidade de proteínas necessárias para o processo. A matéria lignocelulósica do bagaço de cana apresenta em sua composição, principalmente, celulose (41 a 44%), hemicelulose (25 a 27%) e lignina (20 a 22%). As fibras de celulose são incorporadas a uma rede de hemicelulose e lignina o que torna esse composto hidrofóbico, criando um complexo recalcitrante a degradação enzimática (Marabezi, 2009 e Fan, 2010). - A celulose: Polímero constituído de D-anidroglicopiranose unidas por ligações β-1,4-glicosídicas. As ligações de hidrogênio entre as unidades poliméricas, causadas pela existência de grupos hidroxila na cadeia, e as forças de Van der Waals, resultam em uma estrutura cristalina. Há dois tipos de ligação de hidrogênio nesse sistema, uma entre as glicoses adjacentes e a outra com cadeias vizinhas. Essa última realiza um efeito de compactação da celulose, fazendo com que surjam diversas faces, que irão interagir com água e enzimas celulases (Marabezi, 2009 e Zhang & R., 2004). - A hemicelulose: Polímero formado por diversos açúcares como xilose, arabinose e galactose. Os monômeros possuem cinco (pentoses) e seis (hexose) carbonos que, para cada vegetal, têm diferentes predominâncias, além de ser constituída de açúcares ácidos. No caso do bagaço, a hemicelulose mais abundante é a xilose (Rosa & Garcia, 2009; Saha, 2003 e Santos, et. al. 2012). - A Lignina: Considerada a macromolécula de maior complexidade, possui unidades fenilpropanônicas (C9) e é amorfa. Atua no transporte de água, nutrientes e metabólitos, além de oferecer resistência mecânica e proteção (Marabezi, 2009).Thus, one of the bottlenecks in the production of second generation ethanol is the development of economically viable processes, among which enzymatic hydrolysis stands out, specifically the use of a series of enzymes with synergistic action, capable of degrading the complex structure. lignocellulosic wall, allowing the release of fermentable sugars. The need for a large number of different enzymes acting synergistically to convert biomass into suitable sugars, bioethanol production is a challenge to optimize and lower the costs of this process. Thus, the biggest technical problems to be overcome are the increased activity of these enzymes and the reduction in the amount of protein needed for the process. The lignocellulosic matter of sugarcane bagasse presents mainly cellulose (41-44%), hemicellulose (25-27%) and lignin (20-22%). Cellulose fibers are incorporated into a hemicellulose and lignin network which makes this compound hydrophobic, creating a recalcitrant complex to enzymatic degradation (Marabezi, 2009 and Fan, 2010). - Cellulose: A polymer consisting of D-anhydroglycopyranose joined by β-1,4-glycosidic bonds. The hydrogen bonds between the polymeric units, caused by the existence of hydroxyl groups in the chain, and the Van der Waals forces, result in a crystalline structure. There are two types of hydrogen bonding in this system, one between adjacent glycoses and the other with neighboring chains. The latter performs a cellulose compaction effect, causing several faces to appear, which will interact with water and cellulase enzymes (Marabezi, 2009 and Zhang & R., 2004). - Hemicellulose: Polymer formed by several sugars such as xylose, arabinose and galactose. The monomers have five (pentoses) and six (hexose) carbons which, for each vegetable, have different predominances, besides being composed of acid sugars. In the case of bagasse, the most abundant hemicellulose is xylose (Rosa & Garcia, 2009; Saha, 2003 and Santos, et. Al. 2012). - Lignin: Considered the most complex macromolecule, it has phenylpropanonic units (C9) and is amorphous. It acts in the transportation of water, nutrients and metabolites, besides offering mechanical resistance and protection (Marabezi, 2009).

Um dos mais importantes grupos de enzimas são as celulases, que englobam exoglicanases, endoglicanases e beta-glicosidases, as quais catalisam a hidrólise das ligações 1,4-beta-D-glícosidicas. Por sua vez as xilanases são responsáveis pela quebra randômica das ligações endo-1,4-xilano e as beta-xilosidases são capazes de hidrolisar as cadeias curtas de xilooligossacarídeos, obtidos a partir da quebra randômica das xilanases, em xilose (Dumona, 2012).One of the most important groups of enzymes are cellulases, which include exoglycans, endoglycans and beta-glycosidases, which catalyze the hydrolysis of 1,4-beta-D-glycosidic bonds. In turn, xylanases are responsible for the random breakdown of endo-1,4-xylan bonds and beta-xylosidases are able to hydrolyze the short chains of xyloligosaccharides obtained from the random breakdown of xylanases in xylose (Dumona, 2012). .

Na natureza são encontradas enzimas multifuncionais (quimeras) utilizadas por micro-organísmos para a degradação eficiente de polissacarídeos, como os celulossomas (Doi e Kosugi, 2004). A utilização de enzimas com mais de um tipo de atividade catalítica tem sido apontado como uma promissora estratégia no sentido de diminuir a quantidade de enzimas necessárias ao processo além de apresentar atividade sinérgica na degradação de substratos complexos (Fan et. al., 2009).In nature are found multifunctional enzymes (chimeras) used by microorganisms for the efficient degradation of polysaccharides, such as cellulosomes (Doi and Kosugi, 2004). The use of enzymes with more than one type of catalytic activity has been pointed as a promising strategy to reduce the amount of enzymes required for the process and to present synergistic activity in the degradation of complex substrates (Fan et. Al., 2009).

Estudos com foco em engenharia de proteínas multifuncionais tem demonstrado que é possível obter ganho na atividade de uma quimera quando comparado a seus módulos separados (Adlakha et. al., 2011; Xue et. al. 2009), o que tem sido atribuído a maior proximidade física das enzimas, flexibilidade conformacional dada pelo linker* (uma sequência protéica escolhida para unir as duas ou mais unidades individuais) (Xue, 2009) e possivelmente, processamento local e imediato (o produto de uma enzima é substrato da da outra). *1 entende-se “linkek' como sendo uma dada sequência específica de aminoácidos unindo dois domínios protéicos. ■ A adição de um linker, que cria uma conformação estendida, gera maior flexibilidade à fusão, auxiliando na manutenção das propriedades positivas que ocorrem naturalmente nas enzimas. Ditas propriedades são comparadas através de testes laboratoriais e, em alguns casos, as quimeras têm melhores performances de desempenho do que as enzimas separadas em um complexo, mas sem estarem em forma de quimeras (Fan, 2010). Não é possível, no entanto, predizer a atividade (influência ou contribuição) de certo linker antes da formação da quimera. Apesar de alguns estudos serem conduzidos para aumentar a confiabilidade dos resultados, em alguns sistemas, ainda não se pode afirmar qual será a resposta do dito linker.Studies focusing on multifunctional protein engineering have shown that it is possible to gain gain in activity of a chimera when compared to its separate modules (Adlakha et. Al., 2011; Xue et. Al. 2009), which has been attributed to greater physical proximity of enzymes, conformational flexibility given by linker * (a protein sequence chosen to join the two or more individual units) (Xue, 2009) and possibly local and immediate processing (the product of one enzyme is substrate for the other). * 1 means 'linkek' as a given specific amino acid sequence joining two protein domains. ■ The addition of a linker, which creates extended conformation, creates greater fusion flexibility, helping to maintain the naturally occurring positive properties of enzymes. These properties are compared through laboratory tests and, in some cases, chimeras have better performance performances than enzymes separated into a complex but not in the form of chimeras (Fan, 2010). It is not possible, however, to predict the activity (influence or contribution) of a certain linker before chimera formation. Although some studies are conducted to increase the reliability of the results, in some systems, it is still not possible to say what will be the response of said linker.

Ainda, com relação às famílias de cada enzima, deve-se destacar que existem beta-xilosidades em várias famílias de hidrolases de glicosídeo. Várias propriedades físico-químicas e bioquímicas variam de uma família para outra, dentre elas o tipo de enovelamento terciário e o mecanismo catalítico. As hidrolases de glicosideo podem clivar os açúcares do polímero segundo dois tipos principais de mecanismos: retenção ou inversão da configuração do carbono anomérico. Para o caso de beta-xilosidases, enzimas que desempenham a catálise com o mecanismo de retenção podem além de hidrolisar, também sintetizar (transglicosilação) em determinadas condições. Desse modo, reduzem o rendimento do produto xilose a ser t obtido, uma vez que ao realizar a transglicosilação a enzima está polimerizando t'os açucares livres em xilooligossacarídeos. Após várias análises, a enzima que trabalhamos foi escolhida propositalmente na família GH 43, que não tem esse tipo de atividade de transglicosilação e é, portanto, uma candidata a oferecer altos rendimentos de xilose. A outra enzima quimérica desse tipo relatada na literatura pertence à família GH 39, que possui a atividade de transglicosilação.Also, regarding the families of each enzyme, it should be noted that there are beta-xylosities in several families of glycoside hydrolases. Several physicochemical and biochemical properties vary from family to family, including the type of tertiary folding and the catalytic mechanism. Glycoside hydrolases can cleave polymer sugars according to two main types of mechanisms: retention or inversion of the anomeric carbon configuration. In the case of beta-xylosidases, enzymes that perform catalysis with the retention mechanism may not only hydrolyze but also synthesize (transglycosylate) under certain conditions. Thus, they reduce the yield of the xylose product to be obtained, since by transglycosylating the enzyme is polymerizing free sugars into xyloligosaccharides. After several analyzes, the enzyme we worked on was purposely chosen from the GH 43 family, which does not have this kind of transglycosylation activity and is therefore a candidate to offer high xylose yields. The other chimeric enzyme of this type reported in the literature belongs to the GH 39 family, which has transglycosylation activity.

Neste trabalho, Zhanmin Fan, et. al, (2008) “The Construction and Characterization of Two Xylan-Degrading Chimeric Enzymes", descrevem a construção de uma quimera xilanase-xilosidase, para produção de bioetanol, a partir de substratos naturais comerciais. Os autores utilizaram uma xilanase de C. thermocellum e uma xilosidase de Thermoaerobacterium sp. (com atividade de transglicosilação).In this paper, Zhanmin Fan, et. al, (2008) "The Construction and Characterization of Two Xylan-Degrading Chimeric Enzymes" describe the construction of a xylanase-xylosidase chimera for bioethanol production from commercial natural substrates. The authors used a C. thermocellum xylanase. and a Thermoaerobacterium sp. xilosidase (with transglycosylation activity).

Zhanmin Fan, et. al, (2009), “Multimeric Hemícellulases Facilitate Biomass Conversion”, igualmente utiliza o conceito de quimeras para produzir uma enzima com atividade trifuncional de xilanase, arabinofuranosidase e xilosidase, demonstrando que há efeito sinérgico entre as funções quando unidas nesta ordem. PT1319079 também descreve uma enzima com atividade xilanásica de Talaramyces sp. e com funcionalidade de arabinofuranosidase e xilosidase.Zhanmin Fan, et. al, (2009), “Multimeric Hemícellulases Facilitate Biomass Conversion”, also uses the concept of chimeras to produce an enzyme with trifunctional xylanase, arabinofuranosidase and xilosidase activity, demonstrating that there is synergistic effect between functions when joined in this order. PT1319079 also describes an enzyme with xylanase activity of Talaramyces sp. and with arabinofuranosidase and xilosidase functionality.

Sarah Morais, et. al. (2010), “Contribution of a Xylan-Binding Module to the Degradation of a Complex Cellulosic Substrate by Designer Cellulosomes” e US20120301930, unem as enzimas livres xilanase Xyn11A e Xyn11B de Thermobifida fusca, através de uma abordagem de bioengenharia celulossômica para testar a melhora de sua ação na degradação da biomassa quando unidas. US20120028306, US20110312058 e US20120021092 descrevem uma enzima com atividade xilanásica de um Bacillus subtilis que tem diversas aplicações, dentre elas, na área de produção do bioetanol. PT1263941 apresenta um xilanase preferencialmente de um B. subtilis que possui sensibilidade reduzida a um inibidor dessa enzima, tipicamente uma proteína, que possui o papel de controlar a despolimerização de hidratos de carbono complexos. Suas principais aplicações seriam para forragem, produção de amido, panificação, separação de farinha e produção de papel e pasta. US5306633, US8372620, US20050079573, US20100040595, BR200417821 descrevem uma xilanase útil para o segmento de alimentos, que no caso da segunda e terceira patente a enzima é de um B. subtilis, que têm propriedades mais adequadas para dito segmento, e para o último documento, melhor resistência à temperatura. CA2210247 apresenta uma nova quimera a partir da substituição da xilanase de um Bacillus ou Trichoderma por uma sequência de aminoácidos de uma xilanase de Thermomonospora fusca para melhora da termofilicidade e alcalofilicidade. O objetivo de aplicação é para o branqueamento de pasta de madeira. CN102051350 traz uma nova enzima bifuncional, com atividade xilosidase e arabinofuranosidase, para conversão de biomassa lignocelulósica aplicada à indústria química, têxtil, de alimentos e bioenergia. Bem como a CN101870966 também apresenta os mesmos objetivos, no entanto, com uma enzima bifuncional glicosidase/xilosidase. É evidente, portanto, que grandes esforços têm sido empregados a fim de encontrar enzimas capazes de atingir altos rendimentos, melhorando, consequentemente, a produção do etanol de segunda geração. Dessa forma, a presente invenção vem sanar parte das necessidades encontradas nos processos hidrolíticos.Sarah Morais, et. al. (2010), “Contribution of the Xylan-Binding Module to the Degradation of a Complex Cellulosic Substrate by Designer Cellulosomes” and US20120301930, join Thermobifida fusca's free xylanase enzymes Xyn11A and Xyn11B through a cellulosic bioengineering approach to test improvement their action on biomass degradation when united. US20120028306, US20110312058 and US20120021092 describe an enzyme with xylanase activity of a Bacillus subtilis that has several applications, among them, in the bioethanol production area. PT1263941 discloses a xylanase preferably from a B. subtilis that has reduced sensitivity to an inhibitor of that enzyme, typically a protein, which has the role of controlling depolymerization of complex carbohydrates. Its main applications would be for fodder, starch production, baking, flour separation and paper and pulp production. US5306633, US8372620, US20050079573, US20100040595, BR200417821 describe a useful xylanase for the food segment, which in the case of the second and third patents the enzyme is of a B. subtilis, which have properties more suitable for said segment, and for the last document. , better temperature resistance. CA2210247 discloses a new chimera from the replacement of a Bacillus or Trichoderma xylanase with an amino acid sequence of a Thermomonospora fusca xylanase for improved thermophilicity and alkalophilicity. The purpose of application is for wood pulp bleaching. CN102051350 brings a new bifunctional enzyme, with activity xilosidase and arabinofuranosidase, for lignocellulosic biomass conversion applied to the chemical, textile, food and bioenergy industries. As well as CN101870966 also has the same goals, however, with a bifunctional glycosidase / xylosidase enzyme. It is evident, therefore, that great efforts have been employed to find enzymes capable of achieving high yields, thereby improving the production of second generation ethanol. Thus, the present invention addresses part of the needs encountered in hydrolytic processes.

Um inconveniente da técnica anterior refere-se aos sistemas que prevêem as respostas para diferentes "Hnkers”, sistemas esses que não podem ser utilizados para predizer os resultados que foram obtidos com o linker aplicado na presente invenção. Dessa forma, a quimera obtida na presente invenção de forma surpreendentemente melhora a atividade xilanásica e xilosidásica existente.A drawback of the prior art relates to systems that predict the responses to different Hnkers, which systems cannot be used to predict the results that were obtained with the linker applied in the present invention. The invention surprisingly improves the existing xylanasic and xylosidic activity.

Outro inconveniente da técnica anterior refere-se à falha em aperfeiçoar a atividade das quimeras com relação às enzimas não fusionadas que, apesar de manterem a atividade das enzimas quiméricas próximas à das enzimas não fusionadas, não apresentam uma melhora tão acentuada quanto à da presente invenção. Em alguns casos relatados ocorre até mesmo perda de rendimento, Outro inconveniente da técnica anterior se refere à utilização de beta-xilosidades de famílias que promovem a transglicosilação de xilose e formação de polímeros.Another drawback of the prior art relates to the failure to improve the activity of chimeras with respect to non-fused enzymes which, while maintaining the activity of chimeric enzymes close to that of non-fused enzymes, do not show as marked an improvement as that of the present invention. . In some reported cases even yield loss occurs. Another drawback of the prior art concerns the use of beta-xylosities from families that promote xylose transglycosylation and polymer formation.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

De uma forma geral este invento propõe uma enzima bifuncional com atividade de xilanase e xilosidase para o tratamento de matéria rica em hemicelulose para a liberação de xilose.In general this invention proposes a bifunctional enzyme with xylanase and xylosidase activity for the treatment of hemicellulose rich matter for xylose release.

Assim, foi desenvolvida uma associação de enzimas diferentes pela ligação de seus domínios a um linker. 9 Figura então como um primeiro objetivo da presente invenção prover uma enzima bifuncional que atue sinergicamente na conversão de matéria rica em hemicelulose, em açúcares menores e adequados à produção de bioetanol ou outros produtos químicos de valor agregado, como por exemplo, polímeros interessantes para a indústria, mediante uma otimização das atividades enzimáticas e com consequente redução nos custos de processo. Em que matéria rica se refere a substratos que contenham, em sua estrutura, polímeros com unidades de xiloses, sendo esses preferencialmente bagaço e palha de cana-de-açúcar.Thus, an association of different enzymes was developed by linking their domains to a linker. It is therefore a first object of the present invention to provide a bifunctional enzyme that acts synergistically on the conversion of hemicellulose rich matter into smaller sugars suitable for the production of bioethanol or other value-added chemicals, such as polymers of interest for by optimizing enzymatic activities and thereby reducing process costs. Where rich matter refers to substrates containing in their structure polymers with xylose units, which are preferably sugarcane bagasse and straw.

Em continuidade tem-se um processo de obtenção de xilose, através do tratamento de matéria rica em hemicelulose, como por exemplo, biomassa lignocelulósica, mais especificamente, bagaço e palha de cana-de-açúcar, mediante a utilização da enzima bifuncional, bem como seu método de produção. E, por fim, um processo de tratamento de resíduo de tratamento de matéria rica em hemicelulose, como por exemplo, licor de tratamento hidrotérmico. A dita liberação de xilose proporciona melhora na etapa de fermentação do bagaço, pois agrega ao processo um açúcar que pode ser convertido em etanol ou outros produtos químicos, a partir de micro-organismos capazes de metabolizar pentoses.In continuity there is a process of obtaining xylose through the treatment of rich hemicellulose matter, such as lignocellulosic biomass, more specifically, sugarcane bagasse and straw, using the bifunctional enzyme, as well as your production method. And, finally, a waste treatment process for treating hemicellulose rich matter, such as hydrothermal treatment liquor. This release of xylose provides improvement in the bagasse fermentation stage, as it adds to the process a sugar that can be converted into ethanol or other chemicals, from microorganisms capable of metabolizing pentoses.

DESCRIÇÃO DAS FIGURASDESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1 - Curvas de pH da quimera e β-xilosidase feitas em substrato sintético pNPX;Figure 1 - pH curves of chimera and β-xilosidase made on pNPX synthetic substrate;

Figura 2 - Curva de temperatura da quimera e da endoxilanase em substrato Xilano beechwood;Figure 2 - Temperature curve of chimera and endoxylanase in Xylan beechwood substrate;

Figura 3 - Curva de temperatura da quimera e da endoxilanase em sintético pNPX;Figure 3 - Temperature curve of chimera and endoxylanase in synthetic pNPX;

Figura 4 - Quantificação de Xilose liberada a partir de Xilano beechwood em reação de hidrólise por 24 horas;Figure 4 - Quantification of Xylose released from beechwood Xylan in hydrolysis reaction for 24 hours;

Figura 5 - Eletroforese capilar de zona (CZE) mostrando a maior eficiência da quimera na quebra do substrato com liberação de xilose (X1) após hidrólise, em comparação com a união dos módulos numa só atividade que resultou na quebra do substrato mas com liberação de oligossacarídeos de vários tamanhos (X2, X3, X4 , X5, X6);Figure 5 - Zone Capillary Electrophoresis (CZE) showing greater chimera efficiency in breaking xylose-releasing substrate (X1) after hydrolysis, compared with uniting together in one activity that resulted in breaking substrate but releasing oligosaccharides of various sizes (X2, X3, X4, X5, X6);

Figura 6 - Rendimento na produção das enzimas em termos de atividade no substrato xilano beechwood. XAXB:Quimera, XA: xilanase, XB: β-xilosidase; r Figura 7 - Rendimento na produção das enzimas em termos (de atividade no substrato pNPX. XAXB:Quimera, XA: xilanase, XB: β-xilosidase.Figure 6 - Yield in enzyme production in terms of activity on the beechwood xylan substrate. XAXB: Chimera, XA: xylanase, XB: β-xylosidase; r Figure 7 - Yield in enzyme production in terms of (activity on pNPX substrate. XAXB: Chimera, XA: xylanase, XB: β-xylosidase.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção aborda uma enzima bifuncional com atividade de xilanase e xilosidase construída por módulos do micro-organismo Bacillus subtilis, e ligadas por um linker específico, conforme sequência de DNA SEQ ID NO 1, com boa atividade de hidrólise em biomassas em geral, mas especificadamente sobre bagaço e palha de cana-de-açúcar, que apresenta grande potencial para aplicação industrial, haja visto toda a biomassa gerada a partir da fermentação da cana-de-açúcar.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a bifunctional enzyme with xylanase and xylosidase activity constructed by Bacillus subtilis microorganism modules, and linked by a specific linker according to DNA sequence SEQ ID NO 1, with good hydrolysis activity in biomass. In general, but specifically on sugarcane bagasse and straw, which has great potential for industrial application, we have seen all the biomass generated from the fermentation of sugarcane.

Assim, a presente invenção aborda uma construção mediante a união de dois módulos individuais, utilizando a técnica de fusão “end-to-end", sendo que os módulos estão conectados por um linker específico. A enzima deste invento é capaz de obter a xilose mediante a ação sinérgica que ocorre sobre o substrato, sendo que a xilanase promove a quebra dos xiloligômeros a xilobiose, enquanto a xilosidase atua na quebra de xilobiose em xilose. A quimera obtida é mais eficaz do que as enzimas não fusionadas, resultando em um produto melhor, com resultados mais positivos que as os módulos individuais, sendo que a quimera foi capaz de liberar mais xilose do que seus módulos individuais separados. A enzima é uma construção de duas hemicelulases, uma endo-1,4-p-xílanase (GH11) e p-1,4-xilosidase (GH43), ambas provenientes de Bacillus subtilis, unidas por meio de um linker de laminarase (GH16) proveniente de Thermotoga petrophila, de acordo com a SEQ ID NO 1. Há que se salientar que enzimas beta-xilosidades, as quais desempenham a catálise com o mecanismo de retenção, podem além de hidrolisar, também sintetizar (transglicosilação), e com isso, reduzem o rendimento do produto xilose a ser obtido, uma vez que ao realizar a transglicosilação a enzima está polimerizando novamente os açúcares em xilooligossacarídeos.Thus, the present invention addresses a construction by joining two individual modules using the end-to-end fusion technique, the modules being connected by a specific linker. The enzyme of this invention is capable of obtaining xylose. synergistic action that occurs on the substrate, and xylanase promotes the breakdown of xyloligomers to xylobiose, while xylosidase acts on the breakdown of xylobiose in xylose.The obtained chimera is more effective than the non-fused enzymes, resulting in a product better, with more positive results than the individual modules, and the chimera was able to release more xylose than its separate individual modules.The enzyme is a construct of two hemicellulases, an endo-1,4-p-xylanase (GH11). ) and p-1,4-xylosidase (GH43), both from Bacillus subtilis, joined by a laminarase linker (GH16) from Thermotoga petrophila according to SEQ ID NO 1. However, beta-xylosity enzymes, which perform catalysis with the retention mechanism, can hydrolyze and synthesize (transglycosylation), and thus reduce the yield of the xylose product to be obtained, since by performing transglycosylation. The enzyme is again polymerizing sugars into xyloligosaccharides.

Contudo a presente invenção utiliza especificamente uma beta xilosidase da família GH43, que não desempenha esta atividade e, portanto, provê altos rendimentos de xilose ao coibir a repolimerização.However the present invention specifically utilizes a GH43 family beta xylosidase which does not perform this activity and thus provides high xylose yields by curbing repolymerization.

Além disso, parte fundamental desta nova construção enzimática é a seleção do linker utilizado, o qual cria uma conformação espacial f estendida que agrega maior flexibilidade à cadeia final. Há que se salientar que este linker melhora a atividade destas enzimas quando comparadas individualmente. A quimera xilanase_p-xilosidase é obtida com módulos do micro-organismo Bacillus subitilis. O fragmento de DNA foi clonado em plasmídeo para expressão da proteína em cepas de E.coli.In addition, a key part of this new enzyme construct is the selection of the linker used, which creates an extended spatial conformation that adds greater flexibility to the final chain. It should be noted that this linker improves the activity of these enzymes when compared individually. The xylanase_p-xilosidase chimera is obtained with modules of the Bacillus subitilis microorganism. The DNA fragment was cloned into a plasmid for protein expression in E.coli strains.

Esta enzima bifuncional pode ter identidade ou similaridade de sequências maiores que 60% comparando-se com a SEQ ID NO 1. O processo de preparação desta enzima bifuncional é descrito em termos das etapas: preparação do inóculo, crescimento, indução da expressão da proteína, recuperação do micro-organismo, lise erecuperação do produto. O procedimento geral de expressão heteróloga será descrito a seguir lembrando que foram realizadas adaptações conforme a célula hospedeira ou a necessidade de melhorar a expressão.This bifunctional enzyme may have sequence identity or similarity greater than 60% compared to SEQ ID NO 1. The preparation process of this bifunctional enzyme is described in terms of the steps: inoculum preparation, growth, protein expression induction, microorganism recovery, lysis and product recovery. The general procedure of heterologous expression will be described below remembering that adaptations were made according to the host cell or the need to improve expression.

Preparação do Inóculo Com uma colônia do transformante de £. coli foi feito seu pré-ínóculo em 10 ml de meio LB líquido 1% (m/v) de triptona, 1% (m/v) NaCI e 0,5% (m/v) de extrato de levedura com 50 pg/mL de kanamicina incubados a 37°C e 250 rpm por 16 horas. Alíquotas de 5 mL do pré-inóculo foram transferidas para 500 ml de meio LB líquido com 50 pg/ml de canamicina. A reação foi incubada a 37°C, 250 rpm e acompanhado o crescimento celular através de leitura da densidade óptica e a retirada de amostra para posterior análise em gel SDS-PAGE 12% (eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio) (Laemmli, 1970).Inoculum Preparation With a transformant colony of £. coli was pre-inoculated in 10 ml tryptone 1% (w / v) liquid LB medium, 1% (w / v) NaCl and 0.5% (w / v) 50 pg / yeast extract mL of kanamycin incubated at 37 ° C and 250 rpm for 16 hours. 5 mL aliquots of the pre-inoculum were transferred to 500 ml of liquid LB medium with 50 pg / ml kanamycin. The reaction was incubated at 37 ° C, 250 rpm and cell growth was monitored by reading optical density and taking samples for further analysis on 12% SDS-PAGE gel (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) ( Laemmli, 1970).

Crescimento, Indução da Expressão da Proteína e Recuperação do Microrqanismo A densidade óptica foi monitorada a 600 nm (por espectrofotometria) até atingir próximo de 0,6, correspondente à fase de crescimento exponencial das células, inicia-se à indução da expressão das proteínas com 0,5 - 1 mM de IPTG (indutor). Foram recolhidas alíquotas durante a indução para posterior análise por SDS-PAGE 12%. Após 4 horas de indução, as células foram centrifugadas por 30 minutos, 9000 rpm, a 4°C.).Growth, Protein Expression Induction and Microorganism Recovery The optical density was monitored at 600 nm (by spectrophotometry) until it reaches close to 0.6, corresponding to the exponential growth phase of the cells. 0.5 - 1 mM IPTG (inductor). Aliquots were collected during induction for further analysis by 12% SDS-PAGE. After 4 hours of induction, cells were centrifuged for 30 minutes, 9000 rpm at 4 ° C.).

Lise Celular e Recuperação do Produto A lise do microrganismo ocorre por qualquer meio de rompimento celular efetuados para E. coli, bem como sua recuperação também pode ocorrer através de qualquer meio daquele conhecido pelo estado da técnica. A seguir são descritos uns dos meios para efetuar tal etapa: O sedimentado celular resultante da centrifugação da cultura de células foi ressuspendido em tampão fostato de sódio pH 7,4 com 0,5 mg/mL de lisozima. Após incubação à temperatura ambiente foram realizados ciclos de sonicação. O lisado foi centrifugado por 10-60 minutos, a 9000-12000 g e a 4°C. Foi guardada uma amostra do pellet (sedimentado) para posterior análise em gel SDS PAGE 12%. Com o sobrenadante (não sedimentado) foi realizado teste de atividade para confirmar a presença da enzima de interesse. Confirmada a atividade deu-se prosseguimento às etapas de purificação.Cell Lysis and Product Recovery The lysis of the microorganism occurs by any means of cell disruption performed for E. coli, as well as its recovery may also occur by any means known to the prior art. Means for performing such a step are described below: The cell pellet resulting from the cell culture centrifugation was resuspended in pH 7.4 sodium phosphate buffer with 0.5 mg / ml lysozyme. After incubation at room temperature sonication cycles were performed. The lysate was centrifuged for 10-60 minutes at 9000-12000 g and at 4 ° C. A sample of the pellet (pelleted) was saved for further analysis on 12% SDS PAGE gel. With the supernatant (not sedimented) an activity test was performed to confirm the presence of the enzyme of interest. Once the activity was confirmed, the purification steps were continued.

Purificação por Cromatoqrafia de Afinidade A sequência amino-terminal de 6 resíduos de histidina adicionada na proteína recombinante, pelo vetor pET permite sua purificação por cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC). Esta técnica é baseada na ligação reversível entre o íon e o anel imidazólico da histidina, aminoácidos presentes na proteína. O sobrenadante resultante da lise celular contendo a enzima multifuncional de interesse foi purificado utilizando a coluna HisTrap™ de 5 mL (GE Healthcare) acoplada ao sistema AKTA™FPLC™ (GE Healthcare) a 0,3 MPa de pressão e 1 mL/min de fluxo. O sobrenadante foi aplicado na coluna previamente equilibrada com tampão. O desligamento da enzima ocorre com a utilização de um gradiente linear de 0 a 100% de tampão, adicionado de 500 mM de imidazol, o imidazol presente compete com a histidina pela ligação no íon metálico. As frações coletadas correspondentes a cada pico do cromatograma e ao flow-through foram analisadas por SDS-PAGE 12%.Purification by Affinity Chromatography The amino-terminal sequence of 6 histidine residues added to the recombinant protein by the pET vector allows its purification by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC). This technique is based on the reversible bond between the ion and the imidazolic ring of histidine, amino acids present in the protein. The resulting cell lysis supernatant containing the multifunctional enzyme of interest was purified using the 5 mL HisTrap ™ column (GE Healthcare) coupled to the AKTA ™ FPLC ™ system (GE Healthcare) at 0.3 MPa pressure and 1 mL / min of flow. The supernatant was applied to the column previously equilibrated with buffer. Enzyme shutdown occurs using a linear gradient of 0 to 100% buffer, added with 500 mM imidazole, imidazole present competes with histidine for metal ion binding. The collected fractions corresponding to each chromatogram peak and flow-through were analyzed by 12% SDS-PAGE.

Purificação por Cromatoqrafia de Exclusão Molecular As frações vindas da cromatografia de afinidade que continham a proteína recombinante foram identificadas com o uso da técnica de SDS-PAGE, sendo posteriormente agrupadas para concentração e diálise. A amostra foi então concentrada e dialisada com tampão 20 mM de fosfato de sódio, 50mM NaCI em centrifugação, à 3.800 rcf, 4°C, até o volume baixar para aproximadamente 2ml. As enzimas passaram também pelo processo de cromatografia de filtração em gel, técnica que separa moléculas com base na forma e no peso molecular, sendo também denominada de cromatografia por exclusão molecular. A coluna utilizada foi a Superdex 200 GL 10/300 GE Healthcare® (10 mm de diâmetro e 300 mm de altura) acoplada ao sistema ÀKTA™FPLC™ GE Heathcare®, em um sistema isocrático com fluxo de 0,5 mL/min e pressão máxima de 1,5 MPa, utilizando como eluente o tampão 20 mM fosfato de sódio, 50 mM NaCI. As frações e o flowtrought também foram analisados no gel SDS-PAGE e as frações que continham a proteína de interesse foram concentradas.Purification by Molecular Exclusion Chromatography Fractions from the affinity chromatography containing the recombinant protein were identified using the SDS-PAGE technique and then pooled for concentration and dialysis. The sample was then concentrated and dialyzed with 20mM sodium phosphate buffer, 50mM NaCl in centrifugation, at 3,800 rcf, 4 ° C, until the volume dropped to approximately 2ml. The enzymes also underwent the process of gel filtration chromatography, a technique that separates molecules based on shape and molecular weight, and is also called molecular exclusion chromatography. The column used was the GE Healthcare® Superdex 200 GL 10/300 (10 mm diameter and 300 mm height) coupled to the GE Heathcare® ÀKTA ™ FPLC ™ system, in an isocratic system with a flow rate of 0.5 mL / min and maximum pressure of 1.5 MPa using 20 mM sodium phosphate buffer, 50 mM NaCl as eluent. Fractions and flowtrought were also analyzed on the SDS-PAGE gel and fractions containing the protein of interest were concentrated.

Os resultados obtidos pela presente invenção mostram que a quimera xilanasej3-xilosidase tem vantagens significativas em relação à atividade obtida de seus módulos separados. Verificou-se que há um ganho na termoestablidade da enzima β-xilosidase quando unida ao módulo da endo-xilanase, pois sua atividade ótima foi deslocada de 35°C para 50°C quando unida formando a quimera.The results obtained by the present invention show that the xylanase? 3-xylosidase chimera has significant advantages over the activity obtained from its separate modules. It was found that there is a gain in the thermostability of the enzyme β-xylosidase when attached to the endo-xylanase module, as its optimal activity was shifted from 35 ° C to 50 ° C when joined forming the chimera.

Além disso, a quimera mostrou uma maior eficiência na hidrólise do substrato padrão xilano beechwood visto que após 24 horas de atividade a concentração de xilose no ensaio com a quimera foi de cerca de 7,5 mg/mL, enquanto que no ensaio realizado com seus módulos individuais, na mesma proporção molar, a concentração foi de 3,2 mg/mL. O rendimento na produção dessas enzimas em termos de atividade em seus substratos específicos também foi maior para a quimera em comparação aos módulos individuais.In addition, the chimera showed greater efficiency in the hydrolysis of the beechwood xylan standard substrate as after 24 hours of activity the xylose concentration in the chimera assay was about 7.5 mg / mL, whereas in the assay performed with its individual modules, at the same molar ratio, the concentration was 3.2 mg / mL. The yield of these enzymes in terms of activity on their specific substrates was also higher for chimera compared to individual modules.

Ademais, a presente invenção provê um processo de produção de etanol de segunda geração, mediante a degradação de biomassa vegetal, preferencialmente bagaço e/ou palha de cana-de açúcar, utilizando uma enzima bifuncional tal como acima descrita e ainda, a dita enzima pode atuar suplementando coquetéis enzimáticos aplicados na degradação da biomassa lignocelulósica. É importante ressaltar que, qualquer matéria rica em hemicelulose, ou seja, que seja constituída por esse polímero e outros mais podem ser degradadas, hidrolisadas até a formação de xilose, pela enzima bifuncional da presente invenção. É também importante ressaltar que tanto o plasmídeo em que os fragmentos serão clonados, quanto o microrganismo em que a enzima será expressa, podem ser qualquer um daqueles inseridos no estado da técnica, e que permitam o bom andamento das próximas etapas do processo de obtenção da enzima bifuncional. É também importante ressaltar que o meio de cultura utilizado para preparação do inóculo pode ser qualquer um já conhecido no estado da técnica, e que permita o bom andamento das próximas etapas do processo de obtenção da enzima bifuncional. É também importante ressaltar que as condições de crescimento, indução, recuperação e lise, podem ser quaisquer umas daquelas,'já inseridas no estado da técnica, e que permitam a produção da enzima bifuncional. A presente invenção ainda prove um processo de obtenção da xilose, bem como um processo de tratamento do resíduo obtido por tratamento da matéria rica em hemicelulose mediante a aplicação da enzima bifuncional da presente invenção. A obtenção da xilose está condicionada a utilização da enzima binfuncional da presente invenção para a desestruturação da matéria rica em hemicelulose, tal como biomassa lignocelulósica, preferencialmente bagaço ou palha de cana-de-açúcar. Referido processo ocorre a pH de 6 a 8, com variação de temperatura de 20 a 60°C, mais precisamente de 45 a 50°C, em tempos de 0,5-48 horas, preferencialmente de 20 horas. O processo de tratamento dos resíduos obtidos do tratamento de matéria rica em hemicelulose é baseado na utilização da enzima bifuncional acima descrita, a qual é colocada em contato com os referidos resíduos. Este resíduo pode ser preferencialmente um licor rico em hemicelulose, sendo que este método compreende as seguintes etapas: a) pré-tratamento da biomassa lignocelulósica com água quente e/ou explosão a vapor; b) separação da fração rica em hemicelulose, líquida, e da fração rica em celulose e lignina, sólida; c) tratamento da fase líquida obtida da etapa anterior com a enzima bifuncional da presente invenção.Furthermore, the present invention provides a second generation ethanol production process by degrading plant biomass, preferably sugarcane bagasse and / or straw, using a bifunctional enzyme as described above and further, said enzyme may act by supplementing enzymatic cocktails applied in the degradation of lignocellulosic biomass. Importantly, any material rich in hemicellulose, i.e. consisting of such a polymer and more can be degraded, hydrolysed to xylose formation, by the bifunctional enzyme of the present invention. It is also important to point out that both the plasmid in which the fragments will be cloned, as well as the microorganism in which the enzyme will be expressed, can be any of those inserted in the state of the art, and allow the next steps of the process of obtaining the DNA to proceed smoothly. bifunctional enzyme. It is also important to note that the culture medium used for inoculum preparation can be any one already known in the state of the art, and permits the smooth progress of the next steps in the process of obtaining the bifunctional enzyme. It is also important to note that the conditions of growth, induction, recovery and lysis may be any of those already in the state of the art which allow the production of the bifunctional enzyme. The present invention further provides a process for obtaining xylose as well as a process for treating the residue obtained by treating the hemicellulose rich matter by applying the bifunctional enzyme of the present invention. Obtaining xylose is subject to the use of the binfunctional enzyme of the present invention for the disruption of hemicellulose rich matter, such as lignocellulosic biomass, preferably sugarcane bagasse or straw. Said process occurs at a pH of 6 to 8, with a temperature range of from 20 to 60 ° C, more precisely from 45 to 50 ° C, in times of 0.5-48 hours, preferably 20 hours. The process of treating the residues obtained from the treatment of hemicellulose rich matter is based on the use of the bifunctional enzyme described above, which is brought into contact with said residues. This residue may preferably be a hemicellulose rich liquor, which method comprises the following steps: a) pre-treating the lignocellulosic biomass with hot water and / or steam explosion; b) separating the liquid hemicellulose-rich fraction from the solid lignin-rich cellulose fraction; c) treating the liquid phase obtained from the previous step with the bifunctional enzyme of the present invention.

Exemplos Curvas de pH A faixa de pH ótimo para a atividade da quimera e seus módulos foi determinada em seus substratos específicos como descrito na metodologia, gerando as curvas apresentadas na Figura 1.Examples pH Curves The optimal pH range for chimera activity and its modules was determined on its specific substrates as described in the methodology, generating the curves shown in Figure 1.

Nota-se que a faixa de pH para atividade ótima dessas enzimas fica dentro do intervalo de 6 a 8, apresentando queda acentuada com uma variação de apenas 0,5 ponto de pH para menos ou 1,0 para mais, como podemos ver para a atividade da β-xilosidase em pNPX que perdeu mais de 80% de sua atividade tanto em pH 5,5 e em pH9,0. O pH ótimo para atividade de β-xilosidases provenientes de diversos micro-organismos abrange uma gama variável de valores que vão desde os mais ácidos como para β-xilosidase de Clostridium stercorarium (pH 3,5) (Suryani, * 2004) até os mais básicos como para a β-xilosidase de Bacillus holodurans C-125 com pl-l ótimo de 8,0 (Smaali, 2006). Assim, também são encontrados β-xilosidases com atividade ótima na faixa de 6,0 a 7,0 como em Thermoanaerobacterium sacchorolyticum pH 6,0 (Shao, 2010).It is noted that the pH range for optimal activity of these enzymes is within the range of 6 to 8, showing a sharp drop with a variation of only 0.5 pH below or 1.0 above, as we can see for β-xylosidase activity in pNPX that lost more than 80% of its activity at both pH 5.5 and pH9.0. The optimal pH for β-xylosidase activity from various microorganisms covers a variable range of values ranging from the most acidic to Clostridium stercorarium β-xylosidase (pH 3.5) (Suryani, * 2004) to the highest. as for Bacillus holodurans C-125 β-xylosidase with optimal pl-1 of 8.0 (Smaali, 2006). Thus, β-xylosidases with optimal activity in the range of 6.0 to 7.0 are also found as in Thermoanaerobacterium sacchorolyticum pH 6.0 (Shao, 2010).

Comumente trabalhos com enzimas multifuncionais tem trazido resultados mostrando que a união de duas enzimas numa quimera não alteram o pH ótimo em relação a seus módulos livres (Xue, 2009).Como pode ser observado aqui, especialmente para a atividade em Xilano onde as curvas de pH da quimera e da xilanase sozinha ficaram muito parecidas.Commonly works with multifunctional enzymes have brought results showing that the union of two enzymes in a chimera does not alter the optimal pH in relation to their free modules (Xue, 2009). As can be observed here, especially for the activity in Xilano where the curves of pH of chimera and xylanase alone were very similar.

Neste sentido a união dos dois módulos catalíticos (χίΐ3η3εβ_β-xilosidase) não alteraram o pH ótimo da construção final da quimera (Figura 1).In this sense, the union of the two catalytic modules (χίΐ3η3εβ_β-xilosidase) did not alter the optimal pH of the chimera's final construction (Figure 1).

Curvas de Temperatura Tendo sido encontrada um pH ótimo igual para todas a enzimas em estudo, seguiu-se a determinação da temperatura em que estas apresentam maior atividade.Temperature Curves Having found an optimum pH equal to all the enzymes under study, it was followed by the determination of the temperature in which they present the highest activity.

Analisando as curvas de temperatura de endo-xilanase e da quimera em Xilano (Figura 2) vemos que houve uma mudança no padrão da curva, pois a xilanase apresenta uma faixa de temperatura em que sua atividade está acima de 80%, maior que a da quimera, abrangendo de 35CC a 55°C enquanto a quimera tem esse nível de atividade apenas entre as temperaturas de 40 a 50°C.Analyzing the endo-xylanase and chimera temperature curves in Xylan (Figure 2) we see that there has been a change in the curve pattern, because xylanase has a temperature range in which its activity is above 80%, higher than chimera, ranging from 35CC to 55 ° C while the chimera has this level of activity only between temperatures of 40 to 50 ° C.

Para as curvas de temperatura da β-xilosidase e da quimera em pNPX (Figura 3) temos um deslocamento significativo do pico de atividade ótima, visto que a β-xilosidase (domínio único) teve maior atividade a 35°C mantendo uma faixa muito estreita de atividade acima de 80% quando variada a temperatura, enquanto que a quimera (xilanase^-xilosidase) teve um pico de atividade ótima a 50°C com uma curva muito mais suave, ou seja, com uma faixa de temperatura de 30 a 55°C com atividade acima de 80% Assim, como para o pH, a temperatura ótima para um mesmo tipo de enzima varia muito. Podemos encontrar na literatura para β-xilosidase temperaturas para atividade ótima que vão de 90°C Thermotoga marítima (Xue, 2004) a 25°C em Selenomonas ruminantium (Jordam, 2008) e mesmo para outras β-xilosidases como a de Bacillus pumilus de atividade máxima a 37°C (Xu, 1991).For the β-xylosidase and chimera temperature curves in pNPX (Figure 3) we have a significant displacement of the optimal activity peak, since β-xylosidase (single domain) had higher activity at 35 ° C maintaining a very narrow range. above 80% when temperature varied, while the chimera (xylanase ^ -xylosidase) peaked at 50 ° C with a much smoother curve, ie a temperature range of 30 to 55 ° C. ° C with activity above 80% Thus, as for pH, the optimum temperature for the same type of enzyme varies greatly. We can find in the literature for β-xylosidase optimum activity temperatures ranging from 90 ° C Maritime Thermotoga (Xue, 2004) to 25 ° C in Selenomonas ruminantium (Jordam, 2008) and even for other β-xylosidases such as Bacillus pumilus de maximum activity at 37 ° C (Xu, 1991).

Em nosso trabalho a quimera proporcionou o aumento da termoestabilidade do domínio de β-xilosidase, fornecendo um aumento de 15°C em sua temperatura ótima.In our work, the chimera increased the thermostability of the β-xylosidase domain, providing a 15 ° C increase in its optimal temperature.

Hidrólise enzimática de Xilano Para que fosse possível a comparação da eficiência na liberação de xilose a partir de um substrato poiissacarídico, a enzima quimérica xilanase_p-xilosidase assim como uma mistura de seus módulos individuais na mesma proporção molar foram incubadas à temperatura de 45°C por 24 horas sob agitação constante em substrato Xilano beechwood, com retirada de nove alíquotas correspondentes aos tempos de 0, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 19, e 24 horas. A quantificação da xilose liberada (Figura 4) mostra que há um ganho significativo na liberação desse monossacarídeo quando substrato é incubado com a quimera, comparando-se com a reação de hidrólise em que seus módulos separados são colocados juntos numa reação na mesma proporção molar, visto que após 24 horas de hidrólise a concentração de xilose no ensaio com a quimera era cerca de 8 mg/mL, substancialmente maior que a reação que continha os módulos individuais.Enzymatic Hydrolysis of Xylan In order to be able to compare the efficiency of xylose release from a polysaccharide substrate, the chimeric enzyme xylanase_p-xilosidase as well as a mixture of its individual modules in the same molar ratio were incubated at 45 ° C for 24 hours under constant stirring in beechwood Xylan substrate, with removal of nine aliquots corresponding to times 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 19, and 24 hours. Quantification of released xylose (Figure 4) shows that there is a significant gain in the release of this monosaccharide when substrate is incubated with the chimera compared to the hydrolysis reaction in which its separate modules are placed together in a reaction at the same molar ratio. whereas after 24 hours of hydrolysis the xylose concentration in the chimera assay was about 8 mg / mL, substantially higher than the reaction containing the individual modules.

Além disso, também foi verificado que a quimera quebra o substrato mais eficientemente, tendo em vista que após o período de 24 horas o substrato hidrolisado com a quimera apresentava maior proporção de xilose em relação aos demais oligossacarídeos. Contrariamente, no resultado do ensaio realizado com a mistura dos módulos separados se observa uma grande quantidade de oligossacarídeos, especialmente X3 (oligossacarídeo de três xiloses), enquanto que a xilose aparece numa proporção mais baixa (Figura 5).In addition, it was also found that the chimera breaks the substrate more efficiently, since after 24 hours the hydrolyzed substrate with the chimera had a higher proportion of xylose than the other oligosaccharides. In contrast, the result of the test performed with the mixing of the separate modules shows a large amount of oligosaccharides, especially X3 (three xylose oligosaccharides), while xylose appears in a lower proportion (Figure 5).

Como já citado, estudos com foco na engenharia de proteínas multifuncionais trazem resultados positivos para a união de módulos enzimáticos diferentes, e o ganho em termos de atividade tem sido creditado em sua maior parte a proximidade física das enzimas e a flexibilidade conformacional dada pelo linker que une as unidades (Adlakha, 2011; Xue 2009).As already mentioned, studies focusing on multifunctional protein engineering bring positive results for the joining of different enzyme modules, and the gain in activity has been mostly credited to the physical proximity of the enzymes and the conformational flexibility given by the linker that joins the units together (Adlakha, 2011; Xue 2009).

Trabalhando com uma quimera bifuncional também com módulos de xilanase e β-xilosidase, porém do micro-organismo Clostridium thermocellum, Fan et. al. 2008 demonstraram não haver diferença significativa na atividade na liberação de xilose quando a quimera foi comparada a seus módulos numa mistura para hidrólise dos substratos oat spelt e wheat arabinoxylan.Working with a bifunctional chimera also with xylanase and β-xylosidase modules, but from the microorganism Clostridium thermocellum, Fan et. al. 2008 showed no significant difference in activity on xylose release when the chimera was compared to its modules in a mixture for hydrolysis of oat spelt and wheat arabinoxylan substrates.

Rendimento na produção das enzimas Para fins de comparação na produção dessas enzimas os testes foram realizados em condições padronizadas, como descrito nos métodos, e a medida de rendimento foi calculada tomando-se a atividade do sobrenadante pela massa celular resultante após expressão heteróloga, gerando uma unidade de U/mL f por grama de massa celular.Enzyme Production Yield For purposes of comparison of enzyme production the assays were performed under standard conditions as described in the methods, and the yield measure was calculated by taking the supernatant activity by the resulting cell mass after heterologous expression, generating a unit of U / mL f per gram of cell mass.

Os resultados mostram que o rendimento da quimera foi maior tanto para atividade em xilano quando comparada com o módulo individual de xilanase (Figura 6), quanto para a atividade em pNPX quando comparada com o módulo individual de β-xilosidase (Figura 7).The results show that chimera yield was higher for both xylan activity when compared to individual xylanase modulus (Figure 6) and pNPX activity when compared to individual β-xylosidase modulus (Figure 7).

Em termos de rendimento a quimera apresentou para atividade de xilanase um valor de 1,2 U/mL/g, enquanto que o próprio módulo de xilanase isolado o valor foi de 0,9 U/mL/g, ou seja, houve um rendimento cerca de 0,4 U/mL/g maior para a atividade da quimera sobre o substrato xilano beechwood. Sobre esse substrato o rendimento da β-xilosidase foi muito baixo o que era esperando tendo em vista que este módulo individual atua na hidrólise de oligossacarídeos e não sobre cadeias maiores como as que constituem o xilano.In terms of yield the chimera presented for xylanase activity a value of 1.2 U / mL / g, whereas the xylanase modulus itself was 0.9 U / mL / g, ie there was a yield about 0.4 U / mL / g higher for chimera activity on the beechwood xylan substrate. The yield of β-xylosidase was very low on this substrate, which was expected since this individual module acts on the hydrolysis of oligosaccharides and not on larger chains such as those constituting xylan.

Apesar de uma diferença menor, 0,03 U/mL/g a quimera também apresentou rendimento maior para atividade de β-xilosidase em relação ao módulo individual sobre o substrato sintético pNPX. O módulo isolado da endo-xilanase praticamente não teve atividade sobre esse substrato e dessa forma o valor do rendimento foi muito baixo, o que também era esperado já que essa enzima quebra grandes cadeias de xilano.Despite a smaller difference, 0.03 U / mL / g the chimera also showed higher yield for β-xilosidase activity in relation to the individual modulus on the pNPX synthetic substrate. The isolated modulus of endo-xylanase had virtually no activity on this substrate and thus the yield value was very low, which was also expected as this enzyme breaks down large xylan chains.

Cabe lembrar que a quantificação da atividade sobre substrato pNPX é feita tomando como base uma curva padrão de pNP e por isso os valores de rendimento tem magnitude diferente comparando as atividades sobre o substrato Xilano que usa para a quantificação uma curva de DNS.It is worth remembering that the activity quantification on pNPX substrate is based on a standard pNP curve and therefore the yield values have different magnitude when comparing the activities on the Xylan substrate that uses a DNS curve for quantification.

REIVINDICAÇÃOCLAIM

Claims

1. Bifunctional enzyme with xylanase-xylosidase activity, characterized by having SEQ ID NO 1.

Bifunctional enzyme according to claim 1, characterized in that it consists of a xylosidase, a linker and a xylanase.

Bifunctional enzyme according to claims 1 and 2, characterized in that the xylosidase is GH43 family β-1,4-xylosidase, the xylanase is a GH11 family endo-1,4-β-xylanase and the linker ser part of a GH16 laminarase.

Bifunctional enzyme according to claims 1 to 3, characterized in that the xylanase and xylosidase are from Bacillus sp. and for the linker coming from Thermotoga petrophila.

Bifunctional enzyme according to claims 1 to 4, characterized in that it has sequence identity or similarity greater than 60% compared to SEQ ID NO 1.

Process for producing a bifunctional enzyme with xylanase and xylosidase activities as defined in one of claims 1 to 5, characterized in that the DNA fragment is cloned into plasmids for protein expression in E.coli strains.

Process according to Claim 6, characterized in that it comprises the steps of: a) preparing the inoculum, wherein said inoculum is preferably 1% (w / v) tryptone, 1% (w / v) liquid LB medium NaCl and 0.5% (w / v) yeast extract with 50 pg / ml kanamycin in the presence of E. coli BL21 pRAREII; b) growth, wherein said growth preferably occurs at 20 to 45 ° C for up to 48 hours in shaker or bioreactor cultivating at high cell density; c) induction of protein expression, wherein said induction preferably occurs with IPTG or lactose or mixture of IPTG and lactose in any proportion. d) recovering the microorganism by any means of separation, preferably by centrifugation for 10-60 minutes, 9000-12000 g at 4-10 ° C; e) lysis of the microorganism by any cell disruption means performed for E. coli. f) recovering the product by any separation means, preferably by centrifugation for 10-60 minutes, 9000-12000 g at 4-10 ° C.

Xylose-producing process, characterized in that a bifunctional enzyme as defined in claims 1 to 5 is used to disrupt hemicellulose rich material.

Xylose production process according to Claim 8, characterized in that the hemicellulose rich material is preferably lignocellulosic biomass, more preferably sugarcane bagasse or straw.

Xylose production process according to Claim 8, characterized in that the hemicellulose rich material is preferably a residue from the treatment of hemicellulose rich matter.

Xylose production process according to Claims 8 to 10, characterized in that the degradation of the lignocellulosic biomass occurs at pH 6 to 8, temperature from 20 to 60 ° C, preferably from 45 to 50 ° C, at times of 0 ° C. , 5-48 hours, preferably 20 hours.

A waste treatment process obtained by treating hemicellulose rich matter, characterized in that said residue comes into contact with the bifunctional enzyme as defined in claims 1 to 5.

A waste treatment process obtained by treating hemicellulose rich material according to claim 12, characterized in that said residue is hemicellulose liquor. ·

Waste treatment process for the treatment of hemicellulose rich matter according to claim 12, characterized in that said method has the steps of: a) pre-treating the lignocellulosic biomass with hot water and / or steam explosion; b) separating the liquid hemicellulose-rich fraction from the solid lignin-rich cellulose fraction; treating the liquid phase obtained from the previous step with the bifunctional enzyme as defined in one of claims 1 to 5.