BG99795A

BG99795A - Лекарствена форма на база биостимулатор

Info

Publication number: BG99795A
Application number: BG99795A
Authority: BG
Inventors: Borislav B Trifonov; Georgi K Rusev; Nikola A Boev; Metodi S Petrov
Original assignee: Trifonov; Rusev; Boev; Petrov
Priority date: 1995-07-19
Filing date: 1995-07-19
Publication date: 1997-01-31
Also published as: EP0786987A1; WO1997003653A1; US5948442A; BG62038B1; JPH10508038A; CA2200295A1

Abstract

Лекарствената форма е приложима в животновъдството, диетологията и в хуманната и ветеринарната медицина за стимулиране на морфогенезата. Тя е на базата на биостимулиращи вещества, изолирани от тънкочр евна мукоза на топлокръвни животни, например свине. Лекарствената форма съдържа два биоактивни нуклеопептида от тази мукоза - нискомолекулен нуклеопептид е молекулна маса 0,6-0,65 кИа, съдържащ гуаноз ил, а в пептидната си верига - глицин (Gly) и триптофан (Try), и високомолекулярен нуклеопептид с молекулна маса 1,1-1,3 к11а, съдържащ аденозил, а в пептидната си верига - аргинин (Arg), серии (Ser), левцин (Leu), хистидин (His) и тирозин (Тгп). Нуклеопептидното съдържание е 0,0125- 0,0150% тегл. Носителят е натриев алгинат 0,2-0,25% тегл. и физиологичен разтвор допълва съдържанието до 100% тегл. Л екарствената форма може да е и ентеросолвентна гранула, активното нуклеопептидно съдържание в която е 0,125- 0,150% тегл., а носителят е адсорбент, например нишесте.

Description

Изобретението се отнася до препарата Ентерогенин-пулвис и ампули :метод за изолирането му при промишлени условия;изготвяне на фармацевтичните му форми;проучване на фармакологичните му ефекти. Активната компонента на Ентерогенин-пулвис и ампули е биопродукт, изолиран от тънкочревна мукоз а. Публикувани са данни за наличието в чревната мукоза на вещества,подтискащи клетъчната пролиферация /1,2,3/.В международната литература липсват съобщения за изолиране на вещества със стимулиращ ефект върху морфогенезата.Патентиран е от нас метод за изолиране на биостимулиращо вещество от тънкочревна мукоза на топлокръвни.животни /4,5 /.Недостатъците на този патент се отнасят до сложната технологична обработка.оскъпяваща производството,както и до недовърЕване на метода до кра»ни фармацевтични форми,проучени и в фармакологичен аспект.

···· ·· · · · е ··· · · · ·····

Задачи по настоящето изобрейений; cs.il/fla се.Шцфбри методът за изолиране на биоактивната компонента на препарата:Ентерогенинпулвис и ампули; 2/Да се разработят: фармацевтични форми на препарата Ентерогенин-пулвис и амп'/ли;3/Да се изпита фармакологичното действие ”7?

на препарата ьнтерогенин-пулвле и а .-пули в условията на. зоотехничеефектите на биоактивната му компонента.

Първата задача се реаава чрез метод за изолиране на стимулатор на биосинтетичните процеси от тънкочревна мукоза на свине.като принципната схема в производствени условия включва:1/изолиране на определена клетъчна маса от тънкочревна мукоза,изхвърляна като отпадъчен продукт в чревни цехове на месокомбинатите;2/получаване на алкохолнокисел екстракт след утаяване на високомолекулните биополимери;при този етап опасностите от замърсяване предвид изходната биомаса се ликвидират;

3/лоно обменно фракциониране в бачпроцед}.фи:4/ултрафилтрапия на елуент а от проц.3.Технологичната схема е описана към пример 1.1.В сравнение с метода описан в патент БЗ 49927 мпк А 61 К 37/02 промените се свеждот тени някои етапи в принципната технологична схема,изменени и стеснен: са параметрите на ултрарилтрация,като в резултат на всичко това са изолирани вместо един- два био активни циклопептида/наречени от нас стимулиращи ентерацито_генини/.

Втората

1/пакети от ентео осолв ентни гранули

Tt-,ι......... ~......

за петюгално задача се резава чрез изготвяне на две фармацевтични фор...и: Ентерогенин п.улвис прилагане;2/флакони от Ентерогенин ампули, съдържащ’пречистен биопрепарат в депоформа.Съхранявани при температура 2-6°С фармацевтичните форми запазват активността си 3 години.Предложеният^:от нас анализ на посочените по-горе фармацевтични форми е одобрен от Лабораторията за контрол на ветеринарни препарати към НСБМД /6/.Анализът обхваща реакции за химично и биологично идентифициране на биологично активните нуклеопептиди в Ентерогенин.Предложен е и анализ на вехикулните компоненти във фармацевтичните форми.

Третата задача се реаава чрез проведени лабораторни експерименти и клиникозоотехнически внедряв-ния.ьиоактивните нуклеопептиди в състава на Ентерогенин-пулвис и ампули”деистстват на молекулярно ниво:редуцират пролиферативния цикъл на • · · • · · · · ризиолЬгич51?)4р(;г₽нефкге₽.щйте се чревни мукозни ··· ·· ... - .. ...

клетки,което води до увеличаване на резорптивната повърхност в тънките черва;в непролиферативните клетки стимулират синтеза на специфични белтъци:актомиозин в напречно-набраздената мускулатура, детоксикиращи белтъци в черния дроб, ш.уногенни белтъци в слезката, храносмилателни ецзими в стомашно-чревния тракт.В гладко^мускулни клетки предизвикват деполиригация,като стимулират Са -поток /7/.

При ежедневно прилагане на преп.рата при малки експериментални животни се стига до увеличение на телесната маса над 200%.В условията на свинеферми и говедовъдни ферми прилагането на”Пнтерогенин в продължение на 20 дни води до дълготраен ефект на. стимулация .проследен до еаестия месец, изразяващ се до повишаване на дневния тегловен прираст при прасета с 1<5г,а при телета с Ибг.При пилета ’’Ентерогенин”.поставен в питейната вода з биосинтезата на ДПК и а периода 3-45 дни след излюпването стимулира белтъците, като увелич^телесната, маса на 118%.

Препаратът ’’Знтерогенин” показа при експериментални животни и лечебни ефекти:при модели на стомашни язви;след интоксикации на черния дроб; за профилактика. на заразни заболявания, стимулирайки имуногенезата.

Ентерогенин” не е токсичен,не е тератогенен,не е ембриотоксичен, не е генотоксичен/изследвания в НОЦ и ДИКЛС/.

Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения: Пример 1.Задача l.Ha ”3итерлинг”-мааина в ’’чревните цехове” на месокомбинатитве се събира клетъчната маса от трети валяк,като едновременно се поставя при постоянно разбъркване 20% ледена оцетна киселина до крайна концентрация 2%оцетна киселина към общата биомаса.Обработката на биомасата може непосредствено да продължи или да се замрази до -40°С във фризер.като последното налага последващо непълно размразяване. Следва обработка на машина за мелене на месо.Към смляната маса се прибавя 0,2 обема 95% етилов алкохол.Следва бързо подгряване до 70°С и бързо охлаждане до стмна температура.Течният екстракт се отделя чрез сепарация и филтруване,като високомолекулният детрит се изхвърля. Киселото pH се корегира до pH 6,5-7,0.Отстраняването на алкохола и 'липидните примеси се реализира с етер в стъклен реактор.При контрол на солевата концентрация концентратът се сорбира на ДЕАЕцелулоза и с ”бач”процедури се елуира с алкализиран солеви разтвор.

Ак •· •· •·

Λ · • · · · • · · · · · • · · · · · ?диайо ¹*-ултрафилтри,като се

Активната фракция се пречиства щГез събира фракцията в диапазона 2,0- 0,5 кДа,като второто ?итр:/в..не се извърдва при стерилни условия.Определя се концентрацията нуклеопептиди необходимо за по-нататъшното дозиране на фармацевтичните форми.

Пример 1.Задачи 2. Изготвянето-на фармацевтичните рории”Ентерогенин пулвис и ампули” се предхожда от химичн и и биологични изследвания за идентичности на нуклеопептидите:а/ултравиолетов абсорбционен спектър-максимум 260нм.

миниме?л 237и ,съотношение ^А260^/А237 =1,21-1,19 б/специфична реакция з_а. пептиди-напр.нинхидриновата реакция на Рай хелд,в/определнне- на молекулната uacatc помощта на калибрирана с пептиди с известна мол.маса колонка Серадекс Г-25 фаЛн; по К _г рефе· рентните граници на двата активни нуклеопептида са 1,1-1,ЗкДа и 0,6-0,65кДа;г/аминокиселинен състав:чрез ’’.рингер принт”анализ на хартиена хроматография на харткяБатмак-1” или по-точно чрез количествено определяне на аминокиселинен анализатор.В нискомолекулния нуклеопептид се откриват глицин и трипторан ,във виория-аргинин,серин. левцин,хистидин,глицин и тирозин ;д/количествен анализ:спектрофотометрично определяне на изчисл ение': Нуклеопептиди^ е/биологичната активност се спрямо стандарт 0,01 ммол аденин сулфат;

= Α^θθπροόδ/ AgggCTaHflapT х 0,0125 определя чрез инкорпорацията на ⁰Н-левцин /инжектиран интраперитонеално в доза 0,04 за 20г мижа/. 18 часа след въвеждането на изотопа/за контролната грмпа/ и на изотопа заедн с”Ентерогенин”0,02мг/за опитната група/се измерва включването в

50мг мускулна маса от аддукторите на заден кралник на мижата.

Пример 1.Задача З.Кдин бърз критерий за биологична активност на препа рата”Пнтерогенин пулвис и ампулисе оказа изследването на биосинтезата на ДНК,РНК и белтъци по инкорпорацията на съответните изотопно белязани предшественици.Средната активация е над 200%/табл.1/.При няколкократно третираните животни сЕнтерогенни” настъпват дълготрайни .морфологични промени/табл.2/.Увеличава се резрптивната повърхност на тънките черва , което е причина- за увеличена ефективност на храната 2,56 пъти при по-малко количество поета храна и увеличен коефицент на белтъчна ефективност-2,5пъти спрямо контролите.

Морфологиини пр омени нас тъпват “ ·· ·· ···· ·· ···· : : : : .· · ·—.

... . . ., : . —, ;

-ι *в йаПреЦнона^раздената мускулатура относително се увеличават съкратятелките мускулни белтъци.Динамиката на растежа се подобрява при яесткратно инжектиране на”Ентерогенин ампул: на телета,при ежедневно смесване пъс храната за 20 дни на ’’Ентерогенин пулвис”при свине и сладководни риби,Дри 45-дневно към поилната вода при пилета.

Получихме отчетлив лечебен ерект! на Ентерогенин” при два модела на експериментални язви/резерпинов и стрес-хистаминов/у плъхове.След остра еднократна тетрахлорметан ова интоксикация у плъхове изследвахме динамиката на метаболитните и възстановителни процеси при протичането на хепатореналния синдром.Препаратът ’’Ентерогенин” показа протактивен и реп-ративен ерект .

·· ·· • · ·· • · ·· • · · · ·· • ·· • · · · · · • · · • · · · · • · · · • · • · · · ·

Влияние на Ентерогенин върху биосинтезата на ДНК /включване 3 14 на Н“Ти?лидин/,РНК /включване на С-уридин/ и белтъци /включване на Н-левцин/ в % спрямо контролните животни без Ентерогенин

Вид животния Орган

Влючване тимидин уридин левцин

Плъхове

ДУСЩЕНУП221 леюнум190 средна част т.черва 284 илеум 337· ядра на хепатоцити 161

дуоденуъ:163 иеюнун οΟώооО средна чгст т.черва 212212 илеум 153160 мускул 177

средна част т.черва	242	265
Пилета бял мускул	103	Ί П .1
червен мускул	113	193
черен дроб	133	331

Морфологични промени след няколккратно третиране с Бнтерогенни в спряло контролни животни без йнтероген;· • · · · ·

Показ ател	0 ρ п а н	Животно	% на изменение
Тегловна маса/г/	Цялостно тегло мижи	212
Тегловна маса /г/	Черен дроб	плъх	159
— ^н —	Тънки черва	плъх	126
— ^п —	Сърце	плъх	135
_ (I _	Слезка	плъх	112
п _	Бъбрек	ΙϊύΐΈΣ	120
5 ? Клетъчност/х10 / л. 1мкм	Дуоденум	плъх	144
чревна лигавица/	йеюнум	плъх	173
	средна част	т.черва плъх	167
__ п __	илеум	плъх	135
_ и _	дуоденум	МИ :Км	134
_ и _	йеюнум	лижа	163
— ^п «-	средна част	т.чевва нижа	178
— ^п —	илеум	мижа	139
Броп тънко^ревни въси	средна част	т.черва мижа	133
на микроскоп.срез
Дължина тънкочр.въса	средна част	т.черва мижа	125
на микцоск. срез/мкм/
Площ на e.nHOgMycKynHO	м.гастрокнеъ	•иус прасе	191
влакно /мкм /	диафрагма	прасе	279
, Т! __	М. обликвус	прасе	252
Диаметър на едно муск.м.гастрокне}/	шус прасе	154
влакно/мкм електр.	диафрагма	прасе	170
микроскопи^/	м.обликвус	прасе	157
Дебелина на Z бразда	м.гастпокнем	гнус прасе	300
мхУ електр ._м икр оск опия/

• ·

СРфПСрТБО^/ТЕХНИК А/

ЗА ИЗОЛИРАНЕ НА СТЖУЛИРАШИ ЕНТЕРО1П1ТОГЕНЛНИ

МАНИПУЛАЦИЯ

ПРОДУКТ

оитерлинг? малина

20/£ оцетна киселина.

Подкислена биомаса

Алтернативна -я процедура Малина за месо /Хом о г енизатор/

Реактор с подгряване и одлавдане

Сепаратор

Р-р натриева о-sа

ДЕАЕ-целулоза в колона

През диафпо мембранни дискове • · · · • · · endogenous colon mitosis inhibitor

ЛИТЕРАТУРА

An cells(hT 295 in serum restricted medium, virchows arch.1, ;;o,<1Ά9)595-1% rosis in.iibitor and.

4.Триронов A. , Русев Г.К. ,Ео.жев Η.,

5.Русев Γ.Κ. ,ΤρηροΗΟΒ A. ,Петров A и употреса •'P ринарномедицинската практика Hg, пвеп activity of intesxinal smootn muscle fro..: t.ie

J .Gastrointet.motil k 1992), 195-199 • · · ·

l.i/етод за изолиране на стимулатор на биосинтетичните процеси от тънкочревна мукоза,включващ Фракциониране на отпадъчна чревна б 'иом ас а, екстракция с оцетна киселина,утаяване с етилов алкохол

-у пои ниска концентрация, г.оноооменна хроматография и ултрафилтрация в 'диапазона 0,5-2 кДалт,на.Изолирани са 2 биоактивни нуклеопептида.

I

2.Лекарствени форми:Ентерогенин ампули-флакони съдържащи 0,0125$ нуклеопептид в депо форма с 0,2$натриев а-гинатвъв физиологииенр-р. ’’Ентерогенин пулвис” съдържащ 0,125$ нуклеопептид,сорбиран върху ниаесте и гранулиран с хидрирана мазнина.

Във фармацевтичните форми двата нуклеопептида се идентифицират качествено и количествено по УВ-спектър,реакции за пептиди. аминокиселинен състав· молекулна мас·, .биологичното титруване се изразива чрез езекта върх··’ инкорпорацията на изотопно

м/инокис елини в непи^чно набраздени мускули.

3.метод за практическо приложение на препарата”Ентегогенин пулвис и

6-кратно интрамускулно аплиццране през 3 дни по 0,5мл/100кг телесни маса от”Ентероге пулвис в доза 100г/200кг жива телзсна i в продължение на 45 дни към поилната вода на”Ентероген-;н амп /ли в доза 0,5мл/10 кг жива телесна маса;г/за сладководни риби-врез развъдния период към 5кг от фуражната храна да се разчесва 100г Ентерогенин пулвис

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Лекарствени форми на стимулатор на биосинтетичните процеси, характеризиращи се,че представляват Ентерогенин ампули”флакони съдържащи 0,0125% биоактивен нуклеопептид в депоформа с 0,2% натриев алгинат във физиологичен разтвор и ’’Ентерогенин пулвис” съдържащ 0,125% биоактивен нуклеопептид сорбиран върху никесте и гранулиран в ентеросолвентна форма с хидрирана , мазнина
2. метод за получаване на биоактивната съставка на лекарствените форми,съгласно претенция Но 1,характеризираща се с това,че включва фракциониране на отпадъчна чревна биомаса,екстракция с оцетна киселина.утаяване с етилов алкохол при ниска концентрация, конообменна хроматография и ултрафилтрация в диапазона 0,5-2 кДа. Изолират се 2 биоактивни нуклеопептида.
3. Приложение на препарата ’’Ентерогенин пулвис и ампули” във ветеринарномедицинската практика^ а/за прасета-ежедневно размесване към фуражната храна в продължение на 20-30 дни на ’’Ентерогенин пулвис” в доза 100г/200кг жива телесна маса;

б/за преживни животни- 6 /8/-кратно интрамускулно аплициране през 3 дни по 0,5мл/100кг жива телесна маса от Ентерогенин ампули; в/за пилета-ежедневно в продължение на 45 дни прибавяне към поилната. вода на Ентерогенин ампули” 0,5мл/10кг жива, телесна маса; г/за сладководни риби-през развъдния период към 5кг от фуражната храна да се размесва 100г Ентерогенин пулвис”.