BG2604U1 - Автоматичен поточен флуоресцен­ тен брояч на клетки в биологични течности - Google Patents

Abstract

Полезният модел е в областта на системите за преброяването на биологични клетки, суспендирани в течности. Фокусът на полезния модел е автоматизирани поточни флуоресцентни системи за броене на клетки. Описан е напълно автоматизиран поточен флуоресцентен апарат за определяне на общ брой соматични клетки и на броя неутрофили в мляко. Системата включва перисталтична помпа, кювета, флуоресцентен микроскоп, програма за анализ на изображения с помощта на уиндоус базиран таблет и един LCD монитор със сензорен екран, които са вградени в един апарат с тегло 3 kg. Не е известен досега автоматизиран поточен флуоресцентен апарат, базиран на изображения за диференциално преброяване на клетки в мляко, управляван по този начин. Апаратът е преносим, с малки размери, без подвижни механични компоненти в системата за автофокусиране, високо чувствителен и селективен, поради използването на селективно флуоресцентно багрило за общ брой соматични клетки и на флуоресцентно маркирано антитяло срещу неутрофили, осигуряващо диференциално броене на левкоцитите в млякото.

Description

преброяване на клетки в мляко, управляван по този начин. Апаратът е преносим, с малки размери, без подвижни механични компоненти в системата за автофокусиране, високо чувствителен и селективен, поради използването на селективно флуоресцентно багрило за общ брой соматични клетки и на флуоресцентно маркирано антитяло срещу неутрофили, осигуряващо диференциално броене на левкоцитите в млякото.

претенция, 8 фигури

2604 UI (54) АВТОМАТИЧЕН ПОТОЧЕН ФЛУОРЕСЦЕНТЕН БРОЯЧ НА КЛЕТКИ В БИОЛОГИЧНИ ТЕЧНОСТИ

Област на техниката

Полезният модел е в областта на системите за преброяването на биологични клетки, суспендирани в течности. Фокусът на полезния модел е автоматизирани поточни флуоресцентни системи за броене на клетки.

Предшестващо състояние на техниката

Общият брой соматични клетки (SCC) е признат показател за здравето на кравите и за качеството на млякото. SCC е индикатор за наличие на инфекция и възпаление на млечната жлеза на млекодайните крави, наречено мастит. Соматичните клетки са основно левкоцити, чието количество зависи от клетъчната имунна защита. Преброяването на соматични клетки и диференциалното идентифициране и преброяване на левкоцитите в мляко е от съществено значение при диагностиката на мастит.

В последните години са разработени автоматични портативни анализатори, базиращи се на директния микроскопски флуоресцентен метод за броене на соматични клетки, като С-Reader „ADAM“ на Digital Bio Technology; NucleoCounter SCC 100 на Chemometec; DCC на DeLaval.

Много използвани анализатори за определяне на SCC са флуоресцентните поточни цитометри (Somacount 150 на Bentley Instruments; SomascopeTM на Delta Instruments, FossoMatic 4000TM на фирмата Foss Electric). Тези апарати се базират на едноцветна флуоресценция и се определя само общия брой клетки. Потокът проба се изтласква през много малък диаметър, което позволява само една клетка да премине и да се осъществи преброяването (Gunasekera T.S. et al. 2003, Feng W. et al. 2004). Като маркери се използват следните флуоресцентни багрила, етидиев бромид, пропидиев йодид и DAPI (Gonzalo С. et al. 2004, Wallen С.А. et al. 1982).

Диференциалното определяне на левкоцити дава по-големи възможности за откриване на инфекции при животни. Неутрофилите и макрофагите са ценни индикатори за патогенни микроорганизми, предизвикващи инфекции. Неутрофилите се борят с инфекциите чрез осво бождаване на ензими, които убиват бактериите. Установяването на ролята и съотношенията на тези видове клетки позволява ранното откриване на различни заболявания. Например, повишеният брой на неутрофили е сигурен знак за субклиничен мастит при кравите.

Диференцираното определяне на левкоцитите в мляко е малко проучен въпрос. Известен е преносим диагностичен анализатор QScout™ Farm Lab, който идентифицира и диференцира левкоцитите (лимфоцити, неутрофили и макрофаги) в млякото. Той сканира проби мляко чрез вграден флуоресцентен микроскоп с две багрила - едното оцветява ядрата на клетките, а другото оцветява плазмата на клетките. Особено ценен показател е броят на неутрофилите. Увеличеният брой неутрофили е ясен знак за субклиничен мастит. Този метод е бърз, информативен, но е недостатъчно селективен, тъй като не използва антитела.

Разработени са значителен брой методи за диференциално определяне на клетки с помощта на специфични антитела, но в кръвни проби, в областта на хуманната медицина. Тези методи осигуряват много добра селективност и чувствителност на измерването, благодарение на специфичната имунореакция антитяло-антиген. Herzenberg и Loken са разработили първия мулти-параметричен метод за преброяване на клетките с помощта на моноклонални антитела (Herzenberg et al. 1976; Loken et al. 1977), който e наречен двуцветен имунофлуоресцентен метод. След това се описва трицветната имунофлуоресцентна система (Parks et al., 1984) и това е началото на многоцветната поточна цитометрия. Тези системи изискват мулти-параметрична информация от няколко цитометъра или от един цитометьр, оборудван с фотоумножителни тръби за едновременно откриване на няколко флуоресцентни маркери, които имат емисии при различни дължини на вълните (Janossy et al. 2000, Glencross et al. 2002, Janossy et al. 2003). Съвсем наскоро, е разработен флуоцитометьр, оборудван с много светлинни източници и датчици, които могат да измерват до 16 оптични параметри едновременно в кръвни проби (Cottingham, 2005). Основният недостатък на тези системи е сложната конструкция, големите размери, висока цена и необходимостта от квалифициран персонал.

2604 UI

Техническа същност на полезния модел

Описан е напълно автоматизиран поточен флуоресцентен апарат за определяне на общ брой соматични клетки и на броя неутрофили в мляко с висока точност, с минимална намеса на потребителя и с относително малки размери. Системата включва перисталтична помпа 11, кювета 18, LED светодиоди 13 и 14, флуоресцентен микроскоп 20,21,22,23, програма за анализ на изображения с помощта на уиндоус базиран микропроцесор, свързан с монитор 1 и един LCD монитор със сензорен екран, които са вградени в един апарат с тегло само 3 kg (фигура 1 и 2). Системата е затворена в преносим корпус от неръждаема стомана и пластмасово лице, както е показано на фиг. 1.

Апаратът е преносим и се основава на флуоресцентна микроскопска техника с ниско увеличение за броене на клетки. Той използва LED оптика и CCD технологиите на заснемане за да направи анализа на клетките по-точен, надежден и бърз. Обективната селективност на апарата се комбинира с висока стабилност на електронните, оптични и химични компоненти на системата, при което се осигуряват почти идентични показатели през целия срок на експлоатация на апарата. Освен това липсват механични компоненти за фокусиране, тъй като се използва електрически управляема течна леща в този апарат 19, което осигурява висока степен на еднаквост между различните апарати. Апаратът е поточен и всяка следваща проба изтласква предната проба от кюветата благодарение на вградената перисталтична помпа 11. Кюветата е поставена на оптичния път на микроскопа 20, 21,22. Системата автоматично се фокусира върху кюветата и оцветените клетки се заснемат от чувствителна CCD камера 23. Алгоритъмът за анализ на дигиталните изображения определя броя и размера на флуоресциращите клетки и изчислява тяхната концентрация. Резултатите автоматично се представят на дисплея на уреда, както и на принтер. Има възможност за запис на резултатите и евентуално генериране на отчети от резултатите.

За определяне на общия брой соматични клетки се използва флуоресцентно багрило (синтезирано от нас Sofia Green с максимум на екстинкция/емисия 470/511 nm или пропидиев йодид, закупен от фирма Sigma Aldrich с максимум на екстинкция/емисия 493/617 nm), което се свързва селективно с ДНК на ядрото на клетките. Ядрата на всички клетки светят зелено при използването на Sofia Green или червено при пропидиев йодид (PI). Броят на неутрофилите се определя на базата на маркирано поликлонално антитяло срещу неутрофили с второ флуоресцентно багрило (АТТО 565 - с емисия при 592 nm или FITC - с емисия при 518 nm, закупени от фирма Sigma Aldrich). ATTO 565 свети червено и се комбинира със Sofia Green, a FITC (емисия при 518 nm) свети зелено и се комбинира с пропидиев йодид (PI). Първичното антитяло разпознава целевата молекула (клетката антиген) и се свързва към специфичен регион наричан епитоп. Приложеният флуорофор се открива чрез флуоресцентна микроскопия при друга дължина на вълната различна от дължина на вълната на Sofia Green или на пропидиевия йодид.

Анализът е директен. Пробата мляко се смесва с разтвор на флуоресцентното багрило Sofia Green или пропидиев йодид (PI). Веднага след това се прибавя разтвор на маркираното поликлонално антитяло срещу неутрофили с второто флуоресцентно багрило. Сместа се инкубира определено време. След това чрез вградена перисталтична помпа в апарата се засмуква течността и преминава в кювета, която е поставена на оптичния път на микроскопа. Системата автоматично се фокусира върху кюветата и оцветените клетки се заснемат от чувствителна CCD камера.

Не е известен досега автоматизиран поточен флуоресцентен апарат, базиран на изображения за диференциално преброяване на клетки в мляко, управляван по този начин. Апаратът е преносим, с малки размери, без подвижни механични компоненти в системата за автофокусиране, високо чувствителен и селективен, поради използването на селективно флуоресцентно багрило за общ брой соматични клетки и на флуоресцентно маркирано антитяло срещу неутрофили, осигуряващо диференциално броене на левкоцитите в млякото.

Пояснение на приложените фигури

Фигура 1. Външен вид на поточния флуоресцентен апарат за преброяване на клетките

Фигура 2. Диаграма на поточния флуоресцентен апарат за преброяване на клетките

2604 UI

Фигура 3. Диаграма на двата оптични пътя

Фигура 4. Електрическа блокова схема на поточния флуоресцентен апарат за преброяване на клетките

Фигура 5. Вътрешен изглед на поточния флуоресцентен апарат за преброяване на клетките

Фигура 6. Флуоресцентни микроскопски снимки от диференциалното броене на клетки

Фигура 7. Оцветени неутрофили, изолирани от краве мляко: с антитяло - FITC /зелена емисия/ и с PI /червена емисия/

Фигура 8. Диференциално оцветяване на клетки

Пример за изпълнение на полезния модел

Съгласно фигура 1, резултатите автоматично се представят на уиндоус базиран таблет 1, поместен в горната част на корпуса 2. Пробата мляко се смесва с багрилото пропидиев йодид и конюгата анти-неутрофил-FITC или с Sofia Green и конюгат анти-неутрофил-АТТО 565 в микро епруветка 4, поставена в държател 5. Чрез пробовземаща тръбичка 3 благодарение на перисталтичната помпа пробата се придвижвало микрофлуидна проточна кювета и се провежда анализа. Отработената проба се събира в туба 7 чрез изпускателна тръбичка 9. Предвидено е почистване на микрофлуидна поточна кювета чрез туба с алкален миещ препарат 6, който се подава чрез смукателна тръбичка 8.

Съгласно фигура 2, пробата с багрило пропидиев йодид (или Sofia Green) и конюгат антинеутрофил-FITC (или конюгат анти-неутрофилиАТТО 565) се смесват в микро епруветка 4. Чрез пробовземаща тръбичка 3 и през притискащия клапан 10, благодарение на перисталтичната помпа 11 пробата се придвижва до микрофлуидна поточна кювета 18 и се провежда анализа. Апаратът е адаптиран за оптична конфигурация, измерваща два цвята (зелен и червен). Два LED светодиода 13 и 14 се използват като източник на възбуждане и всеки един от тях преминава през два оптични пътя, включващи: колимираща леща 15, тънкослоен полосови филтър 16 - (единият е 560/30 nm, а другият 470/30 nm), фокусираща леща 17 и се фокусират върху микрофлуидната поточна кювета 18. За извършване на автофокусиране се използва течна оптическа леща 19. Флуоресцентните емисии се събират чрез ахроматична леща 20, преминават през двулентов тънкослоен оптичен филтър 21 за отстраняване на остатъчната възбуждаща светлина и през втора ахроматична леща 22. Светлинното изображение се проектира и след това се сканира от CCD камера 23. Могат да се използват две конфигурации: 1. Червената флуоресценция се дължи на емисията на оцветените ядра на клетките от PI (емисионен пик 617 nm), а зелената флуоресценция на оцветените неутрофили с конюгата антитяло-FITC (емисионен пик 518 nm). 2. Зелената флуоресценция се дължи на емисията на оцветените ядра на клетките от Sofia Green (емисионен пик 511 nm), а червената флуоресценция на оцветените неутрофили с конюгата антитяло-АТТО 565 (емисионен пик 592 nm). За точно отчитане на броя на клетките, до 90 флуоресцентни изображения хомогенно разпределени в полето се обработват за една единична проба. Системата е свързана с компютър. Чрез софтуерна програма се анализират дигиталните изображения и се определя броя и размера на флуоресциращите клетки и се изчислява тяхната концентрация. Резултатите автоматично се представят на дисплея на уреда, както и на принтер. Отработената проба изтича и се събира в туба 7. Предвидено е почистване на микрофлуидна поточна кювета чрез пиезо диск 24 и постъпващ алкален миещ препарат от туба 6 по тръбичка и притискащ клапан 12. Апаратът позволява да се следи и морфологията на клетките с увеличение 1x10.

Съгласно фигура 3, LED светодиод, син, 470 nm, 5 вата 14 се използва като източник на възбуждане, който преминава през фокусираща оптика с отрязващ 480 nm филтър 25 и се фокусира върху ядрата на клетките, свързани с флуоресцентното багрило Sofia Green 26. Синята фонова светлина 27 и възбудената зелена светлина от свързаното багрило с ядрата на клетките 28 преминават през тънкослоен двулентов оптичен филтър 21, който пропуска само зелената светлина. Графика на пропускане на двулентовия тънкослоен филтър (nm/пропускливост Т%) 29. Светлинното изображение се проектира и след това се сканира от CCD сензор 23. LED светодиод, оранжев, 560 nm, 5 вата 13 се използва като източник на възбуждане, който преминава през фокусираща оптика с отрязващ 560 nm филтър 30 и се фокусира върху неутрофилите свързани с конюгата на антитялото с флуоресцентното багрило 31.

2604 UI

Оранжевата фонова светлина 32 и възбудената червена светлина от свързаните неутрофили с конюгата антитялото-флуоресцентното багрило 33 преминават през тънкослоен двулентов оптичен филтър 21, който пропуска само червената светлина. Графика на пропускане надвулентовия тънкослоен филтър (nm/пропускливост Т%) 34. Светлинното изображение се проектира и след това се сканира от CCD сензор 23.

Съгласно фигура 4, чрез система от електрически драйвери се извършва управлението на апарата с помощта на уиндоус базиран таблет 1, който се свързва със системата чрез юесби порт 35 и основната процесорна платка 36. Първо се задейства електрическия драйвер за управление на перисталтична помпа 37 и пробата постъпва в кюветата. След това последователно се задействат електрическите драйвери на двата притискащи клапана 38 и двата светодиода 39. Електрическият драйвер 40 управлява ултрасоник генератора, който задвижва пиезодиска и той почиства кюветата, съвместно с миещия препарат.

Съгласно фигура 5, чрез пробовземаща тръбичка 3 и през притискащия клапан 10, благодарение на комплекта стъпков мотор и перисталтичната помпа 11 пробата се придвижва до микрофлуидна поточна кювета 18. Два LED светодиода 13 и 14 се използват като източник на възбуждане. Възбудената светлина от левкоцитите преминава през флуоресцентния микроскоп 41. Светлинното изображение се проектира и след това се сканира от CCD сензор 23. Отработената проба изтича и се събира в туба 7. Предвидено е почистване на микрофлуидна поточна кювета чрез постъпващ алкален миещ препарат от туба 6 по тръбичка и притискащ клапан 12.

Съгласно фигура 6, флуоресцентното багрило пропидиев йодид се свързва селективно с ДНК на ядрото на соматичните клетки и ги оцветява в червен цвят 1. С червен цвят се оцветява и ядрото на неутрофилите. Антитялото (анти-неутрофили), маркирано с FITC се свързва с епитопите, лежащи на повърхността на неутрофилната клетка и цялата повърхност на клетката се оцветява със зелен цвят. Това свързване се осъществява само с неутрофилните клетки. При последователно възбуждане с 470 шп и с 560 пш се заснема първо зелено оцветяване на неутрофилите, след това червеното оцветяване на всички соматични клетки. Софтуера обединява двете изображения 3. Образува се зелен пръстен около оцветеното ядро на неутрофилната клетка в червен цвят. Това двойно оцветяване се забелязва само при неутрофилите. При останалите клетки е налице само червено оцветяване на ядрата. Малките зелени точки не се броят, те не са клетки 3.

Съгласно фигура 7, изолирани са само неутрофилни клетки от краве мляко. Те са оцветени зелено, когато на повърхността им се свърже добавеното антитяло маркирано с F1TC. Ядрата на неутрофилите се оцветяват червено, когато към тях се добави пропидиев йодид.

Съгласно фигура 8, левкоцитите (неутрофили, еозинофили, базофили, моноцити, макрофаги, лимфоцити) дават само червена емисия. Неутрофилите дават червена, зелена и червена + зелена емисия (само на обединената снимка се вижда).

Пробата мляко 100 μΐ се смесва с 3 μΐ 2% Тритон, 4 μΐ флуоресцентно багрило пропидиев йодид или Sofia Green (150 μΜ) и със 100 μΐ маркирано поликлонално антитяло срещу неутрофили с FITC или АТТО 565 (100 μΜ). Сместа се инкубира 60 min при 37°С. След това чрез вградена перисталтична помпа в апарата се засмуква течността и се инжектира в кювета (10 μΐ), която е поставена на оптичния път на микроскопа. Системата автоматично се фокусира върху кюветата и оцветените клетки се заснемат от CCD камера. Оцветените клетки с първото флуоресцентно багрило дава общият брой соматични клетки, а оцветените клетки с второто флуоресцентно багрило дава броят на неутрофилите. Алгоритъмът за анализ на дигиталните изображения определя броят и размера на флуоресциращите клетки и изчислява тяхната концентрация. Резултатите автоматично се представят на дисплея на уреда.

Приложение на полезния модел

Автоматизираният поточен флуоресцентен апарат се използва за определяне на общ брой левкоцити и диференцирано определяне на левкоцити в различни биологични течности. В примера е посочено приложението на апарата за определяне на общ брой соматични клетки и определяне на броя на неутрофили в мляко. Този апарат има универсално приложение. Той може да се прилага за диференцирано определяне на

2604 UI клетки не само в мляко, но и в кръвни проби. Могат да бъдат диференцирани по-голям брой левкоцити - неутрофили, макрофаги, лимфоцити. За целта се използват съответно по-голям брой първични антитела срещу споменатите видове клетки, белязани с различни флуоресцентни багрила. По този начин този апарат осигурява провеждането на мултианализи в една и съща проба и напълно може да замени популярния капилярен поточен флуоцитометьр. Преброяване на клетките е от интерес в различни клинични и научни процедури, включително броене на левкоцитите и еритроцитите, което е от значение при диагностика на различни заболявания, или патологични състояния и при наблюдението на пациенти, които са подложени на лечение за тези заболявания.

Claims (18)

1. Автоматичен поточен флуоресцентен брояч, базиран на изображения за диференциално преброяване на клетки в мляко, характеризиращ се с това, че се състои от корпус (2), в горната част на който е разположен LCD монитор (1), а в долната част на корпуса (2) е разположена микро епруветка (4), поставена в държател (5), и свързана отгоре с пробовземаща тръбичка (3), при което микро епруветката (4), съдържа смес от проба и селективни флуоресцентни багрила, а на пробовзимащата тръбичка е осигурен притискащ клапан (10), свързан с перисталтична помпа (11), подаваща сместа за анализ през микрофлуидна поточна кювета (18), облъчена с два LED светодиода (13 и 14) през колимираща леща (15), тънкослоен полосови филтър (16), фокусираща леща (17), като за излъчената светлина от пробата в кюветата (18) е осигурен микроскоп, включващ последователно течна оптическа леща (19), ахроматична леща (20), двулентов тънкослоен оптичен филтър (21) и втора ахроматична леща (22), камера (23) за проектиране на светлината чрез микропроцесор, свързан с монитора (1), при което за почистване на кюветата (18), е осигурена туба (6) с алкален миещ разтвор, за преминаване през притискащ клапан (12) по тръбичката (3) към кюветата (18), под която е монтиран пиезо диск (24).

Приложение: 8 фигури

Литература

1. ADAM-SCC, Compact Somatic Cell Counter, Product Catalogue From cell counting to diagnostic, NanoEnTek Inc., Digital Bio Technology, Korea, http://www.nanoentek.com/.

2. Cottingham, K. Incredible shrinking flow cytometers. Analytical Chemistry 2005; 77(3): 73a - 76a.

3. DeLaval Cell counter DCC, DeLaval International AB Sweden, Stockholm, 2003, http://www. delaval.com/.

4. Glencross, D., Scott, L., Jani, 1., Barnett, D. & Janossy, G. CD45-assisted PanLeucogating for accurate, cost-effective dual-platform CD4+ T-cell enumeration. Cytometry Part B: Clinical Cytometry 2002; 50(2): 69 - 77.

5. Gonzalo C, Boixo JC, Carriedo JA, San Primitive F. Evaluation of rapid somatic cell counters under different analytical conditions in ovine milk. Journal of Dairy Science 2004; 87: 3623-3628.

6. Gunasekera TS, Vea IDA, Attfield PV. Potential for broad applications of flow cytometry and fluorescence techniques in microbiological and somatic cell analyses of milk. International Journal of Food Microbiology 2003; 85: 269-279.

7. Feng W, Zheng X. Comparing techniques for detecting the number of somatic cells in raw milk. European Food Research and Technology 2004; 220: 653-657.

8. FossoMatic 4000TM, Foss Electric, Denmark, http://www.foss.dk/.

9. Nucleocounter® SCC-100™ - Somatic cell counter, ChemoMetec, Copenhagen http:// chemometec.coin/cell-coiinters/somatic-cell- counter-scc-100 nucleocounter/.

10. Janossy, G., Jani, I. & Gohde, W. Affordable CD4+ T-cell counts on‘singleplatform‘flow cytometers I. Primary CD4 gating. British Journal of Haematology 2000; 111 (4): 1198-1208.

11. Janossy, G., Jani, I. V. & Brando, B. New trends in affordable CD4+ T-cell enumeration by flow cytometry in HIV/AIDS. Clinical and Applied Immunology Reviews 2003; 4(2): 91-107.

12. Herzenberg, L., Sweet, R. Fluorescence-activated cell sorting. Sci Am. 1976; 234(3): 108-117.

13. Loken, M., Parks, D. & Herzenberg, L. Two-color immunofluorescence using a fluorescence-activated cell sorter. J. Histochem Cytochem 1977; 25(7): 899-907.

2604 UI

14. Parks, D., Hardy, R. & Herzenberg, L. Three color immunofluorescence analysis of mouse B lymphocyte subpopulations. Cytometry 1984; 5(2): 159-168.

15. QScout™ MLD (milk leukocyte differential), Qscout Farm Lab.

16. Somacount T. M 150, Bentley Instruments, Chaska, Minnesota 55318 USA, http://bentleyin struments.com/.

17. SomascopeTM for somatic cells count, Delta Instruments, Nitherlands, http://www.deltainstruments.com/.

18. Wallen CA, Higashikubo R, Dethlefsen LA. Comparison of two flow cytometric assays for cellular RNA-acridine orange and propidium iodide. Journal of Dairy Science 1982; 3(3): 155-160.