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a d'une demande de Mémoire descriptif déposé B D'INVENTION au nom de :
Société dite : INSTITUT VIRION AG pour : "Complément de couches nourricières pour la culture de Campylobacter jejuni".
Convention Internationale : priorité d'une demande de brevet déposée en ALLEMAGNE FEDERALE le 20 octobre 1982 sous le n P 32 38 819. 5.
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La présente invention concerne un complément de couches nourricières pour la culture sélective de Campylobacter éjuni, lequel complément contient au moins une substance antimicrobienne efficace.
Depuis quelques années, on sait que l'espèce bactérienne Campylobacter joue un rôle important à l'origine des gastro-entérites. En particulier, le genre Campylobacter faetus Subsp. jejuni, que l'on appellera ci-après plus simplement Campylobacter jejuni, a été découvert comme étant particulièrement dangereux pour l'homme et de nombreux animaux. Il est par conséquent nécessaire de mettre Campylobacter jejuni en culture sélective dans le but d'un diagnostic et/ou de l'examen des médicaments ou respectivement de la résistance.
Pour éviter autant que possible que sur une couche nourricière bactériologique, d'autres micro-organismes, outre Campylobacter jejuni, ne se reproduisent de façon importante, on a déjà mélangé aux couches nourricières utilisées des substances anti-microbiennes efficaces déterminées, contre lesquelles Campylobacter jejuni présente une résistance élevée par rapport à d'autres micro-organismes. On connaît les compléments à mélanger aux couches nourricières qui contiennent, par exemple, une ou plusieurs des substances antimicrobiennes
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efficaces qui suivent : Polymycine, Rifampicine, Triméthoprim, Actidion, Colistine, Bacitracine, Novobiocine, Cycloheximide, Céphazoline, Amphotêricine.
La présente invention a pour conséquent pour tâche de créer un complément de la sorte ci-dessus dont l'effet sélectif pour favoriser Campylobacter jejuni est considérablement meilleur que celui des compléments de cette sorte connus
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jusqu'à maintenant.
Le complément selon l'invention, permettant de résoudre la tâche indiquée ci-dessus, se différencie de compléments connus de la sorte ci-dessus par le fait qu'il y a, comme substance antimicrobienne efficace, du Céfopérazon.
Jusqu'à maintenant, l'on n'aencore jamais utilisé de Céfopérazon comme substance antimicrobienne efficace dans des compléments pour des couches nourricières pour la culture sélective de Campylobacter jejuni. On a pu montrer que Céfopérazon pouvait produire un effet sélectif antimicrobien particulièrement valable dans le sens souhaité.
De façon utile, le complément selon l'invention contient, comme substances antimicrobiennes efficaces, outre Céfopérazon, de la Rifampicine et avantageusement également de l'Amphotéricine B et de la Colistine.
Le complément est utilisé, selon une autre forme de l'invention, en mélange avec une couche nourricière bactériologique pour la culture sélective de Campylobacter jejuni de façon que pour 1 ml du mélange total, il y ait environ 15 pg de Cefopérazon et environ 10 pg de Rifampicine et le cas échéant de plus, environ 2 pg d'Amphotéricine B et environ 10 U. I. de Colistine. Une telle composition permet une très bonne croissance de Campylobacter jejuni, tandis que la croissance de la flore non souhaitée qui l'accompagne est empêchée de façon importante. De ce fait, l'isolement de l'excitateur pathogène Campylobacter jejuni est considérablement facilité.
Une bonne solubilité dans l'eau est un autre avantage du complément selon l'invention.
L'invention ser. a mieux expliquéeen se référant aux exemples qui suivent : EXEMPLE 1 :
Dans une couche nourricière bactériologique usuelle, se composant d'un litre d'agar de Colombie et de 50 ml de
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sang de brebis, on a mélangé un complément contenant trois parties en poids de Céfopérazon et deux parties en poids de Rifampicine. La concentration a été choisie de façon que pour environ 1 ml du mélange total, il y ait 15 vue de Céfopérazon et environ 10 pg de Rifampicine. Ce mélange pour couche nourricière sera désigné ci-après par"1-A".
Pour une comparaison avec l'état de la technique, on a préparé un deuxième mélange pour couche nourricière désigné ci-après par"1-B", présentant la composition qui suit : 1 litre d'agar de Colombie, 50 ml de sang de brebis et un complément particulièrement recommandé jusqu'à maintenant, contenant, pour 1 ml du mélange total, 25 U. I. de Bacitracine, 50 ig de Cycloheximide, 10 U. I. de Colistine, 15 pg de Céphazoline et 6 pg de Novobiocine.
759 boites stériles de Pétri ont été garnies du mélange pour couche nourricière 1-A et le même nombre de boites stérile, de Pétri a été garni du deuxième mélange pour couches nourricière 1-B. Ensuite, la totalité des boites a été incubée à la façon habituelle dans les recherches bactériologiques, avec des échantillons d'une même selle humaine, puis on a laissé toutes les boites au repos à 37 C dans une atmosphère se composant de 85 % d'azote, 10 % de gaz carbonique et 5 % d'oxygène.
Au bout de 20 heures, on a pu établir, dans 55 boites (= 7,24%) contenant le mélange pour couche nourricière 1-A et dans 56 boites (=7, 37 %) contenant le mélange pour couches nourricière 1-B, la présence decaipylobacter jejuni.
Ainsi, on peut obtenir, avec le complément contenu dans le mélange pour couche nourricière 1-A selon l'invention, pratiquement la même bonne croissance de Campylobacter jeun que celle obtenue avec le complément connu contenu dans le deuxième mélange pour couche nourricière 1-B. Cependant, des différences se sont montrées lors de la croissance de la flore d'accompagnement.
L'on n'a pu établir que dans 65 % des boites une croissance à peu près aussi forte de la flore d'accompagnement dans les mélanges pour couche nourricière 1-A et
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1-B. 15 % de toutes les boites ont montré une croissance accrue de la flore d'accompagnement dans le mélange pour couche nourricière 1-A tandis que 20 % de toutes les boites ont laissé reconnaître une croissance augmentée de la flore d'accompagnement dans la deuxième couche nourricière 1-B.
Les isolements entrepris à la façon habituelle, ont conduit, en ce qui concerne la flore d'accompagnement, aux résultats qui suivent : sur le mélange pour couche nourricière 1-A, il s'est révélé, après le premier isolement 10 %, après deux isolements 3 % et après trois isolements 2 % de toutes les boites, une plus forte croissance de la flore d'accompagnement, principalement des levures et des bactéries de E. Coli. Par contre, avec le mélange pour couche nourricière 1-B, il s'est révélé, après le premier isolement 13 %, après deux isolements 3 % et après trois isolements 4 % de toutes les. boites une plus forte croissance de la flore d'accompagnement, principalement des coques et Pseudomonas.
On reconnait que sur le mélange pour couche nourricière contenant le complément selon l'invention, le germe pathogène Campylobacter jéjuni peut être mieux séparé de la flore l'accompagnant que sur le mélange pour couche nourricière contenant le complément connu 1-B, tandis qu'évidemment le complément selon l'invention exerce un effet antimicrobien plus fort sur la flore d'accompagnement que le complément connu, sans influencer la croissance de Campylobacter.
EXEMPLE 2.
Dans une couche nourricière bactériologique se composant d'un litre d'agar de Colombie et de 50 ml de sang de brebis, on a mélangé un complément qui contenait les substances antimicrobiennes efficaces selon l'invention Céfopérazon, Rifampicine, Amphotéricine B et Colistine.
La concentration était telle que pour 1 ml du mélange total,
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0ily aitenviron 15 pg de Céfopérazon, lOug de Rifampicine, 2 pg d'Amphotéricine B et 10 U. I. de Colistine. Ce mélange pour couche nourricière sera désigné ci-après par"2-A".
Pour une comparaison avec l'état de la technique, on a de nouveau utilisé le melange pour couche nourricière 1-B indiqué à. l'exemple 1.
1570 boites stériles de Pétri ont été garnies du mélange pour couche nourricière 2-A et le même nombre de boites stériles de Pétri a été garni du mélange pour couche nourricière connu 1-B. Ensuite, toutes les boites ont été incubées à la façon habituelle, avec des échantillons d'une selle humaine, et ensuite, on a laissé reposer toutes
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les boites dans une atmosphère se composant de 85 % d'azote, 10 % de gaz carbonique et 5 % d'oxygène, à 370C.
Au bout de 18 heures, on a pu établir, dans 148 boites (= 9,42 %) avec le mélange pour couche nourricière 2-A et dans 146 boites (= 9,29 %) avec le mélange connu pour couche nourricière 1-B, l'augmentation de Campylobacter jéjuni. Ainsi, le complément selon l'invention contenu dans le mélange pour couche nourricière 2-A n'a pas d'influence néfaste sur la croissance de Campylobacter jejuni, en comparaison au complément connu dans le mélange pour couche nourricière 1-B.
Cependant, des différences de croissance de la flore d'accompagnement sont encore plus remarquables que dans le cas de l'exemple 1. Dans 71,6% des boites avec le mélange pour couche nourricière 2-A, l'on n'a pu établir aucune croissance de la flore d'accompagnement, tandis que cela n'était le cas que pour 47,5 % des boites avec le mélange pour couche nourricière connu 1-B. Dans les 28,4 % des boites restantes avec le mélange pour couche nourricière 2-A, il s'est montré une flore d'accompagnement, dans le premier quadrant 23,1 % dans le deuxième quadrant. à 3,6 %, dans le troisième quadrant à 1,0 % et dans le quatrième quadrant à 0,7 % de toutes les boites ayant le mélange pour couche nourricière 2-A.
Par
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contre, on a établi, pour 54,3 % des boites contenant le mélange pour couche nourricière connu 1-B, une croissance de la flore d'accompagnement, et à 37,6 % dans le premier quadrant à 10,0 % dans le deuxième quadrant à 2,9 % dans le troisième quadrant et à 3,8 % dans le quatrième quadrant pour toutes les boites avec le mélange pour couche nourricière 1-B.
Il est clair que la culture sélective recherchée de Campylobacter jejuni est considérablement plus efficace avec le mélange pour couche nourricière 2-A contenant le complément selon l'invention qu'avec le mélange pour couche nourricière connu 1-B, tandis que le complément selon l'invention est mieux adapté à diminuer la croissance de la flore d'accompagnement que le complément connu.
Le complément décrit à l'exemple 2 contenant les substances antimicrobiennes efficaces Céfopérazon, Rifampicine, Amphotéricine B et Colistine s'est révélé également plus efficace, dans le sens souhaité que le complément décrit à l'exemple 1, qui ne contenait que Céfopérazon et Rifampicine.
Par conséquent, le complément selon l'invention indiqué à l'exemple 2 est préféré.
Mais la présente invention concerne tous les compléments pour des couches nourricières permettant la culture sélective de Campylobacter jejuni, qui contiennent Céfopérazon et le cas échéant d'autres substances antimicrobiennes efficaces.
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a of a request for descriptive memory filed B D'INVENTION in the name of:
Company known as: INSTITUT VIRION AG for: "Supplement of nourishing layers for the culture of Campylobacter jejuni".
International Convention: priority of a patent application filed in FEDERAL GERMANY on October 20, 1982 under number P 32 38 819. 5.
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The present invention relates to a supplement of feeder layers for the selective culture of Campylobacter éjuni, which supplement contains at least one effective antimicrobial substance.
For several years, we have known that the bacterial species Campylobacter plays an important role at the origin of gastroenteritis. In particular, the genus Campylobacter faetus Subsp. jejuni, which will be referred to hereinafter more simply as Campylobacter jejuni, has been discovered to be particularly dangerous for humans and many animals. It is therefore necessary to put Campylobacter jejuni in selective culture for the purpose of diagnosis and / or examination of drugs or resistance respectively.
To avoid as far as possible that on a bacteriological nourishing layer, other micro-organisms, in addition to Campylobacter jejuni, do not reproduce significantly, we have already mixed with the nourishing layers used certain effective anti-microbial substances, against which Campylobacter jejuni has a high resistance compared to other microorganisms. We know the supplements to mix with the diapers which contain, for example, one or more of the antimicrobial substances
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effective following: Polymycin, Rifampicin, Trimethoprim, Actidion, Colistin, Bacitracin, Novobiocin, Cycloheximide, Cephazolin, Amphotericin.
The present invention therefore has the task of creating a complement of the above kind whose selective effect for promoting Campylobacter jejuni is considerably better than that of known supplements of this kind.
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until now.
The complement according to the invention, making it possible to solve the task indicated above, differs from known supplements of the above kind by the fact that there is, as effective antimicrobial substance, Cefoperazon.
Until now, Cefoperazon has never been used as an effective antimicrobial substance in supplements for nursing diapers for the selective culture of Campylobacter jejuni. It has been shown that Cefoperazon can produce a particularly valuable selective antimicrobial effect in the desired direction.
In a useful manner, the supplement according to the invention contains, as effective antimicrobial substances, in addition to Cefoperazon, Rifampicin and advantageously also Amphotericin B and Colistin.
The complement is used, according to another form of the invention, as a mixture with a bacteriological nourishing layer for the selective culture of Campylobacter jejuni so that for 1 ml of the total mixture, there is approximately 15 μg of Cefoperazon and approximately 10 μg of Rifampicin and, if necessary, approximately 2 μg of Amphotericin B and approximately 10 IU of Colistin. Such a composition allows very good growth of Campylobacter jejuni, while the growth of the unwanted flora which accompanies it is significantly prevented. Therefore, the isolation of the pathogenic exciter Campylobacter jejuni is considerably facilitated.
Good solubility in water is another advantage of the supplement according to the invention.
The invention is. explained better by referring to the following examples: EXAMPLE 1:
In a usual bacteriological feeder layer, consisting of one liter of Colombian agar and 50 ml of
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sheep's blood, a complement was mixed containing three parts by weight of Cefoperazon and two parts by weight of Rifampicin. The concentration was chosen so that for approximately 1 ml of the total mixture, there was 15 times of Cefoperazon and approximately 10 μg of Rifampicin. This feed layer mixture will be designated below by "1-A".
For a comparison with the state of the art, a second mixture for a feeder layer, hereinafter designated "1-B", was prepared, having the following composition: 1 liter of Colombian agar, 50 ml of blood from sheep and a supplement particularly recommended so far, containing, for 1 ml of the total mixture, 25 IU of Bacitracin, 50 ig of Cycloheximide, 10 IU of Colistin, 15 pg of Cephazoline and 6 pg of Novobiocin.
759 sterile Petri dishes were filled with the feed layer 1-A mixture and the same number of sterile Petri dishes were filled with the second feed layer mixture 1-B. Then, all the dishes were incubated in the usual way in bacteriological research, with samples of the same human stool, then all the dishes were left to stand at 37 ° C. in an atmosphere consisting of 85% of nitrogen, 10% carbon dioxide and 5% oxygen.
After 20 hours, it was possible to establish, in 55 boxes (= 7.24%) containing the mixture for feeder layer 1-A and in 56 boxes (= 7.37%) containing the mixture for feeder layer 1-B , the presence of caipylobacter jejuni.
Thus, it is possible to obtain, with the supplement contained in the mixture for nourishing layer 1-A according to the invention, practically the same good good growth of Campylobacter fasting as that obtained with the known complement contained in the second mixture for nourishing layer 1-B . However, differences were shown during the growth of the accompanying flora.
It was only possible to establish that in 65% of the boxes about as strong growth of the accompanying flora in the mixes for nourishing layer 1-A and
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1-B. 15% of all boxes showed increased growth of the accompanying flora in the feed layer mixture 1-A while 20% of all the boxes showed increased growth of the accompanying flora in the second layer nurturer 1-B.
The isolations undertaken in the usual way have led, with regard to the accompanying flora, to the following results: on the mixture for nourishing layer 1-A, it has been found, after the first isolation 10%, after two isolations 3% and after three isolations 2% of all the boxes, stronger growth of the accompanying flora, mainly yeasts and bacteria of E. Coli. On the other hand, with the feed layer mixture 1-B, it was found, after the first isolation 13%, after two isolations 3% and after three isolations 4% of all. boxes a stronger growth of the accompanying flora, mainly cockles and Pseudomonas.
It is recognized that on the nourishing layer mixture containing the supplement according to the invention, the pathogenic germ Campylobacter jejuni can be better separated from the accompanying flora than on the nourishing layer mixture containing the known complement 1-B, while obviously the supplement according to the invention exerts a stronger antimicrobial effect on the accompanying flora than the known supplement, without influencing the growth of Campylobacter.
EXAMPLE 2.
In a bacteriological nourishing layer consisting of one liter of Colombian agar and 50 ml of sheep's blood, a supplement was mixed which contained the effective antimicrobial substances according to the invention Cefoperazon, Rifampicin, Amphotericin B and Colistin.
The concentration was such that for 1 ml of the total mixture,
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There are about 15 pg of Cefoperazon, 1 Oug of Rifampicin, 2 pg of Amphotericin B and 10 U. of Colistin. This feed layer mixture will be designated below by "2-A".
For a comparison with the state of the art, the feed layer mixture 1-B indicated in again was used. Example 1.
1,570 sterile Petri dishes were filled with the feed layer mixture 2-A and the same number of sterile Petri dishes were filled with the known feed layer mixture 1-B. Then all the dishes were incubated in the usual way, with samples from a human stool, and then all
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boxes in an atmosphere consisting of 85% nitrogen, 10% carbon dioxide and 5% oxygen, at 370C.
After 18 hours, it was possible to establish, in 148 boxes (= 9.42%) with the mixture for feeder layer 2-A and in 146 boxes (= 9.29%) with the known mixture for feeder layer 1- B, the increase in Campylobacter jejuni. Thus, the complement according to the invention contained in the mixture for the nourishing layer 2-A has no harmful influence on the growth of Campylobacter jejuni, in comparison with the known complement in the mixture for the nourishing layer 1-B.
However, differences in growth of the accompanying flora are even more remarkable than in the case of Example 1. In 71.6% of the boxes with the mixture for the nourishing layer 2-A, it was not possible to establish no growth of the accompanying flora, while this was the case only for 47.5% of the boxes with the known nourishing layer mixture 1-B. In the 28.4% of the remaining boxes with the mixture for the nourishing layer 2-A, there was an accompanying flora, in the first quadrant 23.1% in the second quadrant. at 3.6%, in the third quadrant at 1.0% and in the fourth quadrant at 0.7% of all boxes with the feed layer 2-A mixture.
By
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on the other hand, for 54.3% of the boxes containing the known nourishing layer mixture 1-B, growth of the accompanying flora was established, and at 37.6% in the first quadrant to 10.0% in the second quadrant at 2.9% in the third quadrant and 3.8% in the fourth quadrant for all boxes with the feed layer mixture 1-B.
It is clear that the desired selective culture of Campylobacter jejuni is considerably more effective with the mixture for nourishing layer 2-A containing the supplement according to the invention than with the mixture for known nourishing layer 1-B, while the complement according to l he invention is better suited to decrease the growth of the accompanying flora than the known supplement.
The supplement described in Example 2 containing the effective antimicrobial substances Cefoperazon, Rifampicin, Amphotericin B and Colistin was also found to be more effective, in the desired sense than the supplement described in Example 1, which contained only Cefoperazon and Rifampicin .
Consequently, the supplement according to the invention indicated in Example 2 is preferred.
However, the present invention relates to all the supplements for nourishing layers allowing the selective culture of Campylobacter jejuni, which contain Cefoperazon and, where appropriate, other effective antimicrobial substances.