<EMI ID=1.1> <EMI ID=2.1>
<EMI ID=3.1>
<EMI ID=4.1>
atome de carbone, ou bien R est le reste d'un nucléoside ou d'un alcool de sucre, ou peut encore représenter un groupe inorganique, tel qu'un anion hydroxyle ou sulfite.
<EMI ID=5.1>
glucoside d'une base hétérocyclique, ce terme englobant à la fois les glucosides naturels (comme l'adénosine, la cytidine, l'inosine, la guanosine ou l'uridine et leurs dérivés désoxy) et les glucosides synthétiques formés au départ de sucres naturels ou synthétiques (par exemple les hexoses, les pentoses ou leurs dérivés désoxy) , ainsi que les bases hétérocycliques naturelles ou synthétiques. L'expression "reste d'un nucléoside" désigne un groupe nucléoside attaché à l'atome de cobalt par une liaison carbone-cobalt. Les bases hétérocycliques peuvent être des bases naturelles ou synthétiques, comme la pyridine, la quinoléine, l'isoquinoléine, le benzimidazole, l'azapurine, l'azapyrimidine, etc.
Les groupes réactifs des nucléosides, sauf pour ce qui concerne le groupe attaché à l'atome de carbone destiné à être lié à l'atome de cobalt de la molécule de cobamide, doivent être protégés durant la réaction. A cet effet, on peut utiliser des groupes protecteurs traditionnels, qui sont séparés après la réaction par des méthodes connues en soi.
Le reste d'un alcool de sucre peut être, par exemple, <EMI ID=6.1>
La plupart des composés répondant à la formule générale
(I) présentée par la suite sont connus pour des propriétés pharma.cologiques intéressantes, telles que les effets de la vitamine
<EMI ID=7.1>
enzymatiques remarquables.
On connaît de nombreux procédés pour la préparation de
<EMI ID=8.1>
Suivant le procédé décrit dans le brevet britannique n[deg.] 963.373 et dans le brevet allemand 1.213.842, on prépare des
<EMI ID=9.1>
ou arylsuifonyle, de manier qu'un cobamide comportant un anion, en particulier un groupe cyano, ou une molécule d'eau attachée à l'atome de cobalt soit réduit et que le dérivé résultant, dans lequel l'atome de cobalt originellement trivalent a été réduit à un cobalt monovalent, soit condensé avec un agent approprié d.'alkylation, d'acylation ou de sulfonylation. Lorsqu'on utilise de
<EMI ID=10.1>
'est d'abord purifiée en la faisant passer à travers une colonne échangeuse d'ions. Le cobamide non converti se reconvertit en hydroxycobalamine durant la réaction, cet bydroxycobalamine apparaissant comme impureté dans le produit. Lorsqu'on utilise de la cyanocobalamine comme substance de départ, une partie des groupes cyanure qui se séparent au cours de la phase de réduction quitte le système, tandis qu'une partie de ces groupes est liée <EMI ID=11.1>
acide, le cyanure tend à se libérer lentement et il reconvertit
<EMI ID=12.1>
lamine comme impuretés. Celles-ci sont difficiles à séparer car
<EMI ID=13.1>
produit. La cyanocobalamine est difficile à séparer par une chromatographie sur colonne car elle traverse pratiquement toute la colonne avec le produit final. Au cours de la réaction, d'au-
<EMI ID=14.1>
comme intermédiaires, que. l'on doit également séparer..
<EMI ID=15.1>
<EMI ID=16.1>
cobamides obtenus par réduction de la cyanocobalamine. Suivant ce brevet, on applique à cet effet divers sels de métaux qui oc
<EMI ID=17.1>
la suite de l'utilisation de borohydrur� de sodium comme agent
<EMI ID=18.1>
cyanure libères en complexes. Ce procédé présente le désavantage que la réaction se développe lentement, de sorte que la quantité
<EMI ID=19.1>
<EMI ID=20.1>
ble avec l'hydrox ocobalamine, ce qui diminue ainsi le rendement. De plus, du cyanure peut se libérer lors de l'acidification de la solution alcaline, de sorte que le produit brut doit être purifié par chromatographie.
<EMI ID=21.1>
thylcobalamine, qui est une substance intéressante du point de vu <EMI ID=22.1>
Suivant le procédé décrit dans le brevet belge
n[deg.] 773.144, on procède de manière que l'hydroxocobalamine soit réduite avec du chlorure stanneux dans une atmosphère .d'azcte sous une forte illumination, le cobamide réduit étant ensuite soumis à
<EMI ID=23.1>
groupes de méthyle du squelette de corrine se séparent par un mécanisme radicalaire sous l'effet d'une forte lumière et que les produits de cette réaction secondaire souillent le produit final.
Suivant la demande de brevet japonais publiée
<EMI ID=24.1>
de semicarbazide et le produit résultant est soumis à chromatographie sur une série de colonnes échangeuses d'ions ayant des propriétés variables.
<EMI ID=25.1>
n[deg.] 2.255.203 et dans le brevet belge n[deg.] 817.937, de l'hydroxoco-
<EMI ID=26.1>
<EMI ID=27.1>
<EMI ID=28.1>
matographie. Ce procédé exige d'importantes colonnes échangeuses
<EMI ID=29.1>
Comme on l'a décrit dans la demande de brevet japonais publiée 72/34720, . on a obtenu des alkyl cobalamines avec des rendements nettement meilleurs en ajoutant un réactif de Grignard à
<EMI ID=30.1>
le produit résultant par une chromatographie sur colonne.
Suivant le procédé décrit dans le brevet hongrois
<EMI ID=31.1> <EMI ID=32.1>
duit de cette méthylation sélective, réalisée en une seule étape, contient toutefois aussi certains produits de décomposition qui se
<EMI ID=33.1>
en présence de grandes quantités d'iode ou durant l'évaporation du mélange jusqu'à siccité. La nature du réactif appliqué dans le procédé limite le nombre des dérivés que l'on peut obtenir. De plus, les difficultés qui s'élèvent au cours de la préparation du réactif rendent difficile une production à grande échelle.
La présente invention concerne l'élaboration d'un nou-
<EMI ID=34.1>
cile à mettre en oeuvre même sous des conditions à grande échelle.
L' invention est basée sur le fait reconnu que, lorsqu'un
<EMI ID=35.1>
valentes durant la phase de réduction, les effets néfastes de l' anion peuvent être éliminés, et la p-substitution de l'atome de cobalt, c'est-à-dire la formation de la liaison carbone-cobalt, peut se développer sans difficultés quelconques.
Sur la base de ce qui précède l'invention se rapporte
<EMI ID=36.1>
<EMI ID=37.1>
dans laquelle:
R se trouve dans la position {3 et représente un groupe
<EMI ID=38.1>
carbalcoxy attaché à l'atome de cobalt du noyau de corrinotde par l'intermédiaire d'un atome de carbone, ou bien R est le reste d'un nucléoside ou d'un alcool de sucre, ou bien encore peut représenter un groupe inorganique, tel qu'un anion hydroxyle ou sulfite,
<EMI ID=39.1>
formule générale (I) mais comportant un groupe X au lieu du substituant R, X représentant un anion attaché à l'atome de cobalt et différent de R, tel qu'un ion cyanure, cyanate, halogénuxe, hydroxyle, bisulfite, rhodanate, sulfite, rhodanide, nitrite ou am-
<EMI ID=40.1>
<EMI ID=41.1>
kylation, d'hydroxyalkylation, de carboxyalkylation, d'aralkyla-
<EMI ID=42.1>
d'un nucléoside, avec un dérivé d'alcool de sucre ou avec un sel minéral. Le procédé de l'invention se caractérise en ce que la
<EMI ID=43.1>
moins un composé capable de lier le groupe X avec une liaison covalente. Ce composé lie, par addition, le groupe X se libérant durant la réaction et les impuretés d'aminés primaires éventuellement présentes, en les séparant ainsi du mélange de réaction. En conséquence, les matières de départ n'ayant pas réagi ou reconverties n'apparaissent pas comme impuretés dans le produit final, et il n'y a pas non plus de possibilité de formation d'antimêtabolites.
Tous les composés organiques capables de former un compo- <EMI ID=44.1>
<EMI ID=45.1>
C'est ainsi que, lorsque le groupe X est un groupe de cyanure ou un anion ayant un comportement semblable à celui du cyanure, tel qu'un ion cyanate, rhodanide, ou rhodanate, il peut être attaché à un aldéhyde aliphatique ou aromatique, à une cétone aliphatique ou aromatique, à un aldose ou à un cétose. Ces composés fcrment des cyanhydrines avec les groupes X mentionnés ci-dessus. Comme aldéhydes aliphatiques, on peut utiliser par exemple
<EMI ID=46.1>
<EMI ID=47.1>
benzaldênyde.
Parmi les cétones aromatiques, les substances applica-
<EMI ID=48.1>
parmi les cétones aliphatiques, on peut mentionner l'acétone ou
<EMI ID=49.1>
,Comme aldoses, on peut utiliser par exemple le D-ribose l'arabinose, le glucose, le mannose, le galactose, etc, tandis que comme cétoses, on peut utiliser notamment le fructose ou le sorbose.
Lorsque X désigne un anion sulfite ou bisulfite, celui. ci peut également être attaché à un aldéhyde sous la forme de bisulfite d'aldéhyde.
Lorsque X désigne un anion nitrite, celui-ci peut être attaché au phénol ou à un dérivé de phénol, formant un composé de nitrophênol avec l'anion nitrite. Parmi les dérivés de phénol, on peut mentionner le crésol et le thymol.
Comme on l'a déjà mentionné précédemment, le principal <EMI ID=50.1>
produit final relativement pur. Il se forme une petite quantité seulement d'impuretés qui peuvent être séparées sans application de phases chromatcgraphiques ou sans l'utilisation de colonnes échangeuses d'ion ou de colonnes de diéthylaminoéthyl- ou carboxyméthylcellulose préalablement désactivées. L'invention est mise plus complètement encore en évidence grâce aux exemples non limitatifs suivants.
Exemple 1
On introduit 5.0 g de cyanocobalamine cristalline dans un ballon à fond rond, à quatre cols rodés, d'une contenance de
500 ml, puis on y ajoute 100 ml d'eau distillée et 2 ml d'une so-
<EMI ID=51.1>
viduels du ballon, on adapte un entonnoir à robinet, un petit ballon en caoutchouc, ainsi qu'un raccord court et un long raccord, tous équipés d'un robinet.
Le mélange est agité par voie magnétique, le système est dégazé par dépression et ensuite rempli d'argon par le long raccord. Cette opération est répétée deux fois de plus, puis le court raccord est attaché à un laveur de gaz rempli d'eau distillée.
On ajoute ensuite au mélange par l'entonnoir à robinet une solution de 2 g de borohydrure de sodium dans 10 ml d'eau distillée. Il se produit une rapide formation de mousse et une rapide effervescence, puis le mélange cristallin rouge vire d'abord
<EMI ID=52.1>
tes les opérations sont réalisées sous une faible lumière diffuse.
Après 1 heure d'agitation, on ajoute au mélange exempt <EMI ID=53.1> veille à ce qu'il n'y ait pas d'entrée d'air dans le système. Or. agite le mélange pendant 15 minutes supplémentaires, puis on in-
<EMI ID=54.1>
de l'introduction de ce réactif, la solution de couleur bleu verdatre vire brusquement au rouge. Après 20 minutes d'agitation,
<EMI ID=55.1>
de méthyle au mélange afin de terminer la réaction.
Le mélange est agité pendant 20 minutes, puis on ajoute
12-15 ml- d'une solution aqueuse à 10% d'acide chlorhydrique, et ce
<EMI ID=56.1>
Lorsque le dégagement d'hydrogène cesse, le pE du mélange est vérifié et le contenu du ballon est amené dans un entonnoir à décantation. Le ballon est lavé à l'eau distillée et le liquide de lavage est également ajouté au mélange précédent.
On dissout 10 g de phénol cristallin dans la solution résultante, d'un volume d'environ 200 ml, puis on secoue le mélange avec 75, 50 et 25 ml d'un mélange de phénol et de chloroforme
(rapport de 1/1 en volume/volume). Les phases organiques sont combinées, lavées avec un volume égal d'eau distillée, puis les phases sont séparées l'une de l'autre.
On ajoute à la phase organique 150 ml d'acétone, 60 ml d'eau distillée et 500 ml de chloroforme, la phase organique est séparée à nouveau, et on là lave avec 25 ml d'eau distillée.
Les phases aqueuses sort combinées, mélangées avec 10 ml d'acétone, puis on laisse reposer le mélange à la température ambiante pendant la nuit pour la cristallisation.
<EMI ID=57.1>
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
<EMI ID=60.1>
<EMI ID=61.1>
<EMI ID=62.1>
<EMI ID=63.1>
ment activée, lavée jusqu'à ce qu'elle soit:neutre, et on agite le mélange pendant 15-20 minutes. Le mélange encore chaud (environ
<EMI ID=64.1>
un vide de pompe à injection. La cellulose restant sur le filtre
<EMI ID=65.1>
20% en volume d'éthanol, jusqu'à obtention d'un liquide de lavage incolore. On ajoute au filtrat de la carboxyméthylcellulose
<EMI ID=66.1>
mélange est traité de la. façon décrite précédemment et le filtrat
<EMI ID=67.1>
300 ml dans un évaporateur rotatif à une température ne dépassant
<EMI ID=68.1>
nuit pour réaliser la cristallisation. Les cristaux séparés sont enlevés par filtration à travers un filtre en verre fritte, puis
<EMI ID=69.1>
<EMI ID=70.1>
<EMI ID=71.1>
cristalline. Par évaporation de la liqueur-mère, 4,12 g supplémentaires du produit final cristallin sont obtenus. La teneur du produit final'on agent actif est de 99,4% (sur la hase d'une
<EMI ID=72.1> <EMI ID=73.1>
sont les suivantes: cyanocobalamine: 0%; impuretés acides: 0,3%;
<EMI ID=74.1>
un rendement de 98,6%.
Exemple 2
On introduit 5,0 g de cyanocobalamine cristalline dans un ballon à fond rond, à quatre cols rodés, d'une contenance de
<EMI ID=75.1>
distiLlêe (rapport de 1/1 en volume/volume) et 2 ml d'une solution aqueuse à 40% de formaldéhyde. La réduction est réalisée de la façon décrite dans l'Exemple 1, par introduction d'abord d'une so-
<EMI ID=76.1>
et ensuite d'une solution d'une quantité supplémentaire de 0,5 g de borohydrure dans 5 ml d'eau distillée.
<EMI ID=77.1>
de sodium, on agite le mélange pendant 15 minutes, puis on y ajoute un réactif préparé de la façon décrite ci-après.
<EMI ID=78.1>
chement préparée au départ de 2,5 g d'adénosine avec une teneur d'humidité inférieure à 0,1%, est évaporée dans un ballon à fond rond jusqu' à obtention d'une masse -résineuse. On ajoute à cette
<EMI ID=79.1>
chlorhydrique 0,3. N (mélange d'un rapport de 1/1 en volume/volume), puis on traite le mélange au reflux pendant 30 minutes. Le mélange est refroidi rapidement jusqu'à la température ambiante, neutralise à un pH de 7,2 à 8,2 avec une solution aqueuse d'hydroxyde de so-
<EMI ID=80.1>
<EMI ID=81.1>
<EMI ID=82.1> vire brusquement au rouge lors de l'introduction du réactif. Ce mélange est agité pendant 15 minutessupplémentaires, puis acidifié jusqu'au pH de 6, 0 avec une solution aqueuse à 10% d'acide chlorhydrique,, et on évapore ensuite le méthanol sous vide à une
<EMI ID=83.1>
<EMI ID=84.1>
<EMI ID=85.1>
nisée, puis le produit.passe de nouveau en phase aqueuse. On ajoute de l'acétone de manière continue au mélange pour provoquer
<EMI ID=86.1>
dant la nuit. De cette manière, on obtient 5,4 g de la coenzyme
<EMI ID=87.1>
décrite dans l'Exemple 1 pour obtenir 5,10 g de la coenzyme cris-
<EMI ID=88.1>
<EMI ID=89.1>
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
<EMI ID=92.1> <EMI ID=93.1>
<EMI ID=94.1>
<EMI ID=95.1> <EMI ID=96.1>
<EMI ID=97.1>
volume) de méthanol et d'acide chlorhydrique aqueux 0,3 N soit
<EMI ID=98.1>
alcoolique étant ensuite réglé à 8,0 avec une solution aqueuse
<EMI ID=99.1>
<EMI ID=100.1>
sation, on obtient 5,06 g (86,8%) de la coenzyme facteur -111
<EMI ID=101.1>
Exemple 4
<EMI ID=102.1>
de la façon décrite dans, l'Exemple 1. Ensuite, on procède comme décrit dans cet Exécute 1 à la différence que l'on utilise 1 ml
de benzaldéhyde comme agent de liaison du cyanure et qu'on emploie,.
<EMI ID=103.1>
<EMI ID=104.1>
<EMI ID=105.1>
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
<EMI ID=108.1>
<EMI ID=109.1>
<EMI ID=110.1> solution de 1,5 g de nitrite de sodium dans 10 ml d'eau distillée.
Après 10 minutes d'agitation, le pH de la solution est ajusté à 5,5-6,0 avec une solution aqueuse à 20% d'acide acétique, puis on ajoute une solution de 4,5 g de chlorhydrate d'hydroxylamine et de 3,0 g de chlorure d'ammonium dans 30 ml d'eau distillée. Le mélange de réaction est agité occasionnellement. Après environ 2 heures, le mélange est extrait avec un mélange de phénol et de chloroforme pour séparer les sels, puis le produit est converti en hydroxocobalamine base et ensuite en formiate d'hydroxocobala-
<EMI ID=111.1>
4,8 g (94,0%) de formiate d'hydroxoccbalamine cristallin, exempt d'impuretés de cyanocobalamine et de nitritocobalamine.
Exemple 7
On ajoute 100 ml d'eau distillée et 6 ml de phénol liquéfié à 5,0 g de nitritocobalamine cristalline. Ensuite, on procède comme décrit dans l'Exemple 1 pour obtenir 4,7 g de méthylcobalamine cristalline. Le rendement s'élève à 96,1%.
Exemple 8
On procède comme décrit dans l'Exemple 1 à la différence
<EMI ID=112.1>
<EMI ID=113.1>
Exemple 9
On procède comme décrit dans l'Exemple 2 à la différence
<EMI ID=114.1>
<EMI ID=115.1>
<EMI ID=116.1>
E;::em�� 10
<EMI ID=117.1>
<EMI ID=118.1>
sodium en présence de 20 ml d'eau distillée et de 0,4 ml d'une solution aqueuse à 40% de. formaldéhyde pour obtenir de l'hydridocobalamine. La réaction se réalise de la façon décrite dans l'Exemple 1.
Ensuite, on ajoute au mélange de réaction, une solution
<EMI ID=119.1>
puis on ajuste le pH de ce mélange à 5,5-6,0 avec une solution aqueuse à 10% d'acide chlorhydrique. On soumet le mélange à une distillation sous vide sur une courte période de temps,, puis on le désalinise et on le concentre en utilisant un mélange de phénol et de chloroforme. Les traces des solvants organiques sont séparées de la solution aqueuse, et l'agent actif est lié sur une
<EMI ID=120.1>
duit est élue avec une solution à 2% de chlorure de sodium formée avec de l'eau distillée, le pH de l'agent d'élution étant ajusté à 8,0 avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 2 N. L'effluent est acidifié au pH de 5,5 avec une solution aqueuse à 10% d'acide chlorhydrique, puis la solution est désalinisée et passée dans une colonne chargée de carboxyméthylcellulose. Cette colonne est lavée avec une solution d'acide acétique 0,05 molaire jusqu'à obtention d'un liquide de lavage incolore, puis le produit est élue avec une solution aqueuse d'acide acétique 0,8 molaire. L'éluat est concentré avec un mélange de phénol et de chloroforme, puis évaporé jusqu'à un volume final d'environ 20 ml. On ajoute 9-10 parties en volume d'acétone au concentré, et le mé- <EMI ID=121.1>
<EMI ID=122.1>
Exemple 11
<EMI ID=123.1>
<EMI ID=124.1>
<EMI ID=125.1>
didésoxy-D-mannitol de l'acide monocarboxylique de la vitamine Bï2'
Exemple 12
<EMI ID=126.1>
rence que l'on utilise, comme réactif, 0,5 g de p-chlorométhyl-
<EMI ID=127.1>
<EMI ID=128.1>
dérivé de p-chlorométhylbenzaldéhyde de l'acide monocarboxylique
<EMI ID=129.1>
Exemple 13
<EMI ID=130.1>
que l'on utilise comme substance de départ 50 ml d'une solution
<EMI ID=131.1>
lichrome). On obtient de la sorte 0,94 g de méthylcobalamine cristalline.
Exemple 14
On procède comme décrit dans l'Exemple 1, à la différen que l'on utilise comme substance de départ 50 ml d'une solution contenant 2,1 g de dicyanocobinamide, et qu'on utilise 0,5 g de g
<EMI ID = 1.1> <EMI ID = 2.1>
<EMI ID = 3.1>
<EMI ID = 4.1>
carbon atom, or else R is the residue of a nucleoside or of a sugar alcohol, or may also represent an inorganic group, such as a hydroxyl or sulfite anion.
<EMI ID = 5.1>
glucoside of a heterocyclic base, this term including both natural glucosides (such as adenosine, cytidine, inosine, guanosine or uridine and their deoxy derivatives) and synthetic glucosides formed from natural sugars or synthetic (for example hexoses, pentoses or their deoxy derivatives), as well as natural or synthetic heterocyclic bases. The expression "residue of a nucleoside" designates a nucleoside group attached to the cobalt atom by a carbon-cobalt bond. The heterocyclic bases can be natural or synthetic bases, such as pyridine, quinoline, isoquinoline, benzimidazole, azapurine, azapyrimidine, etc.
The reactive groups of nucleosides, except for the group attached to the carbon atom intended to be linked to the cobalt atom of the cobamide molecule, must be protected during the reaction. Conventional protective groups can be used for this purpose, which are separated after the reaction by methods known per se.
The rest of a sugar alcohol can be, for example, <EMI ID = 6.1>
Most of the compounds corresponding to the general formula
(I) presented below are known for interesting pharma.cological properties, such as the effects of vitamin
<EMI ID = 7.1>
remarkable enzymes.
Many processes are known for the preparation of
<EMI ID = 8.1>
According to the method described in British patent n [deg.] 963,373 and in German patent 1,213,842,
<EMI ID = 9.1>
or arylsuifonyl, so that a cobamide having an anion, in particular a cyano group, or a water molecule attached to the cobalt atom is reduced and the resulting derivative, in which the originally trivalent cobalt atom has been reduced to a monovalent cobalt, either condensed with an appropriate alkylating, acylating or sulfonylating agent. When using
<EMI ID = 10.1>
is first purified by passing it through an ion exchange column. Unconverted cobamide converts back to hydroxycobalamin during the reaction, this bydroxycobalamin appearing as an impurity in the product. When cyanocobalamin is used as starting material, part of the cyanide groups which separate during the reduction phase leave the system, while part of these groups is linked <EMI ID = 11.1>
acidic, cyanide tends to release slowly and it converts
<EMI ID = 12.1>
laminates as impurities. These are difficult to separate because
<EMI ID = 13.1>
product. Cyanocobalamin is difficult to separate by column chromatography because it crosses almost the entire column with the final product. During the reaction, other
<EMI ID = 14.1>
as intermediaries, that. we must also separate ..
<EMI ID = 15.1>
<EMI ID = 16.1>
cobamides obtained by reduction of cyanocobalamin. According to this patent, various metal salts which oc
<EMI ID = 17.1>
Following the use of borohydrur � sodium as an agent
<EMI ID = 18.1>
cyanide released into complexes. This process has the disadvantage that the reaction develops slowly, so that the amount
<EMI ID = 19.1>
<EMI ID = 20.1>
ble with hydroxide ocobalamin, which reduces the yield. In addition, cyanide can be released during the acidification of the alkaline solution, so that the crude product must be purified by chromatography.
<EMI ID = 21.1>
thylcobalamin, which is an interesting substance from the point of view <EMI ID = 22.1>
According to the process described in the Belgian patent
n [deg.] 773.144, the procedure is that the hydroxocobalamin is reduced with stannous chloride in an atmosphere of azctes under strong illumination, the reduced cobamide then being subjected to
<EMI ID = 23.1>
methyl groups of the corrine skeleton separate by a radical mechanism under the effect of strong light and the products of this secondary reaction contaminate the final product.
According to the published Japanese patent application
<EMI ID = 24.1>
semicarbazide and the resulting product is subjected to chromatography on a series of ion exchange columns having variable properties.
<EMI ID = 25.1>
n [deg.] 2,255,203 and in Belgian patent n [deg.] 817,937, hydroxoco-
<EMI ID = 26.1>
<EMI ID = 27.1>
<EMI ID = 28.1>
matography. This process requires large exchange columns
<EMI ID = 29.1>
As described in Japanese published patent application 72/34720,. alkyl cobalamins were obtained with much better yields by adding a Grignard reagent to
<EMI ID = 30.1>
the resulting product by column chromatography.
According to the process described in the Hungarian patent
<EMI ID = 31.1> <EMI ID = 32.1>
the product of this selective methylation, carried out in a single step, however also contains certain decomposition products which
<EMI ID = 33.1>
in the presence of large quantities of iodine or during the evaporation of the mixture to dryness. The nature of the reagent applied in the process limits the number of derivatives that can be obtained. In addition, the difficulties which arise during the preparation of the reagent make large-scale production difficult.
The present invention relates to the development of a new
<EMI ID = 34.1>
cile to implement even under large-scale conditions.
The invention is based on the recognized fact that, when
<EMI ID = 35.1>
valentes during the reduction phase, the harmful effects of the anion can be eliminated, and the p-substitution of the cobalt atom, i.e. the formation of the carbon-cobalt bond, can develop without any difficulties.
On the basis of the above the invention relates
<EMI ID = 36.1>
<EMI ID = 37.1>
in which:
R is in position {3 and represents a group
<EMI ID = 38.1>
carbalcoxy attached to the cobalt atom of the corrinotde nucleus via a carbon atom, or R is the residue of a nucleoside or a sugar alcohol, or alternatively can represent an inorganic group, such as a hydroxyl or sulfite anion,
<EMI ID = 39.1>
general formula (I) but comprising a group X instead of the substituent R, X representing an anion attached to the cobalt atom and different from R, such as a cyanide, cyanate, halogenuxe, hydroxyl, bisulfite, rhodanate, sulfite ion , rhodanide, nitrite or am-
<EMI ID = 40.1>
<EMI ID = 41.1>
kylation, hydroxyalkylation, carboxyalkylation, aralkyla-
<EMI ID = 42.1>
of a nucleoside, with a sugar alcohol derivative or with a mineral salt. The method of the invention is characterized in that the
<EMI ID = 43.1>
minus a compound capable of binding group X with a covalent bond. This compound binds, by addition, the X group released during the reaction and the impurities of primary amines which may be present, thus separating them from the reaction mixture. As a result, unreacted or reconverted starting materials do not appear as impurities in the final product, nor is there any possibility of the formation of antimetabolites.
All organic compounds capable of forming a compound <EMI ID = 44.1>
<EMI ID = 45.1>
Thus, when the group X is a cyanide group or an anion having a behavior similar to that of cyanide, such as a cyanate, rhodanide, or rhodanate ion, it can be attached to an aliphatic or aromatic aldehyde, an aliphatic or aromatic ketone, an aldose or a ketosis. These compounds form cyanohydrins with the X groups mentioned above. As aliphatic aldehydes, for example,
<EMI ID = 46.1>
<EMI ID = 47.1>
benzaldênyde.
Among the aromatic ketones, the substances applied
<EMI ID = 48.1>
among the aliphatic ketones, acetone or
<EMI ID = 49.1>
As aldoses, one can use for example D-ribose arabinose, glucose, mannose, galactose, etc, while as ketoses, one can use in particular fructose or sorbose.
When X denotes a sulfite or bisulfite anion, that. it can also be attached to an aldehyde in the form of aldehyde bisulfite.
When X denotes a nitrite anion, it can be attached to phenol or a phenol derivative, forming a nitrophenol compound with the nitrite anion. Among the phenol derivatives, cresol and thymol can be mentioned.
As previously mentioned, the main <EMI ID = 50.1>
relatively pure end product. Only a small amount of impurities is formed which can be separated without the application of chromatographic phases or without the use of ion-exchange columns or columns of diethylaminoethyl- or carboxymethylcellulose previously deactivated. The invention is more fully demonstrated thanks to the following nonlimiting examples.
Example 1
5.0 g of crystalline cyanocobalamin are introduced into a round bottom flask, with four ground necks, with a capacity of
500 ml, then add 100 ml of distilled water and 2 ml of a so-
<EMI ID = 51.1>
for the balloon, we adapt a tap funnel, a small rubber balloon, as well as a short connector and a long connector, all fitted with a tap.
The mixture is stirred magnetically, the system is degassed by vacuum and then filled with argon through the long connector. This is repeated two more times, then the short fitting is attached to a gas washer filled with distilled water.
A solution of 2 g of sodium borohydride in 10 ml of distilled water is then added to the mixture through the tap funnel. Rapid foaming and rapid effervescence occurs, then the red crystalline mixture turns first
<EMI ID = 52.1>
your operations are carried out in low diffuse light.
After 1 hour of stirring, <EMI ID = 53.1> is added to the free mixture, ensuring that there is no air entering the system. Or. Stir the mixture for an additional 15 minutes, then
<EMI ID = 54.1>
from the introduction of this reagent, the greenish-blue solution suddenly turns red. After 20 minutes of agitation,
<EMI ID = 55.1>
methyl to the mixture to complete the reaction.
The mixture is stirred for 20 minutes, then added
12-15 ml- of a 10% aqueous hydrochloric acid solution, and this
<EMI ID = 56.1>
When the evolution of hydrogen ceases, the pE of the mixture is checked and the contents of the flask are brought into a settling funnel. The flask is washed with distilled water and the washing liquid is also added to the previous mixture.
10 g of crystalline phenol are dissolved in the resulting solution, with a volume of about 200 ml, then the mixture is shaken with 75, 50 and 25 ml of a mixture of phenol and chloroform
(1/1 volume / volume ratio). The organic phases are combined, washed with an equal volume of distilled water, then the phases are separated from one another.
150 ml of acetone, 60 ml of distilled water and 500 ml of chloroform are added to the organic phase, the organic phase is again separated and washed there with 25 ml of distilled water.
The aqueous phases come out combined, mixed with 10 ml of acetone, then the mixture is left to stand at room temperature overnight for crystallization.
<EMI ID = 57.1>
<EMI ID = 58.1>
<EMI ID = 59.1>
<EMI ID = 60.1>
<EMI ID = 61.1>
<EMI ID = 62.1>
<EMI ID = 63.1>
activated, washed until it is: neutral, and the mixture is stirred for 15-20 minutes. The mixture still hot (about
<EMI ID = 64.1>
an injection pump vacuum. The cellulose remaining on the filter
<EMI ID = 65.1>
20% by volume of ethanol, until a colorless washing liquid is obtained. Carboxymethylcellulose is added to the filtrate
<EMI ID = 66.1>
mixture is dealt with. previously described way and the filtrate
<EMI ID = 67.1>
300 ml in a rotary evaporator at a temperature not exceeding
<EMI ID = 68.1>
night to achieve crystallization. The separated crystals are removed by filtration through a sintered glass filter, then
<EMI ID = 69.1>
<EMI ID = 70.1>
<EMI ID = 71.1>
crystalline. By evaporation of the mother liquor, an additional 4.12 g of the crystalline final product is obtained. The content of the final product on active agent is 99.4% (on the basis of a
<EMI ID = 72.1> <EMI ID = 73.1>
are as follows: cyanocobalamin: 0%; acidic impurities: 0.3%;
<EMI ID = 74.1>
a yield of 98.6%.
Example 2
5.0 g of crystalline cyanocobalamin are introduced into a round bottom flask with four ground necks, with a capacity of
<EMI ID = 75.1>
distilled (ratio of 1/1 by volume / volume) and 2 ml of a 40% aqueous formaldehyde solution. The reduction is carried out as described in Example 1, by first introducing a so-
<EMI ID = 76.1>
and then a solution of an additional 0.5 g of borohydride in 5 ml of distilled water.
<EMI ID = 77.1>
of sodium, the mixture is stirred for 15 minutes, then a reagent prepared as described below is added thereto.
<EMI ID = 78.1>
Chely prepared from 2.5 g of adenosine with a moisture content of less than 0.1%, is evaporated in a round bottom flask until a resinous mass is obtained. We add to this
<EMI ID = 79.1>
hydrochloric 0.3. N (mixture of a ratio of 1/1 by volume / volume), then the mixture is treated at reflux for 30 minutes. The mixture is rapidly cooled to room temperature, neutralized to a pH of 7.2 to 8.2 with an aqueous solution of sodium hydroxide.
<EMI ID = 80.1>
<EMI ID = 81.1>
<EMI ID = 82.1> suddenly turns red when the reagent is introduced. This mixture is stirred for an additional 15 minutes, then acidified to pH 6.0 with 10% aqueous hydrochloric acid, and the methanol is then evaporated in vacuo to
<EMI ID = 83.1>
<EMI ID = 84.1>
<EMI ID = 85.1>
then the product again goes into the aqueous phase. Acetone is added continuously to the mixture to cause
<EMI ID = 86.1>
in the night. In this way, 5.4 g of the coenzyme are obtained.
<EMI ID = 87.1>
described in Example 1 to obtain 5.10 g of the coenzyme cris-
<EMI ID = 88.1>
<EMI ID = 89.1>
<EMI ID = 90.1>
<EMI ID = 91.1>
<EMI ID = 92.1> <EMI ID = 93.1>
<EMI ID = 94.1>
<EMI ID = 95.1> <EMI ID = 96.1>
<EMI ID = 97.1>
volume) of methanol and 0.3N aqueous hydrochloric acid, i.e.
<EMI ID = 98.1>
alcoholic being then set to 8.0 with an aqueous solution
<EMI ID = 99.1>
<EMI ID = 100.1>
sation, 5.06 g (86.8%) of the factor 111 coenzyme is obtained
<EMI ID = 101.1>
Example 4
<EMI ID = 102.1>
as described in, Example 1. Then we proceed as described in this Execute 1 with the difference that we use 1 ml
of benzaldehyde as a bonding agent for cyanide and which is used ,.
<EMI ID = 103.1>
<EMI ID = 104.1>
<EMI ID = 105.1>
<EMI ID = 106.1>
<EMI ID = 107.1>
<EMI ID = 108.1>
<EMI ID = 109.1>
<EMI ID = 110.1> solution of 1.5 g of sodium nitrite in 10 ml of distilled water.
After 10 minutes of stirring, the pH of the solution is adjusted to 5.5-6.0 with a 20% aqueous solution of acetic acid, then a solution of 4.5 g of hydroxylamine hydrochloride is added and 3.0 g of ammonium chloride in 30 ml of distilled water. The reaction mixture is stirred occasionally. After about 2 hours, the mixture is extracted with a mixture of phenol and chloroform to separate the salts, then the product is converted into hydroxocobalamin base and then into hydroxocobala formate.
<EMI ID = 111.1>
4.8 g (94.0%) of crystalline hydroxoccbalamine formate, free from cyanocobalamin and nitritocobalamin impurities.
Example 7
100 ml of distilled water and 6 ml of liquefied phenol are added to 5.0 g of crystalline nitritocobalamin. Then, proceed as described in Example 1 to obtain 4.7 g of crystalline methylcobalamin. The yield is 96.1%.
Example 8
We proceed as described in Example 1 with the difference
<EMI ID = 112.1>
<EMI ID = 113.1>
Example 9
We proceed as described in Example 2 with the difference
<EMI ID = 114.1>
<EMI ID = 115.1>
<EMI ID = 116.1>
E; :: em � � 10
<EMI ID = 117.1>
<EMI ID = 118.1>
sodium in the presence of 20 ml of distilled water and 0.4 ml of a 40% aqueous solution of. formaldehyde to obtain hydridocobalamin. The reaction is carried out as described in Example 1.
Then a solution is added to the reaction mixture.
<EMI ID = 119.1>
then the pH of this mixture is adjusted to 5.5-6.0 with a 10% aqueous solution of hydrochloric acid. The mixture is subjected to vacuum distillation over a short period of time, then desalinated and concentrated using a mixture of phenol and chloroform. The traces of organic solvents are separated from the aqueous solution, and the active agent is bound on a
<EMI ID = 120.1>
duit is eluted with a 2% solution of sodium chloride formed with distilled water, the pH of the eluting agent being adjusted to 8.0 with a 2N aqueous sodium hydroxide solution. effluent is acidified to pH 5.5 with a 10% aqueous hydrochloric acid solution, then the solution is desalinated and passed through a column loaded with carboxymethylcellulose. This column is washed with a 0.05 molar acetic acid solution until a colorless washing liquid is obtained, then the product is eluted with an aqueous 0.8 molar acetic acid solution. The eluate is concentrated with a mixture of phenol and chloroform, then evaporated to a final volume of approximately 20 ml. 9-10 parts by volume of acetone are added to the concentrate, and the met <EMI ID = 121.1>
<EMI ID = 122.1>
Example 11
<EMI ID = 123.1>
<EMI ID = 124.1>
<EMI ID = 125.1>
dideoxy-D-mannitol of vitamin B2 monocarboxylic acid
Example 12
<EMI ID = 126.1>
Using as reagent, 0.5 g of p-chloromethyl-
<EMI ID = 127.1>
<EMI ID = 128.1>
p-chloromethylbenzaldehyde derivative of monocarboxylic acid
<EMI ID = 129.1>
Example 13
<EMI ID = 130.1>
which is used as the starting substance 50 ml of a solution
<EMI ID = 131.1>
lichrome). 0.94 g of crystalline methylcobalamin are thus obtained.
Example 14
The procedure is as described in Example 1, with the difference that 50 ml of a solution containing 2.1 g of dicyanocobinamide is used as starting material and that 0.5 g of g is used.