"Procédé inhibant la libération des gonadotropines" La présente invention est relative à des; peptides qui inhibent la libération de gonadotropines par la glande pituitaire ou hypophyse chez les mammifères, y compris chez les Êtres humains, et elle se rapporte d'une manière plus spécifique à des méthodes pour empêcher la conception par l'administration à des mammifères mâles de tels peptides qui inhibent la fonction des gonades et la
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tostérone.
La glande pituitaire ou hypophyse est fixée par un pédon-
nom d'hypothalamus. La. glande pituitaire comprend deux lobes, les
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tuitaire accumule et fait passer dans la circulation générale deux hormones fabriquées dans l'hypothalamus, ces hormones étant la vasopressine et l'oxytocine. Le lobe antérieur de la glande pituitaire secrète un certain nombre d'hormones, qui sont des molécules protéiques ou glycoprotéiques complexes qui se déplacent à travers la circulation sanguine vers différents organes et qui, à leur tour, stimulent la sécrétion dans la circulation sanguine d'autres hormones provenant des organes périphériques. En particulier, l'hormone folliculostimulante (FSH) et l'hormone lutéinisante (LH), quelque fois appelées gonadotropines ou hormones gonadotropiques, sont libérées par la glande pituitaire.
Ces hormones, en combinaison, règlent le fonctionnement des gonades pour la production de testostérone dans les testicules et de progestérone et d'oestrogène dans les ovaires, et règlent également la production et la maturation des gamètes.
La libération d'une hormone par le lobe antérieur de la <EMI ID=3.1>
tion préalable d'une autre classe d'hormones produites par l'hypothalamus. L'une de ces hormones hypothalamiques agit comme facteur qui déclenche la libération des hormones gonadotropiques, en particulier la LH. L'hormone hypothalamique qui agit comme
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présente invention LRF, bien qu'on puisse également l'appeler
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décapeptide répondant à la structure suivante:
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Les peptides sont des composés qui contiennent deux ou plusieurs aminoacides dans lesquels le groupe carboxyle d'un acide
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telle que représentée ci-dessus, concorde avec la représentation
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et le groupe carboxyle à la droite. La position du résidu d'aminoacide est identifiée en numérotant les résidus d'aminoacide de la gauche vers la droite. Dans le cas du LRF, la portion hydroxyle du groupe carboxyle de la glycine a été remplacée par un groupe amino (NH2) . Les abréviations pour les résidus d'aminoacide individuels susmentionnsés sont des abréviations que l'on utilise ordinairement et sont basées sur la dénomination habituelle de l'aminoacide; c'est-à-dire que p-Glu représente l'acide pyroglutamique,
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présente la sérine, Tyr représente la tyrosine, Gly représente la glycine, Leu représente la leucine, Arg représente l'arginine, et Pro représente la proline. A l'exception de la glycine, les aminoacides des peptides de l'invention sont de la configuration <EMI ID=10.1>
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Gly en position 6 du décapeptide LRF, peut donner un peptide ayant une puissance d'environ 1 à 35 fois plus grande, par rapport au LRF, pour effectuer la libération de la LH et d'autres gonadotropines par la glande pituitaire des mammifères. L'effet de libération est obtenu lorsque l'analogue de LRF, appelé agoniste de LRF, est introduit dans la circulation sanguine d'un mammifère.
Il est également connu que la substitution de différents aminoacides au His (ou la destruction de Bis) en position 2 du
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d'autres gonadotropines par la glande pituitaire des mammifères.
En particulier, on obtient différents degrés d'inhibition de la
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par D-Ala, D-Phe ou Gly. L'effet inhibiteur de ces peptidea modifiés en position 2 peut être encore accru lorsque l'on substitue un D-aminoacide au Gly en position 6 des décapeptides. Par
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puissant comme inhibiteur pour la libération de gonadotropines que ne l'est le même peptide où Gly est présent en position 6 plutôt que D-Ala.
Certains mammifères femelles qui n'ont pas de cycle ovulatoire et qui ne présentent pas de troubles hypophysaires ou ovariens commencent à sécréter des quantités normales de gonade-
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C'est ainsi que l'administration de LRF est considérée comme appro-
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pour lesquelles on désire empêcher l'ovulation chez les mammifères femelles, et l'administration d'antagonistes de LRF a été utilisée pour empêcher l'ovulation. On a également constaté que l'administration d'agonistes puissants s'est= révélée intéressante en diminuant sensiblement le nombre de spermatozoïdes chez les mammifères mâles; toutefois, des méthodes plus efficaces permettant d'inhiber la spermatogenèse chez les mammifères mâles utilisant des analogues de LRF sont recherchées.
La présente invention prévoit un procédé de traitement des mammifères mâles, y compris les Atres humains, utilisant des peptides qui inhibent fortement la libération des gonadotropines.
L'administration de ces analogues de LRF qui sont de puissants
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reproduction des mammifères mâles et réalise une diminution tellement importante de la numérotation ou du nombre de spermatozoïdes que la fertilisation est empêchée d'une manière efficace.
D'une manière générale, suivant la présente invention, on
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inhibent fortement la sécrétion des gonadotropines par la glande
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mains, et qui inhibent la libération des stéroïdes par les gonades, peut être appliquée chez les mammifères mâles car ces antagonistes de LRF s'avèrent efficaces à des niveaux de dosage suffisamment faibles, c'est-à-Cire ne dépassant pas environ 3 mg par jour par kilo de poids de corps, pour éliminer les effets dermatologiques et autres effets secondaires indésirables. Le peptide
a de préférence une affinité de liaison d'au moins quinze fois celle montrée par le LRF. Le peptide doit avoir une valeur de <EMI ID=22.1>
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le, par injection ou par voie sous-cutanée. L'administration orale est préférable pour les êtres humains; toutefois, l'injection peut s'avérer préférable pour les utilisations en médecine vétérinaire. Le peptide peut Etre combiné à des supports ou diluants pharmaceutiquement acceptables appropriés, tels que .es huiles végérales, des sucres, de l'amidon de mats, des polysaccharides et des gommes. Le peptide pourrait être administré chaque jour pendant sept jours consécutifs de chaque mois. Ou bien, il pourrait être administré chaque jour à un taux quelque peu inférieur en môme temps que des androgènes appropriés.
Ces peptides sont souvent administrés sous la forme de sels non toxiques pharmaceutiquement acceptables, tels que des sels d'addition d'acide ou des complexes métalliques, par exemple avec du zinc, du fer, etc (qui sont considérés comme sels d'addition dans le cadre de la présente invention). Des exemples de ces sels d'addition d'acide sont les chlorhydrate, bromhydrate, sulfate, phosphate, maléate, acétate, citrate, benzoate, suceinate, malate, ascorbate, tartrate etc.
Des exemples de peptides que l'on peut utiliser soit les antagonistes de LRF dans lesquels il y a des substitutions
en positions 1 et 6, dans lesquels du D-Phe substitué est présent en position 2 et dans lesquels du D-Trp est présent en position 3. La position 1 peut contenir du déshyJro-Pro, du déshydro-D-Pro,
du Thz ou du D-Thz. La position 6 peut contenir soit du D-Trp soit du (imBzl)D-His. De plus, certaines substitutions peuvent éventuellement être faites en positions 7 et 10. Par déshydro Pro, <EMI ID=25.1>
l'on peut préparer par le traitement de chlorhydrate de cystéine
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est fixé à l'azote; par exemple, on prépare Ac-Thz par la réaction de Thz avec de l'anhydride acétique.
D'une manière plus spécifique, les peptides de la présente invention sont représentés par la formule suivante:
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dans laquelle R représente de l'hydrogène ou un radical fornyle, acétyle, acrylyle, benzoyle ou allyle, R2 représente du déshydro Pro, du déshydro D-Pro, du Thz ou du D-Thz, R3 représente pCl-D-
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autre alkyl amide comportant 1 à 5 atomes de carbone. On peut uti-
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Les peptides de la présente invention peuvent être synthétisés par une technique en phase solide en utilisant une résine chlorométhylée pour les peptides dans lesquels un alkylamide
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tides dans lesquels Gly-NH2 est présent. La synthèse est réalisée en ajoutant par paliers successifs les aminoacides dans la chaîne
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d'Amérique n[deg.] 4.072.668, incorporé dans le cadre de la présente invention à titre de référence. Les groupes de protection des chaînes latérales, ainsi que cela est bien connu en pratique, sont
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couplés à la chaîne en formation sous la résine.
Une telle méthode permet d'obtenir la peptidorésine intermédiaire totalement protégée. Le peptide totalement protégé
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ainsi que cela est bien connu en pratique, pour donner L'intermédiaire d'amide totalement protégé. Les intermédiaires de l'invention peuvent être représentés par la formule suivante:
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du type que l'on utilise en pratique dans la synthèse par paliers
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désirée représente un groupe acyle particulier, ce groupe pouvant être utilisé comme groupe de protection. Parmi les classes de
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groupes de protection du type acyle, tels que les groupes formyle, trifluoroacétyle, phtalyle, Tos, benzoyle, benzènesulfonyle, nitrophénylsulfényle, tritylsulfényle, o-nitrophénoxyacétyle, acrylyle, chloroacétyle, acétyle et a-chlorobutyryle; (2) les groupes de protection du type uréthanne aromatique, par exemple
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p-chloro-bensyloxycarbonyle, le p-nitrobenzyloxycarbonyle, le p-bromobenzyloxycarbonyle et le p-méthoxybenzyloxycarbonyle; (3) les groupes de protection du type uréthanne aliphatique, tels que le terbutyloxycarbonyle (Boc), le diisopropylméthoxycarbonyle,
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(4) les groupes de protection du type uréthanne cycloalkylé, tels que le cyclopentyloxycarbonyle, l'adamantyloxycarbonyle et le cyclohexyloxycarbonyle; (5) les groupes de protection du type thiouréthanne, tels que le phénylthiocarbonyle; (6) les groupes de <EMI ID=42.1>
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X. <2> est un groupe de protection pour le groupe hydroxyle alcoolique de Ser et est choisi parmi l'acétyle, le benzoyle, le tétrahydropyrannyle, le tert-butyle, le trityle, le benzyle et le 2,6-dichlorobenzyle. Le benzyle est préféré.
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nant le tétrahydropyrannyle, le tert-butyle, le trityle, le benzyle, le benzyloxycarbonyle, le 4-bromobenzyloxycarbonyle et le 2,6dichlorobenzyle. Le 2,6-dichlorobenzyle est préféré.
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guanidino de Arg et est choisi dans le groupe comprenant les radicaux nitro, Tos, benzyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle, et Boc; ou bien, X4 peut représenter de l'hydrogène, ce qui. signifie qu'il n'y a pas de groupes de protection sur les atomes d'azote des chaînes latérales de l'arginine.
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de 1 à 5 atomes de carbone, la phénéthylamine, O-CH2-(support de résine}, Gly-O-CH2-(support de résine) et Gly-NH-(support de résine).
Les critères pour choisir les groupes de protection de chaînes latérales en ce qui concerne X <2> -X 4 résident dans le fait que le groupe de protection doit être stable vis-à-vis du réactif sous les conditions réactionnelles choisies pour séparer le groupe de protection d'a-amino à chaque étape de la synthèse, que le groupe de protection ne doit pas être éliminé sous des conditions de couplage et que le groupe de protection puisse être enlevé à la fin de la synthèse de la séquence d'aminoacides désirée sous des conditions de réaction qui ne modifient pas la chaîne de peptide.
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nombreux groupes fonctionnels du support de résine de polystyrène
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de résine], une liaison d'amide relie Gly à la résine de BEA ou à une résine de BHA paraméthylée.
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lyle, benzoyle ou allyle, il peut être utilisé comme groupe de
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auquel cas il peut être ajouté à la proline ou au Thz avant d'être couplé à la chatne de peptide. Acétyle est abrégé en Ac, et acrylyle est abrégé en Acr. Ou bien, on peut réaliser une réaction avec le peptide sur la résine, par exemple par réaction avec de l'acide acétique en présence de dicyclohexyl carbodiimide
(DCC) ou avec de l'anhydride acétique.
La séparation de la protection des peptides ainsi que le clivage du peptide à partir de la résine de benzhydrylamine se
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l'anisole au peptide avant le traitement avec le HF. Après la séparation du HF, sous vide, on traite le peptide dont la protection a été séparée, on le clive avec de l'éther.on le décante,on le reprend dans de l'acide acétique dilué et on le lyophilise . La purification du peptide est effectuée par une chromatographie échangeuse d'ions sur une colonne CMC, suivie d'une chromatographie de partage en utilisant le système d'élution suivant:
n-butanol et acide acétique O,1N (rapport en volume: 1/1), sur une colonne garnie de Séphadex G 25.
Les peptides de 1 ' invention, sont considérés comme étant efficaces à des taux de 200 microgrammes par kg de poids de corps, Il est préférable d'utiliser des niveaux de dosage d'environ
0,1 à environ 3 mg par kg de poids de corps lorsque les antagonistes sont administrés pour inhiber la spermatogenèse chez les mammifères mâles sur une base régulière; toutefois, il n'est pas certain que 'Le poids corporel est le véritable critère, de sorte que des quantités moindres peuvent s'avérer efficaces.
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rentes caractéristiques de l'invention mais ne constituent en aucun cas une limitation à celle-ci.
Exemple 1
A titre d'exemple, une synthèse en phase solide caracté-
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LRF est donnée ci-après. Ce peptide répond à la formule suivante:
Ac-déshydro Pro-pCl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-N MeLeu-ArgPro-Gly-NH2.
On utilise une résine de BHA, et du Gly protégé par Boc
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en utilisant un excès de trois fois de dérivé de Boc et du DCC comme réactif d'activation. Le résidu de glycine se fixe au ré-
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Après le couplage de chaque résidu d'aminoacide, le lavage, le déblocage et le couplage du résidu d'aminoacide suivant sont réalisés conformément à l'échelle ci-après en utilisant une machine automatisée et en commençant avec environ 5 g de résine :
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Après l'étape 13, on prélève une portion pour un essai à la ninhydrine : si l'essai est négatif, on revient à l'étape 1 pour le couplage de l'aminoacide suivant; si l'essai est positif ou légèrement positif, on revient et on répète les étapes 9 à 13.
L'échelle susmentionnée est utilisée pour le couplage de chacun des aminoacides du peptide de l'invention après avoir atta-
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pour chacun des aminoacides restants tout au long de la synthèse. La chaîne latérale de Arg est protégée avec Tos. On utilise Bzl comme groupe de protection de chaîne latérale pour le groupe hydroxyle de Ser, et on utilise le 2,6-dichlorobenzyle comme groupe de protection de chaîne latérale pour le groupe hydroxyle de Tyr.
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CH2C12, sont couplés en utilisant du DMF.
Le clivage du peptide à partir de la résine et la séparation totale de la protection des chaînes latérales se font très
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avant le traitement au HF. Après séparation du HF sous vide, on extrait la résine avec de l'acide acétique à 50% en volume, et le:
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sont lyophilisés,pour donner une poudre de peptide brute.
La purification du peptide est ensuite effectuée au moyen d'une chromatographie échangeuse d'ions sur CMC (Whatman CM
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eau 50/50) suivie d'une chromatographie de partage dans une colonr de filtration pour gel en utilisant le système d'élut ion suivant:
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On essaye le peptide in vitro en utilisant des cellules pituitaires ou hypophysaires de rat dissociées maintenues en culture pendant 4 jours avant l'essai. Les niveaux de LH obtenus en réponse à l'application de peptides sont testés par une technique de radioimmunoessay spécifique pour la LH de rat. Des récipients plats de cellules ne reçoivent que du LRF (3 nanomolair Des récipients plats expérimentaux reçoivent une mesure 3 nanomolaire dans du LRF plus une mesure ayant une concentration de peptide d'essai allant de 1 à 100 nanomolaire. La quantité de LE sécrétée dans les échantillons traités seulement avec du LRF est comparée à celle sécrétée par les échantillons traités avec le peptide plus le LRF de manière à déterminer le rapport auquel une <EMI ID=65.1>
forme du rapport de concentrations molaires du peptide d'essai
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libérée par du LRF 3 nanomolaire jusqu'à 50% de la valeur de ré-
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efficace dans le procédé de la présente invention, il doit avoir
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viron 25 fois celle du LRF.
On utilise le peptide à un niveau efficace pour réduire le poids des testicules et des vésicules séminales et également pour inhiber la spermatogenèse après une administration de 14 jours à des rats mâles. Les niveaux de testostérone (T) des rats
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maux témoins une semaine après l'arrêt du traitement pendant 14 jours. Les poids des prostates des rats mâles se retrouvent après 2-3 semaines et les poids des vésicules séminales se retrouvent après 4-5 semaines. Il est préférable d'utiliser des niveaux
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jour, qui peuvent s'administrer sans effets secondaires défavorables. Il est possible d'utiliser des teneurs inférieures en antagonistes pour obtenir des résultats similaires.
Exemple 2
Des rats males (environ 320 g chacun ) sont chacun traités avec 1 mg du peptide synthétisé dans l'Exemple 1, une fois par jour, pendant 14 jours par injection dans 0,2 ml d'huile de mats. Tous les rats présentent une diminution de poids des <EMI ID=72.1>
maux mâles traités, sont réduits comparativement aux animaux témoins.
Un examen histologique des testicules après le traitement de 14 jours révèle une spermatogenèse dopée pendant une période allant jusqu'à plusieurs semaines après la cessation des injections journalières. Les rats sont incapables de provoquer une fertilisation après le traitement pendant environ 7 jours consécutifs.
La récupération complète du poids des testicules et des vésicules séminales ainsi que de la spermatogenèse en dernier lieu
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dant 14 jours. Après environ 4 semaines, les poids des testicules sont égaux à environ 80% de ceux du groupe témoin, et environ 7 jours après, une bonne spermatogenèse apparaît dans la majorité des tubes
Le peptide essayé s'avère intéressant pour empêcher la reproduction chez les mammifères mâles sans provoquer d'effets
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ministration aux hommes sur une base régulière, il serait préférable de l'administrer en même temps que des androgènes appropriés,
Exemple 3
D'autres antagonistes de LRF répondant à la formule générale:
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sont synthétisés de la façon suivante:
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que le peptide de l'Exemple 1, et on constate qu'ils ont la valeur de ICR�� donnée ci-après.
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Ces peptides sont ensuite essayés suivant le procédé de l'Exemple 2, et tous les cinq peptides s'avèrent intéressants
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production lorsqu'on les administre à des mammifères mâles à un dosage similaire pendant des périodes de temps similaires.
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisation ci-avant et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre du présent brevet. Par exemple, une substitution et des modifications dans les autres membres de la chaîne de LRF peuvent être effectuées conformément à des développements bien connus qui ont permis d'obtenir des analogues de LRF, intéressants, connus. De plus, d'autres substitutions qui ne détruisent pas d'une façon <EMI ID=80.1>
dans les peptides utilisés suivant l'invention, et des groupes acyle équivalents peuvent être substitués aux groupes entrant dans
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REVENDICATIONS
1. Procédé pour inhiber la spermatogenèse chez des mammifères mâles et pour empêcher ainsi la reproduction, caractérisé en ce qu'il consiste à administrer une quantité efficace d'un peptide ou d'un sel non toxique de celui-ci à un mammifère
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3 mg par kg de poids de corps, ce peptide étant un antagoniste
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"Method inhibiting the release of gonadotropins" The present invention relates to; peptides which inhibit the release of gonadotropins from the pituitary gland or pituitary gland in mammals, including humans, and relates more specifically to methods of preventing conception by administration to male mammals of such peptides that inhibit the function of the gonads and the
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tosterone.
The pituitary gland or pituitary gland is fixed by a pedon-
name of hypothalamus. The pituitary gland has two lobes, the
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tuitaire accumulates and passes into the general circulation two hormones produced in the hypothalamus, these hormones being vasopressin and oxytocin. The anterior lobe of the pituitary gland secretes a number of hormones, which are complex protein or glycoprotein molecules that travel through the bloodstream to different organs and which, in turn, stimulate secretion in the bloodstream. other hormones from peripheral organs. In particular, follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), sometimes called gonadotropins or gonadotropic hormones, are released by the pituitary gland.
These hormones, in combination, regulate the functioning of the gonads for the production of testosterone in the testes and progesterone and estrogen in the ovaries, and also regulate the production and maturation of gametes.
Release of a hormone from the <EMI ID = 3.1> anterior lobe
another class of hormones produced by the hypothalamus. One of these hypothalamic hormones acts as a factor that triggers the release of gonadotropic hormones, especially LH. The hypothalamic hormone which acts as
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present invention LRF, although it can also be called
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decapeptide with the following structure:
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Peptides are compounds that contain two or more amino acids in which the carboxyl group of an acid
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as shown above, matches the representation
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and the carboxyl group on the right. The position of the amino acid residue is identified by numbering the amino acid residues from left to right. In the case of LRF, the hydroxyl portion of the carboxyl group of glycine has been replaced by an amino group (NH2). The abbreviations for the aforementioned individual amino acid residues are commonly used abbreviations and are based on the common name of the amino acid; that is to say that p-Glu represents pyroglutamic acid,
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presents serine, Tyr represents tyrosine, Gly represents glycine, Leu represents leucine, Arg represents arginine, and Pro represents proline. With the exception of glycine, the amino acids of the peptides of the invention have the configuration <EMI ID = 10.1>
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Gly in position 6 of the LRF decapeptide, can give a peptide having a power of approximately 1 to 35 times greater, compared to LRF, to effect the release of LH and other gonadotropins by the pituitary gland of mammals. The release effect is obtained when the LRF analog, called an LRF agonist, is introduced into the bloodstream of a mammal.
It is also known that the substitution of different amino acids for His (or the destruction of Bis) in position 2 of the
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other gonadotropins by the pituitary gland of mammals.
In particular, different degrees of inhibition of the
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by D-Ala, D-Phe or Gly. The inhibitory effect of these peptides modified in position 2 can be further increased when a D-amino acid is substituted for Gly in position 6 of the decapeptides. By
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powerful as an inhibitor for the release of gonadotropins than is the same peptide where Gly is present in position 6 rather than D-Ala.
Some female mammals who do not have an ovulatory cycle and who do not have pituitary or ovarian disorders begin to secrete normal amounts of gonad-
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This is how the administration of LRF is considered appropriate.
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for which it is desired to prevent ovulation in female mammals, and the administration of LRF antagonists has been used to prevent ovulation. It has also been found that administration of potent agonists has been shown to be beneficial in significantly reducing the number of sperm in male mammals; however, more effective methods of inhibiting spermatogenesis in male mammals using LRF analogs are being sought.
The present invention provides a method of treating male mammals, including humans, using peptides which strongly inhibit the release of gonadotropins.
Administration of these potent LRF analogs
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reproduction of male mammals and achieves such a large decrease in the number or number of sperm that fertilization is effectively prevented.
In general, according to the present invention, we
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strongly inhibit the secretion of gonadotropins by the gland
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hands, and which inhibit the release of steroids by the gonads, can be applied in male mammals as these LRF antagonists are found to be effective at sufficiently low dosage levels, i.e. wax not exceeding approximately 3 mg per day per pound of body weight, to eliminate dermatological and other unwanted side effects. The peptide
preferably has a binding affinity of at least fifteen times that shown by the LRF. The peptide must have a value of <EMI ID = 22.1>
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on, by injection or subcutaneously. Oral administration is preferable for humans; however, injection may be preferable for use in veterinary medicine. The peptide can be combined with suitable pharmaceutically acceptable carriers or diluents, such as vegetable oils, sugars, mat starch, polysaccharides and gums. The peptide could be administered daily for seven consecutive days each month. Or, it could be administered daily at a somewhat lower rate along with appropriate androgens.
These peptides are often administered in the form of non-toxic pharmaceutically acceptable salts, such as acid addition salts or metal complexes, for example with zinc, iron, etc. (which are considered as addition salts in the scope of the present invention). Examples of these acid addition salts are the hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, maleate, acetate, citrate, benzoate, succeinate, malate, ascorbate, tartrate etc.
Examples of peptides that can be used are LRF antagonists in which there are substitutions
in positions 1 and 6, in which substituted D-Phe is present in position 2 and in which D-Trp is present in position 3. Position 1 may contain dehyJro-Pro, dehydro-D-Pro,
Thz or D-Thz. Position 6 can contain either D-Trp or (imBzl) D-His. In addition, certain substitutions can possibly be made in positions 7 and 10. By Dehydro Pro, <EMI ID = 25.1>
can be prepared by cysteine hydrochloride treatment
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is attached to nitrogen; for example, Ac-Thz is prepared by the reaction of Thz with acetic anhydride.
More specifically, the peptides of the present invention are represented by the following formula:
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wherein R represents hydrogen or a fornyl, acetyl, acrylyl, benzoyl or allyl radical, R2 represents dehydro Pro, dehydro D-Pro, Thz or D-Thz, R3 represents pCl-D-
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other alkyl amide having 1 to 5 carbon atoms. We can use
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The peptides of the present invention can be synthesized by a solid phase technique using a chloromethylated resin for peptides in which an alkylamide
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tides in which Gly-NH2 is present. The synthesis is carried out by adding successively the amino acids in the chain
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America n [deg.] 4,072,668, incorporated in the context of the present invention for reference. The side chain protection groups, as is well known in practice, are
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coupled to the chain in formation under the resin.
Such a method makes it possible to obtain the fully protected intermediate peptidoresin. The fully protected peptide
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as is well known in practice, to give the fully protected amide intermediate. The intermediaries of the invention can be represented by the following formula:
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of the type used in practice in stepwise synthesis
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desired represents a particular acyl group, this group can be used as a protecting group. Among the classes of
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acyl-type protecting groups, such as formyl, trifluoroacetyl, phtalyl, Tos, benzoyl, benzenesulfonyl, nitrophenylsulfenyl, tritylsulfenyl, o-nitrophenoxyacetyl, acrylyl, chloroacetyl, acetyl and α-chlorobutyryl groups; (2) protective groups of the aromatic urethane type, for example
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p-chloro-bensyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, p-bromobenzyloxycarbonyl and p-methoxybenzyloxycarbonyl; (3) protective groups of the aliphatic urethane type, such as terbutyloxycarbonyl (Boc), diisopropylmethoxycarbonyl,
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(4) protecting groups of the cycloalkylated urethane type, such as cyclopentyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl and cyclohexyloxycarbonyl; (5) thiourethane-type protective groups, such as phenylthiocarbonyl; (6) groups of <EMI ID = 42.1>
<EMI ID = 43.1>
<EMI ID = 44.1>
X. <2> is a protecting group for the alcoholic hydroxyl group of Ser and is chosen from acetyl, benzoyl, tetrahydropyrannyl, tert-butyl, trityl, benzyl and 2,6-dichlorobenzyl. Benzyl is preferred.
<EMI ID = 45.1>
<EMI ID = 46.1>
nant tetrahydropyrannyl, tert-butyl, trityl, benzyl, benzyloxycarbonyl, 4-bromobenzyloxycarbonyl and 2,6dichlorobenzyl. 2,6-dichlorobenzyl is preferred.
<EMI ID = 47.1>
guanidino of Arg and is chosen from the group comprising the nitro, Tos, benzyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, and Boc radicals; or, X4 can represent hydrogen, which. means that there are no protecting groups on the nitrogen atoms of the arginine side chains.
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from 1 to 5 carbon atoms, phenethylamine, O-CH2- (resin support}, Gly-O-CH2- (resin support) and Gly-NH- (resin support).
The criteria for choosing the side chain protection groups with regard to X <2> -X 4 reside in the fact that the protection group must be stable with respect to the reagent under the reaction conditions chosen to separate the group of α-amino protection at each stage of the synthesis, that the protection group must not be eliminated under coupling conditions and that the protection group can be removed at the end of the synthesis of the amino acid sequence desired under reaction conditions which do not alter the peptide chain.
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many functional groups of the polystyrene resin support
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of resin], an amide bond connects Gly to the BEA resin or to a paramethylated BHA resin.
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lyle, benzoyl or allyl, it can be used as a group of
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in which case it can be added to proline or Thz before being coupled to the peptide cat. Acetyl is abbreviated as Ac, and acrylyl is abbreviated as Acr. Alternatively, a reaction can be carried out with the peptide on the resin, for example by reaction with acetic acid in the presence of dicyclohexyl carbodiimide
(DCC) or with acetic anhydride.
The separation of the protection of the peptides as well as the cleavage of the peptide from the benzhydrylamine resin takes place
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anisole to peptide before treatment with HF. After the separation of the HF, under vacuum, the peptide whose protection has been separated is treated, it is cleaved with ether. It is decanted, it is taken up in dilute acetic acid and lyophilized. The peptide is purified by ion exchange chromatography on a CMC column, followed by partition chromatography using the following elution system:
n-butanol and acetic acid O, 1N (volume ratio: 1/1), on a column packed with Sephadex G 25.
The peptides of the invention are considered to be effective at rates of 200 micrograms per kg of body weight. It is preferable to use dosage levels of about
0.1 to about 3 mg per kg body weight when antagonists are administered to inhibit spermatogenesis in male mammals on a regular basis; however, it is unclear whether 'body weight is the real criteria, so lower amounts may prove to be effective.
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annuities characteristic of the invention but do not in any way constitute a limitation thereto.
Example 1
By way of example, a solid phase synthesis characterized
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LRF is given below. This peptide has the following formula:
Ac-dehydro Pro-pCl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-N MeLeu-ArgPro-Gly-NH2.
We use a resin of BHA, and Gly protected by Boc
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using a three-fold excess of Boc derivative and DCC as an activating reagent. The glycine residue binds to the re-
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After the coupling of each amino acid residue, the washing, unblocking and coupling of the following amino acid residue are carried out according to the scale below using an automated machine and starting with approximately 5 g of resin:
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After step 13, a portion is taken for a ninhydrin test: if the test is negative, we return to step 1 for the coupling of the next amino acid; if the test is positive or slightly positive, we return and repeat steps 9 to 13.
The aforementioned scale is used for the coupling of each of the amino acids of the peptide of the invention after having atta-
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for each of the amino acids remaining throughout the synthesis. The Arg side chain is protected with Tos. Bzl is used as the side chain protecting group for the hydroxyl group of Ser, and 2,6-dichlorobenzyl is used as the side chain protecting group for the hydroxyl group of Tyr.
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CH2C12, are coupled using DMF.
The cleavage of the peptide from the resin and the complete separation of the protection of the side chains is very
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before HF treatment. After separation of the HF under vacuum, the resin is extracted with acetic acid at 50% by volume, and the:
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are lyophilized, to give a crude peptide powder.
The purification of the peptide is then carried out by means of ion exchange chromatography on CMC (Whatman CM
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water 50/50) followed by partition chromatography in a gel filtration filter using the following elution system:
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The peptide is tested in vitro using dissociated pituitary or pituitary rat cells maintained in culture for 4 days before the test. The LH levels obtained in response to the application of peptides are tested by a radioimmunoessay technique specific for rat LH. Flat cell containers receive only LRF (3 nanomolar Experimental flat vessels receive a 3 nanomolar measurement in LRF plus a measurement with a concentration of test peptide ranging from 1 to 100 nanomolar. The amount of LE secreted in the samples treated only with LRF is compared to that secreted by the samples treated with peptide plus LRF so as to determine the ratio at which an <EMI ID = 65.1>
form of the molar concentration ratio of the test peptide
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released by nanomolar LRF 3 up to 50% of the re-value
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effective in the process of the present invention, it must have
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about 25 times that of the LRF.
The peptide is used at an effective level to reduce the weight of the testes and seminal vesicles and also to inhibit spermatogenesis after 14 days of administration to male rats. Testosterone (T) Levels in Rats
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control pain one week after stopping treatment for 14 days. The weights of the prostates of the male rats are found after 2-3 weeks and the weights of the seminal vesicles are found after 4-5 weeks. It is best to use levels
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day, which can be administered without adverse side effects. It is possible to use lower levels of antagonists to obtain similar results.
Example 2
Male rats (about 320 g each) are each treated with 1 mg of the peptide synthesized in Example 1, once a day, for 14 days by injection in 0.2 ml of mat oil. All rats show decreased weight of <EMI ID = 72.1>
treated male ailments are reduced compared to control animals.
A histological examination of the testes after the 14-day treatment reveals doped spermatogenesis for a period of up to several weeks after the cessation of daily injections. Rats are unable to induce fertilization after treatment for approximately 7 consecutive days.
Complete recovery of the weight of the testes and seminal vesicles as well as spermatogenesis lastly
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for 14 days. After about 4 weeks, the weight of the testes is approximately 80% of that of the control group, and about 7 days later, good spermatogenesis appears in the majority of the tubes.
Peptide tested proves to be interesting for preventing reproduction in male mammals without causing effects
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administration to men on a regular basis, it would be better to administer it together with appropriate androgens,
Example 3
Other LRF antagonists corresponding to the general formula:
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are summarized as follows:
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than the peptide of Example 1, and it is found that they have the value of ICR & �# given below.
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These peptides are then tested according to the method of Example 2, and all the five peptides prove to be interesting.
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production when administered to male mammals at a similar dosage for similar periods of time.
It should be understood that the present invention is in no way limited to the above embodiments and that many modifications can be made without departing from the scope of this patent. For example, substitution and modifications in the other members of the LRF chain can be carried out in accordance with well known developments which have made it possible to obtain analogues of LRF which are interesting and known. In addition, other substitutions that do not destroy <EMI ID = 80.1>
in the peptides used according to the invention, and equivalent acyl groups may be substituted for the groups included in
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CLAIMS
1. Method for inhibiting spermatogenesis in male mammals and thereby preventing reproduction, characterized in that it consists in administering an effective amount of a peptide or a non-toxic salt thereof to a mammal
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3 mg per kg of body weight, this peptide being an antagonist
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