Farmaceutisch preparaat en werkwijze ter
bereiding daarvan.
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een farmaceutisch preparaat, dat anti-hemofiliefactor (factor VIII)
<EMI ID=1.1>
daarvan.
Hemofilie A is een ziekte, waarbij stollingsfactor VIII voorkomt als een genetische variant, die onwerkzaam is. Bij de ziekte van Von Willebrand komt stollingsfactor VIII in lage concentratie in het bloedplasma voor. Beide ziekten worden gekenmerkt door een abnormale bloedingsneiging. De bloedingen kunnen levensbedreigend zijn, maar ook tot ernstige invaliditeit leiden, onder andere door hemartrose en spieratrofie.
De therapie bestaat uit het toedienen van factor VIII.
Dit kan alleen langs intraveneuze weg geschieden, omdat factor VIII zeer gevoelig is voor proteolytische enzymen, waardoor
het oraal toedienen van factor VIII niet resulteert in de opname daarvan in het bloed. De toediening van factor VIII wordt toegepast als er bloedingen zijn en profylaktisch voor operaties of voor situaties, waarbij een verhoogd risico voor bloeding bestaat
(sportbeoefening bijvoorbeeld). Het nadeel van deze toedieningswijze is de noodzakelijke venapunctie. Ofschoon er patiënten zijn die zichzelf deze injecties" toedienen, zijn de eisen van steriliteit en techniek van de venapunctie van dien aard, dat meestal hulp in een medisch centrum nodig is. Verder is de noodzakelijke venapunctie soms moeilijk, zoals bij dikke patiënten
of bij patiënten waarbij venen door herhaald prikken gecicatriceerd zijn. Een orale behandeling van hemofilie is daarom dringend gewenst.
Gevonden werd nu, dat farmaceutische preparaten, die antihemofiliefactor (factor VIII) als werkzame stof bevatten, bij orale toediening effectief zijn, wanneer de anti-hemofiliefactor is opgenomen in uit fosfolipiden gevormde liposomen.
Onder uit fosfolipiden gevormde liposomen worden structuren verstaan, die opgebouwd zijn uit een aantal concentrische schillen (te vergelijken met een ui ), waarvan de totale diameter
500 - 1000 nm kan bedragen. Deze liposomen worden gevormd, wanneer men fosfolipiden in water suspendeert. Indien de liposomen worden gevormd, dat wil zeggen de fosfatiden worden gesuspendeerd in een oplossing van anti-hemofiliefactor (factor VIII), wordt
<EMI ID=2.1>
dat de stof op deze wijze als het ware verpakt wordt en in het maagdarmkanaal in hoge mate beschermd wordt, zodat de stof niet kan worden afgebroken, voordat deze in de bloedbaan kan worden opgenomen.
Het gebruikte dragermateriaal, dat wil zeggen de lipiden, komen normaal in het lichaam voor en vormen tevens een normaal bestanddeel van onze voeding (met name ei, vis en vlees) zodat zij als niet-toxisch beschouwd kunnen worden.
Het fosfolipide, waaruit de liposomen volgens de uitvinding zijn gevormd, is bij voorkeur ei-lecithine, hoewel hiervoor in principe alle lecithines (bijvoorbeeld soja-lecithine) in aanmerking komen.
Ei-lecithine is echter gemakkelijk verkrijgbaar en bevat geen toxische stoffen.
Bij voorkeur zijn de liposomen uit een mengsel van fosfolipiden met een netto geladen lipide gevormd. Dit lipide brengt een lading aan in de dubbellaag van het fosfolipide, waardoor de afstand tussen de dubbell�gen wordt vergroot. Hierdoor wordt factor VIII gemakkelijker tussen de schillen van het fosfoli-pide opgenomen. Als voorbeelden van dergelijke geladen lipiden kunnen vetalcoholfosfaten, zoals dicetyl-fosfaat, maar ook fosfatidezuren en vrije vetzuren met lange keten, zoals oliezuur, worden genoemd. Bij voorkeur is het geladen lipide een fosfatidezuur, in het bijzonder een natuurlijk voorkomend fosfatidezuur. Laatstgenoemde natuurlijke fosfatidezuren zijn in het algemeen mengsels, waarbij de vetzuurresten afgeleid zijn
<EMI ID=3.1> De uitvinding betreft ook een werkwijze ter bereiding van
een farmaceutisch preparaat, dat anti-hemofiliefactor (factor VIII) als werkzame stof bevat. Deze werkwijze heeft als kenmerk, dat
men fosfolipide-liposomen vormt bij aanwezigheid van f actor VIII. In het algemeen wordt deze werkwijze uitgevoerd door een fosfolipide te suspenderen in een waterige oplossing van factor VIII. Dit suspenderen kan geschieden met behulp van ultrageluid, doch ook heel gemakkelijk door het fosfolipide op te lossen in een vluchtig oplosmiddel zoals ethanol, de oplossing in een kolf te brengen en daarin in te dampen zodanig, dat het fosfolipide in
een dunne laag op de binnenwand van de kolf wordt afgezet. Wanneer men daarna een waterige oplossing van factor VIII toevoegt
en het mengsel, na toevoeging van enige glaskraaltjes krachtig zwenkt, ontstaat een melkachtige suspensie van liposomen.
Deze kunnen worden afgecentrifugeerd en desgewenst weer worden gesuspendeerd in water of een fysiologische zoutoplossing. De liposoom-suspensie kan verder worden verwerkt tot een oraal
in te ne.men drank, die bijvoorbeeld smaakcorrigentia kan bevatten. Ook kan men de liposoomsuspensie in geconcentreerde of verdunde vorm in zachte gelatinecapsules brengen. Eventueel zijn de preparaten zodanig samengesteld dat zij eerst in de darm en niet
in de maag uiteenvallen.
Plasmafracties, die rijk zijn aan factor VIII kunnen op verschillende wijze worden bereid. In dit verband kan worden
<EMI ID=4.1>
<EMI ID=5.1>
verkregen door plasma enige tijd bij lage temperatuur te bewaren, waarbij een neerslag ontstaat, dat kan worden afgecentrifugeerd. Dit neerslag wordt cryoprecipitaat genoemd en is uitstekend geschikt voor toepassing in de onderhavige preparaten, Cryopre- cipitaat bevat ook fibrinogeen. Verrassenderwijze is gebleken, dat uit cryoprecipitaat een groter percentage factor VIII in de liposomen wordt opgenomen, dan van fibrinogeen. De f armaceutische preparaten volgens de uitvinding bevatten daarom minder fibrinogeen per gewichtseenheid factor VIII dan het cryoprecipitaat waarvan uitgegaan is.
Bij de werkwijze volgens de uitvinding gebruikt men bij voorkeur eilecithine als fosfolipide, in het bijzonder eilecithine gemengd met een geladen lipide, waarvoor bij voorkeur een fosfatidezuur, in het bijzonder een natuurlijk fosfatidezuur wordt gekozen.
De voordelen van de preparaten volgens de uitvinding zijn evident. De bereidingswijze is eenvoudig. Bovendien behoeft
deze niet strikt steriel te geschieden. Het is echter gewenst ervoor te zorgen, dat het preparaat niet kan bederven door aantasting door micro-organismen.
Hoewel slechts ongeveer 30% van de in de preparaten aanwezige hoeveelheid factor VIII na orale toediening in de bloedbaan wordt opgenomen, bezitten de preparaten volgens de uitvinding het voordeel, dat de afgifte van factor VIII aan het bloed vertraagd plaatsvindt. Bij intraveneuze toediening, waarbij factor VIII uiteraard voor 100% in de bloedbaan terechtkomt, neemt
men een halfwaardetijd van 14 uur waar. Door het effect van de vertraagde afgifte is de bloedspiegel gedurende de tweede dag na toediening van de onderhavige preparaten daarom gelijk aan of zelfs groter dan bij intraveneuze toediening.
De uitvinding wordt toegelicht aan de hand van het volgende voorbeeld.
Voorbeeld.
<EMI ID=6.1>
Aan twee rondbodemkolven van 250 ml wordt aan elk 50 ml
van een eilecithine-oplossing (Koch-Light; 1 g/10 ml ethanol) en
10 ml van een fosfatidezuur-oplossing (Koch-Light; 20 mg/ml chloroform) toegevoegd.
De oplosmiddelen worden bij ongeveer 45[deg.]C met behulp van een op een waterstraalpomp aangesloten rotatieverdamper afge- dampt. Op deze wijze blijven de lipiden achter als een dunne laag op de binnenwand van de kolf. Aan één der kolven wordt
100 ml van een isotone (0,9 gew.% NaCl) oplossing van een factor VIII verrijkt preparaat (AHF-Konzentrat SRK (human); Zentral Laboratorium Blutspendedienst SRK Switzerland; 10 ml gelyofiliseerd bevat ongeveer 230 E factor VIII) toegevoegd, alsmede enige glaskraaltjes. Het mengsel wordt met de hand krachtig rondgezwenkt totdat de lipidenfilm van de wand is verdwenen (5 a 10 minuten). De ontstane melkachtige suspensie wordt 20 minuten gecentrifugeerd bij 27.000 x g waardoor de liposomen gaan drijven. De onderstaande vloeistof wordt toegevoegd aan de andere kolf en wederom geschud in aanwezigheid van glaskraaltjes, totdat alle liposomen zijn gevormd. Na afcentrifugeren kan in ' de onderstaande vloeistof de hoeveelheid niet ingevangen factor VIII worden bepaald.
Beide liposoomfracties van de centrifugaties worden gemengd, waarna ze, eventueel na verdunning met fysiologische zoutoplossing en/of op smaak brengen, oraal kunnen worden toegediend.
De hoeveelheid ingevangen factor VIII bedroeg op deze wijze ongeveer 80%. De hoeveelheid ingevangen fibrinogeen bedroeg slechts 25%, zodat hier een verrijking aan factor VIII heeft plaatsgevonden.
Factor VIII werd bepaald met de "one stage" methode van Veldkamp (Thrombos. Diathes haemorrh. 12, 279 (1968)).
Resultaten
Een typisch experiment is geillustreerd in bijgaande figuur.
Op tijdstip 0 (patiënt nuchter) werden 800 eenheden factor VIII in de vorm van het op bovenstaande wijze verkregen preparaat per os toegediend. Daarop stijgt het gehalte aan factor VIII
in het plasma tot ongeveer 10% van de normale waarde en blijft
<EMI ID=7.1>
moet opgemerkt worden dat men bij een factor VIII gehalte van
<EMI ID=8.1>
<EMI ID=9.1>
De lage dosering van het voorbeeld geeft dus al gedurende twee etmalen een effectieve profylaxe.
In de fig. geeft de lijn A aan, hoe het concentratieverloop geweest zou zijn, indien dezelfde hoeveelheid factor VIII intraveneus zou zijn toegediend. Lijn B geeft het gevonden verloop weer, bij toediening per os. Het verdient vermelding,
dat de proefpersoon voor de toediening leed aan hematurie en dat deze afwijking van 2 tot 60 uur na de toediening af wezig was om daarna weer terug te komen. Toediening van factor VIII afzon-derlijk en van fosfolipide afzonderlijk was geheel zonder effect op de factor VIII spiegel.
Pharmaceutical preparation and method ter
preparation thereof.
The present invention relates to a pharmaceutical composition which contains anti-haemophilia factor (factor VIII)
<EMI ID = 1.1>
thereof.
Hemophilia A is a disease in which clotting factor VIII occurs as a genetic variant that is ineffective. In von Willebrand's disease, clotting factor VIII occurs in the blood plasma in low concentration. Both diseases are characterized by an abnormal bleeding tendency. The bleeding can be life-threatening, but can also lead to serious disability, including hemarthrosis and muscle atrophy.
The therapy consists of the administration of factor VIII.
This can only be done intravenously, since factor VIII is very sensitive to proteolytic enzymes, causing
the oral administration of factor VIII does not result in its uptake into the blood. The administration of factor VIII is used when there is bleeding and prophylactic for surgery or for situations where there is an increased risk of bleeding
(sports, for example). The disadvantage of this mode of administration is the necessary venipuncture. Although there are patients who self-administer these injections, the requirements of sterility and technique of venipuncture are such that help is usually needed in a medical center. Furthermore, the necessary venipuncture is sometimes difficult, such as in fat patients
or in patients in whom veins are cicatricized by repeated piercing. An oral treatment of hemophilia is therefore urgently needed.
It has now been found that pharmaceutical compositions containing antihemophilic factor (factor VIII) as active ingredient are effective when administered orally when the anti-hemophilic factor is incorporated into liposomes formed from phospholipids.
Liposomes formed from phospholipids are structures consisting of a number of concentric shells (comparable to an onion), the total diameter of which
500-1000 nm. These liposomes are formed when phospholipids are suspended in water. If the liposomes are formed, i.e. the phosphatides are suspended in a solution of anti-hemophilia factor (factor VIII),
<EMI ID = 2.1>
that in this way the substance is packaged as it were and is highly protected in the gastrointestinal tract, so that the substance cannot be broken down before it can be absorbed into the bloodstream.
The carrier material used, ie the lipids, normally occur in the body and are also a normal part of our diet (especially egg, fish and meat) so that they can be considered non-toxic.
The phospholipid from which the liposomes according to the invention are formed is preferably egg lecithin, although in principle all lecithins (for example soy lecithin) are suitable for this.
However, egg lecithin is readily available and does not contain any toxic substances.
Preferably, the liposomes are formed from a mixture of phospholipids with a net charged lipid. This lipid charges the bilayer of the phospholipid, increasing the spacing between the double layer. As a result, factor VIII is more easily incorporated between the shells of the phospholipid. As examples of such charged lipids, fatty alcohol phosphates such as dicetyl phosphate, but also phosphatidic acids and long chain free fatty acids such as oleic acid can be mentioned. Preferably the charged lipid is a phosphatidic acid, in particular a naturally occurring phosphatidic acid. The latter natural phosphatidic acids are generally mixtures in which the fatty acid residues are derived
<EMI ID = 3.1> The invention also relates to a process for the preparation of
a pharmaceutical composition containing anti-haemophilia factor (factor VIII) as the active substance. This method is characterized in that
phospholipid liposomes are formed in the presence of factor VIII. Generally, this process is performed by suspending a phospholipid in an aqueous factor VIII solution. This suspension can be done by ultrasound, but also very easily by dissolving the phospholipid in a volatile solvent such as ethanol, placing the solution in a flask and evaporating in such a way that the phospholipid is
a thin layer is deposited on the inner wall of the flask. When an aqueous solution of factor VIII is then added
and the mixture, after adding a few glass beads, swings vigorously, a milky suspension of liposomes is formed.
These can be centrifuged off and, if desired, resuspended in water or physiological saline. The liposome suspension can be further processed into an oral
a drink to be taken, which may contain, for example, flavor correction agents. The liposome suspension can also be placed in soft or gelatin capsules in concentrated or diluted form. Optionally, the preparations are composed in such a way that they first enter the intestine and not
break up in the stomach.
Plasma fractions rich in factor VIII can be prepared in various ways. In this regard can be
<EMI ID = 4.1>
<EMI ID = 5.1>
obtained by storing plasma at low temperature for some time, producing a precipitate which can be centrifuged off. This precipitate is called cryoprecipitate and is excellent for use in the present compositions. Cryoprecipitate also contains fibrinogen. Surprisingly, it has been found that cryoprecipitate contains a greater percentage of factor VIII in the liposomes than from fibrinogen. The pharmaceutical compositions of the invention therefore contain less fibrinogen per unit weight of factor VIII than the starting cryoprecipitate.
The method according to the invention preferably uses egg lecithin as a phospholipid, in particular egg lecithin mixed with a charged lipid, for which a phosphatidic acid, in particular a natural phosphatidic acid, is preferably chosen.
The advantages of the preparations according to the invention are evident. The preparation method is simple. In addition, need
it should not be strictly sterile. However, it is desirable to ensure that the composition cannot spoil due to attack by microorganisms.
Although only about 30% of the amount of factor VIII present in the compositions is absorbed into the bloodstream after oral administration, the compositions of the invention have the advantage that the release of factor VIII to the blood is delayed. When administered intravenously, where factor VIII naturally enters the bloodstream 100%
a half-life of 14 hours is observed. Therefore, due to the effect of the delayed release, the blood level during the second day after administration of the present compositions is equal to or even greater than with intravenous administration.
The invention is illustrated by the following example.
Example.
<EMI ID = 6.1>
Two 250 ml round bottom flasks add 50 ml to each
of an egg lecithin solution (Koch-Light; 1 g / 10 ml ethanol) and
10 ml of a phosphatidic acid solution (Koch-Light; 20 mg / ml chloroform) was added.
The solvents are evaporated at about 45 [deg.] C using a rotary evaporator connected to a water jet pump. In this way, the lipids remain as a thin layer on the inner wall of the flask. One of the flasks is used
100 ml of an isotonic (0.9 wt.% NaCl) solution of a factor VIII enriched preparation (AHF-Konzentrat SRK (human); Zentral Laboratory Blutspendedienst SRK Switzerland; 10 ml lyophilized contains approximately 230 U factor VIII) and some glass beads. The mixture is swirled vigorously by hand until the lipid film has disappeared from the wall (5 to 10 minutes). The resulting milky suspension is centrifuged at 27,000 x g for 20 minutes causing the liposomes to float. The liquid below is added to the other flask and shaken again in the presence of glass beads, until all liposomes are formed. After centrifugation, the amount of factor VIII untrapped can be determined in the liquid below.
Both liposome fractions from the centrifugations are mixed, after which they can be administered orally, optionally after dilution with physiological saline and / or flavoring.
The amount of factor VIII captured in this manner was about 80%. The amount of fibrinogen captured was only 25%, so that factor VIII enrichment took place here.
Factor VIII was determined by the "one stage" method of Veldkamp (Thrombos. Diathes haemorrh. 12, 279 (1968)).
Results
A typical experiment is illustrated in the accompanying figure.
At time 0 (patient fasted), 800 units of factor VIII were administered per os in the form of the preparation obtained above. Subsequently, the factor VIII content increases
in the plasma to about 10% of the normal value and remains
<EMI ID = 7.1>
it should be noted that at a factor VIII content of
<EMI ID = 8.1>
<EMI ID = 9.1>
The low dose of the example thus already provides effective prophylaxis for two days.
In the figure, line A indicates how the concentration course would have been if the same amount of factor VIII had been administered intravenously. Line B shows the course found, when administered per os. It is worth mentioning,
that the subject had haematuria prior to administration and that this deviation was absent from 2 to 60 hours after administration and then returned. Administration of factor VIII separately and of phospholipid separately was completely without effect on the factor VIII level.