BE877591A - Appareil et procede pour determiner par luminescence la concentration d'une substance a analyser dans un echantillon - Google Patents

Description

  Appareil et procédé pour déterminer par luminescence la concentration d'une substance à analyser dans un échantillon.

  
Il est devenu habituel., par exemple en recherche

  
médicale et biomédicale, de même que pour les examens de routine

  
et le diagnostic, de mesurer la concentration de différentes substances, dites ci-après substances à analyser, dans un échantillon en faisant-participer ces substances à analyser à une. réaction luminescente avec d'autres substances déterminées

  
au préalable et choisies de façon que le rendement luminescent

  
de la réaction présente une relation univoque avec la concentration en substance à analyser. Des mesures diverses ont

  
été exécutées plus spécifiquement sur des substances contenues

  
dans les liquides de l'organisme, par exemple sur des hormones,

  
des médicaments et des constituants du sang. 

  
Des publications dans lesquelles ces mesures ont

  
 <EMI ID=1.1> 

  
Proceedings of the First International Symposium on Analytical Applications of Bioluminescence and Chemiluminescence Bruxelles 6 - 8 septembre 1978.

  
Les procédés connus ne se sont pas toujours révélés convenir pour établir un diagnostic par des examens

  
de laboratoire de routine et la présente invention offre la ' possibilité de satisfaire adéquatement aux nécessités de

  
tels examens.

  
Suivant un premier aspect de l'invention, un appareil pour déterminer par luminescence La quantité ou la concentration d'une substance à analyser dans un échantillon comprend un corps comprenant plusieurs cellules dont chacune

  
 <EMI ID=2.1> 

  
nêtre par laquelle de la lumière peut quitter la cellule; une chambre d'examen propre à recevoir au moins une partie du corps contenant une cellule, un photodétecteur conçu et agencé pour recevoir la lumière émise par une cellule se trouvant à un poste d'examen de la chambre d'examen et pour donner un signal de sortie qui dépend de la lumière émise;

  
 <EMI ID=3.1> 

  
successivement au poste d'examen.

  
Suivant un autre aspect, l'invention a pour objet. un procédé pour déterminer la quantité ou la concentration d'une substance à analyser dans' un échantillon, suivant lequel on exécute une réaction luminescente dont l'émission lumineuse dépend de cette quantité ou concentration et on utilise cette émission lumineuse pour déterminer cette quantité ou concentration, la substance à analyser.de l'échantillon et une quantité connue de la même substance à analyser mar-quéé à l'aide d.'une substance indicatrice étant mises à réagir avec un réactif spécifique pour la formation d'un produit de.

   réaction, la quantité ou concentration de la substance à analyser marquée qui a réagi ou n'a pas réagi, la substance indicatrice étant déterminable et donc aussi la substance à analyser marquée, étant déterminée par mesure de l'émission lumineuse d'une réaction luminescente à laquelle la substance indicatrice participe..

  
Par "réactif spécifique", il convient d'entendre 

  
un réactif choisi de manière à réagir avec la substance à  analyser particulière sous examen. Par exemple, la substance

  
à analyser peut être un antigène, auquel cas le réactif spécifique serait un anticorps et réciproquement.

  
La réaction luminescente Peut être une réaction chimiluminescente ou une réaction bioluminescente.

  
L'invention est décrite plus en détail ci-après

  
à titre d'exemple avec référence aux dessins annexés, dans lesquels:
Fig. 1 est une vue en plan d'un appareil conforme à l'invention, une partie supérieure de l'appareil ayant été omise; Fig. 2 est une vue en élévation latérale des parties  de l'appareil représentées à la Fig. 1; Fig. 3 est une vue en coupe partielle suivant la ligne 3-3 de la Fig. 1 et <EMI ID=4.1> 

  
L'.appareil peut être utilisé pour déterminer.la quantité ou la concentration d'une substance à analyser dans un échantillon liquide. La substance à analyser peut être un antigène, par exemple une protéine, ou peut être un nucléotide, par exemple le nicotinamide adénine dinucléotide  <EMI ID=5.1> 

  
une de ces substances peut être formée. Lorsque la substance à analyser est un antigène, l'échantillon et une quantité connue d'antigène.marqué sont mis à réagir avec un anticorps pour l'antigène et le produit de cette réaction est séparé, par exemple par précipitation, de l'antigène qui n'a pas réagi. L'antigène marqué est préparé par fixation d'une mola cule pouvant participer à une réaction luminescente sur

  
un antigène qui est identique à la substance à analyser.

  
La molécule indicatrice peut être un réactif luminescent,

  
par exemple le luminol, mais est de préférence une enzyme capable de catalyser une réaction luminescente. Un exemple 'd'une telle enzyme est la peroxidase.

  
La solution subsistant après la séparation du produit de réaction de l'antigène sur l'anticorps contient

  
tant de l'antigène marqué que de la substance à analyser, dans des proportions qui dépendent de la quantité de substance à analyser contenue dans l'échantillon original. Les solutions obtenues à partir d'échantillons originaux différents sont introduites dans les cellules respectives de l'appareil illustré aux dessins.

  
L'appareil comprend un corps ayant la forme d'un bloc 10 fait d'aluminium ou d'une autre matière bonne conductrice de la chaleur. Ce bloc comporte un certain nombre de cellules pour recevoir les différentes solutions à examiner. Dans l'exemple particulier illustré, chaque cellule est définie par un récipient en matière plastique transparente disponible dans le commerce et généralement appelé cuvette. Les cuvettes. sont insérées dans des logements formant une rangée adjacente à un bord latéral du bloc 10 et peuvent en être retirées aisément pour le nettoyage, la mise en réserve ou l'évacuation avec les déchets, de même que pour le rempla-:! cement par des cuvettes fraîches. Au voisinage de la paroi 

  
de chaque cuvette, , le bloc comporte un orifice 12 par lequel  la lumière peut quitter la cellule.

  
L'appareil comprend en outre une chambre d'examen 13 qui peut recevoir en entier le bloc 10 dans lequel sont insérées les cuvettes 11. A une extrémité, la chambre 13 comprend une ouverture 14 par laquelle le bloc 10 peut être inséré dans la chambre. A un poste d'examen, la chambre comporte, dans une paroi latérale, une fenêtre ou ouverture 15 par laquelle la lumière émise par la cellule peut quitter la chambre et entrer dans un photodétecteur monté en position adjacente à cette paroi latérale de la chambre par-dessus l'orifice 15.. Ce photodétecteur est de préférence un tube photomultiplicateur 16. Au voisinage de l'ouverture 14, la chambre comprend des joints étanches à la lumière pour empêcher la lumière extérieure d'entrer dans la chambre entre le bloc
10 et les parois de la chambré.

   Un piège à lumière est également réalisé entre l'orifice 15 et les joints à l'ouverture 14. La chambre est de manière générale étanche à la lumière, sauf

  
à l'orifice 15. 

  
Un volet à ressort 17 est normalement prévu pour

  
 <EMI ID=6.1> 

  
l'orifice 15 lorsque le bloc 10 ne se trouve pas dans

  
la chambre. Ce volet empêche la lumière ambiante d'atteindre le tube photomultiplicateur. Lorsque le bloc 10 est inséré dans la chambre, le volet 17 est repoussé en position inopérante, comme illustré à la Fig. 2.

  
Un dispositif de transport permet d'avancer le bloc
10 dans la chambre 13 pas à pas pour présenter les cuvettes 11 successivement au poste d'examen. Le dispositif dé transport comprend un moteur électrique 18 qui entraîne un galet 19 garni de caoutchouc par l'intermédiaire d'une transmission à poulie   <EMI ID=7.1> 

  
support 21 qui peut pivoter autour d'un axe vertical 22 et qui est sollicité par un ressort 23 de manière à pivoter dans la direction où le galet 19 est pressé contre une surface latérale du bloc 10 lorsque celui-ci se trouve dans la chambre 13. La came 24 sert d'arrêt empêchant un frottement exagéré du galet 19 sur le bloc 10 lorsque ce dernier est introduit dans la chambre ou en est retiré.

  
En un endroit déterminé au préalable par rapport à chaque cuvette 11, le bloc 10 comporte un alésage transversal correspondant 26. Pour détecter l'arrivée de.chaque

  
 <EMI ID=8.1> 

  
des côtés du bloc 10, une source de lumière infrarouge 27 et,de l'autre côté du bloc, un phototransistor 28. Lorsqu'une

  
 <EMI ID=9.1> 

  
tor sont alignés avec l'un des alésages correspondants 26. Le moteur 18 est un servomoteur à courant continu permettant de positionner le bloc 10 avec précision de façon qu'une cuvette occupe le poste d'examen.

  
Pour débiter un réactif luminescent dans chaque  cellule, l'appareil est muni d'un injecteur de réactif comprenant un tube 29 (Fig. 4) qui est connecté à une pipette automatique distributrice (non représentée) et qui est monté de manière à pouvoir effectuer un mouvement de va-et-vient sur un trajet vertical au-dessus du poste d'examen. Le tube est fixé au piston d'un vérin pneumatique 30 qui peut abaisser le tube de la position de repos indiquée en traits continus à la Fig. 4 à la position d'injection in-

  
 <EMI ID=10.1> 

  
du niveau des cuvettes 11 et du bloc '10. En position d'injec&#65533; 

  
tion, le tube pénètre dans une cuvette au poste d'examen jus-

  
 <EMI ID=11.1> 

  
définie.

  
Le vérin pneumatique 30 est alimenté en air par une valve à commande électrique (non illustrée) connectée

  
dans un circuit électrique du bloc de commande 32, lui-même

  
de type classique. Le phototransistor 28 et le moteur 18

  
sont également connectés dans le circuit du bloc de commande. Le bloc de commande 32 peut être réglé de manière à imposer pour le cycle une durée déterminée au préalable, qui peut s'échelonner de 1 seconde à 10 minutes. Le bloc de commande donne l'indication visuelle de la position du bloc 10 pour identifier la cellule qui se trouve en alignement avec le

  
tube photomultiplicateur.

  
Lorsque chaque solution à examiner contient un antigène marqué au moyen de peroxidase ou d'une autre enzyme appropriée, une quantité connue de la solution) de même qu'une quantité connue d'un premier réactif luminescent et éventuellement d'un diluant sont introduites dans l'une des cuvettes ,Il tandis que le bloc 10 se trouve à l'extérieur de la chambre 13. Des solutions provenant d'autres échantillons peuvent être introduites de même dans les autres cuvettes. Le bloc est alors soumis à nouveau à des vibrations pour le mélange intime des solutions et les solutions sont amenées à

  
une température déterminée au préalable par un dispositif thermorégulateur noyé dans le bloc 10. Le dispositif thermorégulateur peut comprendre, par exemple, un élément chauffant, un serpentin pour la circulation d'un fluide chaud ou froid ou un élément électrique Peltier de chauffage ou de refroidissement, tous commandés par un thermostat. Le bloc 10 est alo:rs introduit dans la chambre 13 jusqu'à ce qu'il prenne contact avec

  
le galet 19. Le bloc de commande de l'appareil est alors mis en service pour qu'il induise le fonctionnement cyclique

  
de l'appareil en vue de l'analyse de la solution contenue dans chacune des cellules successives. Lorsqu'une cellule

  
a été amenée au poste d'examen., le tube 29 est abaissé jusque dans cette cellule et un volume déterminé au préalable d'un second réactif luminescent est injecté dans la cellule à

  
une vitesse telle que le mélange des liquides dans la cellule soit rapide. De la sorte, la réaction luminescen.te peut avoir lieu et de la lumière est émise par la cellule à travers la fenêtre constituée par la paroi transparente de la cuvette et l'orifice 12. Le tube photomultiplicateur 16 donne un signal.de sortie qui dépend de la lumière émise par la cellule. Après écoulement d'un intervalle judicieusement choisi, le tube 29 est relevé jusqu'à sa position de repos et la cellule suivante est amenée au poste d'examen.

  
Lorsque le premier réactif est le peroxyde d'hydrogène, le second réactif luminescent peut être le luminol.

  
La concentration de l'enzyme dans chaque cellule dépend de la quantité de substance à analyser contenue dans l'échantillon correspondant à cette cellule. Une variation de la quantité de substance à analyser dans les différents échantillons se.traduit par une variation correspondante de la vitesse à laquelle la réaction luminescente a lieu dans les différentes cellules et ainsi par des différences correspondantes de l'émission lumineuse par les cellules.

  
Il serait possible d'utiliser l'un des réactifs luminescents comme substance indicatrice sur l'antigène, mais la Demanderesse préfère utiliser l'enzyme à cette fin. Comme la quantité d'enzyme en présence ne diminue pas à mesure que, la réaction luminescente progresse, le signal de sortie. du tube photomultiplicateur est relativement constant après une période initiale au cours de laquelle le signal de sortie augmente rapidement. De plus, la présence d'une protéine

  
sur l'enzyme n'inhibe habituellement pas l'action catalytique de l'enzyme,tandis que la présence d'une protéine sur

  
le luminol provoque un empêchement stérique ou une désactivation qui ralentit la réaction luminescente et fait donc baisser la sensibilité du mode opératoire à des variations

  
de la quantité de substance à analyser contenue dans l'échantillon initial.

  
Le signal de sortie du tube photomultiplicateur 16

  
 <EMI ID=12.1> 

  
plume ou intégré sur la durée au cours de laquelle la lumière émise par une cellule est décelée par le tube 16 ou sur une fraction de cette durée ou bien traité de toute autre manière.

  
L'appareil peut être utilisé pour déterminer la

  
 <EMI ID=13.1> 

  
L'adénosine triphosphat&#65533; réagit avec la luciférine de lampyridé en présence de luciférase de lampyridé pour produire

  
de l'adénosine monophosphate. De la lumière est émise au cours de la réaction.. 'Un volume déterminé au préalable de l'échantillon contenant de l'adénosine triphosphate et une solution de luciférase de lampyridé sont introduits dans

  
une cuvette 11 et-mélangés par agitation, la température de la solution résultante étant amenée à une valeur déterminée au préalable. La cuvette véhiculée dans le bloc 10 est alors amenée au poste d'examen où un volume déterminé au préala-

  
 <EMI ID=14.1> 

  
dans la solution par le tube 29 de façon que les solutions se mélangen.t rapidement. La lumière émise pendant la réaction

  
est détectée par le tube photomultiplicateur 16 dont le signal de sortie permet de déterminer la concentration en adénosine triphosphate de l'échantillon. Un procédé convenablement mo-difié est applicable à la détermination de la concentration d'un échantillon en un substrat à partir duquel de l'adénosine triphosphate peut se former.

  
l'appareil convient aussi pour l'analyse d'un échantillon solide, lequel est alors introduit dans une cuvette et additionné par le tube 29 d'un réactif qui provoque une réaction luminescente de l'échantillon.

  
le tube photomultiplicateur peut être remplacé

  
dans sa fonction de photodétecteur par une pellicule photographique ou un dispositif électronique photosemiconducteur.

  
 <EMI ID=15.1> 

  
l'antigène, l'anticorps ou une protéine de fixation spécifique à l'aide d'une enzyme qui est capable de catalyser une réaction luminescente. En variante, la substance indicatrice pourrait être un réactif qui participe à une réaction luminescente ou un précurseur d'un tel réactif ou encore un catalyseur pour une réaction luminescente. Par exemple, un antigène pourrait être marqué au moyen d'un aldéhyde aliphatique (comme le tétradécylaldéhyde ou le dodécylaldéhyde) par

  
 <EMI ID=16.1> 

  
avec le produit de réaction intermédiaire. L'antigène marqué pourrait être.dosé par réaction bioluminescente avec la luciférase bactérienne ou la flavine mononucléotide réductase.

  
Pour le maintien de l'uniformité de la température

  
 <EMI ID=17.1> 

  
il s'est révélé avantageux d'utiliser'l'appareil de la manière

  
 <EMI ID=18.1> 

  
de manière à prendre contact avec le galet 19 au moyen duquel il est avancé complètement et sans interruption dans la chambre d'examen 13 jusqu'à ce qu'il actionne un interrupteur de

  
 <EMI ID=19.1>  de 32 de l'appareil. Le fonctionnement de l'interrrupteur inverse le mouvement du moteur 18 qui retire le bloc 10

  
de la chambre en exécutant l'opération cyclique décrite cidessus pour l'examen successif des échantillons dans chaque cuvette 11. De la sorte, les échantillons ne sont affectés par la température ambiante qu'après avoir été examinés.

  
Aux fins de l'invention, par "lumière", il convient d'entendre tout rayonnement électromagnétique non seulement du domaine optique, mais aussi du domaine infrarouge

  
ou ultraviolet et pouvant s'étendre, en longueurs d'onde, du domaine hertzien au domaine des rayons X. 

  
 <EMI ID=20.1> 

  
1 - Appareil pour déterminer par luminescence la quantité ou la concentration d'une substance à analyser dans

  
un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend un corps

  
(10) comprenant plusieurs cellules (11) dont chacune est

  
propre à contenir un échantillon et comporte une fenêtre (12) par laquelle de la lumière peut quitter.la cellule (11), une chambre d'examen (13) propre à recevoir le corps (10) contenant au moins une cellule (11); un photodétecteur (16)

  
conçu et agencé pour recevoir la lumière émise par une cel-
-lule (11) se trouvant à un poste d'examen dans la chambre d'examen (13) et pour donner un signal de sortie qui dépend de la lumière émise, outre un dispositif de transport-(18,

  
19, 20) propre à amener les cellules (11) successivement

  
au poste d'examen.

Claims (1)

1. 2 - Appareil suivant la revendication 1, caractérisé en ce que chaque cellule (11) comprend une partie de paroi transparente qui forme la fenêtre (12) de la cellule.

   3 - Appareil suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que chaque cellule (11) est définie par un élément qui peut être retiré du corps (10) pour le nettoyage, la mise en réserve ou l'évacuation avec les déchets. <EMI ID=21.1>

   cations précédentes; caractérisé en ce que le dispositif

   de transport comprend un moteur électrique (18) entraînant

   le bloc (10) au moyen d'une transmission à courroie et poulie (20) et d'un galet à surf ace-de caoutchouc (19) qui vient au contact du corps (10).

   5 - Appareil suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la température du contenu des cellules dans le corps (10) peut être réglée au moyen d'un dispositif thermorégulateur noyé dans le corps. 6 - Appareil suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif étanche à la lumière empêchant la lumière ambiante d'entrer dans la chambre (13) par une ouverture ou un orifice quelconque de celle-ci.

   <EMI ID=22.1>

   risé en ce que le dispositif étanche à la lumière comprend

   <EMI ID=23.1>

   8 - Appareil suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif distributeur (29) qui distribue une quantité déterminée au préalable de réactif dans une cellule (11) se trouvant au poste d'examen.

   9 - Appareil suivant la revendication 8, caractérisé en ce que le dispositif distributeur'comprend un injecteur de réactif (29, 30) conçu et agencé pour pénétrer dans une cellule (11) et en ressortir par va-et-vient et pour débiter un réactif dans cette cellule en substance au fond de celle-ci.

   10 - Appareil suivant la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il comprend un bloc de commande réglable

   <EMI ID=24.1>

   le dispositif distributeur (29) afin d'établir un fonctionnement cyclique dont le cycle comprend l'amenée d'une cellule

   (11) au poste d'examen, l'introduction du réactif dans

   la cellule, la détection, de la lumière émise par la cellule pendant une durée déterminée au préalable et enfin le retrait de la cellule hors du poste d'examen.

   11 - Appareil suivant la revendication 10, caractérisé en ce que le bloc de commande est actionné par un dispositif photosensible (28) éclairé par une source de lumière infrarouge (27) à travers un alésage (26) du corps (10) lorsqu'une cellule (11) quelconque occupe le poste d'examen.

   12 - Appareil suivant la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que le bloc de commande est conçu pour introduire d'abord complètement et sans interruption le corps (10) dans la chambre d'examen (13 ), puis pour retirer le corps (10) hors de la chambre d'examen (13) en conformité avec le fonctionnement cyclique.

   13 - Procédé pour déterminer la quantité ou la concentration d'une substance à analyser dans un échantillon, suivant lequel on exécute une réaction luminescente dont l'émission lumineuse dépend de cette quantité ou concentration, caractérisé en ce qu'on fait réagir la substance à analyser de l'échantillon et une quantité connue de la même

   <EMI ID=25.1>

   catrice avec une quantité connue d'un réactif spécifique pour obtenir un produit de réaction et on détermine la quantité ou concentration de substance à analyser marquée qui a réagi ou n'a pas réagi, la substance indicatrice étant déterminable et donc aussi la substance à analyser marquée, en mesurant l'émission lumineuse d'une réaction luminescente à laquelle la substance indicatrice participe.

   <EMI ID=26.1>

   risé en ce qu'on sépare le produit de réaction de la substance à analyser marquée qui n'a pas réagi avant de déterminer la quantité ou concentration de substance à analyser marquée

   qui a réagi ou n'a pas réagi.

   15 - Procédé-suivant la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que la substance indicatrice est une enzyme capable de catalyser une réaction luminescente.

   16 --Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce que l'enzyme est une peroxidase. <EMI ID=27.1>

   caractérisé en ce que la substance indicatrice est un réactif ou un catalyseur pour réaction luminescente qui participe à une réaction luminescente, ou bien est un précurseur d'un tel réactif .

   18 - Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que la substance à analyser est marquée au moyen d'un aldéhyde aliphatique par réaction photochimique de

   <EMI ID=28.1>

   réaction nucléophile de la substance à analyser avec le produit de réaction intermédiaire, et la concentration ou quantité de substance à analyser est ensuite déterminée par réaction bioluminescente avec la luciférase bactérienne ou la flavine mononucléotide réductase.