Antigène superficiel de l'hépatite B <EMI ID=1.1>
antigène superficiel de l'hépatite B (HBsAg) purifié
conforme à la présente invention consiste en un liquide contenant de l'HBSAg. Le liquide en question peut être n'importe quel liquide biologique humain contenant de l'HBSAg tel.que, par exemple. le plasma,
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nasales et pharyngées, la bile, le liquide spinal,
la sueur, l'urine, le sperme, les sécrétions vaginales ou le sang menstruel. Le liquide biologique le plus facile à obtenir est le plasma. Le plasma est obtenu
de manière classique, par exemple, par plasmaphorèse. La proportion d'HB Ag dans le liquide biologique
humain peut être mesurée, de manière connue, par mise en oeuvre de n'importe quel moyen approprié, par exemple par hémagglutination passive inversée ou par fixation complémentaire.
Lorsque le liquide biologique est le plasma,
ce dernier peut être traité directement ou être refroidi et le cryoprécipité qui se forme peut être séparé
par une légère centrifugation, ou bien du CaC12 peut
être ajouté pour enlever le fibrinogène et on peut ensuite procéder à une clarification. Le liquide ainsi
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HB Ag dans le liquide ainsi obtenu est isolé par une <EMI ID=4.1>
de séparation zonale proportionnelle.
Au cours de la séparation isopycnique, le concentre partiellement purifié est mis en contact avec un milieu liquide possédant un gradient de densité ou de poids spécifique qui englobe la densité ou le poids spécifique de l'antigène spécifique à isoler.
Le milieu liquide est ensuite soumis à une ultracentrifugation pour obtenir 'ne répartition d'équilibre des constituants du sérum à travers le gradient de poids spécifique selon leurs poids spécifiques individuels. Des fractions successives du milieu sont déplacées et celles contenant l'antigène souhaité,
à savoir les fractions possédant un poids spécifique
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n[deg.] 2 049 515 et le brevet des Etats-Unis d'Amérique
n[deg.] 3 636 191. Les concentrations des solutions formant le gradient sont choisies de manière à englober la plage des poids spécifiques qui varie d'environ 1,0
à environ 1,41 g/cc. On peut utiliser le milieu liquide sous la forme d'un gradient linéaire ou d'un gradient échelonné. De préférence, on l'utilise sous la forme d'un gradient échelonné, en raison de sa capacité de fractionnement inhérente supérieure.
Au cours de la séparation zonale proportionnée, le concentré partiellement purifié est soumis à une ultracentrifugation en contact avec un milieu liquide possédant un gradient de densité ou de poids spécifique, mais en utilisant cette fois la technique zonale proportionnée, c'est-à-dire en une proportion et pendant une période telles que l'équilibre ne soit pas
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concentrations des solutions formant le gradient échelonné sont choisies de manière à englober la plage des poids spécifiques variant d'environ 1,0 à environ
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proportionnée jusqu'à ce que l'HBsAg réside dans la région de densité ou de poids spécifique de 1,13 à
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complément macroglobulinique du plasma. Si l'on effectue l'étape de séparation zonale proportionnée de telle manière que l'HB Ag souhaité atteigne sa position
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1,18 à environ 1,20 g/cc, on constate qu'une fraction macroglobulinique du plasma apparaît comme contaminant
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Les milieux liquides utilisés pour la réalisation de l'étape de séparation isopycnique peuvent être n'importe quel gradient de densité ou de poids spécifique situé dans des gammes appropriées. Les solutés de la technique antérieure pour de telles solutions englobent, par exemple, le saccharose, le bromure de potassium, le chlorure de césium, le tartrate de potassium et analogues.
L'étape de séparation en bandes isopycniques
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exemple, du type Electronucléonics-K, en remplissant le rotor stationnaire de solution saline, puis en déplaçant successivement la solution saline vers le haut avec des parties aliquotes de solution du milieu liquide de poids spécifique croissant jusqu'à la formation d'un gradient échelonné. Le plasma est introduit par le sommet du rotor déplaçant une certaine quantité de la solution à poids spécifique le plus élevé du fond. De manière typique, le volume du plasma varie d'environ 15% à environ 40% de celui du gradient échelonné. La centrifugeuse est amenée à son régime par l'intermédiaire d'un système de commande de la vitesse programmé qui évite le mélange au cours de la phase de réorientation initiale.
Lorsque l'équilibre est atteint et que le produit est en sa position appropriée de poids spécifique ou de densité, on arrête le rotor à l'aide du même système de commande de la vitesse que celui mentionné ci-dessus afin d'empêcher un mélange lors de la réorientation en la configuration d'origine. Ensuite, on sépare le gradient par en dessous et on recueille la coupe de poids spécifique approprié.
On utilise une technique similaire pour procéder à la séparation zonale proportionnée. La coupe de poids spécifique approprié provenant de la séparation zonale proportionnée est le concentré souhaité de l'antigène de l'hépatite B.
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approximativement 20 nm, l'étape de séparation en bandes isopycniques est d'une mise en oeuvre extrêmement longue, exigeant environ 18 heures de centrifugation. Il s'en suit que même en opérant 24 heures par jour, à raison de 7 jours par semaine, il n'est possible que de traiter seulement environ 4 lots de
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tivité peut évidemment être augmentée en utilisant des centrifugeuses supplémentaires. Ceci nécessite cependant un investissement important en capital,
en raison du coût élevé de chaque centrifugeuse.
On a constaté à présent que de substantiels accroissements de la productivité et d'importantes réductions des coûts de fonctionnement pouvaient être obtenus en traitant le liquide biologique humain
par du sulfate d'ammonium avant de soumettre ce liquide à des conditions de séparation isopycnique.
La quantité de sulfate d'ammonium employée doit être
au moins environ la quantité de sulfate d'ammonium
qui suffit à provoquer la précipitation de sensiblement la totalité de l'HBsAg dans le liquide, tout en évitant la précipitation de matière protéinique supplémentaire indésirable. Par suite de cette précipitation, l'HB Ag de plusieurs litres de liquide peut être soumis à
une séparation isopycnique en un lot, tandis que
sans précipitation à l'aide de sulfate d'ammonium, seule une bien plus faible quantité de liquide peut être soumise en une seule fois à l'étape de séparation isopycnique. Généralement, lorsque le liquide biologique est constitué de plasma, on utilise d'environ 200 à environ 250 g de sulfate d'ammonium par litre de plasma et, de préférence, on en utilise environ 225 g par litre de plasma. Des quantités de sulfate d' ammonium inférieures aux valeurs précitées ne préci-
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quantités supérieures de sulfate d'ammonium provoquent la précipitation de matière protéinique supplémentaire indésirable. Lorsque le liquide est le plasma et que l'on utilise une précipitation au sulfate d'ammonium,
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à une séparation isopycnique en un seul lot ; sans précipitation au sulfate d'ammonium on ne peut soumettre qu'environ 1,5 litre de plasma seulement à la séparation isopycnique.
Après l'addition du sulfate d'ammonium, on agite le liquide pour dissoudre ce sulfate d'ammonium. De préférence, on agite le liquide pendant au moins environ 3 heures à une température peu élevée variant d'environ 0 à environ 10[deg.]C, de préférence à environ
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Une agitation supplémentaire allant au-delà de 4 heures n'est pas nuisible. Le précipité qui se forme est recueilli par centrifugation et les granules sont remis en suspension dans une solution saline et dialysés vis-à-vis d'une solution saline afin d'éliminer le sulfate d'ammonium. Le concentré de liquide ainsi obtenu est ensuite soumis à une séparation en bandes isopycniques en utilisant un gradient ayant une
plage de poids spécifiques admissibles variant d' environ 1,1 à environ 1,4 g/cc.
Le produit issu de la séparation isopycnique est dialysé vis-à-vis de PBS afin d'en séparer la matière formant le gradient si elle est dialysable.
Le produit est ensuite soumis à une séparation
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dans la plage de poids spécifiques variant d'environ 1,13 à environ 1,16 g/cc. On peut utiliser n'importe quelle matière pour gradient qui engendre cette
plage de poids spécifiques et qui est dialysable et physiologiquement acceptable. De manière typique, on réalise cette séparation zonale proportionnée en l'espace d'environ 16 à environ 20 heures, de préférence, d'environ 17 à environ 18 heures, à une vitesse d'environ 30 000 tpm. A des vitesses supérieures, on a besoin de moins de temps et à des vitesses inférieures on a besoin d. plus de temps.
Selon une caractéristique préférée de la présente invention, le gradient est constitué de bromure de sodium. Contrairement aux produits utilisés jusqu'à présent, le bromure de sodium possède des avantages bien définis. La solubilité du bromure de sodium permet d'en utiliser des solutions de densité élevée pour la formation de gradients aux températures du réfrigérateur (2-6[deg.]C). Il existe des avantages économiques définis à utiliser le bromure de sodium par rapport à un sel tel que le chlorure de césium, comme aussi à ne pas avoir à résoudre le problème
que pose la toxicité vis-à-vis de l'homme d'ions
césium résiduels et d'ions césium liés à l'HB Ag.
Avec un gradient à base de bromure de sodium, n'importe quels ions liés à l'HB Ag seront, en raison de caractéristiques biophysiques, des ions sodium qui
sont parfaitement compatibles avec le système biologique humain et qui ne posent pas de problèmes de toxicité.
La solubilité supérieure du bromure de sodium
aux températures inférieures par rapport à la solubilité
du bromure de potassium, permet l'emploi de températures réduites qui entraînent une meilleure stabilité des substances biologiques. L'emploi d'un gradient échelonné plutôt que d'un gradient linéaire est préférable,
étant donné qu'il accumule les impuretés aux frontières
des échelons et permet le raitement d'un plus grand
volume de plasma en un seul gradient.
L'exemple qui suit illustre la présente
invention sans cependant limiter cette dernière en
aucune manière.
Exemple
On filtre 20 litres de plasma clarifié provenant
de donneurs d'hépatite B à travers un filtre de
293 mm contenant une membrane filtrante AP 20
'(Millipore). On ajoute 4,53 kg de sulfate d'ammonium
au filtrat que l'on agite ensuite modérément jusqu'au lendemain à 5[deg.]C. On recueille le précipité qui se
forme par centrifugation en lot à 7000 X g pendant
30 minutes en utilisant un rotor JA-10 (3 litres de contenance par lot). On met les granules ou parties obtenues après la centrifugation en suspension dans
environ 2,25 litres d'une solution saline. On dialyse ensuite la suspension concentrée vis-à-vis de 40 litres <EMI ID=18.1>
ammonium.
On remplit le rotor d'une centrifuge de
type Electronulceonics-K, de 8400 ml de tampon au phosphate. Après rotation du rotor jusqu'à 10 000 tpm afin de dégazer le système, on pompe le gradient échelonné suivant dans le fond du rotor stationnaire :
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On pompe la suspension dialysée contenant l'HB Ag, 2250 ml, par le haut du rotor stationnaire, déplaçant 2250 ml de NaBr à 40% du fond du rotor.
On provoque l'accélération du rotor jusqu'à une vitesse de 30 000 tpm et on maintient cette vitesse pendant 18 heures. Après arrêt du rotor, on recueille
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de densité ou de poids spécifique de 1,21 à 1,24 et on la dialyse vis-à-vis du tampon au phosphate.
On remplit ensuite le rotor de tampon au phosphate, dégazé de la manière décrite plus haut,
et on pompe le gradient échelonné suivant dans le fond du rotor stationnaire :
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de l'étape de séparation isopycnique au NaBr, 2 000 ml,
par le haut du rotor stationnaire, déplaçant 2000 ml de saccharose à 50% du fond du rotor. On fait ensuite tourner le rotor à la vitesse de 28 000 tpm pendant
18 heures. Après l'arrêt du rotor, on recueille
1000 ml de matière riche en HBsAg dans la région de densité ou de poids spécifique de 1,135-1,165.
REVENDICATIONS
1. Procédé d'obtention de l'HB s Ag d'un liquide
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le liquide par une quantité de sulfate d'ammonium suffisant à précipiter une fraction d'antigène
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précipitée à une séparation isopycnique et à une séparation zonale proportionnée et en ce que l'on
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poids spécifiques variant de 1,13 à environ 1,16 g/cc.
Hepatitis B surface antigen <EMI ID = 1.1>
purified hepatitis B surface antigen (HBsAg)
according to the present invention consists of a liquid containing HBsAg. The fluid in question can be any human biological fluid containing HBsAg such as, for example. plasma,
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nasal and pharyngeal, bile, spinal fluid,
sweat, urine, semen, vaginal fluids, or menstrual blood. The easiest body fluid to obtain is plasma. Plasma is obtained
conventionally, for example, by plasmaphoresis. The proportion of HB Ag in the biological fluid
human can be measured, in a known manner, by using any suitable means, for example by reverse passive hemagglutination or by complementary fixation.
When the biological fluid is plasma,
the latter can be processed directly or be cooled and the resulting cryoprecipitate can be separated
by gentle centrifugation, or CaC12 can
be added to remove fibrinogen and then clarification can proceed. The liquid as well
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HB Ag in the liquid thus obtained is isolated by an <EMI ID = 4.1>
proportional zonal separation.
During isopycnic separation, the partially purified concentrate is contacted with a liquid medium having a density or specific weight gradient which encompasses the density or specific weight of the specific antigen to be isolated.
The liquid medium is then subjected to ultracentrifugation to obtain an equilibrium distribution of the constituents of the serum through the density gradient according to their individual specific weights. Successive fractions of the medium are moved and those containing the desired antigen,
namely the fractions having a specific weight
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n [deg.] 2,049,515 and the patent of the United States of America
n [deg.] 3,636,191. The concentrations of the solutions forming the gradient are chosen so as to encompass the range of specific gravities which varies from approximately 1.0
at about 1.41 g / cc. The liquid medium can be used in the form of a linear gradient or a stepped gradient. Preferably, it is used in the form of a stepped gradient, due to its inherent superior fractionation capacity.
During the proportional zonal separation, the partially purified concentrate is subjected to ultracentrifugation in contact with a liquid medium having a density or specific gravity gradient, but this time using the proportional zonal technique, i.e. in a proportion and for a period such that the equilibrium is not
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concentrations of the solutions forming the stepped gradient are chosen to encompass the range of specific gravities varying from about 1.0 to about
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proportioned until HBsAg resides in the region of specific gravity or specific gravity of 1.13 to
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plasma macroglobulin supplement. If the proportionate zonal separation step is carried out in such a way that the desired HB Ag reaches its position
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1.18 to about 1.20 g / cc, a macroglobulin fraction of the plasma is found to appear as a contaminant
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The liquid media used for performing the isopycnic separation step can be any density or specific gravity gradient within appropriate ranges. Prior art solutes for such solutions include, for example, sucrose, potassium bromide, cesium chloride, potassium tartrate and the like.
The stage of separation into isopycnic bands
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example, of the Electronucleonics-K type, by filling the stationary rotor with saline solution, then successively moving the saline solution upwards with aliquots of solution of the liquid medium of increasing specific gravity until a step gradient is formed . Plasma is introduced through the top of the rotor displacing a certain amount of the highest specific gravity solution from the bottom. Typically, the volume of the plasma varies from about 15% to about 40% of that of the step gradient. The centrifuge is brought up to speed via a programmed speed control system that prevents mixing during the initial reorientation phase.
When equilibrium is reached and the product is in its proper position of specific gravity or density, the rotor is stopped using the same speed control system as mentioned above to prevent mixing. when reorienting to the original configuration. Then the gradient is separated from below and the section of the appropriate specific gravity is collected.
A similar technique is used to perform the proportionate zonal separation. The appropriate specific weight cut from the proportionate zonal separation is the desired concentrate of hepatitis B antigen.
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At approximately 20 nm, the isopycnic band separation step is extremely time-consuming to perform, requiring approximately 18 hours of centrifugation. It follows that even when operating 24 hours a day, 7 days a week, it is only possible to process only about 4 batches of
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tivity can obviously be increased by using additional centrifuges. This however requires a significant capital investment,
due to the high cost of each centrifuge.
It has now been found that substantial increases in productivity and significant reductions in operating costs can be achieved by processing human body fluid.
with ammonium sulfate before subjecting this liquid to isopycnic separation conditions.
The amount of ammonium sulphate used should be
at least approximately the amount of ammonium sulfate
which is sufficient to cause precipitation of substantially all of the HBsAg in the liquid, while avoiding the precipitation of unwanted additional proteinaceous material. As a result of this precipitation, the HB Ag of several liters of liquid may be subjected to
isopycnic separation into a batch, while
without precipitation with ammonium sulfate, only a much smaller amount of liquid can be subjected to the isopycnic separation step at one time. Generally, when the biological fluid consists of plasma, about 200 to about 250 g of ammonium sulfate is used per liter of plasma, and preferably about 225 g per liter of plasma is used. Amounts of ammonium sulphate lower than the aforementioned values do not
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Higher amounts of ammonium sulfate cause precipitation of unwanted additional proteinaceous material. When the liquid is plasma and ammonium sulfate precipitation is used,
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to isopycnic separation in a single batch; without ammonium sulphate precipitation, only about 1.5 liters of plasma can be subjected to isopycnic separation.
After the addition of ammonium sulfate, the liquid is stirred to dissolve this ammonium sulfate. Preferably, the liquid is stirred for at least about 3 hours at a low temperature varying from about 0 to about 10 [deg.] C, preferably at about
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Additional agitation beyond 4 hours is not harmful. The precipitate which forms is collected by centrifugation and the granules are resuspended in saline solution and dialyzed against saline solution to remove ammonium sulfate. The liquid concentrate thus obtained is then subjected to separation into isopycnic bands using a gradient having a
permissible specific weight range varying from about 1.1 to about 1.4 g / cc.
The product resulting from the isopycnic separation is dialyzed against PBS in order to separate therefrom the material forming the gradient if it is dialyzable.
The product is then subjected to separation
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in the specific weight range varying from about 1.13 to about 1.16 g / cc. Any gradient material can be used which generates this
specific weight range and which is dialyzable and physiologically acceptable. Typically, this proportionate zonal separation is accomplished over a period of about 16 to about 20 hours, preferably about 17 to about 18 hours, at a speed of about 30,000 rpm. At higher speeds less time is needed and at lower speeds d. more time.
According to a preferred characteristic of the present invention, the gradient consists of sodium bromide. Unlike the products used so far, sodium bromide has well-defined advantages. The solubility of sodium bromide allows the use of high density solutions for the formation of gradients at refrigerator temperatures (2-6 [deg.] C). There are definite economic advantages to using sodium bromide over a salt such as cesium chloride, as well as not having to solve the problem.
that poses the toxicity vis-à-vis the human ions
residual cesium and cesium ions bound to HB Ag.
With a sodium bromide gradient, any ions bound to HB Ag will, due to biophysical characteristics, be sodium ions which
are perfectly compatible with the human biological system and do not pose problems of toxicity.
The superior solubility of sodium bromide
at temperatures lower than the solubility
potassium bromide, allows the use of reduced temperatures which lead to better stability of biological substances. The use of a stepped gradient rather than a linear gradient is preferable,
since it accumulates impurities at the borders
rungs and allows the treatment of a greater
volume of plasma in a single gradient.
The following example illustrates this
invention without however limiting the latter by
no way.
Example
20 liters of clarified plasma from
of hepatitis B donors through a
293 mm containing an AP 20 filter membrane
'(Millipore). Add 4.53 kg of ammonium sulfate
the filtrate which is then stirred moderately overnight at 5 [deg.] C. We collect the precipitate which
form by batch centrifugation at 7000 X g for
30 minutes using a JA-10 rotor (3 liters capacity per batch). The granules or parts obtained after centrifugation are suspended in
about 2.25 liters of saline solution. The concentrated suspension is then dialyzed against 40 liters <EMI ID = 18.1>
ammonium.
The rotor of a centrifuge is filled with
type Electronulceonics-K, 8400 ml of phosphate buffer. After rotating the rotor up to 10,000 rpm in order to degas the system, the following stepped gradient is pumped into the base of the stationary rotor:
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The dialyzed suspension containing HB Ag, 2250 mL, was pumped through the top of the stationary rotor, displacing 2250 mL of 40% NaBr from the bottom of the rotor.
The rotor is accelerated to a speed of 30,000 rpm and this speed is maintained for 18 hours. After stopping the rotor, we collect
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density or specific gravity of 1.21 to 1.24 and dialyzed against the phosphate buffer.
The rotor is then filled with phosphate buffer, degassed in the manner described above,
and the following stepped gradient is pumped into the base of the stationary rotor:
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of the isopycnic separation step with NaBr, 2000 ml,
through the top of the stationary rotor, moving 2000 ml 50% sucrose from the bottom of the rotor. The rotor is then rotated at the speed of 28,000 rpm for
18 hours. After stopping the rotor, we collect
1000 ml of material rich in HBsAg in the region of specific gravity or specific gravity of 1.135-1.165.
CLAIMS
1. Process for obtaining HB s Ag from a liquid
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the liquid with a quantity of ammonium sulphate sufficient to precipitate a fraction of antigen
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precipitated to an isopycnic separation and a proportionate zonal separation and in that one
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specific weights varying from 1.13 to about 1.16 g / cc.