La présente invention concerne en général la détermination
de l'efficacité des antibiotiques sur les micro-organismes, et
en particulier un dispositif et un procédé permettant de réaliser
des essais de susceptibilité aux antibiotiques sans isoler les micro-organismes.
Le mode opératoire clinique de routine qui permet de
déterminer la sensibilité des micro-organismes aux antibiotiques
est fondamentalement une opération en deux temps dont l'achèvement nécessite au moins 48 heures. Le premier temps consiste à cultiver
le micro-organisme à partir d'un échantillon, et dans ce cas-là
on isole le micro-organisme. Le second temps consiste à soumettre
le micro-organisme isolé à l'action de différents antibiotiques
de façon à déterminer lequel inhibe la croissance du microorganisme. Bien entendu, pendant le temps nécessaire pour procéder aux essais de susceptibilité, l'état d'un patient risque d'empirer
ou de se modifier spectaculairement. Il est donc impératif de déterminer l'antibiotique approprié et de l'administrer aussitôt
que possible.
L'un des objectifs principaux de la présente invention est
de procurer un dispositif et un procédé permettant de conduire
<EMI ID=1.1>
relativement court, qui peut ne pas dépasser huit heures. Un autre objectif de l'invention est de procurer un dispositif et un procédé
du type susmentionné, avec examen direct de l'échantillon clinique sans isolement du micro-organisme soupçonné. Un autre objectif de l'invention est de procurer un dispositif d'utilisation simple et
ne nécessitant pas de techniciens très-qualifiés. Ces objectifs, notamment, ainsi que les avantages de l'invention, ressortiront de
la description détaillée qui va suivre.
La présente invention est concrétisée par un appareil et un procédé qui, fondamentalement, consiste à introduire un spécimen
dans des mélanges d'un milieu de culture sélectif et d'antibiotique:
connus. Si le spécimen contient un micro-organisme qui est favorisé par le milieu de culture d'un mélange, et si ce micro-organisme
n'est pas susceptible à l'antibiotique, les caractéristiques
optiques du mélange se modifient.
Sur la planche de dessins annexée, les mêmes repères et les
mêmes lettres désignent les mêmes pièces dans tous les cas, et :
La figure 1 est une vue de dessus d'une cassette construite conformément à la présente invention et la concrétisant La figure 2 est une vue en coupe suivant la ligne 2-2 de la figure 1 ; La figure 3 est une vue en coupe suivant la ligne 3-3 de la figure 1 ; et La figure 4 est une vue en perspective montrant le spécimen dilue lors de son introduction dans la cassette.
Sur la figure 1, C désigne une cassette permettant de procéder à des essais de susceptibilité aux antibiotiques, c'est-à-dire à des essais visant à déterminer Les effets d'antibiotiques connus, qui sont contenus dans la cassette C, sur un micro-organisme introduit dans cette cassette C. La cassette C permet également l' identification du micro-organisme. La cassctts C est de forme rectangulaire, et mesure de préférence environ 5,7 cm sur 9,1 cm et est épaisse d'environ 3,2 mm. Le long de l'un de ses petits bords, la cassette C présente deux échancrures espacées 2 de mise en place, tandis que chacun de ses grands bords présente une
<EMI ID=2.1>
cassette près du bord dans lequel est pratiquée chacune des
<EMI ID=3.1>
2 et les échancrures de préhension 4 permettent la manipulation mécanique de la cassette C en vue de l'examen notamment. Près de l'un de ses grands bords, la cassette C porte un code d'identification approprié sur l'une de ses grandes surfaces, et ce code identifie le patient, le type de milieu de culture, la date de l'échantillon, etc...
La cassette C comporte un corps rigide sous la forme d'une plaque 10 en matière plastique qui a la même dimension et la même forme que la cassette C, et qui comporte donc les échancrures 2
et 4. La plaque 10 comporte des creux 12 de culture qui sont disposés en plusieurs groupes ou rangs transversaux. Près de chaque creux 12 de culture, la plaque 10 comporte en outre deux cavités 14 et 16 de trop-plein, et ces cavités sont reliées aux creux 12 par l'intermédiaire de canaux 18 et 20 de trop-plein.
Les creux 12 elles cavités 14 et 16 de trop-plein traversent complètement la plaque 10.
<EMI ID=4.1>
branche longitudinale 24 d'alimentation, des branches latérales 26, et des branches terminales 28, toutes ces branches formant des saignées qui ne s'ouvrent que sur une seule face de la plaque 10. La branche longitudinale 24 d'alimentation longe l'un des grands bords latéraux de la plaque 10 et est parallèle à ce bord latéral et est coupée par un certain nombre des branches latérales transversales <2>6, une branche latérale 26 correspondant à chaque rang de creux 12. Les différents creux 12 sont reliés aux branches latérales 26 par l'intermédiaire des branches terminales 28, lesquelles sont assez longues pour empêcher la migration du contenu des creux adjacents pendant le laps de temps qui intéresse l'observateur. Les branches terminales 28 conduisent aux creux 12 eux-mêmes et non aux cavités 14 et 16 de trop-plein qui correspondent à ces creux.
Un orifice 30 de remplissage est prévu entre la branche longitudinale 24 et le bord latéral adjacent qui est parallèle à cette branche 24. L'orifice 30 de remplissage s'ouvre dans le passage longitudinal 24 et à l'opposé du bord latéral. La partie extérieure de l'orifice 30 de remplissage est occupée par une cloison 32 étroitement ajustée.
Tous les creux 12 de culture de la cassette C contiennent le même milieu de culture sélectif qui favorise un micro-organisme spécifique, en ce sens que seul ce micro-organisme, lorsqu'il
sera entretenu par le milieu de culture, modifiera les caractéristiques de transmission de la lumière du milieu de culture d'une manière caractéristique pré-déterminée, liée au temps. Le milieu
de culture est à l'état lyophilisé et se réhydrate au moment même où on y introduit le spécimen. En fait, le milieu de culture subit une modification optique par suite de l'action métabolique du micro-organisme spécifique, et si, dans la plupart des cas, le micro-organisme ainsi favorisé croît ou se multiplie dans le milieu sélectif, la croissance n'est pas nécessaire pour provoquer la modification optique caractéristique. D'autres micro-organismes qui pourraient vivre et/ou se multiplier dans le milieu de culture ne provoqueront pas la modification optique caractéristique- Par conséquent, lorsque l'on observe la modification optique caractéristique, il est évident que le micro-organisme spécifique vit dans le milieu de culture.
Etant donné que ce milieu de culture est à l'état lyophilisé, on peut conserver la cassette C pendant des laps de temps relativement longs. Cependant, le milieu de culture doit se rehydrater avant d'être capable d'entretenir le micro-organisme spécifique pour que ses caractéristiques de transmission de lumière se modifient. Le milieu de culture sélectif est habituellement le même pour tous les creux 12 de la cassette C, mais il peut varier de cassette ai cassette en fonction du micro-organisme qui intéresse l'observateur. Il est également possible de construire une cassette C avec des milieux différents dans les creux 12. Ceci est commode lorsque l'aspect extérieur de la maladie réduit le champ d'investigation à quelques micro-organismes.
Dans au moins un des creux 12, il est courant que le milieu de,culture sélectif ne comporte pas d'antibiotique qui risque d'être nuisible pour le micro-organisme qui intéresse l'observateur. Dans chacun des autres creux 12, le milieu de culture se trouve mélangé avec un antibiotique qui est susceptible de nuire aux micro-organismes choisis. Les antibiotiques, ou leurs mélanges, peuvent varier d'un creux 12 à l'autre, et les deux creux
12 différents peuvent comporter le même antibiotique, mais à
des concentrations différentes. Ainsi, les micro-organismes ne vivront et ne se multiplieront pas dans les creux 12 contenant
un antibiotique auquel le micro-organisme favorisé est susceptible, pourvu que l'antibiotique soit présent à une concentration suffisante.
Chaque grande surface de la plaque 10 est recouverte d'un ruban transparent 34 qui est assez large et assez long pour recouvrir complètement et fermer tous les creux 12, les cavités
14 et 16 de trop-plein, les canaux 18 et 20 de trop-plein, et
les passages 24, 26 et 28 de remplissage. Le ruban 34 a la propriété de laisser l'air entrer dans les creux 12 et d'empêcher l'eau et les micro-organismes de s'échapper.
Pour procéder à un essai de susceptibilité aux antibiotiques
à l'aide de la cassette C, on dilue un spécimen, soupçonné de renfermer un micro-organisme nuisible, dans une quantité prédéterminée d'eau contenue dans un réservoir 36. L'extrémité inférieure du réservoir 36 porte une aiguille 38 qui en fait saillie, et on introduit cette aiguille dans la cloison 32 pour mettre en communication l'orifice 30 de remplissage et l'intérieur du réservoir 36 (figure 4).
Une fois que le réservoir et la cassette C sont raccordés
par l'aiguille 38, on crée un vide de l'ordre de 40 mm de mercure dans les passages 24, 26 et 28 de remplissage ainsi que dans les creux 12 de la cassette C, en reliant une pompe a vide à l'extrémité supérieure du réservoir 36. Ainsi, or évacue l'intérieur de la cassette C à travers l'eau qui se trouve dans
le réservoir 36.
Des que le vide recherché est obtenu, on relie à l'atmosphère l'extrémité supérieure du réservoir 36 pour que la pression qui .s'exerce sur le mélange diluant refoule ce mélange dans la cassette C. Ainsi, le mélange diluant prend la place de l'air évacue. En fait, le mélange diluant coule très rapidement dans les passages 24, 26 et 28 de remplissage, et, de là, dans les creux
12 où il réhydrate le milieu de culture. Le mélange diluant et le milieu de culture débordent en outre dans les canaux 18 et 20 de trop-plein et les cavités 14 et 16 de trop-plein à leurs extrémités. L'air qui reste éventuellement dans le passage 22 et les creux 12 se rassemble dans les cavités 14 et 16 de trop-plein.
Il faut noter que, si le ruban 34 laisse entrer l'air dans les creux 12, ses pores sont assez petits pour que le vide créé par
la pompe subsiste assez longtemps pour réaliser un remplissage correct lors du relâchement du vide.
On place ensuite la cassette C dans un environnement chauffé pour faire incuber les micro-organismes qui se trouvent éventuellement dans les creux 12.
En supposant que le milieu de culture utilisé dans la cassette C favorise le micro-organisme dans le mélange diluant, ce microorganisme restera viable et vivra'-. dans le creux 12 renfermant
le milieu de culture pur. Par conséquent, le micro-organisme croîtra et son action métabolique fera subir au milieu de culture une modification de ses caractéristiques optiques. Etant donné
que l'on connait le micro-organisme favorisé par le milieu de culture, ainsi que la nature de la modification des caractéristiques optiques qui est provoquée par le micro-organisme, la modification des caractéristiques optiques du creux 12 qui contient le milieu de culture pur permet d' identifier le micro-organisme.
Ce n'est pas seulement le creux 12 contenant le milieu de culture pur qui subit une modification de ses caractéristiques optiques, mais aussi tous les autres creux 12 qui contiennent un antibiotique auquel le micro-organisme n'est pas susceptible. D'autre part, tout creux 12 contenant un antibiotique de concentration insuffisante subira lui aussi une modification de ses caractéristiques optiques. En d'autres termes, le microorganisme favorisé vivra dans tous les puits 12 où l'antibiotique n'est pas efficace ou ne se trouve pas à une concentration suffisante. Mais l'absence d'une modification quelconque des caractéristiques optiques révèle que l'antibiotique est efficace contre ce micro-organisme. Etant donné que l'on connaît l'antibiotique qui se trouve dans chaque creux 12, on est en mesure de déterminer quels antibiotiques combattront le microorganisme.
Des modifications significatives des caractéristiques optiques des creux 12 se produisent au moins 2 heures après l'introduction du mélange diluant et après incubation pendant
14 heures au maximum. On peut observer les modifications à l'oeil nu ou bien à l'aide d'un détecteur électro-optique. Le détecteur électro-optique projette la lumière � travers les creux
12 et mesure l'intensité de la lumière au-delà des creux 12.
Une modification d'intensité importante révèle la croissance ou l'action métabolique du micro-organisme favorisé dans un creux 12, et donc que l'antibiotique qui se trouve dans ce creux 12 n'est pas efficace contre le micro-organisme favorisé.
EXEMPLE
On utilise le bouillon conforme qui est décrit dans le Brevet belge ?799 798 pour détecter des micro-organismes conformes
(Escherichia coli) qui se trouvent surtout dans les matières fécales et provoquent une infection entérique. On prépare ce bouillon en dissolvant 10 g de lactose et 10 g de "gélysat" dans
1 litre d'eau distillée. On ajoute ensuite de l'acide chlorhydrique ou de la soude pour porter le pH à 7,4. Puis on ajoute 10 g de désoxycholate de sodium. On peut chauffer le mélange pour dissoudre les ingrédients, mais il ne faut pas le porter à ébullition. Enfin, on stérilise la solution en la filtrant et on ajoute 13,3 mg de vert brillant. On lyophilise le bouillon précédent pour former le milieu sélectif que l'on place dans l'un des creux 12 sous sa forme pure.
Pour chaque litre de milieu avant lyophilisation, on peut ajouter l'un des antibiotiques suivants aux concentrations indiquées de façon à forme= un mélange pour les autres puits 12 :
<EMI ID=5.1>
Pour d'autres milieux sélectifs, on utilise des concentrations similaires.
REVENDICATIONS
1. Dispositif permettant de procéder à des essais de susceptibilité aux antibiotiques sur des spécimens cliniques, comprenant : une plaque dans laquelle sont ménagés des creux
de détection et des passages de remplissage qui mènent à ces creux ; et un mélange de milieu de culture et d'antibiotiques connus dans au moins certains des creux de détection, le milieu
de culture étant sensible aux micro-organismes, en ce sens que
les caractéristiques optiques du milieu de culture ne se modifient d'une manière prédéterminée que lorsqu'un micro-organisme est entretenu dans le milieu de culture.
The present invention relates in general to the determination
the effectiveness of antibiotics on microorganisms, and
in particular a device and a method for making
antibiotic susceptibility testing without isolating microorganisms.
The routine clinical procedure that allows
determine the sensitivity of microorganisms to antibiotics
is basically a two-step operation that requires at least 48 hours to complete. The first step is to cultivate
the microorganism from a sample, and in this case
the microorganism is isolated. The second step is to submit
the microorganism isolated by the action of different antibiotics
so as to determine which one inhibits the growth of the microorganism. Of course, during the time it takes to perform susceptibility testing, a patient's condition may worsen.
or change dramatically. It is therefore imperative to determine the appropriate antibiotic and administer it immediately.
as possible.
One of the main objectives of the present invention is
to provide a device and a method for conducting
<EMI ID = 1.1>
relatively short, which may not exceed eight hours. Another object of the invention is to provide a device and a method
of the above-mentioned type, with direct examination of the clinical sample without isolation of the suspected microorganism. Another objective of the invention is to provide a device that is easy to use and
not requiring highly qualified technicians. These objectives, in particular, as well as the advantages of the invention, will emerge from
the detailed description which follows.
The present invention is embodied in an apparatus and a method which basically involves introducing a specimen
in mixtures of a selective culture medium and antibiotic:
known. If the specimen contains a microorganism which is favored by the culture medium of a mixture, and whether this microorganism
is not susceptible to the antibiotic, the characteristics
optics of the mixture change.
On the attached sheet of drawings, the same references and
same letters designate the same parts in all cases, and:
Figure 1 is a top view of a cassette constructed in accordance with the present invention and embodying it; Figure 2 is a sectional view taken along line 2-2 of Figure 1; Figure 3 is a sectional view taken along line 3-3 of Figure 1; and Figure 4 is a perspective view showing the diluted specimen as it is introduced into the cassette.
In Figure 1, C denotes a cassette for performing antibiotic susceptibility tests, that is to say tests to determine the effects of known antibiotics, which are contained in the cassette C, on a microorganism introduced into this cassette C. The cassette C also allows the identification of the microorganism. Cassette C is rectangular in shape, and preferably measures about 5.7 cm by 9.1 cm and is about 3.2 mm thick. Along one of its small edges, the cassette C has two spaced indentations 2 for positioning, while each of its large edges has a
<EMI ID = 2.1>
cassette near the edge in which each of the
<EMI ID = 3.1>
2 and the gripping notches 4 allow the mechanical manipulation of the cassette C for examination in particular. Near one of its large edges, Cassette C bears an appropriate identification code on one of its large surfaces, and this code identifies the patient, the type of culture medium, the date of the sample, etc ...
The cassette C has a rigid body in the form of a plastic plate 10 which has the same size and the same shape as the cassette C, and which therefore comprises the notches 2
and 4. The plate 10 has cultivation hollows 12 which are arranged in several groups or transverse rows. Near each culture hollow 12, the plate 10 further comprises two overflow cavities 14 and 16, and these cavities are connected to the hollows 12 by means of overflow channels 18 and 20.
The hollows 12 and the overflow cavities 14 and 16 completely pass through the plate 10.
<EMI ID = 4.1>
longitudinal branch 24 of supply, lateral branches 26, and end branches 28, all these branches forming grooves which open only on one side of the plate 10. The longitudinal branch 24 of supply runs along one side. of the large lateral edges of the plate 10 and is parallel to this lateral edge and is cut by a certain number of the transverse lateral branches <2> 6, a lateral branch 26 corresponding to each row of recesses 12. The various recesses 12 are connected to the side branches 26 through end branches 28, which are long enough to prevent migration of contents from adjacent hollows during the time of interest to the observer. The end branches 28 lead to the hollows 12 themselves and not to the overflow cavities 14 and 16 which correspond to these hollows.
A filling orifice 30 is provided between the longitudinal branch 24 and the adjacent lateral edge which is parallel to this branch 24. The filling orifice 30 opens into the longitudinal passage 24 and opposite the lateral edge. The outer portion of the fill port 30 is occupied by a tight fitting partition 32.
All of the culture wells 12 of cassette C contain the same selective culture medium which favors a specific microorganism, in that only that microorganism, when
will be maintained by the culture medium, will modify the light transmission characteristics of the culture medium in a predetermined, characteristic manner related to time. The middle
culture is in the lyophilized state and rehydrates at the same time as the specimen is introduced. In fact, the culture medium undergoes an optical change as a result of the metabolic action of the specific microorganism, and if in most cases the microorganism thus promoted grows or multiplies in the selective medium, the growth is not necessary to cause the characteristic optical change. Other microorganisms that might live and / or multiply in the culture medium will not cause the characteristic optical change - Therefore, when observing the characteristic optical change, it is evident that the specific microorganism lives in the culture medium.
Since this culture medium is in a lyophilized state, Cassette C can be stored for relatively long periods of time. However, the culture medium must rehydrate before it is able to support the specific microorganism for its light transmission characteristics to change. The selective culture medium is usually the same for all wells 12 of cassette C, but it can vary from cassette to cassette depending on the microorganism of interest to the observer. It is also possible to construct a cassette C with different media in the recesses 12. This is convenient when the outward appearance of the disease narrows the field of investigation to a few microorganisms.
In at least one of the hollows 12, it is common for the selective culture medium to contain no antibiotic which may be harmful to the microorganism of interest to the observer. In each of the other hollows 12, the culture medium is mixed with an antibiotic which is liable to harm the selected microorganisms. Antibiotics, or mixtures thereof, can vary from trough 12 to trough, and both troughs
12 different may have the same antibiotic, but
different concentrations. Thus, microorganisms will not live and multiply in the hollows 12 containing
an antibiotic to which the favored microorganism is susceptible, provided that the antibiotic is present in a sufficient concentration.
Each major surface of the plate 10 is covered with a transparent tape 34 which is wide and long enough to completely cover and close all the recesses 12, the cavities.
14 and 16 overflow, channels 18 and 20 overflow, and
the filling passages 24, 26 and 28. The tape 34 has the property of allowing air to enter the recesses 12 and of preventing water and microorganisms from escaping.
To perform an antibiotic susceptibility test
using cassette C, a specimen, suspected of containing a harmful microorganism, is diluted in a predetermined quantity of water contained in a reservoir 36. The lower end of the reservoir 36 carries a needle 38 which makes it projection, and this needle is introduced into the partition 32 to place the filling orifice 30 in communication with the interior of the reservoir 36 (FIG. 4).
Once the reservoir and cassette C are connected
through the needle 38, a vacuum of the order of 40 mm of mercury is created in the filling passages 24, 26 and 28 as well as in the hollows 12 of the cassette C, by connecting a vacuum pump to the end upper tank 36. Thus, gold evacuates the interior of the cassette C through the water in
the tank 36.
As soon as the desired vacuum is obtained, the upper end of the reservoir 36 is connected to the atmosphere so that the pressure exerted on the diluent mixture forces this mixture into the cassette C. Thus, the diluent mixture takes the place. air is exhausted. In fact, the diluent mixture flows very quickly through the filling passages 24, 26 and 28, and from there into the hollows.
12 where it rehydrates the culture medium. The diluent mixture and the culture medium further overflow into the overflow channels 18 and 20 and the overflow cavities 14 and 16 at their ends. The air which may remain in the passage 22 and the hollows 12 collects in the cavities 14 and 16 of overflow.
It should be noted that, if the tape 34 allows air to enter the recesses 12, its pores are small enough that the vacuum created by
the pump remains long enough to achieve correct filling when the vacuum is released.
The cassette C is then placed in a heated environment to incubate the microorganisms which may be found in the pits 12.
Assuming that the culture medium used in Cassette C favors the microorganism in the diluent mixture, this microorganism will remain viable and live. in the hollow 12 containing
the pure culture medium. Therefore, the microorganism will grow and its metabolic action will cause the culture medium to undergo a change in its optical characteristics. Given
that we know the microorganism favored by the culture medium, as well as the nature of the modification of the optical characteristics which is caused by the microorganism, the modification of the optical characteristics of the hollow 12 which contains the pure culture medium allows the microorganism to be identified.
It is not only the hollow 12 containing the pure culture medium that undergoes a change in its optical characteristics, but also all the other hollows 12 which contain an antibiotic to which the microorganism is not susceptible. On the other hand, any hollow 12 containing an antibiotic of insufficient concentration will also undergo a modification of its optical characteristics. In other words, the favored microorganism will live in all wells 12 where the antibiotic is not effective or is not in sufficient concentration. But the absence of any change in optical characteristics reveals that the antibiotic is effective against this microorganism. Since we know the antibiotic that is in each hollow 12, we are able to determine which antibiotics will fight the microorganism.
Significant changes in the optical characteristics of the pits 12 occur at least 2 hours after the introduction of the diluent mixture and after incubation for
14 hours maximum. The changes can be observed with the naked eye or with the aid of an electro-optical detector. The electro-optical detector projects light � through the hollows
12 and measures the intensity of light beyond the valleys 12.
A significant change in intensity reveals the growth or metabolic action of the microorganism promoted in a hollow 12, and therefore that the antibiotic which is in this hollow 12 is not effective against the favored microorganism.
EXAMPLE
The compliant broth which is described in Belgian Patent No. 799 798 is used to detect compliant microorganisms.
(Escherichia coli) which are mostly found in the feces and cause enteric infection. This broth is prepared by dissolving 10 g of lactose and 10 g of "gelysate" in
1 liter of distilled water. Hydrochloric acid or sodium hydroxide is then added to bring the pH to 7.4. Then 10 g of sodium deoxycholate are added. You can heat the mixture to dissolve the ingredients, but you should not bring it to a boil. Finally, the solution is sterilized by filtering it and 13.3 mg of brilliant green are added. The preceding broth is lyophilized to form the selective medium which is placed in one of the hollows 12 in its pure form.
For each liter of medium before lyophilization, one of the following antibiotics can be added at the concentrations indicated so as to form = a mixture for the other wells 12:
<EMI ID = 5.1>
For other selective media, similar concentrations are used.
CLAIMS
1. Device for performing antibiotic susceptibility tests on clinical specimens, comprising: a plate in which recesses are formed
detection and filling passages that lead to these hollows; and a mixture of culture medium and known antibiotics in at least some of the detection pits, the medium
culture being sensitive to microorganisms, in the sense that
the optical characteristics of the culture medium only change in a predetermined manner when a microorganism is maintained in the culture medium.