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Laprésente invention est relative à un procédé et à une composition pour la conservation de spécimens du règne animal. L'invention concerne, plus particulièrement la conservation de spécimens inanimés ou morts du règne animal, par traitement à l'aide do composés hétérocycliques, caractérisé par la présence d'un noyau de 1,4-dioxanone dans la molécule et/ou les produits d'hydrolyse de ces composés à noyau 1,4-dioxanone ot de sels quaternaires d'hexaméthylènetétramine ou de mélanges de tels sels et de ces composés du type dioxanone.
On cornait de nombreux composés utilisables pour conserver desspécimens du rogne animal. Le phénol et le formaldéhyde s t des agents de conservation couramment utilisés pour l'emlaumement, Ces composés constituent des agents de conservation adéquats, mais la majeure partie des composés de ce type sont malodorants, sont très toxiques et ont tendance à laisser les spécimens troités dans un état rigide. Il a été constaté à présent, dans le cadre de la présente invention, que le traiterient de spécimens d'animaux inanimés à l'aide de 2-para-dioxano- ne et de dérives alkylés de la 2-para-dioxanone, ainsi qu'à l'aide des produits d'hydrolyse de ces composés, laisse les spécimens conservés dans un état flexible et quasiment vivant .
Au surplus, les 2-para-dioxanonos et laurs produits d'hydrolyse sont moine toxiques et n'ont pas d'odeurs désagréables.
Le terme "conservation",tel qu'il est utilisé dans le présent mémoire: signifie que l'action enzymatique est arrêtée dans le tissu animal, ce qui empêche la destruction auto-cata- lytique de ce tissu, tandis que les tissus traités résistent
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aux attaques extérieures des bactéries et des mycètes. L'expres-
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sion "spécimen, du règne animal" :1 édgnc n'importe quelle partio ou 1.' entieté d un organisme animal. Comme exemples de tels organismes, on peut citer les mammifères, les insectes, les poissons et invertébrés, do même que des parties de ces animaux.
Comme autres exemples on peut citer les spécimens de tissus humains et de cadavres.
Une classe de composés intéressants en tant qu'ingré- dient de conservation actif dans les compositions de traitement
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suivant l'invention est; celle des 6-lactonc-s contenant un hétéroatone d'oxygène supplémentaire dans le noyau et les produits hydrolyses de ces 6,-lactones. Une sous-classe appropriée de ces composés (sous forno non-hydrolysée) 'ft celle des composés qu l'on peut représenter par la formule suivante:
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dans laquelle les symboles R qui peuvent être identiques ou dif-
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férents désignent de l'hydrogène, le groupe nethylp ou le groupe éthyle. Comne exemples de ces composés, on peut citjr la 2-pdioxanono-(1 , -dioxan-2-onc: ), la 3, 5-diai:thyl-1 , r-dioXan-2-021c, la 3-mcthyl-G-éthyl-1 , t-dioxran,n-2-onc, la 3, a, G-triMthl-1 , .rdioxan-2-onc et la 6-méthyl-1,-diox.cxn-2-ono.
Cos composes peu- vent aussi être utilisés comme agents de conservation sous leur
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forme acide ou sous forme de nélongos en équilibre avec leurs produits d'hydrolyse.
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Les spécimens do tissu animal peuvent être traités à l'aide des composés de conservation actifs (sous forme des -lactones, de la forme acide de cess-lactones ou do mélanges équilibrés mixtes de ces5-lactones) ,par diversprocédés, tels que l'immersion, l'injection ou l'infusion. Les 2-p-dioxanones peuvent cire utilisée sous forme de solutions aqueuses à des concentrations do 1 % à 100 % (composé pur) en poids ; bien les composés peuvent être mélangés avec d'autres agents de con- servation (tel que le formaldéhyde). Divers solvants des com- posés-lactoniques peuvent être utilisés.
Lorsqu'on utilise de la 2-p-dioxanone comme agent d'embaumement actif, des solvants tels que l'eau, le benzène, le tolu'ne, le xylène, le dioxane, l'éther diéthylique, le chloroforme, létrahydrofuranne, les alcools aliphatiques (tels que léthanol et l'i-propanol), des cé- tones, (telles que l'acétone), des polyols (tels que l'éthylène glycol) et des aldéhydes, peuvent être utilisés.
Comme véhicule @ pour l'imprégnation de spécimens de tissu animal, on peut uti- liser n'importe quelle substance relativement inerte qui dissout les agents d'embaumement du type #-lactone. Lorsqu'on utilise de l'eau comme solvant, la#-lactone forme un mélange en équili- bre avec ses produits d'hydrolyse (principalement l'acide 2- hydroxyalkoxyalcanoique). Pour les spécimens qui ne nécessitent pas une pénétration profonde, des suspensions de l'agent d'em- baumement peuvent être utilisées. Dans le cas de la 2-p-dioxa- none et des 2-p-dioxanonos méthylées qui sont liquides à environ 27 C, les composés peuvent être utilisés sans solvant.
Lorsqu'on utilise do l'eau comme solvant, il se forme un mélange équilibré qui contient, de manière prédominante, de l'acide 2-hydroxyalkoxyalcanoique avec un peu de polymère.
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Dans ces formules, les symboles R ont los significations données pour la formule (I). Lorsqu'on utilise des solutions aqueuses très diluées (contenant moins d'environ 10 % en poids du composé du type dioxanone), la lactone est principalement sous la forme acide. Pour la commodité, les concentrations sont basées sur la quantité totale de#-lactnne présente dans la solution, y compris la S-lactonc présente sous forme hydrolysée. Ainsi, on port préparer des solutions aqueuses d'agents de conservation à partir do la dioxanone ou à partir de l'acide 2-hydroxyalkoxy- alcanoique correspondant , étant donné que dans l'un et l'autre cas un mélange équilibré est obtenu dans la solution aqueuse.
Lorsque des techniques d'immersion sont utilisées pour imprégner le spécimen d'une solution d'une 2-p-dioxanone dans un solvant approprié, ce spécimen est simplement placé dans un récipient contenant la solution, de façon que la totalité ou une partie substantielle du spécimen soit recouverte par la solution. Le spécimen peut être conservé, de manière permanente, dans le récipient (par exemple, lorsqu'on utilise des récipients en verre à des fins d'exposition) ou jusqu'à co que le spécimen
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doive: être utilisé pour une analyse ou étude ultérieure.
Des concentrations de composé du type 2-p-dioxanne actif-d'envi- ron 1 % à 100 % en poids dans la solution de traitement sont convenables. Il est habituellement plus économique d'utiliser des solutions dans lesquelles la concentration de la 0 -lactone active n'est pas supérieure à 80 % en poids et est, de préférence, comprise entre environ 10 % et 80 %.
Ces mêmes solutions peuvent être utilisées, lorsque des techniques d'injection ou d'infusion sont employées pour imprégner les spécimens de tissu animal. Lorsqu'on fait usage de techniques d'injection, le fluide d'embaumement (sous forme d'un composé pur ou d'une solution) est introduit dans le spécimen sous pression par exemple à l'aide d'une seringue et d'une: aiguille- hypodermique.
Lorsque les techniques d'infusion sont employées, le fluide d'embaumement est introduit dans le système circulatoire du¯ spécimen à conserver et ce fluide est admis à diffuser dans le reste du tissu,
En général, des quantités de composés du type 2-p- dioxanone (caleulées our la base de la forme -lactone plutôt que cous la forme acide) de 5 % à 50 % du poids du spécimen moyen traite sont suffisantes pour que la durée de conservation de ce spécimen soit comprise entre 1 mois et une période indé- finiu.
L'imprégnation d'un spécimen à l'aide de quantités de composés du type 2-p-dioxanone de 10 % seulement du poids du spécimen traite donne une conservation sensiblement permanente,
La quantité de matière d'embaumement déposée dans le spéciment peut varier, selon le but d'utilisation du spécimen . Les spécimens destinés à être exposés doivent être trai- tés par do grandes quantités du composé du type 2-p-dioxanone, tandis que les spécimens qui doivent être disséqués endéant quelques jours ou quelques semaines nécessitent une quantité moindr
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do fluide d'embaumement, étant donné que la conservation ne doit pas être permanente.
Un avantage desfluides d'embaumement qui contiennent de la 2-p-dioxanone ou de la méthyl- ou éthyl 2-p-dioxanonc (et/ ou les produits d'hydrolyse de ces composés du type dioxanonc) en tant qu'ingrédients de conservation actifs, par rapport à d'autres agents de conservation communément utilisés, réside dans le fait que les fluides d'embaumement suivant la présente invention ne provoquent pas une constriction des vaissaux sanguins au cuurs du processus d'infusion. Au surplus, les tissus nerveux ne sont pas oblitérés et peuvent être aisément observés âpres le. traitement du spécimen.
Les agents de conservation du type #-lac
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tone de mono que leurs produits d 'hy .. lyse (spécialement la 2-p-dioxanonc et l'acide 2-hydroxyéthoxyactiuù) sont compatibles ave.c des compositions polymtGriqucE3 (telles que: les latex synthétiques), on sorte qu'un polymbrc colore qui contient églement un aeent dû conservation peut être introduit dans lur' vs inos et les artères du spécimen, en une [Jcu10 phasu (plutôt qui, d'introduire un polymère colore dans les vniusMir* sanguins apz : le traitement du spécimen par un agonit de c0ru.:c:r"'::-:;i( .).
Oortfiins conposbs ci't\I':U.loniuu qua.tcrnl1.i!'. dérivés du l'hexa.méth;y'lènctétrll.'i1inc possèdent, COI.une on le o-itp une action anti-bo.ct0rionnc, comme décrit par Scott et al. l:1nS le Journal of Applied Hicrobiology, Vol. 10, n 3, Mai, 1962, p. 211 et
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suivantes.
D'autres dérivés, d'nmmoniw!\ quaternaires intéressants de l thGx"i1.éthyl;';nGtétre.mi1'1u qui contiennent un groupe 4poX dans la molécule peuvent 6tre obtenue par conbinaicon de l'hexaméthylènetétramine et d'une 6piha.lohydrinc (telle que. l' 4pibxor.hydri-. ne ou l'épichlorhydrine) ,
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Lorsqu'un sel d'ammonium quaternaire d'hexaméthylènetétramine est utilisé morne agent de conservation pour un spécimen animal, qui possède un système circulatoire fin ou grossier, les vaissaux du système circulatoire ne subissent pas de constriction ou d'étranglement, bien que le spécimen conservé ait tendance à devenir rigide, Avec un fluide d'embaumement classique pour animaux, (tel que ceux à base de formaldéhyde en solution aqueuse),
les vaisseaux du système circulatoire subissent une constriction et des quantités excessives d'agent de conservation sont nécessaires, pour obtenir une fixation suffisante des parties du spécimen qui contiennent des sections capillaires du système circulatoire. Bien que les agents de conservation à base de composés du type 2-para-dioxanone (et de produits d'hydrolyse de ces com posés) no provoquent pas de constriction des vaissaaur circula- toirs, les constituants cellulaires des tissus animaux ne sont pas fixés et les cellules de ces tissus ont, par conséquent, ten- dance à perdre leur identité. Lorsque ceci se produit, los examens histologiquesde la structure cellulaire au microscope deviennent imprécis.
Lorsque l'on combine les sols quaternaires de l'hexaméthylène tétramine et los composés du type 2-para-dioxa-' nono (ou laurs produits d'hydrolyse),on constate que la com- position de conservation obtenue maintient la structure cellu- laire du spécimen intacte, ne donne pas lieu à une constriction dos vaisseaux des réseaux circulatoires et procure un spécimen qui reste flexible et quasiment vivant.
Ainsi, lorsque la rigidité ne pose pas de problème, mais lorsqu'il est nécessaire de fixer la structure cellulaire du spécimen, l'emploi des sels d'ammonium quaternaires d'hexa- mé-thylènetétramine sans un composé du type 2-para-dioxanone suffit. Si la flexibilité est nécessaire ou souhaitable, il faut
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. utiliser dos composes du type 2-para-dioxanone ou leurs produits d'hydrolyse, conjointement avec les composés quaternaires. Au surplus, l'emploi des compositions de conservation suivant l'in- vention n'est pas lié aux odeurs désagréables, que l'on rencontre lorsqu'on fait usage de formaldéhyde.
La sous-classe préférée des sels d'ammenium quatemai- res d'hexaméthylènetétramine est celle des composés de formule:
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dans laquelle x et y désignent chacun un nombre entier de 1 ou 2 (lorsque x et y = 1, (III) un produit d'addition, molaire 1 :1), A est un groupe organique halogène contenant 1 à 20 atomes de car, bone, tel que le 3-chloro-1-propène, l'épichlorhydrine, l'épi- bromhydrine , le bromure do propargyle, le chlorure de propargy- le, l'[alpha]-chlorotoluène, le bromure de méthyle, le chlorure de mé- thylo et les composés du type polyglycol bis(2-hydroxy-3-chloro- propoxy)
tels que
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Etant donné que la fonction du groupe A est d'assurer une décomposition relativement lente do la partie hexaméthylènetatra- mine,n'importe quel groupe organique A capable de former @ un sel d'ammonium quaternaire convient. Ainsi, des produits d'ad- dition formes par la réaction de duux noies d'une épihalohydri- ne et d'une mole d'un polyalkylène glycol tel que ceux de formule:
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dans laquelle X est un halogène tel que Br ou Cl et n est égal à 1 à 10, et du 1,3-dichloropropène peut être utilisés.
Les sels d'ammenium quaternaires d'hexaméthylènetéramino se préparent en mélangeant des quantités sensiblement stoéchiométri- ques (habituellement équimolaires) d'hexaméthylènetéramine et de l'agent complexant approprié par des procédés connus. De nombreux autres composés quaternaires appropriés sont décrits par Scott et al., dans la publication citée plus haut.
Les produits d'hydrolyse des composés du type 2-pdioxanone peuvent également être utilisés sous forme de leurs sels, spécialement les sels de nétaux alcalins (Na, K par exemple) et les sels de métaux alcaline terreux (Ca, Ba, etc.). Une forme de réalisation préférée de l'invention consiste à neutra- liser un mélange du sel quaternaire et d'une solution aqueuse de 2-para-dioxanone, en utilisant une base classique (NaOH, KOH, Ca(OH)2, NaHCO3, Na3PO4, Na2CO3, etc).
La composition neutralisée (pH 7,0 à 7,5) contient ainsi essentiellement le sel d'am- monium quaternaire d'hexaméthylènetétramine et les sels de métaux alcalins ou de métaux alcalino-terreux de l'acide 2-hydro- xyuthoxy acétique.
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On suppose que les sels d'ammonium quaternaires ou l'hexaméthylènetétramine libèrent lentement du formaldéhyde dans le spécimen imprégné, mais sans provoquer une constriction des vaisseaux circulatoires du spécimen et sans dégager l'odeur typique du formaldéhydc. Cette propriété permet d'utiliser des -quantitésbien moindres des sels d'ammonium quaternaires d'hexaméthylènetétramine que celles qui sont nécessaires avec les fluides d'embaumement classiques .
Ainsi, (3,78 litres d'une solution à 10 % (en poids) d'un sel d'ammonium quater- naire d'hexaméthylènetétramine donnent le même degré de fixation (action de conservation) que 18,9 litres d'une solution à 10 % en poids de formaline
Le rapport du sel d'ammonium quaternaire au compose du type dioxanone (ou produit d'hydrolyse) dans la composition de traitement peut varier entre environ 1 :150 et50:1, lorsque la quantité totale des ingrédients combinés est d'environ 0,5 à 100 % en poids (de préférence de 10 à 50 par rapport au poids total de la composition de traitement. Pour la commodité, les poids du produit d'hydrolyse (et des sels du ceux-ci) des
2-p-dioxanonec snnt basés sur le poids équivalent d s 2-para- dioxanones que ces produits forment théoriquement.
Lorsqu'on utilise des sels quaternaires d'hexaméthylènetétramine sans composés du type 2-para-dioxanone (ou des dérives Je ces com- posés),des quantités d'environ 0,5 en poids à environ 50 % en poidn (par rapport au poids total de la composition de trai- tement) peuvent être utilisées. De bons résultats sont obtenue, lorsque le mélange de traitement est constitué essentiellement d'un mélange de sel d'ammonium quaternaire et de composé du - typo 2-para-dioxanone sensiblement pur.
Lorsque de petites quan- tités (jusqu'à environ 5 à 20 % en poids) d'eau sont présentes
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dans les compositions de traitement, il se forme un mélange équilibré des produits d'hydrolyse, Bien que ceci ne soit pas nécessaire, il est préférable de régler le pH du mélange à une valeur comprise entre 6 et 7,5, lorsqu'on utilise de l'eau comme solvant. Avec des véhicules ou solvants non aqueux, aucun réglage de pH ne se fait normalement. Des agents humectants classiques , tels que l'éthylène glycol, les polyéthylène glycols liquides et la glycérine, peuvent également être incorporés dans les compositions d'embaumement.
Les nouvelles compositions de conservation suivant l'invention sont également compatibles avec d'autres matières d'addition classiques utilisées dans la technique de l'embaumement.
Los spécimens du règne animal qui sont imprégnés des compositions suivant l'invention peuvent être traités par des techniques d'immersion, d'infusion ou d'injection. Le procédé particulier de traitement utilisé dépend de la nature du tissu et du but dans lequel ce tissu doit être conservé. Pour les animaux à systèmes circulatoires grossiers, l'infusion des compositions préservatrices dans le système circulatoire est très satisfaisante. Lorsque de petites sections d'organes ou d'autres tissus doivent être conservées, des techniques d'immersion sont habituellement suffisantes. Les techniques d'injection peuvent être utilisées pour la conservation de tissus musculaires ou d'os.
Les compositions de traitement peuvent être emmagasinées ou transportées sous forme concentrée et diluées à l'eau ou avec un autre solvant approprié (tel que les alcools, les glycols, le dioxane ou les hydrocarbures liquides )ayant utilisation.
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EXEMPLE I.
Des spécimens de foie ont été prélevés chez un lapin fraîchement tué et placés dans des solutions aqueuses à 5, 10, 25,50 et 100 % en poids de 2-p-dioxanone. Ces spécimens de foie n!ont révélé aucune trace de putréfaction et sont restés tendres et pliables après 60 jours de stockage. Lorsqu'on les conserve avec des solutions de formaldéhyde, les tissus 'hépatiques perdent leur élasticité après environ 2 jours de conser- vation. ' EXEMPLE II.
Des souris ont été sacrifiées et ouvertes par incision suivant:une ligne centrale. Elles ont ensuite été trenpées dans des solutions aqueuses à 60, 80 et 100 % en poids de 2-p-dioxanone et dans des solutions à 1, 5, 10, 20, 40, 60 et 80 % en poids de 2-p-dioxanone dans une solution à 4 % de formaldéhydc tamponnée neutre: Tous les animaux ont été conservés et ceux traités à l'aide de solutions à 60 et 80 % en poids de 2-p-dioxanone dans de la formalinc cont restés plus tendres et plus pliables qvo les spécimens conservés avec les solutions classi- ques do formaline contenant environ 5-10 % de formalinc et pas de 2-p-dioxanone.
EXEMPLE III.
Les pattes de derrière de chiens sacrifiés ent été. infusées à l'aide'de solutions aqueuses à 80 % et à 60 en poids de 2-p-dioxanone. Les pattes ont été conservées dans une solution aqueuse à 33 % de dioxanone. Elles sont restées tendres et pliables, tout en étant bien conservées. Aucune trace de détérioration ou de perte de flexibilité n'a été constatée après un stockage de 10 mois.
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EXEMPLE IV.
Un coeur de chien a été infusé à l'aide d'une solution à 50 % en'poids de 2-p-dioxanone dans un latex d'acrylate. La composition du latex, avant l'addition d''une quantité de 2-p-dioxanone suf fisante pour former une solution à 50 % était de 46 % en poids de matières solides en suspension dans de l'eau. Les matières solides on suspension étaient constituées d'un copolymère de 2 parties on poids d'acrylate d'éthyle par partie d'acrylate de méthyle, Le coeur a été conservé dans une solution aqueuse à 60 % en poids de 2-p-dioxanone.
Le corur s'est bien conservé tout en restant tendre et pliable et en conservant la teinte naturelle du muscle cardiaque,pendant 10,nois, sans-que l'on constate aucun
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signe de détérioration. # # ## , EXEMPLE V.
Un membre (avant-bras ) de cadavre a été infusé d'une solution aqueuse contenant 25 % on poids do 2-para-dioxanone et
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5 /s en poids de chlorure de N-(3.chloroa.llyl)hexaminium (sel d'amrloYliu;:. quaternaire formé par la réaction de 1 mole d'hexanéthylbnetétranine et de 1 mole de 1 , 3-dichloropropcne ) . L'infusion s'est faite en enfonçant une aiguille dans l'artère principale et en refoulant la solution sous pression dans le tissu, jus- qu'à ce qu'il revienne par le système veineux.
Le nombre infusé a été conservé à la température ambian- te dans une étamine pendant 2 mois et on a constaté qu'il s'est bien conservé pendant cette période. Seule une très légère décoloration de la peau et du tissu a été observée. Le membre est resté pliable et quasiment vivant. Le tissu conjonctif n'a pas été détérioré et le tissu adipeux est resté tendre et naturel, tant en ce qui concerne son aspect que sa texture. La peau a pu être aisément séparée du tissu conjonctif et était tendre et
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pliable; Les nerfs étaient visible et ont pu également Être cisément séparés.
Les vaisseaux sanguins n'avaient subi aucune cons- triction et étaient restés flexibles, tout en conservant un aspect vivant. Aucune putréfaction, ni odeur désagréable ne s'est manifestée.
EXELIPLES VI-XVI.
Des fractions de spécimens de foie de souris, de reins de souris et de foie de lapin ont été chacune trempée dans diverses solutions aqueuses contenant de la 2-para-dioxa- none et/ou des sels quaternaires d'hexaméthylènetétramine. Les échantillons ont été maintenus recouverts des solutions de traitement et observés pendant deux semaines. Tous les échantillons se sont bien conservés. Tous les échantillons à l'exception de celui do l'exemple XIII (2-para-dioxanone sans sel quaternaire) nnt permis d'observer les détails cellulaires, de: la même maniè qu' avec des sections de tissus congelés.. Unu perte des détails cellulaires au microscope s'est produite avec l'échantillon de l'exemple XIII.
La concentration et la composition des solutions utilisées' sont indiquées dans le tableau I. Tous les poids sont indiqués en pour cent par rapport -au poids total dela composition de traitement. Dans les exemples XIV-XVII, les sections de foie do lapin frais mesurant 2,54 cm x 2,54 cm x 0,95 cm ont été trempées dans la solution -aqueuse de l'agent de conservation. Lo tissu s'est bien conservé, en restant ferme et en ne subissant aucune dégradation.
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TABLEAU 1.
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<tb>
<tb>
% <SEP> en <SEP> poids <SEP> % <SEP> en <SEP> poids <SEP> de <SEP> sel
<tb> Exemple <SEP> de <SEP> 2-para- <SEP> d'ammonium <SEP> quaternaire
<tb>
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Td dioxanone d'hexam6thylbnetétramine.
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<tb>
<tb>
VI <SEP> 75 <SEP> 101
<tb> VII <SEP> 75 <SEP> 102
<tb> VIII <SEP> 50 <SEP> 11
<tb> IX <SEP> 37,5 <SEP> 51
<tb> X <SEP> 25 <SEP> 101
<tb> XI <SEP> 12,5 <SEP> 101
<tb> XII <SEP> 12,5 <SEP> 11
<tb>
<tb> XIII <SEP> 75 <SEP> 0 <SEP> @
<tb> XIV <SEP> '¯. <SEP> ¯. <SEP> 0 <SEP> 103
<tb> XV <SEP> 25 <SEP> 103
<tb> XVI <SEP> 0 <SEP> 254
<tb> XVII <SEP> 25 <SEP> 254
<tb>
1 chlorure de N-(3-chloroallyl)hexaminium (produit d'addition
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hexp.méthylnetétrarine-1 , 3-dichloropropène ) 2 chlorure de N-(2,3-époxyj>ropyl)hoxaminium (produit d'addition hox#r.0hylùnetétramine-épichlorhydrinc) 3 produit d'addition hexanethylenetétramine - bromure de propargyle r produit d'addition hexaunthylLnetétramine-a-ohlorotol.unp .
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The present invention relates to a process and a composition for the preservation of specimens from the animal kingdom. The invention relates more particularly to the preservation of inanimate or dead specimens of the animal kingdom by treatment with the aid of heterocyclic compounds, characterized by the presence of a 1,4-dioxanone nucleus in the molecule and / or the products. hydrolysis of these 1,4-dioxanone ring compounds and quaternary salts of hexamethylenetetramine or mixtures of such salts and of these dioxanone-type compounds.
Numerous compounds were known which could be used for preserving animal specimens. Phenol and formaldehyde are commonly used preservatives for glowing. These compounds are adequate preservatives, but the majority of compounds of this type are malodorous, are very toxic and tend to leave specimens tightly knit in. a rigid state. It has now been found, in the context of the present invention, that the treated of specimens of inanimate animals using 2-para-dioxanone and alkylated derivatives of 2-para-dioxanone, as well as 'Using the hydrolysis products of these compounds, leaves the specimens stored in a flexible and nearly alive state.
In addition, 2-para-dioxanonos and their hydrolysis products are toxic and do not have unpleasant odors.
The term "preservation", as used herein: means that the enzymatic action is stopped in the animal tissue, which prevents the auto-catalytic destruction of that tissue, while the treated tissues resist.
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to external attacks of bacteria and fungi. The expres-
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Zion "specimen, of the animal kingdom": 1 edgnc any partio or 1. ' wholeness of an animal organism. Examples of such organisms include mammals, insects, fish and invertebrates, as well as parts of these animals.
Other examples include human tissue specimens and cadavers.
A class of compounds of value as an active preservative in treatment compositions
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according to the invention is; that of the 6-lactons containing an additional oxygen heteroatone in the nucleus and the hydrolyzed products of these 6, -lactones. An appropriate subclass of these compounds (under non-hydrolyzed form) is that of the compounds which can be represented by the following formula:
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in which the R symbols which may be the same or different
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ferents denote hydrogen, the nethylp group or the ethyl group. As examples of these compounds, we can cite 2-pdioxanono- (1, -dioxan-2-onc :), 3, 5-diai: thyl-1, r-dioXan-2-021c, 3-mcthyl- G-ethyl-1, t-dioxran, n-2-onc, 3, a, G-triMthl-1, .rdioxan-2-onc and 6-methyl-1, -diox.cxn-2-ono.
Cos compounds can also be used as preservatives under their
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acid form or in the form of nelongos in equilibrium with their hydrolysis products.
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Animal tissue specimens can be treated with the active preservative compounds (as -lactones, the acid form of cess-lactones, or mixed balanced mixtures of these-lactones), by various methods, such as immersion, injection or infusion. The 2-p-dioxanones can be used in the form of aqueous solutions at concentrations of 1% to 100% (pure compound) by weight; although the compounds can be mixed with other preservatives (such as formaldehyde). Various solvents for the lactone compounds can be used.
When using 2-p-dioxanone as the active embalming agent, solvents such as water, benzene, tolu'ne, xylene, dioxane, diethyl ether, chloroform, etrahydrofuran, aliphatic alcohols (such as ethanol and i-propanol), ketones (such as acetone), polyols (such as ethylene glycol) and aldehydes can be used.
As the vehicle for impregnating animal tissue specimens, any relatively inert substance which dissolves # -lactone embalming agents can be used. When water is used as a solvent, # -lactone forms a mixture in equilibrium with its hydrolysis products (mainly 2-hydroxyalkoxyalkanoic acid). For specimens that do not require deep penetration, suspensions of the embalming agent can be used. In the case of 2-p-dioxanon and methylated 2-p-dioxanonos which are liquid at about 27 ° C, the compounds can be used without a solvent.
When water is used as a solvent, a balanced mixture is formed which contains predominantly 2-hydroxyalkoxyalkanoic acid with some polymer.
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In these formulas, the symbols R have the meanings given for formula (I). When using very dilute aqueous solutions (containing less than about 10% by weight of the dioxanone-like compound), the lactone is predominantly in the acid form. For convenience, the concentrations are based on the total amount of # -lactn present in the solution, including S-lactonc present in hydrolyzed form. Thus, aqueous preservative solutions are prepared from dioxanone or from the corresponding 2-hydroxyalkoxyalkanoic acid, since in either case a balanced mixture is obtained in the aqueous solution.
When immersion techniques are used to impregnate the specimen with a solution of a 2-p-dioxanone in an appropriate solvent, that specimen is simply placed in a container containing the solution, so that all or a substantial part of the specimen is covered by the solution. The specimen can be kept, permanently, in the container (for example, when glass containers are used for display purposes) or until the specimen
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shall: be used for further analysis or study.
Concentrations of the active 2-p-dioxane-type compound of about 1% to 100% by weight in the treatment solution are suitable. It is usually more economical to use solutions in which the concentration of the active O-lactone is not more than 80% by weight and is preferably between about 10% and 80%.
These same solutions can be used, when injection or infusion techniques are employed to impregnate animal tissue specimens. When using injection techniques, the embalming fluid (as a pure compound or a solution) is introduced into the specimen under pressure, for example using a syringe and a: needle- hypodermic.
When infusion techniques are employed, the embalming fluid is introduced into the circulatory system of the specimen to be stored and this fluid is allowed to diffuse into the rest of the tissue,
In general, amounts of 2-p-dioxanone-like compounds (calibrated for the base of the -lactone form rather than the acid form) of 5% to 50% of the weight of the average specimen being treated are sufficient for the duration of the treatment. conservation of this specimen is between 1 month and an indefinite period.
Impregnation of a specimen with amounts of 2-p-dioxanone compounds of only 10% of the weight of the treated specimen results in substantially permanent preservation,
The amount of embalming material deposited in the specimen may vary, depending on the purpose of use of the specimen. Specimens intended for display should be treated with large amounts of the 2-p-dioxanone-like compound, while specimens which must be dissected within a few days or weeks require a smaller amount.
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do embalming fluid, since the preservation should not be permanent.
An advantage of embalming fluids which contain 2-p-dioxanone or methyl- or ethyl 2-p-dioxanon (and / or the hydrolysis products of these dioxanon-like compounds) as preservative ingredients The active ingredients, compared to other commonly used preservatives, is that the embalming fluids according to the present invention do not cause constriction of the blood vessels at the heart of the infusion process. Moreover, the nervous tissues are not obliterated and can be easily observed after the. processing of the specimen.
# -Lac-type preservatives
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mono tone that their hy .. lysis products (especially 2-p-dioxanonc and 2-hydroxyethoxyactiuù acid) are compatible with polymtGriqucE3 compositions (such as: synthetic latexes), so that a colored polymbrc which also contains an aeent due to preservation can be introduced into the ur 'vs inos and the arteries of the specimen, in a [Jcu10 phasu (rather which, to introduce a colored polymer into the blood vniusMir * apz: the treatment of the specimen by a death throes of c0ru.:c:r "':: - :; i (.).
Oortfiins conposbs ci't \ I ': U.loniuu qua.tcrnl1.i!'. hexa.meth; y'lènctétrll.'i1inc derivatives possess, COI.one or o-itp anti-bo.ct0rionnc action, as described by Scott et al. l: 1nS Journal of Applied Hicrobiology, Vol. 10, n 3, May, 1962, p. 211 and
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following.
Other interesting quaternary ammonium derivatives of thGx "i1.ethyl; '; nGtétre.mi1'1u which contain a 4poX group in the molecule can be obtained by combining hexamethylenetetramine and a 6piha. lohydrinc (such as. 4pibxor.hydri-. ne or epichlorohydrin),
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When a quaternary ammonium salt of hexamethylenetetramine is used as a preservative for an animal specimen, which possesses a fine or coarse circulatory system, the vessels of the circulatory system do not constrict or constrict, although the specimen preserved tends to become rigid, With a conventional embalming fluid for animals, (such as those based on formaldehyde in aqueous solution),
the vessels of the circulatory system constrict and excessive amounts of preservative are required, to achieve sufficient fixation of those parts of the specimen which contain capillary sections of the circulatory system. Although preservatives based on 2-para-dioxanone compounds (and hydrolysis products of these compounds) do not cause constriction of the circulatory vessels, the cellular constituents of animal tissues are not fixed. and the cells of these tissues therefore tend to lose their identity. When this happens, histological examinations of cell structure under a microscope become imprecise.
When the quaternary sols of hexamethylene tetramine and the compounds of the 2-para-dioxa-nono type (or their hydrolysis products) are combined, it is found that the preservative composition obtained maintains the cellular structure. The surface of the specimen is intact, does not constrict the vessels of the circulatory networks and provides a specimen which remains flexible and almost alive.
Thus, when stiffness is not a problem, but when it is necessary to fix the cellular structure of the specimen, the use of the quaternary ammonium salts of hexamethylenetetramine without a 2-para compound. dioxanone is sufficient. If flexibility is necessary or desirable, then
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. use of compounds of the type 2-para-dioxanone or their hydrolysis products, together with the quaternary compounds. Moreover, the use of the preservative compositions according to the invention is not related to the unpleasant odors which are encountered when using formaldehyde.
The preferred subclass of quaternium ammonium salts of hexamethylenetetramine is that of compounds of the formula:
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wherein x and y each denote an integer of 1 or 2 (when x and y = 1, (III) an adduct, molar 1: 1), A is a halogenated organic group containing 1 to 20 carbon atoms , bone, such as 3-chloro-1-propene, epichlorohydrin, epibromhydrin, propargyl bromide, propargyl chloride, [alpha] -chlorotoluene, methyl bromide, methyl chloride and polyglycol bis (2-hydroxy-3-chloropropoxy) compounds
such as
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Since the function of group A is to provide relatively slow decomposition of the hexamethylenetatramine moiety, any organic group A capable of forming a quaternary ammonium salt is suitable. Thus, adducts formed by the reaction of two compounds of an epihalohydrin and of a mole of a polyalkylene glycol such as those of formula:
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wherein X is halogen such as Br or Cl and n is 1 to 10, and 1,3-dichloropropene can be used.
Quaternary ammonium salts of hexamethyleneteramino are prepared by mixing substantially stoichiometric (usually equimolar) amounts of hexamethyleneteramine and the appropriate complexing agent by known methods. Many other suitable quaternary compounds are described by Scott et al., In the publication cited above.
The hydrolysis products of 2-pdioxanone compounds can also be used in the form of their salts, especially the alkali netal salts (Na, K for example) and the alkali earth metal salts (Ca, Ba, etc.) . A preferred embodiment of the invention consists in neutralizing a mixture of the quaternary salt and an aqueous solution of 2-para-dioxanone, using a conventional base (NaOH, KOH, Ca (OH) 2, NaHCO3, Na3PO4, Na2CO3, etc).
The neutralized composition (pH 7.0 to 7.5) thus essentially contains the quaternary ammonium salt of hexamethylenetetramine and the alkali metal or alkaline earth metal salts of 2-hydro-xyuthoxy acetic acid.
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It is believed that the quaternary ammonium salts or hexamethylenetetramine slowly release formaldehyde in the impregnated specimen, but without causing constriction of the specimen's circulatory vessels and without giving off the typical smell of formaldehyde. This property makes it possible to use much smaller amounts of quaternary ammonium salts of hexamethylenetetramine than those which are necessary with conventional embalming fluids.
Thus, (3.78 liters of a 10% (by weight) solution of a quaternary ammonium salt of hexamethylenetetramine gives the same degree of fixation (preservative action) as 18.9 liters of a 10% by weight formalin solution
The ratio of the quaternary ammonium salt to the dioxanone-like compound (or hydrolysis product) in the treatment composition can vary between about 1: 150 to 50: 1, when the total amount of the combined ingredients is about 0.5 to 100% by weight (preferably 10 to 50 based on the total weight of the treatment composition. For convenience, the weights of the hydrolysis product (and salts thereof) of
2-p-dioxanonec are based on the equivalent weight of 2-para-dioxanones that these products theoretically form.
When using quaternary salts of hexamethylenetetramine without 2-para-dioxanone compounds (or derivatives of these compounds), amounts from about 0.5 by weight to about 50% by weight (based on total weight of the treatment composition) can be used. Good results are obtained when the treatment mixture consists essentially of a mixture of quaternary ammonium salt and of substantially pure - type 2-para-dioxanone compound.
When small amounts (up to about 5 to 20% by weight) of water are present
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in the treatment compositions a balanced mixture of the hydrolysis products is formed. Although this is not necessary, it is preferable to adjust the pH of the mixture to a value between 6 and 7.5, when using water as a solvent. With non-aqueous vehicles or solvents, no pH adjustment is normally done. Conventional humectants, such as ethylene glycol, liquid polyethylene glycols and glycerin, can also be included in embalming compositions.
The novel preservative compositions according to the invention are also compatible with other conventional addition materials used in the art of embalming.
Specimens from the animal kingdom which are impregnated with the compositions according to the invention can be treated by immersion, infusion or injection techniques. The particular method of treatment used will depend on the nature of the tissue and the purpose for which that tissue is to be stored. For animals with coarse circulatory systems, the infusion of the preservative compositions into the circulatory system is very satisfactory. When small sections of organs or other tissues must be preserved, immersion techniques are usually sufficient. Injection techniques can be used for the preservation of muscle tissue or bone.
The treatment compositions can be stored or transported in concentrated form and diluted with water or another suitable solvent (such as alcohols, glycols, dioxane or liquid hydrocarbons) having use.
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EXAMPLE I.
Liver specimens were taken from a freshly killed rabbit and placed in 5, 10, 25.50 and 100% by weight aqueous solutions of 2-p-dioxanone. These liver specimens showed no evidence of putrefaction and remained tender and pliable after 60 days of storage. When stored with formaldehyde solutions, liver tissues lose elasticity after about 2 days of storage. EXAMPLE II.
Mice were sacrificed and opened by the following incision: a central line. They were then trenpated in 60, 80 and 100% by weight aqueous solutions of 2-p-dioxanone and in 1, 5, 10, 20, 40, 60 and 80% by weight solutions of 2-p-. dioxanone in 4% neutral buffered formaldehyde solution: All animals were kept and those treated with 60 and 80% by weight solutions of 2-p-dioxanone in formalin cont remained softer and more collapsible specimens stored with standard formalin solutions containing about 5-10% formalin and no 2-p-dioxanone.
EXAMPLE III.
The hind legs of sacrificed dogs have been. infused with 80% and 60 by weight aqueous solutions of 2-p-dioxanone. The legs were stored in a 33% aqueous solution of dioxanone. They remained soft and pliable, while being well preserved. No trace of deterioration or loss of flexibility was observed after storage for 10 months.
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EXAMPLE IV.
A dog heart was infused with a 50% by weight solution of 2-p-dioxanone in acrylate latex. The composition of the latex, prior to the addition of sufficient 2-p-dioxanone to form a 50% solution was 46% by weight suspended solids in water. The solids in suspension consisted of a copolymer of 2 parts by weight of ethyl acrylate per part of methyl acrylate. The core was stored in a 60% by weight aqueous solution of 2-p-dioxanone. .
The corur was well preserved while remaining soft and pliable and retaining the natural color of the heart muscle, for 10, nois, without any
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sign of deterioration. # # ##, EXAMPLE V.
A cadaver limb (forearm) was infused with an aqueous solution containing 25% by weight of 2-para-dioxanone and
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5 / s by weight of N- (3.chloroa.llyl) hexaminium chloride (amrloYliu salt;:. Quaternary formed by the reaction of 1 mole of hexanethylbnetetranine and 1 mole of 1, 3-dichloropropcne). The infusion was made by inserting a needle into the main artery and pushing the solution back under pressure through the tissue until it returned through the venous system.
The infused number was stored at room temperature in cheesecloth for 2 months and was found to keep well during this time. Only very slight discoloration of the skin and tissue was observed. The limb remained pliable and almost alive. The connective tissue was not damaged and the fatty tissue remained tender and natural, both in appearance and texture. The skin could be easily separated from the connective tissue and was tender and
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foldable; The nerves were visible and may also have been sheared apart.
The blood vessels had not been constrained and remained flexible, while maintaining a lively appearance. No putrefaction or unpleasant odor arose.
EXELIPLES VI-XVI.
Fractions of mouse liver, mouse kidney and rabbit liver specimens were each soaked in various aqueous solutions containing 2-para-dioxane and / or quaternary salts of hexamethylenetetramine. Samples were kept covered with processing solutions and observed for two weeks. All the samples preserved well. All the samples except that of Example XIII (2-para-dioxanone without quaternary salt) allowed the cellular details to be observed, in the same way as with sections of frozen tissue. Cellular detail under the microscope occurred with the sample from Example XIII.
The concentration and composition of the solutions used are shown in Table I. All weights are given in percent based on the total weight of the treatment composition. In Examples XIV-XVII, sections of fresh rabbit liver measuring 2.54 cm x 2.54 cm x 0.95 cm were soaked in the aqueous solution of the preservative. The fabric is well preserved, remaining firm and not undergoing any degradation.
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TABLE 1.
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<tb>
<tb>
% <SEP> in <SEP> weight <SEP>% <SEP> in <SEP> weight <SEP> of <SEP> sel
<tb> Example <SEP> of <SEP> 2-para- <SEP> of quaternary ammonium <SEP>
<tb>
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Td hexam6ethylbnetetramine dioxanone.
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<tb>
<tb>
VI <SEP> 75 <SEP> 101
<tb> VII <SEP> 75 <SEP> 102
<tb> VIII <SEP> 50 <SEP> 11
<tb> IX <SEP> 37.5 <SEP> 51
<tb> X <SEP> 25 <SEP> 101
<tb> XI <SEP> 12.5 <SEP> 101
<tb> XII <SEP> 12.5 <SEP> 11
<tb>
<tb> XIII <SEP> 75 <SEP> 0 <SEP> @
<tb> XIV <SEP> '¯. <SEP> ¯. <SEP> 0 <SEP> 103
<tb> XV <SEP> 25 <SEP> 103
<tb> XVI <SEP> 0 <SEP> 254
<tb> XVII <SEP> 25 <SEP> 254
<tb>
1 N- (3-chloroallyl) hexaminium chloride (adduct
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hexp.methylnetetrarin-1, 3-dichloropropene) 2 N- (2,3-epoxyj> ropyl) hoxaminium chloride (adduct hox # r.0ethylùnetetetramine-epichlorhydrinc) 3 adduct hexanethylenetetramine - propargyl bromide r product addition hexaunthylLnetetramine-a-ohlorotol.unp.