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"Procédé de préparation d'un virus induisant la formation d'un is- terlttrontt.
Un virus induisant la formation, d'un interférons qui sera appelé ci-dessous virus "interférant", est un virus modifié de manière que si on le met en contact avec des cellules sensi- blés, le virus interférant pénètre dans la cellule, ne s'y dirise pas, mais empêche la multiplication d'un virus virulent dans cette cellule, un peut se rapporter a l'article de sehlesinger dans .Viral and Rickettsial Infections of man", paea 161 à 171
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(publié par J.B. Lippincott Co. (1952) où l'on trouve un exposé plus complet concernant l'effet et l'utilisation du virus inter- férant.
Antérieurement à la présente invention, le virus in- terférant était préparé en exposant le virus infectant à l'irra- diation ultraviolette sous de petits volumes (par exemple 5 à
20 al) dans une boîte de Pétri ou un autre récipient semblable, peu profond, ou en exposant le virus infectant, en quantités qui tiendraient dans un tube à essai, à la chaleur. Ces deux procédés relevant de la technique antérieure présentaient le sérieux de- savantabe d'être utilisables seulement pour dé petits volumes de virus infectant, Par conséquent, antérieurement a la présente invention,
il n'y avait pas de procédé industriellement utili- sable pour la préparation du virus Interférant en landes quan- titées. En outre, du fuit de la sensibilité du virus au traite- ment par la lumière ultraviolette ou à la chaleur, un\' telle production à grande échelle n'était pas considérée comme possi- ble.
Par conséquent, la présente invention a pour but de proposer un procédé de production du virus interférant à grande échelle, en quantités industrielles.
Un autre out de la présente invention consiste à proposer un procédé continu de préparution du virus interférant.
Ces buts sont atteints par le procédé selon la pré- tante invention qui comprend fondamentalement l'opération consis- tant a faire passer de manière continue une suspension aqueuse du virus infectant par un tube de quarts en hélice contenant axialement une source de lumière ultraviolette.
Le virus infectant utilisé a la préparation du virus interférant selon la présente invention peut être obtenu a partir d'un certain nomore de virus, comme on le sait dans cette technique. Une des sources d'un tel virus est le virus de la
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grippe, 1-armi les autres virus utilisables à cet effet on trotta les suivants:le virus de la maladie de Hewcestle, le virus des oreillons, la virus de la pneumonie ues souris, le virus de Ilencéll;
alom,yêlitat4uine de l'xat, le virus de l'encéphalite 4,6 ôaint-louia, le vis ,.e la Bencépiialite japonaise, la virus 4e la fièvre jeuae, le virus de la dencue (fièvre rouge), Ht virus du Nil occidental, la virus de la poliomyélite le virus de ioxeucklee le virus 'lhoile Cf.0 VII, le virus de 1 ' encépnalôayoààr dite, le virus ue la corjunémiObite 3,yiapnocytiquet le virus de la. st.oadtitf veaieuluiz e# le vira... de la varicelle, le virus vacci- nal, las virus de la Pei v14 et le virus du papillome de oiiope.
..ntér.euxaaut au pussae du virus par le -tube dot quartz, le virus infectant est suspendu dans un aâlit 4qd*u** ai le virus infeetz-nt a été inocule et a été incube dans une
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matière organique, telle que les oeufs de poule eaoryonoés, 14# ¯¯ liquide vitellin contenant le virus infectant peut être utilitté comme tel en tant quemilieu. àieni ce cage le liquide vitellid est u'abord soumis ci la dialyse à travers une meaorane temipera.a, telle qu'une membrane di,.Iàaa7ate de iiskiii6e pour éliminer les matières étrangère*; dsa.t,, a:.u3,es, t absorbant le reâ.4w ultra- violets. La dialyse jout être effectuée contre une solution sali- ne tampon, telle qu'une isauature tampon de >orenèju' avec un pH 7,2.
Le fluide vitellin uuteilu, contenant le virus infec- tant, peut alors Stre turuinu ou filtre, sa on 1 désire, pour él.Lluiner lën pa.:ticulu- solides ventue-les. .e tujroinabe peut être effectué u. environ levuv tim jusqu'à environ 2*UUU tpa (et, de préférence a environ 4.u,u tpst) pendant en.v.r 5 à a "Il Ir t ro4 environ du m-nutes (et, Je préférence ],,enuant/J.Lu minutra;.
Le flu.4.je surna3,aant, contenant le virus in,ecttai'!^G, 6;4 alors 4.men: passer liai- une .., --lice de tubulure ae qu6ïtâ. Lai
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tubulure a de préférence un diamètre interne d'environ 1 suc à environ 3 ans (et, de préférence, u1 environ d. nua) et un diamè- tre externe .;,'C;r.Vi.1vlJ :> .1. à environ > tnm (et, de préférence ..'environ 4, mm). Une source de lumière ultraviolette, cIeLt- à-dire d'une lumière ayant une longueur d'onde a"envirun 31 la. environ i:/.75j AO, ebt d.st.u.e l.1x.L....lt.:J.<:nt dans l'nclice. pratique, il a été trouvé qu'une luu..e ultraviolette ie huit watts, passant IJnltuaJ.n...11:tn uuxvant l'uxe de l'hélxce, redt préférable.
Un tel tuue ultraviolet émet #nvj.i-on 17 u.x,Cruwutt8 d'intensité ultra Violattt i4 cc:r:4xn:t,ze carré a une lonbueur. d'onde de J..:.Ó7 A* a une uJ.;..tiJ.nco d'un uetro du tuus.
Le iJ!J.8ÌJ...e (tu virus l.n.1'cctl.:lnt l:!.1" rël,: de maniésa que conque centi,4,dti-e carr du ,4.Llieu contenant le virus infec- tant tsuaisse une exuitJ.un totale d'environ 5.uuu a environ ll.ûuû ers d'irradiation ultiwxulette (de préférence environ lv.v(...v erz;s/cm). àa dl Lri-,dtatiun suuse est d'impor- tance critique puisque si elle art uenaiulemeat inférieure à 5.GJu erc,s/c,2. le virus virulent suotâute après le traitement et, 81 elle est SeT151U.Gl4calt V..I!;d'Ü-Ure à 20.uu erbs/C1I1, une partie .u virus est détruite ae Unlere lue l'efficacité du virus interférant ;:,e tL'vU le dimiiluut. m l'on utilise une source de lumière ultraviolette de huit watts et si la suapensaùn pusse a un pouce de la source, dans ce cus, pour assurer lu Lrastement convenaule, on r,le le u-'-t,st de lu :...u::>Yf1:
...I.Vll du virus infec- tant i.t environ l,b jusqu'à environ 1,:1 litre par heure (et, de préférence, à envix-ja ï,.r litre par h ure)t --1,.e virus inteivérans. est l.1ÜU'b recueilli en turuinant le milieu aqueux. Le tur'.Ll1ut.e peut être effectué a une vitesse d'environ 1, UuU tpiu et h un Qe,,:l.t d'envuon u,4 li tre/ heure ou, de préféren.-e, ù la v.teau d.'env.I.¯un ;1v.UUU tpta et a un déoit alenvii-on 1,; litrt pur heure. La pelote de virus concen- tré peut alors être ra :,: H'!ldû. dans une saumure .tu!ù1)\,n. telle que cella qui a été an u *6 rlus haut, de préférence uirG cuu-
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centration cent fui±. plu.. forte que celle du niveau initialement utilisé.
La nouvelle auspeûsxoa peut alors être turbinée à 2.000 tpm et le liquide eurna6eant, contenant le virus interférant, peut être traité pir un ngent de conservation, tel que lé mer- thionate.
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Le procéda selon la présente invention permet une. production continua de , ruades quantités de virus Interférant et
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constitue donc un procédé inam-trielleaent applicable de pfépa- ration de cette importante auoatance.
Àilexemple qui suit illustre le procédé selon l'iaven-
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tion.
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r:.CL..NL La souche m-u, du type A du virus de la grippe, est inoculée à des 0 :U1'8 de poule o:arryonnés, à une dilution de 1 x .U ..4 L8 oeufs sont incubés à 36 C pendant 4S à 72 heures. un refroidit les veufs et l'un recueille des oeufs le fluide vl- tellin, contenant le v..ru infectant, sous un titre de 2*000 à 4.(ruG ulitéu d'awblutiUùt...lvn ue ce, Iules routes du ,;aAc8; du poulet (Iii.,U) pur SlIJ.llil1 tre. u ouapen6ion de fluide vitellin est alors dialysée u travers une zeu&LI-4âne (Le umlyae Visin contre un volum do foie plu.: 4rnd de Sé1U",UI'8 tatipun de oorensena A V1W>, tout pi 7, punuant 40 7 heures. La suspension de virus dans le fluiae vitellin dialyse est soumise au turbinage a 2,000 tpa pendant l, minuteb pour 4.à.n¯r les solides ..:trIiUoera.
.Le fluide surnageant, cunieutotle virus infectant, est pompe pur une pompe ....iQltlú '....<;) ou une uucre pompe k proportion, pur un tube de "verre" ue quartz (diamètre interne 2 ma* 41"'- tre externe 4., mu) en ser±.enti...-n de lo spires, les spires du seI'..ent,.....n ; 1 espi.Ioc;tt.nt u 1 enVJ,L'on 1,1 ca. Le serpentin est fixe en pobitati a un p-wuce de lu surface d'une lampe ultraviolette de nuit watts. du type G-bT, quî pusse lon,itud.ttr3,oaet par
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l'axe de l'hélice, e tube ultraviolet émet 2u à 4U microwatte d'intensité ultraviolette/cm sous une longueur d'onde de e*537 A à un mètre de la source* de dédit de la suspension du virus infectant passant dans le serpentin de quurtz est de 1,86 litre par heure.
Le virus interférant, est recueilli dans une turbine
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de charpies fonctionnant .et ..JÙ\.JVV tpm sous un débit de 1,2 litres heure. Lu pelote de V..Lt'Ut> concentré est resuspendue, dans un Volume valant 1/lbuème du volume de la suspension ae virus initiale, de saumure tampon de orenü6ns ,J1 à pu ?ge. Un laisse la suspension sedimenter sous l'effet de la pesanteur
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jusqu'au lendemain à 4 C, on la turbine ex ..Ovv tpin pendant dix minutes et le liquiae surnageant, contenant le virus interférant,
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est recueilli. Un ajoute le à-ertalolute au liquide surnageant à un niveau de 2ú mct;/ml.
Le procédé elon l'exemple permet la transformation du virus infectant en virus interférant sous un dewit u1 environ *litres en i7 heures. Hn outre, des teetu effectués dans des oeufs eubryonnés revoient que le virus interférant produit est dépourvu de virus infectant. la présente invention peut être réalisée autrement de diverses manière, dans le domaine des revendications annexées,
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1S"..#irltJ.i V.i114W d.
1. irooeuf continu ae préparation de YJ.rus induisant la formation d'-nterferon, caractérisé par l'opération conssm- tant a faire passer une suspension aqueuse de virus infectant
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par une tuoulure de t,uartz for00 en hélice, contenant axialement une source de lumière ultraviolette.
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A method of preparing a virus which induces the formation of an isterltrera.
A virus which induces the formation of an interferon which will hereinafter be referred to as an "interfering" virus, is a virus modified so that, if brought into contact with sensitive cells, the interfering virus enters the cell, does not. not say so, but prevents the multiplication of a virulent virus in this cell, one can refer to the article of sehlesinger in .Viral and Rickettsial Infections of man ", paea 161 to 171
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(published by J.B. Lippincott Co. (1952) where there is a more complete discussion of the effect and use of the interfering virus.
Prior to the present invention, the interfering virus was prepared by exposing the infecting virus to ultraviolet irradiation in small volumes (eg 5 to.
Al) in a Petri dish or other similar container, shallow, or by exposing the infecting virus, in amounts which would fit in a test tube, to heat. These two prior art methods had the demonstrable seriousness of being usable only for small volumes of infecting virus. Therefore, prior to the present invention,
there was no industrially useful process for the preparation of interfering virus in large heathlands. Further, due to the susceptibility of the virus to treatment with ultraviolet light or heat, such large scale production was not considered possible.
Therefore, the present invention aims to provide a method for producing the interfering virus on a large scale, in industrial quantities.
Another feature of the present invention is to provide a continuous process for preparing the interfering virus.
These objects are achieved by the method according to the present invention which basically comprises the step of continuously passing an aqueous suspension of the infecting virus through a helical quarter tube axially containing a source of ultraviolet light.
The infecting virus used in the preparation of the interfering virus according to the present invention can be obtained from a certain number of viruses, as is known in this technique. One of the sources of such a virus is the
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influenza, 1-among the other viruses which can be used for this purpose, the following are trotted: Hewcestle's disease virus, mumps virus, mouse pneumonia virus, Ilencell virus;
alom, yêlitat4uine de l'xat, the encephalitis virus 4,6 ôaint-louia, the screw, .e the Japanese Bencepiialitis, the virus 4e the fever gameae, the dencue virus (red fever), Ht virus West Nile, poliomyelitis virus ioxeucklee virus Cf.0 VII virus, so-called encephaloid virus, corjuneemia virus 3, apnocytic and la virus. st.oadtitf veaieuluiz e # le vira ... chickenpox, vaccine virus, Pei virus v14 and oiiope papilloma virus.
..enter.euxaaut to the virus pussae through the dot quartz tube, the infecting virus is suspended in an alit 4qd * u ** ai the infeetz-nt virus has been inoculated and was incubated in a
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organic material, such as eaoryonated chicken eggs, 14 # ¯¯ yolk fluid containing the infecting virus can be used as such as a medium. In this cage the vitellid liquid is first subjected to dialysis through a temipera.a meaorane, such as an iiskiii6e di, .Iàaa7ate membrane to remove foreign matter *; dsa.t ,, a: .u3, es, t absorbing ultraviolet rays. The dialysis can be carried out against a buffered saline solution, such as a buffer of> oreneju 'with a pH 7.2.
The uuteilu yolk fluid, containing the infecting virus, can then be stre turuinu or filtered, as desired, to elute the particulate matter. .e tujroinabe can be performed u. about levuv tim up to about 2 * UUU tpa (and, preferably about 4.u, u tpst) for about 5 to 4 minutes (and, I preferably] ,, enuant / J. Lu minutra ;.
The flu.4.je surna3, aant, containing the virus in, ecttai '! ^ G, 6; 4 then 4.men: pass through a .., --lice of tubing ae qu6ïtâ. Lai
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The tubing preferably has an internal diameter of about 1 juice to about 3 years (and, preferably, about u1 d. nua) and an outer diameter.;, 'C; r.Vi.1vlJ:> .1. at about> tnm (and preferably about 4, mm). A source of ultraviolet light, that is to say light having a wavelength of about 1: /. 75j AO, ebt d.st.ue l.1x.L .... lt.:J.<:nt in the practical nclice, it was found that an ultraviolet light ie eight watts, passing IJnltuaJ.n ... 11: tn uuxvant the luxury of the helix, preferable redt.
Such an ultraviolet light emits # nvj.i-on 17 u.x, Cruwutt8 of intensity ultra Violattt i4 cc: r: 4xn: t, ze square has a length. wave of J ..:. Ó7 A * has a uJ.; .. tiJ.nco of a uetro of the tuus.
The iJ! J.8ÌJ ... e (you virus ln1'cctl.: Lnt l:!. 1 "real ,: so that conque centi, 4, dti-e square du, 4.The place containing the infected virus - as long as you leave a total output of about 5.uuu to about ll.ûuû ers of ultiwxulette irradiation (preferably about lv.v (... v erz; s / cm). àa dl Lri-, dtatiun suuse is of critical importance since if it has an uenaiulemeat less than 5.GJu erc, s / c, 2. the virulent virus subsides after the treatment and, 81 it is SeT151U.Gl4calt V..I!; d'Ü- Ure at 20.uu erbs / C1I1, part of the virus is destroyed ae Unlere read the effectiveness of the interfering virus ;:, and the dimiiluut. M we use an eight watt ultraviolet light source and if the suapensaùn pusse has an inch from the source, in this cus, to ensure read Lrastement convenaule, we r, le le u -'- t, st de lu: ... u ::> Yf1:
... I.Vll of the virus infec- ting from about 1, b to about 1,: 1 liter per hour (and, preferably, at approxix-ja ï, .r liter per hour) t --1 , .e inteiverans virus. is l.1ÜU'b collected by steaming the aqueous medium. The tur'.Ll1ut.e can be carried out at a speed of about 1, UuU tpiu and h a Qe ,,: lt of about u, 4 liters / hour or, preferably, at v. teau d.'env.I.¯un; 1v.UUU tpta and has a deoit alenvii-on 1 ,; pure hour litrt. The bundle of concentrated virus can then be ra:,: H '! Ldû. in brine .tu! ù1) \, n. such as cella which has been an u * 6 rlus high, preferably uirG cuu-
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centration cent fui ±. stronger than that of the level initially used.
The new auspexo can then be turbined at 2,000 rpm and the Eurasian liquid, containing the interfering virus, can be treated with a preservative, such as merthionate.
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The process according to the present invention allows a. continued production of large amounts of Interfering virus and
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therefore constitutes an inam-trielleaent applicable method of pfépa- ration of this important auoatance.
The following example illustrates the process according to the iaven
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tion.
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r: .CL..NL The mu strain, type A of the influenza virus, is inoculated with 0: U1'8 o: arryonated hens, at a dilution of 1 x .U. 4 L8 eggs are incubated at 36 C for 4S to 72 hours. one cools the widowers and one collects from the eggs the vl- tellin fluid, containing the infecting v..ru, under a titer of 2 * 000 to 4. (ruG ulitéu of awblutiUùt ... lvn ue ce, Iules routes du,; aAc8; pure chicken (Iii., U) SlIJ.llil1 tre. uapen6ion of yolk fluid is then dialyzed through a zeu & LI-4âne (The umlyae Visin against a volume of liver plus: 4rnd of Sé1U ", UI'8 tatipun de oorensena A V1W>, all pi 7, puncturing 40 7 hours The virus suspension in the dialyzed yolk fluid is subjected to turbining at 2,000 tpa for l, minuteb to 4.n¯r the solids. .: trIiUoera.
The supernatant fluid, cunieutotle infecting virus, is pumped for a pump .... iQltlú '.... <;) or a sugar pump k proportion, for a tube of "glass" of quartz (internal diameter 2 ma * 41 "'- being external 4., mu) in ser ± .enti ...- n of lo turns, the turns of the seI' .. ent, ..... n; 1 espi.Ioc; tt.nt u 1 enVJ, L'on 1.1 ca. The coil is fixed in pobitati to a p-wuce the surface of a watt night ultraviolet lamp. of the type G-bT, which pusse lon, itud.ttr3, oaet by
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the axis of the helix, the ultraviolet tube emits 2u to 4U microwatte of ultraviolet intensity / cm under a wavelength of e * 537 A at one meter from the source * of the suspension of the infecting virus passing through the quurtz coil is 1.86 liters per hour.
The interfering virus is collected in a turbine
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of linting systems operating .and ..JÙ \ .JVV rpm at a flow rate of 1.2 liters per hour. The concentrated V..Lt'Ut> ball is resuspended, in a volume equal to 1 / lb of the volume of the initial virus suspension, of orenü6ns buffer brine, J1 to pu? Age. One leaves the suspension to settle under the effect of gravity
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overnight at 4 C, the turbine is ex ..Ovv tpin for ten minutes and the supernatant liquiae, containing the interfering virus,
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is collected. A-ertalolute is added to the supernatant at a level of 2 u mct / ml.
The method according to the example allows the transformation of the infecting virus into the interfering virus under a dewit of about * liters in 17 hours. In addition, tests performed in eubryonated eggs show that the interfering virus produced is devoid of infecting virus. the present invention can be further realized in various ways, within the scope of the appended claims,
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1. Continuous injection of a preparation of YJ.rus inducing the formation of-nterferon, characterized by the operation consisting in passing an aqueous suspension of infecting virus
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by a tuoulure of t, uartz for00 in a helix, axially containing a source of ultraviolet light.
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