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La présente invention concerne, de manière géné-i rale, des procédés pour obtenir des antibiotiques à partir de solutions brutes de ceux-ci. Plus particulièrement, elle concerne de nouveaux procédés améliorés pour écupé- rer et concentrer des antibiotiques à partir de bouillons de fermentation contenant des antibiotiques élaborés, des myceliums de microorganismes et des milieux nutritifs appropriés.
Précédemment, l'isolement et la séparation d'antibiotiques à partir de bouillons de fermentation, avaient dans lesquels-les antibiotiques . /. été élaborés, se faisaient par des processus d'extraction par des solvants et dtéchange ionique, qui impliquaient le traitement de bouillons récoltés filtrés ou non.
La présente invention concerne, de manière gé- nérale, une nouvelle technique pour isoler des antibioti- ques, qui ont été produits par des processus de fermenta- tion.
L'invention a pour objet un nouveau procédé perfectionné pour la séparation et la purification d'an- tibiotiques à partir de bouillons de fermentation dans lesquels ces antibiotiques ont été élaborés.
L'invention a encore pour objet un procédé pour l'isolement d'antibiotiques avec des rendements élevés.
L'invention a aussi pour objet un procédé com- mercialement applicable pour récupérer l'activité anti- biotique de bouillons de fermentation dans lesquels ces antibiotiques sont élaborés.
@
D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description détaillée sui- vante. @
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Il a été constaté à présent que des antibioti- ques peuvent être isolés des bouillons de fermentation, concurremment/ dans lesquels ils sont élabores,/avec la fermentation.
En d'autres termes, le processus d'isolement peut être exécuté pendant l'élaboration de l'antibiotique. Ceci se fait en ajoutant la résine d'échange ionique choisie au bouillon de fermentation et en permettant à la fermenta- tion de se poursuivre pendant un certain temps après l'ad- dition de la résine.
La caractéristique surprenante de la présente invention réside, en plus de la facilité opératoire accrue et de l'économie de temps et d'équipement, dans les ren- dements accrus obtenus en suivant la pratique de la pré- sente invention. On a constaté que les rendements sont augmentés d'environ 25 % par rapport aux rendements ob- tenus si l'adsorption est exécutée sur du bouillon récol- té. Cette augmentation de rendement est produite en exé- cutant la fermentation en présence d'une résine échan- geuse d'ions, qui adsorbe l'antibiotique à mesure qu'il est élaboré. Une nouvelle augmentation du rendement est obtenue en supprimant le stade de filtration du bouillon de fermentation avant traitement ultérieur.
Au surplus, l'adsorption par la résine est accouplée plus efficace- ment en appliquant ce processus à cause des temps de con- tact plus longs entre le bouillon et la résine qui résul- tent de l'adsorption pendant la fermentation. Un autre avantage du procédé suivant l'invention résidé dans le fait que la fermenur lui-même est utilisé comme endroit d'adsorption, ce qui élimine la nécessité de transférer. le bouillon de fermentation dans un autre récipient pour la mise en contact avec la résine.
Les possibilités les plus complètes de la pré- sente invention peuvent être réalisées avec un antibioti-,
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que instable, tel que la pénicilline, l'adsorption de l'antibiotique au fur et à mesure de sa formation ayant pour effet de l'extraire de la solution dans laquelle il est instable et sujet à l'action dégradante d'agents chimiques et enzymatiques.
Pour l'utilisation efficace du procédé suivant la présente invention, il est essentiel que la résine échangeuse d'ions soit ajoutée au bouillon de fermenta- tion à un moment tel que la fermentation du bouillon puisse se poursuivre en présence de la résine. La rési- ne peut être ajoutée soit dès le début de la fermenta- tion, soit plus tard, par exemple une heure avant le temps de récolte du bouillon de fermentation. Le mini- mum d'une heure est le temps qui s'est avéré nécessaire pour obtenir une récupération substantielle de l'activité antibiotique contenue dans le bouillon de fermentation.
Dans une forme d'exécution préférée de la présente in- vention, la résine d'échange ionique doit être ajoutée à un moment compris entre 48 heures environ après le début de la fermentation et 24 heures environ avant la récolte du bouillon de fermentation.
La résine peut être ajoutée au bouillon de fer- mentation en n'importe quelle concentration désirée, de préférence à des concentrations comprises entre environ 1% en volume et environ 5 % en volume, en fonction prin- cipalement de la concentration en activité antibiotique élaborée dans le bouillon.
La caractéristique nouvelle et unique du pro- cédé suivant l'invention réside dans le fait que la ré- sine échangeuse d'ions est ajoutée pendant la fermenta- tion, cette dernière étant alors poursuivie en présence de..la résine. Certains milieux de fermentation pour la
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production d'antibiotiques sont cependant sensibles à une contamination par des microorganismes étrangers. Ces derniers microorganismes peuvent même aller jusqu'à pro- voquer la perte complète du rendement du produit de fer- mentation désiré, comme cela est le cas pour la pénicil- line. Il est par conséquent souhaitable de stériliser - la résine échangeuse d'ions avant de l'introduire dans' ... l'appareil de fermentation. Cette stérilisation peut s'effectuer en traitant la résine par de la chaleur ou de la vapeur.
Cependant, si la résine est instable en présence de chaleur, l'emploi d'un antiseptique, tel que l'alcool aqueux, est recommandé.
Après adsorption, la résine échangeuse d'ions avec l'antibiotique adsorbé sur elle peut être soumise aux techniques usuelles pour ltisolement de l'antibioti- que. Le bouillon de fermentation et la résine peuvent être séparés par exemple par tamisage. Là résine ainsi séparée peut être lavée pour en éliminer les traces de mycelia ou d'impuretés chimiques non absorbées, après quoi elle peut être éluée à l'aide d'une solution ayant la faculté d'éluer de la résine toute activité antibioti- que adsorbée sur celle-ci. L'éluat peut être soumis à un certain nombre de @ de traitements appropriés, par exemple @ des cristallisations ou des extractions par solvants, en vue de récupérer l'antibiotique pur de 'éluat.
La résine ainsi débarrassée de l'activité an- tibiotique peut alors être régénérée par traitement à l'aide d'une solution de régénération appropriée, après quoi elle peut être utilisée à nouveau pour l'aosorption d'antibiotique; ou bien de la résine fraîche peut être ajoutée avec la résine régénérée dans l'appareil de fer- mentation, si on le désire. Le bouillon épuisé peut être
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remis en contact avec de la résine fraîche ou régénérée et à nouveau séparé de la manière décrite plus haut.
L'invention sera décrite à présent plus en dé- tails, en utilisant de la novobiocine comme antibiotique, pour la facilité de l'exposé.
Les résines échangeuses d'ions qui conviennent pour la mise en oeuvre du procédé suivant la présente in- vention, dans le cas de la novobiocine, sont des résines sous forme de particules de la classe des résines échan- geuses d'anions azotées, polymères et fortement basiques.
Il s'agit ordinairement de résines dans lesquelles des groupes ammonium quaternaires sont attachés à un système' styrène-divinylbenzène. Comme résines de ce type, on peut citer à titre d'exemples les résines "Dowex" four- nies/par la société Dow Chemical Co., Midland, Mich., no- tamment le "Dowex 1-X2", le "Dowex 1-X4", et le "Dowex 2-X4"; les résines "Amberlite" fournies par la société Rohm & Hass Co, Philadelphie, Pa., notamment "Amberlite
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IRA-400", lt trAmberlite IRA-401" et l'Amberlite XE-9't; ainsi que les résines "Dusolite", fournies par la société Chemical Process Co., Redwood City, Californie, notam- ment le "Duolite A-40", l" "Duolite A-101" et le. "Duolitq A-102".
Bien que les résines mentionnées ci-avant aient été citées comme des exemples illustratifs des résines échangeuses d'ions qui peuvent être utilisées pour l'ab- sorption de novobiocine, d'autres résines échangeuses ,d'ions du type fortement basique peuvent également être utilisées.
,Les spécialistes comprendront que d'autres antibiotiques peuvent exiger d'autres types de résines échangeuses d'ions. Ainsi, alors que la pénicilline G, un autre antibiotique acide, peut être adsorbée sur des résines échangeuses d'anions basiques du type utilisé
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pour l'absorption de la novobiocine, des antibiotiques basiques, tels que la streptomycine, la néomycine, l'eulicine et la citovirine, par exemple, requièrent l'utilisation d'une résine d'échange cationique acide pour obtenir une absorption efficace.
Bien que les dimensions des particules de rési- ne ne soient pas critiques, il a été constaté que des résines dent les particules ont des grosseurs comprises entre environ 10 mailles et 200 mailles et, de préféren- ce, entre environ 35 mailles et 100 mailles, sont parti- culièrement intéressantes pour l'absorption.
Pour séparer la résine sur laquelle est adsor- bée l'activité antibiotique, du bouillon épuisé, il est souhaitable de diluer d'abord le bouillon par addition d'un diluant, tel que l'eau. Ce stade de dilution, bien qu'il ne soit pas nécessaire pour la mise en pratique de la présente invention, facilite la séparation du bouillon épuisé et de la résine. Il a été constaté que l'adjonc- tion au bouillon épuisé d'un volume égal d'eau améliore la séparation de la résine du bouillon épuisé contenant des mycelia de microorganismes, des agents nutritifs non utilisés et diverses autres impuretés solides.
Le bouillon contenant la résine peut alors être séparé de celle-ci par tamisage ou par toute autre métho-. de désirée. Le tamisage du mélange à l'aide d'un tamis à mailles de grandeur telle que la résine soit retenue et que les mycelia puissent passer, à savoir un tamis comportant normalement d'environ 10 mailles à environ 200 mailles, s'est révélé efficace pour la séparation, étant donné qu'il ne se produit aucun colmatage ou bou- chage du tamis à l'aide de mycelia ou de bouillon épuisé, comme on a pu l'observer. Pour faciliter davantage cette
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séparation, un tamis du type Vibrant peut être utilisé.
Si on le désire, on peut utiliser encore d'autre dispo- sitif de séparation, notamment des cyclones, des tables à secousse ou des classeurs.
Pour éluer de la résine échangeuse d'ions l'ac- ticité antibiotique adsorbée sur cette résine, on fait usage d'une solution d'élution aqueuse contenant un élec- trolyte. Dans le cas de la novobiocine, des solutions acides a ueuse; contenant un solvant organique pour la no- tobictine se sont avarées efficaces. Ainsi, des solu- tions aqueuses d'acide chlorhydrique ou d'acide acétique mélangées à un solvant organique approprié miscible à l'eau, tel qu'un alcool ou une cétone, se sont révélées satisfaisantes pour l'élution de l'activité novobioini- que adsorbée sur la résine échangeuse d'ions. La concen- tration du composé acide dans la solution d'élution est, de préférence, comprise entre environ 1 % en poids/volu- me et environ 10 % en poids/volume.
La phase organique peut être constituée d'environ 70 % à environ 98 % du solvant organique avec environ 30 % à environ 2 % d'eau.
Dans le cas d'autres antibiotiques que la novo- biocine, des solutions d'élution appropriées peuvent être utilisées pour éluer de la résine échangeuse d'ions l'activité antibiotique absorbée sur cette résine. Ainsi,) dans le cas de la néobicine et de la cytovirine, l'ammo- niac en solution aqueuse constitue une solution d'élu- tion satisfaisante. D'un autre côté, l'acide chlorhydri- que en solution méthanolique est efficace pour l'élution de l'eulicine et de la streptomycine.
L'élution peut se faire soit en colonne, soit par lots, bien que l'élution en colonne soit préférée, à cause des plus petits volumes qui sont nécessaires et à cause de la facilité relative des analyses périodiques
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de l'éluat et de la division de celui-ci en fractions, qui se fait aisément dans le cas où une colonne est uti- lisée pour l'élution.
. L'éluat peut être soumis à un traitement subsé- quent en vue de le purifier davantage. Ainsi, dans le cas de novobiocine, on peut faire passer l'éluat à tra- vers une colonne chromatographique, telle qu'une colonne d'alumine qui a été lavée avec de l'acide sulfurique di- lué et avec de l'eau, après quoi on peut traiter l'éluat purifié et décoloré à l'aide d'une solution acide, telle qu'une solution de méthanol et d'acide acétique, en vue de cristalliser la novobiocine acide. Les cristaux ré- sultant peuvent être filtrés et lavés, par exemple avec une solution méthanolique aqueuse, puis filtrés et séchés, Si on le désire, divers sels de novobiocine peuvent être préparés à partir de cette novobiocine acide, par des techniques de neutralisation appropriées.
Le procédé suivant la présente invention sera illustré davantage dans les exemples suivants. Ces exem- . ples sont donnés à seul titre illustratif et ne doivent pas être considérés comme limitant la portée de l'inven- tion. Ainsi, d'antres antibiotiques que la novobiocine, notamment la streptomycine, la néomycine, l'eulicine, la cytovirine, la pénicilline et analogues, peuvent être isolés de bouillons de fermentation, pendant la fermenta- tion, selon le procédé de la présente invention.
EXEMPLE 1
A 29 ml d'un bouillon de fermentation de novobio cine, on a ajouté 1 ml de résine "Dowex 1-X2" (50-100 mailles ; cycle chloryre) préalablement stérilisée par traitement avec de l'éthanol anhydre. On a laissé la fer- mentation se poursuivre pendant une période totale de
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168 heures. La résine a ensuite été séparée du bouillon épuisé à l'aide d'un tamis à 70 mailles et placée dans une colonne dtun diamètre d'l cm et dtune hauteur de 6 pouces. La résine a été lavée par le bas à l'aide de méthanol et éluée au moyen d'une solution aqueuse à 16 % dtacide chlorhydrique dans une solution méthanolique (2 N) à raison de 0,2 ml par minute.
On a constaté que l'éluat contenait 20. 000 unités d'activité novobiocinique.
Cette détermination de la teneur de l'éluat en activité mao biocinique représente un rendement (par rapport à l'éluat) de 75 %, en comparaison d'un essai parallèle effectué en l'absence de résine.
Le tableau suivant résume les résultats obtenus en opérant par le procédé décrit dans l'exemple I, avec des additions de résine à des moments différents.
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Moment <SEP> de <SEP> l'addi- <SEP> Temps <SEP> de <SEP> Volume <SEP> Volume <SEP> de <SEP> Rendement <SEP> par
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<tb> tion <SEP> de <SEP> résine <SEP> récolte <SEP> de <SEP> bouil- <SEP> résine <SEP> rapport <SEP> à <SEP> l'élua
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<tb> inoculation) <SEP> après <SEP> ino-
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<tb> culation)
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<tb> -------------------------------------------------------------------
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<tb> 48 <SEP> 180 <SEP> 3.ooo <SEP> 35#1 <SEP> 90#2
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<tb> 144 <SEP> 168 <SEP> 378.500 <SEP> 5.000*3 <SEP> 9D#4
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<tb>
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<tb> 156 <SEP> 168 <SEP> 2.721 <SEP> 35#3 <SEP> 85#4
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*1 Résine stérilisée à l'aide de vapeur.
#2 Basé sur essai parallèle en l'absence de résine.- #3 Résine non stérilisée.
#4 Basé sur l'activité dans le bouillon au moment de l'addition de résine.
EXEMPLE II
A 3.000 ml de bouillon de fermentation de néomycine, on a ajouté 180 cc de résine "Duolite C-25", (cycle sodium), préalablement stérilisée par traitement avec une solution à 70 % d'alcool, éthylique et 30 % d'eau. La résine échangeuse d'ions "Duolite C-25"
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est une résine échangeuse de cations du type polystyrè.- ne-divinylbenzène sulfoné ayant une structure fortement poreuse. Cette résine est fournie par la société Chemical rocess Company, Redwood City, Californie. La résine a été ajoutée 48 heures après l'inoculation et le bouillon a été récolté 163 heures après l'inoculation. La résine a été séparée du bouillon épuisé à l'aide d'un tamis à 28 mailles.
Après lavage à l'eau, elle a été placée dans .une colonne d'un pouce et lavée à l'aide d'un courant ascendant d'eau, de manière à éliminer les solides rési- duaires de la fermentation. La résine a ensuite été éluée à l'aide d'un courant ascendant d'une solution 1 N d'am- moniaque, à une vitesse de 3 ml par minute. On a consta- té que l'éluat contenait une activité correspondant à un rendement de 90 %, sur la base d'un essai parallèle effec,; tué en l'absence de résine.
La néomycine peut également être adsorbée sur la résine "Amberlite IRC-50", qui est une résine échan- geuse de cations du type polystyrène-divinylbenzène aci- de, qui tire ses caractéristiques d'échange ionique principalement de groupe acide carboxylique. Cette résine est fournie par la société Rohm & Haas Co , Philadelphie, Pennsylvanie. L'antibiotique en question peut également être absorbé sur d'autres résines de la classe des rési- nes échangeuses de cations acides.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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The present invention relates generally to methods for obtaining antibiotics from crude solutions thereof. More particularly, it relates to new and improved methods for recovering and concentrating antibiotics from fermentation broths containing engineered antibiotics, mycelia of microorganisms and suitable nutrient media.
Previously, the isolation and separation of antibiotics from fermentation broths, had in which the antibiotics. /. developed, were done through solvent extraction and ion exchange processes, which involved the treatment of harvested broths, filtered or not.
The present invention relates generally to a new technique for isolating antibiotics, which have been produced by fermentation processes.
The object of the invention is a new and improved process for the separation and purification of antibiotics from fermentation broths in which these antibiotics have been produced.
A further subject of the invention is a process for the isolation of antibiotics in high yields.
A subject of the invention is also a commercially applicable process for recovering the antibiotic activity of fermentation broths in which these antibiotics are produced.
@
Other objects and advantages of the invention will become apparent from the following detailed description. @
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It has now been found that antibiotics can be isolated from fermentation broths, concurrently / in which they are made, / with fermentation.
In other words, the isolation process can be performed during the development of the antibiotic. This is done by adding the chosen ion exchange resin to the fermentation broth and allowing the fermentation to continue for a period of time after the addition of the resin.
The surprising feature of the present invention resides, in addition to the increased ease of operation and the saving of time and equipment, in the increased yields obtained by following the practice of the present invention. It has been found that the yields are increased by about 25% over the yields obtained if the adsorption is carried out on harvested broth. This increase in yield is produced by carrying out fermentation in the presence of an ion exchange resin, which adsorbs the antibiotic as it is made. A further increase in yield is obtained by eliminating the stage of filtration of the fermentation broth before further processing.
Further, the resin adsorption is more efficiently coupled by applying this process because of the longer contact times between the broth and the resin which result from the adsorption during fermentation. Another advantage of the process according to the invention resided in the fact that the fermenur itself is used as the place of adsorption, which eliminates the need to transfer. the fermentation broth in another container for contact with the resin.
The most complete possibilities of the present invention can be realized with an antibiotic.
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as unstable, such as penicillin, the adsorption of the antibiotic as it is formed having the effect of extracting it from the solution in which it is unstable and subject to the degrading action of chemical agents and enzymatic.
For the effective use of the process according to the present invention, it is essential that the ion exchange resin be added to the fermentation broth at such a time that fermentation of the broth can proceed in the presence of the resin. The resin can be added either at the start of the fermentation or later, for example one hour before the harvest time of the fermentation broth. The minimum of one hour is the time which has been found to be necessary to obtain a substantial recovery of the antibiotic activity contained in the fermentation broth.
In a preferred embodiment of the present invention, the ion exchange resin should be added between about 48 hours after the start of the fermentation and about 24 hours before harvesting the fermentation broth.
The resin can be added to the fermentation broth in any desired concentration, preferably at concentrations of from about 1% by volume to about 5% by volume, depending primarily on the concentration of antibiotic activity developed. in the broth.
The novel and unique feature of the process according to the invention is that the ion exchange resin is added during the fermentation, the latter then being continued in the presence of the resin. Certain fermentation media for
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production of antibiotics are however susceptible to contamination by foreign microorganisms. These latter microorganisms can even go so far as to cause the complete loss of the yield of the desired fermentation product, as is the case with penicillin. It is therefore desirable to sterilize the ion exchange resin prior to introducing it to the fermentation apparatus. This sterilization can be carried out by treating the resin with heat or steam.
However, if the resin is unstable in the presence of heat, the use of an antiseptic, such as aqueous alcohol, is recommended.
After adsorption, the ion exchange resin with the antibiotic adsorbed thereon can be subjected to the usual techniques for the isolation of the antibiotic. The fermentation broth and the resin can be separated, for example by sieving. The resin thus separated can be washed to remove therefrom traces of mycelia or unabsorbed chemical impurities, after which it can be eluted with the aid of a solution having the ability to elute all antibiotic activity from the resin. adsorbed onto it. The eluate can be subjected to a number of suitable treatments, eg crystallizations or solvent extractions, in order to recover the pure antibiotic from the eluate.
The resin thus freed of the antibiotic activity can then be regenerated by treatment with a suitable regeneration solution, after which it can be used again for the aosorption of the antibiotic; or fresh resin can be added with the regenerated resin in the fermentation apparatus, if desired. The exhausted broth can be
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returned to contact with fresh or regenerated resin and separated again as described above.
The invention will now be described in more detail, using novobiocin as an antibiotic, for ease of disclosure.
The ion exchange resins which are suitable for carrying out the process according to the present invention, in the case of novobiocin, are resins in the form of particles of the class of nitrogen anion exchange resins, polymers. and strongly basic.
These are usually resins in which quaternary ammonium groups are attached to a styrene-divinylbenzene system. As resins of this type, there may be mentioned, by way of example, the "Dowex" resins supplied by the company Dow Chemical Co., Midland, Mich., In particular "Dowex 1-X2", "Dowex". 1-X4 ", and" Dowex 2-X4 "; the "Amberlite" resins supplied by the company Rohm & Hass Co, Philadelphia, Pa., in particular "Amberlite
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IRA-400 ", lt trAmberlite IRA-401" and Amberlite XE-9't; as well as "Dusolite" resins, available from Chemical Process Co., Redwood City, Calif., including "Duolite A-40", "Duolite A-101" and "Duolitq A-102" .
Although the aforementioned resins have been cited as illustrative examples of ion exchange resins which can be used for the absorption of novobiocin, other ion exchange resins of the strongly basic type can also be used. used.
Those skilled in the art will understand that other antibiotics may require other types of ion exchange resins. Thus, while penicillin G, another acidic antibiotic, can be adsorbed to basic anion exchange resins of the type used
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for absorption of novobiocin, basic antibiotics, such as streptomycin, neomycin, eulicin and citovirin, for example, require the use of an acidic cation exchange resin to achieve efficient absorption.
Although the sizes of the resin particles are not critical, it has been found that resins of the particles have sizes between about 10 mesh and 200 mesh, and preferably between about 35 mesh and 100 mesh. , are particularly interesting for absorption.
In order to separate the resin on which the antibiotic activity is adsorbed from the spent broth, it is desirable to first dilute the broth by adding a diluent, such as water. This dilution step, although not necessary for the practice of the present invention, facilitates the separation of the spent broth and the resin. It has been found that adding to the spent broth an equal volume of water improves the separation of the resin from the spent broth containing mycelia of microorganisms, unused nutrients and various other solid impurities.
The broth containing the resin can then be separated therefrom by sieving or by any other method. of desired. Sifting the mixture using a mesh sieve of such size that the resin is retained and the mycelia can pass through, i.e. a sieve normally having from about 10 mesh to about 200 mesh, has been found to be effective. for separation, since no plugging or plugging of the sieve occurs with mycelia or spent broth, as has been observed. To further facilitate this
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separation, a vibrating type sieve can be used.
If desired, still other separation devices, such as cyclones, shaker tables or filing cabinets, can be used.
In order to elute the antibiotic activity adsorbed on this resin from the ion exchange resin, an aqueous eluting solution containing an electrolyte is used. In the case of novobiocin, acidic uous solutions; containing an organic solvent for no-tobictin have been found to be effective. Thus, aqueous solutions of hydrochloric acid or acetic acid mixed with a suitable organic solvent miscible with water, such as an alcohol or a ketone, have been found to be satisfactory in eluting the novobioin activity. - that adsorbed on the ion exchange resin. The concentration of the acidic compound in the eluting solution is preferably from about 1% w / v to about 10% w / v.
The organic phase can consist of about 70% to about 98% of the organic solvent with about 30% to about 2% water.
In the case of antibiotics other than novobiocin, suitable eluting solutions can be used to elute from the ion exchange resin the antibiotic activity absorbed on this resin. Thus, in the case of neobicin and cytovirin, ammonia in aqueous solution constitutes a satisfactory elution solution. On the other hand, hydrochloric acid in methanolic solution is effective in eluting eulicin and streptomycin.
Elution can be done either in column or in batches, although column elution is preferred, because of the smaller volumes that are required and because of the relative ease of periodic analyzes.
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of the eluate and the division thereof into fractions, which is easily done in the case where a column is used for the elution.
. The eluate can be subjected to a subsequent treatment with a view to further purification. Thus, in the case of novobiocin, the eluate can be passed through a chromatographic column, such as an alumina column which has been washed with diluted sulfuric acid and with water. , after which the purified and decolorized eluate can be treated with an acidic solution, such as a solution of methanol and acetic acid, to crystallize the acidic novobiocin. The resulting crystals can be filtered and washed, for example with an aqueous methanolic solution, then filtered and dried. If desired, various salts of novobiocin can be prepared from this acidic novobiocin, by suitable neutralization techniques.
The process according to the present invention will be further illustrated in the following examples. These exem-. These are given for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the invention. Thus, other antibiotics than novobiocin, including streptomycin, neomycin, eulicin, cytovirin, penicillin and the like, can be isolated from fermentation broths, during fermentation, according to the process of the present invention. .
EXAMPLE 1
To 29 ml of a novobio cine fermentation broth was added 1 ml of "Dowex 1-X2" resin (50-100 mesh; chlorine cycle) previously sterilized by treatment with anhydrous ethanol. Fermentation was allowed to continue for a total period of
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168 hours. The resin was then separated from the spent broth using a 70 mesh sieve and placed in a column 1 cm in diameter and 6 inches high. The resin was washed from below with methanol and eluted with 16% aqueous hydrochloric acid solution in methanolic (2N) solution at 0.2 ml per minute.
The eluate was found to contain 20,000 units of novobiokinic activity.
This determination of the content of the eluate in mao biokinic activity represents a yield (relative to the eluate) of 75%, in comparison with a parallel test carried out in the absence of resin.
The following table summarizes the results obtained by operating by the process described in Example I, with resin additions at different times.
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Time <SEP> of <SEP> addi- <SEP> Time <SEP> of <SEP> Volume <SEP> Volume <SEP> of <SEP> Efficiency <SEP> by
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* 1 Resin sterilized using steam.
# 2 Based on parallel test in the absence of resin. # 3 Unsterilized resin.
# 4 Based on the activity in the broth at the time of resin addition.
EXAMPLE II
To 3,000 ml of neomycin fermentation broth, 180 cc of "Duolite C-25" resin (sodium cycle), previously sterilized by treatment with a 70% solution of alcohol, ethyl and 30% water, were added. . The "Duolite C-25" ion exchange resin
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is a sulfonated polystyrene-ne-divinylbenzene type cation exchange resin having a highly porous structure. This resin is available from the Chemical Process Company, Redwood City, California. The resin was added 48 hours after inoculation and the broth was harvested 163 hours after inoculation. The resin was separated from the spent broth using a 28 mesh sieve.
After washing with water, it was placed in a one inch column and washed with an ascending stream of water, so as to remove the residual solids from the fermentation. The resin was then eluted using an updraft of a 1N ammonia solution at a rate of 3 ml per minute. The eluate was found to contain an activity corresponding to a 90% yield, on the basis of an effective parallel test; killed in the absence of resin.
Neomycin can also be adsorbed on "Amberlite IRC-50" resin, which is a cation exchange resin of the polystyrene-divinylbenzene acid type, which derives its ion exchange characteristics mainly from the carboxylic acid group. This resin is supplied by Rohm & Haas Co, Philadelphia, Pennsylvania. The antibiotic in question can also be absorbed on other resins of the class of acidic cation exchange resins.
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