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La présente invention est relative à des pro- cédés hautement avantageux pour l'obtention de l-déhydro- stéroïdes de la série du prégnadiène. Ces dérivés sont des composés connus, qui sont physiologiquement actifs ou sont utiles dans la préparation de stéroides physiologi- quement actifs par des procédés connus dans la technique.
Il a été constaté que les stéroïdes hydroxylés de la série du 3-céto-prégnane(y compris le ¯4-prégnène), en particulier les Il 3 , 17 o( , 21-trihydroxy-3,20-dicé- to-stéroides de la série du prégnane (y compris le ¯4- prégnène) et leurs esters, peuvent être convertis en leurs dérivés de ¯1,4-prégnadiène correspondants, en sou- mettant les premiers, en présence d'oxygène, à l'action d'enzymes du microorganisme Nocardia aurantia -qui peut aussi être appelé "Mycobacterium aurantia", tu le dernier travail de Gordon et autres, Journal of Bacteriology, 73, 15-27 (janvier 1957).
L'action des enzymes peut être utilisée soit en mettant en présence, au sein d'un milieu nutritif aqueux, le stéroïde, de l'oxygène et des enzymes de cellules non proliférantes de Nocardia aurantia, soit (de préférence) en introduisant le stéroïde dans une cul- ture aérée de Nocardia aurantia.
. Le microorganisme, Nocardia aurantia, utilisable dans la mise en oeuvre de l'invention, a été déposé dans la collection dite American Type Culture Collection à a Washington, D.C., U.S.A. où on lui/attribué le numéro 12.674 et ou il est à la disposition du public.
En général, les conditions de culture du Nocar- dia aurantia pour les besoins de la présente invention sont (sauf pour l'inclusion du stéroïde à déshydrogéner)
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les mêmes que les conditions de culture du Nocardia pour la production de vitamines ou d'antibiotiques, tels que la vitamine B12. Ainsi, le Nocardia aurantia est cultivé en contact (dans ou sur) un milieu nutritif approprié en présence d'oxygène (air). Un milieu nutritif approprié comprend essentiellement une source de facteurs azotés et une source. assimilable de.carbone et d'énergie.
Cette der nière peut être un hydrate de carbone (tel que sucrose, mélasses, glucose, maltose, amidon ou dextrine) et/ou le staroide lui-mme. Toutefois,.le milieu comprend, de pré- férence, une source assimilable de carbone et d'énergie en plus du stéroïde.
La source de facteurs azotés peut être organique (par exemple, farine de graines de soja, liqueur de macéra- tion de mais, extrait de viande, solubles de distillateur, peptone et/ou extrait de levure) ou synthétique (par exem- ple, composée de composés organiques et inorganiques sim- ples synthétisables, tels que sels ammoniques, nitrates de métaux alcalins, amino-acides ou urée).
Comme substrat stéroide, on emploie un stéroïde saturé dans la position 1,2. Ce stéroïde est,,de préfé- rence, un stéroide de la série du Il .3 , 17 Ó, 21-trihy- droxy-3,20-dicéto-prégnane (y compris de la série du ¯4-prégnène) ou un 21-ester de ce stéroide.
Comme exem- ples de tels stéroïdes, on peut citer les suivants : hydrocartisone, 16 Ó-hydroxyhydrocortisone, 9 o(-halohy- drocortisones (par exemple,9 o(-fluorohydrocortisone), 9 o(-halo-16 c(-hydroxyhydrocortisones (par exemple, 9 Ó- fluoro-16 Ó -hydroxyhydrocortisone), 6 Ó -méthylhydrocor- tisone, 9 Ó-halo-6 o(-méthylhydrocortisones (par exemple, 9 Ó -fluoro-6 Ó-méthylhydrocortisone), 9 0( -halo-6 Ó- méthyl-16 Ó-hydpoxyhydrocortisones (par exemple, 9 Ó-
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fluoro-6 Ó -méthyl-16 o( -hydroxyhydrocortisone) et les esters de ces composés. Parmi les esters, ceus d'acides carboxyliques dthydrocarbures ayant moins de 10 atomes de carbone sont préférés.
Comme exemples de tels acides, on peut citer les acides gras inférieurs (par exemple, les acides acétique et propionique), les acides aryl car- boxyliques monocycliques (par exemple, les acides benzol- que et o(-toluiques), les acides aryl alcanoiques infé- rieurs monocycliques (par exemple, les acides phénoacéti- que et ss-phénylpropionique), les acides cycloalcane car- boxyliques et les acides cycloalkène carboxyliques.
L'invention procure un procédé grâce auquel des ¯1,4-prégnadiènes peuvent être préparés micro biologique- avec des rendements élevés (par exemple, des rendements supérieurs à 50 %) avec production minimum de sous-pro- duits indésirables.
Les exemples suivants illustrent la présente invention, toutes les températures étant indiquées en de, grés Centigrade.
EXEMPLE 1 9 o(-fluoro-16 Ó -hydroxyprednisolone.
(a) Fermentation
Une cultmre en surface sur un milieu de gélose vieux de 15 jours (extrait de boeuf : 1,5 g; extrait de levure : 3 g; peptone : 6 g; dextrose . 1 g; gélose : 20 g ; eau distillée pour faire 1 litre) de Nocardia auran- tia A.T.C.C. 12.674 est mise en suspension dans 5 ml de sérum physiologique.
Des fractions de 1 ml sont utilisées pour inoculer deux fractions de 50 ml du milieu suivant (A) contenu dans des flacons coniques de 250 ml
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glucose 20 g peptone 5 g tryptone 5 g extrait de levure 5 g
CaC03 0,25%
Eau distillée q.s.ad 1 litre
Chauffage à l'autoclave pendant 20 minutes à 120 Les flacons inoculés sont incubés à 25 en les faisant tourner mécaniquement à 280 cycles par minute sur un rayon d'environ 5 cm. Après 20 heures, un transfert de 6 % (vol./vol.) est effectué dans un litre du même milieu (A) contenu dans vingt flacons coniques de 250 ml.
Après une période d'incubation de 23 heures, une fraction de 1 ml d'une solution dé 500 mg de 9 o(-fluoro-16 Ó-hydroxy- hydrocortisone dissous dans 20 ml de méthanol à 95 % est introduite dans chaque flacon. Après cinq heures d'exposi' tion du stéroide dans les flacons dans les conditions d'incubation décrites plus haut, les contenus des flacons sont réunis et le pH de l'ensemble est ramené de 7,5 à environ 3,5 à l'aide d'acide sulfurique 12 N. Au milieu ainsi traité, on ajoute 2 g de Celite (adjuvant de filtra- tion) et le mélange résultant est filtré sur un tampon clarificateur Seitz. Les flacons sont rincés, et le tam- pon et les flacons sont lavés sur l'entonnoir successive- ment avec 4 fractions de 50 ml d'eau chaude.
Le volume du filtrat et des liqueurs de lavage combinés est de 1250 ml.
(b) Isolation de la 9 c( -fluoro-16 Ó -hydroxyprednisolone,
Le filtrat comprenant les liqueurs de lavage (environ 1250 ml) est extrait avec quatre fractions de 500 ml de méthylisobutylcétone. Les extrait combinés sont filtrés et évaporés jusqu'à siccité sous vide. Après tri-
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turation avec de l'acétone, le résidu cristallin donne 3'il mg de 9 o(-fluoro-16 Ó -hydroxyprednisolone, qui après recristallisation dans de l'alcool à 95 % donne environ 304 mg de matière pure fondant à environ 248- 250 (déc) et possédant un spectre infra-rouge identique à celui d'un échantillon authentique. Les liqueurs-;.mères combinées fournissent, par concentration, 13 mg supplémentaires de matière fondant à environ 250 - 256 .
Rendement total : environ 63,5% (poids/poids).
EXEMPLE 2
En remplaçant, dans le mode opératoire de l'exem-
EMI5.1
ple 1, la 9 o -flnoro-16 c( --hydroxyhydrocortisone par 500 mg de l6 o( , p 2l-dÜwétate de 9 o( -fluoro-l6 0( -hydroxyhy- drocortisone, on obtient de la 9 o(-fluoro-16 o(-hydroxy- prednidolone avec un rendement d'environ 52% en poids (environ 260 mg).
EXEMPLE 3
En remplaçant, dans le mode opératoire de l'exem- ple 1, la 9 ci -fluoro-16 Ó -hydroxyhydrocortisone par du
EMI5.2
21-acéLate de 9 o( -fluoro-16 0( -hydroxyhydrocort.sone, on obtient de la 9 Ó -fluoro-16 Ó -hydroxyprednisolone.
EXEMPLE 4
EMI5.3
e( --iluora-fl''-prégnadiëne-11 17 0( , 21-triol-3,20- dione.
EMI5.4
( #ù) Fermentation
Une culture en surface sur un milieu incliné de gélose vieux de quatre jours (extrait de boeuf : 1,5 g; extrait de levure : 3 peptone : 0' g; dextrose . 1 g; gélose 20 g; eau distillée pour faire 1 litre) de Nocar- dia aurantia A.T.C.C. n 12.674 est mise en suspension dans 5 ml de sérum 'physiologique.
Des fractions de 0,5 ml sont utilisées'pour inoculer 50 fractions de 50 ml du mi-
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lieu suivant contenu dans des flacons coniques de 250 ml : .'glucose @ 20 g peptone 5 g tryptone 5 g extrait de levure 5 g
CaC03 0,25%
Eau distillée pour faire 1 litre
Chauffage à l'autoclave pendant 20 minutes à 1200 Les flacons inoculés sont incubés à 25 en les faisant tourner mécaniquement à 280 cycles par minute sur un rayon d'environ 5 cm.
Après 18 heures, un transfert de 6 % (vol/vol) est effectué à 3600 ml du milieu suivant contenu dans 72 flacons coniques de 250 ml : extrait de levure 1,0 g glucose 1,0 g
KH2PO4 1,0 g
Eau distillée pour faire 1 litre
Chauffage à l'autoclave pendant 20 minutes à 120 Après une période d'incubation de 24 heures, des fractions de 0,5 ml d'une solution de 915 mg de 9 Ó -fluorohydrocor- tisone dissous dans 36 ml de méthanol absolu, maintenu à 50 , est ajoutée 2¯ chaque flacon.
Après 6 heures d'exposi-' tion du stéroide aux cellules dans les conditions d'incuba, tion décrites plus haut, les contonus des flacons sont réu- nis et le pH de l'ensemble est ramené de 7,0 à environ 3 à l'aide d'acide sulfurique 12N, après quoi le tout est chauffé dans de la vapeur en circulation pendant 15 minu- tes et filtré à chaud sur un tampon clarificateur Seitz.
Les flaconssont rincés, et le tampon et les cellules sont lavés sun l'entonnoir avec 12 fractions de 50 ml d'eau chaude. Le volume du filtrat et des liqueurs de lavage combinés est de 4180 ml.
EMI6.1
(b) Isolement de la 9 c( -iluoro-±±'4-prégn?diène-11 # ,
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17 Ó, 21-triol-3,20-dione.
Le filtrat contenant les liqueurs de lavage (en- viron 4180 ml) est extrait avec quatre fractions de 1000
EMI7.1
ml de méthylisobutylcéton6 et les extraits combinés à la méthy1isobutylcétonB sont évaporés jusqu'à siccité sous vide. Le résidu (environ 768 mg est lavé avec du chloro- forme. Après le lavage, le résidu apparaît sensiblement pur sur des chromatogrammes sur papier. Par recristallisa- tion du résidu dans du méthanol, on obtient de la 9 cl -
EMI7.2
fluora-1' '-pré ;nadiène-ll 3 , 17 c( , 21-trâol--3 , 20-d.one identique à un échantillon authentique.
De manière similaire, en remplaçant la 9 Ó-fluo- rohydrocortisone par du 21-acétate de 9 ci -fluorohydrocor- tisone dans le mode opératoire de l'exemple 4, on obtient
EMI7.3
de la 9 -:luoro-,1''-prénacine--11 , 17 0( , 21-triol..
3,20-dione.
EXEMPLE 5
EMI7.4
le4-prégnadiène-'ll 17 c( , 2ih-triol-3,20-dione.
En suivant le mode opératoire de l'exemple 4, mais en remplaçant la 9 c( -fluorohydrocortisone par de l'acétate d'hydrocortisone, on obtient de la ¯ 1,4-prégna-
EMI7.5
diène-11 fi , 17 Q, 21-triol-3,20-dione identique à un échantillon identique, avec des rendements d'environ 41 % après quatre heures de contact et de 51 % après huit heures de contact.
De manière similaire, de 1'hydrocortisone peut être utilisée au lieu d'ecétate d'hydrocortisone dans le' mode opératoire de l'exemple 5, pour obtenir le même produit .
Par ailleurs, en remplaçant dans les modes opé-
EMI7.6
ratoires des exemples les stéroïdes utilisés par dzompca-- . sé S, de la 16 ci -hydroxyhydrocortisone ou de le 9 ¯ -
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fluoro-16 c( -hydroxy6 0( -méthylhydrocortisane, on obtient respectivemeht de la ,1'f-prêgnadiène-l' o( , 21-diol- 3,20-dione, de la A 1;4-prégnadiène-11 16 c( , 17 c( , 21-tétrol-3,?0--dione et de la 9 0( --fluoro-6 o -méthyl- .6.1,l.-prégadiène-ll p , 16 c( , 17 0( , 2l-tétrol-3,20- dione.
L'invention peut être mise en oeuvre de manière différente, sans sortir du cadre des revendications sui- vantes.
REVENDICATIONS
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1. Procédé pour préparer un 1-déhydro-stéroide de la série du prégnadiène, dans lequel procédé on soumet un stéroïde hydroxylé de la série du 3-cétoprégnane à l'ac- tion d'enzymes de Nocardia aurantia, en présence d'oxygè-
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ne, et on récupère le 1-d.éhydro-stéroâ.de formé.
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The present invention relates to highly advantageous processes for obtaining 1-dehydro-steroids of the pregnadiene series. These derivatives are known compounds which are physiologically active or are useful in the preparation of physiologically active steroids by methods known in the art.
It has been found that hydroxylated steroids of the 3-keto-pregnan series (including ¯4-pregnene), in particular the Il 3, 17 o (, 21-trihydroxy-3,20-diceto-steroids of the pregnane series (including ¯4-pregnene) and their esters, can be converted into their corresponding ¯1,4-pregnadiene derivatives, by subjecting the former, in the presence of oxygen, to the action enzymes of the microorganism Nocardia aurantia - which may also be referred to as "Mycobacterium aurantia", the latest work of Gordon et al., Journal of Bacteriology, 73, 15-27 (January 1957).
The action of the enzymes can be used either by bringing together, in an aqueous nutrient medium, the steroid, oxygen and enzymes from non-proliferating cells of Nocardia aurantia, or (preferably) by introducing the steroid in an airy culture of Nocardia aurantia.
. The microorganism, Nocardia aurantia, which can be used in the implementation of the invention, has been deposited in the so-called American Type Culture Collection in Washington, DC, USA where it has been assigned the number 12.674 and where it is available. public.
In general, the cultivation conditions of Nocardia aurantia for the purposes of the present invention are (except for the inclusion of the steroid to be dehydrogenated)
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the same as the growing conditions of Nocardia for the production of vitamins or antibiotics, such as vitamin B12. Thus, Nocardia aurantia is cultivated in contact (in or on) an appropriate nutrient medium in the presence of oxygen (air). A suitable nutrient medium essentially comprises a source of nitrogenous factors and a source. assimilable carbon and energy.
The latter can be a carbohydrate (such as sucrose, molasses, glucose, maltose, starch or dextrin) and / or the staroid itself. However, the medium preferably comprises an assimilable source of carbon and energy in addition to the steroid.
The source of nitrogenous factors can be organic (eg, soybean meal, corn maceration liquor, meat extract, distiller solubles, peptone and / or yeast extract) or synthetic (eg. composed of organic and inorganic compounds which can be easily synthesized, such as ammonium salts, alkali metal nitrates, amino acids or urea).
As the steroid substrate, a steroid saturated in the 1,2-position is employed. This steroid is preferably a steroid of the II .3, 17 Ó, 21-trihy-droxy-3,20-diketo-pregnan series (including of the ¯4-pregnene series) or a 21-ester of this steroid.
Examples of such steroids include: hydrocartisone, 16 Ó-hydroxyhydrocortisone, 9 o (-halohy-drocortisones (for example, 9 o (-fluorohydrocortisone), 9 o (-halo-16 c (-hydroxyhydrocortisones) (eg, 9 Ó- fluoro-16 Ó -hydroxyhydrocortisone), 6 Ó -methylhydrocortisone, 9 Ó-halo-6 o (-methylhydrocortisones (eg, 9 Ó -fluoro-6 Ó-methylhydrocortisone), 9 0 ( -halo-6 Ó- methyl-16 Ó-hydpoxyhydrocortisones (for example, 9 Ó-
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fluoro-6 Ó -methyl-16 o (-hydroxyhydrocortisone) and esters of these compounds. Among the esters, those of carboxylic acids of hydrocarbons having less than 10 carbon atoms are preferred.
Examples of such acids include lower fatty acids (eg acetic and propionic acids), monocyclic aryl carboxylic acids (eg benzole and o (-toluic) acids, aryl acids. monocyclic lower alkanoic acids (eg, phenoacetic and s-phenylpropionic acids), cycloalkane carboxylic acids and cycloalkene carboxylic acids.
The invention provides a process whereby ¯1,4-pregnadienes can be prepared microbiologically in high yields (eg, yields greater than 50%) with minimum production of unwanted by-products.
The following examples illustrate the present invention, all temperatures being indicated in Centigrade sand.
EXAMPLE 1 9 o (-fluoro-16 Ó -hydroxyprednisolone.
(a) Fermentation
A surface culture on 15 days old agar medium (beef extract: 1.5 g; yeast extract: 3 g; peptone: 6 g; dextrose. 1 g; agar: 20 g; distilled water to make 1 liter) of Nocardia aurantia ATCC 12.674 is suspended in 5 ml of physiological serum.
1 ml fractions are used to inoculate two 50 ml fractions of the following medium (A) contained in 250 ml conical flasks
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glucose 20 g peptone 5 g tryptone 5 g yeast extract 5 g
CaCO3 0.25%
Distilled water q.s.ad 1 liter
Autoclave for 20 minutes at 120 The inoculated vials are incubated at 25 by rotating them mechanically at 280 cycles per minute over a radius of about 5 cm. After 20 hours, a transfer of 6% (vol./vol.) Is carried out in one liter of the same medium (A) contained in twenty conical flasks of 250 ml.
After an incubation period of 23 hours, a fraction of 1 ml of a solution of 500 mg of 9 o (-fluoro-16 Ó-hydroxy-hydrocortisone dissolved in 20 ml of 95% methanol is introduced into each vial. After five hours of exposure of the steroid in the vials under the incubation conditions described above, the contents of the vials are combined and the pH of the whole is reduced from 7.5 to about 3.5 at using 12 N sulfuric acid. To the medium thus treated, 2 g of Celite (filter aid) are added and the resulting mixture is filtered through a Seitz clarifying pad. The flasks are rinsed, and the buffer and the tubes are The flasks are washed on the funnel successively with 4 fractions of 50 ml of hot water.
The volume of the combined filtrate and washings is 1250 ml.
(b) Isolation of 9 c (-fluoro-16 Ó -hydroxyprednisolone,
The filtrate comprising the washing liquors (approximately 1250 ml) is extracted with four 500 ml fractions of methyl isobutyl ketone. The combined extracts are filtered and evaporated to dryness in vacuo. After sorting
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curing with acetone, the crystalline residue gives 3'il mg of 9 o (-fluoro-16 Ó -hydroxyprednisolone, which after recrystallization from 95% alcohol gives about 304 mg of pure material melting at about 248- 250 (dec) and possessing an infrared spectrum identical to that of an authentic sample The combined mother liquors provide, by concentration, an additional 13 mg of material melting at about 250 - 256.
Total yield: about 63.5% (w / w).
EXAMPLE 2
By replacing, in the procedure of the exem-
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ple 1, 9 o -flnoro-16 c (--hydroxyhydrocortisone per 500 mg of l6 o (, p 9 o (-fluoro-l6 0 (-hydroxyhy- drocortisone) 2l-dÜwetate, 9 o (- fluoro-16 o (-hydroxy-prednidolone in a yield of about 52% by weight (about 260 mg).
EXAMPLE 3
By replacing, in the procedure of Example 1, the 9-ci -fluoro-16 Ó -hydroxyhydrocortisone by
EMI5.2
9 o (-fluoro-16 0 (-hydroxyhydrocort.sone 21-acelate), 9 Ó -fluoro-16 Ó -hydroxyprednisolone is obtained.
EXAMPLE 4
EMI5.3
e (--iluora-fl '' - pregnadien-11 17 0 (, 21-triol-3,20-dione.
EMI5.4
(# ù) Fermentation
A surface culture on a four day old agar slant medium (beef extract: 1.5 g; yeast extract: 3 peptone: 0 'g; dextrose. 1 g; agar 20 g; distilled water to make 1 liter ) of Nocar- dia aurantia ATCC n 12.674 is suspended in 5 ml of physiological serum.
0.5 ml fractions are used to inoculate 50 50 ml fractions of the medium.
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following place contained in 250 ml conical flasks: .'glucose @ 20 g peptone 5 g tryptone 5 g yeast extract 5 g
CaCO3 0.25%
Distilled water to make 1 liter
Autoclave heating for 20 minutes at 1200 The inoculated vials are incubated at 25 by rotating them mechanically at 280 cycles per minute over a radius of about 5 cm.
After 18 hours, a transfer of 6% (vol / vol) is made to 3600 ml of the following medium contained in 72 conical flasks of 250 ml: yeast extract 1.0 g glucose 1.0 g
KH2PO4 1.0 g
Distilled water to make 1 liter
Heating in the autoclave for 20 minutes at 120 After an incubation period of 24 hours, fractions of 0.5 ml of a solution of 915 mg of 9 Ó -fluorohydrocortisone dissolved in 36 ml of absolute methanol, maintained at 50, 2¯ each vial is added.
After 6 hours of exposure of the steroid to the cells under the incubation conditions described above, the contons of the flasks are combined and the pH of the whole is brought back from 7.0 to about 3 at using 12N sulfuric acid, after which the whole is heated in circulating steam for 15 minutes and filtered while hot through a Seitz clarifier pad.
The vials are rinsed, and the buffer and cells are washed in the funnel with 12 x 50 ml fractions of hot water. The volume of the combined filtrate and washings is 4180 ml.
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(b) Isolation of the 9 c (-iluoro- ± +/- '4-prégn? diene-11 #,
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17 Ó, 21-triol-3,20-dione.
The filtrate containing the washing liquors (approx. 4180 ml) is extracted with four fractions of 1000
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ml of methylisobutylketon6 and the extracts combined with methylisobutylketonB are evaporated to dryness in vacuo. The residue (approx. 768 mg is washed with chloroform. After washing, the residue appears substantially pure on paper chromatograms. Recrystallization of the residue from methanol gives 9 cl -
EMI7.2
fluora-1 '' -pre; nadiene-11 3, 17 c (, 21-trâol - 3, 20-d.one identical to authentic sample.
Similarly, by replacing 9 Ó-fluorohydrocortisone with 9CI -fluorohydrocortisone 21-acetate in the procedure of Example 4, one obtains
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9 -: luoro-, 1 '' - prenacin - 11, 17 0 (, 21-triol ..
3,20-dione.
EXAMPLE 5
EMI7.4
17c4-Pregnadiene-11 (, 2ih-triol-3,20-dione.
By following the procedure of Example 4, but replacing the 9 c (-fluorohydrocortisone by hydrocortisone acetate, ¯ 1,4-prégna- is obtained.
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diene-11, 17 Q, 21-triol-3,20-dione identical to an identical sample, with yields of about 41% after four hours of contact and of 51% after eight hours of contact.
Similarly, hydrocortisone can be used instead of hydrocortisone ecetate in the procedure of Example 5, to obtain the same product.
In addition, by replacing in the operating modes
EMI7.6
Examples of steroids used by dzompca--. sé S, 16 ci -hydroxyhydrocortisone or 9 ¯ -
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fluoro-16 c (-hydroxy6 0 (-methylhydrocortisane, one obtains respectively la, 1'f-prêgnadiene-l 'o (, 21-diol-3,20-dione, de la A 1; 4-prégnadiene-11 16 c (, 17 c (, 21-tetrol-3,? 0 - dione and 9 0 (--fluoro-6 o -methyl- .6.1, l.-pregadiene-11 p, 16 c (, 17 0 (, 2l-tetrol-3,20-dione.
The invention can be implemented in a different manner, without departing from the scope of the following claims.
CLAIMS
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1. A process for preparing a 1-dehydro-steroid of the pregnadiene series, wherein the process is subjecting a hydroxylated steroid of the 3-ketopregnane series to the action of Nocardia aurantia enzymes in the presence of oxygen. -
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ne, and the 1-d.hydro-stéroâ.de formed is recovered.