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La présente invention est relative à un procédé perfec- tionné pour la préparation d'un dextrane à poids moléculaire relativement peu élevé; en partant d'un dextrane d'un poids moléculaire relativement élevé. Plus particulièrement,l'invention est relative à un procédé perfectionné pour produire le dextrane "clinique" à partir d'un dextrane d'un poids moléculaire plus élevé, soit, d'un dextrane "natif".
Le dextrane pouvant être utilisé dans les liquides pour les injections intraveineuses,administrées en vue d'éliminerrétat de choc,est connu sous la dénomination de dextrane "clinique".
Des spécifications ont été établies pour cette substance clinique par les autorités militaires des Etats-Unis. Une de ces spécifi- cations se rapporte au poids moléculaire, lequel doit être tel que le poids moléculaire de la fraction de 10 % ayant le poids moléculaire le moins élevé ne soit pas inférieur à 25.000 environ;
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que le poids moléculaire de la fraction de 10 % ayant le poids moléculaire le plus élevé ne soit pas supérieur à 200. 000 environ et que le poids moléculaire moyen soit compris entre 50. 000 et 100. 000, de préférence entre 60.000 et 80. 000.
Une autre de ces spécifications concerne la viscosité relative des solutions aqueuses d'injection, laquelle doit être relativement élevée pour la-concentration donnée du dextrane, qui est généralement de 6 % en poids.
Ihns la pratique courante, le dextrane "clinique" est obtenu par une dépolymérisation partielle et contrôlée du dextrane "natif", en utilisant de l'acide comme agent d'hydrolyse.
Le dextrane "natif" peut être obtenu de plusieurs manières différentes. Il peut être produit par synthèse en inoculant, à un milieu nutritif contenant la saccharose, des microorganismes producteurs de dextrane, tels que ceux des types Leuconostoc mes en- té roi des et L. dextranicum, jusqu'à ce que l'on atteigne une production de dextrane maximum, dans lequel cas la synthèse s'effectue par voie enzymique, en présence de bactéries, ou bien, ce dextrane peut être obtenu en cultivant les microorganismes en vue de produire l'enzyme dextrane-sucrase, en'séparant l'enzyme par filtration de la culture, en introduisant le filtrat, ou l'enzyme qui en a été séparée,
dans une solution aqueuse de saccharose et en laissant reposer la masse jusqu'à ce que le dextrane soit produit par synthèse à partir de la saccharose,cette synthèse étant effectuée en l'absence de bactéries, de débris cellulaires, etc..
Dans l'un comme dans l'autre procédé, le dextrane "natif" est précipité à partir du produit de fermentation ou du milieu nutritif par l'addition d'un non-solvant pour le dextrane y contenu.
Le produit natif possède un poids moléculaire très élevé, qui s'élève à plusieurs millions d'après le calcul, et n'est donc pas recommandé pour les injections.
Comme il a été indiqué plus haut, la pratique classique consiste
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à fractionner le dextrane "natif" dans une solution acide,9 afin d'obtenir des fractions ayant le poids moléculaire moyen réduit voulu.
Selon la présente invention, l'hydrolyse acide de la solution aqueuse contenant le dextrane "natif est effectuée en chauffant un milieu acide aqueux contenant, en plus du dextrane et de l'eau, une quantité limitée constante pour chaque charge,d'un alcool aliphatique inférieur miscible à l'eau ou d'une cétone, telle que l'acétone ou la dioxane, au point d'ébullition du mélange eaualcool ou eau-cétone, jusqu'à l'achèvement de l'hydrolyse voulue.
Dans le mode de réalisation préféré, la proportion présente d'alcool ou de cétone est comprise entre 2,5 % et 33 1/3 % du volume de l'eau, l'adjuvant préféré étant l'isopropanol, l'hydrolyse étant effectuée à 85 C environ.
Dans ce procédé perfectionné et particulièrement favorable, où la solution aqueuse acide du dextrane "natif", solution conte- ' nant l'isopropanol, est chauffée à environ 85 C et est maintenue à cette température pendant la durée de la réaction d'hydrolyse, l'alcool paraît exercer un effet retardateur ou inhibiteur sur l'allure de l'hydrolyse, ce qui a une influence très favorable sur la viscosité des solutions,laqueuses du dextrane "clinique" séparé de l'hydrolysat. L'isopropanol agit évidemment de façon à inhibiter l'allure de l'hydrolyse,en réduisant l'efficacité de l'acide hydrolysant en raison d'une diminution de l'ionisation, ce qui, par conséquent, réduit la rapidité de l'hydrolyse ou du fractionnement.
Comme indiqué plus haut, le dextrane "natif" soumis à l'hydrolyse possède un poids moléculaire moyen élevé; toutefois, certaines de ses fractions possèdent un poids moléculaire plus relevé que d'autres. Une hydrolyse prématurée des portions ayant le poids moléculaire le plus élevé conduit à une polydispersité accrue- indésirable du produit hydrolysé final en solution aqueuse* D e toute évidence, l'isopropanol empêche de façon sélec-
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tive, pendant les stades initiaux de l'hydrolyse, le .'f rationnement prématuré des portions de dextrane à poids moléculaire plus élevé et influence ainsi favorablement la viscosité des solutions aqueuses du produit clinique final, où le dextrane posséda une monodispe rsité moléculaire améliorée.
On a constaté que, lorsque l'hydrolyse est exécutée en chauffant la solution acide - qui contient l'isopropanol et, initialement, le dextrane natif à fractionner, à poids moléculaire moyen élevé, - à 85 C environ, c'est-à-dire à la température du point d'ébullition du mélange eau-isopropanol, cela jusqu'à l'achèvement de l'hydrolyse, ce qui a généralement lieu au bout de quelques minutes, les solutions aqueuses à 6 % de dextrane clinique, séparées de l'hydrolysat, par exemple par précipitation fractionnée, possèdent une viscosité relative supérieure à celle des solutions à 6 % de dextrane hydrolysé obtenu à partir d'un dextrane natif analogue et qui a été hydrolysé dans un milieu acide, mais en l'absence d'alcool. Cette viscosité relative plus élevée des solutions aqueuses constitue une caractéristique avantageuse.
Il semble que cette viscosité plus grande des solutions aqueuses à 6 % de dextrane hydrolysé dans les conditions décrites ici puisse être attribuée au fait que les molécules de dextrane hydrolyse en présence d'isopropanol, par exemple, sont quelque peu moins ramifiées que le dextrane hydrolysé dans les conditions pratiquées à ce jour. En d'autres termes, l'isopropanol est de nature à augmenter la "déramification" du dextrane au cours de l'hydrolyse acide, ce qui fournit une molécule de dextrane plus linéaire.
Ceci signifie encore qu'une plus grande proportion des liaisons 1, 6 se répétant dans la structure moléculaire du dextrane peuvent être fractionnées lorsque l'hydrolyse est exécutée en présence d'isopropanol.Quelle que soit l'explication de ce fait, les solutions aqueuses possèdent une plus grande viscosité
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que les solutions de concentration équivalente de dextrane hydrolysé en milieu acide, en l'absence d'alcool. Par exemple, le dextrane hydrolysée en milieu aqueux ayant une concentration d'iso, propanol de 33 1/3 % du volume de l'eau, possède, à 25 C, une viscosité relatifs de 5,3, tandis que les solutions aqueuses à 6 % de-dextrane "natif analogue, hydrolysé en l'absence d'isopropanol, n'ont, à 25 C, qu'une viscosité relative de 4,3.
La viscosité accrue des solutions selon la présente invention est nettement avantageuse du point de vue clinique.
Il est préférable que la température de la masse en hydrolyse soit maintenue de façon sensiblement constante au point d'ébullitiondu mélange eau-isopropanol. L'apport de chaleur étant constant, l'obtention de ce résultat est facilitée par l'effet de refroidissement dû à la vaporisation du mélange isoproponal-eau.
L'hydrolyse peut éventuellement être exécutée à reflux.
Lorsque l'hydrolyse est exécutée par charges successives, la même concentration d'alcool doit exister au début de chaque opération d'hydrolyse., de sorte que le produit de chaque charge possède les mêmes caractéristiques physiques et fournisse des solutions aqueuses ayant la même viscosité et le même degré de monodispersité moléculaire du dextrane.
Bien qu'il soit préférable d'utiliser un acide minéral, tel que l'acide chlorhydrique ou sulfurique, pour la mise en train de l'hydrolyse, il convient de noter que d'autres acides, tels que l'acide phosphorique, ainsi que des acides organiques, tels que l'acide acétique, peuvent également être utilisés. Le pH du milieu acide aqueux peut se situer entre environ 1,20 et 1,26.
La présence de l'alcool dans la solution aqueuse acide a également pour effet d'abaisser la viscosité initiale de la solution, ce qui a pour résultat une transmission de chaleur plus aisée et plus uniforme à travers la masse.
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Lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, il est avantageux d'incorporer à la solution alcoolique aqueuse ,et acide (de dextrane mati± une petite quantité, par exemple entre 0,3 et 1 %. d'agent réducteur, ce qui contribue à inhiber le développement, au cours de l'hydrolyse, 'de réactions bxydatives indésirables, qui donnent à la solution une coloration -foncée.
L'acide ascorbique constitue un agent réducteur particulièrement favorable.
La durée de l'hydrolyse dans les conditions optima décrites .ci-dessus .. c'est-à-dire le chauffage à 85 C 'environ, du mélange aqueux contenant l'isopropanol - es% 'de 40 à 50 minutes. A la fin .de cette période de chauffage l'hydrolyse étant achevée, on ajoute immédiatement une solution caustique à la concentration et en la quantité requise pour ajuster le pH 'de l'hydrolysat à 6,8-7,0. La solution peut ensuite être refroidie à une température située entre environ SS à 45 C, après quoi la solution est soumise à une décoloration, à une déionisation età une clarification.
La décoloration s'effectue en faisant passer la solution à travers un lit de charbon de bois. La déionisation peut être réalisée en faisant passer la solution décolorée à travers un lit ;ou une colonne contenait une substance minérale 'ou une résine formant un échangeur efficace d'anions et de cations. La clarification ultérieure est généralement opérée en faisant passer la solution à travers la terre à ,diatomées..
Le dextrane hydrolysé, en solution .aqueuse., peut être soumis à une précipitation fractionnée, en utilisant l'alcool ou l'acétone comme agents de précipitation. On sait qu'en introdui sant des additions répétées et croissantes de quantités d'isopropanol ou d'acétone, capables de produire une précipitation, dans la solution aqueuse du produit de la dégradation partielle, on peut précipiter et isoler, à partir de l'hydrolysat, des fractions de dextrane à poids moléculaire moyen sélectif.
La pratique
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courante consiste Sa à ajouter à la solution, à titre de premier accroissement d'alcool, une quantité d'alcool suffisante pour précipiter sélectivement le dextrane ayant le poids moléculaire le plus élevé et qui ne peut pas être utilisé comme dextrane clini- que; à séparer le précipité ;
età ajouter ensuite une quantité d'alcool suffisante pour précipiter le dextrane clinique, en laissant en solution le dextrane ayant le poids moléculaire le moins élevée Ce traitement peut être suivi de l'isolement de la fraction clinique du dextrane d'avec le produit hydrolysé obtenu dans les conditions d'hydrolyse selon la présente invention. La fraction clinique du dextrane peut être déshydratée, en utilisant l'acétone ou l'alcool isopropylique, et en séchant finalement sous vide à une température de 50 C à 80 C.
Les exemples ci-après illustrent le procédé d'hydrolyse perfectionné selon l'invention.
EXEMPLE I.
Une solution aqueuse à 10 % de dextrane à poids moléculaire élevé, contenait de l'isopropanol dans une proportion de 7 % du volume de l'eau présente, a été additionnée d'acide chlorhydrique en quantité suffisante pour amener le pH de la solution à environ 1,04. Le dextrane natif demeure en solution à cette concentration d'isopropanolo On a ensuite chauffé la solution lentement jusque 85 C environ et on l'a maintenue à cette température pendant 40-50 minutes environ, après quoi la solution a été neutralisée, refroidie, décolorée, déionisée et clarifiée, ces traitements ayant été suivis par la précipitation de la fraction clinique du dextrane, qui a été récupérée, déshydratée et, finalement, séchée sous vide, Une solution aqueuse à 6 % du dextrane clinique obtenu de cette manière avait, à 85 C,
une viscosité relative d'environ 3,8 et convenait parfaitement pour les injections intraveineuses destinées à éliminer l'état de choc.
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EXEMPLE II.
On a reproduit l'Exemple I, sauf que l'on a remplacé l'isopropanol par l'éthanol et que la solution acidifiée a été chauffée à la température de 78 C et maintenue à cette tempéra- ture pendant 40-50 minutes.
EXEMPLE III.
On a reproduit l'Exemple I, sauf que l'isopropanol a été utilisé en une proportion de 8 % du volume de l'eau présente.
Une solution aqueuse à 6 % du dextrane clinique obtenu en tant que produit final avait, à 85 C une viscosité relative d'environ 4,0.
EXEMPLE IV.
On a reproduit l'Exemple I, sauf que l'isopropanol a été utilisé dans une proportion de 9 % du volume de l'eau présente.
Une solution aqueuse à 6 % du dextrane clinique obtenu avait, à
85 0, une viscosité relative d'environ 4,3.
EXEMPLE V.
On a reproduit l'Exemple I, sauf que l'isopropanol a été utilisé dans la solution aqueuse acide de dextrane natif en une proportion de 10 % du volume de l'eau présente. Une solution aqueuse à 6.% du dextrane clinique obtenu comme produit final avait, à 85 C, une viscosité relative de 4,8.
EXEMPLE VI.
L'Exemple I a été reproduit, sauf que la proportion d'iso- propanol dans la solution aqueuse acide était de 20 % du volume de l'eau.
EXEMPLE VII.
L'Exemple I a été reproduit, sauf que l'on a employé l'éthanol et que l'hydrolyse a été exécutée à 70 C environ.
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EXEMPLE VIII.
Dans le mode opératoire selon l'Exemple I, on a substitué le méthanol à l'isopropanol, dans une proportion de 10 % du volume de l'eau, et l'hydrolyse a été effectuée à environ 65 C, la durée de l'hydrolyse ayant été quelque peu plus longue que dans l'Exemple I, soit de 55-60 minutes environ.
EXEMPLE IX.
La dioxane a été substituée à l'isopropanol dans l'Exemple I et la température de l'hydrolyse a été élevée à environ 100 0, ce qui a quelque peu abrégé le temps requis pour produire la dégradation voulue.
EXEMPLE X.
On a utilisé l'acétone au lieu de l'isopropanol dans l'Exemple I9 l'hydrolyse étant effectuée à 56 0 environ pendant une durée de 60 minutes environ.
L'alcool ou la cétone, présents pendant l'hydrolyse constituent,chacun, comme on le sait, un agent qui précipite le dextrane à partir de la solution aqueuse, lorsqu'il est employé dans des proportions comparativement importantes, généralement supérieures à 35 % en diurne. Dans le procédé selon l'invention, la proportion de cétone ou d'alcool aliphatique, miscible à l'eau, présente au cours de l'hydrolyses soit de-2,5 % à 33 1/3 % du volume de.l'eau, est généralement insuffisante pour précipiter le dextrane à partir de la solution. En tout cas, la proportion d'alcool ou de cétone utilisée est contrôlée dans les limites indiquées, de sorte que le dextrane à hydrolyser demeure dans la solution.
Avec une proportion de 33 1/3 % d' isopropanol, par exemple, et à la température de travail de 85 C environ9 le dextrane demeure en solution,. La proportion la plus favorable d'alcool ou de cétone peut se situer entre 2,5 et la % ou, ce qui est encore plus avantageux, entre 7 % et 10 %, du volume de l'eau. A ces
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proportions,ni l'alcool ni la cétone ne forment un mélange azéotropique avec l'eau.
Lorsqu'il s'agit de séparer le dextrane natif, soit le dextrane à poids moléculaire élevé défavorable, d'avec le milieu la dans lequel il est produit par synthèse à partir de/saccharose, la précipitation'du dextrane peut s'effectuer à l'aide d'alcools ou de cétones. Ceci étant réalisé, il sera généralement préféra- ble d'utiliser, lors de*l'hydrolyse du dextrane, le même agent de précipitation, mais dans des proportions non susceptibles de provoquer une précipitation* Toutefois, ceci ne présente pas une importance essentielle, et l'alcool ou la cétone que l'on utilisa lors du fractionnement hydrolytique du dextrane, peuvent être différents de ceux employés pour précipiter le dextrane natif,
à condition que l'agent de précipitation !pour le produit natif soit éliminé aussi complètement que possible de lapasse de dextrane natif avant que ce dernier ne se dissolve dans la solution aqueuse acide et avant l'introduction de l'alcool ou de la cétone que l'on doit utiliser pour l'hydrolyse.
Lors de l'exécution de l'hydrolyse acide du dextrane en présence de quantités limitées d'alcool ou de cétone, à la tempé- rature du point d'ébullition du mélange eau-alcool ou eau-cétone-, ou au voisinage de cette température, on obtient un dextrane hydrolysé qui, en se fractionnant, fournit un dextrane ayant un poids moléculaire compris dans la gamma des poids moléculaires des substances servant à grossir la massa du plasma sanguin, et qui forme des solutions aqueuses d'une viscosité où la monodisper- sité moléculaire de dextrane atteint un haut degré, -qui convient parfaitement pour les injections intraveineuses, avec ceci que, en doses thérapeutiques, le dextrane demeure dans le système pen- dant un temps suffisamment long pour éliminer l'état de choc.
Comme.indiqué plus haut, le dextrane natif, c'est-à-dire à
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poids moléculaire élevé, peut être obtenu de diverses manières, soit, comme il a été décrit ici de façon générale, par conversion bactérienne des liaisons 1, 4 d'une dextrine en liaisons 1,6 de dextrane, ou de toute autre manière où l'on peut obtenir, à titre de produit, un dextrane d'un poids moléculaire moyen plus élevé que le 'dextrane clinique, le dextrane ainsi obtenu pouvant être hydrolyse par un acide afin de fournir une substance servant à grossir la masse du plasma sanguin.
Certaines modifications et variantes peuvent être apportées à la mise en pratique de la présente invention, sans s'écarter de l'esprit ni dépasser le cadre de celle-ci.
Par "substance servant à grossir la masse de plasma sanguin" en entend une substance qui peut être administrée en injections intraveineuses, soit pour compléter, soit pour remplacer les injections de plasma sanguin.
Par le terme "monodispersité" on entend une dispersion uni-.' forme de l'hydrolysat en milieu liquide, lorsque l'hydrolysat a un poids moléculaire uniforme et se disperse dans l'eau d'une manière plus égaler d'où une dispersion monomoléculaire. Par le terme "polydispersité" on entend 'une plus' grande disparité dans les poids moléculaires des fractions de dextrane, qui détermine une dispersion moins uniforme dans l'eau.
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The present invention relates to an improved process for the preparation of a relatively low molecular weight dextran; starting with a dextran of a relatively high molecular weight. More particularly, the invention relates to an improved process for producing "clinical" dextran from a dextran of a higher molecular weight, ie, from a "native" dextran.
Dextran which can be used in fluids for intravenous injections, administered for the purpose of relieving shock, is known as "clinical" dextran.
Specifications have been established for this clinical substance by the United States military authorities. One of these specifications relates to molecular weight, which should be such that the molecular weight of the 10% fraction having the lowest molecular weight is not less than about 25,000;
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that the molecular weight of the 10% fraction having the highest molecular weight is not more than about 200,000 and that the average molecular weight is between 50,000 and 100,000, preferably between 60,000 and 80. 000.
Another of these specifications relates to the relative viscosity of the aqueous injection solutions, which must be relatively high for the given concentration of dextran, which is generally 6% by weight.
In common practice, "clinical" dextran is obtained by partial and controlled depolymerization of "native" dextran, using acid as the hydrolysis agent.
The "native" dextran can be obtained in several different ways. It can be produced synthetically by inoculating a nutrient medium containing sucrose with dextran-producing microorganisms, such as those of the types Leuconostoc mes en- té Roi des and L. dextranicum, until a maximum dextran production, in which case the synthesis is carried out enzymically, in the presence of bacteria, or else, this dextran can be obtained by culturing the microorganisms with a view to producing the dextran-sucrase enzyme, by separating the enzyme by filtration of the culture, by introducing the filtrate, or the enzyme which has been separated from it,
in an aqueous solution of sucrose and allowing the mass to stand until dextran is produced by synthesis from sucrose, this synthesis being carried out in the absence of bacteria, cell debris, etc.
In either process, the "native" dextran is precipitated from the fermentation product or nutrient medium by the addition of a non-solvent for the dextran contained therein.
The native product has a very high molecular weight, which is calculated to be in the millions of millions, and is therefore not recommended for injections.
As indicated above, the classic practice consists
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fractionating the "native" dextran in an acidic solution, to obtain fractions having the desired reduced average molecular weight.
According to the present invention, the acid hydrolysis of the aqueous solution containing the "native dextran" is carried out by heating an aqueous acidic medium containing, in addition to dextran and water, a constant limited quantity for each charge, of an alcohol. A lower aliphatic miscible with water or with a ketone, such as acetone or dioxane, at the boiling point of the water-alcohol or water-ketone mixture, until the desired hydrolysis is complete.
In the preferred embodiment, the present proportion of alcohol or ketone is between 2.5% and 33 1/3% of the volume of water, the preferred adjuvant being isopropanol, the hydrolysis being carried out. at about 85 C.
In this improved and particularly favorable process, where the acidic aqueous solution of the "native" dextran, a solution containing isopropanol, is heated to about 85 ° C. and is maintained at this temperature for the duration of the hydrolysis reaction, the alcohol appears to exert a retarding or inhibiting effect on the rate of hydrolysis, which has a very favorable influence on the viscosity of the lacquer solutions of the "clinical" dextran separated from the hydrolyzate. Isopropanol obviously acts to inhibit the rate of hydrolysis, reducing the efficiency of the hydrolyzing acid due to a decrease in ionization, which, therefore, reduces the speed of the hydrolysis. hydrolysis or fractionation.
As indicated above, the "native" dextran subjected to hydrolysis has a high average molecular weight; however, some of its fractions have a higher molecular weight than others. Premature hydrolysis of the higher molecular weight portions results in undesirable increased polydispersity of the final hydrolyzed product in aqueous solution. Obviously, isopropanol selectively inhibits
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During the initial stages of hydrolysis, the premature rationing of the higher molecular weight dextran portions and thus favorably influences the viscosity of aqueous solutions of the final clinical product, where the dextran possessed improved molecular monodisperity.
It has been found that when the hydrolysis is carried out by heating the acidic solution - which contains isopropanol and, initially, the native dextran to be fractionated, at high average molecular weight, - to about 85 C, that is to say say at the boiling point temperature of the water-isopropanol mixture, this until the completion of hydrolysis, which usually takes place after a few minutes, the 6% aqueous solutions of clinical dextran, separated from the hydrolyzate, for example by fractional precipitation, have a relative viscosity greater than that of 6% solutions of hydrolyzed dextran obtained from an analogous native dextran and which has been hydrolyzed in an acidic medium, but in the absence of 'alcohol. This higher relative viscosity of aqueous solutions constitutes an advantageous characteristic.
It seems that this higher viscosity of 6% aqueous solutions of hydrolyzed dextran under the conditions described here can be attributed to the fact that the molecules of dextran hydrolyzed in the presence of isopropanol, for example, are somewhat less branched than hydrolyzed dextran. under the conditions practiced to date. In other words, isopropanol is likely to increase the "dextran" dextran "debranching" during acid hydrolysis, which provides a more linear dextran molecule.
This still means that a greater proportion of the 1, 6 repeating bonds in the molecular structure of dextran can be fractionated when hydrolysis is carried out in the presence of isopropanol. Whatever the explanation for this fact, aqueous solutions have a higher viscosity
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than solutions of equivalent concentration of dextran hydrolyzed in an acidic medium, in the absence of alcohol. For example, dextran hydrolyzed in aqueous medium having a concentration of iso, propanol of 33 1/3% of the volume of water, has, at 25 C, a relative viscosity of 5.3, while aqueous solutions at 6% dextran "native analogue, hydrolyzed in the absence of isopropanol, has, at 25 ° C, only a relative viscosity of 4.3.
The increased viscosity of the solutions according to the present invention is clearly advantageous from a clinical point of view.
It is preferable that the temperature of the mass under hydrolysis is maintained substantially constant at the boiling point of the water-isopropanol mixture. The heat input being constant, obtaining this result is facilitated by the cooling effect due to the vaporization of the isoproponal-water mixture.
The hydrolysis can optionally be carried out at reflux.
When the hydrolysis is carried out in successive batches, the same alcohol concentration should exist at the start of each hydrolysis operation., So that the product of each batch has the same physical characteristics and provides aqueous solutions with the same viscosity. and the same degree of molecular monodispersity of dextran.
While it is preferable to use a mineral acid, such as hydrochloric or sulfuric acid, for initiating hydrolysis, it should be noted that other acids, such as phosphoric acid, as well that organic acids, such as acetic acid, can also be used. The pH of the aqueous acidic medium can be between about 1.20 and 1.26.
The presence of alcohol in the acidic aqueous solution also has the effect of lowering the initial viscosity of the solution, resulting in easier and more uniform heat transfer through the mass.
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When carrying out the process according to the invention, it is advantageous to incorporate in the aqueous alcoholic and acidic solution (of mati dextran ± a small amount, for example between 0.3 and 1%. Of reducing agent. , which helps to inhibit the development, during hydrolysis, of 'undesirable oxidative reactions, which give the solution a dark color.
Ascorbic acid is a particularly favorable reducing agent.
The duration of the hydrolysis under the optimum conditions described above, that is to say the heating to approximately 85 ° C., of the aqueous mixture containing the isopropanol - es% of 40 to 50 minutes. At the end of this heating period, the hydrolysis being completed, a caustic solution is immediately added to the concentration and amount required to adjust the pH of the hydrolyzate to 6.8-7.0. The solution can then be cooled to a temperature between about SS to 45 ° C, after which the solution is subjected to decoloration, deionization and clarification.
Discoloration is accomplished by passing the solution through a bed of charcoal. Deionization can be accomplished by passing the decolored solution through a bed, or a column contained an inorganic substance or a resin forming an efficient anion and cation exchanger. Subsequent clarification is usually carried out by passing the solution through diatomaceous earth.
The hydrolyzed dextran, in aqueous solution, can be subjected to fractional precipitation, using alcohol or acetone as precipitating agents. It is known that by introducing repeated and increasing additions of quantities of isopropanol or of acetone, capable of producing a precipitation, into the aqueous solution of the product of the partial degradation, it is possible to precipitate and isolate, from the hydrolyzate, selective average molecular weight dextran fractions.
The practice
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A common practice is to add to the solution, as the first alcohol build-up, an amount of alcohol sufficient to selectively precipitate the dextran having the highest molecular weight and which cannot be used as a clinical dextran; separating the precipitate;
andthen adding a sufficient amount of alcohol to precipitate the clinical dextran, leaving the dextran with the lower molecular weight in solution This treatment can be followed by isolating the clinical fraction of the dextran from the hydrolyzed product obtained under the hydrolysis conditions according to the present invention. The clinical fraction of dextran can be dehydrated, using acetone or isopropyl alcohol, and finally drying in vacuo at a temperature of 50 C to 80 C.
The examples below illustrate the improved hydrolysis process according to the invention.
EXAMPLE I.
A 10% aqueous solution of high molecular weight dextran, contained isopropanol in a proportion of 7% of the volume of the water present, was added hydrochloric acid in an amount sufficient to bring the pH of the solution to about 1.04. The native dextran remains in solution at this concentration of isopropanolo The solution was then slowly heated to about 85 ° C and kept at this temperature for about 40-50 minutes, after which the solution was neutralized, cooled, decolorized. , deionized and clarified, these treatments having been followed by the precipitation of the clinical fraction of the dextran, which was recovered, dehydrated and, finally, dried under vacuum, A 6% aqueous solution of the clinical dextran obtained in this way had, to 85 C,
a relative viscosity of about 3.8 and was well suited for intravenous injections intended to eliminate shock.
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EXAMPLE II.
Example I was repeated except that the isopropanol was replaced by ethanol and the acidified solution was heated to a temperature of 78 ° C. and held at that temperature for 40-50 minutes.
EXAMPLE III.
Example I was repeated except that isopropanol was used in an amount of 8% of the volume of water present.
A 6% aqueous solution of the clinical dextran obtained as a final product had, at 85 ° C., a relative viscosity of about 4.0.
EXAMPLE IV.
Example I was reproduced except that isopropanol was used in a proportion of 9% of the volume of water present.
A 6% aqueous solution of the obtained clinical dextran had, at
85 0, a relative viscosity of about 4.3.
EXAMPLE V.
Example I was repeated, except that isopropanol was used in the acidic aqueous solution of native dextran in a proportion of 10% of the volume of water present. A 6.% aqueous solution of the clinical dextran obtained as a final product had, at 85 ° C, a relative viscosity of 4.8.
EXAMPLE VI.
Example I was reproduced except that the proportion of isopropanol in the acidic aqueous solution was 20% of the volume of water.
EXAMPLE VII.
Example I was reproduced except that ethanol was used and the hydrolysis was carried out at about 70 ° C.
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EXAMPLE VIII.
In the procedure according to Example I, methanol was substituted for isopropanol, in a proportion of 10% of the volume of water, and the hydrolysis was carried out at about 65 ° C., the duration of the hydrolysis having been somewhat longer than in Example I, approximately 55-60 minutes.
EXAMPLE IX.
Dioxane was substituted for isopropanol in Example I and the temperature of the hydrolysis was raised to about 100 °, which somewhat shortened the time required to produce the desired degradation.
EXAMPLE X.
Acetone was used instead of isopropanol in Example 19 with hydrolysis being carried out at about 560 for a period of about 60 minutes.
Alcohol or ketone, present during hydrolysis, each constitute, as is known, an agent which precipitates dextran from aqueous solution, when employed in comparatively large proportions, generally above 35%. in the daytime. In the process according to the invention, the proportion of ketone or aliphatic alcohol, miscible with water, present during the hydrolyses is from −2.5% to 33 1/3% of the volume of. water, is usually insufficient to precipitate dextran from solution. In any case, the proportion of alcohol or ketone used is controlled within the limits indicated, so that the dextran to be hydrolyzed remains in the solution.
With a proportion of 33 1/3% of isopropanol, for example, and at the working temperature of approximately 85 ° C., the dextran remains in solution. The most favorable proportion of alcohol or ketone can be between 2.5% and 1% or, even more advantageously, between 7% and 10%, by volume of water. To these
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proportions, neither the alcohol nor the ketone form an azeotropic mixture with water.
When it comes to separating the native dextran, that is to say the unfavorable high molecular weight dextran, from the medium la in which it is produced by synthesis from / sucrose, the precipitation of the dextran can take place at using alcohols or ketones. This being done, it will generally be preferable to use, during the hydrolysis of dextran, the same precipitating agent, but in proportions not liable to cause precipitation. However, this is not of essential importance. and the alcohol or the ketone which was used during the hydrolytic fractionation of the dextran, may be different from those employed to precipitate the native dextran,
provided that the precipitating agent for the native product is removed as completely as possible from the native dextran slurry before the latter dissolves in the acidic aqueous solution and before the introduction of the alcohol or ketone which one should use for hydrolysis.
When carrying out the acid hydrolysis of dextran in the presence of limited amounts of alcohol or ketone, at or near the temperature of the boiling point of the water-alcohol or water-ketone mixture. temperature, a hydrolyzed dextran is obtained which, on fractionating, yields a dextran having a molecular weight within the gamma of the molecular weights of the substances used to increase the mass of the blood plasma, and which forms aqueous solutions of a viscosity where the Dextran molecular monodisperity reaches a high degree, which is ideally suited for intravenous injections, with the result that, in therapeutic doses, the dextran remains in the system for a time long enough to eliminate shock.
As indicated above, native dextran, that is to say to
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high molecular weight, can be obtained in various ways, either, as has been described herein generally, by bacterial conversion of the 1, 4 bonds of a dextrin to 1,6 bonds of dextran, or in any other manner where As a product, a dextran of a higher average molecular weight than clinical dextran can be obtained, the dextran thus obtained being hydrolyzable with acid to provide a substance for bulking up the mass of blood plasma.
Certain modifications and variations may be made to the practice of the present invention without departing from the spirit or going beyond the scope thereof.
By "substance used to increase the mass of blood plasma" is meant a substance which can be administered by intravenous injections, either to supplement or to replace injections of blood plasma.
By the term "monodispersity" is meant a uniform dispersion. forms the hydrolyzate in a liquid medium, when the hydrolyzate has a uniform molecular weight and disperses in water in a more equal manner resulting in a monomolecular dispersion. By the term "polydispersity" is meant a greater disparity in the molecular weights of the dextran fractions, which results in a less uniform dispersion in water.