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L'invention est relative aux procédés de prépara- tion de la lysine qui est une aminé acide essentiel ayant une grande importance ; et elle concerne, plus spécialement, un procédé pour'préparer la lysine à partir du composé dé- nommé acide diaminopimélique ainsi qu'un procédé pour prépa-
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rer l'acide dianinopimélique lui-même.
Bien que les travaux dans ce domaine soient relati- vement récente, la littérature, à cause de l'importance de la lysine, contient déjà des indications considérables à son sujet. Davis, dit dans Nature, Vol 169, page 534 (1952) que certains auxotrophes, qui ont besoin de lysine, des Esche- richia coli fournissent des quantités relativement grandes d'acide diaminopimélique.
Une enzyme, qui décarboxyle l'aci-
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de dia:1Ïnopil1CHique pour fournir de la lysine, est indiquée comme existant dans plusieurs bactéries z. iiork - 11 sympo- sium on Amino Acid Métabolism, 1955) mais comme étant absen- te dans les auxotrophes ayant besoin de lysine (Lewey, Iloare &u'ork, 3iochcrnical Journal, Vol. 58 page S;.3 1954 Voir 6[':0.- lement Wright et Cresson, Proceedings of the Society :or Expérimental Biology and Médecine, Vol. F2, }''.2:e 35'i-, 1953.) ' On a découvert maintenant que l'acide. (1.i.<.H1jilhhL- mélique peut être obtenu avec un rendement é]'v6 ut, .J81..ti'., ensuite, être converti en lysine avec un 1'8]\<' W'!l::1Jl, '1 e,r'l quand on a recours à certaines conditions, nouvelles et réglé es, pour les réactions.
Par conséquent, on étudié une méthode pour pré- parer la lysine à un prix notablement inférieur à celui au- quel le composé est couramment vendu dans le commerce.
La première opération pour cette nouvelle synthèse de la lysine est la production de l'acide diaminopimélique.
Cette opération a lieu dans une cuve profonde et aérée, c'est- à-dire par fermentation submergée, on utilisant uneespèce mu
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tante de E. coli qui est incapable de décarboxyler l'acide diaminopimélique en lysine. Ces espèces mutantes peuvent ê tre obtenues par la méthode à la pénicilline de Davis (cités plus haut). On a découvert que plusieurs souches de E. coli, qui ne sont pas capables de convertir l'acide diaminopimé-, lique en lysine et ont besoin de lysine pour leur croissance, sont utiles pour la mise en oeuvre de cette réaction.
En particulier, on a découvert qu'une souche, choisie parmi plusieurs autres.souches convient pour cette réaction, pour fournir le meilleur rendement, bien que d'autrs souches de E. coli, ayant besoin de lysine, conviènnent également. Une culture croissante de'cette souche préférée de E. coli, ayant besoin de lysine.pour sa croissance, et qui convient à la production d'acide diaminopimélique avec un rendement élevé a été déposée à la American Type Culture Collection à Washington, D. C. et ajoutée à sa collection per manente dans laquelle on lui a donné le numéro ATCC 12,408 Afin que cette réaction, qui produit l'acide diaminopiméli- que, puisse se faire avec un rendement élevé, les conditions doivent être soigneusement réglées. On a découvert que, pen dant la fermentation, le pH doit être maintenu au voisinage de la neutralité.
Pendant la fermentation, le pH tend à di minuer et la neutralité est conservée par l'addition d'alca li, par exemple le NaOH ou KOH et, de préférence, de l'hy- droxyde d'ammonium. L'urée peut également être utilisée à cet effet quand elle est convertie en ammoniac* Vers la fin de la fermentation, le pH tend à augmenter et la neutra- lité est conservée en ajoutant au milieu de l'acide sulfuri' due. On a également découvert que l'addition de glycérol au milieu est extrêmement utile. On a aussi découvert que le mar nitol peut être utilisé à la place du glycérol, mais on a constaté que le glycorol est plus efficace et plus économi- que.
De plus-, on a découvert que la'liqueur de macération de
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maïs est un constituant particulièrement bon pour le milieu de fermentation. Cette liqueur fournit la lysine nécessaire à la croissance des auxotrophes de E. coli et agit, peut-être aussi comme source économique de précurseurs tels que l'acide aspartique et l'acide lactique. Par conséquent, à l'aide de ces trois réglage:; nouvellement découverts de la fermentation àsavoir : 1) réglage précis du pH à, ou au voisinage de, la neutralité ; 2) addition de glycérol depuis 1 à 10% en volume;
3) usage de la liqueur de macération de maïs ; on a constaté qu'il est possible d'obtenir de l'acide dia- minopimélique d'une manière économique et sur une grande échelle industrielle. L'acide diaminopimélique est, évidemment un composé ayant une valeur extrêmement importante. Il est utile par lui-même etégalement, comme produit intermédiaire pour la synthèse de lysine, convie indiqué plus loin. On a également obtenu une certaine preuve que l'acide diaminopimé- . lique peut être utilisé comme supplément pour la nourriture de la volaille pour laquelle il peut remplacer la lysine.
Cette fermentation a lieu a environ 25 et, géné ralement trois jours à peu près sont nécessaires pour obtenir un rendement optimum. Il est évident que les conditions, pour obtenir le meilleur rendraient, varient quelque peu avec la souche particulière de l'organisme utilisé.
L'opération finale pour la synthèse de la lysine est la conversion de 1 acide diaminopimélique en lysine. Ceci est obtenu par le traitement de l'acide diaminopimélique de préférence dans le bouillon initial contenant les cellules, avec la décarboxyliase d'enzyne d'acide diaminoimélique obte-. que à partir d'organismes de l'espèce Aerobacter aerogenes et aussi à partir des membres ordinaires de l'espèce E. coli qui n'ont pas besoin do lysine pour leur croissance. L'enzyme est libérée, à partir de ces organismes, par une quelconque des méthodes ordinaires utilisées pour libérer les enzymes.
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Ces méthodes comprennent le traitement avec un solvant tel que le butanol, le traitement par une énergie ultrasonique, et la préparation d'une poudre séchée par l'acétone.
On a découvert que la méthode préférée pour libérer la décarboxylase d'enzyme d'acide diaminopimélique d'avec les organismes du genre A.aerogenes et les organismes du genre E. coli qui n'oint pas besoin de lysine pour leur croissance est le traitement avec le solvant toluène, ce qui présente l'a- vantage additionnel de conserver la stérilité pendant les dernières phases de la réaction pour laquelle l'enzyme est utilisée. Les cellules peuvent être traitées avec le toluè- ne avant ou après l'addition du bouillon d'acide diaminopi- mélique initial mais dans l'un ou l'autre cas on profère que le toluène soit présent dans le mélange de conversion et n'en soit pas séparé.
Une souche particulière de A. aerogened, qui procure des rendements très élevés parce qu'elle ne con- tient pas de décarboxylase d'enzyme de lysine, a été déposée au ATCC et a reçu le numéro 12.409.
Pour obtenir la conversion maximum de l'acide dia- minopimélique en lysine, il est avantageux que certaines con- ditions soient utilisées. On a découvert que l'adddition d agents de chelification, tels que les ions citrate et les sels tétrasodiques de l'acide éthylènediaminetétracétique est très avantageuse pour effectuer cette réaction. l'additon de la vitamine B6 est également utile. L'agent de chelification et la vitamine B6 sont spécialement utiles quand on fait réagir des concentrations élevées d'acide diaminopimélique. On a éga lement découvert que la mise en oeuvre de cette réaction en l'absence de lumière augmente également le rendement mais ceci n'est pas essentiel.
Cette conversion de l'acide diaminopimélique en lysine a lieu en environ 24 heures. On a constaté qu'une température d'environ 28 procure de bosn résultats.
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Après cette réaction, la lysine est purifiée par filtration du mélange de réaction enzyme, par absorption de la lysine sur une résine échangeuse de cations forte., telle que la résine à base d'acide sulfonique, dénommée Amberlite IR-120 (TM de Rohm and Haas Co), par élution de la lysine d'avec la résine échangeuse de cations par un alcali dilué tel que l'hydroxyde de potassium ou de sodium, par le passage de cet éluat à travers une réside échangeuse de cations faible, telle que la résine carboxylique Amberlite IRC-50(TM de Rohm and Haas Co) qui n'absorbe pas la lysine, et par séchage de lteffluant: Une purification additionnelle se fait alors par la méthode ordinaire de recristallisation.
Les exemples ci-dessous sont donnés uniquement à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif ni res- trictif car plusieurs variantes de ces exemples sont passi- bles sans sortir des limites de protection de l'invention EXEMPLE I:
- Production de l'acide diaminopimélique
On cultive le E. coli ATCC 12.408 pendant 20 heures à 28 en le secouant avec le milieu suivant, qui a été stéri- lisé prélablement dans un autoclave pendant 30 minutes sous une pression de 1,4 kg/cm2
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<tb> NH42PO4 <SEP> 0,5%
<tb>
<tb>
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> glycérol <SEP> 0,5
<tb>
pH réglé à 7,5 avec de l'hydroxyde de potassium.
Un autre milieu est préparé pour l'obtention effec- tive d'acide diaminopimélique. Ce milieu a la composition suivante :
EMI5.2
<tb> NH4) <SEP> 2HP4 <SEP> 4%
<tb>
<tb>
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 4 <SEP> en <SEP> volunie
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> glycétol <SEP> 6 <SEP> " <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CaCO <SEP> 0,5
<tb>
Le pH est réglé à 7,5 avec de l',hydroxyde de po tassium. On traite deux litres de ce milieu dans un autoclave
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pendant une heure sous une pression de 1,4 kg/cm2.
On ajoute 100 cm3 de ltinoculum initial à deux litres du milieu utilisé pour la.production. La réaction est effectuée à 28 avec agitation à une vitesse de 1750 t/min., avec aération et a un débit de 1 volume d'air par volume du mélange de réaction et par minute. Une trace d'huile de soja est ajoutée comme agent anti-mousse. Après 72 heures, l'analyse du mélange montre qu'il a une teneur en acide diaminopimélique de 9,0 mg/ml.
EXEMPLE II
Variante de la production de l'acide diamino- pimélique.
On cultive le E. coli n ATCC 12.408 sur le milieu nutritif décrit dans l'exemple I pour obtenir un inooulum. Un litre de cet inoculum est ajouté à 85 litres du milieu' de production stérilisé suivant :
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<tb> (NH4)2HOP4 <SEP> 2 <SEP> % <SEP>
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 4 <SEP> en <SEP> volume
<tb>
<tb> glycérol <SEP> 7 <SEP> " <SEP> "
<tb>
<tb> CaCo3 <SEP> 0,5
<tb>
EMI6.2
pu réglé à 7,5 avec de LllliyclroxycL'e de potassium.
La réaction a lieu à 28 avec agitation à une vitesse de 1750 t/min et avec aération, à un débit d'un volume dtair par volume de mélange de réaction et par minu- te. Une trace dtAntifoam A de la Société Dow Corning (anti-mousse à base de silicone) est ajoutée comme agent anti-mousse. Pendant la réaction, le pH est maintenu au voisinage de la neutralité en ajoutant progressivement de lthydroxyde dtammonium en commençant à la fin d'une durée de réaction d'environ 24 heures. Le pH tend à diminuer et on préfère ajouter progressivement de l'hydroxyde d'ammo-
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nium de manière à maintenir le pH très légèrementjàu-dessus de la neutralité (entre 7 et environ 7,5) pour empêcher
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ainsi le développement d'un bas pH.
Après 64 heures de progression de la réaction, il est nécessaire d'ajouter de l'acide sulfurique pour conserver la neutralité car, à cette phase de la réaction, le pH tend à monter. Après 68 heures, l'analyse du mélange de réaction montre qu'il a une teneur en acide diaminopimélique de 6,5 mg/ml.
EXEMPLE III
Conversion de l'acide diaminopimélique en ly- sine.
On règle le pH à 7,2 de 100 ml d'un bouillon dans lequel l'acide diaminopimélique a été obtenu de la ma nière décrite dans l'exemple I, ce bouillon ayant une te- neur de 2,5 mg d'acide diaminopimélique par ml. Il est à noter que les cellules de E. coli utilisées pour produire l'acide diaminopimélique n'ont pas été enlevées de ce bouillon et qu'on a permis qu'elles restent dans celui-ci.
Ce bouillon est contenu dans un flacon Erlenmeyer de 300 cm3. On y ajoute 5 cm3 de toluène.
On cultive du A. aerogenes, ATCC n 12,409 pendant 20 heures dans des portions de 2 litres du milieu suivant :
EMI7.1
<tb> - <SEP> glycérol <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb>
EMI7.2
(NH 4)2HP04 0,5
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<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,5
<tb>
pH réglé à 7,5 par de l'hydroxyde d'ammonium.
Les conditions pour la culture sont : une tem- pérature de 28 une agitation à la vitesse de 1750 t/min; une aération avec un débit d'un volume d'air/volume du mé lange/minute. Une trace d'huile de soja est ajoutée comme agent anti-mousse. Après 20 heures, on procède à la cen- trifugation de 25 cra3 du bouillon contenant les cellules en suspension. Le liquide surnageant est écarté. Ces cellules sont alors introduites dans le flacon Erlenmeyer
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contenant le bouillon d'acide diaminopimélique et le toluè- ne. Ce flacon est secoué pendant 16 heures à 28 et à la fin de cette période, l'acide diaminopimélique est conver- ti en lysine avec un rendement de 100 %. La lysine est obtenue par un traitement avec éehange d'ions.
EXEMPLE IV
Variante pour la conversion de l'acide diamino pimélique en lysine.
On introduit 100 cm3 d'un bouillon d'acide diaminopimélique dans un flacon Erlenmeyer de 300 cm3. Le pH est réglé à 7,2 et 5 cm3 de toluène sont ajoutés.
On cultive du A. aerogenes, n ATCC 12.409, comme dans l'exemple III et à la;fin de 20 heures on sou- met 7 ml du bouillon dans lequel! sont suspendues les cel- lules à une centrifugation. Le liquide surnageant est écarté. Les cellules sont séchées par congélation et don- nent 75 mg de matières solides qui sont ajoutées au flacon Erlemmeyer contenant l'acide diaminopimélique et le toluè- ne. Ce flacon Erlenmeyer est secoué pendant 16 heures à 28 et, après cela, on constate que l'acide diamonopiméli- que a été convertu en lysine avec un rendement de 100%
EXEMPLE V
Utilisation de composés de chélification.
Au cours d'autres expériences concernant la conversion d'acide diaminopimélique en lysine, effectuées de la manière indiquée dans les exemples III et IV ci-des- sus, on a constaté que, dans les cas d'un bouillon conte- nant de l'acide diaminopimélique avec une teneur élevée en cet acide, la conversion en lysine peut se faire d'une manière plus complète et plus rapide que cela pourrait se faire avec des bouillons contenant ces concentrations éle- vées quand on ajoute un agent de chélification à ce mélan- ge. L'acte citrique et le sel tétrasodique de l'acide
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éthylènediaminotétracétique sont avantageux, lorsqu'ils sont ajoutés à des concentrations comprises entre environ
0,004 partie moléculaire et 0,032 partie moléculaire. L'u- sage de concentrations plus élevées n'est pas recommandé.
L'addition de la vitamine B6 au cours de la conversion de l'acide diaminopimélique en lysine est -éga- lement utile pour la mise en oeuvre de l'invention. Des traces de cette vitamine sont seulement nécessaires.
REVENDICATIONS
1. Procédé pour préparer de l'acide diaminopiméli- 'que par fermentation submergée aérobique d'une espèce mu- tante de E. coli qui a besoin de lysine pour sa croissance et ne contient pas de décarboxylase d'enzyme d'acide dia- minopimélique, la fermentation ayant lieu sur un milieu nutritif dont le pH est maintenu à une valeur voisine de la neutralité.
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The invention relates to processes for the preparation of lysine which is an essential amino acid of great importance; and more especially it relates to a process for preparing lysine from the compound called diaminopimelic acid as well as to a process for preparing lysine.
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rer the dianinopimelic acid itself.
Although the work in this field is relatively recent, the literature, because of the importance of lysine, already contains considerable indications about it. Davis, says in Nature, Vol 169, page 534 (1952) that certain auxotrophs, which require lysine, of Esche- richia coli provide relatively large amounts of diaminopimelic acid.
An enzyme, which decarboxylates acid
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of dia: inopilichic to provide lysine, is indicated to exist in several bacteria z. iiork - 11 sympo- sium on Amino Acid Metabolism, 1955) but as being absent in auxotrophs requiring lysine (Lewey, Iloare & u'ork, 3iochcrnical Journal, Vol. 58 page S;. 3 1954 See 6 [' : 0.- Element Wright and Cresson, Proceedings of the Society: or Experimental Biology and Medicine, Vol. F2,} ''. 2: e 35'i-, 1953.) 'It has now been discovered that acid. (1.i. <. H1jilhhL- melic can be obtained with a yield of] 'v6 ut, .J81..ti'., Then, be converted into lysine with a 1'8] \ <'W'! L: : 1Jl, '1 e, r'l when certain new and regulated conditions are used for the reactions.
Therefore, a method was investigated to prepare lysine at a price significantly lower than that at which the compound is commonly sold commercially.
The first operation for this new synthesis of lysine is the production of diaminopimelic acid.
This operation takes place in a deep and aerated tank, that is to say by submerged fermentation, using a mu species.
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aunt of E. coli who is unable to decarboxylate diaminopimelic acid to lysine. These mutant species can be obtained by the Davis penicillin method (cited above). It has been found that several strains of E. coli which are not capable of converting diaminopimlic acid to lysine and require lysine for their growth are useful for carrying out this reaction.
In particular, it has been found that one strain, selected from among several other strains, is suitable for this reaction to provide the best yield, although other strains of E. coli, which require lysine, are also suitable. A growing culture of this preferred strain of E. coli, requiring lysine for growth, and which is suitable for the production of diaminopimelic acid in high yield has been deposited in the American Type Culture Collection in Washington, DC and added to its permanent collection in which it has been given ATCC number 12,408 In order for this reaction, which produces diaminopimelic acid, to proceed in high yield, the conditions must be carefully controlled. It has been found that during fermentation the pH must be maintained in the vicinity of neutrality.
During fermentation, the pH tends to decrease and neutrality is maintained by the addition of alkali, for example NaOH or KOH and preferably ammonium hydroxide. Urea can also be used for this purpose when it is converted to ammonia. Towards the end of fermentation the pH tends to increase and neutrality is retained by adding sulfurized acid to the medium. It has also been found that the addition of glycerol to the medium is extremely useful. It has also been found that mar nitol can be used in place of glycerol, but glycorol has been found to be more efficient and economical.
In addition, it was discovered that the maceration liqueur of
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corn is a particularly good constituent for the fermentation medium. This liquor provides the lysine necessary for the growth of E. coli auxotrophs and acts, perhaps also as an economical source of precursors such as aspartic acid and lactic acid. Therefore, using these three setting :; Newly discovered from fermentation to know: 1) fine adjustment of pH at, or near, neutral; 2) addition of glycerol from 1 to 10% by volume;
3) use of corn maceration liquor; it has been found that it is possible to obtain diaminopimelic acid economically and on a large industrial scale. Diaminopimelic acid is, of course, a compound of extremely important value. It is useful on its own and also, as an intermediate for the synthesis of lysine, discussed below. There has also been some evidence that diaminopime acid. Lique can be used as a supplement for poultry feed for which it can replace lysine.
This fermentation takes place about 25 and, generally about three days are necessary to obtain an optimum yield. Obviously, the conditions, to get the best performance would vary somewhat with the particular strain of organism used.
The final step for the synthesis of lysine is the conversion of diaminopimelic acid to lysine. This is achieved by treating the diaminopimelic acid, preferably in the initial broth containing the cells, with the obtained diaminoimelic acid enzyme decarboxylase. as from organisms of the species Aerobacter aerogenes and also from ordinary members of the species E. coli which do not require lysine for their growth. The enzyme is released from these organisms by any of the ordinary methods used to release the enzymes.
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These methods include treatment with a solvent such as butanol, treatment with ultrasonic energy, and preparation of a powder dried with acetone.
It has been found that the preferred method of releasing the diaminopimelic acid enzyme decarboxylase from organisms of the genus A.aerogenes and organisms of the genus E. coli which do not require lysine for their growth is by treatment. with the toluene solvent, which has the additional advantage of maintaining sterility during the later stages of the reaction for which the enzyme is used. Cells can be treated with toluene before or after addition of the initial diaminopimic acid broth, but in either case toluene is said to be present in the conversion mixture and not not separate from it.
A particular strain of A. aerogened, which provides very high yields because it does not contain the lysine enzyme decarboxylase, has been deposited with ATCC and received number 12.409.
In order to obtain the maximum conversion of diaminopimelic acid to lysine, it is advantageous that certain conditions are used. It has been found that the addition of chelating agents, such as citrate ions and tetrasodium salts of ethylenediaminetetraacetic acid is very advantageous to effect this reaction. Adding vitamin B6 is also helpful. The chelating agent and vitamin B6 are especially useful when reacting high concentrations of diaminopimelic acid. It has also been found that carrying out this reaction in the absence of light also increases the yield, but this is not essential.
This conversion of diaminopimelic acid to lysine takes place in about 24 hours. It has been found that a temperature of about 28 gives good results.
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After this reaction, the lysine is purified by filtration of the enzyme reaction mixture, by absorption of the lysine on a strong cation exchange resin, such as the sulfonic acid-based resin, called Amberlite IR-120 (TM from Rohm and Haas Co), by eluting lysine from the cation exchange resin by a dilute alkali such as potassium or sodium hydroxide, by passing this eluate through a weak cation exchange reside, such as Amberlite IRC-50 carboxylic resin (TM from Rohm and Haas Co) which does not absorb lysine, and by drying the effluent: Additional purification is then carried out by the ordinary recrystallization method.
The examples below are given solely by way of illustration and are in no way limiting or restrictive, since several variants of these examples are acceptable without departing from the limits of protection of the invention. EXAMPLE I:
- Production of diaminopimelic acid
E. coli ATCC 12.408 was cultured for 20 hours at 28 hours by shaking it with the following medium, which had been sterilized beforehand in an autoclave for 30 minutes under a pressure of 1.4 kg / cm2.
EMI5.1
<tb> NH42PO4 <SEP> 0.5%
<tb>
<tb>
<tb> liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> 0.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> glycerol <SEP> 0.5
<tb>
pH adjusted to 7.5 with potassium hydroxide.
Another medium is prepared for the actual production of diaminopimelic acid. This medium has the following composition:
EMI5.2
<tb> NH4) <SEP> 2HP4 <SEP> 4%
<tb>
<tb>
<tb> liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> 4 <SEP> in <SEP> volunie
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> glycetol <SEP> 6 <SEP> "<SEP>"
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CaCO <SEP> 0.5
<tb>
The pH is adjusted to 7.5 with potassium hydroxide. We treat two liters of this medium in an autoclave
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for one hour under a pressure of 1.4 kg / cm2.
100 cc of the initial inoculum are added to two liters of the medium used for production. The reaction is carried out at 28 with stirring at a speed of 1750 rpm, with aeration and at a flow rate of 1 volume of air per volume of the reaction mixture per minute. A trace of soybean oil is added as an anti-foaming agent. After 72 hours, analysis of the mixture shows that it has a diaminopimelic acid content of 9.0 mg / ml.
EXAMPLE II
Variant of the production of diamino-pimelic acid.
E. coli ATCC 12.408 is cultured on the nutrient medium described in Example I to obtain inooulum. One liter of this inoculum is added to 85 liters of the following sterilized production medium:
EMI6.1
<tb> (NH4) 2HOP4 <SEP> 2 <SEP>% <SEP>
<tb> liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> 4 <SEP> in <SEP> volume
<tb>
<tb> glycerol <SEP> 7 <SEP> "<SEP>"
<tb>
<tb> CaCo3 <SEP> 0.5
<tb>
EMI6.2
pu set to 7.5 with LllliyclroxycL'e of potassium.
The reaction takes place at 28 with stirring at a speed of 1750 rpm and with aeration at a rate of one volume of air per volume of reaction mixture per minute. A trace of Antifoam A from the Dow Corning Company (silicone-based defoamer) is added as an antifoam agent. During the reaction, the pH is kept near neutral by gradually adding ammonium hydroxide starting at the end of a reaction time of about 24 hours. The pH tends to decrease and it is preferred to gradually add ammonium hydroxide.
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nium so as to keep the pH very slightly above neutral (between 7 and about 7.5) to prevent
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thus the development of a low pH.
After 64 hours of progress of the reaction, it is necessary to add sulfuric acid to maintain neutrality because, at this phase of the reaction, the pH tends to rise. After 68 hours, analysis of the reaction mixture shows that it has a diaminopimelic acid content of 6.5 mg / ml.
EXAMPLE III
Conversion of diaminopimelic acid to lysine.
100 ml of a broth in which diaminopimelic acid was obtained as described in Example I was adjusted to pH 7.2, this broth having a content of 2.5 mg of acid. diaminopimelic per ml. It should be noted that the E. coli cells used to produce diaminopimelic acid were not removed from this broth and were allowed to remain in it.
This broth is contained in a 300 cm3 Erlenmeyer flask. 5 cm3 of toluene are added thereto.
A. aerogenes, ATCC No. 12,409 was grown for 20 hours in 2 liter portions of the following medium:
EMI7.1
<tb> - <SEP> glycerol <SEP> 0.5 <SEP>%
<tb>
EMI7.2
(NH 4) 2HPO4 0.5
EMI7.3
<tb> liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> 0.5
<tb>
pH adjusted to 7.5 with ammonium hydroxide.
The conditions for the culture are: a temperature of 28 with stirring at the speed of 1750 rpm; aeration with a flow rate of one volume of air / volume of the mixture / minute. A trace of soybean oil is added as an anti-foaming agent. After 20 hours, centrifugation of 25 cra3 of the broth containing the cells in suspension is carried out. The supernatant liquid is discarded. These cells are then introduced into the Erlenmeyer flask
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containing diaminopimelic acid broth and toluene. This flask is shaken for 16 hours at 28 and at the end of this period the diaminopimelic acid is converted into lysine in a 100% yield. Lysine is obtained by treatment with ion exchange.
EXAMPLE IV
Variant for the conversion of diamino pimelic acid to lysine.
100 cm3 of a diaminopimelic acid broth is introduced into a 300 cm3 Erlenmeyer flask. The pH is adjusted to 7.2 and 5 cm3 of toluene are added.
A. aerogenes, ATCC No. 12.409, was grown as in Example III and at the end of 20 hours 7 ml of the broth in which! the cells are suspended by centrifugation. The supernatant liquid is discarded. The cells are freeze dried and give 75 mg of solids which is added to the Erlemmeyer flask containing diaminopimelic acid and toluene. This Erlenmeyer flask is shaken for 16 hours at 28 and after that it is found that the diamonopimelic acid has been converted to lysine in a yield of 100%.
EXAMPLE V
Use of chelating compounds.
In further experiments relating to the conversion of diaminopimelic acid to lysine, carried out as indicated in Examples III and IV above, it was found that in the case of a broth containing 1 'diaminopimelic acid with a high content of this acid, the conversion to lysine can be done in a more complete and rapid manner than could be done with broths containing these high concentrations when a chelating agent is added to it. mixed. Citric act and tetrasodium salt of acid
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ethylenediaminotetraacetics are advantageous when added at concentrations of between about
0.004 molecular part and 0.032 molecular part. The use of higher concentrations is not recommended.
The addition of vitamin B6 during the conversion of diaminopimelic acid to lysine is also useful in the practice of the invention. Traces of this vitamin are only necessary.
CLAIMS
1. A process for preparing diaminopimelic acid by aerobic submerged fermentation of a mutant species of E. coli which needs lysine for its growth and does not contain the diacid enzyme decarboxylase. minopimelic, the fermentation taking place on a nutrient medium whose pH is maintained at a value close to neutrality.