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La présente invention concerne un procédé de fabrica- tion de substance d'enzyme protéolytique et plus particulièrement d'un protéinase pancréatique spécialement utile à la dispersion de cellules de tissu dans des cultures de tissu.
La préparation d'agents do culture de tissu pour assurer la croissance de micro-organismes, tels que les virus de dégénération de tissu, comprend la dispersion de cellules de tissu dans le milieu de culture pour faciliter son accessibilité
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aux micro-organismes. Jusqu'à. présent, cette dispersion de cellules de tissu dans le milieu de tise été obtenue avec des produits pancréatiques bruts. Ces pr@@@aits contiennent toute une variété d'agents du type enzyme coriprenant des protéinases, des lipases, des amylases et des nucléases. En conséquence, l'application de matières de pancréas brut aux cultures de tissu a pour effet une hydrolyse et une décomposi- tion de nombreux constituants de ces dernières en plus de la dispersion de cellules du tissu.
Ceci produit une destruction indésirable de certains élé ants ses ntiels de la culture de tissu et rend on ne,,peut difficile l'obtention de cultures uniformes de tissu d'une masse à l'autre. En conséquence, la croissance de micro-organismes dans les cultures de tissu ne peut pas être contrôlée dans la Mesure désirée.
On a maintenant trouvé un procédé de production d'une substance enzyme protéolytique capable de disperser des cellules de tissu dans des cultures de micro-organismes sans produire des dégradations et décompositions indésirab dans la culture de tissu. Cette enzyme que l'on a appelée "pancrine" peut être caractérisée analytiquement par son aptitude à faire cailler le lait dans le procédé de Kunitz (voir J. Gen. Physiol 18, 495 1935), dans lequel le caillage du lait est exprimé en unités rainette par mg. d'enzyme et par son inaptitude à coaguler du plasma citré sur toute base de comparaison avec la trypsine, c'est-à-dire le poids, la détermination protéolytique en unités ou la détermination en unités d'esterase TSAME.
De même, la pancrine peut être caractérisée par sa sensibilité aux inhibiteurs généraux de .. téase, par exemple au fluorophos- phate de diisopropyle (DF) @ sérum sanguin, puis des inhibiteurs spécifiques de trypsine dérivés de pancréas, graines de soja, etc. C'est-à-dire qu'alors que la pancrine est essentiellement inhibitée par le DFP et le sérum sanguin, elle .est incomplètement inhibitée par la graine de soja et les inhibiteurs de trypsine de pancréas. En outre, la sensibilité de la pancrine à la d-phénylalanine (inhibiteur de carboxypep-
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tidase) et au propionate do bota phényl (inhibiteur de chymotrypsine et de carboxypoptidases diffère qualitativement de celle soit de la chymotrypsine, soit de la carboxypeptidase.
Une autre caractéristique de la pancrinc est que son action protéolytique se produit sensiblement sans diminution en l'absence d'agents réducteurs, tels que cystéine et acide sulfhydrique.
Cette protéinase peut être caractérisée chimiquement du fait qu'elle est soluble dans une solution aqueuse d'alcool à 60 % (en volume), à une température de 25 C. De même, l'activité protéolytique de pancrine peut être maintenue dans une solution aqueuse pendant une période de 8 heures à une température de 25 C et avec un pH de 4,7, puis pendant deux mois à une température de 2 à 3 C et à un pII de 7,4 ou 4,7.
L'activité enzymatique de pancrine peut être caracté- risée par le fait que le rapport de son activité protéolytique sur un substrat d'hémoglobine dénaturé à l'urée à son activité d'esterase sur un substrat d'ester éthylique d'acétyl-1-tyrosine (ATEE) est d'au moins 150. Par exemple, on a trouvé qu'une préparation partiellement épurée de cette protéinase montre une activité de 38,4 unités sur un substrat d'hémoglobine dénaturé à l'urée, tandis que son activité sur le substrat ATEE est de 0,187 unité. Ainsi, le rapport d'activité d'hémoglobine à activité ATTE pour cette préparation est de 206.
D'autre part; un produit de chymotrypsine cristallisé montre une activité de 5,7 unités sur un substrat d'hémoglobine dénaturé à l'urée et de 0,396 unité sur un substrat ATEE; en conséquence, le rapport hémoglobine : ATEE pour la chymotrypsine est 14,4.
Ce substrat ATTEE a été trouvé être spécifique pour la chymotrypsine par Kaufman, S. J. Biol. Chem. 177, 793 (1949), tandis que le substrat d'ester méthylique de p-toluènesulfonyl- 1-arginine (TSAI.:E) a été rapporté comme étant spécifique de la trypsine par Schwert, G.. W. J. Biol. Chem., 172, 221 (1948).
Une unité d'activité d'esterase pour l'un quelconque de ces substrats spécifiques peut être définie cornue la .. -' jure
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hydrolysantc de 1. . .. L':':jrt .. tco. î)1.lti jîyr .ts d erlr yi:ie* L'activité ['J ,ç-'::d1yti2.llú du c:.: préparations d'enzy..ies sur l'h0:,o,-lobine Ù'1lJvnJ'(0 à l'urne peut 0t1'c 1.=sur.5c suivant le mode opératoire ir.di;z: par ,,n<;.>n, J. Cen. l'hysiol. 22, 79 (1930), dans lequel jm>. ii;,it.J c'.'<;c.',zvitf' prJl6ol;ticne peut être définie co:,:..\O 1.1 . d'un. .¯=. tyrosine par rzài. d'enzyme en 10 minutes, 1. mie turc de 37 0. On a trouvé que la vitesse optinuu do pl'otG,)YS0 l 1# 11:1ncru).e ne..;o:.:., 00 ne dénaturée peut être oiJenue 1 un pli dens la co..-r.le de 7 à 9.
Ce mode opératoire anùlyti'-;L<o peut êt1'G appliqua aux substrats de protéine native, de même qu'à ceux qui ont été dénaturés à l'urée, etc. Ce mode opératoire peut aussi être utilisé en liaison avec d'autres substrats 'Le protéine, tels que case ne et albumine du sang.
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L'activité d'üst81'ase de trypsine cristallisée sur un substrat T5A..E a été trouvée être de 0,4/xj, tandis que celle d'une préparation de pancrine partiellement épurée est 0,138.
'On a trouvé que le rapport de l'activité de pancrine sur le substrat d'hémoglobine ou substrat ATEE restait pratiquement constant au cours d'une épuration partielle de cette enzyme.
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Par exemple, le rapport ri W.:olobire : ATl!iE pour 6 préparations de pancrine ayant des degrés différents de pureté fut 192 + 34.
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Ainsi, l'activité ixi 1± peut µtre inhérente à la molécule de pancrine. Cependant cn peut concevoir que l'activité ATEE peut' être due simplement b. une substance ChYI'1Otrypsine contami- nante étroi tellent associée 0. la pancrine. En conséquence, par . un rapport d'activité de pancrine sur substrat d'hémoglobine
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dénaturée à l'urée à substrat 1';, on entend comprendre la possibilité que le dno7einateur activité de substrat ATBE peut être 0, ce qui fait que l'activité d'hémoglobine dénaturée à l'urée de la pancrine peut encore être considérée comme étant plus de 150 unités et d'un rapport d'au noins 150.
Ce protéinasc peut être obtenu par un procédé qui comprend la mise en contact d'une matière à faible échange cationique et d'un concentré daueux brut du pancréas contenant
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ce protéinase, pour adsorber l'enzyme sur la matière d'échange cationique. Le protéinase adsorbé peut être élue ou séparé de la matière d'échange cationique avec une solution saline aqueuse.
Ce concentré aqueux brut de pancréas peut être préparé en faisant venir un tissu de pancréas subdivisé en contact avec une solution aqueusu pour obtenir un extrait aqueux contenant cette substance d'enzyme protéolytique. Les glandes pancréas peuvent être subdivisées par des opérations telles que hachage, broyage et réduction, puis elles sont dégraissées.,par extraction en utilisant des solvants, tels que l'acétone, le xylène et des fractions d'hydrocarbures du pétrole. Bien que du tissu de pancréas de mammifères, tels que pancréas de porc et de,,boeuf soit la source préférée de cette enzyme protéolytique, il est évident que l'aenzyme peut être obtenue à partir d'autres sources.
Ce tissu de.pancréas peut contenir du tissu de duodénum de porc réduit, par exemple environ la µ? en poids. On n'a pas complètement caractérisé le mécanisme d'activation de la pancrine. Cependant, si ce protéinase est contenu homostatique- ment dans le¯pancréas sous la forme d'une proenzyme, c'est-à- dire du précurseur inactif, il peut être activé dans le duodénum par un procédé analogue à l'activation de trypsinogène par entérokinase ou l'activation de chyrnotrypsinogène par trypsine. En conséquence, il peut être désirable d'inclure de la matière de duodénum dans cette bouillie d'extraction de pancréas. De même, la bouillie d'extraction peut contenir un sel inorganique, tel que chlorure de sodium.
L'extraction de l'enzyme peut être effectuée complètement en 2 à 3 heures à une température de 25 C et en 10 à 16 heures à une température de 0 C. Cet extrait d'enzyme peut être séparé du résidu de tissu par des procédés, tels que centrifugeage et filtrage, puis le résidu séparé peut être mis au rebut ou utilisé pour produire d'autres facteurs pancréatiques.
Tout concentré aqueux brut de ce protéinase, tel que l'extrait pancréatique prémentionné,' peut être soumis à ce
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traite.i.mt d'adsorption-élution pour obtenir un produit de pancrine épuré. u cours de ce traite.lent d'épuration, l'adsorption du protcinase l;"ut ,31;1'0 obtenue car d..;;s :'i...tiores de faible échange catioaique, telles que des rcsimc 'j'acide carboxylique, par exemple celles connues sous lés nO.,1::; de XE-97 et IRC-50 (fabriquées par 710iim et lia,as). Dion qu'on ait trouvé que ce protéinase puisse être adsorbé sur la p'1)tire d' 6chanc;e à un p:3 rentrant dans la u.. :e de ',5 à et 1. uns force ionique de moins de 0,- environ, une adsorption particulièrement désirable de l'ensy-1e est obtenue z un pII de 4,7 et à une force ionique de 0,0.
La ter1.Q':'ratu,ce pour obtenir l'adsorption de ce protéinase peut être d'environ tac.
La natière d'ëchanje cationique peut être équilibrée à ces conditions d'adsorption, par exemple en faisant venir la résine en contact avec une solution tampon 0,05M acétate de sodium-acide acétique à pH 4,7. L'équilibrase de la résine peut être obtenu en mettant la résine et la solution tampon en suspension. .après que la résine a atteint un état d'équilibre avec le tampon, la nasse de la solution peut être séparée de la résine, par exemple par décantation. Le concentré aqueux brut contenant ce protéinase peut être réglé à l'état d'adsorption, par exemple par dilution avec de l'eau, jusqu'à une force ionique inférieure à 0,4,lorsque la force ionique du concentré d'enzyme aqueux est supérieure à 0,4.
D'autre part, le concentré aqueux de protéinase peut être élancé à la résine équilibrée et à un volume d'eau approprié à réduire la force ionique du mélange résultant à noins de 0,4 pour obtenir les conditions d'adsorption.
Cette opération d'adsorption peut être exécutée en mélangeant la matière d'échange cationique équilibrée et le concentré aqueux d'enzyme au cours d'une opération par ruasse et
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en séparant ensuite la ;,;.:::.tH.:re d 1,5chffi:e du liquide surnageant par des procédés, tels que centrifugée et filtrée. A titre de variante, la résine peut être tassée dans une colonne cylindrique et on peut faire passer le concentré aqueux
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d'enzyme à travers cette colonne à une vitesse de courant de nature à adsorber le protéinase sur la matière d'échange.
Le protéinase peut être élué de la matière d'échange cationique à un pH de 4,5 à 5 et à une force ionique de plus de 0,4 environ. Les meilleurs résultats d'élution peuvent être obtenus à un pH d'environ 4,7 et à une force ionique entré 0,8 et 1,5, des résultats d'élution particulièrement désirables étant obtenus à une force ionique d'environ 1,2. Cette élution peut être exécutée en faisant venir la matière d'échange cationique ayant le protéinase adsorbé sur elle en contact avec une solution saline aqueuse ayant une force ionique d'au moins 1,0 environ. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque la force ionique de cet éluant aqueux est d'environ 2,0.
Le contact entre la matière d'échange et l'éluant pour obtenir l'élution de l'enzyme peut être produit par des modes opératoires, tels que celui à masses et les systèmes de colonne prémentionnés. La condition de force ionique utilisée dans cette épuration peut être obtenue avec tout sel inorganique inerte par rapport au protéinase.
Le protéinase élué peut en outre être épuré en répétant l'opération d'adsorption-élution prémentionnée. De même, ce protéinase peut être épuré en fractionnant le produit d'élution précédemment décrit à saturation sensiblement complète avec du sulfate,d'ammonium. On a trouvé que le protéinase élué est sensiblement soluble à une saturation de sulfate d'ammonium inférieure à 0,8, mais qu'il est insolubilisé à une saturation de sulfate d'ammonium de plus de 0,8 environ. Dans l'aternative, l'enzyme éluée peut être fractionnée à une concentration d'alcool d'au moins 65 % environ, à une température de -5 C.
Bien qu'on ait trouvé que cette enzyme de protéinase soit sensiblement insoluble à une concentration d'alcool d'environ 65 %, on obtient une précipitation plus complète de cette enzyme à une concentration d'alcool d'environ 80 % et à une température de -5 C. Comme alcools appropriés pour fractionner ce protéinase, on peut citer par exemple l'éthanol et le
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méthanol. La substance d'enzyme précipitée peut être séparée du
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liquide surnageant par des procédés tels que centrifusease et fil, puis, après dialyse pour éliminer le sel ou solvant résiduel de ce liquide, la substance d'enzyme peut être déshydratée si on le désire. De préférence, cette déshydratation
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de la substance d' eny::o est obtenue par lyophilisation.
La dispersion de cellules de tissu dans une culture de tissu peut être obtenue en faisant venir une suspension de tissu animal subdivisé en contact avec une préparation de cette substance de protéinase. Par exemple, du tissu de rein de singe subdivisé, mis en suspension dans un milieu de croissance de
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icro-orGanis2es convenable, peut être mêlant à une solution à 1 le de cette subs'nce d'enzyme pour produire la désintégration des fra7lments de tissu en les cellules individuelles. La culture de croissance dispersée de cellules de tissu ainsi obtenue peut être utilisée pour la culture de micro-organismes, tels que des virus de dégénération de tissu.
Les éléments nutritifs compris dans la culture de croissance varient avec les nécessités des organisnes particuliers et un milieu convenable pour cultiver des virus de dégénération de tissu,
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tels de poliomyelite, est décrit par J.S. Youngner ùans Proc.
Exp. Biol. ... ed. , 85, 202 (1954).
L'invention peut en outre être illustrée par les exemples suivants :
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.8x..;r1]Jle 1
Du tissu de pancréas de porc, ayant été subdivisé par hachage, dégraissée ou extraction au solvant et déshydraté en
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une quantité de 400 c:ra:,,::,es, fut n.2ln::;é avec 2000 cm3 d'eau. Le tissu de pancréas sec contenait environ 8 µ.' en poids de
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chlorure de sodiun et 10 "' en poids de tissu de duodénum de porc. Ce mélange fut soumis à l'extraction par agitation à une température de 25 C pendant une période de 5 heures.
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L'extrait formé fut séparé du résidu du tissu par centrifugeage
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et le volume de l'exteait otenu étaitde 1800 cm).
Une résine de type acide carboxylique (XE-97), en une quantité de 180 g. fat équilibréc avec un tampon à l'acétate 0,05M, contenant de l'acétate de sodium et de l'acide acétique à un pH de il-,7. La résine équilibrée fut mélangéc avec 720 cm3 d'extrait pancréatique et 4950 cm3 d'cau. Le mélange résultant fut agité à une température do 25 C pendant une période de 90 minutes et ensuite la r6sine fut séparée du liquide surnageant par centrifugeage. La résine séparée fut lavée à l'eau deux fois, chaque lavage étant effectué avec 1800 cm3 d'eau. Les eaux de lavage furent séparées de la résine par centrifugeage et mises au rebut.
La résine lavée fut' mélangée avec 760 cm3 de solution tampon acétate de sodium-2-.! - acide acétique de pH 4,7 et 'le mélange résultant fut agité pendant une période de 90 minutes à une température de 25 C. Le produit 'd'élution fut séparé de la résine par centrifugeage et ensuite 690 cm3 de produit d'élution furent récupérés, ce produit ayant une concentration de protéine de 2,4 mg. par cm3 déterminée par le procédé à la micro protéine de Folin. Ce produit d'élution, en une quantité de 675 cm3, fut mélangé avec 393 grammes de sulfate d'ammonium solide et agité à une température de 25 C pendant une période d'une heure pour obtenir la dissolution du sulfate d'ammonium.
Le précipité formé après cela fut séparé du liquide surnageant par filtrage et le précipité séparé fut séché par lyophilisation. Le produit lyophilisé pesait Il,3 grammes et contenait environ 5% de protéine. L'activité de protéinase de ce produit séché fut déterminée en utilisant de l'hémoglobine comme substrat et le résultat peut être exprimé soit comme 0,11 mg. de tyrosine libéré par mg. de poids, soit 2,2 mg. de tyrosine libérés par mg. de protéine.
Exemple 2
Un produit de pancréas de porc séché, dégraissé et réduit, contenant environ 8% en poids de chlorure do sodium et 10 % en poids.de tissu de duodénum de porc en une quantité de
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800 grades fut :..' 4; avec 4000 CH3 d' eau. Ce :,iàla=1je fut a-it3 pendant une période de 3 heures à une température de 2500. L'extrait for,.!é ensuite fut sépare du résidu de tis par centrifuc;ea,ú et le velu!.;'-' d'extrait ainsi obtenu était
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3700 cm3.
Une résine de type acide carboxylique (XE-97) en une
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quantité de 26J t;ral.E!l3 fut équilibrée avec une solution tu.-.zpon acétate de sodiwi-<i,<5-11 - acide acétique au pH -,7. La résine équilibrée fut :.:é 6ar¯.ve avec 8C0 cin3 do l'extrait pancréatique et 5450 cm3 d'eau. Ce ..;5itI1j;e fut a01 té pendant une période de
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135 minutes à une température de 25 C. La résine fut séparée du
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liquide surnageant par centri .caGe et le liquide surnageant fut nis au rebut. La r0sine fut ensuite lavée deux fois, chaque lavage ét. 1w lit avec 20CO c:3 d'eau. Les eaux de lavage furent sé# ¯ ..., de 1 résine par centrifugeage et l1ises au
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rebut.
La résine lavée fut éluée avec 800 cm3 de solution
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tampon acétate de sodiu:"-2.: - acide acétique au pi 4,7 par
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agitation à une température de 25 C, pendant une période de 135 minutes. Le produit dilution résultant fut séparé de la ré-
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sine par centrifu3eac, et la résine fut mise au rebut. Le produit d'élution fut obtenu en un volume de 750 csi3 contenant 3 1 mg. de nrotéine par cr3.
Dne partie de ce produit d' élution, en une quantité de 720 cr.3, fut -."L e avec 341 gra-mes de sulfate d'a';:''''1oniu::n solide et le ,']"1&?1'::::; T-'sû¯it;zat fut agité à une température de 25 C pendant uno :¯e..zr . 1. F;.5c; ;t< forné fut laissé déposer à une tenpérature de COC et 5ÉParà du liquide surnaGeant par centrifuC8ae. Le précipité fut séché par lyophilisation et le produit séché fut obtenu An un rendement de 10,98 gramnes.
Ce produit sèche avait W18 activité de protéinase éGale à 0,4 mz. de tyrosine par tii'. de proJui ou 3,0 r. de tyrosine par m.:::;. de protéine (le r0ju1t séché contenait environ 5 ; de protéine).
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Une seconde partie du produit d'élution, en une
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quantité de 700 c,,,3, fil j,; lan ,to avec 332 C. de sulfate
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d'ammonium solide et le mélange fut agite à une température de 25 C pendant une heure. Ensuite, le précipité formé fut laissé déposer à une température de 0 C et séparé du liquide surnageant par centrifugage. Ce précipité fut déshydraté par lyophilisation et le produit séché fut obtenu en un rendement de 14,35 g. contenant environ 5 % en poids de protéine.
L'activité de protéinase de ce produit était équivalente à 0,37 mg. de tyrosine par mg. de produit ou 7,4mg. de tyrosine par mg. de .protéine. Exemple 3
Du tissu de pancréas de porc réduit, dégraissé et séché, contenant environ 8 % en poids de chlorure de sodium et
10 % en poids de tissu de duodénum de porc, en une quantité de
400 g.,' fut mélangé avec 2000 cm3 d'eau. Ce mélange fut agité pendant 4 heures à une température de 25 C. L'extrait formé fut séparé du résidu de,tissu par centrifugeage. Cet extrait pancréatique fut obtenu en un volume de 1530 cm3.
La résine de type acide carboxylique (XE-97), en une quantité de 300 g., fut équilibrée avec une solution tampon acétate de sodium-0,05M - acide acétique au pH 4,7. La résine équilibrée fut mélangée avec 1200 cm3 de l'extrait paneront ue et 8174 cm3 d'eau, puis le mélange résultant fut agité à @@@ température de 25 C. Ensuite, la résine fut séparée du lique surnageant et ce liquide fut mis au rebut. La résine fut laves deux fois, chaque lavage étant fait avec 3000 cm3 d'eau. Les eaux de lavage furent séparées de la résine par centrifugeage et mises au rebut. La résine fut mélangée avec 1200 cm3 de solution tampon acétate de sodium-2M - acide acétique au pH 4,7 et le,mélange résultant fut agité à une température de 25 C.
Le produit d'élution formé fut séparé de'la résine par centrifugeage. Ce produit d'élution fut mélangé avec 498 g. de sulfate d'ammonium solide et le mélange résultant fut agité pendant une heure à une température de 25 C. Ensuite, le
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mélange fut laissé déposer à une tc:np,5r[turc de OOG et le précipité forme fut séparé par contrifu,ca-0. Ce précipité fut séché par lyophilisation et le produit séché résultant pesait 23,0 g. contenant environ 5 % do protéine. L'activité de protéinase de ce produit fut déterminée comme 0,25 -au. de
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tyrosine par m. de produit ou 5, 0 ln;. de tyrosine par ru,. de protéine.
La résine éluée prénentionnée fut ;ù41anyse avec 500. cl) de solution tampon acétate de soâiu:r-2:.: - acide acétique de pH 4,7. Le 1.iôianse résultant fut agité à une température de 0 C et ensuite le produit d'élution fut séparé de la résine par centrifujeage. Ce produit d'élution, qui fut obtenu en un volune de 450 cm3, était avec 214 C. de sulfate
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dlarinonium solide. Le mélange résultant fut aité à une température de 250C pendant une heure et le précipité for.-.i6 fut laissé déposer à une température de 0 C. Ce précipité fut
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séparé du liquide surnageant par centrifugeage et ce précipité fut déshydraté par lyophilisation. Le rendement de produit séché était de 6,6 g. contenant environ 5 % en poids de
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protéine.
L'activité de protéinase de ce produit fut déterminée co-rte 0,36 mb. de tyrosine par n. ioduit ou 7 , 2 ^.. .., de tyrosine par mg. de protéine.
Exemple 4
Du tissu de pancréas de porc séché, décaissé et réduit, contenant environ 8 % en poids de chlorure de sodium et
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10 . en poids de tissu de duod'nurl de porc, fut avec 3.600 en-3 d'eau. Ce ?n2lane rut aité à une t rature de 25'C pendant 5 heures. Ltr'xtrait rsultant fut séparé du résidu de tissu par centrifugage et le voulse d'extrait ainsi obtenu fut de 3050 cm3.
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Une raine de type acide c,rboY.:ylir.!.ue (X2:-97) en une quantit0 de 70'J r. fut 'nuilibr6e avec une solution tampon acétate de ::oriurn-c3,t,î,1 - acide ac..Lique de pII -1,7. La résine équilibrée [',It u'Jlanr,;t':;c av'..c 2000 c/:(;; cytrait PIncr,5atique et
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19090 cm3 d'eau. Ce mélange fut ajité pendant 60 minutes il une température de 25 C, nsuite, la r6sîno fut du liquide surnageant par contrifugcace. Cette rusine fut lavée deux fois, ce lavage étant obtenu avec 7000 cm3 d'eau. Les eaux de lavage
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furent séparées de la résine par conbrifucasc et Mises au rebut. La résine lavée fut ',1 ;lauÔe avec J0'>0 cn3 de solution tampon acétate d'ammonium-2M - acide acétique de pI3 4,7 et le mélan,e résultant fut aGité pondant 60 minutes à une température de 25 C.
Le produit d'élution formé fut séparé de la résine par centrifugeage..Ce produit d'élution fut obtenu en un volume de 2800 cm3 contenant 3,0 mg. de protéine par cm3, tel que déterminé par le procédé micro protéine de Folin.
Une partie de ce produit d'élution, en une quantité
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de 380 cm3, fut mélangée avec 2045 cmj d'alcool 3.A à 95 ;.
L'alcool fut additionné au produit d'élution d'une manière capillaire à une température de -5 C sous une agitation vigoureuse. Le précipité formé fut laissé déposer à une température de -5 C et ce précipité fut séparé du liquide surnageant par centrifugeage. Le précipité séparé fut séché par lyophilisation et obtenu en un rendement de 0,49 g. Ce produit, qui était sensiblement tout protéine, fut désigné par A.
Une seconde partie de ce produit d'élution, en une quantité de 1600 cm3, fut mélangée avec 8600 cm3 d'alcool 3A à 95 L'alcool fut additionné au produit d'élution .d'une manière capillaire à une température de -5 C sous agitation vigoureuse. Le précipité formé fut laissé déposer à une température de -5 C et il fut ensuite séparé du liquide surna- geant par centrifugeage. Ce précipité fut déshydraté par lyophilisation et obtenu en un rendement de 2,6 g. Ce produit séché, qui était sensiblement tout protéine, fut désigné par B.
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Une troisième partie du produit d'élution, en une quantité de 595 cnâ, fut raclansoe avec '3200 cmj d'alcool 3 à 95 #. L'alcool fut additionné au produit d'olution d'une manière capillaire à une température de -5oC, sous agitation vigoureuse. Le précipité ainsi for 10 fut laisse déposer à une
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température de -5 C et séparé du liquide surnageant par centri- fugeage.. Ce précipité séparé fut déshydraté par lyophilistion et le produit séché pesait 0,70 g.. Ce produit sec fut désigné par C et était sensiblement tout protéine..
Les produits sèches prémentionnés A. B et. C furen' rassemblés et mélangés pour former une masse uniforme., Cette masse fut analysée quant à son activité de protéinase et les résultats indiquèrent une activité de 6,5 mg. de tyrosine:par mg. de produit.
Exemple 5
Un produit d'élution de protéinase, obtenu suivant l'exemple 4, fut soumis à une opération d'adsorption analogue comme suit :
Ce produit d'élution, en un volume de 140 cm'3, fut mélangé avec 965 cm3 d'eau et 96,5 cm3 de résine XE-97 tassée contenant 35 g. de résine sèche préalablement équilibrée, suivant le procédé de l'exemple 4.
Le mélange résultant fut agité à la température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite le liquide surnageant fut séparé de la résine par centrifugeage et mis au rebut. La résine séparée fut soumise à l'élution avec 168 cm3 de solutioi. tampon acétate d'ammonium-2N- acide acétique de pH 4,7.
Ce produit d'élution fut analysé et les résultats furent les suivants :
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<tb>
<tb> Concentration <SEP> de <SEP> protéine <SEP> (procédé
<tb> micro <SEP> Folin <SEP> mg/cm3) <SEP> 0,246
<tb> activité <SEP> protêt-tique <SEP> (substrat
<tb> d'hémoglobine <SEP> dénaturée <SEP> - <SEP> unités/cm3) <SEP> 9,44
<tb>
Ainsi, la pureté de ce produit de pancrine peut être calculée comme 38,4 unités protéolytiques par mg. de protéine.
Exemple
L'activité protéolytique du produit de pancrine obtenu à l'exemple 5 fut comparée avec celle de trypsine et de chymotrypsine sur différents substrats de protéine, dans
<Desc/Clms Page number 15>
lesquels D désigne la forme dénaturée à l'urée du substrat et N désigne les substrats naturels.
Les résultatsfurent comme suit :
EMI15.1
<tb>
<tb> Substrats <SEP> tryp- <SEP> chyme- <SEP> pancrine <SEP> ancrine: <SEP> pancrine:
<tb> sine <SEP> tryp- <SEP> trypsine <SEP> chymo-
<tb> ¯¯¯¯ <SEP> sine¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> trypsine
<tb> hémoglobine <SEP> D <SEP> 11,94 <SEP> 5,70 <SEP> 38,40 <SEP> 3,2 <SEP> 6,7
<tb> hémoglobine <SEP> N <SEP> 1,79 <SEP> 1,10 <SEP> 5,36 <SEP> 3,0 <SEP> 4,9
<tb> albumine <SEP> de
<tb> sérum <SEP> D <SEP> 4,77 <SEP> 2,45 <SEP> 6,17 <SEP> 1,3 <SEP> 2,5
<tb> albumine <SEP> de
<tb> sérum <SEP> N <SEP> 0,44 <SEP> 0,38 <SEP> 1,90 <SEP> 4,3 <SEP> 5,0
<tb> caséine <SEP> D <SEP> 11,52 <SEP> 18,40 <SEP> 31,55 <SEP> 2,7 <SEP> 1,7
<tb> caséine <SEP> N <SEP> 6,16 <SEP> 9,49 <SEP> 9,54 <SEP> 1,5 <SEP> 1,0
<tb>
* Rapport d'activité de pancrine à trypsine.
** Rapport d'activité de pancrine à chymotrypsine.
Exemple 7
L'influence d'inhibiteurs de trypsine particuliers sur l'activité protéolytique de pancrine par rapport au substrat d'hémoglobine dénaturée à l'urée fut démontrée comme suit :
EMI15.2
<tb>
<tb> Inhibiteur <SEP> trypsine <SEP> chymotryp- <SEP> pancrine
<tb> acti- <SEP> inhi- <SEP> sine <SEP> acti- <SEP> inhivite <SEP> bition <SEP> acti- <SEP> inhi- <SEP> vité <SEP> bition <SEP> %
<tb> vité <SEP> bition
<tb> néant <SEP> 11,94 <SEP> 5,70 <SEP> 35,80
<tb> inhibiteur
<tb> graine <SEP> de <SEP> soja
<tb> trypsine <SEP> .1,58 <SEP> 87 <SEP> 3,67 <SEP> 36 <SEP> 28,20 <SEP> 21
<tb> inhibiteur
<tb> trypsine
<tb> pancréatique <SEP> 2,41 <SEP> 80 <SEP> . <SEP> 4,63 <SEP> 19 <SEP> 24,50 <SEP> 32
<tb>
La concentration d'inhibiteur dans ces compositions était de 100 grammes par unité d'activité protéolytique.
Ceci s'élève à un rapport de poids d'inhibiteur à enzyme de 4 (pancrine) 1,2 (trypsine) et 0,6 (chymotrypsine).
Exemple 8
L'influence de propionate de bêta phényl sur l'activi-
<Desc/Clms Page number 16>
té protéolytique et esterolytique de chymotrypsine et de pancrine peut être démontée comme suit
EMI16.1
<tb>
<tb> Substrat <SEP> propionate <SEP> chymotrypsine <SEP> pancrine
<tb> betaphényle <SEP> activité <SEP> (unités) <SEP> activité <SEP> (unités)
<tb> concentré <SEP> M <SEP> init. <SEP> final <SEP> inhib. <SEP> init. <SEP> final <SEP> inhib.
<tb>
@
<tb> hémoglobine
<tb> dénaturée
<tb> par <SEP> urée <SEP> 0,09 <SEP> 5,70 <SEP> 1, <SEP> 60 <SEP> 72 <SEP> 35,80 <SEP> 16,49 <SEP> 54
<tb> ATEE <SEP> 0,06 <SEP> 0,396 <SEP> 0,190 <SEP> 52 <SEP> 0,187 <SEP> 0,161 <SEP> 14
<tb> ATEE <SEP> 0,006 <SEP> 0,396 <SEP> 0,356 <SEP> 10 <SEP> 0,187 <SEP> 0,187 <SEP> 0
<tb>
Les différences de sensibilité de pancrine et de chymotrypsine à l'inhibition par le propionate de betaph6nyle dépassent les limites d'erreur pour le procède d'essai. En conséquence, ces résultats indiquent que l'inhibition de chymotrypsine par le propionate de bétaphényle est qualitativement différente de celle de pancrine.
Bien que dans la description qui précède divers modes de réalisation de l'invention aient été décrits en détail pour l'illustrer, il est évident que diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadr le l'invention.
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The present invention relates to a method of making a proteolytic enzyme substance and more particularly a pancreatic proteinase especially useful for the dispersion of tissue cells in tissue cultures.
The preparation of tissue culture agents for the growth of microorganisms, such as tissue degenerative viruses, comprises dispersing tissue cells in the culture medium to facilitate its accessibility.
<Desc / Clms Page number 2>
to microorganisms. Until. present, this dispersion of tissue cells in tise medium was obtained with crude pancreatic products. These preparations contain a variety of enzyme-like agents which are associated with proteinases, lipases, amylases and nucleases. Accordingly, application of crude pancreatic materials to tissue cultures results in hydrolysis and decomposition of many constituents thereof in addition to the dispersal of cells from the tissue.
This produces undesirable destruction of some basic tissue culture components and makes it difficult to obtain uniform tissue cultures from mass to mass. As a result, the growth of microorganisms in tissue cultures cannot be controlled to the extent desired.
We have now found a method of producing a proteolytic enzyme substance capable of dispersing tissue cells in cultures of microorganisms without producing undesired degradation and decomposition in the tissue culture. This enzyme which has been called "pancrin" can be characterized analytically by its ability to curdle milk in the Kunitz method (see J. Gen. Physiol 18, 495 1935), in which the curdling of the milk is expressed as tree frog units per mg. enzyme and by its inability to coagulate citrated plasma on any basis of comparison with trypsin, i.e., weight, proteolytic unit determination or TSAME esterase unit determination.
Likewise, pancrin can be characterized by its sensitivity to general inhibitors of tease, for example to diisopropyl fluorophosphate (DF) @ blood serum, then to specific inhibitors of trypsin derived from pancreas, soybeans, etc. That is, while pancrin is primarily inhibited by DFP and blood serum, it is incompletely inhibited by soybean and pancreatic trypsin inhibitors. In addition, the sensitivity of pancrin to d-phenylalanine (carboxypep inhibitor
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tidase) and bota phenyl propionate (chymotrypsin and carboxypoptidase inhibitor qualitatively differs from either chymotrypsin or carboxypeptidase.
Another characteristic of pancreat is that its proteolytic action occurs substantially without decrease in the absence of reducing agents, such as cysteine and hydrogen sulfide.
This proteinase can be chemically characterized as being soluble in an aqueous solution of 60% alcohol (by volume), at a temperature of 25 C. Likewise, the proteolytic activity of pancrin can be maintained in a solution. aqueous for a period of 8 hours at a temperature of 25 C and with a pH of 4.7, then for two months at a temperature of 2-3 C and a pII of 7.4 or 4.7.
The enzymatic activity of pancrin can be characterized by the ratio of its proteolytic activity on a urea denatured hemoglobin substrate to its esterase activity on an acetyl-1 ethyl ester substrate. -tyrosine (ATEE) is at least 150. For example, it has been found that a partially purified preparation of this proteinase shows an activity of 38.4 units on a urea denatured hemoglobin substrate, while its activity on the ATEE substrate is 0.187 units. Thus, the ratio of hemoglobin activity to ATTE activity for this preparation is 206.
On the other hand; a crystallized chymotrypsin product shows an activity of 5.7 units on a urea denatured hemoglobin substrate and of 0.396 units on an ATEE substrate; accordingly, the hemoglobin: ATEE ratio for chymotrypsin is 14.4.
This ATTEE substrate was found to be specific for chymotrypsin by Kaufman, S. J. Biol. Chem. 177, 793 (1949), while p-toluenesulfonyl-1-arginine methyl ester substrate (TSAI.:E) has been reported to be specific for trypsin by Schwert, G .. W. J. Biol. Chem., 172, 221 (1948).
A unit of esterase activity for any of these specific substrates can be defined as follows:
<Desc / Clms Page number 4>
EMI4.1
hydrolyzantc of 1.. .. L ':': jrt .. tco. î) 1.lti jîyr .ts d erlr yi: ie * The activity ['J, ç -' :: d1yti2.llú of c:.: enzyme preparations on the h0:, o, - lobin Ù'1lJvnJ '(0 at the urn can 0t1'c 1. = sur.5c according to the procedure ir.di; z: par ,, n <;.> n, J. Cen. hysiol. 22 , 79 (1930), in which jm>. Ii;, it.J c '.' <; C. ', Zvitf' prJl6ol; ticne can be defined as:,: .. \ O 1.1. Of a.. ¯ =. Tyrosine by enzyme rzai in 10 minutes, 1. Turkish mie of 37 0. It has been found that the optimum speed do pl'otG,) YS0 l 1 # 11: 1ncru) .e ne ..; o :.:., 00 denatured can be 1 folded in the co ..- r.le of 7 to 9.
This analytical procedure can be applied to native protein substrates, as well as to those which have been denatured with urea, etc. This procedure can also be used in conjunction with other protein substrates, such as case ne and blood albumin.
EMI4.2
The ist81'ase activity of trypsin crystallized on a T5A..E substrate was found to be 0.4 µl, while that of a partially purified pancrin preparation is 0.138.
It was found that the ratio of pancrin activity to hemoglobin substrate or ATEE substrate remained nearly constant during partial purification of this enzyme.
EMI4.3
For example, the ratio ri W.:olobire: ATl! IE for 6 preparations of pancrin having different degrees of purity was 192 + 34.
EMI4.4
Thus, the ixi 1 ± activity may be inherent in the pancrin molecule. However, it is conceivable that the ATEE activity may be due simply to b. a contaminating substance ChYI'1Otrypsin closely associated with pancrin. Accordingly, para. a ratio of pancrin activity to hemoglobin substrate
EMI4.5
1 'substrate urea denatured, it is understood to understand the possibility that the ATBE substrate activity dno7einator may be 0, so that the urea denatured hemoglobin activity of pancrin can still be considered as being over 150 units and a ratio of at no. 150.
This asc protein can be obtained by a process which comprises contacting a low cation exchange material and a crude pancreatic water concentrate containing
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this proteinase, to adsorb the enzyme on the cation exchange material. The adsorbed proteinase can be eluted or separated from the cation exchange material with aqueous saline solution.
This crude aqueous pancreatic concentrate can be prepared by contacting a subdivided pancreatic tissue with an aqueous solution to obtain an aqueous extract containing this proteolytic enzyme substance. The pancreatic glands can be subdivided by such operations as chopping, grinding and reduction, and then they are degreased, by extraction using solvents, such as acetone, xylene and hydrocarbon fractions of petroleum. Although pancreatic tissue from mammals, such as pig and beef pancreas is the preferred source of this proteolytic enzyme, it is evident that the aenzyme can be obtained from other sources.
This pancreatic tissue may contain reduced pig duodenum tissue, for example about µ? in weight. The mechanism of pancrin activation has not been fully characterized. However, if this proteinase is homostatically contained in the pancreas as a proenzyme, i.e. the inactive precursor, it can be activated in the duodenum by a process analogous to the activation of trypsinogen. by enterokinase or the activation of chyrnotrypsinogen by trypsin. Accordingly, it may be desirable to include duodenum material in this pancreas extraction slurry. Likewise, the extraction slurry may contain an inorganic salt, such as sodium chloride.
Extraction of the enzyme can be carried out completely in 2 to 3 hours at a temperature of 25 C and in 10 to 16 hours at a temperature of 0 C. This enzyme extract can be separated from the tissue residue by methods. , such as centrifuging and filtering, then the separated residue can be discarded or used to produce other pancreatic factors.
Any crude aqueous concentrate of this proteinase, such as the pancreatic extract mentioned above, can be subjected to this
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EMI6.1
adsorption-elution treatment to obtain a purified pancrin product. During this slow purification treatment, the adsorption of protcinase l; "ut, 31; 1'0 obtained because of ... ;; s: '... tiores of weak catioaic exchange, such as rcsimc 'carboxylic acid, for example those known as Nos., 1 ::; of XE-97 and IRC-50 (manufactured by 710im et 11a, as). It has been found that this proteinase can be adsorbed on the p '1) draws 6chanc; e at a p: 3 entering the u ..: e of', 5 at and 1. an ionic strength of less than about 0, -, a particularly desirable adsorption of the ensy-1e is obtained with a pII of 4.7 and at an ionic strength of 0.0.
The ter1.Q ':' ratu, this to obtain the adsorption of this proteinase can be about tac.
The cationic exchange material can be equilibrated to these adsorption conditions, for example by contacting the resin with a 0.05M sodium acetate-acetic acid buffer solution at pH 4.7. Resin equilibrase can be obtained by suspending the resin and the buffer solution. .after the resin has reached a state of equilibrium with the buffer, the trap of the solution can be separated from the resin, for example by decantation. The crude aqueous concentrate containing this proteinase can be adjusted to the state of adsorption, for example by dilution with water, to an ionic strength of less than 0.4, when the ionic strength of the aqueous enzyme concentrate is greater than 0.4.
On the other hand, the aqueous proteinase concentrate can be scaled to the equilibrated resin and an appropriate volume of water to reduce the ionic strength of the resulting mixture to no less than 0.4 to obtain the adsorption conditions.
This adsorption operation can be carried out by mixing the balanced cation exchange material and the aqueous enzyme concentrate in a batch operation and
EMI6.2
then separating the;,;. :::. tH.:re d 1.5chffi: e from the supernatant liquid by methods, such as centrifuged and filtered. Alternatively, the resin can be packed into a cylindrical column and the aqueous concentrate can be passed through.
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of enzyme through this column at a flow rate such as to adsorb proteinase onto the exchange material.
The proteinase can be eluted from the cation exchange material at a pH of 4.5 to 5 and an ionic strength of more than about 0.4. The best elution results can be obtained at a pH of about 4.7 and an ionic strength between 0.8 and 1.5, particularly desirable elution results being obtained at an ionic strength of about 1, 2. This elution can be accomplished by contacting the cation exchange material having the proteinase adsorbed thereon with an aqueous saline solution having an ionic strength of at least about 1.0. The best results are obtained when the ionic strength of this aqueous eluent is about 2.0.
Contact between the exchange material and the eluent to elute the enzyme can be produced by procedures, such as mass and column systems above. The ionic strength condition used in this purification can be obtained with any inorganic salt which is inert with respect to the proteinase.
The eluted proteinase can further be purified by repeating the above-mentioned adsorption-elution operation. Likewise, this proteinase can be purified by fractionating the elution product described above to substantially complete saturation with ammonium sulfate. It has been found that the eluted proteinase is substantially soluble at an ammonium sulfate saturation of less than 0.8, but is insolubilized at an ammonium sulfate saturation of greater than about 0.8. Alternatively, the eluted enzyme can be fractionated at an alcohol concentration of at least about 65%, at a temperature of -5 C.
Although this proteinase enzyme has been found to be substantially insoluble at an alcohol concentration of about 65%, a more complete precipitation of this enzyme is obtained at an alcohol concentration of about 80% and at a temperature. of -5 C. As suitable alcohols for fractionating this proteinase, there may be mentioned, for example, ethanol and
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methanol. The precipitated enzyme substance can be separated from the
EMI8.1
supernatant liquid by methods such as centrifusease and wire, and then, after dialysis to remove residual salt or solvent therefrom, the enzyme substance can be dehydrated if desired. Preferably, this dehydration
EMI8.2
eny :: o substance is obtained by lyophilization.
The dispersion of tissue cells in a tissue culture can be achieved by bringing a suspension of subdivided animal tissue into contact with a preparation of this proteinase substance. For example, subdivided monkey kidney tissue suspended in growth medium of
EMI8.3
suitable icro-organisms, can be mixed with a 1-l solution of this enzyme substance to produce disintegration of the tissue fragments into individual cells. The dispersed growth culture of tissue cells thus obtained can be used for culturing microorganisms, such as tissue degenerating viruses.
The nutrients included in the growth culture vary with the needs of the particular organism and a suitable medium for growing tissue degenerative viruses,
EMI8.4
such as polio, is described by J.S. Youngner in Proc.
Exp. Biol. ... ed. , 85, 202 (1954).
The invention can further be illustrated by the following examples:
EMI8.5
.8x ..; r1] Jle 1
Pork pancreatic tissue, which has been subdivided by mincing, degreasing or solvent extraction and dehydrating into
EMI8.6
a quantity of 400 c: ra: ,, ::, es, was n.2ln ::; é with 2000 cm3 of water. The dry pancreatic tissue contained approximately 8 µ. in weight of
EMI8.7
sodium chloride and 10% by weight of pig duodenum tissue. This mixture was extracted by stirring at a temperature of 25 ° C. for a period of 5 hours.
EMI8.8
The extract formed was separated from the tissue residue by centrifugation.
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and the volume of the outside removed was 1800 cm).
A carboxylic acid resin (XE-97), in an amount of 180 g. Fat equilibrated with 0.05M acetate buffer, containing sodium acetate and acetic acid at pH 11-7. The balanced resin was mixed with 720 cc of pancreatic extract and 4950 cc of water. The resulting mixture was stirred at a temperature of 25 ° C for a period of 90 minutes and then the resin was separated from the supernatant liquid by centrifugation. The separated resin was washed with water twice, each wash being carried out with 1800 cc of water. The washings were separated from the resin by centrifugation and discarded.
The washed resin was mixed with 760 cm3 of sodium acetate-2- buffer solution. - acetic acid of pH 4.7 and the resulting mixture was stirred for a period of 90 minutes at a temperature of 25 C. The elution product was separated from the resin by centrifugation and then 690 cm3 of elution product were recovered, this product having a protein concentration of 2.4 mg. per cm3 determined by the Folin micro protein method. This elution product, in an amount of 675 cc, was mixed with 393 grams of solid ammonium sulfate and stirred at a temperature of 25 ° C. for a period of one hour to obtain dissolution of the ammonium sulfate.
The precipitate formed after this was separated from the supernatant liquid by filtering and the separated precipitate was dried by lyophilization. The lyophilized product weighed 11.3 grams and contained about 5% protein. The proteinase activity of this dried product was determined using hemoglobin as a substrate and the result can be expressed as either 0.11 mg. of tyrosine released per mg. by weight, i.e. 2.2 mg. of tyrosine released per mg. protein.
Example 2
A dried, defatted and reduced pork pancreas product containing about 8% by weight sodium chloride and 10% by weight pig duodenum tissue in an amount of
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800 grades was: .. '4; with 4000 CH3 of water. Ce:, iàla = 1I was a-it3 for a period of 3 hours at a temperature of 2500. The extracted extract was then separated from the tis residue by centrifugation; ea, ú and the hairy!.; ' - 'extract thus obtained was
EMI10.2
3700 cm3.
A carboxylic acid resin (XE-97) in one
EMI10.3
26J t; ral.E! 13 was equilibrated with a solution of sodium acetate, <5-11 - acetic acid at pH -, 7. The balanced resin was: 6ar¯.ve with 8C0 cin3 of the pancreatic extract and 5450 cm3 of water. This ..; 5itI1j; e was a01 ted for a period of
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135 minutes at a temperature of 25 C. The resin was separated from the
EMI10.5
supernatant liquid by centering and the supernatant liquid was discarded. The resin was then washed twice, each et. 1w bed with 20CO c: 3 water. The washing waters were dried from 1 resin by centrifuging and l1ises in
EMI10.6
scum.
The washed resin was eluted with 800 cm3 of solution.
EMI10.7
sodium acetate buffer: "- 2 .: - acetic acid at pI 4.7 per
EMI10.8
stirring at a temperature of 25 C, for a period of 135 minutes. The resulting dilution was separated from the re-
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sine by centrifugation, and the resin was discarded. The elution product was obtained in a volume of 750 csi 3 containing 31 mg. protein by cr3.
Part of this elution product, in an amount of 720 cr. 3, was -. "L e with 341 grams of sulfate of a ';:' '' '1oniu :: n solid and,' ] "1 &? 1 '::::; T-'sû¯it; zat was stirred at a temperature of 25 C for uno: ¯e..zr. 1. F; .5c; ; t <forne was allowed to settle at a temperature of COC and 5 Para supernatant liquid by centrifugation. The precipitate was dried by lyophilization and the dried product was obtained in a yield of 10.98 grams.
This dry product had W18 proteinase activity of 0.4 mz. of tyrosine by tii '. of proJui or 3.0 r. of tyrosine by m. :::;. protein (the dried r0ju1t contained about 5% protein).
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A second part of the elution product, in a
EMI10.11
amount of 700 c ,,, 3, yarn j ,; lan, to with 332 C. of sulfate
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solid ammonium and the mixture was stirred at a temperature of 25 ° C. for one hour. Then, the precipitate formed was allowed to settle at a temperature of 0 C and separated from the supernatant liquid by centrifuging. This precipitate was dried by lyophilization and the dried product was obtained in a yield of 14.35 g. containing about 5% by weight protein.
The proteinase activity of this product was equivalent to 0.37 mg. of tyrosine per mg. of product or 7.4mg. of tyrosine per mg. of .protein. Example 3
Reduced, defatted and dried pig pancreatic tissue containing approximately 8% by weight of sodium chloride and
10% by weight pig duodenum tissue, in an amount of
400 g., Was mixed with 2000 cm3 of water. This mixture was stirred for 4 hours at a temperature of 25 ° C. The extract formed was separated from the tissue residue by centrifuging. This pancreatic extract was obtained in a volume of 1530 cm3.
The carboxylic acid-type resin (XE-97), in an amount of 300 g., Was equilibrated with a buffer solution of sodium acetate-0.05M - acetic acid at pH 4.7. The equilibrated resin was mixed with 1200 cm3 of the bread extract and 8174 cm3 of water, then the resulting mixture was stirred at a temperature of 25 C. Then, the resin was separated from the liquid supernatant and this liquid was placed. discarded. The resin was washed twice, each wash being done with 3000 cm3 of water. The washings were separated from the resin by centrifugation and discarded. The resin was mixed with 1200 cm3 of sodium acetate-2M-acetic acid buffer solution at pH 4.7 and the resulting mixture was stirred at a temperature of 25 ° C.
The elution product formed was separated from the resin by centrifugation. This elution product was mixed with 498 g. of solid ammonium sulfate and the resulting mixture was stirred for one hour at a temperature of 25 C. Then, the
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mixture was allowed to settle at tc: np, 5r [Turkish OOG and the precipitate formed was separated by contrifu, ca-0. This precipitate was dried by lyophilization and the resulting dried product weighed 23.0 g. containing about 5% protein. The proteinase activity of this product was determined as 0.25 -au. of
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tyrosine by m. of product or 5.0 ln ;. of tyrosine by ru ,. protein.
The eluted resin mentioned was dissolved with 500 µl) of sodium acetate buffer solution: r-2:.: - acetic acid of pH 4.7. The resulting colander was stirred at a temperature of 0 C and then the elution product was separated from the resin by centrifuging. This elution product, which was obtained in a volume of 450 cm3, was with 214 ° C. of sulfate.
EMI12.3
solid dlarinonium. The resulting mixture was stirred at a temperature of 250 ° C. for one hour and the precipitate formed. 16 was allowed to settle at a temperature of 0 C. This precipitate was left to settle.
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separated from the supernatant liquid by centrifugation and this precipitate was dried by lyophilization. The yield of dried product was 6.6 g. containing about 5% by weight of
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protein.
The proteinase activity of this product was determined at 0.36 mb. of tyrosine by n. ioduct or 7.2 ^ .. .., tyrosine per mg. protein.
Example 4
Dried, shelled and reduced pork pancreatic tissue containing approximately 8% by weight sodium chloride and
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10. by weight of pig duod'nurl tissue, was with 3,600 in-3 of water. This? N2lane was stirred at a temperature of 25 ° C for 5 hours. The resulting extract was separated from the tissue residue by centrifugation and the extract quantity thus obtained was 3050 cm3.
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A c, rboY.: Ylir.!. Ue acid-type groove (X2: -97) in an amount of 70'J r. was equilibrated with a buffer acetate solution of :: oriurn-c3, t, 1.1 - acylic acid of pII -1.7. The balanced resin [', It u'Jlanr,; t':; c av '.. c 2000 c / :( ;; cytrait PIncr, 5atique and
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19,090 cm3 of water. This mixture was stirred for 60 minutes at a temperature of 25 ° C., then the residue was supernatant liquid by leakage. This plant was washed twice, this washing being obtained with 7000 cm3 of water. Wash waters
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were separated from the resin by conbrifucasc and Discarded. The washed resin was washed with J0 '> 0 cn3 of ammonium acetate-2M - acetic acid buffer solution of pI3 4.7 and the resulting mixture was stirred for 60 minutes at a temperature of 25 ° C.
The elution product formed was separated from the resin by centrifugation. This elution product was obtained in a volume of 2800 cm 3 containing 3.0 mg. of protein per cm3, as determined by the Folin micro protein method.
A part of this elution product, in an amount
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of 380 cm3, was mixed with 2045 cmj of alcohol 3.A to 95 ;.
Alcohol was added to the elution in a capillary fashion at a temperature of -5 ° C with vigorous stirring. The precipitate formed was allowed to settle at a temperature of -5 ° C. and this precipitate was separated from the supernatant liquid by centrifuging. The separated precipitate was dried by lyophilization and obtained in a yield of 0.49 g. This product, which was essentially all protein, was designated as A.
A second part of this elution product, in an amount of 1600 cc, was mixed with 8600 cc of 3A to 95 alcohol. The alcohol was added to the elution product in a capillary fashion at a temperature of -5. C with vigorous stirring. The precipitate formed was allowed to settle at a temperature of -5 ° C. and was then separated from the supernatant liquid by centrifugation. This precipitate was dried by lyophilization and obtained in a yield of 2.6 g. This dried product, which was essentially all protein, was designated as B.
EMI13.4
A third part of the elution product, in an amount of 595 cc, was scraped off with 3200 cc of 3-95% alcohol. Alcohol was added to the solution in a capillary manner at a temperature of -5oC, with vigorous stirring. The precipitate thus formed was left to deposit at a
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temperature of -5 ° C and separated from the supernatant liquid by centrifugation. This separated precipitate was dehydrated by lyophilization and the dried product weighed 0.70 g. This dry product was designated C and was essentially all protein.
The dry products mentioned above A. B and. C furen 'collected and mixed to form a uniform mass. This mass was analyzed for its proteinase activity and the results indicated an activity of 6.5 mg. of tyrosine: per mg. of product.
Example 5
A proteinase elution product, obtained according to Example 4, was subjected to a similar adsorption operation as follows:
This elution product, in a volume of 140 cc, was mixed with 965 cc of water and 96.5 cc of packed XE-97 resin containing 35 g. of dry resin previously equilibrated, according to the method of Example 4.
The resulting mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. Then the supernatant liquid was separated from the resin by centrifugation and discarded. The separated resin was eluted with 168 cc of solution. ammonium acetate-2N-acetic acid buffer of pH 4.7.
This elution product was analyzed and the results were as follows:
EMI14.1
<tb>
<tb> Concentration <SEP> of <SEP> protein <SEP> (method
<tb> micro <SEP> Folin <SEP> mg / cm3) <SEP> 0.246
<tb> activity <SEP> protêt-tick <SEP> (substrate
<tb> denatured <SEP> hemoglobin <SEP> - <SEP> units / cm3) <SEP> 9.44
<tb>
Thus, the purity of this pancrin product can be calculated as 38.4 proteolytic units per mg. protein.
Example
The proteolytic activity of the pancrin product obtained in Example 5 was compared with that of trypsin and chymotrypsin on different protein substrates, in
<Desc / Clms Page number 15>
which D denotes the urea denatured form of the substrate and N denotes the natural substrates.
The results were as follows:
EMI15.1
<tb>
<tb> Substrates <SEP> tryp- <SEP> chyme- <SEP> pancrin <SEP> anchor: <SEP> pancrin:
<tb> sine <SEP> tryp- <SEP> trypsin <SEP> chymo-
<tb> ¯¯¯¯ <SEP> sinē¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> trypsin
<tb> hemoglobin <SEP> D <SEP> 11.94 <SEP> 5.70 <SEP> 38.40 <SEP> 3.2 <SEP> 6.7
<tb> hemoglobin <SEP> N <SEP> 1.79 <SEP> 1.10 <SEP> 5.36 <SEP> 3.0 <SEP> 4.9
<tb> albumin <SEP> of
<tb> serum <SEP> D <SEP> 4.77 <SEP> 2.45 <SEP> 6.17 <SEP> 1.3 <SEP> 2.5
<tb> albumin <SEP> of
<tb> serum <SEP> N <SEP> 0.44 <SEP> 0.38 <SEP> 1.90 <SEP> 4.3 <SEP> 5.0
<tb> casein <SEP> D <SEP> 11.52 <SEP> 18.40 <SEP> 31.55 <SEP> 2.7 <SEP> 1.7
<tb> casein <SEP> N <SEP> 6.16 <SEP> 9.49 <SEP> 9.54 <SEP> 1.5 <SEP> 1.0
<tb>
* Pancrin to trypsin activity ratio.
** Pancrin to chymotrypsin activity ratio.
Example 7
The influence of particular trypsin inhibitors on the proteolytic activity of pancrin relative to the urea denatured hemoglobin substrate was demonstrated as follows:
EMI15.2
<tb>
<tb> Inhibitor <SEP> trypsin <SEP> chymotryp- <SEP> pancrin
<tb> acti- <SEP> inhi- <SEP> sine <SEP> acti- <SEP> inhivite <SEP> bition <SEP> acti- <SEP> inhi- <SEP> vity <SEP> bition <SEP>%
<tb> speed <SEP> bition
<tb> none <SEP> 11.94 <SEP> 5.70 <SEP> 35.80
<tb> inhibitor
<tb> <SEP> soybean <SEP> seed
<tb> trypsin <SEP> .1.58 <SEP> 87 <SEP> 3.67 <SEP> 36 <SEP> 28.20 <SEP> 21
<tb> inhibitor
<tb> trypsin
<tb> pancreatic <SEP> 2.41 <SEP> 80 <SEP>. <SEP> 4.63 <SEP> 19 <SEP> 24.50 <SEP> 32
<tb>
The concentration of inhibitor in these compositions was 100 grams per unit of proteolytic activity.
This amounts to an inhibitor to enzyme weight ratio of 4 (pancrin), 1,2 (trypsin) and 0.6 (chymotrypsin).
Example 8
The influence of beta phenyl propionate on the activity
<Desc / Clms Page number 16>
Proteolytic and esterolytic chymotrypsin and pancrin can be disassembled as follows
EMI16.1
<tb>
<tb> Substrate <SEP> propionate <SEP> chymotrypsin <SEP> pancrin
<tb> betaphenyl <SEP> activity <SEP> (units) <SEP> activity <SEP> (units)
<tb> concentrated <SEP> M <SEP> init. <SEP> final <SEP> inhib. <SEP> init. <SEP> final <SEP> inhib.
<tb>
@
<tb> hemoglobin
<tb> denatured
<tb> by <SEP> urea <SEP> 0.09 <SEP> 5.70 <SEP> 1, <SEP> 60 <SEP> 72 <SEP> 35.80 <SEP> 16.49 <SEP> 54
<tb> ATEE <SEP> 0.06 <SEP> 0.396 <SEP> 0.190 <SEP> 52 <SEP> 0.187 <SEP> 0.161 <SEP> 14
<tb> ATEE <SEP> 0.006 <SEP> 0.396 <SEP> 0.356 <SEP> 10 <SEP> 0.187 <SEP> 0.187 <SEP> 0
<tb>
The differences in the sensitivity of pancrin and chymotrypsin to inhibition by betaphenyl propionate exceed the limits of error for the test procedure. Accordingly, these results indicate that the inhibition of chymotrypsin by betaphenyl propionate is qualitatively different from that of pancrin.
Although in the above description various embodiments of the invention have been described in detail to illustrate it, it is obvious that various modifications can be made to it without departing from the scope of the invention.