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La présente invention se rapporte à un procédé pour la préparation d'esters polysulfuriques de la chitosane par sulfation de la chitosane.
Le procédé usuel de sulfation de la chitosane par l'acide chlorosulfonique (ou chlorhydrine sulfurique) en présence de pyridine donne des
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résultats très peu saifaisants.A1nsi,lorsqu'on introduit la chitosane dans un mélange chaud de pyridine et d'acide chlorosulfonique (3:1 parties en volume),pn n'obtient qu'un faible rendement en ester polysulfurique de chi- tosane.Même lorsqu'on chauffe longuement la chitosane au sein de pyridine pour la faire gonfler et qu'on la traite ensuite par le mélange pyridine-
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acide chlorosulfonique, les résultats ne sont guère meilleurs.Ce procédé présente les désavantages de nécessiter beaucoup de temps, d'être compliqué et de ne pas se porter à une mise en oeuvre sur une grande échelle.
On a trouvé qu'ils est facile d'effectuer la sulfation de la chito- sane, si on la met en solution avant la sulfation en la dissolvant sous for- me de ses sels dans de la formamide.
Le procédé pour'.la préparation d'esters polysulfuriques de la chi- tosne, suivant la présente" invention,consiste à transformer la chitosane en un sel,à dissoudre ce sel dans de la formamide et à faire agir sur,cette solution de l'acide chlorosulfonique ou un mélange de pyridine et d'acide chlorosulfonique.
La réaction entre les sels de'la chitosane en solution avec 1'
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acide chlorosulfonique, selon la présente invention,est homogène et se laisse facilement contr8ler de sorte que l'on peut obtenir, de manire re- productible,tous les degrés de sulfation voulus.
Les esters polysulfuriques de chitosane obtenus selon la présente invention sont des substances qui exercent une action inhibitrice sur la coagulation du sang et présentent une activité analogue à celle de l'hépa- rine.Ces esters peuvent, par conséquent, être utilisés à des fins thérapeuti-
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ques dans tous les cas où l'on désire obtenir l'effet anticoagulant de l'hc:- parine.Les fractions à poids IrÍblédù1a.irê bas 'de - ' e4te>s 1pol;rsu:tfuriques' , de''chiiosane o15tenùs tpeuvent - Ê!,tre utilisées pour éclà'.xo3x, du plasma ; lîpéràique , .' : 1 -' .
Il convient de mettre en oeuvre le procédé selon la présente in- vention de la manière décrite ci-après,
On désaoétyle de la qhitine (cf.Dissertation par Bruno Camerino,
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zuriah,1945,h- 36);par exemple un'produit commercial, de préférence exempt de carbonate,par fusion alcaline selon les indications de LOEWY (Biochem.
Zeitschrift 23 47 i1910j ).On dissout la ohitosane, obtenue, après éli- mination de l'alcali,dans un acide inorganique ou organique, de préférence un acide monobasique tel que les acides chlorhydrique,bromhydrique, perchlo- rique, nitrique, formique ,acétique ,etc., et,on précipite le sel de chitosane par addition d'agents précipitants miscibles à l'eau tels que, par exemple, l'acétone, le méthanol,etc.Ensuite on dissout le sel de chito-
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sane dans de la fô r6ami.de, ''onca3 oute â; la solution tout en la refroidis- sant clé l'acide chlorosulfoïliqus ét on agite longuement le méi1.Ie mé- .lange *.é,t3tnelayeutid.a.b#r dé.
Tâ: aanièfe âécri-bë. ci-après,Les po- duits -ainsi obtenus se caractérisent par le fait qu'ils contiennent encore des groupements amirio libres, ce qui est démontré,par les résultats des
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dosages d'azote selon Van Slyke.Le nombre de groupements amino est parti- culièrement élévé lorsqu'on utilise des'sels de chitosane avec des acides forts, par exemple le,chlorhydrate on le perchlorate.
Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé suivant la pré- sente invention,on peut ajouter la solution du sel de chitosane dans la formamide à un mélange chaud de pyridine et d'acide chlorosulfonique et
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procéder à la sulfation à une température quelconque comprise entre 20 et
100 C. Le produits obtenus selon ce mode opératoire contiennent, en général un nombre inférieur de groupements amino libres.
On a constaté que la sulfation du sel de chitosane dans la for- mamide est accompagnée d'une formylation d'une partie des groupements amino libres, de sorte qu'on obtient des produits qui contiennent, suivant les conditions de réaction, un nombre plus ou moins élevé de groupements amino formylés.Les produits contenant de nombreux groupements amino libres présentent, relativement, peu de groupes formyliques et vice versa.Ainsi, .'on peut influencer la teneur en groupes formyliques par lés mesures indi- quées, par exemple par sulfation de sels de la chitosane avec des acides forts, en présence ou absence de pyridine, ou par sulfation de sels de la chitosane avec des acides faibles, en présence ou absence de pyridine.Oh obtient une teneur basse en groupes formyliques (environ 1,5% de groupes formyliquesg)
par exemple en sulfatant le. chlorhydrate de chitosane en 1' absence de pyridine, tandis qu'on obtient une teneur élevée en groupes formyliques (environ 9% de groupes formyliques) en sulfatant le formiate de chitosane en présence de pyridine.
Le présent procédé permet donc d'ajuster à volonté la teneur des produits finals en groupements amino libres, en utilisant des sels de la chitosane avec des acides forts et en variant la quantité de la pyridine.
La teneur des produits finals en soufre est une fonction de la quantité d'acide chlorosulfonique utilisée ainsi que de la température et du temps de sulfation.On peut faire varier à volonté la teneur en.,soufre entre des limites assez éloignées.
Suivant les propriétés physiques que devca présenter le produit final, on peut procéder à une dégradation partielle des molécules de chi- tosane ,soit avant ou après la sulfation.mais en tout cas après la salifi- cation de la chitosane.Cette dégradation peut être effectuée,par exemple* par un traitement avec du peroxyde d'hydrogène ou par hydrolyse avec des acides ou des alcalis.A la suite de cette dégradation, on obtient des produits finals dont le degré de polymérisation est inférieur à celui des produits de départ.
L'activité anticoagulante des produits obtenus par le présente pro- cédé est une fonction de la teneur en soufre et du degré de polymérisation des produits.Lorsqu'il est prévu d'utiliser les esters polysulfuriques de chitosane comme anticoagulants, il convient, par conséquence, de choisir une teneur en soufre élevée, par exemple d'environ 12 à 16%, et un degré de polymérisation élevé.On a fait la découverte surprenante que, parmi les esters polysulfuriques de la chitosane, ceux qui présentent un degré de polymérisation réduit et qui ne possèdent aucune ou qu'une faible activité anticoagulante;exercent une action clarifiante remarquable sur le plasma lipémique et peuvent, par conséquent, être utilisés comme médicaments contre l'artérioclérose.
Ainsi, le présente procédé permet d'obtenir des homolo- gues polymères qui différent quant à leur activité biologique,à partir d'un seul et même squelette polymère, en modifiant la longueur de chaîne des molécules polymères.
Une dégradation partielle peut être obtenue, en particulier, en traitant le sel de chitosane ou les esters polysulfuriques de la chitosane par du peroxyde d'hydrogène .On peut obtenir différents degrés de dégradation en'faisant varier la quantité de peroxyde,la température et le temps de - réaction et le temps de réaction ou en combinant judicieusement 'des facteurs.
On peut également effectuer la dégradation par voie hydrolytique, soit avec des acides ou des alcalis, de manière connue.Pour'influencer la longueur de chaîne, on dispose encore de la méthode consistant à faire varier la
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température de sulfation, le degré de dégradation étan d'autant plus élevé que la température de sulfation est plus élevée.Le degré de la dégradation des esters polysulfuriques est caractérisé viscosimétriquement par l'indice de viscosité ("intrinsic viscosity"); n, qui est défini par l'équation suivante :
n, = lim nspec c c oùnspec = nl-n. /n. = nrel - 1, et n = viscosité de la solution
L = viscosité du solvant c concentration en g/100 cm3
La valeur limite n est déterminée graphiquement, à partir de différentes concentrations, par exemple en portant nspec/c en ordonnée et c en abscisse.Les mesures de viscosité sont exécutées à l'aide d'un viscosimètre Ostwald à 25 C.
Les esters polysulfuriques de chitosane obtenus par le présent procédé sont des corps polydispersés. Par conséquent, il convient, en par- ticulier dans les cas où l'on a intercalé une opération de dégradation, de procéder à un fractionnement des produits obtenus,soit avant ou après la sulfation, mais en tout cas après la dégradation, et de choisir les fractions qui, après leur transformation, présenteront les propriétés voulues.
Dans ce but, on peut fractionner soit la chitosane sous forme de ses sels soit les esters polysulfuriques de la chitosane, de préférence sous forme de leurs sels alcalins.On peut procéder de la manière suivante : On dissout le pro- duit pollydispersé dans de l'eau et on ajoute à la solution un précipitant miscible à l'eau tel que le méthanol, l'éthanol, d'écétone, etc., en quan- tités de plus en plus élevées, les fractions individuelles étant ainsi pré- cipitées dans l'ordre des poids moléculaires décroissants.On sépare les fractions individuelles les unes des autres.Pour précipiter les fractions à poids moléculaire élevé, on ajoute donc une petite quantité de précipi- tant,
tandis que la précipitation des fractions à poids moléculaire bas nécessite une quantité plus grande de précipitant.Pour obtenir des esters polysulfuriques de chitosane anticoagulants à poids moléculaire élevé, on éliminera du mélange polydispersé les fractions à poids moléculaire bas, tandis que pour obtenir des esters polysulfuriques à poids moléculaires bas,utilisables dans la thérapeutique de l'artériosclérose, on éliminera les fractions à poids moléculaire élevé,
Pour élaborer le mélange d'esters polysulfuriques de chitosane obtenu, il convient de procéder de la manière suivante:
On sépare les frac- tions polymères du produit de sulfation à l'aide de méthanol ou d'un autre précipitant convehalbe, par exemple d'éthanol, d'acétone, etc., éventuellement en ajoutant de l'acétate de sodium pour faciliter la précipitation.Le pré- cipité est lavé avec le précipitant et ensuite dissout dans une petite quantité d'eau.On ajuste le PH de la solution à 9 avec un alcali.A cette solution du sel alcalin brut, on ajoute de nouveau du méthanol,et éventuel- lement de l'acétate de sodium, pour précipiter ledit sel alcalin.On redis- sout le produit précipité dans de l'eau,on ajoute de la glace à la solu- tion et on transforme le produit dissous en son sel de narcotine ou d'un
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autre alcaloïde, en ajoutant à la solution, en l'agitant,
une solution con- centrée de narcotine ou de l'alcaloïde correspondant.On isole dle sel obtenu, par centrifugation ou filtration,on le lave soigneusement à l'eau et on-le retransforme en sel alcalin en l'ajoutant à une solution de carbonate,soit à la température, ambiante soit à une température quelque peu élevée.L'alca- loïde précipité est séparé par filtration et soigneusement lavé .Le filtrat est neutralisé à l'aide d'acide acétique,concentré, si nécessaire, et ensui- te traité par du méthanol ou un autre précipitant.On peut, éventuellement,:' répéter cette précipitation pour purifier et fractionner les esters poly- sulfuriques de chitosane.
Pour des buts thérapeutiques,les esters polysulfuriques de chi- tosàne obtenus par le procédé suivant la présente invention, lesquels sont caractérisés par une toxicité très faible,sont utilisés, de préférence, sous forme de leurs sels alcalins.
Exemple;1
Pour préparer la, formiate de chitosane,on dissout la chitosane dans de l'acide formique étendu et on ajoute de l'acétone à la solution visqueuse pour obtenir un précipité.Le précipité est essoré,séché et broyé.
Le produit obtenu est facilement soluble dans l'eau n = 1,04.
En vue d'une dégradation partielle, on dissout, en qhauffant dans un bain de vapeur,100 g du formiate de chitosane obtenu dans 1 litre d' eau'bn ajoute 25 cc. de perhydrol à 30% à la solution et on chauffe le mé- lange à 7000,, en l'agitant, dahscmm thermostat.Au bout 'de 2 heures le perhy- drol est entièrement consommé .Le mélange réactionnel est ensuite concentré à 450 ce.dans le vide,éventuellement après filtration.A la solution concen- trée on ajoute, 3 litres d'acétone pour obtenir un précipité.Après élimina- tion de l'acétone aqueux par décantation, on verse 500 ce. d'acétone fraî- che sur le précipité, on l'essore et on le sèche pour le durcir.Rendement
90 g; n = 0,190.
Pour la sulfation, on dissout 90 g de ce formiate de chitosane partiellement dégradé, n agitant, dans 900 cc. de formamide'chauffée à 50 C.
Ensuite, on refoidit la solution, avec de l'eau glacée et on y ajoute len- tement, goutte à goutte, à environ 1000, 180 cc. d'acide chlorosulfonique
Pour mener à bout'la réaction, on agite le mélange réactionnel pendant la nuit, à la température ambiante.Ensuite, on essore le mélange à travers de la cellulose filtrante et on ajoute u filtrat, en lagitant, 3 litres de méthanol contenant 120 g d'acétate de sodium en solution pour provoquer - une précipitation.On isole le précipité et on le dissout dans une petite quantité d'eau.On ajuste le pH de la solution à 9 par addition d'alcali concentré et on représipite à l'aide de méthanol,:
On dissout le!sel sodique brut dans environ 1,5 litres d'eau et on ajoute à la solution 500 g de glace.Ensuite, on ajoute à ce mélange, en l'agitant,une solution de 280 g de chlorhydrate de narcotine dans 1 litre d'eau,pour précipiter le sel de narcotine de l'ester polysulfurique de chitosane.Ce sel est isolé par fil- tration et lavé avec environ 1,5 litres d'eau froide.On met en suspension le sel de narcotine dans environ 1,5 litres d'eau,on ajoute 60 g de carbo- nate de sodium solide à la suspension et on agite le mélange pendant la nuit.On essore la narcotine précipitée et on la lave avec environ 1 litre d'eau.Ensuite, on ajuste le PH du filtrat à 5 par addition d'acide acétique glacial, on le concentre à 450 cc.
sous pression réduite et on ajoute à la solution concentrée 3 litres de méthanol contenant, ensolution, 30 g d'acéta- te de sodium,pour provoquer'une précipitation.On repète une fois encore cette suite d'opérations.Par séchage du précipité sous pression réduite on obtient 110 g d'une poudre blanche présentant une teneur en soufre de 15,1% et un indice de viscosité n de 0,072 (dans une solution 0,5 N de NaCl).
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Teneur totale en azote: 3,39%; teneur en azote selon Van Slyke (groupements amino libres): 1,20%; teneur en groupements formyliques ; 3,2% .Ce produit ne possède qu'une faible activité anticoangulante; en revanche, il exerce une action clarifiante prononcée sur le plasma lipémique.
Exemple 2.
On mélange 90 g du formiate de chitosane obtenu selon l'exemple
1 avec de la formamide pour obtenir une pâte.On dissout cette pâte à 50 C en ajoutant 900 cc. de formamide, tout en agitant.Après élimination de gru- meaux non-dissous par filtration,on procède à la sulfation,selon les indi- cations données dans l'exemple 1, avec 180 cc. d'acide chlorosulfonique.Le mélange de sulfation est élaboré de la manière décrite dans l'exemple 1.
L'ester polysulfurique de chitosane obtenu présente une teneur en soufre de 12,6 % et un indice de viscosité n de 0,3415 (dans une solution 0,5 N de
NaCl).Teneur totale en azote :3,05% teneur en azote selon Van Slijke groupements amino libres): 0,5%; teneur en groupes formyliques: 6,0%.
Ce produit présente, in vivo, une bonne activité anticoagulante et peut être utilisé comme anticoagulant.
Exemple 3.
On met en suspension 50 g de chitosane dans environ 1200 cc.d'eau et on ajoute à la suspension ,en l'agitant, environ 30 ce.d'acide chlorhy- drique concentré.On obtient ainsi une solution à viscosité élevée.Par ad- dition d'environ 3 litres d'acétone à la solution,on précipite du chlorhy- drate de chitosane que l'on isole par filtration, lave à l'acétone et sèche..
On dissout 10 g de ce chlorhydrate de'chitosane dans 60 cc. de formamide en chauffant à 70 C.On ajoute la solution obtenue à un mélange fon- du de 90 cc.de pyridine et 30 cc d'acide chlorosulfonique , à 70 C.La température du mélange s'élève à 85 C.Il se produit un dégagement de gaz à la suite d'une décomposition de la formamide.Le mélange réactionnel est ensuite agité pendant 2 heures à 90 C.Le mélange de sulfation est élaboré de la manière décrite dans l'exemple 1.Le produit obtenu présente les propriétés suivantes : Teneur en soufre: 14,8 %, n = 0,270 (dans une solu- tion 0,5 N de NaCl);teneur totale en azote :4,26%; teneur en azote selon Van Slyke: 0,16; teneur en groupes formyliques :6,0%.
Exemple 4.'
On dissout 5 g d'ester polysulfurique de chitosane (n = 0,315, en.solution de NaCl 0,5 N) obtenu.selon l'exemple 2 'dans 7,5 cc. d'eau.
On chauffe la solution à 70 C dans un thermostat et on y ajoute 1,75 cc. d'acide chlorhydrique concentré.Au bout de 330 minutes la solution de l' ester partiellement dégradé est neutralisée par de la soude caustique;con- centrée et additionnée de méthanol pour précipiter le produit de dégrada- tion.L'indice de viscosité n du produit obtenu est tombé à 0,135 (en solu- tion 0,5 N de NaCl).
Exemple 5.
On dissout 2 g de l'ester polysulfurique de chitosane ( n = 0,315) obtenu selon l'exemple 2 dans 20 cc. d'eau.On ajoute 0,3 ce.de peroxyde d'hydrogène à 30% à la solution et on la chauffe environ 1 heure à 90 C.Au bout de ce temps la réaction est terminée et le peroxyde est consommé.Après une filtration éventuellement nécessaire, on concentre la solution à 10 ce.sous pression réduite et on ajoute du méthanol au concen- trat pour précipiter un produit présentant un indice de viscosité n de 0,150 (en solution 0,5 N de NaCl).
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Exemple 6
On dissout 5 g de chlorhydrate de chitosane dans 75 ce. de formamide dans un bain de -vapeur.On refroidit ensuite la solution à 5 -10 C avec de l'eau glacée.Ensuite, on ajoute lentement, goutte à goutte, 15 ce.d'acide chlorosulfonique et on agite le mélange pendant 24 heures à la température ambiante.Le mélange de sulfation est élaboré de la manière décrite dans l' exemple 1.Le produit obtenu présente les propriétés suivantes: n = 0,245; teneur en soufre :16,24 %, teneur totàle en azote: 3,58%; teneur en azote selon Van Slyke: 2,90%.
Exemple 7
On introduit 340 g de formiate de chitosane non dégradé dans 5,8 litres de formamide. Le mélange est agité pendant 24 heures à la tempéra- ture ambiante et ensuite encore 5 heures à 6000.La solution obtenue,à vis- cosité élevée, est ensuite ajoutée à un mélange fondu de 680 ce.d'acide chlorosulfonique et de 2040 ce. de pyridine.Le mélange de sulfation est chauffé pendant 4 heures à 900C.En élaborant le mélange de réaction de la manière décrite dans l'exemple 1, on obtient un ester polysulfurique de chitosane présentant une teneur en soufre de 12,7%. [#]= 0,48 (en solution 0,5 N-de NaCl); teneur totale en axote: 4,34%,teneur en azote selon Van Slyke: 0,07%; teneur en groupes formyliques:8,7%.
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The present invention relates to a process for the preparation of polysulfuric esters of chitosan by sulfation of chitosan.
The usual process of sulfation of chitosan with chlorosulfonic acid (or sulfuric chlorohydrin) in the presence of pyridine gives
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Very poor results. Therefore, when chitosan is introduced into a hot mixture of pyridine and chlorosulfonic acid (3: 1 parts by volume), pn obtains only a low yield of polysulfuric ester of chitosan. Even when the chitosan is heated for a long time in pyridine to make it swell and that it is then treated with the pyridine mixture.
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chlorosulfonic acid, the results are not much better. This process has the disadvantages of requiring a lot of time, of being complicated and of not being carried out on a large scale.
It has been found that it is easy to effect the sulfation of chitosane, if it is dissolved before sulfation by dissolving it in the form of its salts in formamide.
The process for the preparation of polysulphuric esters of chitosene, according to the present invention, consists of converting chitosan into a salt, dissolving this salt in formamide and reacting this solution of l. chlorosulfonic acid or a mixture of pyridine and chlorosulfonic acid.
The reaction between the salts of chitosan in solution with 1 '
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Chlorosulfonic acid, according to the present invention, is homogeneous and can be easily controlled so that all desired degrees of sulfation can be reproducibly obtained.
The polysulphuric esters of chitosan obtained according to the present invention are substances which exert an inhibitory action on blood coagulation and exhibit an activity similar to that of heparin. These esters can therefore be used for therapeutic purposes. -
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ques in all cases where it is desired to obtain the anticoagulant effect of hc: - parine.Low weight fractions IrÍblédù1a.irê 'de -' e4te> s 1pol; rsu: tfuriques', de''chiiosane o15tenùs t can be used to light up plasma; lîpéràique,. ' : 1 - '.
The process according to the present invention should be carried out as described below,
Qhitin is deaoetylated (see Dissertation by Bruno Camerino,
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zuriah, 1945, h- 36); for example a commercial product, preferably carbonate-free, by alkaline melting according to the indications of LOEWY (Biochem.
Zeitschrift 23 47 i1910j). The ohitosan obtained, after elimination of the alkali, is dissolved in an inorganic or organic acid, preferably a monobasic acid such as hydrochloric, hydrobromic, perchloric, nitric, formic acids, acetic, etc., and the chitosan salt is precipitated by the addition of water-miscible precipitating agents such as, for example, acetone, methanol, etc., then the chitosan salt is dissolved.
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sane in fô r6ami.de, '' onca3 oute â; the solution while cooling it with the chlorosulfoilic acid and the mixture is stirred for a long time * .é, t3tnelayeutid.a.b # rd.
Tâ: aanièfe âécri-bë. below, The resulting polymers are characterized by the fact that they still contain free amirio groups, which is demonstrated by the results of the
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Nitrogen determinations according to Van Slyke. The number of amino groups is especially high when chitosan salts with strong acids are used, for example hydrochloride or perchlorate.
According to another embodiment of the process according to the present invention, the solution of the chitosan salt in formamide can be added to a hot mixture of pyridine and chlorosulfonic acid and
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carry out the sulfation at any temperature between 20 and
100 C. The products obtained according to this procedure generally contain a lower number of free amino groups.
It has been found that the sulfation of the chitosan salt in the formamide is accompanied by a formylation of part of the free amino groups, so that products are obtained which contain, depending on the reaction conditions, a greater number. or less formyl amino groups. Products containing many free amino groups have relatively few formyl groups and vice versa. Thus, the content of formyl groups can be influenced by the measures indicated, for example by sulfation of salts of chitosan with strong acids, in the presence or absence of pyridine, or by sulfation of salts of chitosan with weak acids, in the presence or absence of pyridine.Oh obtains a low content of formyl groups (about 1, 5% formyl groupsg)
for example by sulfating the. Chitosan hydrochloride in the absence of pyridine, while a high content of formyl groups (about 9% formyl groups) is obtained by sulfating chitosan formate in the presence of pyridine.
The present process therefore makes it possible to adjust the content of the final products of free amino groups at will, by using salts of chitosan with strong acids and by varying the amount of pyridine.
The sulfur content of the end products is a function of the amount of chlorosulfonic acid used as well as the sulfation temperature and time. The sulfur content can be varied at will between fairly wide limits.
Depending on the physical properties that the final product must have, a partial degradation of the chitosan molecules can be carried out, either before or after the sulfation, but in any case after the salification of the chitosan. This degradation can be carried out. , for example * by treatment with hydrogen peroxide or by hydrolysis with acids or alkalis. As a result of this degradation, end products are obtained whose degree of polymerization is lower than that of the starting products.
The anticoagulant activity of the products obtained by the present process is a function of the sulfur content and the degree of polymerization of the products. When it is intended to use the polysulfuric esters of chitosan as anticoagulants, it is therefore appropriate , to choose a high sulfur content, for example about 12 to 16%, and a high degree of polymerization. It has been surprisingly found that among the polysulfuric esters of chitosan those which exhibit a reduced degree of polymerization and which have no or only weak anticoagulant activity, exert a remarkable clarifying action on lipemic plasma and can therefore be used as drugs against arterioclerosis.
Thus, the present process makes it possible to obtain polymer homologues which differ in their biological activity, from one and the same polymer backbone, by modifying the chain length of the polymer molecules.
Partial degradation can be obtained, in particular, by treating the chitosan salt or the polysulfuric esters of chitosan with hydrogen peroxide. Different degrees of degradation can be obtained by varying the amount of peroxide, the temperature and the temperature. reaction time and reaction time or by a judicious combination of factors.
The degradation can also be carried out hydrolytically, either with acids or alkalis, in a known manner. In order to influence the chain length, the method of varying the chain length is also available.
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sulfation temperature, the degree of degradation etan all the higher as the sulfation temperature is higher. The degree of degradation of polysulfuric esters is characterized viscosimetrically by the viscosity index ("intrinsic viscosity"); n, which is defined by the following equation:
n, = lim nspec c c wherenspec = nl-n. /not. = nrel - 1, and n = viscosity of the solution
L = viscosity of the solvent c concentration in g / 100 cm3
The limit value n is determined graphically, from different concentrations, for example by plotting nspec / c on the y-axis and c on the x-axis. The viscosity measurements are carried out using an Ostwald viscometer at 25 C.
The polysulfuric esters of chitosan obtained by the present process are polydisperse bodies. Consequently, it is advisable, in particular in cases where a degradation operation has been interposed, to proceed with a fractionation of the products obtained, either before or after the sulfation, but in any case after the degradation, and to choose the fractions which, after their transformation, will exhibit the desired properties.
For this purpose, it is possible to fractionate either chitosan in the form of its salts or the polysulphuric esters of chitosan, preferably in the form of their alkali salts. The following procedure can be carried out: The pollydispersed product is dissolved in water. water and a water-miscible precipitant, such as methanol, ethanol, ecetone, etc., is added to the solution in increasing amounts, the individual fractions thereby being precipitated in the solution. order of decreasing molecular weights. The individual fractions are separated from each other. To precipitate the high molecular weight fractions, a small amount of precipitate is therefore added,
while the precipitation of the low molecular weight fractions requires a larger amount of precipitant. To obtain high molecular weight anticoagulant polysulfuric chitosan esters, the low molecular weight fractions will be removed from the polydispersed mixture, while to obtain polysulfuric esters at low molecular weight, which can be used in the therapy of arteriosclerosis, the high molecular weight fractions will be eliminated,
To prepare the mixture of polysulphuric esters of chitosan obtained, it is necessary to proceed as follows:
The polymeric fractions of the sulfation product are separated with the aid of methanol or another convoluted precipitant, for example ethanol, acetone, etc., optionally with the addition of sodium acetate to facilitate the separation. precipitation. The precipitate is washed with the precipitant and then dissolved in a small quantity of water. The pH of the solution is adjusted to 9 with an alkali. To this solution of the crude alkali salt, methanol is added again. and optionally sodium acetate, to precipitate said alkali salt. The precipitated product is redissolved in water, ice is added to the solution and the dissolved product is converted to its sodium salt. narcotine or a
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other alkaloid, adding to the solution, stirring it,
a concentrated solution of narcotine or the corresponding alkaloid. The salt obtained is isolated by centrifugation or filtration, washed thoroughly with water and converted back to alkaline salt by adding it to a carbonate solution , either at room temperature or at a somewhat elevated temperature. The precipitated alkaloid is filtered off and washed thoroughly. The filtrate is neutralized with acetic acid, concentrated, if necessary, and then It is treated with methanol or another precipitant. This precipitation can optionally be repeated to purify and fractionate the poly-sulfuric esters of chitosan.
For therapeutic purposes, the polysulfuric esters of chitones obtained by the process according to the present invention, which are characterized by very low toxicity, are preferably used in the form of their alkali salts.
Example; 1
To prepare chitosan formate, chitosan is dissolved in extended formic acid and acetone is added to the viscous solution to obtain a precipitate. The precipitate is drained, dried and ground.
The product obtained is easily soluble in water n = 1.04.
With a view to partial degradation, 100 g of the chitosan formate obtained are dissolved, while heating in a steam bath, in 1 liter of water, and 25 cc. 30% perhydrol in the solution and the mixture is heated to 7000, with stirring, dahscmm thermostat. After 2 hours the perhy- drol is completely consumed. The reaction mixture is then concentrated to 450 cc. .in vacuum, optionally after filtration. 3 liters of acetone are added to the concentrated solution to obtain a precipitate. After removal of the aqueous acetone by decantation, 500 cc are poured in. of fresh acetone on the precipitate, filtered off and dried to harden.
90 g; n = 0.190.
For sulfation, 90 g of this partially degraded chitosan formate, with stirring, is dissolved in 900 cc. of formamide 'heated to 50 C.
Then the solution is cooled with ice water and added slowly, dropwise, to about 1000, 180 cc. chlorosulfonic acid
To carry out the reaction, the reaction mixture is stirred overnight at room temperature, then the mixture is filtered off through filter cellulose and the filtrate is added, with stirring, 3 liters of methanol containing 120 g. of sodium acetate in solution to induce - precipitation. The precipitate is isolated and dissolved in a small amount of water. The pH of the solution is adjusted to 9 by adding concentrated alkali and re-precipitated with methanol aid ,:
The crude sodium salt is dissolved in about 1.5 liters of water and 500 g of ice is added to the solution. To this mixture is added, with stirring, a solution of 280 g of narcotine hydrochloride in 1 liter of water, to precipitate the narcotine salt from the polysulfuric ester of chitosan. This salt is isolated by filtration and washed with about 1.5 liters of cold water. The narcotine salt is suspended in about 1.5 liters of water, 60 g of solid sodium carbonate is added to the suspension and the mixture is stirred overnight. The precipitated narcotine is filtered off and washed with about 1 liter of water. , the pH of the filtrate is adjusted to 5 by the addition of glacial acetic acid, it is concentrated to 450 cc.
under reduced pressure and 3 liters of methanol containing, in solution, 30 g of sodium acetate, are added to the concentrated solution to cause precipitation. This series of operations is repeated once more. By drying the precipitate under reduced pressure 110 g of a white powder are obtained having a sulfur content of 15.1% and a viscosity index n of 0.072 (in a 0.5 N solution of NaCl).
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Total nitrogen content: 3.39%; nitrogen content according to Van Slyke (free amino groups): 1.20%; content of formyl groups; 3.2%. This product has only weak anticoangulant activity; on the other hand, it exerts a pronounced clarifying action on the lipemic plasma.
Example 2.
90 g of chitosan formate obtained according to example are mixed
1 with formamide to obtain a paste.We dissolve this paste at 50 C by adding 900 cc. of formamide, while stirring. After removal of the undissolved lumps by filtration, the sulfation is carried out, according to the indications given in Example 1, with 180 cc. of chlorosulfonic acid. The sulfation mixture is prepared as described in Example 1.
The polysulphuric ester of chitosan obtained has a sulfur content of 12.6% and a viscosity number n of 0.3415 (in a 0.5 N solution of
NaCl). Total nitrogen content: 3.05% nitrogen content according to Van Slijke free amino groups): 0.5%; content of formyl groups: 6.0%.
This product has, in vivo, a good anticoagulant activity and can be used as an anticoagulant.
Example 3.
50 g of chitosan are suspended in about 1200 cc of water and about 30 cc of concentrated hydrochloric acid is added to the suspension with stirring. This gives a high viscosity solution. Adding about 3 liters of acetone to the solution, chitosan hydrochloride is precipitated which is isolated by filtration, washed with acetone and dried.
10 g of this chitosan hydrochloride are dissolved in 60 cc. of formamide by heating to 70 C. The solution obtained is added to a molten mixture of 90 cc of pyridine and 30 cc of chlorosulfonic acid, at 70 C. The temperature of the mixture is 85 C. produces gas evolution following decomposition of formamide. The reaction mixture is then stirred for 2 hours at 90 C. The sulfation mixture is prepared as described in Example 1 The product obtained has the following characteristics. following properties: Sulfur content: 14.8%, n = 0.270 (in 0.5N NaCl solution), total nitrogen content: 4.26%; nitrogen content according to Van Slyke: 0.16; content of formyl groups: 6.0%.
Example 4. '
5 g of polysulfuric ester of chitosan (n = 0.315, in 0.5N NaCl solution) obtained according to Example 2 'are dissolved in 7.5 cc. of water.
The solution is heated to 70 ° C. in a thermostat and 1.75 cc is added thereto. of concentrated hydrochloric acid. After 330 minutes the solution of the partially degraded ester is neutralized with caustic soda; concentrated and added with methanol to precipitate the degradation product. The viscosity index n of product obtained dropped to 0.135 (in 0.5N NaCl solution).
Example 5.
2 g of the polysulphuric ester of chitosan (n = 0.315) obtained according to Example 2 are dissolved in 20 cc. water. 0.3 cc of 30% hydrogen peroxide is added to the solution and heated for about 1 hour at 90 C. At the end of this time the reaction is complete and the peroxide is consumed. If required, filtration is concentrated to 10 cc under reduced pressure and methanol is added to the concentrate to precipitate a product having a viscosity number n of 0.150 (in 0.5 N NaCl solution).
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Example 6
5 g of chitosan hydrochloride is dissolved in 75 cc. of formamide in a steam bath. The solution is then cooled to 5 -10 C with ice-water. Then, 15 cc of chlorosulfonic acid is slowly added dropwise and the mixture is stirred for 24 hours at room temperature. The sulfation mixture is prepared as described in Example 1. The product obtained exhibits the following properties: n = 0.245; sulfur content: 16.24%, total nitrogen content: 3.58%; nitrogen content according to Van Slyke: 2.90%.
Example 7
340 g of undegraded chitosan formate are introduced into 5.8 liters of formamide. The mixture is stirred for 24 hours at room temperature and then a further 5 hours at 6000. The solution obtained, at high viscosity, is then added to a molten mixture of 680 cc of chlorosulfonic acid and 2040 cc. . of pyridine. The sulfation mixture is heated for 4 hours at 900 C. By working out the reaction mixture as described in Example 1, a polysulfuric ester of chitosan is obtained with a sulfur content of 12.7%. [#] = 0.48 (in 0.5 N-NaCl solution); total axote content: 4.34%, nitrogen content according to Van Slyke: 0.07%; content of formyl groups: 8.7%.