BE1023838A1 - Cellules hotes modifiees pour une utilisation dans la production de bioconjugues - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne des cellules hôtes capables de produire des oligosaccharides ou polysaccharides hybrides, lesdits oligosaccharides ou polysaccharides hybrides ne comprenant pas d hexose au niveau de I extrémité réductrice de leur premier motif répétitif. La présente invention concerne également des oligosaccharides ou polysaccharides hybrides et des bioconjugués qui peuvent être produits par les cellules hôtes décrites dans la présente invention, lesdits bioconjugués comprenant une protéine support liée à un oligosaccharide ou polysaccharide hybride qui ne comprennent pas d hexose au niveau de I extrémité réductrice de leur premier motif répétitif.

Description

CELLULES HOTES MODIFIEES POUR UNE UTILISATION DANS LA PRODUCTION DE BIOCONJUGUES
1 - INTRODUCTION
On propose dans la présente demande des cellules hôtes pouvant produire des oligosaccharides et des polysaccharides hybrides, lesdits oligosaccharides et polysaccharides hybrides ne comprenant pas d'hexose à l'extrémité réductrice de leur premier motif répétitif. On propose également des oligosaccharides et polysaccharides hybrides et des bioconjugués qui peuvent être produits par les cellules hôtes décrites ici, lesdits bioconjugués comprenant une protéine support liée à un oligosaccharide ou polysaccharide hybride qui ne comprend pas d'hexose à l'extrémité réductrice de leur premier motif répétitif.
2 - ARRIERE-PLAN
La glycosylation est un processus grâce auquel les molécules d'hydrates de carbone ou les sucres (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, ou polysaccharides) se fixent sur les chaînes latérales de différents résidus d'acides aminés dans une protéine ou un polypeptide pour produire une glycoprotéine.
La glycosylation des protéines liée en N (N- glycosylation) - le type le plus courant de modification post-traductionnelle se produisant dans le réticulum endoplasmique des eucaryotes - est l'addition des molécules d'hydrate de carbone à un résidu d'asparagine dans la chaîne polypeptidique d'une protéine cible. Le processus s'effectue grâce au complexe enzymatique oligosaccharyltransférase (OST) responsable du transfert d'un oligosaccharide préassemblé à partir d'un support lipidique (dolichol phosphate) sur un résidu d'asparagine d'une protéine naissante à l'intérieur de la séquence conservée Asn-X-Ser/Thr (où X est un acide aminé quelconque à l'exception de la proline) dans le réticulum endoplasmique. La chaîne saccharide est alors soumise à d'autres modifications dans l'appareil de Golqi. Par nature, la qlycosylation liée en N se produit chez les eucaryotes et les archées, mais rarement chez les bactéries.
La glycosylation liée en 0 est une forme de glycosylation qui se produit chez les eucaryotes, les archées, et les bactéries. Elle consiste en la fixation d'une molécule de sucre sur un atome d'oxygène dans un résidu d'acide aminé dans la cible protéique. L'utilisation de cellules hôtes pour produire des bioconjugués comprenant des protéines supports liées (par exemple liées en N) à des molécules d'hydrates de carbone ou de sucres est connue de l'état de l'art. Cependant, en dépit des avancées dans la production des bioconjugués en utilisant des cellules hôtes procaryotes, il subsiste un besoin en matière de méthodes améliorées de production de bioconjugués dans des cellules hôtes.
3 - RESUME DE L'INVENTION
Il est bien connu de l'état de l'art que les oligosaccharyltransférases provenant de C. jejuni (PglB) ont une faible affinité envers les glycanes (oligosaccharides ou polysaccharides) comprenant un hexose monosaccharide au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif (Proc Natl Acad Sei USA. 2006 May 2 ; 103(18) : 7088-93) . Par conséquent, l'utilisation de systèmes de cellules hôtes pour produire des bioconjugués a été typiquement limitée jusqu'à présent à la production de bioconjugués constitués de protéines supports liées à des oligosaccharides ou polysaccharides qui ne comprennent pas de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif. Cependant, puisque de nombreux antigènes bactériens d'oligosaccharide/polysaccharide contiennent des monosaccharides hexoses (par exemple glucose) au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif, les systèmes de cellules hôtes pour la production de bioconjugués connus de l'état de l'art sont insuffisants pour produire des bioconjugués comprenant ces antigènes d'oligosaccharide/ polysaccharide. L'inventeur de la présente demande a identifié de nouvelles approches pour modifier une cellule hôte afin de rendre les cellules hôtes capables de produire des oligosaccharides ou polysaccharides hybrides qui sont dérivés d'oligosaccharides ou de polysaccharides donneurs. Les oligosaccharides ou polysaccharides donneurs sont des oligosaccharides ou polysaccharides qui comprennent des monosaccharides hexoses (par exemple glucose) au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif, alors que les oligosaccharides ou polysaccharides hybrides ne comprennent pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif, mais comprennent à la place un dérivé de monosaccharide hexose. Ces dérivés de monosaccharide hexose sont des substrats adéquats pour PglB, et peuvent donc être liés à une protéine support au sein de cellules hôtes approprié de manière à produire un bioconjugué utile par exemple dans le traitement de maladies/d'infections bactériennes et/ou pour la vaccination contre les maladies /infections bactériennes. De manière capitale, l'inventeur de la présente demande a fait la découverte étonnante que la translocation et la polymérisation des oligosaccharides et polysaccharides hybrides décrits ici peuvent être réalisées dans des cellules hôtes comprenant un mécanisme de glycosylation hétérologue (par exemple flippases, polymérases) , à cause de la spécificité relâchée des enzymes polymérase (wzy) et flippase (wzx) . Conjointement, les découvertes décrites dans le présent document permettent la génération de cellules hôtes modifiées capables de produire à de hauts rendements des bioconjugués qui ne pouvaient être produits à de hauts rendements avant les découvertes de 1'invention. L'invention est résumée par les modes de réalisation présentés ci-dessous.
Mode de réalisation 1 : une cellule hôte procaryote, comprenant : a) des acides nucléiques qui codent des glycosyltransférases qui produisent un motif répétitif oligosaccharide ou polysaccharide, ledit motif répétitif ne comprenant pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice et ledit motif répétitif oligosaccharide ou polysaccharide étant dérivé d'un motif répétitif oligosaccharide ou polysaccharide donneur qui comprend un hexose au niveau de l'extrémité réductrice ; b) un acide nucléique qui code une protéine support comprenant une séquence consensus de N-glycosylation ; et c) un acide nucléique qui code une oligosaccharyl transférase.
Mode de réalisation 2 : une cellule hôte procaryote, comprenant : a) des acides nucléiques qui codent des glycosyltransférases qui produisent un motif répétitif oligosaccharide ou polysaccharide, ledit motif répétitif ne comprenant pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice et ledit motif répétitif oligosaccharide ou polysaccharide étant dérivé d'un motif répétitif oligosaccharide ou polysaccharide donneur qui comprend un hexose au niveau de l'extrémité réductrice ; b) un acide nucléique qui code une protéine support comprenant une séquence consensus de N-glycosylation ; c) un acide nucléique qui code une oligosaccharyl transférase ; et d) un acide nucléique qui code une polymérase (wzy) , la polymérase catalysant la production d'un oligosaccharide ou polysaccharide hybride, où l'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride (i) comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif et (ii) comprend des monosaccharides hexoses au niveau de l'extrémité réductrice de tous les autres motifs répétitifs.
Mode de réalisation 3 : La cellule hôte du mode de réalisation 1 ou 2, ladite cellule hôte comprenant des glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse du motif répétitif oligosaccharide ou polysaccharide donneur.
Mode de réalisation 4 : La cellule hôte du mode de réalisation 3, lesdites glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des motifs répétitifs de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur étant présentes dans la cellule hôte sous forme de cluster d'opéron ou de gène ou d'une partie de celui-ci.
Mode de réalisation 5 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-4, ladite cellule hôte étant capable de produire un oligosaccharide ou polysaccharide hybride, où ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identique à l'oligosaccharide ou au polysaccharide donneur, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif à la place du monosaccharide hexose normalement présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur.
Mode de réalisation 6 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-4, ladite cellule hôte étant capable de produire un oligosaccharide ou polysaccharide hybride, où ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identique à l'oligosaccharide ou au polysaccharide donneur, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif en plus de comprendre la totalité des monosaccharides de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur.
Mode de réalisation 7 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-4, ladite cellule hôte comprenant (i) une glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur un undécaprényl pyrophosphate (UND-PP) et (ii) une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé de monosaccharide hexose assemblé sur UND-PP.
Mode de réalisation 8 : La cellule hôte du mode de réalisation 7, ledit dérivé de monosaccharide hexose étant un monosaccharide quelconque dont la position C-2 est modifiée par un groupe acétamido comme la N-acétylglucosamine (GlcNAc), la N-acétylgalactose-amine (GalNAc), le 2,4-diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose (DATDH), la N-acétylfucose-amine (FucNAc), la N-acétylquinovosamine (QuiNAc) ; ou la cellule hôte du mode de réalisation 7, ledit dérivé de monosaccharide hexose étant la N-acétylglucosamine (GlcNAc).
Mode de réalisation 9 : La cellule hôte du mode de réalisation 7 ou 8, ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur UND-PP étant hétérologue de la cellule hôte et/ou hétérologue des gènes qui catalysent le motif répétitif de l'oligosaccharide donneur.
Mode de réalisation 10 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 7-9, ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur UND-PP provenant de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
Mode de réalisation 11 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 7-10, ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur UND-PP étant wecA.
Mode de réalisation 12 : La cellule hôte du mode de réalisation 11, ladite wecA provenant de E. coli.
Mode de réalisation 13 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 7-12, ledit monosaccharide hexose étant le galactose (Gai).
Mode de réalisation 14 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 7-13, ladite une ou lesdites plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé de monosaccharide hexose étant la galactosyltransférase (wfeD) provenant de Shigella boyedii.
Mode de réalisation 15 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 7-13, ladite une ou lesdites plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé de monosaccharide hexose étant la galactofuranosyltransférase (WbeY) provenant de E. coli 028.
Mode de réalisation 16 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 7-13, ladite une ou lesdites plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé de monosaccharide hexose étant la galactofuranosyltransferase (WfdK) provenant de E. coli 0167.
Mode de réalisation 17 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 7-13, ladite une ou lesdites plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé de monosaccharide hexose étant la galactofuranosyltransférase (WbeY) provenant de E. coli 028 et la galactofuranosyltransférase (WfdK) provenant de E. coli 0167.
Mode de réalisation 18 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 3, 4, ou 6-17, lesdites glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse de motifs répétitifs de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur comprenant la WchL (N-acétylglucosamine-transférase) et la WchM (galactosyltransférase) provenant de S. pneumoniae CP14.
Mode de réalisation 19 : La cellule hôte du mode de réalisation 18, ladite cellule hôte étant capable de produire un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride, où ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identique à S. pneumoniae CP14, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif à la place du monosaccharide hexose normalement présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de S. pneumoniae CP14.
Mode de réalisation 20 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 3, 4, ou 6-17, lesdites glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse de motifs répétitifs de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur comprenant Weiß, WciC, WeiD, WeiE, et WeiF provenant de S. pneumoniae CP33F.
Mode de réalisation 21 : La cellule hôte du mode de réalisation 20, ladite cellule hôte étant capable de produire un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride, où ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identique à S. pneumoniae CP33F, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif à la place du monosaccharide hexose normalement présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de S. pneumoniae CP33F.
Mode de réalisation 22 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-4, ladite cellule hôte comprenant (i) une glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur un undécaprényl pyrophosphate (UND-PP) et (ii) des glycosyltransférases qui assemblent le motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sur le dérivé de monosaccharide hexose.
Mode de réalisation 23 : La cellule hôte du mode de réalisation 22, ledit dérivé de monosaccharide hexose étant la N-acétylglucosamine (GlcNAc) ; ledit dérivé de monosaccharide hexose étant en variante tout monosaccharide qui est modifié en position C-2 par un groupe acétamido comme la N-acétylglucosamine (GlcNAc), la N-acétylgalactoseamine (GalNAc), le 2,4-Diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose (DATDH), la N-acétylfucose-amine (FucNAc), la N-acétylquinovosamine (QuiNAc).
Mode de réalisation 24 : La cellule hôte du mode de réalisation 22 ou 23, ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur UND-PP étant hétérologue de la cellule hôte.
Mode de réalisation 25 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 22-24, ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur UND-PP provenant de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
Mode de réalisation 26 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 22-25, ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur UND-PP étant wecA.
Mode de réalisation 27 : La cellule hôte du mode de réalisation 26, ladite wecA provenant de E. coli.
Mode de réalisation 28 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 22-21, les glycosyltransférases qui assemblent le motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sur le dérivé de monosaccharide hexose comprenant une glycosyltransférase qui est capable d'ajouter le monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au dérivé de monosaccharide hexose relié à 1'undécaprényl phosphate.
Mode de réalisation 29 : La cellule hôte du mode de réalisation 28, ladite glycosyltransférase qui est capable d'ajouter ledit monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au monosaccharide relié à 1'undécaprényl phosphate est une glucosyltransférase telle que WciQ, WfaM, WfaP, WeiL, WelO, WffJ, WfgD, WbdN, WcmM.
Mode de réalisation 30 : La cellule hôte du mode de réalisation 29, ladite glucosyltransférase étant WciQ de E. coli 021, WfaM de E. coli 024, WfaP de E. coli 056, WeiL de E. coli 061, WelO de E. coli 0102, WffJ de E. coli 0130, WfgD de E. coli 0152, WbdN de E. coli 0157, et WcmM de E. coli 0173.
Mode de réalisation 31 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 28-30, les glycosyltransférases qui assemblent le motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sur le dérivé de monosaccharide hexose comprenant une glycosyltransférase qui est capable d'ajouter le monosaccharide qui est adjacent au monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur.
Mode de réalisation 32 : La cellule hôte du mode de réalisation 31, ladite glycosyltransférase qui est capable d'ajouter le monosaccharide qui est adjacent au monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur étant une glucosyltransférase (telle que WciP ou wciQ) .
Mode de réalisation 33 : La cellule hôte du mode de réalisation 32, la glucosyltransférase étant wciQ de E. coli 021 ou la galactosyltransférase WciQ de E. coli 021.
Mode de réalisation 34 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 32-33, ladite cellule hôte comprenant en outre une enzyme capable de modifier un monosaccharide.
Mode de réalisation 35 : La cellule hôte du mode de réalisation 34, 1'enzyme étant une épimérase ou une racémase.
Mode de réalisation 36 : La cellule hôte du mode de réalisation 35, ladite épimerase provenant de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce
Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce
Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce
Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
Mode de réalisation 37 : La cellule hôte du mode de réalisation 36, ladite épimérase provenant de E. coli.
Mode de réalisation 38 : La cellule hôte du mode de réalisation 37, ladite épimérase étant Z3206 de E. coli 0157.
Mode de réalisation 39 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 22-38, lesdites qlycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des motifs répétitifs de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur comprenant wchL et wchM de S. pneumoniae CP14.
Mode de réalisation 40 : La cellule hôte du mode de réalisation 39, ladite cellule hôte étant capable de produire un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride, où ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identique à S. pneumoniae CP14, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif en plus de comprendre tous les résidus de monosaccharide de S. pneumoniae CP14.
Mode de réalisation 41 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-40, ledit monosaccharide non-hexose ou ledit dérivé de monosaccharide hexose étant un monosaccharide comprenant un groupe acétamido en position 2.
Mode de réalisation 42 : La cellule hôte du mode de réalisation 41, ledit monosaccharide non-hexose ou ledit dérivé de monosaccharide hexose étant GlcNAc, HexNAc, désoxy HexNAc, FucNAc, GalNAc, QuiNAc, ManNAc, ou 2,4-diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose.
Mode de réalisation 43 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-42, ladite cellule hôte comprenant un acide nucléique qui code une polymérase de polysaccharide capsulaire {wzy) ou une polymérase d'antigène O ( wzy) .
Mode de réalisation 44 : La cellule hôte du mode de réalisation 43, ladite polymérase étant hétérologue de la cellule hôte et/ou ladite polymérase étant hétérologue du cluster de gène codant les enzymes pour la synthèse du motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur.
Mode de réalisation 45 : La cellule hôte du mode de réalisation 43-44, ladite polymérase provenant de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
Mode de réalisation 46 : La cellule hôte du mode de réalisation 45, ladite polymérase provenant de Streptococcus pneumoniae.
Mode de réalisation 47 : La cellule hôte du mode de réalisation 46, ladite polymérase provenant de S. pneumoniae CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6 (A et B), CP7 (A,B, C), CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A, B, C, F) , CPU (A, B,C,D,F), CP12(A,B,F), CP13, CP14 CP15(A,B,C,F) , CP16(A,F), CP17(A,F), CPI 8(A,B,C,F) , CPI 9 (A, B, C, F) , CP2 0, CP21, CP22 (A, F) , CP23(A,B,F), CP24(A,B,F), CP25(A,F) , CP2 6, CP27,CP28(A,F) , CP29, CP31, CP32(A,F) , CP33(A,B,C,D,F) , CP34, CP35(A,B,C,D,F) , CP36, CP37, CP38, CP3 9, CP4 0, CP41(A,F) , CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47(A,F) , ou CP4 8.
Mode de réalisation 48 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-47, ladite cellule hôte comprenant un acide nucléique qui code une flippase (wzx).
Mode de réalisation 49 : Cellule hôte du mode de réalisation 48, ladite flippase étant hétérologue de la cellule hôte et/ou ladite flippase étant hétérologue au cluster de gène codant les enzymes pour la synthèse du motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur.
Mode de réalisation 50 : La cellule hôte du mode de réalisation 48-49, ladite flippase provenant de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce
Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce
Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce
Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
Mode de réalisation 51 : La cellule hôte du mode de réalisation 50, ladite flippase provenant de Streptococcus pneumoniae.
Mode de réalisation 52 : La cellule hôte du mode de réalisation 51, ladite flippase provenant de S. pneumoniae CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6 (A et B), CP7 (A,B, C) , CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A, B, C, F) , CPU (A, B,C,D,F), CP12(A,B,F), CP13, CP14 CP15(A,B,C,F) , CP16(A,F), CP17(A,F), CPI 8(A,B,C,F) , CP19 (A, B, C, F) , CP2 0, CP21, CP22 (A, F) , CP23(A,B,F), CP24(A,B,F), CP25(A,F) , CP2 6, CP27,CP28(A,F) , CP29, CP31, CP32(A,F) , CP33(A,B,C,D,F), CP34, CP35(A,B,C,D,F), CP36, CP37, CP38, CP39, CP4 0, CP41(A,F) , CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47(A,F), ou CP4 8.
Mode de réalisation 53 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-52, ledit oligosaccharide ou polysaccharide provenant de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce
Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce
Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce
Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce
Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
Mode de réalisation 54 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-53, ledit polysaccharide étant un polysaccharide capsulaire (CP).
Mode de réalisation 55 : La cellule hôte du mode de réalisation 54, ledit polysaccharide capsulaire provenant de Streptococcus pneumoniae.
Mode de réalisation 56 : La cellule hôte du mode de réalisation 45, ledit polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae étant CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6 (A, B), CP7 (A, B, C) , CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A, B, C, F), CPU (A, B, C, D, F), CP12 (A, B, F), CP13, CP14, CP15 (A, B, C, F), CP16 (A, F), CP 17 (A, F), CP18 (A, B, C, F), CP19 (A, B, C, F), CP2 0, CP21, CP22 (A, F), CP23 (A, B, F), CP24 (A, B, F), CP25 (A, F), CP 26, CP2 7, CP28 (A, F), CP29, CP31, CP32 (A, F), CP33 (A, B, C, D, F), CP34, CP35 (A, B, C, D, F), CP36, CP37, CP 3 8, CP39, CP4 0, CP41 (A, F), CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47 (A, F) , ou CP48.
Mode de réalisation 57 : La cellule hôte du mode de réalisation 56, ledit polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae étant CP8, CP15A, CPI 6F, CP22F, CP23A, CP24F, CP31, CP33F, CP35B, ou CP38.
Mode de réalisation 58 : La cellule hôte du mode de réalisation 56, ledit polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae étant CP14.
Mode de réalisation 59 : La cellule hôte du mode de réalisation 56, ledit polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae étant CP33F.
Mode de réalisation 60 : La cellule hôte du mode de réalisation 54, ledit polysaccharide capsulaire provenant de
Staphylococcus aureus.
Mode de réalisation 61 : La cellule hôte du mode de réalisation 60, ledit polysaccharide capsulaire de S. aureus étant CP5 ou CP8
Mode de réalisation 62 : La cellule hôte du mode de réalisation 54, ledit polysaccharide capsulaire provenant de
Streptococcus agalactiae (GBS).
Mode de réalisation 63 : La cellule hôte du mode de réalisation 62, ledit polysaccharide capsulaire de
Streptococcus agalactiae étant S. agalactiae (groupe B, GBS) CPIa, CPIb, CPU, CPIII, CPIV, CPV, CPVI, CPVII, ou CPVIII .
Mode de réalisation 64 : La cellule hôte du mode de réalisation 54, ledit polysaccharide capsulaire provenant de Enterococcus faecalis.
Mode de réalisation 65 : La cellule hôte du mode de réalisation 64, ledit polysaccharide capsulaire de Enterococcus faecalis étant CPA, CPB, CPC, ou CPD.
Mode de réalisation 66 : La cellule hôte du mode de réalisation 1-65, au moins une desdites glycosyltransférases qui produisent un oligosaccharide ou un polysaccharide qui ne comprennent pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif étant hétérologue de la cellule hôte.
Mode de réalisation 67 : La cellule hôte du mode de réalisation 1-66, ladite protéine support étant hétérologue de la cellule hôte.
Mode de réalisation 68 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-67, ladite oligosaccharyl transférase étant hétérologue de la cellule hôte.
Mode de réalisation 69 : La cellule hôte du mode de réalisation 1-65, au moins une desdites glycosyltransférases qui produisent un oligosaccharide ou un polysaccharide qui ne comprennent pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif, ladite oligosaccharyltransférase, et ladite protéine support étant hétérologue de la cellule hôte.
Mode de réalisation 70 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-69, ladite oligosaccharyl transférase provenant de Campylobacter jejuni.
Mode de réalisation 71 : La cellule hôte du mode de réalisation 70, ladite oligosaccharyl transférase étant le gène pglB de C. jejuni.
Mode de réalisation 72 : La cellule hôte du mode de réalisation 71, ledit gène pglB de C. jejuni étant intégré dans le génome de la cellule hôte.
Mode de réalisation 73 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-72, ladite oligosaccharyl transférase étant dérivée d'un organisme eucaryote ou d'un organisme d'archées.
Mode de réalisation 74 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 3-73, lesdites glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse du motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur étant intégrées au génome de la cellule hôte.
Mode de réalisation 75 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-74, ladite protéine support étant l'exotoxine A détoxifiée de P. aeruginosa (EPA), CRM197, la protéine de liaison au maltose (MBP), le toxoïde de la diphtérie, le toxoïde du tétanos, 1'hémolysine A détoxifiée de S. aureus, le facteur de coagulation A, le facteur de coagulation B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, l'entérotoxine thermolabile de E. coli, des variants détoxifiés de l'entérotoxine thermolabile de E. coli, la toxine du choléra sous-unité B (CTB), la toxine du choléra, des variants détoxifiés de la toxine du choléra, la protéine Sat de E. coli, le domaine passager de la protéine Sat de E. colir la protéine D de la triade polyhistidine de Streptococcus pneumoniae (PhtD), la pneumolysine de Streptococcus pneumoniae et ses variants détoxifiés (dPly), AcrA de C. jejuni, une glycoprotéine naturelle de C. jejuni, PcrV (aka LcrV,EspA, SseB), PopB (YopB, YopD, FliC) , ou OprF, Oprl.
Mode de réalisation 76 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-75, au moins un gène de la cellule hôte ayant une fonction inactivée ou supprimée.
Mode de réalisation 77 : La cellule hôte du mode de réalisation 7 6, le gène waaL de la cellule hôte ayant une fonction inactivée ou supprimée.
Mode de réalisation 78 : La cellule hôte du mode de réalisation 77, le gène waaL de la cellule hôte ayant été remplacé par un acide nucléique codant une oligosaccharyltransférase.
Mode de réalisation 79 : La cellule hôte du mode de réalisation 78, le gène waaL de la cellule hôte ayant été remplacé par pglB de C. jejuni.
Mode de réalisation 80 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-79, ladite cellule hôte étant E. coli.
Mode de réalisation 81 : La cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-80, à la suite de l'inclusion des glycosyltransférases qui produisent un oligosaccharide ou un polysaccharide ne comprenant pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif, ladite cellule hôte étant capable de produire un rendement plus élevé de bioconjugués comprenant la protéine support liée en N à l'oligosaccharide ou au polysaccharide qu'une cellule hôte du même phénotype mais qui comprend l'oligosaccharide ou le polysaccharide donneur.
Mode de réalisation 82 : La cellule hôte du mode de réalisation 81, ladite cellule hôte produisant au moins ou environ 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, ou 500% de bioconjugués en plus qu'une cellule hôte du même phénotype mais qui comprend l'oligosaccharide ou le polysaccharide donneur, lesdits bioconjugués comprenant la protéine support liée en N à l'oligosaccharide ou au polysaccharide.
Mode de réalisation 83 : La cellule hôte du mode de réalisation 81, ladite cellule hôte produisant au moins ou environ 5 fois, 10 fois, 20 fois, 30 fois, 40 fois, 50 fois, 60 fois, 70 fois, 80 fois, 90 fois, ou 100 fois plus de bioconjugués qu'une cellule hôte du même phénotype mais comprenant l'oligosaccharide ou le polysaccharide donneur, lesdits bioconjugués comprenant la protéine support liée en N à l'oligosaccharide ou au polysaccharide.
Mode de réalisation 84 : Une méthode de production d'un bioconjugué comprenant une protéine support liée en N à un oligosaccharide ou un polysaccharide ne comprenant pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif, ladite méthode comprenant (i) la culture de la cellule hôte selon l'un quelconque des modes de réalisation 1-83 dans des conditions appropriées pour la production des protéines et (ii) l'isolation dudit bioconjugué.
Mode de réalisation 85 : Un bioconjugué produit par la méthode du mode de réalisation 84.
Mode de réalisation 86 : Le bioconjugué du mode de réalisation 85, comprenant une protéine support liée à un polysaccharide capsulaire (CP) .
Mode de réalisation 87 : Le bioconjugué du mode de réalisation 86, ledit polysaccharide capsulaire provenant de Streptococcus pneumoniae.
Mode de réalisation 88 : Le bioconjugué du mode de réalisation 87, ledit polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae étant CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6 (A, B), CP7 (A, B, C) , CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A, B, C, F), CPU (A, B, C, D, F), CP12 (A, B, F), CP13, CP14, CP15 (A, B, C, F), CP16 (A, F), CP17 (A, F), CPI 8 (A, B, C, F), CP19 (A, B, C, F), CP2 0, CP21, CP22 (A, F), CP23 (A, B, F), CP24 (A, B, F), CP25 (A, F), CP 26, CP2 7, CP28 (A, F), CP29, CP31, CP32 (A, F), CP33 (A, B, C, D, F), CP34, CP35 (A, B, C, D, F), CP36, CP37, CP3 8, CP3 9, CP4 0, CP41 (A, F), CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47 (A, F), ou CP48.
Mode de réalisation 89 : Le bioconjugué du mode de réalisation 88, ledit polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae étant CP8, CP15A, CPI6F, CP22F, CP23A, CP24F, CP31, CP33F, CP35B, ou CP38.
Mode de réalisation 90 : Le bioconjugué du mode de réalisation 88, ledit polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae étant CP14.
Mode de réalisation 91 : Le bioconjugué du mode de réalisation 88, ledit polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae étant CP33F.
Mode de réalisation 92 : Le bioconjugué du mode de réalisation 86, ledit polysaccharide capsulaire provenant de
Staphylococcus aureus.
Mode de réalisation 93 : Le bioconjugué du mode de réalisation 92, ledit polysaccharide capsulaire de S. aureus étant CP5 ou CP8
Mode de réalisation 94 : Le bioconjugué du mode de réalisation 86, ledit polysaccharide capsulaire provenant de
Streptococcus agalactiae (GBS).
Mode de réalisation 95 : Le bioconjugué du mode de réalisation 94, ledit polysaccharide capsulaire de
Streptococcus agalactiae étant S. agalactiae (groupe B, GBS) CPIa, CPIb, CPU, CPIII, CPIV, CPV, CPVI, CPVII, ou CPVIII.
Mode de réalisation 96 : Le bioconjugué du mode de réalisation 86, ledit polysaccharide capsulaire provenant de
Enterococcus faecalis.
Mode de réalisation 97 : Le bioconjugué du mode de réalisation 96, ledit polysaccharide capsulaire de
Enterococcus faecalis étant CPA, CPB, CPC, ou CPD.
Mode de réalisation 98 : Une composition comprenant le bioconjugué selon l'un quelconque des modes de réalisation 85-97.
Mode de réalisation 99 : Une méthode pour le traitement ou la prévention d'une infection bactérienne chez un sujet, comprenant l'administration de la composition du mode de réalisation 98 au sujet.
Mode de réalisation 100 : Une méthode pour induire une réponse immunitaire contre une souche bactérienne chez un sujet, comprenant l'administration d'une composition du mode de réalisation 98 à un sujet.
Mode de réalisation 101 : La méthode du mode de réalisation 99 ou 100, le sujet étant un humain.
Mode de réalisation 102 : Une méthode pour synthétiser un oligosaccharide ou un polysaccharide de structure
dans laquelle A est un motif répétitif d'oligosaccharide avec un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice (indiquée par une flèche) ; dans laquelle B est un motif répétitif d'oligosaccharide ; dans laquelle A et B sont des motifs répétitifs d'oligosaccharide différents ; et dans laquelle n est au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou au moins 20 ; ladite méthode comprenant : l'incubation de A et B avec une polymérase de polysaccharide.
Mode de réalisation 103 : La méthode du mode de réalisation 102, ladite étape de mise en contact étant réalisée in vitro.
Mode de réalisation 104 : La méthode du mode de réalisation 102, ladite étape de mise en contact étant réalisée dans une cellule procaryote.
Mode de réalisation 105 : La méthode du mode de réalisation 102, ladite étape de mise en contact étant réalisée dans le périplasme d'une cellule procaryote.
Mode de réalisation 106 : La méthode du mode de réalisation 102, ladite polymérase de polysaccharide étant une polymérase de polysaccharide wzy.
Mode de réalisation 107 : La méthode du mode de réalisation 102, A ayant un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice (indiquée par une flèche) et B ayant un hexose au niveau de l'extrémité réductrice, et A et B étant sinon identique.
Mode de réalisation 108 : La méthode selon l'un quelconque des modes de réalisation 102 à 107, ledit monosaccharide non-hexose ou ledit dérivé de monosaccharide hexose étant GlcNAc, GalNAc, FucNAc, QuiNAc, ManNAc, HexNAc, désoxy HexNAc, ou 2,4-diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose.
Mode de réalisation 109 : La méthode du mode de réalisation 102, A ayant la même structure que B à la différence que A possède un monosaccharide supplémentaire au niveau de l'extrémité réductrice.
Mode de réalisation 110 : La méthode du mode de réalisation 109, le monosaccharide supplémentaire étant un dérivé de monosaccharide hexose.
Mode de réalisation 111 : La méthode selon l'un quelconque des modes de réalisation 109 à 110, le monosaccharide supplémentaire étant GlcNAc, HexNAc, désoxy HexNAc, ou 2,4-diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose.
Mode de réalisation 112 : La méthode selon l'un quelconque des modes de réalisation 102 à 111, ladite polymérase provenant de l'espèce Escherichia, de l'espèce
Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce
Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce
Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce
Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce
Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
Mode de réalisation 113 : La méthode selon l'un
quelconque des modes de réalisation 102 à 111, ledit motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur étant un motif répétitif du polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6 (A, B), CP7 (A, B, C), CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A, B, C, F), CPU (A, B, C, D, F), CP12 (A, B, F), CP13, CP14, CP15 (A, B, C, F), CP16 (A, F), CP17 (A, F), CP18 (A, B, C, F), CP19 (A, B, C, F), CP20, CP21, CP22 (A, F), CP2 3 (A, B, F), CP24 (A, B, F), CP25 (A, F), CP 26, CP27, CP2 8 (A, F), CP29, CP31, CP32 (A, F), CP33 (A, B, C, D, F), CP34, CP35 (A, B, C, D, F), CP36, CP37, CP38, CP39, CP4 0, CP41 (A, F), CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47 (A, F), ou CP4 8.
Mode de réalisation 114 : Une composition pharmaceutique comprenant un oligosaccharide ou un polysaccharide synthétisé par la méthode selon l'un quelconque des modes de réalisation 102 à 111.
Mode de réalisation 115 : Un bioconjugué comprenant une protéine support liée en N à un oligosaccharide ou polysaccharide hybride, ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride étant identique à un oligosaccharide ou polysaccharide donneur, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif en plus de comprendre tous les monosaccharides de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur.
Mode de réalisation 116 : Le bioconjugué du mode de réalisation 115, le dérivé de monosaccharide hexose étant tout monosaccharide dans lequel la position C-2 est modifiée par un groupe acétamido comme la N-acétylglucosamine (GlcNAc), la N-acétylgalactose-amine (GalNAc), le 2,4-Diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose (DATDH), la N-acétylfucoseamine (FucNAc), ou la N-acétylquinovosamine (QuiNAc).
Mode de réalisation 117 : Le bioconjugué du mode de réalisation 116, le dérivé de monosaccharide hexose étant la N-acétylglucosamine (GlcNAc).
Mode de réalisation 118 : Le bioconjugué du mode de réalisation 115 ou 116 ou 117, l'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride étant identique à un saccharide capsulaire bactérien Gram positif, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif à la place du monosaccharide hexose normalement présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif dudit saccharide capsulaire bactérien Gram positif.
Mode de réalisation 119 : Le bioconjugué du mode de réalisation 118, le saccharide capsulaire bactérien Gram positif étant un saccharide capsulaire de Streptococcus du groupe A, un saccharide capsulaire de Streptococcus du groupe B, un saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae, un saccharide capsulaire d'Enterococcus ou un saccharide capsulaire de Staphylococcus aureus.
Mode de réalisation 120 : Le bioconjugué du mode de réalisation 119, le saccharide capsulaire bactérien Gram positif étant un saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7A, 7B, IC, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10A, 10B, IOC, 10F, 11A, 11B, 11C, HD, 11F, 12A, 12B, 12F, 13, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 16A, 16F, 17A, 17F, 18A, 18B, 18C, 18F, 19A, 19B, 19C, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24A, 24B, 24F, 25A, 25F, 26, 27, 28A, 28F, 29, 31, 32A, 32 F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33F, 34, 35A, 35B, 35C, 35D, 35F, 36, 37, 38, 39, 40, 41A, 41F, 42, 43, 44, 45, 46, 47A, 47F ou 48.
Mode de réalisation 121 : Le bioconjugué du mode de réalisation 120, le saccharide capsulaire bactérien Gram positif étant un saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 8, 14, 15A, 16F, 22F, 23A, 24F, 31, 33F, 35B ou 38.
Mode de réalisation 122 : Le bioconjugué du mode de réalisation 118, le saccharide capsulaire bactérien Gram positif étant un saccharide capsulaire de S. aureus de sérotype 5 ou 8.
Mode de réalisation 123 : Le bioconjugué du mode de réalisation 118, le saccharide capsulaire bactérien Gram positif étant un saccharide capsulaire de Streptococcus agalactiae (Streptococcus du groupe B) de sérotype Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII ou VIII.
Mode de réalisation 124 : Le bioconjugué du mode de réalisation 118, le saccharide capsulaire bactérien Gram positif étant un saccharide capsulaire de Enterococcus faecalis de sérotype A, B, C ou D.
Mode de réalisation 125 : Le bioconjugué selon l'un quelconque des modes de réalisation 115-124, la protéine support étant une exotoxine A détoxifiée de P. aeruginosa (EPA), CRM197, une protéine de liaison au maltose (MBP), le toxoïde de la diphtérie, le toxoïde du tétanos, une hémolysine A détoxifiée de S. aureus, un facteur de coagulation A, un facteur de coagulation B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, l'entérotoxine thermolabile de E. coli, des variants
détoxifiés de l'entérotoxine thermolabile de E. coli, la toxine du choléra sous-unité B (CTB), la toxine du choléra, des variants détoxifiés de la toxine du choléra, la protéine Sat de E. coli, le domaine passager de la protéine Sat de E. coli, , la pneumolysine de Streptococcus pneumoniae et ses variants détoxifiés, AcrA de C. jejuni, une glycoprotéine naturelle de C. jejuni, PcrV (aka LcrV,EspA, SseB), PopB (YopB, YopD, FliC), ou OprF, Oprl.
Mode de réalisation 126 : Un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride ayant une structure
dans laquelle A est un motif répétitif d'oligosaccharide comprenant au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 monosaccharides, avec un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice (indiquée par une flèche) ; dans laquelle B est un motif répétitif d'oligosaccharide comprenant au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 monosaccharides, dans laquelle A et B sont des motifs répétitifs d'oligosaccharide différents ; et dans laquelle n est au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou au moins 20 ;
Mode de réalisation 127 : L'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride du mode de réalisation 126, le motif répétitif d'oligosaccharide B contenant un monosaccharide d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice du motif répétitif.
Mode de réalisation 128 : L'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride du mode de réalisation 127 le monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du motif répétitif étant choisi dans le groupe constitué par le glucose, galactose, rhamnose, arabinotol, fucose et mannose.
Mode de réalisation 129 : L'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride selon l'un quelconque des modes de réalisation 126-128, le motif répétitif d'oligosaccharide de A et le motif répétitif d'oligosaccharide de B différant seulement en ce qu'ils contiennent un monosaccharide différent au niveau de l'extrémité réductrice du motif répétitif.
Mode de réalisation 130 : L'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride selon l'un quelconque des modes de réalisation 126-129, le motif répétitif d'oligosaccharide de A étant le motif répétitif du saccharide capsulaire d'un saccharide capsulaire bactérien Gram positif, par exemple un saccharide capsulaire de Streptococcus du groupe A, un saccharide capsulaire de Streptococcus du groupe B, un saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae, un saccharide capsulaire d'Enterococcus ou un saccharide capsulaire de Staphylococcus aureus.
Mode de réalisation 131 : L'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride selon l'un quelconque des modes de réalisation 126-130, le motif répétitif d'oligosaccharide de A étant le motif répétitif du saccharide capsulaire d'un saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10A, 10B, IOC, 10F, 11A, 11B, 11C, HD, 11F, 12A, 12B, 12F, 13, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 16A, 16F, 17A, 17F, 18A, 18B, 18C, 18F, 19A, 19B, 19C, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24A, 24B, 24F, 25A, 25F, 26, 27, 28A, 28F, 29, 31, 32A, 32F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33F, 34, 35A, 35B, 35C, 35D, 35F, 36, 37, 38, 39, 40, 41A, 41F, 42, 43, 44, 45, 46, 47A, 47F ou 48.
Mode de réalisation 132 : Un bioconjugué comprenant une protéine support liée à l'oligosaccharide ou au polysaccharide hybride selon l'un quelconque des modes de réalisation 126-131. 3.1 Terminologie OPS : polysaccharide 0 ; l'antigène 0 de la bactérie Gram-négative. OPS est aussi appelé dans le présent document antigène 0. CP : polysaccharide capsulaire LPS : lipopolysaccharide. waaL : le gène de l'antigène 0 ligase codant une enzyme liée à la membrane par un site actif localisé dans le périplasme. L'enzyme codée transfère l'antigène 0 lié à 1'undécaprénylphosphate (UPP) au cœur du lipide A, formant le lipopolysaccharide. RU : motif répétitif. Tel qu'il est utilisé ici, RU est considéré comme étant égal au motif répétitif biologique, BRU. Le BRU désigne le RU d'un antigène 0 tel qu'il a été synthétisé in vivo.
Und-PP : undécaprényl pyrophosphate. LLO : oligosaccharide lié au lipide.
Tel qu'utilisé ici, le terme "bioconjugué" désigne le conjugué entre une protéine (par exemple une protéine support) et un antigène (par exemple un oligosaccharide ou polysaccharide) préparé au seint de la cellule hôte, le mécanisme de la cellule hôte lie l'antigène à la protéine (par exemple lie en N).
Le terme "environ," quand il est utilisé en combinaison avec un numéro désigne tout numéro situé entre ±1, ±5, ou ±10% du numéro référencé.
Tel qu'utilisé ici, le terme "quantité efficace" dans le contexte de l'administration d'une thérapie (par exemple une composition décrite dans la présente demande) à un sujet désigne la quantité d'une thérapie qui possède un ou des effets prophylactiques et/ou thérapeutiques. Dans certains modes de réalisation, une "quantité efficace" désigne la quantité d'une thérapie qui est suffisante pour obtenir un, deux, trois, quatre des effets suivants ou plus : (i) réduire ou améliorer la gravité d'une infection bactérienne ou des symptômes qui lui sont associés ; (ii) réduire la durée d'une infection bactérienne ou des symptômes qui lui sont associés ; (iii) éviter la progression d'une infection bactérienne ou des symptômes qui lui sont associés ; (iv) provoquer la régression d'une infection bactérienne ou des symptômes qui lui sont associés ; (v) éviter le développement ou la survenue d'une infection bactérienne, ou des symptômes qui lui sont associés ; (vi) éviter la récurrence d'une infection bactérienne ou des symptômes qui lui sont associés ; (vii) réduire le dysfonctionnement des organes associé à une infection bactérienne ; (viii) réduire l'hospitalisation d'un sujet atteint d'une infection bactérienne ; (ix) réduire le temps d'hospitalisation d'un sujet atteint d'une infection bactérienne ; (x) augmenter la survie d'un sujet atteint d'une infection bactérienne ; (xi) éliminer une infection bactérienne chez un sujet ; (xii) inhiber ou réduire une réplication bactérienne chez un sujet ; et/ou (xiii) renforcer ou améliorer le ou les effets prophylactiques ou thérapeutiques d'une autre thérapie.
Tel qu'utilisé ici, le terme "en combinaison," dans le contexte de l'administration de deux thérapies ou plus chez un sujet, désigne l'utilisation de plus d'une thérapie. L'utilisation du terme "en combinaison" ne limite pas l'ordre dans lequel les thérapies sont administrées à un sujet. Par exemple, une première thérapie (par exemple une composition décrite dans le présent document) peut être administrée avant (par exemple 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 heure, 2 heures, 4 heures, 6 heures, 12 heures, 16 heures, 24 heures, 48 heures, 72 heures, 96 heures, 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines, 4 semaines, 5 semaines, 6 semaines, 8 semaines, ou 12 semaines avant), concomitamment avec, ou après (par exemple 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 heure, 2 heures, 4 heures, 6 heures, 12 heures, 16 heures, 24 heures, 48 heures, 72 heures, 96 heures, 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines, 4 semaines, 5 semaines, 6 semaines, 8 semaines, ou 12 semaines après) l'administration d'une deuxième thérapie à un sujet.
Tel qu'utilisé ici, le terme "sujet" désigne un animal (par exemple oiseaux, reptiles, et mammifères) . Dans un autre mode de réalisation, un sujet est un mammifère, y compris un non primate (par exemple un chameau, un âne, un zèbre, une vache, un cochon, un cheval, une chèvre, un mouton, un chat, un chien, un rat, et une souris) et un primate (par exemple un singe, un chimpanzé, et un humain). Dans certains modes de réalisation, un sujet est un animal non humain. Dans certains modes de réalisation, un sujet est un animal de la ferme ou un animal domestique (par exemple un chien, un chat, un cheval, une chèvre, un mouton, un cochon, un âne ou une poule) . Dans un mode de réalisation spécifique, un sujet est un humain. Les termes "sujet," "individu," et "patient" peuvent être utilisés de manière synonyme dans le présent document.
Tel qu'utilisé ici, le terme "oligosaccharide ou polysaccharide donneur" désigne un oligosaccharide ou polysaccharide dont est dérivé un oligosaccharide ou polysaccharide. Les oligosaccharides et polysaccharides donneurs, tels qu'utilisés ici, comprennent un monosaccharide hexose (par exemple un glucose) au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif. L'utilisation du terme oligosaccharide ou polysaccharide donneur n'est pas destiné à suggérer qu'un oligosaccharide ou un polysaccharide est modifié in situ. Plutôt, l'utilisation du terme
Oligosaccharide ou polysaccharide donneur est destiné à signifier un oligosaccharide ou polysaccharide qui, à l'état de type sauvage, est un substrat faible pour l'activité d'oligosaccharyl transférase (par exemple PglB) ou n'est pas un substrat pour l'activité d'oligosaccharyl transférase (par exemple PglB). Les exemples d'oligosaccharides ou de polysaccharides donneurs comprennent ceux provenant de bactéries, y compris S. pneumoniae CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6 (A, B), CP7 (A, B, C) , CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A, B, C, F), CPU (A, B, C, D, F), CP12 (A, B, F), CP13, CP14, CP15 (A, B, C, F), CPI 6 (A, F), CP17 (A, F), CP18 (A, B, C, F), CP19 (A, B, C, F), CP2 0, CP21, CP22 (A, F), CP23 (A, B, F), CP24 (A, B, F), CP25 (A, F), CP 26, CP27, CP28 (A, F), CP29, CP31, CP32 (A, F), CP33 (A, B, C, D, F), CP34, CP35 (A, B, C, D, F), CP36, CP37, CP38, CP39, CP40, CP41 (A, F), CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47 (A, F), et CP48. L'homme du métier sera capable de déterminer facilement si un oligosaccharide ou un polysaccharide comprend un monosaccharide hexose (par exemple glucose) au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif et si un tel oligosaccharide ou polysaccharide est un oligosaccharide ou polysaccharide donneur, tel qu'il est englobé ici.
Tel qu'utilisé ici, le terme "dérivé de monosaccharide hexose" désigne un monosaccharide non-hexose qui peut être un substrat pour l'activité d'oligosaccharyl transférase. En général, le dérivé de monosaccharide hexose comprend un monosaccharide comprenant un groupe acétamido en position 2. Les exemples de dérivés de monosaccharide hexose comprennent GlcNAc, HexNAc, désoxy HexNAc, ou 2,4-diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose.
Tel qu'utilisé ici, le terme "oligosaccharide ou polysaccharide hybride" désigne un oligosaccharide ou polysaccharide manipulé génétiquement qui ne comprend pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif, mais comprend à la place un dérivé de monosaccharide hexose ou un monosaccharide non-hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif.
4 - BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La FIG. 1 reproduit la structure des motifs répétitifs du polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae (CP) 14 et CP33F.
La FIG. 2 est un schéma de l'organisation des gènes du cluster de type sauvage de S. pneumoniae CP14 et la fonction putative de chaque gène.
La FIG. 3 illustre une voie de synthèse par glycosylation pour la production d'un polymère modifié de S. pneumoniae CP14 qui peut être transféré efficacement par une oligosaccharyltransférase sur une protéine support. A : la voie de biosynthèse de type sauvage de S. pneumoniae CP14. B : la biosynthèse d'une sous-unité manipulée génétiquement de CP14 qui diffère au niveau du monosaccharide de l'extrémité réductrice par rapport à la sous-unité de type sauvage. C : polymérisation du polysaccharide de type sauvage CP14 et assemblage du polysaccharide de type sauvage sur une seule sous-unité manipulée génétiquement.
La FIG. 4 indique les composants appropriés à la production et la translocation d'une sous-unité manipulée génétiquement de S. pneumoniae CP14, ainsi que des données confirmant la production et la translocation. A : Schéma des glycosyltransférases essentielles pour la synthèse d'une sous-unité CP14 glyco-manipulée : la galactosyltransférase de Shigella boeydii wfeDr la GlcNAc transférase (wchL) de S. pneumoniae CP14, et la galactosyltransférase (wchM) de S. pneumoniae CP14. B : Schéma des glycosyltransférases qui peuvent synthétiser une sous-unité glyco-manipulée de CP14, identique à (A), mais avec l'addition du gène flippase {wzx) de S. pneumoniae CP14. C : coloration à l'argent du lipo- oligosaccharide après la digestion par la protéinase K de Sç[)874 de E. coli transformée avec un plasmide ("pGVX1190)" comprenant les gènes de (A) (bande 1) ou avec un plasmide ("pGVX1366") comprenant les gènes de (B) (bande 2). Les échantillons ont été résolus sur gel SDS-PAGE à 4-12% avant coloration à l'argent. Les résultats illustrés montrent que la flippase de polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae a une spécificité relâchée pour le glycane et peut déplacer une sous-unité manipulée génétiquement depuis le cytoplasme dans le périplasme. D : Structure de la sous-unité CP14 manipulée génétiquement. Les flèches indiquent les glycosyltransférases correspondantes.
La FIG. 5 montre les analyses d'une sous-unité CP14 manipulée génétiquement qui a été produite dans in E. coli. Les oligosaccharides liés à un lipide (LLO) ont été extraits et marqués par 2AB et soumis à une HPLC couplée à un détecteur de fluorescence. A : Le Chromatogramme HPLC des LLO à sous-unité manipulée génétiquement CP14 extraits de E. coli Sç[)874 (kwaaL) transformés avec le plasmide pGVX1366 ou son vecteur vide correspondant (les pics du vecteur vide sont indiqués). La flèche (à 57,6) indique le pic correspondant à la sous-unité CP14 manipulée génétiquement qui a été soumise à une spectroscopie de masse. B, analyse MS/MS du pic à 57,5 min. Des fragments d'ion ont correspondu à la structure de la sous-unité CP14 manipulée génétiquement.
La FIG. 6 montre que la sous-unité CP14 manipulée génétiquement est un substrat pour 1'oligosaccharyl transférase PglB de C. jejuni. L'analyse western blot a été réalisée sur des protéines extraites de E. coli Ξφ874 (ûwaaL) transformées avec un plasmide pour l'expression de PglB (pGVX970) et un plasmide pour l'expression de AcrA (pGVXl ; protéine support) et un plasmide pour la production de CP14 (pGVX1366) ou d'un vecteur vide (pGVX8). Après induction, les cellules ont été récoltées et les protéines ont été extraites du périplasme et enrichies par chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC) et éluée par un tampon Tris contenant de l'imidazole. A : des échantillons purifiés ont été soumis à SDS-PAGE (gel à 4-12%) et soumis à un électrotransfert sur une membrane de nitrocellulose développée par anti-His. Bande 1, AcrA non glycosylé ; bande 2, AcrA glycosylé avec une seule sous-unité CP14 manipulée génétiquement. B : Scan de la spectroscopie de masse de l'AcrA non glycosylé intact (i) et de l'AcrA glycosylé (ii). La masse de 39957,74 Da correspond à l'AcrA non glycosylé et de 39227,27 Da correspond à l'AcrA glycosylé avec une sous-unité CP14 manipulée génétiquement.
La FIG. 7 montre un schéma d'un cluster de gène de synthèse qui a été synthétisé pour la production d'une sous-unité CP14 manipulée génétiquement (pGVX1433). Les flèches indiquent que les gènes ont été assemblés ensemble pour la production d'une sous-unité CP14 manipulée génétiquement dans un plasmide pGVX81. La flèche grise montre un gène wfeD de Shigella boyedii qui exprime une galactosyltransférase qui assemble Gai forme UDP-Gal en GlcNAc-P-P-Undécaprényle via une liaison ß (1,4) (J Bacteriol. 2011 ; 193(2) : 449-59). La flèche noire indique tous les gènes de S. pneumoniae nécessaires pour la production d'un cluster CP14 sauf pour la Glc transférase amorce wchA (à la place, wecA de E. coli agit comme transférase amorce qui assemble GlcNAc sur le undécaprènolpyrophosphate et ne fait par conséquent pas partie du plasmide).
La FIG. 8 illustre la production de S. pneumoniae CP14 hybride par combinaison des voies de synthèse de type sauvage et hétérologue dans une cellule hôte de E. coli. Le cluster CP14 de type sauvage a été intégré dans l'acide colanique de E. coli W3110 AwaaL transformé avec le plasmide de manipulation génétique CP14 (pGVX1433) ou le vecteur vide (pGVX81). A : Analyse western-blot de la cellule entière digérée par la protéinase K de E. coli W3110 acide colanique: :CP14 Δ waaL, transformée avec un plasmide CP14 de glycomanipulation (bande 1) ou un plasmide vide (bande 2). Des échantillons (LLO) ont été résolus dans un gel de SDS à 4-12% et transférés sur une membrane. Un anticorps de sérotypage anti-CP14 a été utilisé comme anticorps primaire pour le développement de CP14. B : LLO extrait et marqué par 2AB provenant de E. coli W3110 (acide colanique::CP14) transformé avec le plasmide CP14 de glycomanipulation (ligne pleine) ou plasmide vide (ligne pointillée). Les pics indiqués (par une flèche) ont été collectés et soumis à une analyse MS. Dans le polymère CP14 glycomanipulé, la sous-unité manipulée génétiquement découverte dans tous les échantillons a été la première sous-unité seulement et aucune sous-unité manipulée génétiquement n' a été identifiée comme étant un polymère ou à moitié du polymère.
La FIG. 9 montre que PglB peut transférer le polymère CP14 manipulé génétiquement, mais pas le polymère CP14 de type sauvage, sur une protéine support. E. coli W3110 acide colanique::CP14 AwaaL AwecA-wzzE et E. coli W3110 acide colanique:CP14 AwaaL ont été transformés avec un plasmide comprenant RcsA (activateur de la synthèse de CP14), pGVX970 (exprimant PglB), pGVXl (exprimant AcrA la protéine support) ; les cellules ont été récoltées après induction. L'analyse western-blot a été réalisée sur une cellule entière digérée par la protéinase K et des extraits périplamiques enrichis par IMAC qui ont été résolus par SDS-PAGE (gel à 4-12%) , électro-transférés sur une membrane en nitrocellulose et incubés avec un anticorps CP14. A : Western blot des échantillons digérés par la protéinase K de E. coli W3110 acide colanique:CP14
AwaaL (bande 1) et E. coli W3110 acide colanique: :CP14 AwaaL AwecA-wzzE (bande 2) transformés. B : Analyse western blot des échantillons enrichis par IMAC de E. coli W3110 acide colanique:CP14 AwaaL (bande 1) et E. coli W3110 acide colanique::CP14 AwaaL AwecA-wzzE (bande 2) transformés. Sur l'encart A, toutes les souches ont produit les LLO et ont été reconnues par l'anticorps anti CP14. Cependant, sur l'encart B, la glycoprotéine (CP14-AcrA) seulement a été détectée dans la souche E. coli W3110 acide colanique::CP14, AwaaL et non E. coli W3110 acide colanique::CP14, AwaaL, AwecA-wzzE, qui ne peut produire la sous-unité de manipulation génétique CP14 à cause de l'absence de wecA (codant la transférase d'amorce qui ajoute GlcNAc à UndP) et produit par conséquent seulement la structure CP14 de type sauvage (qui n'est pas un substrat pour PglB du fait de la présence d'un hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif).
La FIG. 10 montre que le polymère CP14 manipulé génétiquement peut être transféré par PglB sur différentes protéines supports. E. coli W3110 acide colanique::CP14, AwaaL a été transformé avec un plasmide CP14 de manipulation génétique (pGVX1433) et un plasmide pour l'expression de RcsA (pGVX970, exprimant PglB) et de pGVX538 (exprimant la protéine support EPA) . Tous les échantillons ont été récoltés après l'induction et la protéine a été extraite du périplasme et enrichie par IMAC. Les échantillons de protéine enrichis ont été résolus par SDS-PAGE (gel à 4-12%) et électro-transférés sur une membrane en nitrocellulose membrane et incubés avec un anticorps anti-His (A) ou un anticorps CP14 (B) comme anticorps primaire.
La FIG. 11 montre la production et la purification de l'EPA glycosylée avec le polymère CP14 manipulé génétiquement. E. coli W3110 acide colanique::CP14 AwaaL a été transformé par un plasmide CP14 manipulée génétiquement (pGVX1433) et des plasmides pour l'expression de PglB (pGVX970) et d'EPA (pGVX538) et RcsA (pour activer la synthèse de CP14) . La souche transformée a été utilisée pour la fermentation et la biomasse a été collectée. Les protéines périplasmiques ont été extraites et soumises à IMAC et la chromatographie d'affinité à la lectine (agglutinine-agarose de Ricinus communis) pour purifier le conjugué CP14-EPA jusqu'à l'homogénéité. Des échantillons purifiés ont été soumis à SDS-PAGE et électro-transférés sur nitrocellulose. L'analyse western blot a été réalisée en utilisant des anticorps de sérotypage anti-His (b) ou anti-CP14 (B) . C : un gel coloré au bleu de Coomassie du bioconjugué CP14-EPA purifié.
La FIG. 12 présente un schéma de l'organisation des gènes du cluster de type sauvage de S. pneumoniae CP33F et la fonction putative de chaque gène. Une partie du cluster (des gènes à l'exception des gènes régulateurs) a été intégrée dans E. coli W3110 en remplaçant le cluster de l'acide colanique de E. coli W3110.
La FIG. 13 montre le développement des souches de E. coli exprimant la capsule de S. pneumoniae CP33F. A : l'acide colanique de E. coli W3110 a été remplacé par CP33F. L'analyse Western blot des extraits de cellules entières digérées par la protéinase K en utilisant l'anticorps de sérotypage CP33F, tous les clones exprimant CP33F. B : La lipopolysaccharide ligase (waaL) de la souche E. coli a été remplacée par pglB pour produire E.coli W3310 CA::CP33F waaL::pglB. La souche transformée a été utilisée pour la fermentation et la biomasse a été collectée. L'analyse western blot des extraits de cellules entières digérées par la protéinase K a été réalisée en utilisant un anticorps de sérotypage CP33F. Deux clones différents (A, B) ont été testés.
La FIG. 14 représente un schéma d'un cluster de gène de synthèse qui a été synthétisé pour la production d'une sous-unité CP33F manipulée génétiquement (incorporée dans un plasmide pGVX2342). A : Les flèches indiquent des gènes qui ont été assemblés pour la production de la sous-unité CP33F manipulée génétiquement dans le plasmide pGVX81. Les flèches grises représentent des gènes provenant de différentes souches de E. coli qui expriment des Galf-transférases (wfdK et wbeY) qui ajoutent la forme Galf UDP-Galf à GlcNAc-P-P-Undécaprényl et galE(UPD-Galactose épimérase) et glf (UDP-galactopyranose mutase) . Les flèches noires représentent les gènes de S. pneumoniae nécessaires pour la production du cluster CP33F à l'exception de la Glc transferase d'amorce wchA (à la place, E. coli wecA endogène agit comme transférase d'amorce qui assemble GlcNAc sur 1'undécaprénolpyrophosphate et ne fait donc pas partie du plasmide) . B : structure de la sous-unité manipulée génétiquement de CP33F, les flèches indiquent les glycosyltransférases correspondantes provenant de différentes bactéries.
La FIG. 15 montre la production et la translocation de la sous-unité de S. pneumoniae CP33F manipulée génétiquement. A : Coloration à l'argent du lipo-oligosaccharide après digestion par la protéinase K de E. coli W3110 transformé avec le plasmide pGVX2098, sans flippase CP33Fwzx (bande 1) ou avec pGVX2342, contenant la flippase CP33Fwzx (bande 2). Des échantillons ont été résolus dans le gel SDS-PAGE à 4-12% avant la coloration à l'argent ou le western blot. B : Analyse western blot des mêmes échantillons que ci-dessus en utilisant un anticorps de sérotypage CP33F comme anticorps primaire. Ces données montrent que la flippase du polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae a une spécificité relâchée pour le glycane et peut déplacer la sous-unité manipulée génétiquement du cytoplasme dans le périplasme.
La FIG. 16 montre la production de la sous-unité CP33F manipulée génétiquement produite dans E. coli. Les
Oligosaccharides liés au lipide (LLO) ont été extraits et marqués par 2AB puis soumis à une HPLC couplée à un détecteur de fluorescence. A : Chromatogramme HPLC de la sous-unité CP33F manipulée génétiquement. Les LLO ont été purifiés à partir de E. coli Ξφ874 AwaaL transformé par le plasmide CP33F manipulé génétiquement, pGVX2342 ou le vecteur vide. La flèche indique le pic correspondant à la sous-unité CP33F manipulée génétiquement qui a été collectée pour l'analyse MS. B : analyse MS/MS du pic à 70,5 min. Les fragments d'ion ont
correspondu à la structure espérée de la sous-unité CP33F manipulée génétiquement.
La FIG. 17 montre que la sous-unité CP33F manipulée génétiquement peut être transférée par PglB. L'analyse western blot des échantillons de protéine : E. coli W3110 AwaaL transformé avec le plasmide d'expression de PglB (pGVX970), le plasmide d'expression AcrA de la protéine support (pGVXl) et le plasmide vide (pGVX1387) ou le plasmide pGVX2306 (exprimant la sous-unité CP33F manipulée génétiquement). Les cellules ont été récoltées après induction et les protéines ont été extraites du périplasme, enrichies par IMAC et les échantillons purifiés ont été soumis à SDS-PAGE (gel à 4-12%) et électro-transférés sur une membrane en nitrocellulose membrane développée par l'anticorps anti-His (A), ou par un anticorps de sérotypage CP33F (B) comme anticorps primaire. Bande 1, échantillon de protéine provenant de la souche E. coli abritant le plasmide vide ; bande 2, échantillon de protéine provenant de la souche E. coli abritant le plasmide CP33F de manipulation génétique (pGVX2306).
La FIG. 18 montre que PglB peut transférer le polymère CP33F manipulé génétiquement sur une protéine support mais ne peut transférer le CP33F de type sauvage. Analyse western-blot de cellules entières digérées par la protéinase K (A) et d'extraits périplasmiques enrichis par IMAC (B et C) de E.
coli W3110 acide colanique: :CP33F waaL::PglB transformé avec le plasmide RcsA (activateur de la synthèse de CP33F) et pGVX2310 exprimant EPA (protéine support) et le vecteur vide (bande 1, 2) ou le plasmide de manipulation génétique CP33F (pGVX2346) bande 3 et 4, respectivement (encarts A et B) . Tous les échantillons ont été résolus par SDS-PAGE (gel à 4-12%), électro-transférés sur une membrane en nitrocellulose et incubés avec un anticorps de sérotypage CP33F (A et B) et avec un anticorps a-His (C). Comme le montre l'encart A, toutes les souches ont produit des LLO reconnus par l'anticorps anti-CP33F ; cependant, la glycoprotéine (CP33F-EPA) a été seulement détectée dans la souche exprimant CP33F Eng, ce qui confirme que PglB peut seulement transférer le CP33F modifié de manière à ne pas comprendre d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif.
La FIG. 19 A : est un schéma de l'organisation des gènes du cluster de type sauvage de S. pneumoniae CP14 et de la fonction putative de chaque gène. Le carré en pointillé indique la partie du cluster qui a été intégrée dans le chromosome de E. coli W3110 en remplaçant le cluster E. coli W3110 acide colanique. B : structure d'un motif répétitif (RU) de CP14 de type sauvage, les enzymes étant responsables de l'assemblage indiqué.
La FIG. 20 A : montre un schéma du cluster de synthèse utilisé pour la production de la sous-unité CP14 manipulée génétiquement. Les flèches indiquent les gènes qui ont été assemblés ensemble pour la production de la sous-unité CP14 manipulée génétiquement dans un plasmide arabinose-inductible. Les flèches en gris pâle représentent les gènes wciP (galactosyltransférase qui assemble Gai à partir de UDP-Gal pour donner Glc) et wciQ (glucosyltransférase qui assemble Glc à partir de UDP-Glc pour donner GalNAc-UndPP) provenant de E. coli 021. La flèche gris foncé représente l'épimérase Z3206 qui convertit GlcNAc-UndPP (produit de E. coli wecA) en GalNAc-UndPP (Rush JS, Alaimo C, Robbiani R, Wacker M, Waechter CJ. J Biol Chem. 2010 Jan 15,-285(3) :1671-80) . Les flèches noires représentent wchL (codant la GlcNAc transférase) et wchM (codant la galactosyltransférase) provenant de S. pneumoniae CP14. La flèche blanche représente la flippase de C. jejuni, pglK. B : structure d'un motif répétitif (RU) du CP14 hybride, les enzymes responsables de l'assemblage étant indiquées (ici, un dérivé de monosaccharide hexose existe en tant que monosaccharide au niveau de l'extrémité réductrice, le motif répétitif CP14 de type sauvage complet étant assemblé sur le dérivé de monosaccharide hexose).
La FIG. 21 est un schéma qui illustre une méthode pour la production d'un polymère CP14 hybride qui peut être transféré par une oligosaccharyl transférase (par exemple C. jejuni PglB) . A : montre la voie de biosynthèse de type sauvage de CP14 qui a été incorporé dans E. coli B : illustre la biosynthèse d'une sous-unité manipulée génétiquement de CP14 en utilisant différentes glycosyltransférases pour synthétiser une sous-unité de CP14 de type sauvage complète sur GalNAc-undécaprényl pyrophosphate. C : montre la polymérisation du polysaccharide CP14 de type sauvage sur le haut d'une sous-unité manipulée génétiquement. Ce polymère hybride est transféré par PglB avec un haut rendement.
La FIG. 22 montre que PglB peut transférer le polymère CP14 manipulé génétiquement sur une protéine support. E. coli W3110 acide colanique: :CP14 AwaaL a été transformé par le plasmide RcsA (activateur de la synthèse de CP14), le plasmide pour la production de la sous-unité CP14 manipulée génétiquement, le plasmide exprimant PglB, et le plasmide exprimant EPA (une protéine support) . Les cellules ont été cultivées et récoltées après induction. Les protéines périplasmiques ont été extraites et le conjugué EPA enrichi par chromatographie d'affinité (l'IgG purifiée à partir du sérum de chèvre injecté avec une protéine EPA purifié non glycosylée a été couplée à Affi-Gel ® de Bior-Rad). Les échantillons de protéine enrichis ont été résolus par SDS-PAGE (gel à 4-12%) et électro-transférés sur une membrane en nitrocellulose. A : transfert incubé avec un anticorps monoclonal anti-His. B : transfert incubé avec un anticorps de sérotypage CP14 S. pneumoniae. Dans les deux analyses western-blot, des bandes de type échelle ont été visualisées, elles correspondent aux conjugués CP14-EPA.
La FIG. 23 montre la purification de CP14-EPA. E. coli W3110 acide colanique: :CP14AwaaL a été transformé avec des plasmides pour l'expression de RcsA (activateur de la synthèse de CP14), pour la production de la sous-unité manipulée génétiquement de CP14, exprimant C. jejuni PglB (oligosaccharyltransférase), et EPA-6His (protéine support). Les cellules de E. coli transformées ont été cultivées dans un bioréacteur et les cellules ont été récoltées après induction. Les protéines ont été extraites du périplasme par choc osmotique et purifiées par IMAC, chromatographie d'affinité à la lectine (agglutinine de Ricinus communis), chromatographie d'exclusion stérique, et chromatographie de Source Q. Les échantillons purifiés ont été résolus par SDS-PAGE (gel à 4-12%) et soumis à une coloration par bleu de coomassie (A) ou électro-transférés sur une membrane en nitrocellulose, avec un anticorps monoclonal anti-His comme anticorps primaire (B) ou un anticorps de sérotypage anti-CP14 utilisé comme anticorps primaire (C).
La FIG. 24 est l'illustration de la conception d'une expérience pour l'analyse de l'immunogénicité des bioconjugués CP14-EPA par rapport à un vaccin connu contre Streptococcus pneumoniae (Prevnar 13; Wyeth/Pfizer).
La FIG. 25 montre 1'immunogénicity et la fonctionnalité de l'anticorps dirigé contre le bioconjugué CP14-EPA par rapport à Prevnar 13. Le conjugué CP14-EPA a été injecté en compagnie d'hydroxyde d'aluminium (adjuvant) en deux dosages : 0,4 pg de CP14 et 2,2 pg de CP14, respectivement à trois lapins différents (voir Figure 24) . Comme témoin, Prevnar 13 (2,2 pg) a été injecté à trois lapins différents. A : montre la concentration en l'anticorps spécifique CP14 chez le lapin. ELISA a été réalisé en utilisant le polysaccharide capsulaire CP14 de type sauvage (normalisé sur la base des sérums humains correspondants). B : fonctionnalité des sérums correspondants à A, indiquée par l'indice d'opsonophagocytose.
La FIG. 26 est un dessin montrant la production d'un polysaccharide capsulaire (hybride) glyco-manipulé par rapport à son homologue de type sauvage, lequel comprend un monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif.
La FIG.27 montre le cluster de gène S. pneumoniae CP15A.
La FIG.28 montre la structure du motif répétitif de S. pneumoniae CP15A.
La FIG.29 montre en A : l'organisation génétique du plasmide pGVXN3058 utilisé pour manipuler CP15A et en B : la structure sucrée du CP15A manipulé génétiquement
La FIG.30 illustre la production d'un bioconjugué CP15A-AcrA en présence du vecteur pGVXN3058 (manipulation génétique). A : Analyse western blot des extraits de cellules entières digérées par la protéinase K en utilisant un anticorps anti-CP15A ; B : Analyse western blot de la protéine extraite du périplasme et enrichie par IMAC en utilisant un anticorps anti-CP15A ; C : Analyse western blot de la protéine extraite du périplasme et enrichie par IMAC en utilisant un anticorps anti His.
5 - DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les polysaccharides capsulaires pneumococciques sont synthétisés sur des lipides supports grâce à la collaboration d'un ensemble d'enzymes typiquement codées dans le cluster CP cluster des cellules de S. pneumoniae (Whitfield C, Roberts IS: Structure, assembly and régulation of expression of capsules in Escherichia coli. Mol Microhiol 1999, 31(5) :1307-1319). La synthèse du CP wzy dépendant commence par l'addition d'un monosaccharide-phosphate à 1'undécaprénylphosphate (Und-P) du côté cytoplasmique de la membrane. Un oligosaccharide court est allongé par l'addition séquentielle de monosaccharides à partir de nucléotides de sucre activés par les différentes glycosyltransférases et l'oligosaccharide lié au lipide est exfiltré à travers la membrane par une flippase. Le motif répétitif antigénique (RU) est polymérisé par une réaction enzymatique réalisée par la protéine wzy. Le polysaccharide est ensuite transféré à la structure acceptrice finale. On pense que la polymérisation et le transport vers la surface cellulaire sont contrôlés par un ensemble de 3 à 4 enzymes qui sont situées à l'extrémité 5' des clusters CPCP.
Les glycosyltransférases, la polymérase wzy, la flippase wzx, et la monosaccharide-phosphate transferase sont codées dans la plupart des cas à l'intérieur de dexB en cluster aliA, alors que les voies de biosynthèse du monosaccharide activé par un nucléotide sont codées soit quelque part ailleurs dans le génome dans le cas des activités ménagères générales, et spécifiquement à l'intérieur du cluster CP quand les monosaccharides sont spécifiques pour le CP (Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from ail 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31).
La plupart des voies de biosynthèse produisant le CP utilisent des monosaccharides activés par un nucléotide diphosphate (NDP) comme substrats, notamment UDP-Glc et UDP-GlcNAc. Ces sucres NDP sont fournis dans des hôtes Gram-négatifs et Gram-positifs par les gènes ménagers, et sont donc disponibles en tant que matières de départ pour la synthèse des sucres spécifiques. Les gènes biosynthétiques pour la synthèse des sucres NDP spécifiques ou autres modifications sont presque toujours codés dans les clusters CP.
La synthèse de l'antigène O et la synthèse du CP diffèrent au niveau de la dernière étape de la biosynthèse. L'antigène 0 est ajouté au noyau du lipide A par la ligase WaaL et est ensuite transporté vers la membrane externe, alors que les CP sont présents sous forme de structures capsulaires sur les cellules. En moyenne, la longueur du sucre final de l'antigène 0 est bien plus courte que celle du CP.
Les CP de S. pneumoniae sont classés dans les CP du groupe I à cause des voies biochimiques spécifiques conduisant à leur synthèse. Les bactéries à Gram-négatif contiennent aussi des voies de CP du groupe I, qui diffèrent des clusters du groupe I pneumococciques par la présence de gènes de protéines transporteurs de la membrane additionnels responsables du transport de la membrane externe. Par exemple, ce sont les clusters de gène du mécanisme de biosynthèse à l'acide colanique (CA) wca, (Stevenson G, Andrianopoulos K, Hobbs M, Reeves PR: Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellular polysaccharide colanic acid. J Bacteriol 1996, 178(16):4885-4893) et le cluster de CP K30 (Whitfield C: Biosynthesis and assembly of capsular polysaccharides in Escherichia coli. Annu Rev Biochem 2006, 75:39-68) .
Une méthode pour la production du polysaccharide capsulaire de type sauvage de Streptococcus pneumoniae par intégration chromosomique et modification génétique de E. coli a été décrite. Voir la demande de brevet internationale n° W02014/072405, incorporée ici par référence dans sa totalité. Cependant, en dépit de la production réussie du polysaccharide capsulaire Gram-positif de type sauvage, la production efficace des bioconjugués de CP pneumococcique CP dans E. coli en utilisant des oligosaccharyltransférases (C. jejuni PglB) a été entravée du fait que plus de 90% des polysaccharides capsulaires pneumococcique contiennent de l'hexose (par exemple du glucose) au niveau de l'extrémité réductrice, qui est un substrat sous-optimal pour PglB (Proc Natl Acad Sei U S A. 2006 May 2;103(18) : 7088-93) .
Comme cela a été exposé dans la section 3 ci-dessus, les exemples ci-après et les revendications ci-jointes, l'inventeur de la présente demande a identifié de nouvelles méthodes pour la production d'oligosaccharides et de polysaccharides modifiés, y compris des polysaccharides capsulaires pneumococciques, ce qui permet la biosynthèse d'oligosaccharides et de polysaccharides hybrides sur un monosaccharide réducteur fixé à 1'undécaprénol-pyrophosphate qui est un substrat approprié pour PglB. Donc, les méthodes décrites dans le présent document permettent pour la première fois d'utiliser des cellules hôtes modifiées dans la production à hauts rendements de bioconjugués liés à des antigènes bactériens (oligosaccharides et polysaccharides) qui ne sont normalement pas des substrats pour les oligosaccharyl transférases (ou sont des substrats faibles pour les oligosaccharyl transférases), par exemple PglB (par exemple PglB de C. jejuni).
Dans un mode de réalisation, on propose une bactérie Gram-négative manipulée génétiquement pour la production d'un polysaccharide, ladite bactérie Gram-négative comprenant une voie de synthèse d'un cluster de gène d'un polysaccharide capsulaire qui est intégrée dans le chromosome d'une bactérie Gram-négative. Dans certains modes de réalisation, la bactérie Gram-négative comprend au moins 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, ou au moins 95% des cadres de lecture ouverts du cluster du gène du polysaccharide capsulaire. Dans certains modes de réalisation, la bactérie Gram-négative comprend un cluster du gène du polysaccharide capsulaire complet. Dans certains modes de réalisation, le polysaccharide comprend un épitope du polysaccharide capsulaire.
Dans un mode de réalisation, on propose une bactérie Gram-négative pour la production d'une sous-unité manipulée génétiquement, ladite bactérie Gram-négative comprenant une voie pour la production d'un motif répétitif manipulé génétiquement d'un polysaccharide capsulaire. Dans certains modes de réalisation, la bactérie Gram-négative comprend au moins 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, ou au moins 95% des cadres de lecture ouverts du cluster du gène du polysaccharide capsulaire. Dans certains modes de réalisation, la bactérie Gram-négative comprend plusieurs gènes codant des glycosyltransférases provenant de différentes bactéries Gram-négatives et positives.
Dans certains modes de réalisation, la bactérie Gram-négative du paragraphe précédent est choisie dans le groupe constitué par l'espèce Escherichia, E. coli, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia, l'espèce Neisseria, l'espèce Vibrio, l'espèce Proteus, l'espèce Pseudomonas, l'espèce Aeromonas, et l'espèce Proteus. Dans un mode de réalisation spécifique, la bactérie Gram-négative est E. coli.
Dans certains modes de réalisation, la bactérie Gram-négative du paragraphe précédent est choisie dans le groupe constitué par l'espèce Streptococcus, l'espèce Staphylococcus, l'espèce Bacillus, l'espèce Enterococcus et l'espèce Lactococcus.
Dans certains modes de réalisation, le cluster du gène du polysaccharide capsulaire d'une bactérie Gram-positive qui est manipulée génétiquement dans la bactérie Gram-négative de l'un quelconque des paragraphes précédents est Streptococcus pneumoniae. Dans un mode de réalisation spécifique, le gène régulateur de S. pneumoniae provient du type 14 de S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation spécifique, le gène régulateur de S. pneumoniae provient du type 33F de S. pneumoniae.
Dans un mode de réalisation spécifique de la présente invention, les gènes régulateurs de S. pneumoniae proviennent des types 8, 12F, 15A, 16F, 22F, 23A, 24F, 31, 33F, 35B et 38 de S. pneumoniae.
Dans certains modes de réalisation, la bactérie Gram-négative de l'un quelconque des paragraphes précédents comprend une oligosaccharyltransférase. Dans un mode de réalisation spécifique, 1'oligosaccharyltransférase est hétérologue de la bactérie Gram-négative.
Dans certains modes de réalisation, la bactérie Gram-négative de l'un quelconque des paragraphes précédents comprend au moins une glycosyltransférase hétérologue. Dans un mode de réalisation spécifique, la glycosyltransférase hétérologue est une glycosyltransférase procaryote. Dans un mode de réalisation spécifique, la glycosyltransférase est obtenue à partir de la même bactérie Gram-positive que le gène régulateur.
Dans certains modes de réalisation, la bactérie Gram-négative de l'un quelconque des paragraphes précédents comprend une délétion ou une inactivation d'un ou de plusieurs gènes natifs pour la bactérie Gram-négative. Dans un mode de réalisation spécifique, l'un ou les multiples gènes supprimés comprennent le gène waaL. Dans un mode de réalisation spécifique, l'un ou les multiples gènes supprimés comprennent tous les gènes associés à la biosynthèse de l'antigène 0 dans la bactérie Gram-négative.
Dans certains modes de réalisation, la bactérie Gram-négative de l'un quelconque des paragraphes précédents comprend la substitution d'un ou de plusieurs gènes natifs pour la bactérie Gram-négative. Dans un mode de réalisation spécifique, l'un ou les multiples gènes supprimés comprennent le gène waaL. Dans un mode de réalisation spécifique, waaL a été remplacé par une oligosaccharyltransférase. Dans un mode de réalisation spécifique, waaL a été remplacé par C. jejuni pglB.
Dans certains modes de réalisation, la bactérie Gram-négative de l'un quelconque des paragraphes précédents comprend un acide nucléique codant une protéine support comprenant une séquence consensus pour la glycosylation. Dans un mode de réalisation spécifique, l'acide nucléique codant la protéine support est hétérologue de la bactérie Gram-négative. Dans un mode de réalisation spécifique, la protéine support est l'exotoxine A détoxifiée provenant de P. aeruginosa, CRM197, le toxoïde de la diphtérie, le toxoïde du tétanos, 1'hémolysine A détoxifiée de S. aureus, le facteur de coagulation A, le facteur de coagulation B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, l'entérotoxine thermolabile de E. coli, des variants détoxifiés de l'entérotoxine thermolabile de E. coli, la toxine du choléra sous-unité B (CTB), la toxine du choléra, des variants détoxifiés de la toxine du choléra, la protéine Sat de E. coli, le domaine passager de la protéine Sat de E. coli, AcrA de C. jejuni, les glycoprotéines naturelles de C. jejuni et la pneumolysine de S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation spécifique, la protéine support est une protéine de S. pneumoniae, par exemple la pneumolysine de S. pneumoniae, NOX de S. pneumoniae, PspA de S. pneumoniae, PcpA de S. pneumoniae, PhtD de S. pneumoniae, PhtE de S. pneumoniae, Ply de S. pneumoniae, ou LytB de S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation spécifique, la protéine support est conjuguée au polysaccharide par le biais d'une oligosaccharyl transférase.
Dans certains modes de réalisation, les gènes de glycosyltransférases ont été manipulés génétiquement dans la bactérie Gram-négative pour produire l'une des sous-unités manipulées génétiquement du polysaccharide capsulaire suivantes : CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6 (A et B), CP7 (A,B, C) , CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A,B,C,F), CPU (A, B,C,D,F), CP12 (A,B, F), CP13, CP14, CP15 (A,B,C,F), CP16 (A, F) , CP17 (A,F), CPI 8 (A, B, C, F) , CP19 (A,B,C,F), CP20, CP21, CP22 (A, F) , CP23 (A,B,F), CP24 (A,B,F), CP25 (A,F), CP26, CP27, CP28 (A, F), CP29, CP31, CP32 (A, F) , CP33 (A,B,C,D, F), CP34, CP35 (A, B, C, D, F) , CP36, CP37, CP38, CP39, CP40, CP41 (A, F) , CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47 (A,F), ou CP48 de S. pneumoniae ; ou CP5, ou CP8 de Staphylococcus aureus ; CPIa, CPIb, CPU, CPIII, CPIV, CPV, CPVI, CPVII, ou CPVIII de Streptococcus agalactiae (groupe B, GBS) ; ou CPA, CPB, CPC, ou CPD de
Enterococcus faecalis.
Dans un mode de réalisation spécifique, la bactérie Gram-négative de l'un quelconque des paragraphes précédents comprend une oligosaccharyl transférase. Dans un mode de réalisation spécifique, 1'oligosaccharyl transférase est hétérologue de la bactérie Gram-négative.
Dans un mode de réalisation spécifique, la bactérie Gram-négative de l'un quelconque des paragraphes précédents comprend au moins une glycosyltransférase qui est hétérologue de la bactérie Gram-négative. Dans un mode de réalisation spécifique, la glycosyltransférase est une glycosyltransférase procaryote. Dans un mode de réalisation spécifique, la glycosyltransférase est une archée ou une glycosyltransférase eucaryote.
Dans un mode de réalisation spécifique, la bactérie Gram-négative de l'un quelconque des paragraphes précédents comprend un acide nucléique codant une protéine support comprenant une séquence consensus pour la glycosylation. Dans un mode de réalisation spécifique, l'acide nucléique codant la protéine support est hétérologue de la bactérie Gram-négative. Dans un mode de réalisation spécifique, la protéine support est l'exotoxine A détoxifiée de P. aeruginosa, CRM197, le toxoïde de la diphtérie, le toxoïde du tétanos, 1'hémolysine A détoxifiée de S. aureus, le facteur de coagulation A, le facteur de coagulation B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, l'entérotoxine thermolabile de E. coli, des variants détoxifiés de l'entérotoxine thermolabile de E. coli, la toxine du choléra sous-unité B (CTB), la toxine du choléra, des variants détoxifiés de la toxine du choléra, la protéine Sat de E. coli, le domaine passager de la protéine Sat de E. coli, AcrA de C. jejuni, les glycoprotéines naturelles de C. jejuni. Dans un mode de réalisation spécifique, la protéine support est conjuguée au polysaccharide par le biais de 1'oligosaccharyl transférase.
Dans un mode de réalisation spécifique, le polysaccharide de la bactérie Gram-positive des paragraphes précédents est un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae.
Dans un mode de réalisation spécifique, le polysaccharide de la bactérie Gram-negative des paragraphes précédents est un antigène 0 de E. coli (01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, OlO, 011, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 019, 020, 021, 022, 023, 024, 025, 026, 027, 028, 029, 030, 032, 033, 034, 035, 036, 037, 038, 039, 040, 041, 042, 043, 044, 045, 046, 048, 049, 050, 051, 052, 053, 054, 055, 056, 057, 058, 059, 060, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 070, 071, 073, 074, 075, 076, 077, 078, 079, 080, 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088, 089, 090, 091, 092, 093, 095, 096, 097, 098, 099, OlOO, OlOl, 0102, 0103, 0104, 0105, 0106, 0107, 0108, 0109, OllO, OUI, 0112, 0113, 0114, 0115, 0116, 0117, 0118, 0119, 0120, 0121, 0123, 0124, 0125, 0126, 0127, 0128, 0129, 0130, 0131, 0132, 0133, 0134, 0135, 0136, 0137, 0138, 0139, 0140, 0141, 0142, 0143, 0144,0145, 0146, 0147, 0148, 0149, 0150, 0151, 0152, 0153, 0154, 0155, 0156, 0157, 0158, 0159, 0160, 0161, 0162, 0163, 0164, 0165, 0166, 0167, 0168, 0169, 0170, 0171, 0172, 0173, 0174, 0175, 0176, 0177, 0178, 0179, 0180, 0181, 0182, 0183, 0184, 0185, 0186, 0187), l'espèce
Salmonella (S. enterica sous-espèce Enterica, S. enterica sous-espèce Salamae, S. enterica sous-espèce arizonae, S. enterica sous-espèce Diarizonae, S. enterica sous-espèce Houtenae, S. bongori, et S. enterica sous-espèce Indica), et types 0 1-67, l'espèce Pseudomonas (P. aeruginosa sérotypes 0 1-20), l'espèce Klebsiella (en particulier K. pneumonia sérotypes 01, 02 (et sous-sérotypes) , 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, OlO, 011, 012), les antigènes 0 d'Acinétobacter (en particulier antigènes 0 de A. baumannii), les antigènes 0 de Chlamydia trachomatis (sérotypes A, B, C, D, E, F, G, H, I J, K, Ll, L2, L3) , les antigènes 0 de Vibrio choiera 01 à 155, l'espèce Listeria, en particulier L. monocytogenes type 1, 2, 3, 4 et ses sous-sérotypes, les antigènes 0 de Légionella pneumophila sérotypes 1 à 15, les antigènes 0 de Bordetella parapertussis, les antigènes 0 de Burkholderia mallei et pseudomallei, Francisella tularensis, l'espèce Campylobacter (C. jejuni) ; les polysaccharides capsulaires de Clostridium difficile (sérotypes A, G, H, K, SI, S4, D, Cd-5, et C. perfringens sérotypes A, B, C, D et E) , Staphylococcus aureus type 5 et 8, Streptococcus pyrogenes (polysaccharides capsulaires streptococciques de sérotype du groupe B) , E. coli, Streptococcus agalacticae (polysaccharides capsulaires streptococciques du groupe A), Neisseria meningitidis (sérotypes A, B, C, W, Y, X), Candida albicans, Haemophilus influenza, polysaccharides capsulaires de Enterococcus faecalis type I-V ; et autres structures de surface des polysaccharides, par exemple les glycolipides de Borrelia burgdorferi) , le piline-O-glycane et le lipo-oligosaccharide de Neisseria meningitidis (LOS), LOS de Haemophilus influenza, le lipophosphoglycane majeur de la Leishmania, les antigènes des hydrates de carbone associés aux tumeurs, le glycosyl phosphatidylinositol de la malaria, ou 1'arabinomannane de mycobacterium tuberculosis.
Dans un mode de réalisation spécifique, une glycosyltransférase provenant du cluster du gène du polysaccharide de la bactérie Gram-negative des paragraphes précédents est un antigène 0 de E. coli (01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, OlO, 011, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 019, 020, 021, 022, 023, 024, 025, 026, 027, 028, 029, 030, 032, 033, 034, 035, 036, 037, 038, 039, 040, 041, 042, 043, 044, 045, 046, 048, 049, 050, 051, 052, 053, 054, 055, 056, 057, 058, 059, 060, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 070, 071, 073, 07 4, 075, 076, 077, 078, 079, 080, 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088, 089, 090, 091, 092, 093, 095, 096, 097, 098, 099, 0100, O101, 0102, 0103, 0104, 0105, 0106, 0107, 0108, 0109, OllO, OUI, 0112, 0113, 0114, 0115, 0116, 0117, 0118, 0119, 0120, 0121, 0123, 0124, 0125, 0126, 0127, 0128, 0129, 0130, 0131, 0132, 0133, 0134, 0135, 0136, 0137, 0138, 0139, 0140, 0141, 0142, 0143, 0144,0145, 0146, 0147, 0148, 0149, 0150, 0151, 0152, 0153, 0154, 0155, 0156, 0157, 0158, 0159, 0160, 0161, 0162, 0163, 0164, 0165, 0166, 0167, 0168, 0169, 0170, 0171, 0172, 0173, 0174, 0175, 0176, 0177, 0178, 0179, 0180, 0181, 0182, 0183, 0184, 0185, 0186, 0187), l'espèce Salmonella {S. enterica sous-espèce Enterica, S. enterica sous-espèce Salamae, S. enterica sous-espèce arizonae, S. enterica sous-espèce Diarizonae, S. enterica sous-espèce Houtenae, S. bongori, et S. enterica sous-espèce Indica), et types 0 1-67, l'espèce Pseudomonas (P. aeruginosa sérotypes 0 1-20), l'espèce Klebsiella (en particulier K. pneumonia sérotypes 01, 02 (et sous-sérotypes), 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, OlO, 011, 012), les antigènes 0 d'Acinétobacter (en particulier antigènes 0 de A. baumannii), les antigènes 0 de Chlamydia trachomatis (sérotypes A, B, C, D, E, F, G, H, I J, K, Ll, L2, L3), les antigènes 0 de Vibrio choiera 01 à 155, l'espèce Listeria, en particulier L. monocytogenes type 1, 2, 3, 4 et ses sous-sérotypes, les antigènes 0 de Légionella pneumophila sérotypes 1 à 15, les antigènes 0 de Bordetella parapertussis, les antigènes 0 de Burkholderia mallei et pseudomallei, Francisella tularensis, l'espèce Campylobacter (C. jejuni) ; les polysaccharides capsulaires de Clostridium difficile (sérotypes A, G, H, K, SI, S4, D, Cd-5, et C. perfringens sérotypes A, B, C, D et E), Staphylococcus aureus type 5 et 8, Streptococcus pyrogenes (polysaccharides capsulaires streptococciques de sérotype du groupe B), E. coli, Streptococcus agalacticae (polysaccharides capsulaires streptococciques du groupe A), Neisseria meningitidis (sérotypes A, B, C, W, Y, X), Candida albicans, Haemophilus influenza, polysaccharides capsulaires de Enterococcus faecalis type I-V ; et autres structures de surface des polysaccharides, par exemple les glycolipides de Borrelia burgdorferi) , le piline-O-glycane et le lipo-oligosaccharide de Neisseria meningitidis (LOS) , LOS de Haemophilus influenza, le lipophosphoglycane majeur de la Leishmania, les antigènes des hydrates de carbone associés aux tumeurs, le glycosyl phosphatidylinositol de la malaria, ou 1'arabinomannane de mycobacterium tuberculosis, l'acide téicholde et 1'exopolysaccharide de Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyrogenes, Streptococcus agalacticae , C. perfringens r L. lactis, L. cremoris.
Dans des modes de réalisation spécifiques, on propose une glycoprotéine recombinante produite par la bactérie Gram-négative de l'un quelconque des paragraphes précédents.
Dans des modes de réalisation spécifiques, on propose une méthode pour la production de la glycoprotéine recombinante comprenant la culture de la bactérie Gram-négative de l'un quelconque des paragraphes précédents dans des conditions appropriées pour la production des protéines. Dans un mode de réalisation spécifique, la méthode comprend en outre la purification de la glycoprotéine recombinante.
Dans certains modes de réalisation, différentes glycosyltransférases homologues et hétérologues ont été combinées in vivo pour générer des motifs répétitifs de polysaccharides capsulaires de manipulation génétique de S. pneumoniae CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6 (A et B), CP7 (A, B, C) , CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A, B, C, F), CPU (A, B, C, D, F), CP12 (A, B, F), CP13, CP14 CP15 (A, B, C, F), CP16 (A, F), CP17 (A, F), CPI 8 (A, B, C, F), CP19 (A, B, C, F), CP20, CP21, CP22 (A, F), CP23 (A, B, F), CP24 (A, B, F), CP25 (A, F), CP2 6, CP2 7, CP28 (A, F), CP29, CP31, CP32 (A, F), CP33 (A, B, C, D, F), CPS34, CP35 (A, B, C, D, F), CP36, CP37, CP38, CP39, CP4 0, CP41 (A, F), CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47 (A, F) , CPS48 et toutes les capsules additionnelles telles qu'elles sont mentionnées dans (Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from ail 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31). Spécifiquement, ces polysaccharides capsulaires comprennent CP14 et CP33F de S. pneumoniae.
Dans un mode de réalisation spécifique de la présente invention, un produit vaccinal comprend des motifs répétitifs de polysaccharides capsulaires manipulés génétiquement de S. pneumoniae sérotypes CP8, CP15A, CPI 6F, CP22F, CP23A, CP24F, CP31, CP33F, CP35B et CP38.
Dans d'autres modes de réalisation, les polysaccharides capsulaires d'autres bactéries Gram-positives avec l'hexose ou tout autre monosaccharide peuvent être modifiés en utilisant les méthodes de la présente invention. D'autres bactéries Gram-positives comprennent Staphylococcus aureus et Streptococcus agalactiae (GBS). Les exemples de ces polysaccharides capsulaires comprennent S. aureus CP5, CP8, S. agalactiae (groupe B, GBS) CPIa, CPIb, CPU, CPIII, CPIV, CPV, CPVI, CPVII, CPVIII, Enterococcus faecalis CPA, CPB, CPC, CPD.
Dans certains modes de réalisation, les cellules hôtes bactériennes décrites dans la présente demande et les conjugués produits par ces cellules hôtes bactériennes décrits dans la présente demande possèdent des propriétés avantageuses. Par exemple, dans certains modes de réalisation, les cellules hôtes bactériennes décrites dans la présente demande, lesquelles comprennent des gènes régulateurs dérivés de bactéries Gram-positives, lesdits gènes régulateurs étant impliqués dans la biosynthèse de l'oligo- ou du polysaccharide, sont capables de produire des antigènes de sucre, par exemple des oligo- et/ou polysaccharides, de longueur accrue du fait de la présence desdits gènes régulateurs. En plus, les cellules hôtes bactériennes décrites ici sont capables de produire des quantités accrues d'antigènes de sucre, par exemple des oligo- et/ou polysaccharides, par rapport aux cellules hôtes bactériennes Gram-négatives dépourvues des gènes régulateurs dérivés des bactéries Gram-positives. Chacune de ces caractéristiques est avantageuse du fait que les conjugués produits par les cellules bactériennes ont un rapport antigène sur protéine supérieur et que les cellules bactériennes produisent un nombre plus important de conjugués.
Dans certains modes de réalisation, une cellule bactérienne hôte décrite dans le présent document produit environ 5%, 10%, 15%, 20%, environ 25%, environ 30%, environ 40%, environ 50%, ou plus de 50% de conjugués en plus qu'une cellule hôte bactérienne ayant les mêmes propriétés mais dépourvue d'un gène régulateur provenant d'une bactérie Gram positive qui est impliqué dans la biosynthèse de l'oligo- ou du polysaccharide. Dans certains modes de réalisation, une cellule bactérienne hôte décrite dans le présent document produit environ 5% à 10%, 10% à 20%, 20% à 30%, 30% à 40%, ou 40% à 50% de conjugués en plus qu'une cellule hôte bactérienne ayant les mêmes propriétés mais dépourvue d'un gène régulateur provenant d'une bactérie Gram positive qui est impliqué dans la biosynthèse de l'oligo- ou du polysaccharide.
Dans certains modes de réalisation, une cellule bactérienne hôte décrite dans le présent document produit environ 5%, 10%, 15%, 20%, environ 25%, environ 30%, environ 40%, environ 50%, ou plus de 50% d'antigènes de sucre en plus, par exemple oligo- et/ou polysaccharides, qu'une cellule hôte bactérienne ayant les mêmes propriétés mais dépourvue d'un gène régulateur provenant d'une bactérie Gram positive qui est impliqué dans la biosynthèse de l'oligo- ou du polysaccharide. Dans certains modes de réalisation, une cellule bactérienne hôte décrite dans le présent document produit 5% à 10%, 10% à 20%, 20% à 30%, 30% à 40%, ou 40% à 50% d'antigènes de sucre en plus, par exemple oligo- et/ou polysaccharides, qu'une cellule hôte bactérienne ayant les mêmes propriétés mais dépourvue d'un gène régulateur provenant d'une bactérie Gram positive qui est impliqué dans la biosynthèse de l'oligo- ou du polysaccharide.
Dans certains modes de réalisation, une cellule bactérienne hôte décrite dans le présent document produit des antigènes de sucre, par exemple oligo- et/ou polysaccharides, qui sont environ 5%, 10%, 15%, 20%, environ 25%, environ 30%, environ 40%, environ 50%, ou plus de 50% plus longs que les antigènes de sucre, par exemple oligo- et/ou polysaccharides, produits par une cellule hôte bactérienne ayant les mêmes propriétés mais dépourvue d'un gène régulateur provenant d'une bactérie Gram positive qui est impliqué dans la biosynthèse de 1'oligo- ou du polysaccharide. Dans certains modes de réalisation, une cellule bactérienne hôte décrite dans le présent document produit des antigènes de sucre, par exemple oligo- et/ou polysaccharides, qui sont environ 5% à 10%, 10% à 20%, 20% à 30%, 30% à 40%, ou 40% à 50% plus longs que les antigènes de sucre, par exemple oligo- et/ou polysaccharides, produits par une cellule hôte bactérienne ayant les mêmes propriétés mais dépourvue d'un gène régulateur provenant d'une bactérie Gram positive qui est impliqué dans la biosynthèse de 1'oligo- ou du polysaccharide.
Divers essais peuvent être utilisés pour caractériser les conjugués décrits dans le présent document, par exemple pour caractériser la protéine support, le ou les antigènes de sucre immobilisés (par exemple oligo- et/ou polysaccharide) , ou les deux, y compris par exemple la chromatographie d'exclusion stérique haute performance, le focusing isoélectrique, SDS-PAGE et western Blot, la détermination de la masse moléculaire par MS, le séquençage en N-terminal, l'analyse des acides aminés, la chromatographie liquide en phase inverse, la spectroscopie de masse électrospray, la spectroscopie de masse tandem (MS/MS), et la cartographie des peptides par spectroscopie de masse après digestion tryptique.
5.1 CELLULES HOTES
Toute cellule hôte connue de l'homme du métier peut être utilisée pour produire les oligosaccharides et polysaccharides hybrides décrits dans la présente demande et des bioconjugués comprenant les oligosaccharides et polysaccharides hybrides décrits dans la présente demande, y compris les archées, les cellules hôtes procaryotes et les cellules hôtes eucaryotes. Les exemples de cellules hôtes procaryotes pour l'utilisation dans la production des oligosaccharides et polysaccharides hybrides décrits dans la présente demande et des bioconjugués comprenant les oligosaccharides et polysaccharides hybrides décrits dans la présente demande, incluent sans limitation, l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xhantomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia, l'espèce Lactococcus, l'espèce Lactobacillus, l'espèce Pseudomonas, l'espèce Corynebacterium, l'espèce Streptomyces, l'espèce Streptococcus, l'espèce Staphylococcus, l'espèce Bacillus, et l'espèce Clostridium. Dans un mode de réalisation spécifique, la cellule hôte utilisée pour produire les oligosaccharides et polysaccharides hybrides décrits dans la présente demande et les bioconjugués comprenant les oligosaccharides et polysaccharides hybrides décrits dans la présente demande est E. coli.
Dans certains modes de réalisation, les cellules hôtes utilisées pour produire les oligosaccharides et polysaccharides hybrides décrits dans le présent document et les bioconjugués comprenant les oligosaccharides et polysaccharides hybrides décrits dans le présent document sont manipulées génétiquement pour comprendre des acides nucléiques, par exemple des acides nucléiques hétérologues qui codent une ou plusieurs protéines supports et/ou des acides nucléiques hétérologues qui codent une ou plusieurs protéines par exemple des gènes codant une ou plusieurs protéines. Dans un mode de réalisation spécifique, les acides nucléiques hétérologues qui codent des protéines impliquées dans les voies de la glycosylation (par exemple voies de glycosylation procaryote et/ou eucaryote) peuvent être introduits dans les cellules hôtes décrites dans la présente demande. Ces acides nucléiques peuvent coder des protéines, y compris, sans limitation, des oligosaccharyl transférases, des épimérases, des flippases, des polymérases, et/ou des glycosyltransférases. Des acides nucléiques hétérologues (par exemple des acides nucléiques qui codent des protéines supports et/ou des acides nucléiques qui codent d'autres protéines, par exemple des protéines impliquées dans la glycosylation) peuvent être introduits dans les cellules hôtes décrites dans la présente demande en utilisant toutes méthodes connues de l'homme du métier, par exemple 1'électroporation, la transformation chimique par choc thermique, la transformation naturelle, la transduction de phage, et la conjugaison. Dans des modes de réalisation spécifiques, les acides nucléiques hétérologues sont introduits dans les cellules hôtes décrites dans la présente demande en utilisant un plasmide, par exemple, les acides nucléiques hétérologues sont exprimés dans les cellules hôtes par le biais d'un plasmide (par exemple un vecteur d'expression). Dans un autre mode de réalisation spécifique, les acides nucléiques hétérologues sont introduits dans les cellules hôtes décrites dans le présent document en utilisant la méthode d'insertion décrite dans la demande de brevet international n° PCT/EP2013/068737.
Dans certains modes de réalisation, des modifications supplémentaires peuvent être introduites (par exemple en utilisant des techniques recombinantes) dans les cellules hôtes décrites dans le présent document. Par exemple, les acides nucléiques des cellules hôtes (par exemple gènes) qui codent des protéines faisant partie d'une voie de glycosylation entrant éventuellement en compétition ou en interférence (par exemple qui entre en compétition ou interfère avec un ou plusieurs gènes hétérologues impliqués dans la glycosylation et qui sont introduits de manière recombinante dans la cellule hôte) peuvent être supprimés ou modifiés au sein de la cellule hôte (génome) d'une manière qui les rend inactif s/dysfontionnels (ce qui veut dire que les acides nucléiques des cellules hôtes qui sont supprimés/modifiés ne codent pas une protéine fonctionnelle ou ne codent pas une protéine d'une manière quelconque). Dans certains modes de réalisation, quand des acides nucléiques sont supprimés du génome des cellules hôtes proposées dans le présent document, ils sont remplacés par une séquence souhaitable, par exemple une séquence utile pour la production d'une glycoprotéine.
Les exemples de gènes pouvant être supprimés dans les cellules hôtes (et dans certains cas remplacés par d'autres séquences d'acides nucléiques désirés) comprennent des gènes des cellules hôtes impliquées dans la biosynthèse des glycolipides tels que waaL (voir par exemple Feldman et al., 2005, PNAS USA 102:3016-3021), le cluster de la biosynthèse du cœur du lipide A (waa) , le cluster du galactose {gai), le cluster de l'arabinose {ara), le cluster de l'acide coionique (wc), le cluster du polysaccharide capsulaire, les gènes de la biosynthèse de 1'undécaprènol-p (par exemple uppS , uppP), les gènes de recyclage und-P, les enzymes métaboliques impliquées dans la biosynthèse du sucre activée par un nucléotide, le cluster de l'antigène commun entérobactérien, et les clusters de la modification de l'antigène O par le prophage comme le cluster gtrABS.
5.2 PROTEINES SUPPORTS
Toute protéine support appropriée à l'utilisation dans la production de vaccins conjugués (par exemple bioconjugués pour l'utilisation dans des vaccins) peut être utilisée dans la présente demande, par exemple des acides nucléiques codant la protéine support peuvent être introduits dans une cellule hôte proposée dans la présente invention pour la production d'un bioconjugué comprenant une protéine support liée à un oligosaccharide et un polysaccharide hybride. Les exemples de protéine support comprennent, sans limitation, l'exotosine A détoxifiée de P. aeruginosa (EPA ; voir par exemple Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61), CRM197, la protéine de liaison au maltose (MBP), le toxoïde de la diphtérie, le toxoïde du tétanos, 1'hémolysine A détoxifiée de S. aureus, le facteur de coagulation A, le facteur de coagulation B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, l'entérotoxine thermolabile de E. coli, des variants détoxifiés de l'entérotoxine thermolabile de E. coli, la toxine du choléra sous-unité B (CTB), la toxine du choléra, des variants détoxifiés de la toxine du choléra, la protéine Sat de E. coli, le domaine passager de la protéine Sat de E. coli, la pneumolysine de Streptococcus pneumoniae et les variants détoxifiés de celle-ci, AcrA de C. jejuni et les glycoprotéines naturelles de C. jejuni. Pour EPA, divers variants de la protéine détoxifiés ont été décrits dans la littérature et pourraient être utilisés comme protéines supports.
Dans certains modes de réalisation, les protéines supports utilisées dans la génération des bioconjugués décrits dans le présent document sont modifiées, par exemple modifiées de telle sorte que la protéine est moins toxique et/ou plus sensible à la glycosylation. Dans un mode de réalisation spécifique, les protéines supports utilisées dans la génération des bioconjugués décrits dans le présent document sont modifiées de telle sorte que le nombre de sites de glycosylation dans les protéines supports est au maximum de manière à administrer des concentrations plus faibles de protéine, par exemple dans une composition immunogénique, sous sa forme bioconjuguée.
Dans certains modes de réalisation, les protéines supports décrites dans le présent document sont modifiées dans le but d'inclure 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sites de glycosylation ou plus que ce qui serait normalement associé à la protéine support (par exemple par rapport au nombre de sites de glycosylation associés à la protéine support dans son état natif/naturel, par exemple de "type sauvage"). Dans des modes de réalisation spécifiques, l'introduction des sites de glycosylation est réalisée par l'insertion de séquences consensus de glycosylation (par exemple Asn-X-Ser(Thr), dans laquelle X peut être tout acide aminé sauf Pro ; ou Asp (Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), dans laquelle X et Z sont choisis indépendamment parmi tout acide aminé naturel sauf Pro (voir le document WO 2006/119987)) n'importe où dans la structure primaire de la protéine. L'introduction de tels sites de glycosylation peut être réalisée par exemple en ajoutant de nouveaux acides aminés à la structure primaire de la protéine (ce qui veut dire que des sites de glycosylation sont ajoutés en entier ou en partie), ou en faisant muter les acides existant dans la protéine afin de générer les sites de glycosylation (ce qui veut dire que les sites de glycosylation ne sont pas ajoutés à la protéine mais que les acides aminés sélectionnés de la protéine sont mutés de manière à former des sites de glycosylation). L'homme du métier conviendra que la séquence d'acides aminés d'une protéine peut être facilement modifiée en utilisant les approches connues de l'état de l'art, par exemple des approches recombinantes qui comprennent la modification de la séquence d'acide nucléique codant la protéine. Dans des modes de réalisation spécifiques, les séquences consensus de glycosylation sont introduites dans des régions spécifiques de la protéine support, par exemple des structures de surface de la protéine, au niveau des terminaisons N ou C de la protéine et/ou dans des boucles qui sont stabilisées par des ponts disulfures à la base de la protéine. Dans certains modes de réalisation, la séquence consensus de glycosylation de 5 acides aminés classique peut être allongée par des résidus de lysine pour une glycosylation plus efficace, et ainsi, la séquence consensus insérée peut coder 5, 6, ou 7 acides aminés qui devront être insérés ou qui remplaceront les acides aminés de la protéine acceptrice. Dans un mode de réalisation particulier, une protéine support est une EPA détoxifiée comprenant 4 séquences consensus de glycosylation Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr.
Dans certains modes de réalisation, les protéines supports utilisées dans la génération des bioconjugués décrits dans le présent document comprennent une "étiquette," c'est-à-dire une séquence d'acides aminés qui permet l'isolation et/ou l'identification de la protéine support. Par exemple, l'addition d'une étiquette à une protéine support décrite dans le présent document peut être utile dans la purification de cette protéine et donc la purification des vaccins conjugués comprenant la protéine support étiquetée. Les exemples d'étiquette pouvant être utilisés ici comprennent, sans limitation, les étiquettes histidine (HIS) (par exemple étiquette hexa histidine, ou 6XHis-Tag), FLAG-TAG, et les étiquettes HA. Dans certains modes de réalisation, les étiquettes utilisées ici sont amovibles, par exemple éliminées par des agents chimiques ou des moyens enzymatiques, une fois qu'elles ne sont plus nécessaires, par exemple après que la protéine a été purifiée.
Dans certains modes de réalisation, les protéines supports décrites dans la présente demande comprennent une séquence signal qui cible la protéine support sur l'espace périplamsique de la cellule hôte qui exprime la protéine support. Dans un mode de réalisation spécifique, la séquence signal vient de E. coli DsbA, de la porine A à membrane externe de E. coli (OmpA) , de la protéine de liaison au maitose de E. coli (MalE) , de la pectate lyase de Erwinia carotovorans (PelB), Flgl, NikA, ou de 1'endoxylanase de l'espèce Bacillus (XynA), de l'entérotoxine thermolabile de E. coli LTIIb, de l'endoxylanase de Bacillus XynA, ou de la flagelline de E. coli (Flgl).
5.3 MECANISME DE GLYCOSYLATION
Les cellules hôtes proposées dans la présente invention comprennent et/ou peuvent être modifiées pour comprendre des acides nucléiques qui codent un mécanisme génétique (par exemple les glycosyltransférases, les flippases, les polymérases, et/ou les oligosaccharyltransférases) capables de produire des oligosaccharides et/ou polysaccharides hybrides ainsi qu'un mécanisme génétique capable de lier ces oligosaccharides et/ou polysaccharides hybrides aux protéines supports.
Glycosyltransférases
Les cellules hôtes proposées dans la présente invention comprennent des acides nucléiques qui codent des glycosyltransférases qui produisent un motif répétitif d'oligosaccharide ou de polysaccharide, ledit motif répétitif ne comprenant pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice et ledit motif répétitif d'oligosaccharide ou de polysaccharide étant dérivé d'un motif répétitif d'oligosaccharide ou de polysaccharide donneur qui comprend un hexose au niveau de l'extrémité réductrice. L'homme du métier sera facilement capable de déterminer quelles glycosyltransférases peuvent être manipulées génétiquement dans une cellule hôte de manière à rendre la cellule hôte capable de produire un motif répétitif d'un oligosaccharide ou d'un polysaccharide hybride basé sur un oligosaccharide ou polysaccharide donneur d'intérêt. En réalité, les glycosyltransférases sont bien connues de l'état de l'art.
Dans un mode de réalisation spécifique, les cellules hôtes proposées dans la présente demande comprennent un acide nucléique qui code une glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur 1'undécaprényl pyrophosphate (UND-PP). Ladite glycosyltransférase peut être dérivée par exemple de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter. Dans un mode de réalisation spécifique, ladite glycosyltransférase est wecA.
Dans un mode de réalisation spécifique, les cellules hôtes proposées dans la présente demande comprennent des acides nucléiques qui codent des glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse du motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur. De telles glycosyltransférases seront facilement évidentes pour l'homme du métier une fois que le motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur en question sera sélectionné.
Dans un mode de réalisation spécifique, lesdites glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des motifs répétitifs de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur comprennent wchL et/ou wchM de S. pneumoniae CP14. Dans un mode de réalisation spécifique, lesdites glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des motifs répétitifs de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur comprennent wciC, wciD, wciE, et/ou wciF de S. pneumoniae CP33F.
Dans un mode de réalisation spécifique, les cellules hôtes proposées dans la présente demande comprennent des acides nucléiques qui codent une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé de monosaccharide hexose assemblé sur l'UND-PP. Dans un mode de réalisation spécifique, lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé de monosaccharide hexose est la galactosyltransférase (wfeD) de Shigella boyedii. Dans un autre mode de réalisation spécifique, lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé de monosaccharide hexose est la galactofuranosyltransférase (wbeY) de E. coli 028. Dans un autre mode de réalisation spécifique, lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé de monosaccharide hexose est la galactofuranosyltransférase (wfdK) de E. coli 0167. Dans un autre mode de réalisation spécifique, lesdites une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé de monosaccharide hexose sont la galactofuranosyltransférase (wbeY) de E. coli 028 et la galactofuranosyltransférase (wfdK) de E. coli 0167.
Dans un autre mode de réalisation spécifique, les cellules hôtes proposées dans la présente demande comprennent des acides nucléiques qui codent des glycosyltransférases qui assemblent le motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sur le dérivé de monosaccharide hexose.
Dans un mode de réalisation, les glycosyltransférases qui assemblent le motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sur le dérivé de monosaccharide hexose comprennent une glycosyltransférase qui est capable d'ajouter le monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif au dérivé de monosaccharide hexose. Les exemples de glycosyltransférases comprennent les galactosyltransférases (wciP), par exemple wciP de E. coli 021.
Dans un mode de réalisation, les glycosyltransférases qui assemblent le motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sur le dérivé de monosaccharide hexose comprennent une glycosyltransférase qui est capable d'ajouter le monosaccharide qui est adjacent au monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur. Les exemples de glycosyltransférases comprennent les glucosyltransférases (wciQ) , par exemple wciQ de E. coli 021.
Oligosaccharyl Transférases
Les oligosaccharyl transférases transfèrent les oligosaccharides liés aux lipides sur les résidus asparagine des chaînes polypeptidiques naissantes qui comprennent un motif consensus de W-glycoxylation par exemple Asn-X-Ser(Thr), dans laquelle X peut être tout acide aminé sauf Pro ; ou Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), dans laquelle X et Z sont choisis indépendamment parmi tout acide aminé naturel sauf Pro (voir le document WO 2006/119987). Voir par exemple les documents WO 2003/074687 et WO 2006/119987, dont les divulgations sont incorporées ici par référence dans leur totalité.
Dans certains modes de réalisation, les cellules hôtes proposées dans la présente demande comprennent des acides nucléiques qui codent une oligosaccharyl transférase. L'acide nucléique qui code une oligosaccharyl transférase peut être native pour la cellule hôte, ou peut être introduite dans la cellule hôte en utilisant des approches génétiques, comme décrit ci-dessus. L'oligosaccharyl transférase peut provenir d'une source quelconque connue de l'état de l'art. Dans un mode de réalisation spécifique, 1 ' oligosaccharyl transférase est une oligosaccharyl transférase de Campylobacter. Dans un autre mode de réalisation spécifique, 1 ' oligosaccharyl transférase est une oligosaccharyl transférase de Campylobacter jejuni (c'est-à-dire pglB ; voir par exemple Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793 ; voir aussi par exemple NCBI Gene ID: 3231775, UniProt n° d'enregistrement 086154). Dans un autre mode de réalisation spécifique, 1'oligosaccharyl transférase est une oligosaccharyl transférase de Campylobacter larl (voir par exemple NCBI Gene ID: 7410986).
Fllppases
Dans certains modes de réalisation, une flippase (Wzx) est introduite dans une cellule hôte décrite dans le présent document (ce qui veut dire que la flippase est hétérologue de la cellule hôte) . Des flippases de divers organismes (par exemple flippases bactériennes) sont connus de l'état de l'art. Les flippases déplacent les motifs répétitifs de type sauvage et/ou leurs motifs répétitifs manipulés génétiquement (hybride) correspondants depuis le cytoplasme dans le périplasme des cellules hôtes (par exemple E. coli).
Dans un mode de réalisation spécifique, une flippase d'une voie de biosynthèse du polysaccharide capsulaire est introduite dans une cellule hôte décrite dans le présent document.
Dans un autre mode de réalisation spécifique, une flippase d'une voie de biosynthèse du polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae est introduite dans une cellule hôte décrite dans le présent document. Dans certains modes de réalisation, la flippase introduite dans les cellules hôtes décrites dans le présent document est le gène wzx provenant d'un cluster de gène du polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6 (A et B), CP7 (A,B, C) , CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A,B,C,F), CPU (A, B,C,D,F), CP12 (A,B,F), CPI 3, CP14 CP15 (A,B,C,F), CP16 (A,F) , CP17 (A,F), CPI 8 (A, B, C, F) , CP19 (A,B,C,F), CP20, CP21, CP22 (A, F) , CP23 (A,B,F), CP2 4 (A,B,F), CP25 (A,F) , CP26, CP27, CP28 (A, F), CP29, CP31, CP32 (A, F) , CP33 (A,B,C,D, F), CP34, CP35 (A,B,C,D,F), CP36, CP37, CP38, CP39, CP40, CP41 (A,F), CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47 (A, F) , ou CP48. Dans un mode de réalisation spécifique, la flippase introduite dans les cellules hôtes décrites dans le présent document est le gène wzx provenant d'un cluster de gène du polysaccharide capsulaire de CP8, CP15A, CPI 6F, CP22F, CP23A, CP24F, CP31, CP33F, CP35B, ou CP38. D'autres flippases qui peuvent être introduites dans les cellules hôtes décrites dans le présent document proviennent de S. pneumoniae décrites dans Bentley SD, Aanensen DM,
Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from ail 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31).
Dans certains modes de réalisation, la flippase introduite dans les cellules hôtes décrites dans le présent document provient de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
Polymerases
Dans certains modes de réalisation, une polymérase (Wzy) est introduite dans une cellule hôte décrite dans le présent document (ce qui veut dire que la polymérase est hétérologue de la cellule hôte). Des polymérases de divers organismes (par exemple polymérases bactériennes) sont connues de l'état de 1'art.
Dans un mode de réalisation spécifique, une polymérase d'une voie de biosynthèse du polysaccharide capsulaire est introduite dans une cellule hôte décrite dans le présent document.
Dans un autre mode de réalisation spécifique, une polymérase d'une voie de biosynthèse du polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae est introduite dans une cellule hôte décrite dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, la polymérase introduite dans les cellules hôtes décrites dans le présent document est le gène wzy provenant d'un cluster de gène du polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae CPI, CP2, CP4, CP5, CP6 (A et B), CP7 (A,B, C) , CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A, B, C, F) , CPU (A, B, C, D, F) , CP12 (A, B, F) , CP13, CP14 CP15 (A, B, C, F) , CPI 6 (A, F), CP17 (A, F) , CP18 (A, B, C, F) , CP19 (A, B, C, F) , CP2 0, CP21, CP22 (A, F) , CP23 (A, B, F), CP24 (A, B, F), CP2 5 (A, F), CP26, CP27, CP28 (A, F) , CP29, CP31, CP32 (A, F) , CP33 (A,B,C,D,F), CP34, CP35 (A,B,C,D,F), CP36, CP37, CP38, CP39, CP40, CP41 (A, F) , CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47 (A,F), ou CP48. Dans un mode de réalisation spécifique, la polymérase introduite dans les cellules hôtes décrites dans le présent document est le gène wzy provenant d'un cluster de gène du polysaccharide capsulaire de CP8, CP15A, CP16F, CP22F, CP23A, CP24F, CP31, CP33F, CP35B, ou CP38. D'autres polymérases qui peuvent être introduites dans les cellules hôtes décrites dans le présent document viennent de S. pneumoniae décrites dans Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from ail 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31).
Dans certains modes de réalisation, la polymérase introduite dans les cellules hôtes décrites dans le présent document provient de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce
Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce
Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce
Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce
Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
Enzymes qui modifient les monosaccharides
Dans certains modes de réalisation, des enzymes capables de modifier des monosaccharides sont introduites dans une cellule hôte décrite dans le présent document (ce qui veut dire que les enzymes capables de modifier des monosaccharides sont hétérologues de la cellule hôte). Ces enzymes comprennent par exemple des épimérases et des racémases.
Les épimérases et les racémases de divers organismes (par exemple épimérases et racémases bactériennes) sont connues de l'état de l'art. Dans certains modes de réalisation, les épimérases et/ou les racémases introduites dans les cellules hôtes décrites dans le présent document proviennent de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
Dans un mode de réalisation spécifique, l'épimérase Z3206 de E. coli 0157 est introduite dans les cellules hôtes décrites dans le présent document.
5.4 BIOCONJUGUES
Dans certains modes de réalisation, les cellules hôtes décrites dans le présent document peuvent être utilisées pour produire des bioconjugués comprenant un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride décrit dans le présent document lié à une protéine support. Les méthodes pour la production de ces bioconjugués en utilisant des cellules hôtes sont bien connues de l'état de l'art. Voir par exemple les documents WO 2003/074687 et WO 2006/119987, chacun d'eux étant incorporé ici par référence dans leur totalité.
Les bioconjugués tels que décrits dans le présent document ont des propriétés avantageuses par rapport aux glycoconjugués produits chimiquement, par exemple les bioconjugués nécessitent moins de produits chimiques dans leur fabrication et sont plus résistants en termes de produit final généré. Donc, les bioconjugués sont préférés par rapport aux glycoconjugués produits chimiquement.
Les cellules hôtes et les méthodes décrites ici permettent la production de nouvelles structures saccharides hybrides dans lesquelles le motif répétitif usuel d'un saccharide particulier est utilisé pour la majorité du saccharide final mais le premier motif répétitif contient un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice. Ces saccharides hybrides ont l'avantage de conserver la structure native pour la plupart du saccharide de manière à conserver les antigènes usuels, mais la présence d'un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice de l'oligosaccharide ou du polysaccharide assemblé lui permet d'être un substrat approprié pour les glycosyltransférases telles que PglB, permettant une efficacité accrue dans la fixation de ces saccharides hyrbrides sur une protéine support pour fabriquer un bioconjugué.
Un autre mode de réalisation de l'invention est un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride présentant une structure (B)n-A- dans laquelle A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 monosaccharides, avec un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice (indiqué par une flèche); dans laquelle B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 monosaccharides ; dans laquelle A et B sont des motifs répétitifs d'oligosaccharide différents ; et dans laquelle n est au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou au moins 200.
Dans un mode de réalisation, A est un oligosaccharide ne contenant pas plus de 20, 15, 12, 10, 9, ou 8 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, B est un oligosaccharide ne contenant pas plus de 20, 15, 12, 10, 9, ou 8 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, A et B sont des oligosaccharides ne contenant pas plus de 20, 15, 12, 10, 9, ou 8 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, n n'est pas supérieur à 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 ou 5.
Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 3 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 3 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 3 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 3 monosaccharides et n est au moins 5. Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 3 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 3 monosaccharides et n est au moins 20.
Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 4 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 4 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 4 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 4 monosaccharides et n est au moins 5. Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 4 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 4 monosaccharides et n est au moins 20.
Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 5 monosaccharides et B is est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 5 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 5 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 5 monosaccharides et n est au moins 5. Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 5 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 5 monosaccharides et n est au moins 20.
Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 6 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 6 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 6 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 6 monosaccharides et n est au moins 5. Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 6 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant au moins 6 monosaccharides et n est au moins 20.
Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant entre 2 et 8 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant entre 2 et 8 monosaccharides. Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant entre 2 et 8 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant entre 2 et 8 monosaccharides et n est au moins 5 et n'est pas supérieur à 500. Dans un mode de réalisation, A est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant entre 2 et 8 monosaccharides et B est un motif répétitif d'oligosaccharide contenant entre 2 et 8 monosaccharides et n est au moins 20 et n'est pas supérieur à 100.
Dans un mode de réalisation de l'oligosaccharide ou du polysaccharide hybride, le motif répétitif de l'oligosaccharide B contient un monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du motif répétitif. Dans un mode de réalisation de l'oligosaccharide ou du polysaccharide hybride, le monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du motif répétitif est choisi dans le groupe constitué par le glucose, le galactose, le rhamnose, 1'arabinotol, le fucose et le mannose ; de manière appropriée, le groupe se compose du glucose et du galactose.
Dans un mode de réalisation de l'oligosaccharide ou du polysaccharide hybride, le motif répétitif de l'oligosaccharide de A et le motif répétitif de l'oligosaccharide de B diffèrent seulement en ce qu'ils contiennent un monosaccharide différent au niveau de l'extrémité réductrice du motif répétitif.
Dans un mode de réalisation de l'oligosaccharide ou du polysaccharide hybride, le motif répétitif de l'oligosaccharide de A est le motif répétitif du saccharide capsulaire d'un saccharide capsulaire bactérien Gram positif, par exemple un saccharide capsulaire streptococcique du groupe A, un saccharide capsulaire streptococcique du groupe B, un saccharide capsulaire de Streptocuccus pneumoniae, un saccharide capsulaire enterococcique ou un un saccharide capsulaire de Staphylococcus aureus ; par exemple le motif répétitif du saccharide capsulaire d'un Streptococcus pneumoniae de sérotype 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10A, 10B, IOC, 10F, 11A, 11B, 11C, HD, 11F, 12A, 12B, 12F, 13, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 16A, 16F, 17A, 17F, 18A, 18B, 18C, 18F, 19A, 19B, 19C, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24A, 24B, 24F, 25A, 25F, 26, 27, 28A, 28F, 29, 31, 32A, 32F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33F, 34, 35A, 35B, 35C, 35D, 35F, 36, 37, 38, 39, 40, 41A, 41F, 42, 43, 44, 45, 46, 47A, 47F ou 48 ; de manière appropriée de sérotypes 8, 12F, 14, 15A, 16F, 22F, 23A, 24F, 31, 33F, 35B ou 38.
Dans un mode de réalisation de l'oligosaccharide ou du polysaccharide hybride, le motif répétitif de l'oligosaccharide de A est le motif répétitif du saccharide capsulaire d'un saccharide capsulaire streptococcique du groupe B, choisi parmi les sérotypes Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII ou VIII,
Dans un mode de réalisation de l'oligosaccharide ou du polysaccharide hybride, le motif répétitif de l'oligosaccharide de A est le motif répétitif d'un saccharide capsulaire de Staphylococcus aureus de sérotype 5 ou de sérotype 8, ou de Enterococcus faecalis de sérotype A, B, C ou D.
Un autre aspect de l'invention est un bioconjugué comprenant une protéine support telle que décrite dans le présent document, liée aux oligosaccharides ou polysaccharides hybrides décrits ci-dessus.
Un autre aspect de l'invention est un bioconjugué comprenant une protéine support liée en N à un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride, ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride étant identique à un oligosaccharide ou polysaccharide hybride, à l'exception du fait que l'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif en plus de comprendre la totalité des monosaccharides de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur. En d'autres termes, un bioconjugué comprenant une protéine support contenant une séquence consensus Asn-X-Ser/Thr, dont le résidu asparagine est lié à un oligosaccharide ou polysaccharide hybride, où ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride contient au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 , 40 ou 50 motifs répétitifs saccharide d'un oligosaccharide ou polysaccharide donneur et un autre motif répétitif lié en N à la protéine support dans laquelle un dérivé de monosaccharide hexose est situé au niveau de l'extrémité réductrice dudit autre motif répétitif.
Dans un mode de réalisation, le dérivé de monosaccharide hexose est tout monosaccharide dans lequel la position C-2 est modifiée par un groupe actémido. Des dérivés appropriés de monosaccharide hexose commprennent la N-acétylglucosamine (GlcNAc), la N-acétylgalactoseamine (GalNAc), HexNAc, désoxy HexNAc, la 2,4-diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose (DATDH), la N-acétylfucoseamine (FucNAc), ou la N-acétylquinovosamine (QuiNAc). Un dérivé de monosaccharide hexose approprié est la N-acétylglucosamine (GlcNAc).
Dans un mode de réalisation, l'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride est identique à un saccharide capsulaire bactérien Gram positif, à l'exception du fait que l'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif à la place du monosaccharide hexose normalement présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif dudit saccharide capsulaire bactérien Gram positif.
Dans un mode de réalisation, le saccharide capsulaire bactérien Gram positif est un saccharide capsulaire streptococcique du groupe A, un saccharide capsulaire streptococcique du groupe B, un saccharide capsulaire de Streptocuccus pneumoniae, un saccharide capsulaire entérococcique ou un saccharide capsulaire de Staphylococcus aureus. Le terme saccharide comprend à la fois l'oligosaccharide et le polysaccharide.
Dans un mode de réalisation, le saccharide capsulaire bactérien Gram positif est un saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10A, 10B, IOC, 10F, 11A, 11B, 11C, HD, 11F, 12A, 12B, 12F, 13, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 16A, 16F, 17A, 17F, 18A, 18B, 18C, 18F, 19A, 19B, 19C, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24A, 24B, 24F, 25A, 25F, 26, 27, 28A, 28F, 29, 31, 32A, 32F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33F, 34, 35A, 35B, 35C, 35D, 35F, 36, 37, 38, 39, 40, 41A, 41F, 42, 43, 44, 45, 46, 47A, 47F ou 48 ; de manière appropriée un saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 8, 12F, 14, 15A, 16F, 22F, 23A, 24F, 31, 33F, 35B ou 38.
Dans un mode de réalisation, le saccharide capsulaire bactérien Gram positif est un saccharide capsulaire de S. aureus de sérotype 5 ou 8.
Dans un mode de réalisation, le saccharide capsulaire bactérien Gram positif est un saccharide capsulaire de
Streptococcus agalactiae (Streptococcus du groupe B) de sérotype Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII ou VIII.
Dans un mode de réalisation, le saccharide capsulaire bactérien Gram positif est un saccharide capsulaire de
Enterococcus faecalis de sérotype A, B, C ou D.
Dans un mode de réalisation, la protéine support est l'exotoxine A détoxifiée de P. aeruginosa (EPA), CRM197, la protéine de liaison au maltose (MBP), le toxoïde de la diphtérie, le toxoïde du tétanos, 1'hémolysine A détoxifiée de S. aureus, le facteur de coagulation A, le facteur de coagulation B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, l'entérotoxine thermolabile de E. coli, des variants détoxifiés de l'entérotoxine thermolabile de E. coli, la toxine du choléra sous-unité B (CTB), la toxine du choléra, des variants détoxifiés de la toxine du choléra, la protéine Sat de E. coli, le domaine passager de la protéine Sat de E. coli, la pneumolysine de Streptococcus pneumoniae et ses variants détoxifiés, la protéine PhtD de Streptococcus pneumoniae, AcrA de C. jejuni, une glycoprotéine naturelle de C. jejuni, PcrV (aka LcrV,EspA, SseB), PopB (YopB, YopD, FliC), ou OprF, Oprl. Dans un mode de réalisation, chaque protéine support contient au moins 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 séquences consensus de glycosylation (par exemple Asn-X-Ser/Thr, plus particulièrement Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr,dans laquelle X et Z peut être tout acide aminé naturel sauf Pro.
5.5 COMPOSITIONS
Compositions comprenant les cellules hôtes
Dans un aspect, on propose des compositions comprenant les cellules hôtes décrites dans le présent document. Ces compositions peuvent être utilisées dans des méthodes pour générer les bioconjugués décrits ici, par exemple les compositions peuvent être cultivées dans des conditions appropriées pour la production des protéines. Par la suite, les bioconjugués peuvent être isolés desdits compositions en utilisant des méthodes connues de l'état de l'art.
Les compositions comprenant les cellules hôtes proposées ici peuvent comprendre des composants supplémentaires appropriés pour l'entretien et la survie des cellules hôtes décrites ici, et peuvent en outre comprendre des composants additionnels nécessaires ou bénéfiques pour la production des protéines par les cellules hôtes, par exemple des inducteurs pour les promoteurs inductibles, comme l'arabinose, l'IPTG.
Compositions comprenant des bioconjugués
Dans un autre aspect, on propose des compositions (par exemple des compositions pharmaceutiques) comprenant un ou plusieurs des bioconjugués décrits ici. Dans un mode de réalisation spécifique, une composition proposée dans la présente demande comprend un ou plusieurs des bioconjugués décrits dans le présent document. Les compositions décrites dans le présent document sont utiles dans le traitement et la prévention de l'infection bactérienne chez des sujets (par exemple sujets humains) avec des bactéries connues pour avoir des oligosaccharides et/ou polysaccharides antigéniques.
Dans un mode de réalisation spécifique, on propose dans la présente demande une composition comprenant un bioconjugué, ledit bioconjugué comprenant un polysaccharide capsulaire hybride de S. pneumoniae. Dans un autre mode de réalisation spécifique, on propose dans la présente demande une composition comprenant deux bioconjugués, lesdits bioconjugués comprenant chacun un polysaccharide capsulaire hybride de S. pneumoniae différent (c'est-à-dire une composition bivalente). Dans un autre mode de réalisation spécifique, on propose dans la présente demande une composition comprenant trois bioconjugués, lesdits bioconjugués comprenant chacun un polysaccharide capsulaire hybride de S. pneumoniae différent (c'est-à-dire une composition trivalente). Dans un mode de réalisation spécifique, ledit polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae est CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6 (A, B), CP7 (A, B, C) , CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A, B, C, F), CPU (A, B, C, D, F), CP12 (A, B, F), CP13, CP14, CP15 (A, B, C, F), CP16 (A, F), CP17 (A, F), CPI 8 (A, B, C, F), CP19 (A, B, C, F), CP20, CP21, CP22 (A, F), CP23 (A, B, F), CP24 (A, B, F), CP25 (A, F), CP 26, CP2 7, CP28 (A, F), CP29, CP31, CP32 (A, F), CP33 (A, B, C, D, F), CP34, CP35 (A, B, C, D, F), CP36, CP37, CP38, CP39, CP4 0, CP41 (A, F), CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47 (A, F), ou CP48. Dans un mode de réalisation spécifique, ladite composition trivalente comprend (i) un bioconjugué comprenant un polysaccharide capsulaire hybride de S. pneumoniae CPI ; (ii) (i) un bioconjugué comprenant un polysaccharide capsulaire hybride de S. pneumoniae CP4 ; et (iii) (i) un bioconjugué comprenant un polysaccharide capsulaire hybride de S. pneumoniae CP14.
Dans un mode de réalisation spécifique, on propose dans la présente demande une composition comprenant un bioconjugué, ledit bioconjugué comprenant un polysaccharide capsulaire hybride de Staphylococcus aureus, par exemple le polysaccharide capsulaire de S. aureus est CP5 ou CP8.
Dans un mode de réalisation spécifique, on propose dans la présente demande une composition comprenant un bioconjugué, ledit bioconjugué comprenant un polysaccharide capsulaire hybride de Streptococcus agalactiae (GBS), par exemple S. agalactiae (groupe B, GBS) CPIa, CPIb, CPU, CPIII, CPIV, CPV, CPVI, CPVII, ou CPVIII.
Dans un mode de réalisation spécifique, on propose dans la présente demande une composition comprenant un bioconjugué, ledit bioconjugué comprenant un polysaccharide capsulaire hybride de Enterococcus faecalis, par exemple un polysaccharide capsulaire Enterococcus faecalis CPA, CPB, CPC, ou CPD.
Dans certains modes de réalisation, en plus de comprendre un bioconjugué décrit dans la présente demande (les compositions (par exemple les compositions pharmaceutiques) décrites dans la présente demande, comprennent un support pharmaceutiquement acceptable. Tel qu'il est utilisé ici, le terme "pharmaceutiquement acceptable" signifie approuvé par l'Agence de Réglementation du Gouvernement fédéral ou du Gouvernement d'un Etat ou spécifié dans la liste de la Pharmacopée U. S. ou autres pharmacopées reconnues en général pour une utilisation chez les animaux, et en particulier chez les humains. Le terme "support," tel qu'il est utilisé dans le contexte d'un support pharmaceutiquement acceptable, désigne un diluant, un adjuvant, un excipient, ou un véhicule avec lequel est administrée la composition pharmaceutique. Les solutions de liquide physiologique et les solutions aqueuses de dextrose et de glycérol solutions peuvent aussi être utilisées dans des supports liquides, en particulier pour solutions injectables. Les excipients appropriés comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, la gélatine, le malt, le riz, la farine, la chaux, le gel de silice, le stéarate de sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé en poudre, le glycérol, le propylène, le glycol, l'eau, l'éthanol et similaire. Les exemples de supports pharmaceutiques appropriés sont décrits dans "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin.
Les compositions comprenant les bioconjugués décrits dans le présent document peuvent comprendre tout composant supplémentaire pour une utilisation dans l'administration pharmaceutique. Dans des modes de réalisation spécifiques, les compositions décrites dans le présent document sont des formulations monovalentes. Dans d'autres modes de réalisations, les compositions décrites dans le présent document sont des formulations multivalentes, par exemple formulations bivalentes, trivalentes, et tétravalentes. Par exemple, une formulation multivalente comprend plus d'un bioconjugué décrit dans le présent document.
Dans certains modes de réalisation, les compositions décrites dans le présent document comprennent en plus un conservateur, par exemple le dérivé de mercure thimérosal. Dans un mode de réalisation spécifique, les compositions pharmaceutiques décrites dans le présent document comprennent 0,001% à 0,01% de thimérosal. Dans d'autres modes de réalisations, les compositions pharmaceutiques décrites dans le présent document ne comprennent pas de conservateur.
Dans certains modes de réalisation, les compositions pharmaceutiques décrites dans le présent document (par exemple les compositions immunogéniques) comprennent, ou sont administrées en combinaison avec un adjuvant. L'adjuvant pour l'administration en combinaison avec une composition décrite dans le présent document peut être administrée avant, simultanément ou après l'administration de ladite composition. Dans certains modes de réalisation, le terme "adjuvant" désigne un composé qui, une fois administré en conjonction ou en tant que partie d'une composition décrite dans la présente demande, augmente, accentue et/ou booste la réponse immunitaire à un bioconjugué mais, une fois administré seul, le composé ne génère pas de réponse immunitaire au bioconjugué. Dans certains modes de réalisation, l'adjuvant génère une réponse immunitaire au polypeptide bioconjugué et ne produit pas d'allergie ou autre réaction négative. Les adjuvants peuvent renforcer une réponse immunitaire par le biais de plusieurs mécanismes, y compris, par exemple, le recrutement des lymphocytes, la stimulation des lymphocytes B et/ou T, et la stimulation des macrophages.
Les exemples spécifiques d'adjuvants comprennent, mais sans y être limités, les sels d'aluminium (alun) (comme 1'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium, et le sulfate d'aluminium), le monophosphoryl lipide A 3-dés-0-acylé (MPL) (voir brevet du Royaume-Uni GB2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), le polysorbate 80 (Tween 80 ; ICL Americas, Inc.), les composés imidazopyridine (voir la demande internationale n° PCT/US2007/064857, publiée en tant que publication internationale n° W02007/109812), les composés imidazoquinoxaline (voir la demande internationale n° PCT/US2007/064858, publiée en tant que publication internationale n° W02007/109813) et les saponines, comme QS21 (voir Kensil et al., dans Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); U.S. Pat. No. 5,057,540). Dans certains modes de réalisation, l'adjuvant est l'adjuvant de Freund (complet ou incomplet). Les autres adjuvants sont les émulsions huile dans eau (comme le squalène ou l'huile d'arachide), éventuellement en combinaison avec stimulants immunitaires, comme le monophosphoryl lipide A (voir Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Un autre adjuvant est CpG (Bioworld Today,
Nov. 15, 1998) .
Dans certains modes de réalisation, les compositions décrites dans la présente deamnde sont formulées pour être appropriées à la voie d'administration voulue chez un sujet. Par exemple, les compositions décrites dans la présente demande peuvent être formulées pour être appropriées à l'administration sous-cutanée, parentérale, orale, intradermique, transdermique, colorectale, intrapéritonéenne, et rectale. Dans un mode de réalisation spécifique, la composition pharmaceutique peut être formulée pour l'administration intraveineuse, orale, intrapéritonéenne, intranasale, intratrachéale, sous-cutanée, intramusculaire, topique, intradermique, transdermique ou pulmonaire.
Dans certains modes de réalisation, les compositions décrites dans la présente demande comprennent en plus un ou plusieurs tampons, par exemple un tampon de phosphate et un tampon de saccharose phosphate glutamate. Dans d'autres modes de réalisation, les compositions décrites dans le présent document ne comprennent pas de tampon.
Dans certains modes de réalisation, les compositions décrites dans le présent document comprennent en plus un ou plusieurs sels, par exemple chorure de sodium, chorure de calcium, phosphate de sodium, glutamate monosodique, et sels d'aluminium (par exemple hydroxyde d'aluminium, phosphate d'aluminium,, alun (sulfate de potassium aluminium), ou un mélange de ces sels d'aluminium). Dans d'autres modes de réalisation, les compositions décrites dans le présent document ne comprennent pas de sels.
Les compositions décrites dans le présent document peuvent être incluses dans un récipient, un pack, ou un distributeur, conjointement avec les instructions pour leur administration.
Les compositions décrites dans le présent document peuvent être stockées avant utilisation, par exemple, les compositions peuvent être stockées congelées (par exemple à environ -20°C ou à environ -70°C) ; stockées dans des conditions réfrigérées (par exemple à environ 4°C) ; ou stockées à température ambiante.
5.6 UTILISATIONS PROPHYLACTIQUES ET THERAPEUTIQUES
On propose dans le présent document des méthodes pour le traitement et/ou la prévention des infections bactériennes chez un sujet, consistant à administrer au sujet un bioconjugué décrit dans le présent document ou une composition décrite dans le présent document. Dans un mode de réalisation spécifique, les compositions décrites dans le présent document sont utilisées dans la prévention de l'infection chez un sujet (par exemple, sujets humains) par une bactérie. Les infections bactériennes pouvant être traitées et/ou évitées en utilisant les bioconjugués et/ou les compositions décrits dans le présent document comprennent celles provoquées par l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xhantomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia, l'espèce Aeromonas, l'espèce Francisella, l'espèce Helicobacter, l'espèce Proteus, l'espèce Lactococcus, l'espèce Lactobacillus, l'espèce Pseudomonas, l'espèce Corynebacterium, l'espèce Streptomyces, l'espèce Streptococcus, l'espèce
Enterococcus, l'espèce Staphylococcus, l'espèce Bacillus, l'espèce Clostridium, l'espèce Listeria, ou l'espèce Campylobacter. Dans un mode de réalisation spécifique, un bioconjugué décrit dans le présent document ou une composition décrite dans le présent document est utilisé(e) pour traiter ou éviter une infection par l'espèce Streptococcus.
On propose également dans la présente demande des méthodes pour induire une réponse immunitaire chez un sujet contre une bactérie, consistant à administrer au sujet un bioconjugué décrit dans le présent document (ou une composition décrite dans le présent document. Dans un mode de réalisation, ledit sujet a une infection bactérienne au moment de l'administration. Dans un autre mode de réalisation, ledit sujet n'a pas d'infection bactérienne au moment de l'administration. Les bioconjugués et/ou les compositions proposés dans le présent document peuvent être utilisés pour induire une réponse immunitaire contre l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xhantomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia, l'espèce Aeromonas, l'espèce Francisella, l'espèce Helicobacter, l'espèce Proteus, l'espèce Lactococcus, l'espèce Lactobacillus, l'espèce Pseudomonas, l'espèce Corynebacterium, l'espèce Streptomyces, l'espèce Streptococcus, l'espèce Enterococcus, l'espèce Staphylococcus, l'espèce Bacillus, l'espèce Clostridium, l'espèce Listeria, ou l'espèce Campylobacter. Dans un mode de réalisation spécifique, un bioconjugué décrit dans le présent document ou une composition décrite dans le présent document est utilisé(e) pour induire une réponse immunitaire contre l'espèce Streptococcus.
On propose également dans le présent document des méthodes pour induire la production d'anticorps opsonophagocytiques chez un sujet contre une bactérie, consistant en l'administration au sujet d'un bioconjugué décrit dans le présent document (ou d'une composition décrite dans le présent document) . Dans un mode de réalisation, ledit sujet a une infection bactérienne au moment de l'administration. Dans un autre mode de réalisation, ledit sujet n'a pas d'infection bactérienne au moment de l'administration. Les bioconjugués et/ou les compositions proposés dans le présent document peuvent être utilisés pour induire la production d'anticorps opsonophagocytiques contre l'espèce Escherichia, l'espèce Shigella, l'espèce Klebsiella, l'espèce Xhantomonas, l'espèce Salmonella, l'espèce Yersinia, l'espèce Aeromonas, l'espèce Francisella, l'espèce Helicobacter, l'espèce Proteus, l'espèce Lactococcus, l'espèce Lactobacillus, l'espèce Pseudomonas, l'espèce Corynebacterium, l'espèce Streptomyces, l'espèce Streptococcus, l'espèce Enterococcus, l'espèce Staphylococcus, l'espèce Bacillus, l'espèce Clostridium, l'espèce Listeria, ou l'espèce Campylobacter. Dans un mode de réalisation spécifique, un bioconjugué décrit dans le présent document ou une composition décrite dans le présent document est utilisé(e) pour induire la production d'anticorps opsonophagocytiques contre l'espèce Streptococcus.
Thérapies combinées
Dans certains modes de réalisation, un bioconjugué décrit dans le présent document ou une composition décrite dans le présent document est administré(e) à un sujet en combinaison avec une ou plusieurs thérapies (par exemple thréapies antibactériennes ou immunomodulatoires). La thérapie ou les multiples thérapies peuvent être bénéfiques dans le traitement ou la prévention d'une infection bactérienne ou peuvent améliorer un symptôme ou un état associé à une infection bactérienne. Dans certains modes de réalisation, la thérapie ou les multiples thérapies sont des médicaments analgésiques ou antipyrétiques. Dans certains modes de réalisation, les thérapies sont administrées à moins de 5 minutes de distance, à moins de 30 minutes de distance, à 1 heure de distance, à environ 1 heure de distance, entre environ 1 à environ 2 heures de distance, entre environ 2 heures à environ 3 heures de distance, entre environ 3 heures à environ 4 heures de distance, entre environ 4 heures à environ 5 heures de distance, entre environ 5 heures à environ 6 heures de distance, entre environ 6 heures à environ 7 heures de distance, entre environ 7 heures à environ 8 heures de distance, entre environ 8 heures à environ 9 heures de distance, entre environ 9 heures à environ 10 heures de distance, entre environ 10 heures à environ 11 heures de distance, entre environ 11 heures à environ 12 heures de distance, entre environ 12 heures à 18 heures de distance, 18 heures à 24 heures de distance, 24 heures à 36 heures de distance, 36 heures à 48 heures de distance, 48 heures à 52 heures de distance, 52 heures à 60 heures de distance, 60 heures à 72 heures de distance, 72 heures à 84 heures de distance, 84 heures à 96 heures de distance, ou 96 heures à 120 heures de distance.
Tout agent antibactérien connu de l'homme du métier peut être utilisé en combinaison avec un bioconjugué décrit dans le présent document ou une composition décrite dans le présent document. Les exemples non limitatifs de ces agents antibactériens sont l'amikacine, l'amoxicilline, 1'amoxicillin-acide clavulanique, 1'amphothéricine-B, l'ampicilline, 1'ampicilline-sulbactame, 1'apramycine, 1'azithromycine, 1'aztréoname, la bacitracine, la benzylpénicilline, la caspofungine, le céfaclor, le céfadroxil, la céfalexine, la céfalothine, la céfazoline, le céfdinir, le céfépime, le céfixime, le céfménoxime, la céfopérazone, le céfopérazone-sulbactame, le céfotaxime, la céfoxitin, le céfpirome, le céfpodoxime, le céfpodoxime-acide clavulanique, le céfpodoxime-sulbactame, le céfprozil, le céfquinome, le céftazidime, la céftibutine, le céftiofur, le céftobiprole, le céftriaxon, le céfuroxime, le chloramphénicole, le florfénicole, la Ciprofloxacine, la Clarithromycine, la clinafloxacine, la clindamycine, la cloxacilline, la colistine, le cotrimoxazol (triméthoprime/ sulphamethoxazole) , la dalbavancine, la dalfopristine/ la quinopristine, la daptomycine, la dibékacine, la dicloxacilline, le doripénem, la doxycycline, 1'enrofloxacine, 1'ertapénem, l'érythromycine, la flucloxacilline, le fluconazol, la flucytosine, la fosfomycine, l'acide fusidique, la garénoxacine, la gatifloxacine, la gémifloxacine, la gentamicine, l'imipénem, 1'itraconazole, la kanamycine, le kétoconazole, la lévofloxacine, la lincomycine, le linézolide, le loracarbef, le mécillnam (1'amdinocilline), le méropénem, le métronidazole, la méziocilline, le mézlocilline-sulbactame, la minocycline, la moxifloxacine, la mupirocine, l'acide nalidixique, la néomycine, la nétilmicine, la nitrofurantoïne, la norfloxacine, 1'ofloxacine, 1'oxacilline, la péfloxacine, la pénicilline V, la pipéracilline, le pipéracilline- sulbactame, le pipéracilline-tazobactame, la rifampicine, la roxythromycine, la sparfloxacine, la spectinomycine, la spiramycine, la streptomycine, le sulbactame, le suifaméthoxazole, la téicoplanine, la télavancine, la télithromycine, la témocilline, la tétracycline, la ticarcilline, la ticarcilline-acide clavulanique, la tigécycline, la tobramycine, le triméthoprime, la trovafloxacine, la tylosine, la vancomycine, la virginiamycine, et le voriconazole.
Dans certains modes de réalisation, une thérapie combinée comprend l'administration de deux conjugués ou plus, décrits dans le présent document (voir section 5.4) et/ou compositions décrites dans le présent document.
Dosage et fréquence de l'administration
La quantité d'un bioconjugué décrit dans la présente demande ou d'une composition décrite dans la présente demande qui sera efficace dans le traitement et/ou la prévention d'une infection bactérienne dépendra de la nature de la maladie, et peut être déterminée par des techniques cliniques standards. L'administration du bioconjugué et/ou de la composition peut se faire par le biais de diverses voies connues par le médecin,p ar exemple la voie sous-cutanée, parentérale, intraveineuse, intramusculare, topique, orale, intradermique, transdermique, intranasale, etc. Dans un mode de réalisation, l'administration se fait par injection intramusculaire.
Le dosage précis à utiliser dans la formulation dépendra également de la voie d'administration, et de la gravité de l'infection, et devra être décidé en fonction de l'appréciation du médecin et des situations personnelles des sujets. Par exemple, des dosages efficaces peuvent varier en fonction des moyens d'administration, le site cible, l'état physiologique du patient (y compris l'âge, le poids, la santé), que le patient soit humain ou animal, des autres médicaments administrés et si le traitement est prophylactique ou thérapeutique. Les dosages de traitement sont titrés de manière optimale pour optimiser la sécurité et l'efficacité.
Dans certains modes de réalisation, un essai in vitro est utilisé pour aider à identifier des plages de dosage optimal. Voir Section 5.7. Les doses efficaces peuvent être extrapolées à partir des courbes dose - réponse dérivées de systèmes de test in vitro ou de modèles animaux.
Dans certains modes de réalisation, les exemples de dosage pour les vaccins à base de bioconjugué (par exemple compositions comprenant des bioconjugués) vont d'environ 0,1 pg à 400 pg d'hydrate de carbone par dose. Dans d'autres modes de réalisation, les exemples de dosage pour les vaccins à base de glycoconjugués (par exemple compositions comprenant des bioconjugués) vont d'environ 0,1 pg à 4000 pg de protéine(s) par dose. Dans certains modes de réalisation, un exemple de dosage pour un vaccin à base de glycoconjugué (par exemple compositions comprenant des bioconjugués) comprend 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 pg d'hydrate (s) de carbone par dose.
Dans certains modes de réalisation, un exemple de dosage pour un vaccin à base de glycoconjugué (par exemple compositions comprenant des bioconjugués) comprend 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 pg de protéine (s) par dose. Dans certains exemples de mode de réalisation, un dosage pour l'administration à un humain correspond à 0,5 ml contenant environ 1-10, par exemple environ 2-6, par exemple environ 4 pg de polysaccharide pour chacun des glycoconjugués inclus.
Dans certains modes de réalisation, un bioconjugué décrit dans la présente demande ou une composition décrite dans la présente demande est administré à un sujet une fois sous forme de dose unique. Dans certains modes de réalisation, un bioconjugué décrit dans la présente demande ou une composition décrite dans la présente demande est administré à un sujet sous forme de dose unique, suivi d'une seconde dose 3 à 6 semaines plus tard. Selon ces modes de réalisation, des inoculations de rappel peuvent être administrées au sujet dans des intervalles de 6 à 12 mois à la suite de la seconde inoculation. Dans certains modes de réalisation, les inoculations de rappel peuvent utiliser un bioconjugué ou une composition différents. Dans certains modes de réalisation, l'administration du même bioconjugate ou de la même composition peut être répétée et les administrations peuvent être séparées d'au moins 1 jour, 2 jours, 3 jours, 5 jours, 7 jours, 10 jours, 15 jours, 30 jours, 45 jours, 2 mois, 75 jours, 3 mois, ou d'au moins 6 mois. Dans certains modes de réalisation, un bioconjugué décrit dans la présente demande ou une composition décrite dans la présente demande est administré à un sujet une fois par an sous forme de dose unique.
Dans certains modes de réalisation, un bioconjugué décrit dans la présente demande ou une composition décrite dans la présente demande est administré à un sujet à 2, 3, 4, 5 doses ou plus à 2 semaines, 3 semaines, 4 semaines, 5 semaines, ou 6 semaines de distance. Dans certains modes de réalisation, 2, 3, 4, 5 doses ou plus d'un bioconjugué décrit dans la présente demande ou une composition décrite dans la présente demande sont administrés à un sujet à 2, 3, 4, 5 ou 6 semaines de distance à un dosage de 0,1 pg à 0,5 mg, 0,1 pg à 0,4 mg, 0,1 pg à 0,3 mg, 0,1 pg à 0,2 mg, ou 0,1 pg à 0,1 mg de teneur en hydrate de carbone. Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué ou la composition administré(e) est identique à chaque fois. Dans certains modes de réalisation, le bioconjugué ou la composition administré(e) est différent à chaque fois.
5.7 ESSAIS
Essai pour évaluer la capacité des bioconjugués à induire une réponse immunitaire
La capacité des bioconjugués/compositions décrits dans le présent document à générer une réponse immunitaire chez un sujet peut être évaluée en utilisant toute approche connue de l'homme du métier ou décrite dans le présent document. Dans certains modes de réalisation, la capacité d'un bioconjugué à générer une réponse immunitaire chez un sujet peut être évaluée par l'immunisation d'un sujet (par exemple une souris) ou un ensemble de sujets avec un bioconjugué décrit dans le présent document et l'immunisation d'un sujet additionnel (par exemple une souris) ou un ensemble de sujets avec un témoin (PBS). Les sujets ou l'ensemble des sujets peuvent être ultérieurement mis en contact avec une bactérie d'intérêt et la capacité de la bactérie d'intérêt à déclencher la maladie chez les sujets ou l'ensemble de sujets peut être déterminée. L'homme du métier saura si le sujet ou l'ensemble de sujets immunisés avec le témoin souffre de la maladie à la suite de la mise en contact avec la bactérie d'intérêt, si le sujet ou l'ensemble des sujets immunisés avec un ou plusieurs bioconjugués ou une composition de ceux-ci décrite dans le présent document soufre moins ou ne souffre pas de la maladie, et en déduira alors si le bioconjugué est capable de générer une réponse immunitaire chez un sujet. La capacité d'un ou de plusieurs bioconjugués ou la composition de ceux-ci décrits dans le présent document pour induire un antisérum qui réagit de manière croisée avec un antigène 0 provenant d'une bactérie d'intérêt peut être testée par exemple par une immunoanalyse comme ELISA.
Essais bactéricides in Vitro
La capacité des bioconjugués décrits dans le présent document à générer une réponse immunitaire chez un sujet peut être évaluée en utilisant un essai bactéricide du sérum (SBA) ou un essai opsonophagocytotique (OPK), qui constitue une méthode bien établie et acceptée, utilisée pour obtenir l'agrément des vaccins à base de glycoconjugués. Ces essais sont bien connus de l'état de l'art, comprennent, pour résumer, les étapes consistant à générer et isoler des anticorps contre une cible par l'administration chez un sujet (par exemple une souris) d'un composé qui déclenche ces anticorps. Par la suite, la capacité bactéricide des anticorps peut être évaluée par exemple en cultivant les bactéries en question en présence desdits anticorps et compléments et - en fonction de l'essai - de cellules neutrophiles et en testant la capacité des anticorps à tuer et/ou neutraliser les bactéries, par exemple en utilisant des approches microbiologiques standards.
EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse des bioconjugués CP14 dans E. coll
Cet exemple décrit la production de bioconjugués comprenant une protéine support liée à un polysaccharide hybride dérivé du polysaccharide donneur de S. pneumoniae CP14. Le polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif, à la place d'un monosaccharide hexose, qui est présent dans S. pneumoniae CP14 de type sauvage. Le demandeur a identifié que les flippases et les polymérases comprennent une spécificité relâchée, permettant ainsi la manipulation génétique du polysaccharide hybride dans une cellule hôte hétérologue. La présence du dérivé de monosaccharide hexose à la place du monosaccharide hexose permet de transférer le polysaccharide hybride à une protéine support par le biais d'une oligosaccharyltransférase (PglB) pour produire un bioconjugué dans une cellule hôte (E. coli) . L'approche décrite dans cet exemple peut facilement être adaptée à tout oligosaccharide ou polysaccharide comprenant un monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif, permettant ainsi à ces oligosaccharides ou polysaccharides d'être reliés aux protéines supports (pour former des bioconjugués) dans une cellule hôte.
La structure du motif répétitif de S. pneumoniae CP14 est illustrée sur la FIG. 1 et le cluster du gène CP14 est représenté sur la FIG. 2. Le motif répétitif de CP14 est constitué de b-D-Gal-1,4-b-D-GlcNAc-l,3-b-D-Gal-l,4-b-D-Glc-. La FIG 3 illustre le principe de l'approche de la glyco-manipulation utilisée dans cet exemple, laquelle produit un CP14 hybride qui diffère du CP14 de type sauvage seulement au niveau du monosaccharide de l'extrémité réductrice.
La partie du cluster du gène CP14 contenant l'extension allant de wchA à wciY (voir Fig. 2) a été clonée dans le plasmide pDOC-C (Lee DJ, Bingle LE, Heurlier K, Pallen MJ, Penn CW, Busby SJ, Hobman JL: Gene doctoring: a method for recombineering in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains. BMC Microbiol 2009, 9:252) et ultérieurement intégrée dans la souche W3310 de E. coli (comprenant une délétion du gène waaL) à la place du cluster d'acide colanique, en suivant les méthodes décrites dans la demande de brevet internationale n° W02014/072405, qui est incorporée dans le présent document par référence dans sa totalité. La souche résultante, E. coli W3110 acide colanique::CP14 EwaaL, a été utilisée dans certaines expériences, comme cela va être décrit ci-après.
Pour produire la sous-unité CP14 glycomanipulée (un motif répétitif comprenant un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice), une galactosyltransférase (WfeD) provenant de Shigella boyedii a été utilisée. Il a été rapporté que WfeD transfère Gai de UDP-Gal à - GlcNAc-P-P-undécaprényle. D'abord, GlcNAc est assemblé sur UndP depuis UDP-GlcNAc par WecA (qui existe dans toutes les bactéries Gram-négatives qui synthétisent ECA et les bactéries Gram-positives qui fabriquent l'acide téichoique) (Annu Rev Microbiol. 2013;67:313-36; Glycobiology. 2011 Feb ; 21(2):138-51.), pour fabriquer une liaison ß (1,4) (J Bacteriol. 2011 Jan;193(2):449-59). Le produit de cette réaction a été le disaccharide Gal-GlcNAc-P-P-Undécaprenyle. Par la suite, WchL et WchM du cluster de S. pneumoniae CP14 qui ajoutent GlcNAc et Gai à ß-D-Gal-1,4- ß -D-GlcNAc-PP-Und, respectivement ont été utilisées pour produire la sous-unité manipulée génétiquement CP14, ß -D-Gal-1,4- ß -D-GlcNAc-1,3- ß -D-Gal-1,4- ß -D-GlcNAc-PP-Und (FIG. 4D) . Le schéma du plasmide synthétique produit à base de la combinaison des gènes ci-dessus (pGVX1190) est reproduit sur la FIG 4A.
La sous-unité manipulée génétiquement CP14 décrite ci-dessus a été produite dans le cytoplasme de la cellule hôte de E. coli. Cependant, pour la formation du polysaccharide, la sous-unité devant être déplacée dans le périplasme où le polysaccharide de type sauvage (CP14) a pu être assemblée à celui-ci. Pour tester si la flippase de la voie de biosynthèse CP14 a été capable de déplacer la sous-unité manipulée génétiquement, le gène CP14 wzx (flippase) a été ajouté au plasmide pGVX1190 pour générer pGVX1366 (FIG 4B) . Les deux plasmides ont été transformés dans des cellules E. coli Sç[)874 qui étaient dépourvues de flippase d'antigène 0. La coloration à l'argent des échantillons digérés par la protéinase K provenant de E. coli Ξφ874 transformés avec les plasmides a montré une bande correspondant à la sous-unité manipulée génétiquement CP14 assemblée sur le noyau du lipide A seulement quand la flippase de CP14 (Wzx) a été présente (FIG 4C). Ce résultat a démontré que la sous-unité manipulée génétiquement CP14 pouvait être produite et que la flippase de CP14 (Wzx) était capable de le déplacer dans le périplasme où la ligase d'antigène 0 de E. coli, WaaL, le transfère sur un noyau du lipide A.
Pour confirmer la structure de la sous-unité CP14 manipulée génétiquement, pGVX1366 ou son vecteur vide correspondant, a été transformé dans E. coli Sç[)874 EwaaL, les cellules ont été cultivées, récoltées après induction, et le LLO a été purifié et marqué par 2AB et soumis à une HPLC (FIG 5) . Un pic unique d'élution à 57 minutes a été collecté et soumis à une analyse de spectroscopie de masse (FIG 5A). Il a été démontré que la composition de monosaccharide de l'oligosaccharide correspondait à la sous-unité manipulée génétiquement CP14 proposée (FIG 5B).
Pour confirmer que la sous-unité manipulée génétiquement CP14 pouvait être transférée par C. jejuni PglB, des cellules E. coli Ξφ874 HwaaL ont été transformées avec (i) pGVX970 (qui comprend C. jejuni PglB), (ii) pGVXl codant AcrA (protéine support), et (iii) pGVX1366 (voir ci-dessus) ou son vecteur vide correspondant (pGVX81). Après induction, les protéines ont été extraites du périplasme et enrichies par IMAC et soumises à une analyse western blot (FIG 6A). Une bande correspondant à l'AcrA glycosylée a été observée seulement dans des cellules transformées avec le plasmide pGVX1366 (FIG 6A, bande 2) mais pas les cellules transformées avec le vecteur vide (FIG 6A, bande 1) . Les mêmes protéines purifiées ont été analysées par spectroscopie de masse et il a été confirmé que la sous-unité manipulée génétiquement CP14 était reliée à AcrA (FIG 6B ii). Donc, il a été confirmé que le CP14 manipulé génétiquement (hybride) est un substrat pour PglB.
Pour augmenter la productivité du CP14 de type sauvage et améliorer la polymérisation du plasmide CP14 manipulé génétiquement pGVX1366, il a été encore allongé par CP14 wchJ -wchk (en ajoutant Gai à UndPP-Glc) et CP14 wzy. La FIG 7 montre l'organisation des gènes du plasmide synthétique, pGVX1433.
Pour démontrer que le polysaccharide hybride CP14 pouvait être produit dans les cellules E. coli W3110 acide colanique: :CP14 HwaaL (voir la demande de brevet internationale n° W02014/072405), des cellules hôtes ont été transformées par un plasmide exprimant RcsA (nécessaire pour l'activation et la production de CP14 du type sauvage) et pGVX1433 manipulé génétiquement ou son vecteur vide correspondant (FIG 8). Après induction des cellules, les extraits de cellules entières ont été digérés par la protéinase K et les glycolipides ont été séparés sur SDS-PAGE et soumis à une analyse Western blot en utilisant un anticorps de sérotypage CP14. Les deux souches de E. coli transformées avec un plasmide CP14 manipulé génétiquement ou son vecteur vide corerspondant a pu produire le LLO reconnu par un anticorps anti-CP14. Ceci a démontré que les deux cellules pouvaient produire la structure polysaccharide CP14 correcte (FIG 8A) . Les cellules ont été récoltées après induction et LLO et purifiées, marquées par 2AB et soumises à une HPLC (FIG 8B) . Il a été démontré que les cellules abritant le plasmide manipulé génétiquement CP14 produisaient des polysaccharides identiques au type sauvage CP14 sauf qu'il était fixé à GlcNAc-2AB, alors qu'en présence du vecteur vide, le polysaccharide fixé à Glc-2AB (comme dans le type sauvage CP14) . Ceci démontrait de manière surprenante que la polymérase CP14 non seulement polymérise le motif répétitif CP14 mais aussi assemble le polymère de type sauvage sur la sous-unité manipulée génétiquement CP14 qui achève par conséquent la réaction de polymérisation (puisque aucune sous-unité manipulée génétiquement n'a pu être détectée au milieu du polysaccharide CP14).
Pour montrer que seul le polymère CP14 manipulé génétiquement pouvait être efficacement transféré par PglB, E. coli W3110 (acide colanique: :CP14, AwaaL, AwecA-wzzE) et E. coli W3110 (CA:CP14 AwaaL) ont été transformés par le plasmide RcsA (activateur de synthèse du CP14), pGVX970 (exprimant PglB), pGVXl (exprimant la protéine support AcrA) et le plasmide CP14 manipulé génétiquement (pGVX1433) (FIG 9). Après induction, les cellules de E. coli ont été récoltées et des extraits de cellules entières digérées par la protéinase K (FIG 9A) ou la protéine extraite du périplasme et enrichie par IMAC ont été soumis à une analyse Western blot en utilisant un anticorps de sérotypage CP14 comme anticorps primaire (FIG 9B) . Comme le montre l'encart A, toutes les souches ont produit des LLO reconnus par l'anticorps anti-CP14 (FIG 9A bandes 1 et 2) ; cependant, la glycoprotéine (CP14-AcrA) a été seulement détectée dans les souches exprimant la sous-unité de manipulation génétique CP14 dans E. coli W3110 (Acide colanique : : CP14, AwaaL (FIG 9A, bande 1) mais pas dans E. coli W3110 (acide colanique::CP14, AwaaL, AwecA-wzzE) (FIG 9A, bande 2) . Cette souche est dépourvue de WecA (la transférase d'amorce qui ajoute GlcNAc à UndPP) et ne peut par conséquent produire de CP14 manipulée génétiquement. Ceci montre clairement que CP14 qui est assemblée sur une sous-unité CP14 manipulée génétiquement peut être transférée par PglB sur une protéine support (AcrA), alors que le polysaccharide CP14 de type sauvage ne peut être transféré efficacement.
Afin de montrer que le polymère CP14 manipulé génétiquement pouvait être transféré par PglB sur une protéine support différente, E. coli W3110 acide colanique::CP14, AwaaL les cellules ont été transformées par le plasmide manipulé génétiquement CP14 (pGVX1433) et un plasmide pour l'expression de RcsA, pGVX970, et pGVX538 (exprimant la protéine support EPA) . Tous les échantillons ont été récoltés après induction et la protéine a été extraite du périplasme et enrichie par IMAC. Les échantillons de protéine enrichie ont été séparés par SDS-PAGE (gel à 4-12%) et électro-transférés sur une membrane de nitrocellulose puis incubées avec un anticorps anti-His (FIG 10 encart A) ou un anticorps de sérotypage CP14 (FIG 10 encart B) . Des bandes réactives de type échelles ont été observées quand l'anticorps anti-His ou anti-CP14 a été utilisé, ce qui indique que le CP14 manipulé génétiquement a pu être conjugué à 1'EPA. De plus, les mêmes cellules ont été cultivées dans un bioréacteur et soumises à la purification (FIG 11). En utilisant la chromatographie d'échange ionique traditionelle et la lectine (agglutinine de Ricinus communis) la chromatographie d'affinité, un conjugué purifié a été obtenu (FIG 11C).
Exemple 2 : Synthèse des bioconjugués de CP33F dans E. coli L'exemple 1 montre que les oligosaccharides ou polysaccharides comprenant un monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif peuvent être modifiés en remplaçant le monosaccharide hexose par un dérivé de monosaccharide hexose, ce qui permet à ces oligosaccharides ou polysaccharides hybrides d'être liés à des protéines supports (pour former des bioconjugués) dans des cellules hôtes. Comme décrit dans l'exemple 1, la spécificité relâchée du mécanisme de glycosylation (flippases, polymérases) dans les cellules hôtes hétérologues est fondamentale pour la production des oligosaccharides ou polysaccharides hybrides dans les cellules hôtes. Cet exemple décrit la manipulation de l'autre polysaccharide hybride, S. pneumoniae CP33F, dans une cellule hôte et confirme que le polysaccharide hybride est un substrat pour PglB dans la cellule hôte.
Le cluster de gène CP33F est illustré sur la FIG 12 et la structure du motif répétitif de S. pneumoniae CP33F est reproduite sur la FIG 1. Le motif répétitif de CP33F est constitué de ß -D-Gali-l,3- ß -D-Gal-1,3- a -D-Gal(al,2-D-Gal )-1,3- ß -D-Gal.f-1,3-D-Glc- .
La partie du cluster du gène CP33F contenant l'extension allant de wchA à glF (voir FIG 12) a été clonée dans le plasmide pDOC-C (PLoS Genet. 2006 Mar; 2(3) :e31.) et intégrée dans le cluster E. coli W3110 acide colanique comme décrit dans la publication de la demande de brevet internationale n°W02014/072405. E. coli W3110 acide colanique: :CP33F qui produit CP33F, sous le contrôle de RcsA, a été généré et utilisé pour les expériences suivantes (FIG 13A) . En plus, pour améliorer la production des bioconjugués pour les prochaines étapes, la ligase (waaL) de E. coli W3110 acide colanique :: CP33F a été remplacée par C. jejuni pglB pour générer la souche E. coli W3110 acide colanique :: CP33FwaaL: : pglB. Comme on le voit sur la FIG 13B, E. coli W3110 acide colanique::CP33F waaL:\pglB a produit des quantités comparables de LLO avec E. coli W3110 acide colanique::CP33F.
Pour synthétiser une sous-unité glycomanipulée génétiquement CP33F (un motif répétitif comprenant un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice), deux galactofuranosyltransférases, WbeY provenant de E. coli 028 et WfdK provenant de E. coli 0167 ont été utilisées. On a émis l'hypothèse, à partir de la structure de E. coli 028 et E. coli 0167 LPS, que les deux structures étaient constituées de Galf fixée par le biais de la liaison ß (1,3) à la GlcNAc réductrice (Carbohydr Res. (1996) 127-39, Eur. J. Biochem. 246
(1997) 565-573). Par conséquent, on a supposé que WbeY et WfdK pouvaient transférer Galf sur -GlcNAc-P-P-Undécaprényle. GlcNAc a été assemblée sur UndP à partir de UDP-GlcNAc par WecA (qui existe dans toutes les bactéries Gram-négatives qui synthétisent ECA et les bactéries Gram-positives qui fabriquent de l'acide téichoïque) (Annu Rev Microbiol. 2013 ; 67: 313-36 ; Glycobiology. 2011 Feb ; 21(2): 138-51.), pour constituer une liaison ß (1,3) (J Bacteriol. 2011 Jan ; 193(2):449-59). Ensuite, en utilisant les glycosyltransférases WciC, WciD, WciE et WciF du cluster de gène S. pneumoniae CP33F, la synthèse de la sous-unité CP33F manipulée génétiquement (ß -D-Galf-1,3- ß -D-Gal-1,3- a -D-Gal(al,2-D-Gal)-1,3- ß -D-Galf-1,3-D-GlcNAc-PP-Undd) a été achevée (FIG 14B) . L'organisation schématique des gènes du plasmide synthétique pour la production de la sous-unité CP33F manipulée génétiquement est illustrée sur la FIG 14A (pGVX2342). Ce plasmide produit la sous-unité CP33F manipulée génétiquement dans le cytoplasme, depuis lequel elle est déplacée dans le périplasme grâce à la flippase de CP33F où le polysaccharide de type sauvage peut être assemblé sur celle-ci sous l'action de la polymérase CP33F (wzy). Le plasmide pGVX2342 contient aussi la polymérase CP33F {wzy) et E. coli 016 galE et glf pour renforcer la productivité de la polymérase de type sauvage ainsi que la sous-unité manipulée génétiquement (FIG 14A).
Pour montrer que la polymérase (wzx) de CP33F avait une spécificité relâchée pour le glycane et pouvait déplacer le motif répétitif CP33F manipulée génétiquement depuis le cytoplasme dans le périplasme. E. coli W3110 a été transformé avec le plasmide pGVX2342 (FIG 14) ou un plasmide correspondant contenant la totalité des gènes nécedssaires pour la production de CP33F sauf la flippase CP33F {wzx) (pGVX2098). Après induction, les cellules ont été récoltées et soumises à une digestion par la protéinase K. Les cellules digérées ont été testées sur SDS-PAGE 4-12% et soumises à une coloration à l'argent ou électro-transférées sur nitrocellulose et soumises à une analyse western blot en utilisant un anticorps de sérotypage CP33F. Comme on le voit sur la FIG 15A, une bande supplémentaire sur le noyau du lipide A a été seulement détectée dans les cellules de E.coli transformées avec le plasmide pGVX2342 (FIG 15A, bande 2) et non pGVX2098, qui est dépourvue de la flippase CP33F (FIG 15A, bande 1). Cette bande a été aussi détectée par western blot en utilisant un anticorps anti-CP33F (FIG 15B, bande 2) démontrant que le motif répétitif CP33F manipulé génétiquement était produit et déplacé dans le périplasme de E. coli où la ligase d'antigène 0 (WaaL) l'a transféré sur le noyau du lipide A. De manière intéressante, cette expérience montre que la sous-unité CP33F manipulée génétiquement pouvait être reconnue par un anticorps qui était dirigé contre CP33F de type sauvage et qu'ils partagaient des épitopes immunogéniques similaires.
Pour vérifier la structure de la sous-unité CP33F manipulée génétiquement, pGVX2342 ou son vecteur vide correspondant a été transformé dans les cellules E. coli Sç|)874 EwaaL. Après induction, les cellules ont été récoltées et LLO a été purifié et marqué par 2AB et soumis à une HPLC (FIG 16). Le Chromatogramme de la HPLC (FIG 16, encart A) montre un unique pic s'éluant à 72 minutes. Ce pic a été collecté et soumis à une analyse de spectroscopie de masse et il a été démontré que la composition monosaccharide de l'oligosaccharide correspondait à la sous-unité CP33F manipulée génétiquement proposée (FIG 16, encart B).
Pour montrer que la sous-unité CP33F manipulée génétiquement pouvait être transférée par C. jejuni PglB, les cellules E. coli Ξφ874 ΔιwaaL ont été transformées avec pGVX970 (codant C. jejuni PglB), pGVXl (codant la protéine support AcrA) et pGVX2305 (codant la sous-unité de manipulation génétique CP33F) ou son vecteur vide correspondant (pGVX1387). Après induction, les protéines ont été extraites du périplasme et enrichies par IMAC et soumises à une analyse western blot (FIG 17) . Une bande correspondant à AcrA glycosylée a été seulement observée quand le plasmide pGVX1366 (FIG 17A, bande 2) était présent et non le vecteur vide (FIG 17A, bande 1) . Aussi, l'analyse western-blot des mêmes protéines purifiées en utilisant un anticorps de sérotypage anti-CP33F a permis de visualiser une bande provenant des échantillons de protéine extraits des cellules de E. coli abritant le plasmide de manipulation génétique CP33F (FIG 17B, bande 2) et non le vecteur vide correspondant (FIG 17B, bande 1). Cela a démontré que seulement la sous-unité manipulée génétiquement CP33F pouvait être efficacement transférée par PglB à une protéine support.
Pour démontrer que le polymère CP33F manipulé génétiquement pouvait être transféré par PglB et que le polysaccharide CP33F de type sauvage n'est pas un substrat PglB, les cellules E. coli W3110 (acide colanique: : CP33FwaaL::pglB AwecA-wzzE) ont été transformées avec le plasmide RcsA (activateur de la synthèse de CP33F), pGVX970 (exprimant PglB), pGVX2310 exprimant EPA (protéine support), et le plasmide CP33F de manipulation génétique (pGVX2342) ou son vecteur vide correspondant (FIG 18) . Après induction, les cellules de E. coli ont été récoltées et
l'analyse western-blot a été réalisée pour des extraits de cellules entières digérées par la protéinase K (FIG 18A) ou la protéine a été extraite du périplasme et enrichie par IMAC (FIG 18B et C) . L'analyse western blot utilisant un anticorps de sérotypage CP33F comme anticorps primaire pour l'analyse des extraits digérés par la protéinase K a montré que toutes les souches produisaient du LLO (motif en forme d'échelle) (FIG 18A). Cependant, la glycoprotéine (CP33F-EPA) a été seulement détectée dans la souche abritant le plasmide de manipulation génétique CP33F (FIG 18 B et C ; bandes 3 et 4) et non le vecteur vide (FIG 18B et C ; bandes 1 et 2) . Ceci montre clairement que CP33F est transféré par PglB sur une protéine support quand il est assemblé sur la sous-unité CP33F manipulée génétiquement (ce qui veut dire quand elle est manipulée génétiquement sous forme de polysaccharide hybride qui comprend un dérivé de monosaccharide hexose à la place d'un monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif).
Exemple 3 : Synthèse des conjugués CP14 dans E. coli en utilisant une approche de modification différente
Les exemples 1 et 2 expliquent comment modifier les cellules hôtes pour les rendre capables de produire des oligosaccharides ou polysaccharides hybrides qui comprennent un dérivé de monosaccharide hexose à la place d'un monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif. Les exemples 1 et 2 montrent également de manière surprenante que la spécificité relâchée d'un certain mécanisme de glycosylation (flippases, polymérases) permet la production de ces oligosaccharides ou polysaccharides hybrides dans des cellules hôtes hétérologues. Cet exemple présente une approche alternative pour constituer des oligosaccharides ou polysaccharides hybrides qui sont aussi des substrats pour PglB dans les cellules hôtes. En particulier, cet exemple montre que, en ajoutant un dérivé de monosaccharide hexose à un oligosaccharide ou polysaccharide donneur qui comprend un monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif, on peut produire un oligosaccharide ou polysaccharide hybride qui est un substrate pour PglB. De plus, cet exemple montre de manière surprenante que les oligosaccharides ou polysaccharides hybrides produits selon cet exemple étaient des substrats extrêmement efficaces pour PglB. Enfin, cet exemple montre que des bioconjugués comprenant les oligosaccharides ou polysaccharides hybrides produits selon cet exemple étaient fonctionnels et immunogéniques in vivo.
Les gènes du cluster de gène de type sauvage de S. pneumoniae CP14 (voir FIG 19A) ont été clonés et intégrés dans le chromosome de E. coli à la place du cluster E. coli W3110 acide colanique, comme cela est décrit dans la demande de brevet internationale n°WO 2014/072405. Les E. coli génétiquement modifiés produisent CP14 de type sauvage (la structure d'un motif répétitif (RU) de CP14 de type sauvage est présentée sur la FIG 19B).
Ensuite, on a produit un cluster de gène de synthèse (voir FIG 20) qui était capable de produire un oligosaccharide modifié similaire à celui du motif répétitif de type sauvage (c'est-à-dire CP14) sauf qu'il contient un monosaccharide supplémentaire au niveau de l'extrémité réductrice, le monosaccharide supplémentaire étant un dérivé de monosaccharide hexose. En général, la production de cet oligosaccharide était obtenue en combinant plusieurs glycosyltransférases qui ont des fonctions connues. Les étapes spécifiques ont été : d'abord, GlcNAc a été assemblée sur UndP dans la cellule hôte E. coli à partir de UDP-GlcNAc par WecA (voir ci-dessus). Ensuite, l'épimérase Z3206 provenant de E. coli 0157 a converti GlcNAcUndPP en GalNAcUndPP. Ensuite, wciQ de E. coli 021 a ajouté le glucose (Glc) par le biais d'une liaison b(1,3) à GlcNAcUndPP pour former Glc b(1,3)GlcNAc. Ensuite, E.coli 021 wciP a ajouté Gai par le biais de liaisons b(1,4) au disaccharide pour former un trisaccharide, Gai b (1,4) Glc b(1,3) GalNAcUndPP. Enfin, wchL (GlcNAc transférase) et wchM (Galactosyltransférase) de S. pneumoniae CP14 ont achevé l'assemblage du motif répétitif (voir FIG. 20). Le motif répétitif hybride résultant avait la composition suivante : (i) un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice et (ii) le premier motif répétitif provenant de S. pneumoniae CP14.
La sous-unité manipulée génétiquement (hybride) a pu être déplacée du cytoplasme de la cellule hôte au périplasme de la cellule hôte par la flippase de C. jejuni (PglK) (cette flippase a été introduite dans la cellule hôte E. coli en utilisant des techniques de recombinaison standards). Une fois déplacé par la flippase, le polysaccharide CP14 de type sauvage a été polymérisé sur le haut de la sous-unité manipulée génétiquement (hybride) par la polymérase de S. pneumonia présente dans la cellule hôte de E. coli, montrant de nouveau de manière surprenante une spécificité relâchée de la polymérase qui a été essentielle pour la génération du polysaccharide hybride CP14. Voir FIG 21.
Ensuite, il a été déterminé que PglB était capable de transférer le polymère manipulé génétiquement CP14 à la protéine support EPA (voir FIG 22), aboutissant à la production des bioconjugués hybrides CP-14-EPA qui ont pu être purifiés (voir FIG 23) . De manière surprenante, il a été déterminé que les cellules hôtes modifiées décrites dans cet exemple étaient capables de produire de très hauts rendements de bioconjugués hybrides CP-14-EPA. En fait, les rendements de bioconjugués hybrides CP-14-EPA produits en utilisant la méthode de cet exemple ont été 70 fois plus importants que les rendements des bioconjugués CP-14-EPA produits dans l'exemple 1.
Ensuite, la fonctionnalité et l'immunogénicité des bioconjugués hybrides CP-14-EPA ont été évaluées. Des lapins blancs femelles de Nouvelle-Zélande ont été immunisés avec des bioconjugués hybrides CP-14-EPA ou Prevnar 13 à titre de témoin. Voir la FIG 24. Comme le montre la FIG 25, les bioconjugués hybrides CP-14-EPA produits selon cet exemple sont restés fonctionnels et ont été immunogéniques.
Exemple 4 : Synthèse des bioconjugués CP15A dans E. coli L'exemple 1 montre que les oligosaccharides ou les polysaccharides qui comprennent un monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif peuvent être modifiés en remplaçant le monosaccharide hexose par un dérivé de monosaccharide hexose, ce qui permet aux oligosaccharides ou polysaccharides hybrides d'être liés aux protéines supports (pour former des bioconjugués) dans des cellules hôtes. Comme décrit dans l'exemple 1, la spécificité relâchée du mécanisme de glycosylation (polymérases) dans des cellules hôtes hétérologues est fondamentale pour la production des oligosaccharides ou polysaccharides hybrides dans les cellules hôtes. Cet exemple décrit la manipulation génétique d'un autre polysaccharide hybride, S. pneumoniae CP15A, dans une cellule hôte et confirme que le polysaccharide hybride est un substrat pour PglB dans la cellule hôte.
Le cluster de gène CP15A est illustré sur la FIG 27 et la structure du motif répétitif de S. pneumoniae CP15A est indiquée sur FIG 28. Le motif répétitif de CP15A est composé de α-D-Gal-l,2-ß-D-Gal-l,4-[Gro-2-P-3]-ß-D-GlcNAc-1,3-ß-D-Gal-1,4-D-Glc-
La ligase (waaL) de E. coli W3110 a été remplacée par C. jejuni pglB pour générer la souche E. coli W3110 waaL::pglB (StGVXN8011). A la prochaine étape, la partie du cluster de gène CP15A contenant l'extension allant de wchA à gtp3 (voir FIG 27) a été clonée dans le plasmide pDOC (PLoS Genet. 2006 Mar ; 2 ( 3) :e31. ) et intégrée dans le cluster E. coli W3110 waaL'.'.pglB (StGVXN8011) acide colanique, comme décrit dans la publication de la demande de brevet international n°W02014/072405 pour produire StGVXN9510. E. coli W3110 acide colanique :: CP15A waaL'.'.pglB qui produit CP15A, sous le contrôle de RcsA, a été généré et utilisé pour les expériences suivantes (FIG 30).
Pour synthétiser une sous-unité glycomanipulée CP15A (un motif répétitif comprenant un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice), une glucosyltransférase WclQ et des galactosyltransférases WclP de E. coli 021, une N-acétylglucosamine transférase WchL et une galactosyltransférase WchM de S.pneumoniae CP14, une épimérase Z3206 de E.coli 0157, une galactosyltransférase WchN de S.pneumoniae CP15A et une flippase PglK de C.jejuni ont été utilisées (FIG 29A) . GlcNAc a été assemblée sur UndP de UDP-GlcNAc par WecA (qui existe dans toutes les bactéries Gram-négatives qui synthétisent ECA et les bactéries Gram-positives qui fabriquent de l'acide téichoïque) (Annu Rev Microbiol. 2013; 67:313-36; Glycobiology. 2011 Feb;21(2) : 138-51.), pour constituer une liaison ß (1,3) (J Bacteriol. 2011 Jan;193(2):449-59) et a été convertie en Und-PP-GalNAc par l'épimérase Z3206. Ensuite, en utilisant les glycosyltransférases Wcl et WclP (Journal of Microbiological Methods. 2008; 75(2):329-334) un glucose et un galactose sont ajoutés comme 2ème et 3ème fractions de sucre, respectivement. Dans ce qui suit, WchL, et WchM de S. pneumoniae CP14 ajoutent une fraction N-glucosamine et une fraction galactose, respectivement et WchN de S. pneumoniae CP15A ajoute un galactose comme fraction terminale de manière à achever la sous-unité manipulée génétiquement a -D-Gal-1,2- ß -D-Gal-1,4-ß -D-GlcNAc-1,3- ß -D-Gal-1,4- ß -D-Glc-1,3-D-GalNAc- (FIG 29B). L'organisation schématique des gènes du plasmide de synthèse pour la production de la sous-unité manipulée génétiquement CP15A est illustrée sur la FIG 29A (pGVX3058). Ce plasmide produit la sous-unité manipulée génétiquement CP15A dans le cytoplasme, depuis lequel elle est déplacée dans le périplasme par la flippase PglK de C.jejuni où le polysaccharide de type sauvage peut être assemblé sur celui sous l'action de la polymérase de CP15A (wzy) .
Pour montrer que la sous-unité manipulée génétiquement CP15A pouvait être un substrat pour la polymérase CP15A (wzy) et être incorporée dans le polymère CP15A de type sauvage et transférée par PglB sur une protéine support, des cellules E. coli W3110 (acide coionique::CP15A waaL:ipglB) ont été transformées avec le plasmide RcsA (activateur de la synthèse de CP15A), pGVX2703 exprimant la protéine support AcrA, pGVX3058 exprimant le plasmide de manipulation génétique CP15A ou son vecteur vide correspondant (FIG 30). Après induction, les cellules E. coli ont été récoltées et une analyse Western-blot a été réalisée pour les extraits de cellules entières digérées par la protéinase K (FIG 30A) ou la protéine a été extraite du périplasme et enrichie par IMAC (FIG 30 B et 30C). L'analyse western blot en utilisant un anticorps de sérotypage CP15A comme anticorps primaire pour l'analyse des extraits digérés par la protéinase K a montré que toutes les souches produisaient du LLO (motif de type échelle) (FIG 30A bandes 1 et 2) . Cependant, la glycoprotéine (CP15A-AcrA) a été seulement détectée dans la souche abritant le plasmide de manipulation génétique CP15A (FIG 30B et 30C ; bandes 2) et non le vecteur vide (FIG 30B et 30C ; bande 1) . Ceci montre clairement que CP15A est transféré par PglB sur une protéine support quand il est assemblé sur la sous-unité manipulée génétiquement CP15A (c'est-à-dire quand elle est manipulée sous forme de polysaccharide hybride qui comprend un dérivé de monosaccharide hexose à la place d'un monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif).
Equivalents :
Les méthodes, les cellules hôtes, et les compositions exposées dans la présente demande ne sont pas limitées dans la portée par les modes de réalisation spécifiques décrits ici. En fait, diverses modifications des méthodes, cellules hôtes, et compositions en plus de celles décrites dans la présente demande seront évidentes pour l'homme du métier en lisant la description précédente et regardant les figures ci-jointes. Ces modifications sont destinées à rentrer dans la portée des revendications ci-jointes.
Diverses publications, demandes de brevet et divers brevets sont cités dans le présent document, leurs divulgations étant incorporées ici par référence dans leur totalité.

Claims (66)

  1. REVENDICATIONS
    1. Cellule hôte procaryote, comprenant : a) des acides nucléiques qui codent des glycosyltransférases qui produisent un motif répétitif oligosaccharide ou polysaccharide, ledit motif répétitif ne comprenant pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice et ledit motif répétitif oligosaccharide ou polysaccharide étant dérivé d'un motif répétitif oligosaccharide ou polysaccharide donneur qui comprend un hexose au niveau de l'extrémité réductrice ; et b) un acide nucléique qui code une protéine support comprenant une séquence consensus de N-glycosylation ; et c) un acide nucléique qui code une oligosaccharyl transférase ; et éventuellement d) un acide nucléique qui code une polymérase {wzy) , la polymérase catalysant la production d'un oligosaccharide ou polysaccharide hybride, où l'oligosaccharide ou le polysaccharide hybride (i) comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif et (ii) comprend des monosaccharides hexoses au niveau de l'extrémité réductrice de tous les autres motifs répétitifs.
  2. 2. Cellule hôte selon la revendication 1, ladite cellule hôte comprenant des glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse du motif répétitif oligosaccharide ou polysaccharide donneur.
  3. 3. Cellule hôte selon la revendication 2, dans laquelle lesdites glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des motifs répétitifs de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sont présentes dans la cellule hôte sous forme de cluster d'opéron ou de gène ou d'une partie de celui-ci.
  4. 4. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle ladite cellule hôte est capable de capable de produire un oligosaccharide ou polysaccharide hybride, où ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identique à l'oligosaccharide ou au polysaccharide donneur, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif à la place du monosaccharide hexose normalement présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur.
  5. 5. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle ladite cellule hôte est capable de produire un oligosaccharide ou polysaccharide hybride, où ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identique à l'oligosaccharide ou au polysaccharide donneur, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif en plus de comprendre la totalité des monosaccharides de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur.
  6. 6. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ladite cellule hôte comprenant (i) une glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur un undécaprényl pyrophosphate (UND-PP) et (ii) une ou plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé de monosaccharide hexose assemblé sur UND-PP.
  7. 7. Cellule hôte selon la revendication 6, dans laquelle ledit dérivé de monosaccharide hexose est un monosaccharide quelconque dont la position C-2 est modifiée par un groupe acétamido, par exemple, la N-acétylglucosamine (GlcNAc), la N-acétylgalactose-amine (GalNAc), le 2,4-diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose (DATDH), la N-acétylfucose-amine (FucNAc), la N-acétylquinovosamine (QuiNAc).
  8. 8. Cellule hôte selon la revendication 6 ou 7, dans laquelle ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur UND-PP est hétérologue de la cellule hôte et/ou hétérologue des gènes qui catalysent le motif répétitif de l'oligosaccharide donneur.
  9. 9. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans laquelle ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur UND-PP provient de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
  10. 10. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, dans laquelle ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur UND-PP est wecA ; éventuellement de E. coli.
  11. 11. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, dans laquelle ledit monosaccharide hexose est le galactose (Gai).
  12. 12. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 6 à 11, dans laquelle ladite une ou lesdites plusieurs glycosyltransférases capables d'ajouter un monosaccharide au dérivé de monosaccharide hexose est ou sont la galactosyltransférase (wfeD) provenant de Shigella boyedii ou la galactofuranosyltransférase (wbeY) provenant de E. coli 028 ou la galactofuranosyltransférase (wfdK) provenant de E. coli 0167 ou la galactofuranosyltransférase (wbeY) provenant de E. coli 028 et la galactofuranosyltransférase (wfdK) provenant de E. coli 0167.
  13. 13. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 2, 3, ou 5 à 12, dans laquelle lesdites glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse de motifs répétitifs de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur comprennent WchL et/ou WchM provenant de S. pneumoniae CP14.
  14. 14. Cellule hôte selon la revendication 13, ladite cellule hôte étant capable de produire un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride, où ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identique à S. pneumoniae CP14, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif à la place du monosaccharide hexose normalement présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de S. pneumoniae CP14.
  15. 15. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 2, 3, ou 5 à 14, dans laquelle lesdites glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse de motifs répétitifs de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur comprennent WciC, WciD, WciE, et/ou WciF provenant de S. pneumoniae CP33F.
  16. 16. Cellule hôte selon la revendication 15, ladite cellule hôte étant capable de produire un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride, où ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identique à S. pneumoniae CP33F, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif à la place du monosaccharide hexose normalement présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de S. pneumoniae CP33F.
  17. 17. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ladite cellule hôte comprenant (i) une glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur un undécaprényl pyrophosphate (UND-PP) et (ii) des glycosyltransférases qui assemblent le motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sur le dérivé de monosaccharide hexose.
  18. 18. Cellule hôte selon la revendication 17, dans laquelle ledit dérivé de monosaccharide hexose est tout monosaccharide qui est modifié en position C-2 par un groupe acétamido comme la N-acétylglucosamine (GlcNAc), la N-acétylgalactoseamine (GalNAc) , le 2,4-Diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose (DATDH), la N-acétylfucose-amine (FucNAc), la N-acétylquinovosamine (QuiNAc).
  19. 19. Cellule hôte selon la revendication 17 ou 18, dans laquelle ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur UND-PP est hétérologue de la cellule hôte.
  20. 20. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, dans laquelle ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur UND-PP provient de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
  21. 21. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, dans laquelle ladite glycosyltransférase qui assemble un dérivé de monosaccharide hexose sur UND-PP est wecA, éventuellement provenant de E.coli.
  22. 22. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 17 à 21, dans laquelle les glycosyltransférases qui assemblent le motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sur le dérivé de monosaccharide hexose comprennent une glycosyltransférase qui est capable d'ajouter le monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au dérivé de monosaccharide hexose.
  23. 23. Cellule hôte selon la revendication 22, dans laquelle ladite glycosyltransférase qui est capable d'ajouter ledit monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au dérivé de monosaccharide hexose est une galactosyltransférase (WciP), provenant éventuellement de E. coli 021.
  24. 24. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 22 à 23, dans laquelle les glycosyltransférases qui assemblent le motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sur le dérivé de monosaccharide hexose comprennent une glycosyltransférase qui est capable d'ajouter le monosaccharide qui est adjacent au monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur.
  25. 25. Cellule hôte selon la revendication 24, dans laquelle ladite glycosyltransférase qui est capable d'ajouter le monosaccharide qui est adjacent au monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur au monosaccharide hexose présent au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur est une glucosyltransférase (iwciQ) , provenant éventuellement de E. coli 021.
  26. 26. Cellule hôte selon la revendication 25, ladite cellule hôte comprenant en outre une enzyme capable de modifier un monosaccharide, éventuellement une épimérase ou une racémase.
  27. 27. Cellule hôte selon la revendication 26, dans laquelle ladite épimerase provient de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
  28. 28. Cellule hôte selon la revendication 27, dans laquelle ladite épimérase provient de E. coli.
  29. 29. Cellule hôte selon la revendication 27, dans laquelle ladite épimérase est Z3206 de E. coli 0157.
  30. 30. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 17 à 29, dans laquelle lesdites glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse des motifs répétitifs de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur comprennent wchL et wchM de S. pneumoniae CP14.
  31. 31. Cellule hôte selon la revendication 30, ladite cellule hôte étant capable de produire un oligosaccharide ou un polysaccharide hybride, où ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride est identique à S. pneumoniae CP14, à l'exception du fait que ledit oligosaccharide ou polysaccharide hybride comprend un dérivé de monosaccharide hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif en plus de comprendre tous les résidus de monosaccharide de S. pneumoniae CP14.
  32. 32. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 31, dans laquelle ledit monosaccharide non-hexose ou ledit dérivé de monosaccharide hexose est un monosaccharide comprenant un groupe acétamido en position 2.
  33. 33. Cellule hôte selon la revendication 32, dans laquelle ledit dérivé de monosaccharide hexose est tout monosaccharide dont la position C-2 est modifiée par un groupe acétamido comme la N-acétylglucosamine (GlcNAc), la N-acétylgalactose-amine (GalNAc), le 2,4-diacétamido-2,4,6-tridésoxyhexose (DATDH), la N-acétylfucoseamine (FucNAc), ou la N-acétylquinovosamine (QuiNAc).
  34. 34. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 33, ladite cellule hôte comprenant un acide nucléique qui code une polymérase de polysaccharide capsulaire (wzy) ou une polymérase d'antigène O (wzy) .
  35. 35. Cellule hôte selon la revendication 34, dans laquelle ladite polymérase est hétérologue de la cellule hôte et/ou ladite polymérase est hétérologue du cluster de gène codant les enzymes pour la synthèse du motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur.
  36. 36. Cellule hôte selon la revendication 34 à 35, dans laquelle ladite polymérase provient de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
  37. 37. Cellule hôte selon la revendication 36, dans laquelle ladite polymérase provient de Streptococcus pneumoniae, éventuellement de de S. pneumoniae CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6 (A et B), CP7 (A,B, C) , CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A, B, C, F) , CPU (A, B, C, D, F) , CP12(A,B,F), CP13, CP14 CP15 (A, B, C, F) , CPI 6 (A, F) , CP17 (A, F) , CPI8 (A, B, C, F) , CPI 9 (A, B, C, F) , CP2 0, CP21, CP22 (A, F) , CP23(A,B,F), CP24(A,B,F), CP25(A,F) , CP2 6, CP27,CP28(A,F) , CP29, CP31, CP32(A,F), CP33(A,B,C,D,F) , CP34, CP35(A,B,C,D,F) , CP36, CP37, CP38, CP39, CP4 0, CP41(A,F) , CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47(A,F) , ou CP48.
  38. 38. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 37, ladite cellule hôte comprenant un acide nucléique qui code une flippase (wzx) .
  39. 39. Cellule hôte selon la revendication 38, dans laquelle ladite flippase est hétérologue de la cellule hôte et/ou ladite flippase est hétérologue du cluster de gène codant les enzymes pour la synthèse du motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur.
  40. 40. Cellule hôte selon la revendication 38 à 39, dans laquelle ladite flippase provenant de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
  41. 41. Cellule hôte selon la revendication 40, dans laquelle ladite flippase provient de Streptococcus pneumoniae, éventuellement de S. pneumoniae CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6 (A et B), CP7 (A,B, C) , CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A,B,C,F), CPU (A, B, C, D, F) , CP12 (A, B, F) , CP13, CP14 CP15 (A, B, C, F) , CPI 6(A,F) , CP17(A,F) , CPI8(A,B,C,F) , CPI9(A,B,C,F) , CP20,CP21, CP22 (A, F) , CP23 (A, B, F) , CP24(A,B,F), CP25 (A, F) , CP26, CP27,CP28(A,F), CP29, CP31, CP32(A,F), CP33(A,B,C,D,F), CP34, CP35(A,B,C,D,F), CP36, CP37, CP38, CP39, CP40, CP41(A,F), CP42, CP43, CP44, CP45, CP46, CP47(A,F), ou CP48.
  42. 42. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 41, dans laquelle ledit oligosaccharide ou polysaccharide provient de l'espèce Escherichia, de l'espèce Shigella, de l'espèce Klebsiella, de l'espèce Xhantomonas, de l'espèce Salmonella, de l'espèce Yersinia, de l'espèce Aeromonas, de l'espèce Francisella, de l'espèce Helicobacter, de l'espèce Proteus, de l'espèce Lactococcus, de l'espèce Lactobacillus, de l'espèce Pseudomonas, de l'espèce Corynebacterium, de l'espèce Streptomyces, de l'espèce Streptococcus, de l'espèce Enterococcus, de l'espèce Staphylococcus, de l'espèce Bacillus, de l'espèce Clostridium, de l'espèce Listeria, ou de l'espèce Campylobacter.
  43. 43. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 42, dans laquelle ledit polysaccharide est un polysaccharide capsulaire (CP), provenant éventuellement de Streptococcus pneumoniae, dans laquelle ledit polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae est CPI, CP2, CP3, CP4, CP5, CP6 (A, B), CP7 (A, B, C) , CP8, CP9 (A, L, N, V), CP10 (A, B, C, F), CPU (A, B, C, D, F), CP12 (A, B, F), CP13, CP14, CP15 (A, B, C, F), CPI 6 (A, F), CP17 (A, F), CP18 (A, B, C, F), CP19 (A, B, C, F), CP20, CP21, CP22 (A, F), CP23 (A, B, F), CP24 (A, B, F), CP25 (A, F), CP 26, CP27, CP28 (A, F), CP29, CP31, CP32 (A, F), CP3 3 (A, B, C, D, F), CP34, CP35 (A, B, C, D, F), CP36, CP37, CP3 8, CP39, CP40, CP41 (A, F), CP42, CP43, CP44, CP45, CP4 6, CP4 7 (A, F), ou CP48.
  44. 44. Cellule hôte selon la revendication 43, dans laquelle ledit polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae est CP8, CP12F, CP15A, CPI 6F, CP22F, CP23A, CP24F, CP31, CP33F, CP35B, ou CP38.
  45. 45. Cellule hôte selon la revendication 43, dans laquelle ledit polysaccharide capsulaire provient de Staphylococcus aureus, éventuellement dans laquelle ledit polysaccharide capsulaire de S. aureus est CP5 ou CP8.
  46. 46. Cellule hôte selon la revendication 43, dans laquelle ledit polysaccharide capsulaire provient de Streptococcus agalactiae (GBS), éventuellement dans laquelle ledit polysaccharide capsulaire de Streptococcus agalactiae est S. agalactiae (groupe B, GBS) CPIa, CPIb, CPU, CPIII, CPIV, CPV, CPVI, CPVII, ou CPVIII.
  47. 47. Cellule hôte selon la revendication 43, dans laquelle ledit polysaccharide capsulaire provient de Enterococcus faecalis, éventuellement dans laquelle ledit polysaccharide capsulaire de Enterococcus faecalis est CPA, CPB, CPC, ou CPD.
  48. 48. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 47, dans laquelle au moins une desdites glycosyltransférases qui produisent un oligosaccharide ou un polysaccharide qui ne comprennent pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif est hétérologue de la cellule hôte.
  49. 49. Cellule hôte selon la revendication 1 à 48, dans laquelle ladite protéine support est hétérologue de la cellule hôte.
  50. 50. Cellule hôte selon la revendication 1 à 49, dans laquelle ladite oligosaccharyl transférase est hétérologue de la cellule hôte.
  51. 51. Cellule hôte selon la revendication 1 à 50, dans laquelle au moins une desdites glycosyltransférases qui produisent un oligosaccharide ou un polysaccharide qui ne comprennent pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif, ladite oligosaccharyltransférase, et ladite protéine support sont hétérologues de la cellule hôte.
  52. 52. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 51, dans laquelle ladite oligosaccharyl transférase provient de Campylobacter jejunl, éventuellement dans laquelle ladite oligosaccharyl transférase est le gène pglB de C. jejuni, éventuellement dans laquelle ledit gène pglB de C. jejuni est intégré dans le génome de la cellule hôte.
  53. 53. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 52, dans laquelle ladite oligosaccharyl transférase est dérivée d'un organisme eucaryote ou d'un organisme d'archées.
  54. 54. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 53, dans laquelle lesdites glycosyltransférases suffisantes pour la synthèse du motif répétitif de l'oligosaccharide ou du polysaccharide donneur sont intégrées au génome de la cellule hôte.
  55. 55. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 54, dans laquelle ladite protéine support est l'exotoxine A détoxifiée de P. aeruginosa (EPA), CRM197, la protéine de liaison au maltose (MBP), le toxoïde de la diphtérie, le toxoïde du tétanos, 1'hémolysine A détoxifiée de S. aureus, le facteur de coagulation A, le facteur de coagulation B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, l'entérotoxine thermolabile de E. coli, des variants détoxifiés de l'entérotoxine thermolabile de E. coli, la toxine du choléra sous-unité B (CTB), la toxine du choléra, des variants détoxifiés de la toxine du choléra, la protéine Sat de E. coli, le domaine passager de la protéine Sat de E. coli, la pneumolysine de Streptococcus pneumoniae et ses variants détoxifiés, AcrA de C. jejuni, une glycoprotéine naturelle de C. jejuni, PcrV (aka LcrV,EspA, SseB), PopB (YopB, YopD, FliC), ou OprF, OprI.
  56. 56. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 55, dans laquelle au moins un gène de la cellule hôte a une fonction inactivée ou supprimée, éventuellement dans laquelle le gène waaL de la cellule hôte a une fonction inactivée ou supprimée, éventuellement dans laquelle le gène waaL de la cellule hôte a été remplacé par un acide nucléique codant une oligosaccharyltransférase, éventuellement dans laquelle le gène waaL de la cellule hôte a été remplacé par pglB de C. jejuni.
  57. 57. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 56, dans laquelle ladite cellule hôte est E. coli.
  58. 58. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 57, dans laquelle à la suite de l'inclusion des glycosyltransférases qui produisent un oligosaccharide ou un polysaccharide ne comprenant pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif, ladite cellule hôte est capable de produire un rendement plus élevé de bioconjugués comprenant la protéine support liée en N à l'oligosaccharide ou au polysaccharide qu'une cellule hôte du même phénotype mais qui comprend l'oligosaccharide ou le polysaccharide donneur.
  59. 59. Cellule hôte selon la revendication 58, ladite cellule hôte produisant au moins ou environ 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, ou 500% de bioconjugués en plus qu'une cellule hôte du même phénotype mais qui comprend l'oligosaccharide ou le polysaccharide donneur, lesdits bioconjugués comprenant la protéine support liée en N à l'oligosaccharide ou au polysaccharide.
  60. 60. Cellule hôte selon la revendication 58, ladite cellule hôte produisant au moins ou environ 5 fois, 10 fois, 20 fois, 30 fois, 40 fois, 50 fois, 60 fois, 70 fois, 80 fois, 90 fois, ou 100 fois plus de bioconjugués qu'une cellule hôte du même phénotype mais comprenant l'oligosaccharide ou le polysaccharide donneur, lesdits bioconjugués comprenant la protéine support liée en N à l'oligosaccharide ou au polysaccharide.
  61. 61. Méthode de production d'un bioconjugué comprenant une protéine support liée en N à un oligosaccharide ou un polysaccharide ne comprenant pas d'hexose au niveau de l'extrémité réductrice du premier motif répétitif, ladite méthode comprenant (i) la culture de la cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 60 dans des conditions appropriées pour la production des protéines et (ii) l'isolation dudit bioconjugué.
  62. 62. Bioconjugué produit par la méthode selon la revendication 61.
  63. 63. Composition comprenant le bioconjugué selon la revendication 62.
  64. 64. Composition selon la revendication 63 pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une infection bactérienne chez un sujet.
  65. 65. Composition selon la revendication 63 pour une utilisation dans l'induction d'une réponse immunitaire contre une souche bactérienne chez un sujet.
  66. 66. Composition selon la revendication 64 ou 65, pour une utilisation dans laquelle le sujet est un humain.
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