BE1022446A9 - Utilisations des facteurs d'inhibition de la migration des macrophages parasites - Google Patents

Abstract

Cette invention se rapporte à des compositions (p. ex. les compositions de vaccin) qui peuvent être utilisées pour fournir à un sujet une immunité protectrice contre une infection de parasite. Les compositions comprennent : (i) une quantité immunologiquement efficace d'un acide nucléique (par exemple un vaccin à base d'acide nucléique) comprenant une séquence qui encode un antigène de facteur inhibiteur (MIF), parasite de migration de macrophage ; (ii) un antigène MIF de parasite ; ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF de parasite. Les compositions peuvent servir à traiter les infections et

les maladies causées par des protozoaires parasites, _________________________________________________________________________________________________„ ................................ comme un parasite Plasmodium ou les helminthes parasites.

Description

UTILISATIONS DES FACTEURS D'INHIBITION DE LA MIGRATION DES

MACROPHAGES PARASITES

Cette demande revendique le bénéfice de la demande de brevet européen 14161614.4 (déposée le 25 mars 2014), dont le contenu complet est incorporé aux présentes en référence à toutes fins.

DOMAINE TECHNIQUE

Cette invention concerne le domaine du traitement et la prévention des infections parasitaires. En particulier, la présente invention porte sur l'utilisation de facteurs d'inhibition de la migration des macrophages parasites (MIF, Migration Inhibitory Factors) pour la prévention des infections parasitaires comme le paludisme.

ARRIÈRE-PLAN DE LA TECHNIQUE

Les maladies parasitaires causées par les protozoaires et les helminthes affectent des milliards de personnes dans le monde et causent des millions de décès chaque année, en particulier dans les pays tropicaux. Le paludisme, par exemple, qui est causé par le Plasmodium protozoaire, infecte de 300 à 500 millions de personnes chaque année et provoque plus d'un million de décès. Plus d'un tiers de la population mondiale est à risque de paludisme. La mortalité liée à la maladie est principalement causée par des complications dues à une anémie sévère, un choc et le paludisme cérébral, qui peuvent être associés à une réponse pro-inflammatoire excessive. Le paludisme tue plutôt la population immunologiquement naïve, par exemple, les jeunes enfants. Une infection récurrente ou persistante du paludisme peut conduire à la « tolérance » d'une maladie grave, mais les cellules T CD4 mémoires ne semblent pas être convenablement entretenues après l'infection du paludisme et l'immunité protectrice et « stérilisante » ne se développe jamais. [1]. Cette incapacité de développer ou maintenir une immunité efficace « stérilisante » suite à l'infection a été reconnue comme une caractéristique de nombreuses autres infections parasitaires en plus du paludisme. [2]. Cela rend le développement des vaccins particulièrement difficile.

Le parasite Leishmania, un protozoaire flagellé, est une autre cause majeure de maladie parasitaire. La leishmaniose affecte environ 12 millions de personnes par an et provoque environ 60 000 décès, et environ 350 millions de personnes sont considérés à risque. La schistosomiase est causée par des helminthes parasites du genre Schistosoma et on estime qu'elle affecte 200 millions de personnes dans le monde et provoque environ 20 000 décès. On estime que l'infection causée par 1'ankylostome des nématodes Necator americanus et Ancylostoma duodenale affecte plus de 700 millions de personnes. On considère que les autres maladies parasitaires, comme la toxoplasmose, la filariose lymphatique, l'onchocercose et le ver de Guinée, peuvent affecter plus d'un milliard de personnes dans le monde à elles seules. Toutefois, les chercheurs ont eu du mal à développer des vaccins contre ces parasites en raison de leurs cycles de vie multicellulaires complexes, leur variabilité antigénique et leur évasion immunitaire. Ainsi, il y a encore une demande énorme pour des traitements efficaces qui protègent contre les infections parasitaires, comme le paludisme. DESCRIPTION DE L'INVENTION

Les présents inventeurs ont trouvé de manière inattendue que le facteur d'inhibition de la migration des macrophages (MIF) à partir d'un parasite peut être utilisé comme un antigène efficace dans un vaccin afin de fournir une immunité protectrice contre l'infection de parasite.

En particulier, les inventeurs ont conclu que l'immunisation de souris avec un vaccin ARN autoréplicatif encodant l'orthologue MIF du Plasmodium berghei (PbMIF) a conduit à une diminution mesurable et significative de parasitémie suite à l'épreuve initiale de Plasmodium et une réduction prononcée de parasitémie après guérison et reprise de l'épreuve. La parasitémie réduite a été accompagnée d'une expansion de la population des lymphocytes T mémoires répondant au Plasmodium chez les souris traitées. Les inventeurs ont également montré que l'immunisation avec un antigène PbMIF adjuvant était bien toléré et a induit une réponse immunitaire anti-PbMIF solide. L'immunisation avec PbMIF permet donc le développement accru des lymphocytes T mémoires et fournit une protection significative contre la réinfection du paludisme. En outre, les inventeurs ont montré que le transfert passif d'un anticorps anti-PbMIF réduit de manière significative la parasitémie suite à une infection de P. berghei.

Chez les mammifères, le MI F est une cytokine proinflammatoire omniprésente et hautement conservée qui présente des activités enzymatiques tautomérases et oxydoréductases et est impliquée dans la régulation d'un large éventail de réponses immunitaires. Le rôle du MIF dans le système immunitaire des mammifères a été largement étudié et il a été impliqué dans la pathogenèse de plusieurs maladies telles que le choc septique, l'asthme, la polyarthrite rhumatoïde et la maladie inflammatoire de l'intestin [3,4]. Les mécanismes moléculaires précis par lesquels les fonctions MIF ne sont pas encore bien comprises, mais le mammifère MIF a été démontré capable de se lier à et exercer ses effets inflammatoires via le récepteur de surface cellulaire CD74 (également connu comme le récepteur MIF MIF-R) [5,6]. Toutefois, le rôle du MIF a été largement considéré comme se limitant au système immunitaire inné.

Les orthologues de MIF ou homologues sont trouvés dans de nombreux organismes parasites qui infectent les mammifères, y compris les parasites protozoaires unicellulaires tels que Plasmodium, Leishmania et Toxoplasma et les helminthes et nématodes parasitaires telles que Brugia et Ancyclostoma. Malgré le fait qu'on ne partage souvent que les niveaux bas d'identité de séquence, ces orthologues parasites partagent des similitudes structurelles et fonctionnelles étroites avec les MIF de leurs hôtes mammifères [3, 4, 5] . Ainsi, la présente invention est applicable à un large éventail de parasites qui expriment un orthologue ou homologue du MIF. Par exemple, un orthologue du MIF produit par Leishmania major, a été identifié, lequel partage une homologie structurelle et fonctionnelle significative avec un MIF humain, y compris les activités tautomérases, chimiotactiques et anti-apoptotiques et la liaison du MIF-R [7] . On a démontré que les protéines du MIF produites par Plasmodium falciparum et Plasmodium berghei sont semblables les unes aux autres, aux mammifères MIF et autres MIF parasites, qu'elles interagissent avec MIF-R et partagent des fonctions enzymatiques et pro-inflammatoires similaires.

En vue de leur conservation et de leur distribution structurale entre les espèces d'une évolution lointaine, les présents inventeurs ont émis l'hypothèse que des orthologues parasites MIF jouent un rôle dans l'évasion de la réponse immunitaire hôte. Sun et al. [5] ont récemment montré que le MIF du Plasmodium augmente la production de cytokines inflammatoires et des cellules T CD4 activées induites pour les transformer en cellules effectrices de courte durée plutôt que des cellules précurseurs de la mémoire chez les souris infectées, empêchant l'établissement de la mémoire immunologique. En outre, les cellules T CD4 étaient plus sensibles à l'apoptose et les réponses du rappel de cellules T CD4 contre les infections provoquées ont été réduites. Des applications thérapeutiques spéculatives ciblant le MIF ont été proposées. Par exemple, Dobson et al. [4] ont suggéré que le MIF du Plasmodium pourrait être une cible potentielle de médicaments et qu'il serait important de cibler de manière sélective le parasite MIF par rapport aux protéines hôtes. Vermeire et al. [3] ont suggéré que les médicaments ou les vaccins ciblant spécifiquement les orthologues MIF nématodes pourraient avoir une valeur thérapeutique. Cho et al. [8] ont trouvé que l'immunisation des hamsters avec un orthologue MIF de 1'ankylostome Ancylostoma verum a atténué les symptômes cliniques de maladie associée à 1'ankylostome (perte de poids et anémie) et suggéré de cibler 1'ankylostome du MIF avec des inhibiteurs de petites molécules pour traiter l'infection. Cependant, aucun de ces documents n'élucide un rôle précis pour les orthologues MIF dans les infections parasitaires et, avant la présente invention, aucune application thérapeutique spécifique de MIF parasites invertébrés n'avait été fournie.

En revanche, les inventeurs ont identifié pour la première fois qu'une réponse immunitaire contre le MIF peut être utilisée pour fournir une immunité protectrice contre une infection parasitaire. En particulier, les inventeurs ont montré que les MIF parasites sont des candidats de vaccins viables qui peuvent être utilisés soit comme antigènes autonomes ou en association avec d'autres antigènes parasitaires dans le but de promouvoir des réponses de la mémoire de lymphocytes T mémoire de longue durée et une immunité protectrice contre l'infection de parasite. Les résultats des inventeurs montrent également qu'une réponse immunitaire humorale contre le MIF parasite peut protéger de façon efficace un sujet contre une infection de parasite. L'immunité protectrice contre l'infection de parasite peut donc être établie chez un sujet en suscitant une réponse immunitaire contre le MIF parasite et/ou en bloquant la fonction de MIF parasite dans le sujet, permettant ainsi à un sujet de développer une mémoire immunologique protectrice contre le parasite, en particulier lorsque le sujet est, ou a été exposé à des antigènes parasites autres que le MIF (par exemple dû à une infection ou l'exposition à d'autres vaccins parasites).

En conséquence, dans un aspect, l'invention fournit un procédé pour donner une immunité protectrice contre une infection parasitaire chez un sujet en ayant besoin, comprenant l'administration d'une quantité immunologiquement efficace d'une composition au sujet, où la composition comprend : (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ; (ii) un antigène MIF parasite ; ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite. Dans certains modes de réalisation, le procédé peut comprendre l'administration d'une combinaison de (i), (ii) et/ou (iii).

Dans un autre aspect, l'invention fournit une composition pour une utilisation dans un procédé pour fournir une immunité protectrice contre une infection parasitaire chez un sujet en ayant besoin, qui comprend une quantité immunologiquement efficace de : (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ; (ii) un antigène MIF parasite ; ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite. La composition peut être une composition pharmaceutique. En conséquence, la composition peut aussi comprendre un support acceptable du point de vue pharmaceutique. Dans certains modes de réalisation, la composition de (i) ou (ii) est une composition de vaccin. L'invention fournit également un procédé pour fournir une immunité protectrice contre une infection parasitaire chez un sujet en ayant besoin, comprenant l'administration de cellules T CD4 sensibles aux parasites isolées à partir d'un hôte compatible (de préférence de la même espèce que le sujet) , où l'hôte a été immunisé avec une composition de l'invention : à savoir une composition qui comprend une quantité immunologiquement efficace de (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ou (ii) un antigène MIF parasite. On peut avoir administré à l'hôte compatible une composition de l'invention conformément à une méthode pour donner l'immunité protectrice comme décrite par les présentes. On peut avoir administré à l'hôte compatible une composition de l'invention en une dose unique ou doses multiples (c'est-à-dire deux ou plusieurs doses) tel que décrit ci-dessus. Dans certains modes de réalisation, l'hôte compatible peut avoir été immunisé avec la composition et par la suite infecté par le parasite (voir ci-dessous) ou immunisé avec un autre antigène parasite (pour produire la population de cellules T CD4 sensibles aux parasites). Dans certains modes de réalisation, l'hôte compatible peut avoir été guéri de l'infection parasitaire, par exemple par l'administration d'un agent qui tue ou atténue le parasite. Par exemple, une infection par Plasmodium peut être guérie par l'administration d'un antipaludéen. Des exemples de tels agents / antipaludéens comprennent la chloroquine (CQ), la doxycycline, l'atovaquone (plus proguanil) et la méfloquine. Dans certains modes de réalisation, les cellules T CD4 sensibles aux parasites ont été isolées à partir d'un hôte compatible qui a été : (i) administré avec une composition de l'invention et (ii) ensuite infectées par le parasite ou immunisées avec un autre antigène parasite (pour produire la population de cellules T CD4 sensibles aux parasites). Optionnellement, (par exemple le cas où l'hôte est infecté par le parasite), l'hôte peut également avoir été guéri de l'infection par le parasite avant l'isolement des cellules T CD4 sensibles aux parasites. Les cellules T CD4 sensibles aux parasites isolés dudit hôte peuvent fournir chez le sujet une immunité stérilisante (c.-à-d. immunité protectrice totale), au moyen de laquelle le sujet protégé peut provoquer une réponse immunitaire qui élimine complètement l'infection par le parasite.

Le parasite peut être un parasite invertébré, par exemple protozoaire ou helminthe. Dans certains modes de réalisation, le parasite est un protozoaire, par exemple un parasite apicomplexe tel que le Plasmodium. Dans certains modes de réalisation, le protozoaire parasite appartient à un genre choisi dans le groupe composé de : Plasmodium, Toxoplasma, Babesia, Eimeria, Theileria, Neospora, Sarcocystis, Leishmania et Trypanosoma. Dans certains modes de réalisation, le parasite est un helminthe, par exemple un nématode. Dans certains modes de réalisation, l'helminthe parasite appartient à un genre choisi dans le groupe composé de : Ancyclostoma, Necator, Brugia, Wuchereria, Loa, Mansonella, Trichinella, Trichuris, Ascaris,

Anisakis, Dracunculus, Strongyloïdes, Haemonchus, Schïstosoma et Fasciola.

Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant une quantité immunologiquement efficace de : (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ; ou (ii) un antigène MIF parasite ; dans laquelle l'antigène MIF provient d'un protozoaire parasite. L'invention fournit également une composition comprenant une quantité immunologiquement efficace de : (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ; ou (ii) un antigène MIF parasite; dans laquelle l'antigène MIF est un helminthe parasite qui appartient à un genre choisi dans le groupe composé de : Ancyclostom'a, Necator, Brugia, Wucherer ia, Loa, Mansonella, Trichinella, Trichuris, Ascaris, Anisakis, Dracunculus, Strongyloides, Haemonchus,

Schistosoma et Fasciola.

Antigènes MIF parasites L'utilisation d'un antigène MIF parasite dans la présente invention génère une réponse immunitaire chez un sujet dont on constate un polypeptide MIF parasite d'origine naturelle (p. ex. une réponse immunitaire protectrice). L'antigène MIF parasite peut aussi être dénommé un antigène polypeptide MIF parasite. L'« antigène MIF parasite » comprend des fragments immunogènes d'un polypeptide MIF parasite, mais aussi un· polypeptide MIF parasite entier ou de pleine longueur. Par exemple, un antigène MIF parasite peut comprendre ou être constitué d'un polypeptide MIF parasite de pleine longueur ou un fragment immunogène d'un polypeptide MIF parasite. Le polypeptide MIF parasite peut être un polypeptide MIF parasite d'origine naturelle ou une variante de celui-ci (c'est-à-dire une variante ayant une ou plusieurs substitutions d'acides aminés et/ou suppressions). Dans certains modes de réalisation, l'antigène MIF parasite comporte une séquence d'acides aminés contigus et/ou un épitope qui se trouve dans un polypeptide MIF parasite d'origine naturelle.

Le « polypeptide MIF parasite d'origine naturel », comme utilisé ci-après, se réfère à un polypeptide MIF qui est exprimé dans la nature par un parasite. En règle générale, un polypeptide MIF parasite d'origine naturelle est fait d'environ 110 à environ 120 acides aminés de longueur. Dans sa mature, forme transformée, il a un résidu de proline à N-terminal (formé après clivage de méthionine au cours du traitement initial de protéine). Un polypeptide MIF parasite d'origine naturelle peut avoir au moins une activité biologique choisie parmi une activité enzymatique tautomérase de MIF et-R ( par exemple CD74 humain ) d'une activité de liaison. Les polypeptides MIF parasites d'origine naturelle sont des membres d'une superfamille structurale unique, caractérisée par la formation d'un trimère de sous-unités identiques. Dans un MIF d'origine naturelle, chaque monomère peut contenir deux alpha-hélices antiparallèles qui s'emballent contre une feuille bêta à quatre brins, chaque monomère ayant deux brins bêta supplémentaires qui interagissent avec les feuilles bêta des sous-unités adjacentes pour former l'interface entre les monomères. Les trois feuilles bêta peuvent être organisées pour former un baril contenant une chaîne solvant-accessible qui traverse le centre de la protéine le long d'un axe triple moléculaire.

Des exemples de polypeptides de MIF d'origine naturelle comprennent :

Plasmodium falciparum MIF (numéro d'accession UniProt Q8I5C5) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 1:

PCCEVITNVNLPDDNVQSTLSQIENAISDVMGKPLGYIMSNYDYQKNLRFGGSNEAYC FVRITSIGGINRSNNSALADQITKLLVSNLNVKSRRIYVEFRDCSAQNFAFSGSLFG Plasmodium berghei MIF (numéro d'accession UniProt Q4YQW0) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 2 :

PCCELITNISIPDDKAQNTLSEIEDAISNILGKPVAYIMSNYDYQKNLRFSGSNEGYC FVRLTSIGGINRSNNSLLADKITKILSNHLSVKPRRVYIEFRDCSAQNFAFSGSLFG Plasmodium yoelii MIF (numéro d'accession UniProt Q1HEA2) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 3 : PCCELITNISIPDDKAQNALSEIEDAISNVLGKPVAYIMSNYDYQKNLRFSGSNEGYC FVRLTSIGGINRSNNSSLADKITKILSNHLGVKPRRVYIEFRDCSAQNFAFSGSLFG Plasmodium yoelii MIF (numéro d'accession UniProt Q4Y5M8) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 4 : PCCELITNISIPDDKAQAALSEIEDAISNVLGKPTAYIMSNYDYQKNLRFAGSNEGYC FVRLTSLGGINRSNNSSLADKITKHLANHLGVKPRRVYIEFRDCSAQNFAFSGSLFG Plasmodium vivax MIF (numéro d'accession UniProt A5K093) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 5 : PCCQVSTNINASDDDAKKALSQIENAISQVLGKPLGYIMSNLDYQKHMRFGGSHDGFC FVRVTSLGGINKSNNSSLADKITKILASTLNVKSERVFIEFKDCSAQNFAFNGSLFG Plasmodium knowlesi MIF (numéro d'accession UniProt B3LCT3) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 6 : PCCQVSTNINVSDDDAKKALMQIENAISQVMNKPMGYIMSNLDYQKHMRFGGSHDGFC FVRVTSISGISRSNNTALADKITKILASTIKVKSDRVFIEFKDCSAQNFAFNGSLFG Toxoplasma gondii MIF (numéro d'accession UniProt A1XDS9) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 7 : PKCMIFCPVAATPAQQDALLKDAEKAVADALGKPLSYVMVGYSQTGQMRFGGSSDPCA FIRVASIGGITSSTNCKIAAALSAACERHLGVPKNRIYTTFTNKSPSEWAMGDRTFG Leishmania major MIFi ((numéro d'accession UniProt Q4Q413) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 8 : PVIQTFVSTPLDHHKRENLAQVYRAVTRDVLGKPEDLVMMTFHDSTPMHFFGSTDPVA CVRVEALGGYGPSEPEKVTSIVTAAITKECGIVADRIFVLYFSPLHCGWNGTNF Leishmania major MIF2 (numéro d'accession UniProt Q4Q412) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 9 : PFLQTIVSVSLDDQKRANLSAAYGMICREELGKPEDFVMTAFSDKTPISFQGSTAPAA YVRVESWGEYAPSKPKMMTPRIAAAITKECGIPAERIYVFYYSTKHCGWNGTNF Giardia intestinalis MIF (numéro d'accession UniProt A8BFP4) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 10 : PCAIVTTNADFTKDQADAFCLDMGQVLAKETGKPVSYCMAGVRKADMSFGTSTDLCCF VDFYCIGVISQAKNPSISAAITGCLTQHFKVKPERVYISFNEAKGHNWGFNGSTF Brugia malayi MIF (numéro d'accession UniProt A8PJU3) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 11 :

PYFTIDTNIPQNSISSAFLKKASNWAKALGKPESYVSIHVNGGQAMVFGGSEDPCAV

CVLKSIGCVGPKVNNSHAEKLYKLLADELKIPKNRCYIEFVDIEASSMAFNGSTFG

Wuchereria bancrofti MIF (numéro d'accession UniProt 044786) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 12 : PYFTIDTNKPQDSISSAFLKKAPNVVPKALGKPESYVSIHVNGGQPMVFGGSEDPCPV CVLKSIGCVGPKVNNSHAEKLYKLLADELKIPKNRCYIESVDIEASSMAFNGSTFG Ancylostoma duodenale MIF (numéro d'accessionUniProt I3RWR9) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 13 :

PMVRVATNLPDKDVPANFEERLTDILAESMNKPRNRIAIEVMAGQRITHGASRNPVAV

IKVESIGALSADDNIRHTQKITQFCQDTLKLPKDKVIITYFDLQPIHVGFNGTTVAAA

TM

Ancylostoma ceylanicum MIFi (numéro d'accession UniProt A4GRE3) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 14 :

PMVRVATNLPDKDVPANFEERLTDLLAESMNKPRNRIAIEVLAGQRITHGASRNPVAV

IKVESIGALSADDNIRHTQKITQFCQDTLKLPKDKVIITYFDLQPIHVGFNGTTVAAA

TM

Ancylostoma ceylanicum MIF2 (numéro d'accession UniProt B6RTC1) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 15 : PVFQLHTNVSQDKVTPDLLKQISALVARILHKPESYVAVHVVPDQKMTFAGTDGPCGI GILKSIGGVGGSQNNSHAKALFALIKDHLGIEGSRMYIEFVDIGASDIAHNGRTFA Trichinella spiralis MIF (numéro d'accession UniProt E5SFT7) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 16 : PIFTLNTNIKATDVPSDFLSSTSALVGNILSKPGSYVAVHINTDQQLSFGGSTNPAAF GTLMSIGGIEPSRNRDHSAKLFDHLNKKLGIPKNRMYIHFVNLNGDDVGWNGTTF Trichuris trichiura MIF (numéro d'accession UniProt P81748) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 17 : PIFTFSTNVPSENISVDFLKSTSKLIAGMLGKPESYVAVHINGGQKITFGGTDAPAGF GQLLSLGGVGGEKNRSHSAKLFKHLTDGLGIPGNRMYINFVDMRGSDVGYNGSTF Onchocerca volvulus MIF (numéro d'accession UniProt Q963F7) ; IDENTIFIANT SÉQUENCE : 18 : PAFTINTNIPQSNVSDAFLKKASSTVAKALGKPESYVAIHVNGGQAMVFGGSTDPCAV CVLKSIGCVGPNVNNSHSEKLFKLLADELKIPKNRCYIEFVNIDASTMAFNGSTFG Les numéros d'accession UniProt mentionnés ci-dessus se réfèrent à des séquences polypeptidiques MIF qui comprennent une méthionine à N-terminal qui n'est pas présente dans le polypeptide MIF mature. LES IDENTIFIANTS SÉQUENCE : 1-18 montrent la séquence de polypeptide MIF mature, commençant par une proline à N-terminal.

Un antigène MIF parasite peut comporter un polypeptide MIF parasite qui est une variante d'un polypeptide MIF parasite d'origine naturelle. La variante peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 98 % ou au moins 99 % identique à un polypeptide MIF parasite d'origine naturelle de longueur pleine par exemple, un polypeptide selon 1'IDENTIFIANT SÉQUENCE : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18. Alternativement, ou en outre, l'antigène MIF parasite peut comporter un fragment immunogène (c'est-à-dire un fragment contenant de l'épitope) d'un polypeptide MIF parasite qui peut contenir une séquence d'acides aminés contigus d'au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17 , au moins 18, au moins 19 acides aminés identique à une séquence d'acides aminés contigus d'un polypeptide MIF parasite d'origine naturelle, par exemple, un polypeptide selon 1'IDENTIFIANT SÉQUENCE : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18.

Dans certains modes de réalisation, l'antigène MIF parasite comprend une séquence d'acides aminés qui est au moins 7 0 % identique (par exemple, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 98 % ou au moins 99 % identique) à l'IDENTIFIANT SÉQUENCE : 1 et/ou comprend une séquence d'acides aminés contigus d'au moins 8 acides aminés (par exemple, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13 , au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19 acides aminés) qui est identique à une séquence d'acides aminés contigus de 1'IDENTIFIANT SÉQUENCE : 1. Dans certains modes de réalisation, l'antigène MIF parasite comprend une séquence d'acides aminés qui est identique à au moins 70 % (par exemple, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 98 % ou au moins 99 % identique) à 1 : 2 et/ou comprend une séquence d'acides aminés contigus d'au moins 8 acides aminés (par exemple, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13 , au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19 acides aminés) qui est identique à une séquence d'acides aminés contigus de 1'IDENTIFIANT SÉQUENCE : 2.

Lorsque l'antigène MIF parasite est une variante d'un polypeptide MIF parasite d'origine naturelle, l'antigène MIF parasite peut avoir une ou plusieurs substitutions et/ou suppressions d'acides aminés (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 etc.) par rapport au polypeptide MIF parasite d'origine naturelle. La variante peut comporter un maximum de 5, 10, 15 ou 20 substitutions et/ou suppressions par rapport au polypeptide MIF parasite d'origine naturelle. Une ou plusieurs substitutions peuvent être des remplacements d'acides aminés conservateurs, c'est-à-dire le remplacement d'un acide aminé par un autre qui possède une chaîne latérale connexe. Codés génétiquement, des acides aminés sont généralement divisés en quatre familles : (1) acides par exemple aspartate, glutamate ; (2) basique par exemple lysine, arginine, histidine ; (3) non-polaire par exemple alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phénylalanine, méthionine, tryptophane ; et (4) sans charge polaire par exemple glycine, asparagine, glutamine, cystine, sérine, thréonine, tyrosine. La phenylalanine, le tryptophane, et la tyrosine sont parfois classés conjointement comme acides aminés aromatiques. En général, la substitution d'acides aminés simples au sein de ces familles n'a pas un effet majeur sur l'activité biologique. La variante peut également inclure une ou plusieurs insertions (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 etc.) d'acides aminés (par exemple, chacun des 1, 2, 3, 4 ou 5 acides aminés) par rapport au polypeptide MIF parasite d'origine naturelle. La variante peut avoir un maximum de 5, 10, 15 ou 20 insertions par rapport au polypeptide MIF parasite d'origine naturelle.

La variante peut être encodée par une séquence d'acides nucléiques qui peut s'hybrider dans des conditions strictes, à une séquence d'acide nucléique qui encode un polypeptide MIF parasite d'origine naturelle. Les réactions d'hybridation peuvent être réalisées dans des conditions de « stringence » différentes. Les conditions qui augmentent la stringence d'une réaction d'hybridation sont largement connues et publiées dans la technique (par exemple, la page 7.52 de référence 9). Des exemples de conditions appropriées comprennent (par ordre de stringence croissante) : des températures d'incubation de 25 °C, 37 °C, 50 °C, 55 °C et 68 °C ; des concentrations de tampon de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC (où SSC est de 0,15 M de NaCl et 15 mM de tampon citrate) et leurs équivalents utilisant d'autres systèmes tampons ; des concentrations de formamide de 0 %, 25 %, 50 % et 75 % ; des temps d'incubation allant de 5 minutes à 24 heures ; 1, 2 ou plusieurs étapes de lavage ; des temps d'incubation pour le lavage de 1, 2, ou 15 minutes ; et des solutions de lavage de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC, ou de l'eau déminéralisée. Les techniques d'hybridation et leur optimisation sont bien connues dans la technique [par exemple, voir les références 9,12, etc.]. De préférence, une séquence d'acide nucléique codant une variante hybride, dans des conditions de stringence élevée (p. ex. 68 °C et 0,1 x SSC), une séquence d'acide nucléique qui encode un polypeptide MIF parasite d'origine naturelle.

Dans certains modes de réalisation, l'antigène MIF parasite est composé d'au moins 20, au moins 30, au moins 40, au moins 50, au moins 60, au moins 70, au moins 80, au moins 90 ou au moins 100 acides aminés en longueur.

Dans le présent document, le terme « antigène » désigne une molécule contenant un ou plusieurs épitopes (p. ex. : linéaire, conformationnel, ou les deux) qui va stimuler le système immunitaire de l'hôte pour donner une réponse humorale et/ou immunologique spécifique de l'antigène cellulaire (c'est-à-dire une réponse immunitaire qui reconnaît spécifiquement un polypeptide MIF parasite d'origine naturelle). Un « épitope » est la portion d'un antigène qui détermine sa spécificité immunologique. L'antigène, ou un acide nucléique codant l'antigène, peuvent être isolés ou purifiés à partir d'une source naturelle (à savoir un parasite d'intérêt), mais sera généralement produit par des techniques recombinantes ou synthétiques, lesquelles seront familières aux personnes du métier.

Un antigène MIF parasite peut comporter au moins un épitope à cellule T ou B du polypeptide MIF parasite d'origine naturelle. Les épitopes à cellules T et B peuvent être identifiés de façon empirique (par exemple en utilisant PEPSCAN [13,14] ou des méthodes similaires), ou ils peuvent être prédits (par exemple, en utilisant l'indice antigénique Jameson-Wolf [15], les approches fondées sur la matrice [16], TEPITOPE [17], les réseaux neuronaux [18], OptiMer & ÉpiMère [19, 20], ADEPT [21] , Tsites [22], hydrophile [23], indice antigénique [24] ou les méthodes décrites en référence, 25 etc.).

Dans certains modes de réalisation, l'antigène MIF parasite est capable de susciter une réponse des cellules T dans le sujet, par exemple une réponse des cellules (CD4) T auxiliaire.

Plusieurs antigènes MIF parasites

Une composition de l'invention peut utiliser ou cibler un antigène MIF parasite unique, ou peut utiliser ou cibler deux ou plusieurs antigènes MIF parasites différents. Ainsi, dans certains modes de réalisation, une composition telle que définie dans les présentes peut comporter ou encoder un antigène MIF parasite unique ou deux ou plusieurs antigènes MIF parasites différents et/ou peuvent comporter des anticorps qui se lient spécifiquement à un antigène MIF parasite seul ou à deux ou plusieurs antigènes MIF parasites différents.

Dans certains modes de réalisation, la composition peut comporter un acide nucléique qui encode deux ou plusieurs antigènes MIF parasites. Dans certains modes de réalisation, la composition peut comporter deux ou plusieurs acides nucléiques qui encodent un antigène MIF parasite. Dans certains modes de réalisation, la composition peut comporter deux ou plusieurs antigènes MIF parasites. Dans certains modes de réalisation, la composition peut comporter deux ou plusieurs anticorps qui lient respectivement deux ou plusieurs antigènes MIF parasites.

Dans certains modes de réalisation, une composition de l'invention peut comprendre une combinaison de : (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ; (ii) un antigène MIF parasite ; ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite. · Par exemple, la composition peut comprendre une combinaison de (i) et (ii) , (i) et (iii), (ii) et (iii), ou (i) , (ii) et (iii).

Dans chacun de (i) , (ii) et (iii), l'antigène MIF parasite peut être un antigène MIF parasite différent.

Les différents antigènes MIF parasites peuvent être dérivés d'espèces de parasites différents, peuvent être différentes variantes d'un antigène MIF parasite ou peuvent comporter différents épitopes MIF parasites. Dans certains modes de réalisation, une composition peut comprendre ou encoder deux, trois, quatre, ou plus, des antigènes MIF parasites qui peuvent contenir une série d'épitopes. Dans certains modes de réalisation, une composition peut comporter deux, trois, quatre ou plus anticorps qui se lient spécifiquement à un épitope d'antigène MIF parasite différent.

Antigènes de parasites supplémentaires

Comme indiqué plus haut, la réponse immunitaire à l'antigène MIF parasite peut améliorer le développement d'une réponse immunitaire protectrice (par exemple, une réponse de la cellule T CD4 mémoire) à un ou plusieurs antigènes de parasites supplémentaires. Ainsi, les parasites MIF peuvent servir soit comme antigènes autonomes ou en combinaison avec des antigènes de parasites supplémentaires afin de promouvoir des réponses des cellules T mémoires de longue durée et une immunité protectrice contre l'infection de parasite.

Ainsi, une composition telle que définie dans les présentes (c'est-à-dire une composition comprenant (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite, (ii) un antigène MIF parasite ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite) peut en outre comprendre ou encoder un ou plusieurs antigènes de parasites supplémentaires (antigènes de parasite qui ne sont pas des antigènes MIF parasites, ou « antigènes de parasite non-MIF ») . Dans certains modes de réalisation, la composition peut comporter une séquence d'acide nucléique qui encode un antigène de parasite supplémentaire. Par exemple, la composition peut comporter un acide nucléique comprenant aussi bien une séquence qui encode un antigène MIF parasite et une séquence qui encode un antigène parasite supplémentaire (c.-à-d. l'antigène MIF parasite et l'antigène parasite supplémentaire peuvent être encodés par la même molécule d'acide nucléique). Alternativement, ou en outre, la composition peut comporter un acide nucléique plus avancé comprenant une séquence qui encode un antigène parasite supplémentaire (c.-à-d. l'antigène MIF parasite et l'antigène parasite supplémentaire peuvent être encodés par des molécules d'acide nucléique séparées).

Dans certains modes de réalisation, la composition peut comprendre à la fois un antigène MIF parasitaire et un antigène de parasite supplémentaire.

Alternativement, ou en outre, une composition telle que définie dans les présentes (c'est-à-dire une composition comprenant (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite, (ii) un antigène MIF parasite ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite) peut être administrée à un sujet en combinaison avec une composition plus avancée qui comprend ou encode un ou plusieurs antigènes de parasites supplémentaires. La composition plus avancée peut en outre être une composition de vaccin de parasites. Par exemple, un ou plusieurs antigènes parasites supplémentaires peuvent être formulés comme une composition de vaccin de parasites. Dans certains modes de réalisation, une composition telle que définie dans les présentes peut être administrée à un sujet en combinaison avec une composition plus avancée qui comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène de parasite supplémentaire. Dans certains modes de réalisation, une composition telle que définie dans les présentes peut être administrée à un sujet en combinaison avec une composition plus avancée qui comprend un antigène de parasite supplémentaire.

Alternativement, dans certains modes de réalisation, un procédé pour fournir une immunité protectrice contre une infection parasitaire chez un sujet nécessitant un tel traitement selon la présente invention peut comprendre en outre l'administration au sujet d'une composition plus avancée qui comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène de parasite supplémentaire. Dans certains modes de réalisation, un procédé pour fournir une immunité protectrice contre une infection parasitaire chez un sujet nécessitant un tel traitement selon la présente invention peut comprendre en outre l'administration au sujet d'une composition qui comprend en outre un antigène de parasite supplémentaire.

Ainsi, dans un procédé pour fournir une immunité protectrice contre une infection parasitaire chez un sujet dans le besoin, selon la présente invention, on peut administrer au sujet : (1) une composition telle que définie ici, qui comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite et une composition plus avancée qui comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène parasite supplémentaire ; (2) une composition telle que définie ici, qui comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite et une composition plus avancée qui comprend un antigène de parasite supplémentaire ; (3) une composition telle que définie ici, qui comprend un antigène MIF parasite et une composition qui comprend en outre un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène parasite supplémentaire ; (4) une composition telle que définie ici, qui comprend un antigène MIF parasite et une composition plus avancée qui comprend un antigène de parasite supplémentaire ; (5) une composition telle que définie ici, qui comprend un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite et une composition plus avancée qui comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui code un antigène parasite supplémentaire ; ou (6) une composition telle que définie ici, qui comprend un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite et une composition plus avancée qui comprend un antigène parasite supplémentaire.

La composition telle que définie ici (c'est-à-dire une composition comprenant (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite, (ii) un antigène MIF parasite ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite) et la composition comprenant ou codant l'antigène parasite supplémentaire peuvent être fournies en tant que composants distincts et/ou administrés séparément. Alternativement, la composition telle que définie ici (par exemple une composition comprenant (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite, (ii) un antigène MIF parasite, ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasitaire ) et la composition comprenant ou codant l'antigène parasite supplémentaire peuvent être mélangées avant leur administration. L'administration de (A) la composition telle que définie ici (c'est-à-dire une composition comprenant (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MI F parasite, (ii) un antigène MIF parasite ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite) et (B) la composition comprenant ou codant l'antigène de parasite supplémentaire, dans une quelconque combinaison comme décrit ci-après, peut être contemporaine. Par exemple, les compositions (A) et (B) peuvent être administrées en même temps, séparément ou de façon séquentielle. Les compositions (A) et (B) peuvent être administrées dans les 12 mois l'un de l'autre, dans les 6 mois l'un de l'autre, ou en un mois ou moins l'une de l'autre (par exemple, dans les 10 jours) . Les compositions (A) et (B) peuvent être administrées dans les 7 jours, dans les 3 jours, dans les 2 jours, ou dans 24 heures l'une de l'autre. L'administration simultanée peut impliquer l'administration de compositions (A) et (B) en même temps. L'administration simultanée peut inclure l'administration de (A) et (B) à un patient à 12 heures d'intervalle, à 6 heures, à 3 heures, à 2 heures ou à 1 heure l'une de l'autre, généralement lors de la même visite à un centre clinique. La composition (A) peut être administrée avant (B).

Dans certains modes de réalisation, l'antigène parasite supplémentaire peut être dérivé de la même espèce de parasites que l'antigène MIF parasite. Dans d'autres modes de réalisation, l'antigène de parasite supplémentaire peut être d'une espèce différente par rapport à l'antigène MIF parasite.

Un ou plusieurs autres antigènes de parasites peuvent, par exemple, être des antigènes de Plasmodium, ou dérivés d'antigènes de Plasmodium, comme la protéine circumsporozoïte (CS) (éventuellement fusionnée à un antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBsAg)) ; protéine de surface du mérozoïte (MSP), par exemple MSP-1 ; homologue 5 de protéine liant les réticulocytes (RH5), par exemple, PfRH5 ; l'antigène 1 de la membrane apicale (AMA1) ; protéine d'adhésion apparentée à la thrombospondine (TRAP) ; ΜΕ-TRAP (segment d'épitope multiple avec des protéines d'adhésion liées à la thrombospondine : un antigène de fusion pré-érythrocytaire constitué de 17 cellules B, épitopes de cellules T CD4 + et CD8 + provenant de six antigènes de P. falciparum fusionnés à l'allèle T9/96 de TRAP) ; antigène stade hépatique 1 (LSA-1) ; antigène-3 stade hépatique (LSA-3) ; protéine 1 exportée (Exp-1) ; antigène codé par 1'ADN de polyépitope EP1300 avec des séquences de liaison de quatre antigènes pré-érythrocytaires, CS, TRAP, LSA-1 et Exp-1 ; polyprotéine comprenant LSA-3, protéine riche en asparagine, thréonine et sporozoïte (STARP), Expl, Pfsl6, TRAP, et LSA-1 ; une protéine de mérozoïtes de P. falciparum (FMP) comme FMP010 ou FMP001 ; 3-protéine de surface des mérozoïtes (MSP-3) ; la liaison antigène-175 érythrocytaire (EBA175) ; EBA175 RII ; antigène de répétition de sérine (SERA5) ; SE36, une protéine recombinante correspondant à un fragment de l'antigène SERA5 ; protéine riche en glutamate (GLURP) ; antigène de surface de l'érythrocyte infecté à l'anneau (RESA) ; des fragments antigéniques de n'importe lequel de ce qui précède ; ou une combinaison des deux. Dans certains modes de réalisation, un ou plusieurs autres antigènes peuvent être sous forme de sporozoïtes non-répliquant, tels que le PfSPZ (qui se compose de sporozoïtes de Plasmodium falciparum atténués, aseptiques, purifiés, cryopréservés ) (p. ex. Seder et al. Science 341, 1359 (2013)).

Dans certains modes de réalisation, un antigène parasite supplémentaire qui s'utilise avec l'invention est une protéine CS, qui comprend des antigènes de P. falciparum basés sur la protéine circumsporozoïte (CS). Cela peut prendre la forme d'une protéine recombinante qui fusionne une partie de la protéine CS avec HBsAg, connu sous le nom de « RTS», ou TRAP. Les antigènes de P. falciparum appropriés pour fabriquer des hybrides HBsAg peuvent être basés sur une sous-unité de l'antigène de surface circumsporozoïte (« CSP »). Par exemple, ils peuvent inclure entre 3 et 20 répétitions de son motif PNNA, et/ou ils peuvent comprendre la région C-terminal de CSP (mais en général ne comprend les 12 derniers acides aminés du C-terminal). RTS est une protéine hybride comprenant la quasi-totalité la portion C-terminal de CS du NF54 ou isolât 7G8 de P. falciparum (acides aminés 210 à 398, qui comprend 19 répétitions PNNA et dans la région d'épitope de cellule T à acides aminés 367 à 390), fusionnée au N-terminal du HBsAg de quatre acides aminés de la portion preS2 de du HBsAg [26] . La séquence de RTS peut donc contenir : (i) un résidu de méthionine N—terminal ; (ii) Met-Ala-Pro ; (iii) 189 acides aminés correspondant aux acides aminés 210-398 de la protéine CS de 7G8 de P. falciparum ou aux acides aminés 207-395 de protéine CS de NF54 de P. falciparum ; (iv) Arg ou Gly ; (v) Pro-Val-Thr-Asn de la protéine du virus de l'hépatite B Pre-S2 protein ; et (vi) HBsAg. Lorsqu'elle est exprimée dans la levure (en particulier dans S. cerevisiae) , la RTS est produite en tant que particule de lipoprotéine (y comprenant notamment les phospholipides) , et quand elle est co-exprimée avec l'antigène S de HBV, elle produit une particule mixte appelée RTS, S. Un ratio de RTS:S d'environ 1:4 est utile. Les antigènes TRAP sont décrits dans la référence 27. Dans certains modes de réalisation, un antigène de parasite supplémentaire peut prendre la forme de RTS, S.

Un ou plusieurs antigènes parasites supplémentaires peuvent provenir de toutes les espèces de Plasmodium, y compris les espèces de Plasmodium énumérées ci-dessous. Dans certains modes de réalisation, l'antigène de parasite supplémentaire est un antigène Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax. Dans certains modes de réalisation, l'antigène de parasite supplémentaire est une protéine CS (éventuellement fondue avec HBsAg) ; MSP-1 ; PfRH5 ; AMAl ; et des fragments antigéniques de celles-ci. Par exemple, l'antigène MIF parasite peut être un antigène de Plasmodium falciparum MIF et l'antigène de parasite supplémentaire peut être une protéine (CS) de circumsporozoïte de Plasmodium falciparum fondue à un antigène de surface du virus de l'hépatite B (AgHBs).

Dans d'autres modes de réalisation, un ou plusieurs autres antigènes de parasites supplémentaires peuvent être des antigènes de Leishmania, ou dérivés à partir d'antigènes de Leishmania, comme antioxydant spécifique au thiol (TSA) ; protéine 1 inductible au stress (LmSTIl) ; facteur d'initiation de l'élongation du Leishmania (LelF) ; antigène de surface recombinant gp63 ; lipophosphoglycane ; un antigène de promastigote 46 kD dérivé du L. amazonensis ; kinase C activée par Leishmania (LACK) ; antigène de surface du parasite (PSA) ; et l'antigène-2 de surface de parasite (PSA-2) ; antigènes de Schistosoma tels que parasite myosine de 63 kD ; paramyosine 97 kD ; triose phosphate isomérase (TPI) de 28 kD ; protéine intégrale de membrane de 23 kD (Sm23) ; TPS de 26 et 28 kDa ; TPS de S. haematobium de 28 kD (Sh28GST) ; Tetraspanin-2 (SmTSP-2) et protéine de liaison aux acides gras (FABP). Ils peuvent être des antigènes d'Ancyclostoma ou des antigènes provenant de 1'Ancylostoma, telles que la protéine sécrétée Ancylostoma (ASP) ; ils peuvent être des antigènes ou des antigènes dérivés de Necator, tels que Na-ASP-2, une protéine de 21 kDa à partir de Necator americanus ; des fragments antigéniques quelconque parmi ceux susmentionnés, ou une combinaison de ceux-ci.

Une composition de l'invention peut également être utilisée dans un procédé pour améliorer une réponse immunitaire à un autre antigène (par exemple non-MIF) de parasite (par exemple, un autre antigène de Plasmodium, tel que décrit ici) . Ainsi, on fournit ici un procédé pour améliorer une réponse immunitaire à un antigène de parasite, comprenant l'administration d'une composition de l'invention (par exemple une composition comprenant (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui code pour un antigène MIF parasite, (ii) un parasite MIF antigène, et/ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite) à un sujet. L'antigène de parasite contre lequel la réponse immunitaire est améliorée peut comprendre un ou plusieurs autres antigènes parasitaires, comme défini ici. La méthode peut aussi inclure l'administration d'un antigène parasite non-MIF au sujet. Les antigènes du MIF et non-MIF peuvent être administrés simultanément, séparément, ou successivement.

La réponse immunitaire peut être améliorée par rapport à la réponse immunitaire chez un sujet traité avec l'antigène de parasite non-MIF uniquement. La réponse immunitaire améliorée peut comprendre une réponse immunitaire protectrice améliorée contre l'infection de parasite. Les réponses immunitaires protectrices sont définies ici. Par exemple, la réponse immunitaire protectrice peut être caractérisée par une mémoire immunitaire (par exemple une réponse des cellules T mémoire de protection) contre le parasite. L'immunité protectrice peut être une immunité stérilisante.

Polypeptides

Dans certains modes de réalisation, un polypeptide selon la présente invention est sous une forme non-naturelle (p. ex. une forme recombinante ou modifiée).

Par exemple, les polypeptides (p. ex. les antigènes) ci-décrits peuvent être préparés par synthèse chimique (en totalité ou en partie), par digestion des polypeptides plus longs à l'aide de protéases, par la translation de RNA, par purification à partir de culture de cellules (par exemple, à partir de l'expression recombinante), de l'organisme lui-même, etc. Un exemple de procédé pour la production de peptides <40 acides aminés de long impliquant une synthèse chimique in vitro [28, 29]. Des techniques de synthèse peptidiques en phase solide, telles que les procédés basés sur tBoc ou la chimie Fmoc [30] sont connus dans la technique. La synthèse enzymatique [31] peut également être utilisée en totalité ou en partie. Comme alternative à la synthèse chimique, la synthèse biologique peut être utilisée. Par exemple, les polypeptides peuvent être produits par translation. Ceci peut être réalisé in vitro ou in vivo. Les méthodes biologiques se limitent en général à la production de polypeptides issus des L-acides aminés, mais la manipulation des machines de translation (par exemple des molécules d'aminoacyl-ARNt) peut être utilisée pour permettre l'introduction d'acides aminés D (ou d'autres acides aminés non naturels, tels que 1'iodotyrosine ou la méthylphénylalanine, 1'azidohomoalanine, etc.) [32]. Là où les D-acides aminés sont inclus, il est préférable d'utiliser la synthèse chimique. Les polypeptides de la description peuvent présenter des modifications covalentes à l'extrémité C-terminale et/ou N-terminale. Ils peuvent également prendre des formes variées (par exemple native, fusions, glycosylée non- glycosylée, lipidée, non-lipidée, phosphorylée, non-phosphorylée, myristoylée, non-myristoylée, monomère, multimère, particules, dénaturé, etc.). Les polypeptides peuvent être naturellement ou non naturellement glycosylés (c.-à-d. le polypeptide peut avoir un profil de glycosylation qui diffère du motif de glycosylation trouvé dans le polypeptide naturel correspondant).

Les formes de polypeptides non naturels selon l'invention peuvent comprendre une ou plusieurs séquences hétérologues d'acides aminés (par exemple une autre séquence d'antigène ou une balise détectable) en plus d'une séquence d'antigène MIF parasite. Par exemple, un polypeptide de l'invention peut être une protéine de fusion. Alternativement, ou en outre, la séquence d'acides aminés ou la structure chimique du polypeptide peut être modifiée (par exemple avec un ou plusieurs acides aminés non naturels, par modification covalente, et/ou ou en ayant un profil de glycosylation différent, par exemple, par l'élimination ou l'addition d'un ou de plusieurs groupes de glycosyl) par rapport à une séquence polypeptidique naturelle.

Les polypeptides (par exemple, des antigènes) ci-décrits sont de préférence fournis sous forme purifiée ou substantiellement purifiée à savoir sensiblement exempt d'autres polypeptides (p. ex. exempts de polypeptides naturels), particulièrement d'autres polypeptides de cellule hôte ou parasite ; par exemple, au moins environ 50 % de pureté (en poids) , au moins environ 60 % de pureté (en poids) , au moins environ 70 % de pureté (en poids), au moins environ 80 % de pureté (en poids), ou au moins 90 % de pureté, etc. Par ailleurs, moins de 50 %, inférieure à environ 40 %, inférieure à environ 30 %, moins de 20 %, inférieure à environ 10 %, soit inférieure à environ 5 % d'une composition comprend d'autres polypeptides exprimés.

Acides nucléiques L'invention porte également sur des acides nucléiques comportant une séquence qui encode un antigène MIF parasite, comme il est indiqué dans les présentes. L'acide nucléique selon l'invention peut prendre diverses formes (par exemple monocaténaire, bicaténaire, vecteurs, etc.). Les acides nucléiques de l'invention peuvent être circulaires ou ramifiés, mais seront généralement linéaire.

Les acides nucléiques utilisés dans l'invention sont de préférence fournis sous forme purifiée ou substantiellement purifiée à savoir sensiblement exempt d'autres acides nucléiques (p. ex. libre d'acides nucléiques naturels), en particulier d'autres acides nucléiques parasitaires ou cellulaires de l'hôte, étant généralement d'au moins environ 50 % de pureté (en poids), et habituellement d'au moins environ 90 % pur.

Les acides nucléiques peuvent être préparés de plusieurs manières par exemple par synthèse chimique (par exemple phosphoramidite de synthèse d'ADN), en totalité ou en partie, par digestion des acides nucléiques plus longs à l'aide de nucléases (par exemple enzymes de restriction) , en joignant des nucléotides ou des acides nucléiques plus courts (par exemple en utilisant des ligases ou des polymérases) , à partir de banques génomiques ou d'ADNc, etc.

Le terme « acide nucléique » désigne en général une forme polymère de nucléotides d'une longueur quelconque, qui contient des désoxyribonucléotides, ribonucléotides et/ou leurs analogues. Cela comprend des hybrides d'ADN, d'ARN, d'ADN/ARN. Cela comprend également des analogues d'ADN ou d'ARN, tels que ceux contenant des squelettes modifiés (par exemple, acides nucléiques peptidiques (PNA) ou des phosphorothioates) ou des bases modifiées. Ainsi, l'acide nucléique de l'invention comprend l'ARNm, l'ADN, l'ADNc, des acides nucléiques recombinants, des acides nucléiques ramifiés, des plasmides, des vecteurs, etc. Lorsque l'acide nucléique prend la forme d'ARN, il peut y avoir ou ne peut y avoir un bouchon de 5'.

Les acides nucléiques de l'invention comprennent une séquence qui encode au moins un antigène MIF parasite. En règle générale, les acides nucléiques de l'invention seront sous forme recombinante, à savoir une forme qui ne se produit pas dans la nature. Par exemple, l'acide nucléique peut comprendre une ou plusieurs séquences d'acide nucléique hétérologue (par exemple une séquence codant pour un autre antigène et/ou une séquence de contrôle telle qu'un promoteur ou un site d'entrée interne des ribosomes) en plus de la séquence codant au moins un antigène MIF parasite. L'acide nucléique peut faire partie d'un vecteur c.-à-d. une partie d'une construction d'acide nucléique conçu pour la transduction/transfection d'un ou de plusieurs types de cellules. Les vecteurs peuvent être, par exemple, « vecteurs d'expression » qui sont conçus pour l'expression d'une séquence nucléotidique dans une cellule hôte, ou « vecteurs viraux » qui sont conçus pour entraîner la production d'un virus recombinant ou d'une particule de type viral.

Alternativement, ou en outre, la structure de séquence ou de produit chimique de l'acide nucléique peut être modifiée par rapport à une séquence naturelle qui encode un antigène MIF parasite. La séquence de la molécule d'acide nucléique peut être modifiée, par exemple pour augmenter l'efficacité d'expression ou la réplique de l'acide nucléique, ou de fournir une stabilité supplémentaire ou résistance à la dégradation. Par exemple, la séquence de la molécule d'acide nucléique peut être optimisée en codons pour l'expression dans un hôte désiré, tel qu'une cellule de mammifère (par exemple humaine). Une telle modification en ce qui concerne l'usage des codons peut augmenter l'efficacité de la translation et la demi-vie de l'acide nucléique. Une queue polyA (p. ex., d'environ 30 ou plus des résidus d'adénosine) peut être attachée à l'extrémité 3' de l'ARN pour augmenter sa demi-vie. L'extrémité 5' de l'ARN peut être coiffée d'un . ribonucléotide modifié avec la structure m7G (5') ppp (5') N (structure cap 0) ou un de ses dérivés, qui peut être incorporé au cours de la synthèse de l'ARN ou peut être conçu par voie enzymatique après transcription de l'ARN (par exemple, en utilisant l'enzyme Vaccinia Virus Capping Enzyme (VCE) composée d'ARNm triphosphatase, guanylyl-transférase et guanine-7-méthyltransférase, qui catalyse la construction de structures cap 0 N7-monométhylatés) . La structure Cap 0 joue un rôle important dans le maintien de la stabilité et l'efficacité de la translation de la molécule d'ARN. Le bouchon de 5' de la molécule d'ARN peut être modifié par un 2 ' - O - méthyltransférase qui entraîne la génération d'une structure cap 1 (m7Gppp [m2 ’-O] N), qui peut en outre augmenter l'efficacité de translation.

Les acides nucléiques peuvent comporter un ou plusieurs analogues de nucléotides ou des nucléotides modifiés . Comme ceux utilisés dans les présentes, 1'« analogue nucléotidique » ou les « nucléotide modifié » font référence à un nucléotide qui contient une ou plusieurs modifications chimiques (p. ex., substitutions) dans ou sur la base azotée du nucléoside (p. ex., cytosine (C) , thymine (T) ou uracile (U) ) , adénine (A) ou la guanine (G)). Un analogue de nucléotide peut contenir d'autres modifications chimiques dans ou sur la portion de sucre du nucléoside (p. ex. ribose, désoxyribose, ribose modifié, désoxyribose modifié, analogue de sucre de six chaînons ou analogue de sucre à chaîne ouverte), ou le phosphate. La préparation des nucléotides et des nucléotides et nucléotides modifiés est bien connue dans la technique, par exemple numéros de brevet US 4 373 071, 4 458 .066, 4 500 707, 4 668 777, 4 973 679, 5 047 524, 5 132 418, 5 153 319, 5 262 530, 5 700 642, et beaucoup de nucléosides modifiés et nucléotides modifiés sont disponibles dans le commerce.

Les nucléobases modifiés qui peuvent être incorporés dans des nucléosides et nucléotides modifiés et être présents dans les molécules d'ARN comprennent : m5C (5-méthylcytidine), m5U (5-méthyluridine), M6A (N6-méthyladénosine), S2U (2-thiouridine), Um ( 2'-O-méthyluridine) , M1A (1-méthyladénosine); m2A (2-méthyladénosine) ; Am (2-1-O-méthyladénosine) ; ms2m6A (2-méthylthio-N6-méthyladénosine) ; I6A (N6- isopentenyladenosine) ; ms2i6A (2-méthylthio- N6isopentenyladenosine) ; io6A (N6- (cis-hydroxyisopentenyl) adénosine) ; ms2io6A (2-méthylthio-N6- (cis-hydroxyisopentenyl) adénosine); G6A (N6-glycinylcarbamoyladenosine) ; T6a (N6-thréonyl carbamoyladenosine) ; ms2t6A (2-méthylthio-N6-thréonyle carbamoyladenosine) ; m6t6A (N6-méthyl-N6- threonylcarbamoyladenosine); hn6A (adénosine N6- hydroxynorvalylcarbamoyl) ; ms2hn6A (carbamoyladenosine 2-méthylthio-N6-hydroxynorvalyl); Ar (p) (2'-O-ribosyladenosine (phosphate)) ; I (inosine) ; Mli (1-methylinosine) ; m'Im (1,2* — O-dimethylinosine) ; M3C (3-méthylcytidine) ; Cm (2T-0-méthylcytidine); S2C (2-thiocytidine) ; ac4c (N4- acétylcytidine) ; F5C (5 fonnylcytidine) ; m5Cm (5,2-0-dimethylcytidine) ; ac4Cm (N4acetyl2TOmethylcytidine) ; K2C (lysidine) ; M1G (1-méthylguanosine) ; M2G (N2- méthylguanosine) ; m7G (7-méthylguanosine) ; Gm (2'-0-méthylguanosine) ; m22G (N2, N2-dimethylguanosine) ; m2Gm (N2,2'-O-dimethylguanosine) ; m22Gm (N2, N2,2'-0- trimethylguanosine) ; Gr (p) (2'-O-ribosylguanosine (phosphate) ) ; yW (wybutosine) ; o2yW (peroxywybutosine) ; OHyW (hydroxywybutosine) ; OHyW * (hydroxywybutosine désagrégée) ; IMG (wyosine) ; MIMG (méthylguanosine) ; Q (queuosine) ; oQ (epoxyqueuosine) ; Galq (galtactosyl-queuosine) ; manQ (mannosyl-queuosine) ; preQo (7-cyano-7-déazaguanosine) ; preQi (7-aminométhyl-7-déazaguanosine) ; G * (archaeosine) ; D (dihydrouridine) ; m5Um (5,2'-O-dimethyluridine) ; S4U (4-thiouridine) ; m5s2U (5-méthyl-2-thiouridine) ; s2Um (2-thio-2'-O-méthyluridine) ; acp3U (3- (3-amino-3-carboxypropyl) uridine) ; ho5U (5-hydroxyuridine) ; mo5U (5-methoxyuridine) ; cmo5U (uridine d'acide 5-oxyacétique) ; mcmo5U (uridine 5-oxyacétique ester méthylique d'acide) ; chm5u (5-(carboxyhydroxymethyl) uridine)) ; mchm5U (ester 5-(carboxyhydroxymethyl) uridine de méthyle) ; mcm5U (5-méthoxycarbonyl méthyluridine) ; mcm5Um (S-méthoxycarbonylméthyl-2-0-méthyluridine) ; mcm5s2U (5-méthoxycarbonylméthyl-2-thiouridine) ; nm5s2U (5-aminométhyl-2-thiouridine) ; mnm5U (5-methylaminomethyluridine) ; mnm5s2U (5-méthyl- aminométhyl-2-thiouridine) ; mnm5se2U (5-méthylaminométhyl-2-selenouridine) ; ncm5U (5 carbamoylméthyle uridine) ; ncm5Um (5-carbamoylméthyl-2'-O-méthyluridine) ; cmnm5U (5-carboxymethylaminomethyluridine) ; cratim5Um (5 carboxymethylaminomethyl-2-L-0methyluridine) ; cmnm5s2U (5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine) ; m62A (N6, N6-dimethyladenosine) ; Tm (2'-O-methylinosine) ; M4C (N4-méthylcytidine) ; m4Cm (N4,2-0-dimethylcytidine) ; hm5C (5-hydroxymethylcytidine) ; M3U (3-méthyluridine) ; cm5U (5-carboxymethyluridine) ; m6Am (N6, T-O-dimethyladenosine) ; rn62Am (N6, N6, 0-2-trimethyladenosine) ; m2'7G (N2,7-dimethylguanosine) ; m2'2'7G (N2, N2,7-trimethylguanosine) ; m3Um (3,2T-0-dimethyluridine) ; M5D (5-methyldihydrouridine) ; f5Cm (5-formyl-2'-O-méthylcytidine) ; mlGm (l,2'-0-dimethylguanosine) ; Me am (adénosine de 1,2-diméthyl-0) irinomethyluridine) ; tm5s2U (S-taurinomethyl-2-thiouridine)) ; img-14 (4-déméthyl guanosine) ; IMG2 (isoguanosine) ; ac6A (N6-acetyladenosine), hypoxanthine, inosine, 8-oxo-adénine, 7-substitués dérivés de ceux-ci, dihydrouracile, pseudouracile, 2-thio-uracile, 4-thio-uracile, 5-aminouracile, 5- (Οι-Οβ) alkyluracil, 5 -methyluracil, 5- (C2-C6) -alkenyluracil, 5- (C2- C6) -alkynyluracil, 5- (hydroxyméthyl) uracile, 5-chlorouracile, 5-fluoro-uracile, 5-bromo-uracile, la 5-hydroxycytosine, 5- (Ci— C6) -alkylcytosine, la 5-méthylcytosine, 5- (C2-C6) alkenylcytosine, 5- (C2-C6) -alkynylcytosine, 5-chlorocytosine, 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine, N2-dimethylguanine, 7-déazaguanine, 8-azaguanine, la 7-déaza-7-substitué de la guanine, la 7-déaza-7- (C2-C6) alkynylguanine, 7-déaza-8-substituée guanine, 8-hydroxyguanine, 6-thioguanine, 8-oxoguanine, 2-aminopurine , 2-amino-6-chloropurine, 2,4-diaminopurine, la 2,6-diaminopurine, 8-azapurine, substitué 7-déazapurine, 7-déaza-7-substitué purine, 8-7-déaza-substitué purine, hydrogène (résidu abasique) m5C, iu5U, m6A, s2U, W, ou 2'-O-méthyle-U. Beaucoup de ces nucléobases modifiés et leurs ribonucléosides correspondants sont disponibles auprès des fournisseurs commerciaux. Voir par exemple WO 2011/005799.

Les vaccins à base d’acide nucléique

Une composition comme il est indiqué dans les présentes comprenant une séquence d'acide nucléique qui encode un antigène MIF parasite qui pourrait être un vaccin à base d'acide nucléique. Une autre composition comprenant une séquence d'acide nucléique qui encode un ou plusieurs antigènes de parasite supplémentaire peut aussi être fournie comme vaccin à base d'acide nucléique. L'acide nucléique peut être, par exemple, de l'ARN (par exemple un vaccin à base d'ARN) ou d'ADN (par exemple un vaccin à base d'ADN, tel qu'un vaccin à ADN de plasmide). Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique est un vaccin à base d'ARN. Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'ARN comprend une molécule d'ARN auto-répliquant.

La molécule d'ARN auto-répliquant peut être un réplicon d'ARN dérivé d'alphavirus.

Les molécules d'ARN auto-répliquant sont bien connues dans la technique et peuvent être produites en utilisant des éléments de réplication dérivés, par exemple, des alphavirus, et remplaçant les protéines virales structurales par une séquence nucléotidique codant une protéine d'intérêt. Une molécule d'ARN auto-répliquant est typiquement une molécule +brin, qui peut être directement traduite après livraison à une cellule, et cette translation fournit un ARN polymérase ARN-dépendant qui produit alors deux transcriptions antisens et sens de l'ARN délivré. Ainsi, l'ARN délivré conduit à la production de multiples ARN filles. Ces ARN filles, ainsi que les transcriptions sous-génomiques colinéaires, peuvent être convertis eux-mêmes pour fournir une expression in situ d'un antigène codé (par exemple un antigène MIF parasite), ou peuvent être transcrits pour fournir des transcriptions avec le même sens que l'ARN délivré, qui sont traduits pour donner l'expression de l'antigène in situ. Le résultat global de cette séquence de transcriptions est une amplification énorme du nombre d'ARN de réplicon introduit et ainsi l'antigène codé devient un produit polypeptidique majeur des cellules.

Un système approprié pour réaliser l'auto-réplication de cette façon est d'utiliser un réplicon à base d'alphavirus. Ces réplicons sont des ARN à brins + qui conduisent à la translation d'une réplicase (ou réplicase-transcriptase) après livraison à une cellule. La réplicase est traduite comme une polyprotéine qui se sépare automatiquement pour fournir un complexe de réplication qui crée des copies génomique -brin du +brin ARM délivré. Ces transcriptions -brin peuvent elles-mêmes être transcrites pour donner plus de copies du +brin d'ARN parent et aussi pour donner une transcription subgénomique qui code l'antigène. La translation de la transcription subgénomique conduit donc à l'expression in situ de l'antigène par la cellule infectée. Les réplicons d'alphavirus appropriés peuvent utiliser une réplicase d'un virus Sindbis, un virus de la forêt de Semliki, un virus de l'encéphalite équine de l'Est, un virus de l'encéphalite équine du Venezuela, etc. Des mutant ou des séquences de virus de type sauvage peuvent être utilisés, par exemple le mutant atténué de VEEV TC83 a été utilisé dans des réplicons [33].

Dans certains modes de réalisation, la molécule d'ARN auto-répliquant décrite ici code (i) un ARN polymérase dépendant de l'ARN qui peut transcrire l'ARN à partir de la molécule d'ARN auto-répliquant et (ii) un antigène MIF parasite. La polymérase peut être un alphavirus réplicase par exemple, comprenant une ou plusieurs des protéines d'alphavirus nsPl, nsP2, nsP3 et nsP4.

Alors que les génomes alphavirus naturels encodent des protéines de structure du virion, en plus de la polyprotéine non-structurale de réplicase, dans certains modes de réalisation, les molécules d'ARN auto-répliquant n'encodent pas les protéines alphavirus structurales. Ainsi, l'ARN auto-répliquant peut conduire à la production de copies d'ARN génomique de lui-même dans une cellule, mais pas à la production de virions contenant de l'ARN L'incapacité à produire ces virions signifie que, contrairement à un alphavirus de type sauvage, la molécule d'ARN auto-répliquant ne peut pas se perpétuer sous forme infectieuse. Les protéines structurales d'alphavirus qui sont nécessaires à la perpétuation des virus de type sauvage sont absentes de l'ARN auto-répliquant de la présente publication et leur place est prise par le (s) gène(s) codant l'immunogène d'intérêt, de sorte que la transcription subgénomique codent l'immunogène plutôt que les protéines de virion d'alphavirus structurales.

Ainsi, une molécule d'ARN auto-répliquant utile à l'invention peut avoir deux cadres de lecture ouverts. Le premier cadre de lecture ouverte (5') encode une réplicase ; le deuxième cadre de lecture ouvert (3') encode un antigène. Dans certains modes de réalisation de l'ARN peut avoir des cadres supplémentaires de lecture ouverte (par exemple en aval) par exemple pour encoder d'autres antigènes ou pour encoder des polypeptides accessoires.

Dans certains modes de réalisation, la molécule d'ARN auto-répliquant ci-décrite possède un bouchon de 5' (par exemple un 7-methylguanosine). Ce bouchon peut améliorer la translation in vivo de l'ARN. Dans certains modes de réalisation, la séquence 5 'de la molécule d'ARN auto-répliquant doit être choisie pour assurer la compatibilité avec la réplicase encodée.

Une molécule d'ARN auto-répliquant peut avoir une queue poly-A de 3'. Elle peut également comprendre une séquence de reconnaissance de polymérase poly-A (par exemple AAUAAA) à proximité de son extrémité 3'.

Les molécules auto-répliquant d'ARN peuvent avoir différentes longueurs, mais elles sont généralement de 5 000 à 25 000 nucléotides de long. Les molécules d'ARN auto-répliquant seront généralement monocaténaires. En général, les ARN monocaténaires peuvent initier un effet adjuvant en se liant aux hélicases d'ARN, TLR7, TLR8, et/ou PKR. Les ARN présentées sous forme bicaténaire (ARNdb) peuvent se lier à TLR3, et ce récepteur peut également être déclenché par 1'ARNdb qui est formé soit au cours de la réplication d'un ARN monocaténaire ou à l'intérieur de la structure secondaire d'un ARN monocaténaire. L'ARN auto-répliquant peut être commodément préparé par transcription in vitro (IVT). L'IVT peut utiliser un modèle (cDNA) créé et propagé sous forme de plasmides dans les bactéries ou créé synthétiquement (par exemple par synthèse de gène et/ou par des méthodes d'ingénierie de réaction en chaîne polymérase (PCR)). Par exemple, un ARN polymérase dépendant de l'ADN (tels que les T7, T3 ou SP6 ARN polymérases de bactériophages) peut être utilisé pour transcrire l'ARN auto-répliquant à partir d'une matrice d'ADN. Les réactions additionnelles de bouchons et de poly-A appropriés, peuvent être utilisées comme requis (bien que le réplicon poly-A soit habituellement codé au sein de la matrice d'ADN) . Ces polymérases d'ARN peuvent avoir des exigences strictes pour le (s) nucléotides(s) de 5 ' transcrits et, certains modes de réalisation de ces exigences doivent être adaptés aux exigences de la réplicase encodée, pour assurer que l'ARN IVT-transcrit puisse fonctionner efficacement comme substrat pour sa réplicase auto-encodée.

Un ARN auto-répliquant peut comprendre (en plus de toute structure de bouchon 5 ') un ou plusieurs nucléotides ayant une nucléobase modifiée. Un ARN utilisé avec la présente invention ne comprend idéalement que des liaisons phosphodiester entre les nucléosides, mais dans certains modes de réalisation, il peut contenir des liaisons phosphoramidate, phosphorothioate et/ou méthylphosphonate.

La molécule d'ARN d'auto-réplication peut encoder un seul antigène polypeptidique hétérologue (par exemple un antigène MIF parasite) ou, éventuellement, deux ou plusieurs antigènes polypeptidiques hétérologues liés ensemble de façon que chacune des séquences conserve son identité (par exemple, reliés en série) lorsqu'elle est exprimée en tant que séquence d'acide aminé. Les polypeptides hétérologues produits à partir de l'ARN auto-répliquant peuvent alors être produits en tant que polypeptide de fusion ou conçus de manière à donner lieu à des séquences peptidiques ou polypeptidiques distinctes.

Les molécules d'autoréplication d'ARN ci-décrites peuvent être modifiées pour exprimer de multiples séquences de nucléotides, à partir de deux ou plusieurs cadres de lecture ouverts, ce qui permet la co-expression de protéines, tel que un, deux ou plusieurs antigènes de parasites (par exemple, un, deux ou plusieurs antigènes MIF parasites) avec des cytokines ou d'autres immunomodulateurs, qui peuvent améliorer la génération d'une réponse immunitaire. Une telle molécule d'ARN auto-répliquant peut être particulièrement utile, par exemple, dans la production de divers produits de gènes (par exemple des protéines) en même temps, par exemple, en tant que vaccin bivalent ou multivalent.

Si on le souhaite, les molécules d'ARN auto-répliquant peuvent être criblées ou analysées afin de confirmer leurs propriétés thérapeutiques et prophylactiques en utilisant différentes méthodes d'essai in vitro ou in vivo qui sont connues par les hommes du métier. Par exemple, des vaccins comprenant la molécule d'ARN auto-répliquant peuvent être testés pour leur effet sur l'induction de la prolifération ou la fonction d'effecteur du type de lymphocyte d'intérêt particulier, par exemple, les cellules B, les cellules T, des lignées de cellules T et des clones de cellules T. Par exemple, les cellules de la rate provenant de souris immunisées peuvent être isolées et la capacité des lymphocytes T cytotoxiques à lyser des cellules cibles autologues qui contiennent une molécule d'ARN auto-répliquant qui code un antigène MIF parasite. De plus, la différenciation des cellules T auxiliaires peut être analysée en mesurant la prolifération ou de la production de TH1 (IL-2 et IFN-γ) et/ou TH2 (IL-4 et IL-5) des cytokines par ELISA ou directement dans les cellules T CD4 + par cytokine cytoplasmique coloration et cytométrie de flux.

Les molécules d'ARN auto-répliquant qui encode un antigène MIF parasite peuvent également être testées pour leur capacité à induire des réponses immunitaires humorales, comme en témoignent, par exemple, l'induction de lymphocytes B à produire des anticorps spécifiques d'un antigène MIF parasite d'intérêt. Ces analyses peuvent être effectuées en utilisant, par exemple, les lymphocytes B périphériques de personnes immunisées. Ces méthodes de dosage sont connus par les personnes du métier. D'autres dosages qui peuvent être utilisés pour caractériser les molécules d'ARN auto-répliquant qui peuvent impliquer la détection de l'expression de l'antigène MIF parasitaire codé par les cellules cibles. Par exemple, la FACS peut être utilisée pour détecter l'expression de l'antigène sur la surface cellulaire ou intracellulaire. Un autre avantage de la sélection FACS est que l'on peut faire un tri pour différents niveaux d'expression ; l'expression parfois inférieure peut être souhaitable. Une autre méthode appropriée pour identifier des cellules qui expriment un antigène particulier panoramique en utilisant des anticorps monoclonaux sur une plaque ou la capture en utilisant des billes magnétiques revêtues d'anticorps monoclonaux.

Types appropriés de vaccins à base d'acide nucléique à utiliser conformément à la présente communication sont décrits dans les références 34, 35 et 36.

Le vaccin à base d'acide nucléique viral peut comprendre un système viral ou un système non viral de délivrance. Le système de livraison (également dénommé dans la présente véhicule de livraison) peut avoir des effets adjuvants qui améliorent l'immunogénicité de l'antigène MIF parasite codé. Par exemple, la molécule d'acide nucléique peut être encapsulée dans des liposomes, des microparticules de polymère biodégradable non toxiques ou de particules de réplicons viraux (VRP), ou complexé avec des particules d'une émulsion cationique type huile-eau. Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique est comprend un système de délivrance de nano-émulsion cationique (CNE) ou un système de délivrance nanoparticule lipidique (TNL). Par ailleurs, le vaccin à base d'acide nucléique peut comprendre des particules de réplicon virales. Dans les autres modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique peut comporter un acide nucléique nu, comme ARN nu (ARNm, par exemple), mais une livraison via LNP est préférable.

Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique comporte un système de livraison de nanoémulsion cationique (CNE). Les systèmes de livraison et procédés CNE pour leur préparation sont décrits en référence 35. Dans un système de livraison CNE, la molécule d'acide nucléique (par exemple ARN) qui code l'antigène est complexé avec une particule d'une émulsion cationique type huile-eau. Les émulsions cationiques huile-eau peuvent être utilisées pour délivrer des molécules chargées négativement, telles qu'une molécule d'ARN aux cellules. Les particules d'émulsion comprennent un noyau d'huile et un lipide cationique. Le lipide cationique peut interagir avec la molécule chargée négativement en ancrant ainsi la molécule aux particules de l'émulsion. D'autres détails de CNE utiles peuvent être trouvés dans les références 35, 37 &amp; 38 (le contenu complet de tous ce qui sont incorporés ici en référence).

Ainsi, dans un vaccin à base d'acide nucléique de l'invention, une molécule d'ARN codant un antigène MIF parasite peut être complexée par une particule d'une émulsion huile-eau cationique. Les particules comprennent typiquement un noyau d'huile (par exemple une huile végétale ou squalène) qui est en phase liquide à 25°C, un lipide cationique (par exemple, des phospholipides) et, facultativement, un agent tensioactif (par exemple le trioléate de sorbitan, le polysorbate 80) ; le polyéthylène glycol peut également être inclus. Dans certains modes de réalisation, la CNE comprend du squalène et un lipide cationique, tel que le 1,2-dioléoyloxy-3- (triméthylammonio) propane (DOTAP). Dans certains modes de réalisation préférés, le système de livraison est un système de délivrance non virale, tels que les CNE, et le vaccin à base d'acide nucléique comprend un ARN auto-répliquant (ARNm). Cela peut être particulièrement efficace pour induire des réponses immunitaires humorales et cellulaires. Les avantages incluent également l'absence d'une réponse immunitaire anti-vecteur de limitation et une absence de risque d'intégration génomique.

Les systèmes de livraison de LNP et les microparticules polymères biodégradables non-toxiques, et des procédés pour leur préparation sont décrits dans les références 34 et 36. Les LNP sont des particules de liposomes non-virion dans lesquelles une molécule d'acide nucléique (par exemple ARN) peut être encapsulée. Les particules peuvent inclure un ARN externe (par exemple sur la surface des particules), mais au moins la moitié de l'ARN (et idéalement la totalité) est encapsulé. Les particules liposomiques peuvent, par exemple, être formées d'un mélange de zwitterionique, cationique et les lipides anioniques qui peuvent être saturés ou insaturés, par exemple, DSPC (zwitterionique, saturé), DlinDMA (cationique insaturé) et / ou DMG (anionique, saturé). Les LNP préférés pour une utilisation avec 1'invention comprennent un lipide amphiphile susceptible de former des liposomes, éventuellement en combinaison avec au moins un lipide cationique (tel que DOTAP, DSDMA, DODMA, DLinDMA, DLenDMA, etc.). Un mélange de DSPC, DlinDMA, PEG-DMG et de cholestérol est particulièrement efficace. D'autres LNP utiles sont décrits dans les références 34 et 39-43 (le contenu complet de tous ce qui sont incorporés ici par référence) . Dans certains modes de réalisation, les liposomes sont LNPS RV01 (références 34 et 36) .

Anticorps

Dans un aspect, l'invention se rapporte à un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite, comme il est indiqué dans les présentes. De préférence, l'anticorps se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite d'origine naturelle.

Un anticorps qui « se lie spécifiquement » à un antigène MIF parasite est un anticorps qui se lie à cet antigène avec une plus grande affinité et/ou avidité qu'il se lie aux autres antigènes du parasite ou non-parasite. Par exemple, l'anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite peut lier l'antigène MIF parasite avec une plus grande affinité et/ou avidité qu'il ne se lie à HSA. De préférence, l'anticorps ne lie pas expressément aux MIF vertébrés ou à un antigène MIF produits par le sujet.

Dans le présent document, le terme « anticorps » inclut la longueur pleine ou tout anticorps (c'est-à-dire sous leur forme substantiellement intacte), fragments d'anticorps comme F(ab') 2, F(ab) et Fab'-SH fragments, fragments de Fv (hétérodimères non-covalentes), anticorps chaîne unique tels que les molécules de Fv seule chaîne (scFv) ou ceux dérivés de camélidés et requins (p. ex. anticorps de chaîne lourde), anticorps à domaine unique (plots), diabodies, minibodies, oligobodies, etc. Le terme « anticorps » n'implique pas une origine particulière et inclut des anticorps obtenus grâce à des procédés non-conventionnels, tels que l'affichage du phage. Tous les anticorps composeront le site de liaison de l'antigène d'un anticorps pleine longueur ou entier et ainsi conserver la capacité de lier l'antigène. Ainsi, le terme « anticorps » inclut antigène fragments d'anticorps de pleine longueur ou entiers. L'anticorps est idéalement un anticorps monoclonal ou, alternativement, peut être polyclonal. L'anticorps peut être chimérique, humanisé (p. ex. les références 44 &amp; 45), ou totalement humain. Dans les compositions de l'invention, les anticorps polyclonaux, comprenant un ou plusieurs des anticorps qui se lient spécifiquement à l'antigène MIF parasite, peuvent être utilisés. Dans certains modes de réalisation préférés, le concordat comporte des anticorps polyclonaux, par exemple l'anticorps MIF anti-parasite de sérum. Les anticorps polyclonaux peuvent comporter des IgG (par ex. sérum purifié IgG) . Les anticorps peuvent comporter un anticorps neutralisant (c.-à-d. un anticorps qui neutralise les effets biologiques du parasite MIF dans le sujet). L'anticorps est de préférence fourni sous forme purifiée ou sensiblement purifiée. En règle générale, les anticorps seront présents dans une composition qui est effectivement sans autres polypeptides, par exemple, où moins de 90 % (en poids), généralement moins de 60 %, et le plus habituellement moins de 50 % de la composition est faite d'autres polypeptides.

Les anticorps peuvent être de n'importe quel isotype (p. ex. IgA, IgG, IgM c'est-à-dire un γ a, ou μ chaîne lourde), mais sera généralement IgG. Au sein de l'isotype IgG, les anticorps peuvent être une sous-classe IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. L'anticorps peut avoir une κ ou une chaîne légère λ.

Parasites

La présente invention concerne le traitement des infections parasitaires utilisant des antigènes MIF parasites. Le parasite (par exemple l'agent causal de l'infection parasitaire et le parasite à partir duquel l'antigène MIF parasite est dérivé) peut être un parasite invertébré, par exemple un protozoaire ou un helminthe. Le parasite peut, par exemple, être un parasite transmissible par le sang (soit un parasite ayant un cycle de vie qui implique une étape par le sang). Les parasites selon l'invention expriment nécessairement un orthologue MIF (c.-à-d. un polypeptide MIF d'origine naturelle).

Les parasites protozoaires comprennent des parasites apicomplexes, tels que LE Plasmodium spp., Toxoplasma spp., Eimeria spp., Babesia spp., Theileria spp, Neospora spp et Sarcocystis spp. Autres exemples de parasites protozoaires hemoflagellés, tels que Leishmania spp. et Trypanosoma spp., et l'autre avec des flagelles protozoaires tels que Giardia spp.

Plasmodium spp. comprend Plasmodium falciparum, Plasmodium berghei (par ex. souche ANKA), Plasmodium yoelii, Plasmodium chabaudi, Plasmodium vivax, Plasmodium knowlesi, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, et Plasmodium vinckei. Toxoplasma spp. comprend Toxoplasma gondii. Eimeria spp. comprend Eimeria tenella et Eimeria acervulina. Babesia spp. comprend Babesia microti, Babesia divergens, et Babesia duncani. Theileria spp. comprend Theileria annulata, Theileria parva, Theileria equi et Theileria orientalis. Neospora spp. comprend Neospora caninum. Sarcosystis spp. comprend Sarcocystis neurona. Leishmania spp. comprend Leishmania major, Leishmania tropica, Leishmania aethiopica, Leishmania infantum (ou Leishmania chagasi), Leishmania donovani, Leishmania amazonensis et Leishmania braziliensis. Trypanosoma spp. comprend Trypanosoma brucei (sous-espèce gambiense, rhodesiense, ou brucei), et Trypanosoma cruzi. Giardia spp. comprend Giardia lamblia (ou Giardia intestinalis).

Les helminthes parasites comprennent les nématodes (par exemple, 1'ankylostome, trichures, filariid, ascaris, strongles et les nématodes de trichostrongyle), tels queAncyclostoma spp., Necator spp., Brugia spp., Wuchereria spp., Loa spp., Mansonella spp., Trichinella spp., Trichuris spp., Ascaris spp., Anisakis spp., Dracunculus spp., Strongyloides spp., Haemonchus spp., Toxocara spp., Dictyocaulus spp., Ostertagia spp., Teladorsagia spp, Onchocerca spp. and Dirofilaria spp. D'autres exemples incluent Acanthocheilonema spp., Aelurostrongylus spp., Angiostrongylus spp., Bunostomum spp., Dioctophyme spp., Dipetalonema spp., Lagochilascaris spp., Muellerius spp., Parafilaria spp., Parascaris spp., Protostrongylus spp., Setaria spp., Stephanofilaria spp., Strongylus spp., Thelazia spp., Capillaria spp., Chabertia spp., Cooperia spp., Enterobius spp., Nematodirus spp., Oesophagostomum spp, et Trichostrongylus spp. D'autres exemples de parasites d'helminthe comprennent trématodes, comme Schistosoma spp. et les douves du foie telles que Fasciola spp (par exemple Fasciola hepatica).

Ancyclostoma spp. comprend Ancylostoma duodenale, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma caninum, Ancylostoma pluridentatum, et Ancylostoma tubaeforme. Necator spp. comprend Necator americanus. Brugia spp. comprend Brugia malayi, Brugia timori et Brugia pahangi. Wuchereria spp. comprendIVuchereria bancrofti. Loa spp. comprend Loa loa. Mansonella spp. comprendMansonella streptocerca, Mansonella perstans et Mansonella ozzardi. Trichinella spp. comprend Trichinella spiralis, Trichinella pseudospiralis, Trichinella nelsoni, Trichinella britovi, Trichinella murrelli, et Trichinella nativa. Trichuris spp. comprend Trichuris trichiura, Trichuris mûris, Trichuris campanula, Trichuris suis, Trichuris

Ovis and Trichuris vulpis. Ascaris spp. comprend Ascaris lumbricoides, et Ascaris suum. Anisakis spp. comprend Anisakis simplex. Dracunculus spp. comprend Dracunculus medinensis, et Dracunculus insignis. Strongyloides spp. comprend Strongyloides stercoralis et Strongyloides papillosus. Onchocerca spp. comprend Onchocerca volvulus et Onchocerca tubingensis. Dirofilaria spp. comprend Dirofilaria immitis et Dirofilaria repens. Haemonchus spp. comprend Haemonchus contortus et Haemonchus placei. Toxocara spp. comprend Toxocara canis et Toxocara cati. Dictyocaulus spp. comprend Dictyocaulus viviparus et Dictyocaulus arnfieldi. Chabertia spp. comprend Chabertia ovina. Cooperia spp. comprend Cooperia curticei et Cooperia oncophora. Nematodirus spp. comprend Nematodirus spathiger et Nematodirus filicollis. Oesophagostomum spp. comprend Oesophagostomum columbianum et Oesophagostomum venulosum. Trichostrongylus spp. comprend Trichostrongylus axei, Trichostrongylus colubriformis et Trichostrongylus vitrinus. D'autres nématodes parasites comprennent Parastrongyloides trichosuri, Ostertagia ostertagi, Ostertagia trifurcata, et Teladorsagia circumcincta.

Schistosoma spp. comprend Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Schistosoma bovis, Schistosoma mattheei, Schistosoma margrebowiei, Schistosoma curassoni, Schistosoma rodhaini, Schistosoma indicum, Schistosoma intercalatum, Schistosoma malayensis, Schistosoma ovuncatum, Schistosoma nasale, et Schistosoma spindale. Fasciola spp. comprend Fasciola hepatica, Fasciola magna, Fasciola gigant ica, Fasciola jacksoni.

La référence 46 décrit spéculativement des compositions thérapeutiques afin de protéger les animaux des maladies causées par des helminthes parasites qui comprennent des protéines MI F d'helminthe parasite, acides nucléiques qui s'hybrident dans des conditions de stringence avec un gène MIF Dirofilaria immitis ou un gène MIF Onchocerca volvulus et les anticorps isolés qui se lient sélectivement à une protéine MIF d'helminthe parasite. Cependant, contrairement à la présente invention, ces compositions thérapeutiques ne sont pas étayées par des preuves expérimentales qui établissent que de telles compositions auraient un effet thérapeutique. Néanmoins, dans certains modes de réalisation de la présente invention, le parasite n'est pas un helminthe parasite. Dans certains modes de réalisation, le parasite n'est pas un nématode parasite. Dans certains modes de réalisation, le parasite n'est pas un ver nématode filariidés. Dans certains modes de réalisation, en particulier dans lequel la composition comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite, le parasite n'est pas Onchocerca volvulus ou Dirofilaria immitis. Par exemple, dans certains modes de réalisation l'antigène MIF parasite (p. ex. l'antigène MIF parasite codé par un acide nucléique de la composition) n'est pas un antigène MIF Onchocerca volvulus ou de l'antigène MIF Dirofilaria immitis.

La référence 47 a évalué la réponse immunitaire induite par les vaccins d'ADN exprimant Trichinella spiralis MCD-1, T. spiralis MIF ou co-exprimant T. spiralis MCD-1 et MIF, chez des souris BALB/c. L'immunisation avec le vaccin co-exprimant MCD-1 et le MIF a été suivie par une petite réduction de la charge parasitaire mais le MIF exprimant un vaccin d'ADN T. spiralis ne protège pas les souris contre une infection de T. spiralis. Dans certains modes de réalisation de la présente invention, le parasite n'est pas Trichinella spiralis, en particulier dans lequel la composition comprend un acide nucléique (et ADN en particulier) comprenant une séquence qui code pour un antigène MIF parasite. Dans certains modes de réalisation, l'antigène MIF parasite (par exemple, l'antigène MIF parasite codé par un acide nucléique de la composition) n'est pas un antigène MIF de Trichinella spiralis. Dans certains modes de réalisation, la composition et/ou l'antigène MIF parasite ne comprend pas de protéine du domaine multicystatine analogue, tel que T. spiralis MCD-1.

Les infections parasitaires peuvent, par exemple, inclure le paludisme (par exemple, de la malaria cérébrale), la toxoplasmose, la coccidiose, la babésiose, la theilériose, la trypanosomiase, la leishmaniose, la filariose, 1'éléphantiasis, la trichinose, trichocéphalose, ascaridiase, la dracunculose (Guinée maladie du ver), myéloencéphalite protozoaire équine (EPM), fasciolosis et la schistosomiase. De préférence, les procédés et les compositions décrits ici sont utilisés pour fournir une immunité protectrice contre le paludisme.

Les procédés et compositions décrits ici peuvent être utilisés pour fournir une immunité protectrice contre une infection par le parasite unique, ou la co-infection par deux ou plusieurs parasites différents. Les deux ou plusieurs parasites peuvent être deux ou plusieurs parasites choisis parmi ceux qui sont énumérés ici. Dans certains modes de réalisation, au moins l'un des deux ou plusieurs parasites est un parasite Plasmodium, tel qu'un parasite Plasmodium falciparum.

Les méthodes de traitement et les utilisations médicales

Les compositions divulguées ici peuvent servir dans un procédé pour fournir une immunité protectrice contre une infection parasitaire chez un sujet (par exemple un vertébré) dans le besoin, comprenant la réalisation de l'administration de la composition (par exemple une quantité immunologique efficace de la composition) au sujet. L'invention fournit également une composition comme il est indiqué dans les présentes devant servir à fournir une immunité protectrice contre une infection parasitaire chez un sujet.

Dans certains modes de réalisation, la composition fournit l'immunité protectrice en générant une réponse immunitaire protectrice contre l'infection de parasite (p. ex. l'immunisation active), en particulier dans ces modes de réalisation où la composition comporte un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ou comprend un antigène MIF parasite. L'immunité protectrice peut aussi être donnée par l'administration au sujet d'un anticorps qui se lie spécifiquement l'antigène MIF parasite (par exemple par une immunisation passive). L'immunité protectrice peut également être fournie par l'administration de cellules T CD4 sensibles aux parasites à partir d'un hôte compatible (de préférence de la même espèce que le sujet), dans lequel l'hôte soit vacciné avec une composition de l'invention : c'est-à-dire une composition qui comprend une somme immunologique efficace de (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ou (ii) un antigène MIF parasite (par exemple par transfert adoptif de lymphocytes T CD4). L'hôte compatible peut avoir été vacciné avec la composition et exposé au parasite ou un antigène de parasite pour produire une population de cellules T CD4 sensibles aux parasites. L'administration d'une composition de l'invention à un sujet (ou hôte compatible) permet au sujet (ou hôte) afin de produire une population de cellules T CD4 d'un parasite en réponse à l'exposition au parasite ou un antigène de parasite. La population des cellules T CD4 mémoires sensible au parasite peut être immunisée « stérilement » (c'est-à-dire l'immunité protectrice complète) contre une réinfection.

Ainsi, un procédé est également fourni par les présentes pour offrir au sujet une protection contre une réinfection parasite (par exemple, stérilisation) l'immunité contre la réinfection de parasite. Le procédé peut comprendre : (i) administrer une composition de l'invention (par exemple une composition comprenant un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite) à ce sujet et (ii) ensuite infecter le sujet avec le parasite ou vacciner l'objet avec un autre antigène parasite (pour produire une population de cellules T CD4 sensibles aux parasites). À l'étape (ii), une infection ultérieure d'un sujet avec le parasite peut être délibérée dans une étude chez l'animal, mais chez les humains, il est préférable que cela se produit par l'intermédiaire d'une infection naturelle. Ainsi, le procédé peut être appliqué à un sujet qui est susceptible d'être exposé à l'infection, par exemple qui vit dans une région impaludée, ou qui travaille avec les patients atteints de paludisme, etc. Eventuellement (par exemple, où le sujet est infecté par le parasite) , ces méthodes peuvent comprendre en outre le durcissement au sujet de l'infection par le parasite, par exemple, par administration d'un agent qui tue ou atténue le parasite, comme décrit ici.

Les termes « Immunité protectrice » ou une « réponse immunitaire protectrice », tels qu'utilisés ci-après, se réfèrent à l'immunité ou de susciter une réponse immunitaire contre un agent infectieux (p. ex. un parasite), qui est exposé par un sujet, qui prévient ou atténue une infection ou réduit d'au moins un symptôme de celle-ci. Plus précisément, l'induction de l'immunité protectrice ou d'une réponse immunitaire protectrice de l'administration d'une composition de l'invention est évidente par l'élimination ou la réduction de la présence d'un ou plusieurs symptômes de l'infection parasitaire et/ou une extension de la mémoire parasite favorisant la population de lymphocytes T. Dans le présent document, le terme « réponse immunitaire » désigne à la fois la réponse immunitaire humorale et la réponse immunitaire à médiation cellulaire. De préférence, l'immunité protectrice fournie par l'invention est caractérisée par la mémoire immunologique protectrice (par exemple une réponse de lymphocytes T mémoire protectifs) contre le parasite. L'immunité protectrice peut être caractérisée par une population des cellules T mémoire sensibles au parasite et efficace (par exemple, sensible au Plasmodium) . Dans les modes de réalisation préférés, l'immunité protectrice est maintenue (par exemple l'effet protecteur ne diminue pas au cours de l'infection par le parasite). De préférence, le sujet peut récupérer de l'infection de parasite. Dans des modes de réalisation préférés, le traitement avec une composition de l'invention telle que décrite ici fournit une immunité protectrice contre une réinfection par le parasite. L'immunité protectrice peut être une immunité stérilisante (à savoir l'immunité protectrice complète), le sujet protégé peut provoquer une réponse immunitaire qui élimine complètement 1'infection.

Une composition de l'invention peut donc traiter ou prévenir une infection par le parasite (ou une maladie qui lui est associée). Dans des modes de réalisation préférés, la maladie est le paludisme. Plus particulièrement, la maladie peut être un paludisme cérébral.

Les compositions selon l'invention peuvent être utilisées pour induire une réponse immunitaire primaire et/ou stimuler une réponse immunitaire.

Lorsqu'un sujet est traité conformément à la présente invention, le sujet peut avoir une population de cellules T mémoire sensibles aux parasites (par exemple sensible au Plasmodium ) par rapport à un sujet non traité après l'infection parasitaire, en particulier dans les modes de réalisation où la composition comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui code un antigène parasitaire ou MIF comprend un antigène MIF parasite. La population des cellules T de mémoire sensible au parasite peut comprendre des cellules CD4 + Ki67 + IL-7Ra + T. Par exemple, les cellules T mémoires sensibles au parasite peuvent comprendre des cellules de mémoire T (CD4 + CD62L + Ki67 + IL-7Ra +) et/ou des cellules effecteurs T (CD4+Ki67+ CD62L- IL-7Ra+). La population des cellules T mémoires sensibles au parasite peut être étendue d'au moins 5 %, au moins 10 %, au moins 15 %, au moins 20 %, au moins 25 %, au moins 30 %, au moins 35 %, au moins 40 %, au moins 45 %, au moins 50 % (par exemple par rapport à un sujet non traité) après une infection de parasite.

Lorsqu'un sujet est traité conformément à la présente invention, le sujet peut avoir diminué les niveaux IFN -γ par rapport à un sujet non traité, suite à une infection de parasite. Par exemple, les niveaux sériques IFNy peuvent être diminués. La production d'IFNy par les cellules T CD4 effectrices terminales et inflammatoires peut être diminuée. Les niveaux IFNy peuvent être évalués par ELISA spécifique. La diminution peut être d'au moins 10 %, au moins 20 %, au moins 30 %, au moins 40 %, au moins 50 %, ou au moins 60 % par rapport à un sujet non traité après l'infection parasitaire.

Une composition de l'invention pouvant être administrée à un sujet pour permettre au sujet de développer et/ou maintenir une immunité stérilisante à l'infection de parasite. L'immunité protectrice peut être fournie ou augmentée chez un sujet vacciné après infection de parasite ou l'exposition à un autre vaccin de parasite ou antigène (par exemple, un antigène de parasite supplémentaire, tel que défini ici) .

Une composition de l'invention peut être utilisée dans un régime de la vaccination prime-boost. L'immunité protectrice contre une infection parasitaire selon l'invention peut être réalisée par l'administration d'un vaccin de sensibilisation, comprenant une composition de l'invention, suivie d'un vaccin de rappel. Le vaccin de rappel se distingue du vaccin d'amorçage et comprend ou encode un ou plusieurs autres antigènes de parasites (c'est-à-dire non-MIF) supplémentaires, tel que défini dans les présentes. Le vaccin de rappel peut, par exemple, comprendre une forme atténuée de parasite auquel l'immunité protectrice doit être fournie. De préférence, les vaccins d'amorçage et de rappel sont administrés à environ 16 semaines d'intervalle au moins (par exemple environ 8 semaines, 6 semaines, 4 semaines, 2 semaines ou 1 semaine d'intervalle au moins). Comme alternative, les deux vaccins peuvent être administrés en 12 heures d'intervalle, en 6 heures, en 3 heures, en 2 heures ou 1 heure chacun.

Si la composition de l'invention comprend des anticorps qui se lient spécifiquement à un antigène MIF de parasite (anticorps MIF anti-parasite ), la composition peut être utilisée dans une méthode de traitement d'une infection de parasite ou un procédé permettant une immunité protectrice contre une infection parasitaire, c'est-à-dire l'immunisation passive à des fins thérapeutiques ou prophylactiques. Par exemple, la composition peut être utilisée dans une méthode de traitement (p. ex. l'amélioration) d'un ou plusieurs des symptômes du paludisme (c'est-à-dire où le parasite est Plasmodium). Les symptômes peuvent être choisis parmi des maux de tête, la fièvre, les frissons, les douleurs articulaires, les vomissements, anémie hémolytique, le jaunissement, l'hémoglobinurie, dommages à la rétine, convulsions, encéphalopathie, ou un ou plusieurs des symptômes neurologiques, y compris une posture anormale, nystagmus, conjugué regard de paralysie (les yeux ne tournent pas ensemble dans le même direction), opisthotonos, des convulsions, ou de coma. Le paludisme peut être un paludisme cérébral.

Dans certains modes de réalisation, l'anticorps MIF antiparasite est administré à un sujet infecté. Le sujet peut être un sujet récemment infecté. Par exemple, l'anticorps peut être administré dans les 2 semaines de l'infection (p. ex. dans les 10 jours, 9 jours, 8 jours, 7 jours, 6 jours, 5 jours, 4 jours, 3 jours, 2 jours, 24 heures). Par ailleurs, le sujet peut présenter un risque d'infection. Par exemple, le sujet peut être à risque d'infection dans les 2 semaines de l'administration de l'anticorps (par exemple en 10 jours, 9 jours, 8 jours, 7 jours, 6 jours, 5 jours, 4 jours, 3 jours, 2 jours, 24 heures).

Dans certains modes de réalisation, le sujet est un vertébré, par exemple, un mammifère, comme un être humain ou un mammifère vétérinaire (chat, chien, cheval, vache, moutons, bovins, cerf, chèvre ou porc) que les parasites visés aux présentes peuvent s'avérer être problématiques dans un large éventail d'espèces.

Les compositions de l'invention peuvent être élaborées sous forme de compositions de vaccin. Les vaccins selon l'invention peuvent être soit prophylactiques (c.-à-d. pour prévenir l'infection) ou thérapeutiques (c.-à-d. pour traiter l'infection), mais seront généralement prophylactiques.

Les compositions de l'invention peuvent être utilisées pour traiter les enfants et les adultes. Lorsque le vaccin est à usage prophylactique, l'homme est de préférence un enfant (par exemple un enfant en bas âge ou nourrisson) ou un adolescent. Lorsque le vaccin est pour un usage thérapeutique, l'homme est de préférence un adolescent ou un adulte. Un vaccin destiné aux enfants peut aussi être administré à des adultes, par exemple pour évaluer l'innocuité, la posologie, l'immunogénicité, etc.

Ainsi un sujet humain peut être âgé de moins de 1 an, moins de 5 ans, 1-5 ans, 5-15 ans, 15-55 ans, ou au moins de 55 ans. Les patients préférés pour recevoir les compositions sont les personnes âgées (p. ex. > 50 ans, > 60 ans et de préférence > 65 ans), les jeunes (p. ex. < âgé de 5 ans), les patients hospitalisés, les travailleurs de la santé, des services armés et militaires, les femmes enceintes, les malades chroniques ou immunodéficients. Cependant, les compositions ne conviennent pas uniquement pour ces groupes et peuvent être utilisées plus généralement dans une population.

Le sujet peut avoir été préalablement infecté et/ou élaboré une réponse immunitaire contre le parasite d'intérêt. Par exemple, le sujet peut avoir précédemment élaboré une réponse immunitaire contre l'antigène MIF parasite d'intérêt. Par ailleurs, le sujet peut être immunologiquement naïf en ce qui concerne le parasite et/ou de l'antigène MIF parasite.

Par « quantité immunologiquement efficace », on entend que l'administration de cette quantité à un sujet, soit en dose unique, soit dans le cadre d'une série, est efficace pour le traitement ou la prévention d'une infection de parasite. Cette quantité varie en fonction de la santé et la condition physique de l'individu à traiter, l'âge, le groupe taxonomique de .l'individu à traiter (par exemple, humain, primate non humain, etc.), la capacité du système immunitaire de l'individu à synthétiser des anticorps, les degrés de protection souhaités, la formulation de la composition ou vaccin, de l'évaluation du médecin traitant de la situation médicale, de la gravité de la maladie, la puissance du composé administré, du mode d'administration et d'autres facteurs pertinents. Il est prévu que le montant va tomber dans une gamme relativement large qui peut être déterminée au moyen d'essais courants.

Une dose d'acide nucléique (p. ex. un vaccin basé sur les acides nucléiques) peut avoir < 100 pg d'acide nucléique ; par exemple de 10-100 pg, comme sujet 10 pg, 25 pg, 50 pg, 75 pg ou 100 pg, mais une expression peut être vue à des niveaux beaucoup plus bas ; par exemple en utilisant < 1 pg/dose, < 100 pg/dose, < 10 pg/dose, < lpg/dose, etc. De même, une dose d'un antigène de protéine peut avoir < 100 pg de protéines; par exemple de 10-100 pg, jusqu'à environ 10 pg, 25 pg, 50 pg, 75pg ou 100 pg. Une dose d'un anticorps peut avoir ^ 1 000 mg anticorps ou anticorps de < 500 mg ; par exemple, de 1-1 000 ou 1-500 mg, comme environ 10 mg, 20 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, mg 800 ou 900 mg. L'anticorps peut être administré en une dose d'environ 0,1-10 mg/kg de poids corporel.

Les compositions de l'invention seront généralement administrées directement à un sujet. La livraison directe peut être effectuée par injection parentérale (par exemple par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, ou à l'espace interstitiel d'un tissu). D'autres voies de délivrance comprennent rectale, orale (par exemple comprimé, spray), buccale, sublinguale, vaginale, topique, transdermique ou transcutanée, intranasale, oculaire, auditive, pulmonaire ou une autre administration muqueuse. L'administration intradermique et intramusculaire sont deux voies privilégiées. L'injection peut se faire via une aiguille (par exemple une aiguille hypodermique), mais l'injection sans aiguille peut également être utilisée. Une dose intramusculaire typique est de 0,5 ml.

Une façon de vérifier l'efficacité du traitement thérapeutique comprend la surveillance de l'infection par le parasite après l'administration de compositions décrites ici. Une façon de vérifier l'efficacité du traitement prophylactique consiste à surveiller les réponses immunitaires, systémiques (par exemple la surveillance du niveau de la production d'IgGl et IgG2a) et/ou muqueuse (par exemple la surveillance du niveau de production d'IgA), contre l'antigène. En général, les réponses d'anticorps sériques spécifiques de l'antigène sont déterminées post-vaccination mais avant la provocation, alors que les réponses d'anticorps muqueux spécifiques de l'antigène sont déterminées post-vaccination et après la provocation.

Un autre moyen d'évaluer l'immunogénicité des compositions selon l'invention est d'exprimer l'antigène MIF parasite par recombinaison pour cribler des sérums de patients ou les sécrétions muqueuses par immunotransfert et/ou microréseaux. Une réaction positive entre l'antigène MIF parasite et l'échantillon du patient indique que le patient a monté une réponse immunitaire à l'antigène. Cette méthode peut également être utilisée pour identifier les antigènes immunodominants et/ou épitopes au sein des antigènes protéiques. L'efficacité des compositions peut également être déterminée in vivo en remettant en cause des modèles animaux appropriés de l'infection de parasite d'intérêt.

Le dosage peut être par un calendrier de dose unique ou un programme multiple de dosage (par exemple deux doses ou plus). Des doses multiples peuvent être utilisées dans un programme de vaccination primaire et/ou dans un calendrier de vaccination de rappel. Dans un schéma à dose multiple, les différentes doses peuvent être données par des itinéraires identiques ou différents, par exemple, un amorçage parentérale et un rappel muqueux, un amorçage muqueux et un rappel par voie parentérale, etc. Les doses multiples seront typiquement administrées au moins à 1 semaine d'intervalle (par exemple, environ 2 semaines, environ 3 semaines, environ 4 semaines, environ 6 semaines, environ 8 semaines, environ 10 semaines, environ 12 semaines, environ 16 semaines, etc.). Dans un mode de réalisation, les deux ou plusieurs doses sont administrées à environ 3 semaines d'intervalle.

Lorsque des doses multiples d'une composition de l'invention (c'est-à-dire deux doses ou plus) sont administrées à un sujet, la composition utilisée pour chaque dose peut être sélectionnée indépendamment d'une composition qui comprend : (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ; (ii) un antigène MIF parasite ; et (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite. La composition administrée dans une première dose (la première composition de dose) peut être une composition comprenant un parmi (i) , (ii) et/ou (iii) et la composition administrée dans une deuxième dose (la deuxième composition de dose) peut être une composition comprenant un parmi (i), (ii) et/ou (iii) . La composition de chacune des deux ou de plusieurs doses peuvent être les mêmes (par exemple une première dose de (i) suivie d'une seconde dose de (i) , ou une première dose (ii) suivie d'une seconde dose de (ii) ) ou peut être différente (par exemple une première dose de (i) suivie d'une seconde dose de (ii) , ou une première dose de (ii) suivie d'une seconde dose de (i) ) . Dans chacune des (i) , (ii) et (iii) , dans chaque dose, l'antigène MIF parasite peut être le même antigène MIF de parasite.

Les compositions pharmaceutiques L'invention concerne des compositions comprenant (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ; (ii) un antigène MIF parasite ; ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite. La composition peut être une composition pharmaceutique, par exemple une composition du vaccin. En conséquence, la composition peut également comprendre un support pharmaceutiquement acceptable. Si la composition comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite (par exemple, vaccin basé sur les acides nucléiques), la composition peut également comporter un système de livraison, tel que décrit ci-dessus.

Un « support pharmaceutiquement acceptable » comprend un support quelconque qui n' induit pas sur la production d'anticorps nocifs pour l'individu recevant la composition. Les supports appropriés sont typiquement de grandes macromolécules, lentement métabolisées telles que des protéines, des polysaccharides, des acides polylactiques, des acides polyglyc-oliques, des acides aminés polymères, des copolymères d'acides aminés, le saccharose, le tréhalose, le lactose et des agrégats lipidiques (tels que des gouttelettes d'huile ou des liposomes). De tels supports sont bien connus par les gens du métier. Les compositions peuvent également contenir un diluant pharmaceutiquement acceptable, tels que l'eau, saline, glycérol, etc. En outre, les substances auxiliaires, comme les agents de mouillage ou émulsifiants, des agents, les substances de tampon pH semblables, peuvent être présents. L'apyrogène stérile, une solution saline physiologique tamponnée au phosphate est un support typique. Une discussion approfondie des excipients pharmaceutiquement acceptables est disponible dans la réf. 48.

Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre des particules dans de l'eau ordinaire (par exemple w.f.i.) ou dans un tampon, par exemple un tampon phosphate, un tampon tris, un tampon borate, un tampon succinate, un tampon histidine, ou un tampon citrate. Les tampons de sel seront généralement compris dans la gamme de 5 à 20 mM.

Les compositions pharmaceutiques peuvent avoir un pH compris entre 5,0 et 9,5, par exemple entre 6,0 et 8,0.

Les compositions peuvent inclure des sels de sodium (chlorure de sodium par exemple) pour donner de la tonicité. Une concentration de 10+2 mg/ml NaCl est typique par exemple environ 9 mg/ml.

Les compositions peuvent inclure des chélateurs d'ions métalliques. Ceux-ci peuvent prolonger la stabilité de l'ARN par élimination des ions qui peuvent accélérer l'hydrolyse phosphodiester. Ainsi, une composition peut comprendre un ou plusieurs acide pentétique EDTA, EGTA, BAPTA, etc. Ces chélateurs sont généralement présents entre 10-500 μΜ, par exemple 0,1 mM. Un sel de citrate, comme le citrate de sodium, peut aussi agir comme un agent chélateur, tout en fournir aussi avantageusement une activité de mise en mémoire tampon.

Les compositions pharmaceutiques peuvent avoir une osmolalité comprise entre 200 mOsm/kg et 400 mOsm/kg, par exemple entre 240 et 360 mOsm/kg ou entre 290 et 310 mOsm/kg.

Les compositions pharmaceutiques peuvent inclure un ou plusieurs agents de conservation, comme le thiomersal ou 2-phénoxyéthanol. Les compositions sans mercure sont préférées, et les vaccins sans agent de conservation peuvent être préparés.

Les compositions pharmaceutiques sont de préférence stériles.

Les compositions pharmaceutiques peuvent être non-pyrogènes contenant par exemple < 1 UE (unité d'endotoxine, une mesure standard) par dose et de préférence < 0,1 UE par dose.

Les compositions pharmaceutiques peuvent être sans gluten.

Les compositions pharmaceutiques peuvent être préparées sous forme de dose unitaire. Dans certains modes de réalisation, une dose unitaire peut avoir un volume compris entre 0,1-1,0 ml, par exemple environ 0,5 ml.

Les compositions peuvent être préparées sous forme de compositions injectables, soit sous forme de solutions ou de suspensions. La composition peut être préparée pour une administration pulmonaire, par exemple par un inhalateur, en utilisant une pulvérisation fine. La composition peut être préparée pour l'administration nasale, auditive ou administration oculaire, par exemple sous forme de pulvérisation ou de gouttes. Les produits injectables pour administration intramusculaire sont typiques. L'invention propose également un dispositif d'administration (par exemple, une seringue, un nébuliseur, un pulvérisateur agricole, inhalateur, un patch dermique, etc.) contenant une composition pharmaceutique de l'invention. Ce dispositif peut être utilisé pour administrer la composition à un sujet (par exemple, un sujet vertébré).

Une composition de l'invention peut également comprendre, ou être administrée en association avec un ou plusieurs adjuvants (par exemple des adjuvants de vaccins), en particulier lorsque la composition comprend une quantité immunologiquement efficace d'un antigène MIF parasite.

Les adjuvants qui peuvent être utilisés dans les compositions de l'invention comprennent, mais ne se limitent pas à : (A) des compositions, par exemple les sels d'aluminium et de calcium, tels que les phosphates d'aluminium contenant des minéraux. (B) des émulsions de pétrole, par exemple le squalène-en-eau, comme le MF59 ou AS03. L'adjuvant complet de Freund (CFA) et l'adjuvant incomplet de Freund (IFA) peuvent également être utilisés. (C) Formulations de saponine. (D) Les virosomes et particules d'apparence-virale (VLP). (E) Les dérivés bactériens ou microbiens tels que les dérivés non-toxiques de lipopolysaccharide entérobactéries (LPS), les dérivés de lipide A, des oligonucléotides immunostimulants et des toxines et leurs dérivés detoxifies ADP-ribosylante. (F) Les immunomodulateurs humains, par . exemple des cytokines, telles que les interleukines, interférons, le facteur de stimulation des colonies de macrophages et le facteur de nécrose tumorale. (G) Les bioadhésifs et des mucoadhésifs tels que interestérifiés des microsphères d'acide hyaluronique, les dérivés réticulés de poly (acide acrylique), l'alcool polyvinylique, la polyvinylpyrrolidone, les polysaccharides et la carboxyméthylcellulose. (H) Les microparticules, par exemple des particules de ~ 100 pm à ~ 150 pm de diamètre, de préférence ~ 200 pm à ~ 30 pm de diamètre, et de préférence entre ~ 500 pm à ~ 10 pm de diamètre) formées à partir de matériaux qui sont biodégradables et non-toxiques (par exemple, un poly (a-hydroxy acide), un acide polyhydroxybutyrique, un polyorthoester, un polyanhydride, une polycaprolactone, etc.), avec un poly (lactide-co-glycolide) sont préférés, éventuellement traités pour avoir une surface de charge négative (par exemple avec du SDS) ou une surface chargée positivement (par exemple avec un détergent cationique, comme CTAB). (I) Les liposomes. (J) Formulations des polyoxyéthylène éther et ester de polyoxyéthylène. (K) Polyphosphazène (PCPP) . (L) Les peptides muramyl. (M) Des composés imidazoquinolone, par exemple Imiquamod et ses homologues. L'utilisation d'un hydroxyde d'aluminium ou adjuvant de phosphate en aluminium est particulièrement préférée et les antigènes sont généralement adsorbés à ces sels. Alternativement, MF59, AS01 ou AS03 peuvent être utilisés comme adjuvant.

Des exemples d'adjuvants comprennent également des agonistes de TLR7 humain, par exemple un composé de formule (K). Ces agonistes sont discutés en détail dans la référence 49:

dans lequel: R1 est H, Ci-C6alkyl, -C(R5)2OH, -i/R5, -I^R6, -L2R5, -L2R6, -OL2R5, ou -OL2R6; L1 est —C(O)— ou -0-; L2 est Ci-C6alkylène, C2-C6alkylène, arylène, hétéroarylène ou - ( (CR4R4) pO) q (CH2) p-, dans lequel Ci-C6alkylène et C2- C6alkenylène de L2 sont éventuellement substitués par 1 à 4 groupes fluoro ; chaque L3 est choisi indépendamment parmi Ci-C6alkylène et -( (CR4R4) pO) q (CH2) p-, dans lequel Ci-C6alkylène de L3 est éventuellement substitué par 1 à 4 groupes fluoro ; L4 est arylène ou hétéroarylène ; R2 est H ou Ci-C6alkyle ; R3 est choisi parmi Ci-C4alkyle, -L3R5, -L1R5, -L3R7, L3L4L3R7, -l3l4r5, -l3l4l3r5, -OL3R5, -OL3R7, -OL3L4R7, -OL3L4L3R7, - OR8, -OL3L4R5, -OL3L4L3R5 et -C(R5)2OH ; chaque R4 est indépendamment choisi parmi H et un groupe fluoro ; R5 est -P(0) (OR9) 2, R6 est -CF2P(0) (OR9) 2 ou -C(0)OR10; R7 est -CF2P(0) (OR9) 2 ou -C(0)OR10; R8 est H ou Ci-C4alkyle ; chaque R9 est indépendamment choisi parmi H et Ci-C6alkyle ; R10 est H ou Ci~C4alkyle ; chaque p est indépendamment choisi parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6, et q est 1, 2, 3 ou 4.

Un agoniste TLR7, par exemple un agoniste TLR7 de formule (K), peut être adsorbé sur un sel d'aluminium insoluble (par exemple, pour former un complexe absorbé pour immunogènes adjuvants). Des sels d'aluminium utiles comprennent, à titre non limitatif, 1'hydroxyde d'aluminium et des adjuvants de phosphate d'aluminium. Les sels d'aluminium qui comprennent des ions d'hydroxyde sont préférés pour une utilisation avec l'invention car ces ions hydroxydes peuvent facilement subir un échange de ligand avec des composés de formule (K). Ainsi, les sels préférés pour l'adsorption des agonistes TLR sont 1'hydroxyde d'aluminium et/ou de l'aluminium hydroxyphosphate. Celles-ci ont des groupements hydroxyles de surface qui peuvent facilement subir un échange de ligands avec des groupes contenant du phosphore (par exemple des phosphates, des phosphonates) pour fournir une adsorption stable. Dans un mode de réalisation exemplaire, un adjuvant d'hydroxyde d'aluminium est utilisé. Alternativement, un agoniste TLR7, comme un agoniste TLR7 de formule (K) ne peut pas être adsorbé à un sel d'aluminium insolubles.

Des adjuvants contenant du phosphore utilisés avec la présente invention peuvent exister sous un certain nombre de formes protonées et déprotonées en fonction du pH du milieu environnant, par exemple le pH du solvant dans lequel ils sont dissous. Par conséquent, même si une forme particulière peut être illustrée, il est prévu que ces illustrations sont simplement représentatives et non limitatives à une forme protonée ou déprotonée spécifique. Par exemple, dans le cas d'un groupe phosphate, cela a été illustré comme -OP(O)(0H)2 mais la définition inclut les formes protonées [0P(0) (0H2) (0H)]+ et -[OP(0) (OH)2]2+ qui peuvent exister dans des conditions acides et les formes déprotonées -[OP(O)(OH)(0)]' et [OP(O)(0)2]2‘ pouvant exister dans des conditions basiques.

Des combinaisons d'un ou plusieurs adjuvants identifiés ci-dessus peuvent également être utilisés avec l'invention. L’identité de séquence L'identité ou l'homologie par rapport à une séquence est définie ici comme le pourcentage des résidus d'acides aminés dans la séquence candidate qui sont identiques avec la séquence de référence d'acides aminés après alignement des séquences et introduction de brèches, si nécessaire, pour atteindre le pourcentage maximum de l'identité de séquence sans prendre en considération une quelconque substitution conservatrice en tant que partie de l'identité de séquence. L'identité de séquence peut être déterminée par des procédés classiques qui sont couramment utilisés pour comparer la similarité de position des acides aminés des deux polypeptides. L'utilisation d'un programme d'ordinateur tel que BLAST ou FASTA, deux polypeptides sont alignés pour la correspondance optimale de leurs acides aminés respectifs (soit le long de toute la longueur d'un ou de deux séquences ou le long d'une portion prédéterminée d'une ou des deux séquences). Les programmes offrent une pénalité d'ouverture par défaut et une pénalité d'écart par défaut et une matrice de notation telle que PAM 250 [une matrice standard de notation. Voir Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)] peut être utilisé en conjonction avec le programme informatique. Par exemple, l'identité en pourcentage peut être calculée comme suit : le nombre total d'appariements identiques multiplié par 100 et ensuite divisé par la somme de la longueur de la séquence la plus longue dans l'intervalle correspondant et le nombre de lacunes introduites dans les séquences plus courtes afin d'aligner les deux séquences. Général

Le terme « comprenant » englobe « y compris » ainsi que « composé « par exemple une composition « comprenant » X peut consister exclusivement en X ou peuvent inclure quelque chose supplémentaire par exemple X + Y.

Le terme « environ » en relation avec une valeur numérique x est facultatif et signifie, par exemple, x+10 %.

Lorsque la présente invention se réfère à une séquence de référence à un code d'adhésion UniProt ou GenBank, la séquence visée est la version actuelle à la date de dépôt de la présente demande.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS

La figure 1 montre les réponses de cellules T spécifiques du paludisme chez des souris immunisées avec : ARN encodant PbMIF dans un véhicule de livraison CNE (PbMIF-CNE) ; ARN encodant GFP dans un véhicule de livraison CNE (GFP-CNE) ; ou des souris immunisées avec la protéine PbMIF avec l'adjuvant de Freund (PbMIF-FA) ; à 7 jours après l'infection de Plasmodium au jour 40 de la post-vaccination. *P<0,05

La figure 2 montre l'activité de neutralisation de la vaccination PbMIF sur (A) parasitémie à Plasmodium et (B) contenu de la rate de parasite à 7 jours de post-infection. *P<0,05

La figure 3 montre les titres anti-PbMIF (OD^onm) sériques au jour 14 (2 semaines après la première immunisation) pour les souris immunisées avec l'ARN/PMIF CNE ou ARN/GFP CNE. Les titres moyens sont exprimés sous forme de titres de point de terminaison ; la dilution réciproque qui se donne à fond OD45onni· ****PC0,0001 Mann-Whitney U, n = 15 par groupe.

La figure 4 illustre des titres anti-PbMIF (OD450nm) sériques au jour 35 (2 semaines après la deuxième immunisation) pour les souris immunisées avec l'ARN/PMIF CNE ou ARN/GFP CNE. Les titres sont exprimés en moyenne sur la figure 3. ****P<0,0001 Mann-Whitney U, n = 15 par groupe.

La figure 5 montre : (A) un système de vaccination ARN/PbMIF CNE et ARN/GFP CNE, premier défi de parasite, remède (CQ) et deuxième défi du parasite ; (B) Plasmodium parasitémie au-delà de 7 jours après le premier défi de parasite (jours 35 à 42) ; et (C) les niveaux de sérum IFNy sur 5 jours· post infection. *P<0,5, **P<0,01 Mann-Whitney U, n = 15 par groupe.

La figure 6A montre les titres d'anti-PbMIF sérique (OD450nm) au jour 59 (2,5 semaines après l'infection) de souris immunisées avec 1'ARN/PMIF CNE ou ARN/GFP CNE (**** P <0,0001 ü de Mann-Whitney, n = 15 par groupe) . La figure 6B montre les réponses moyennes des IgG anti-Plasmodium au jour 59 (*** p <0,01 U de Mann-Whitney, n = 15 par groupe). Les titres sont exprimés en moyennes sur la Figure 3.

La figure 7 montre la parasitémie de Plasmodium chez les souris immunisées avec de 1'ARN/PMIF CNE ou ARN/GFP CNE pendant 14 jours après la deuxième défi (59-73 jours). * P <0,05, ** P <0,01 Mann-Whitney U, n = 9 au total (4 x ARN/GFP témoin CNE, 5 X ARN / PMIF CNE).

La figure 8 montre les effets du CNE de RNA/PMIF rapport à la vaccination RNA/GFP CNE sur le phénotype de cellules T. Les cellules T répondant à P. berghei (CD4 + Ki67hi) ont été divisées en sous-ensembles : Tmem (mémoire) CD62L + IL-7Ra+ ;

Tem (mémoire effectrice) CD62L IL-7Ra+ ; et Teff (effecteur) CD62L- IL-7ROT. La figure 8A montre les pourcentages des différents phénotypes de cellules T, 7 après l'infection primaire. La figure 8B montre les pourcentages des différents phénotypes de cellules T, 7 jours après la seconde infection. La figure 8C montre les pourcentages de cellules qui sont PD-1+ (indiquant l'épuisement des cellules T). *P<0.05, **P<0.01 Mann-Whitney U.

La figure 9 montre le parasitémie de Plasmodium chez les souris recevant le transfert passif d'un anticorps polyclonal anti-PbMIF (IgG) par rapport aux souris ayant reçu une IgG témoin de lapin non immunisé (Ctrl IgG) au jour 7 de postinfection. Chaque point de données représente une seule souris. P=0,0005 par t-test.

La figure 10 montre que le transfert passif d'IgG à partir PbMIF immunisé des souris et le stade sanguin infecté offre une protection partielle à la fois BALB/c et paludisme cérébrales sensibles C57BL/6. (A) 1/IgG isolé de GFP (témoin) ou PbMIF vaccinés et des souris infectées PbA étaient i.p. administrées à des souris BALB/c et C57BL/6 naïves puis suivi par une infection PbA. (B) La parasitémie et l'analyse de survie de Kaplan-Meyer de souris BALB/c administrés IgG immune. Les valeurs de p ont été générées en utilisant un test de longue portée et les données sont de deux expériences indépendantes avec 5 souris par groupe (* p <0,05, ** p <0,01). (C) Des parcelles de survie de Kaplan-Meyer et ECM (neuropaludisme expérimental) de souris C57BL/6 administré IgG immunes et infectées avec PbA. Les valeurs de p statistiques ont été générées en utilisant un test de longue portée (** p< 0,01) et les données sont représentatives des deux expériences indépendantes n=10 souris par groupe.

La figure 11 montre que les cellules T CD4 transférées de manière adoptive d'une souris immunisée PbMIF confèrent une protection à une provocation homologue. (A) Des souris immunisées CD45.2 BALB/c ont été infectées avec 106 PbA-iRBCs et traitées avec de la chloroquine aux jours 7-12. Quatre semaines plus tard, les souris ont été réinfectées par PbA et les splénocytes isolés au jour 7 après l'infection, incubés à la chloroquine pour éliminer les résidus Plasmodium et étiqueté avec CFSE. Les cellules T CD4 purifiés (2 x 107) furent donc transférés dans des souris BALB/c CD45.1 naïves et infectées 3 jours plus tard avec 106 PbA-iRBCs. (B) La parasitémie chez des souris par transfert adoptif de cellules T CD4 à partir de GFP (o) ou PbMIF (·) de souris immunisées (* p < 0,05, #p < 0,001, par analyse ANOVA à deux voies) . Le graphique montre le % de parasitémie par rapport aux jours de post-infection. (C) L'histogramme de dilution de CFSE typique des cellules T CD4 transférées adoptivement (CD45.2) de GFP ou de donneurs immunisés de PbMIF, l'énumération des cellules T CD 4 transférées CD45.2 récupérées, et la réponse de la prolifération des cellules T CD4 transférées dans des récipients CD45.1, 7 jours après l'infection. (D) Pourcentage de la prolifération des cellules CD45.2 CD4 T (CFSE10) produisant de I'IFNy après stimulation ex vivo avec des lysats de PbA—iRBC. (E) Intensité de fluorescence moyenne de PD-1 dans les cellules T CD4 CD45.2 PjbA-sensibles (CFSE10) de GFP (témoin) ou donneurs immunisés de PbMIF. Les résultats sont de deux expériences distinctes avec 4 souris par groupe (* p < 0,05, ** p < 0,01 par test de Mann-

Whitney.)

MODES DE REALISATION DE L'INVENTION

EXEMPLE 1 : VACCINATION À L'AIDE DE P. EERGHEI MIF, SUIVIE PAR LE DEFI DE PARASITE

Des groupes de 5 souris BALB/c femelles âgées de 8 à 10 semaines ont été immunisées avec : (1) de l'ARN codant P.

berghei MIF (PbMIF) dans un véhicule de livraison LNP (RV01, voir les références 34 et 36) ; (2) un ARN codant pour PbMIF

dans un véhicule de livraison CNE (comprenant le squalène et le DOTAP, comme décrit en référence 35) ; (3) l'ARN encodant GFP dans un véhicule de livraison CNE ; ou (4) par injection intraperitoneale (i.p.) de protéine PbMIF avec l'adjuvant de Freund, comme indiqué dans le tableau 1. Des immunisations ont été effectuées les jours 0 et 21.

Tableau 1

Des échantillons de sang ont été prélevés à partir de souris immunisées au jour 14 et au jour 35 (14 jours après le rappel) et les titres sériques totales d'IgG anti-PbMIF ont été mesurés par dosage ELISA anti-PbMIF. Les souris immunisées ont été contestées au jour 38-40 par injection i.p. de P. berghei ANKA 106 (PbA)-infectés par les globules rouges (hématies). Le poids des souris au cours du temps (jours de 0 à 40) et l'aspect clinique ont également été évalués pour les souris dans chaque groupe expérimental.

Titres de sérum IgG anti-PbMIF de souris immunisées et la tolérance au vaccin

Les titres IgG ont été mesurés 14 jours après la première immunisation et 14 jours après l'immunisation deuxième rappel. Des tests Anti-PbMIF ELISA ont été effectués comme suit : 96 puits ont été .revêtus pendant une nuit avec 100 ng/ml de recombinant PbMIF. Après blocage pendant 1 heure à la température ambiante, des dilutions en série de sérums ont été incubées pendant 2 heures et l'IgG totale liée a été détectée avec un anticorps de lapin anti-IgG de souris couplé à la peroxydase de raifort (HRP). 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) a été utilisé comme substrat. La réaction a été arrêtée avec l'acide et la lecture de l'OD réalisée à 450 nm. L'immunisation avec le vaccin PbMIF auto-répliquant de l'ARN ou de protéine PbMIF (groupes 1, 2 et 4) a suscité des réponses d'anticorps humorale primaire et secondaire à PbMIF. Aucune réponse significative n'a été observée chez les souris témoins traitées avec de l'ARN/GFP CNE (groupe 3). Des réactions secondaires ont été observées dans 80 % des souris traitées avec le CNE ARN/PMI F (groupe 2) et 60 % des souris traitées avec ARN/PMIF LNP (groupe 1), avec des titres comparables. Les réponses primaires dans les groupes 1 et 2 ont été ~ 100 fois moins et des réactions secondaires dans les groupes 1 et 2 étaient ~ 1 000 fois moins que les souris traitées avec la protéine PMIF FCA/FIA (groupe 4).

Les souries ont bien toléré la vaccination, avec aucun changement dans l'aspect clinique (observation clinique q3d) et aucune réduction du poids entre les différents groupes expérimentaux du jour 0 au jour 40.

Impact de la vaccination PbMIF sur les réponses des cellules T spécifiques au paludisme

Les groupes 2, 3 et 4 ont été sélectionnés pour l'étude.

Les souris immunisées ont été contestées au jour 40 par injection i.p. de 106 de globules rouges RBC infectés par PbA. Au jour 7 post-infection, les splénocytes ont été isolés et stimulés ex vivo en cultivant avec des lysats de cellules de globules rouges infectées en présence de perles anti-CD3/CD28 et de bréfeldine A pendant 6 heures. La coloration de cytokine intracellulaire a ensuite été réalisée. Les anticorps suivants ont été utilisés pour étudier des cellules T CD4 de production d'IFN-γ, l'activation des cellules T (CDlla) et la différenciation des cellules T (T-bet) : Ki67 FITC, CD45.2

PerCP-Cy5.5, IFNy PE-Cy7, CD4 Alexa 700, CDlla eFluor 405, T-bet Alexa 647 (Life Technologies). Les cellules T CD4 PbA-sensibles sont définies comme CD45.2+, KÎ67+, CD4+. Les cellules colorées ont été analysées par cytométrie de flux.

Au jour 7 après l'infection, les souris immunisés PbMIF (groupes 2 et 4) montrent une cellule T proliferative plus forte en réponse à P. berghei parasites (cellules supérieures CD4+KÎ67 + ) une réponse de la mémoire des cellules T CD4 plus forte pour les parasites, comme, indiqué par CDlla inférieur et inférieure T-bet (fig. IA et IB) et moins de cellules T inflammatoires, l'effecteur terminal de l'IFN-γ produisant (fig. IC et 1D) que les souris témoins (groupe 3).

Par exemple, la cytométrie de flux a montré que 5,26 % des cellules T CD4 spléniques à partir de l'ARN/PMIF CNE (Groupe 2) des souris immunisées ont été inflammatoire, l'effecteur terminal de 1'IFN-y-production de cellules T CD4 (marqué avec antiCD4 et colorées pour l'IFN-γ à un anti-IFN-γ anticorps), comparativement à 11,1 % des cellules CD4 T spléniques de l'ARN t.émoin/GFP CNE (Groupe 3) (souris immunisées à l'aide de cellules regroupées en 5 souris par groupe). D'autres études ont montré une augmentation > 65 % dans le nombre de cellules T CD4 mémoires sensibles au Plasmodium (CD62L + IL7Ra +) et les précurseurs de cellules T CD4 mémoires effectrices (CD62L-IL7Ra +), ainsi qu'une réduction de 20 % dans l'expression du marqueur de l'épuisement de PD-1 chez les souris immunisées PbMIF-CNE par rapport aux souris témoins GFP-CNE au jour 7 après l'infection (n = 5 par groupe, sur la base de deux expériences séparées), ce qui suggère une préservation relative de la réponse de mémoire dans chez les souris immunisées PbMIF par rapport au groupe témoin. Il a également été démontré que, au jour 7 post-infection, le nombre de cellules T CD4 auxiliaires folliculaires et sensibles au Plasmodium (cellulesFH T - CD49dhlCDllahlCXCR5hi CD4 ) était supérieur de 50 % chez les souris immunisées PbMIF-CNE par rapport aux souris témoins GFP-CNE. Conformément à cette augmentation de la population de cellules TFH observée, il y avait une amélioration correspondante du nombre de cellules B spléniques, avec une augmentation de 30 % en cellules B (CD19+B220+) et la population de plasmablaste de cellules B a plus que doublé (CD19loB220loCD138hlIgD“) . Ainsi, l'immunisation PbMIF est associée à une amélioration de l'hôte TFH et les réponses des cellules B. L’évaluation de l’activité de neutralisation des vaccinations PbMIF ARN sur la parasitémie de P. berghei et sur le contenu en parasite splénique

Au jour 7 post-infection, la parasitémie a également été étudiée chez les souris immunisées, contestées des groupes 2 et 3. Le fardeau parasitaire a été mesuré par la détection quantitative de PCR de copies ARNr 18S de P. berghei de sang périphérique, et le fardeau parasitaire splénique a été mesuré par l'expression de l'ARNr 18S par rapport à l'hôte GAPDH..

Comme le montre la fig. 2, une vaccination PbMIF-CNE a été associée à une réduction significative de la parasitémie (30 %) et le contenu de parasite splénique lors de l'épreuve avec infection mortelle de P. berghei.

La parasitémie et la survie lors de la première infection

Dans une autre expérience, les souris BALB/c préalablement vaccinées avec le vaccin de RNA/PbMIF-CNE ou GFP-CNE étaient infectées par PbA et la parasitémie suivie de FACS. La parasitémie a été significativement réduite chez les souris immunisées RNA/PbMIF-CNE par rapport aux souris témoins GFP-CNE-immunisés. Alors qu'il n'y n'avait aucune différence initiale de parasitémie entre les deux groupes, il y avait une augmentation plus rapide du parasitémie après le jour 5 dans le groupe témoin (GFP-CNE), qui est devenu moribond au jour 21. En revanche, les souris immunisées PbMIF ont montré un meilleur contrôle de la parasitémie pendant les 15 premiers jours de l'infection. La survie était également surveillée jusqu'à 30 jours postinfection et les souris ARN/PbMIF-CNE-immunisées ont montré une prolongation de 37 % dans le temps moyen de survie par rapport aux souris témoins immunisées GFP-CNE.

Conclusions (1)

La protéine PbMIF et les vaccins d'ARN auto-répliquant sont bien tolérés et produisent une réponse d'anticorps humorale primaire et secondaire chez les souris BALB/c.

La vaccination d'ARN/PbMIF (avec CNE) a neutralisé l'activité PbMIF du Plasmodium, et amélioré la différenciation des cellules T CD4 mémoires. En outre, la neutralisation de l'activité PbMIF a réduit de façon significative la parasitémie et la teneur en parasite des rates et a incontestablement amélioré le temps de survie moyen chez les souris infectées. Ainsi, la vaccination PbMIF confère une protection au moins partielle au premier défi d'infection.

EXEMPLE 2: VACCINATION À L'AIDE DE P. BERGHEI MIF DANS UN

VÉHICULE DE LIVRAISON CNE ARN, SUIVI DE DÉFI, DE GUÉRISON ET REDÉFI DE PARASITE L'exemple 2 diffère de l'exemple 1 dans l'addition d'un premier défi de parasite, suivi par la guérison pour élargir la population de cellules T mémoires spécifiques au Plasmodium.

Des groupes de 15 souris BALB/c femelles âgées de 8 à 10 semaines ont été immunisés avec : (1) l'ARN encodant le PbMIF dans un véhicule de livraison CNE et (2) un ARN codant la GFP dans un véhicule de livraison CNE, comme indiqué dans le tableau 2. Des immunisations ont été effectuées les jours 0 et 21.

Tableau 2

Des échantillons de sang ont été prélevés à partir de souris immunisées aux jours 14 et 35 et les titres d'IgG anti-PbMIF sériques complets ont été mesurés par dosage ELISA anti-PbMIF. Les souris immunisées ont été contestées au jour 35 par injection i.p. de globules rouge 106PbA infectés. Elle a été suivie par la guérison avec la chloroquine (CQ) (50 mg/kg/jour) les jours 7-10 post-défi (jours 42-45).

Lectures suite au premier défi :

Parasitémie : 3, 5 et 7 jours post-défi (jours 38, 40, 42) .

Anti-Ig PbMIF sérique total et anti-Plasmodium Ig total après guérison CQ (avant le 2eme défi, jour 59) .

Les souris immunisées ont été re-contestées avec P.berghei au jour 59 et l'infection a été suivie pendant 7 ou 14 jours post-re-défi. 5 souris/groupe ont été euthanasiées au jour 4 ou 7 et les souris restantes ont été suivies pour parasitémie.

Lectures :

Parasitémie : jours 5, 8, 11 et 14 post-défi (jours 64, 67, 70, 73) .

Phénotypes de cellules T (jour 66).

Les titres d'anti-IgG PbMIF sérique au jour 14 (deux semaines après la première vaccination) et au jour 35 (2 semaines après la deuxième vaccination)

Les titres d'IgG sériques ont été mesurés par anti-PbMIF ELISA au jour 14, après la première immunisation et au jour 35, après la seconde immunisation. Des dosages ELISA anti-PbMIF ont été réalisés comme dans l'exemple 1.

Les titres d'anticorps anti-IgG PbMIF sériques ont été mesurés pour chaque souris au jour 14. Une réponse anti-IgG

PbMIF (~ 1/2 500) a été observée chez 50 % des souris immunisées PbMIF dans le groupe 1 après la première immunisation. Les titres en moyenne à 14 jours sont présentés dans la figure. 3.

En outre, les titres d'anti-IgG sériques PbMIF ont été mesurés pour chaque souris au jour 35. Une augmentation des titres d'IgG anti-PbMIF a été observée chez 95 % des souris immunisées PbMIF dans le groupe 1 après la seconde immunisation dans le groupe PbMIF-CNE et les titres sont 5 fois plus élevés par rapport à ceux au jour 14 (~1/14 500).

Infection de défi jours 35-42 pour étendre les cellules T mémoires spécifiçpies au Plasmodium

La parasitémie a été évaluée aux jours 3, 5 et 7 après le premier défi (jours 35-42), comme décrit dans l'exemple 1. Le sérum IFNy a également été évalué par un ELISA spécifique au jour 5 de post-infection.

Comme le montre la fig. 5B, une différence détectable (0,5 log) de la parasitémie a été observée 7 jours après la première infection de Plasmodium. Cet effet est associé à circulation réduite IFNy qui est compatible avec des niveaux réduits d'une réponse de cellule T IFNy+T hautement inflammatoire (Fig. 5C).

Les titres anti-PbMIF et anti-Plasmodixm IgG sériques au jour 59, 2,5 semaines après la première infection

Les titres d'anticorps anti-IgG PbMIF sériques ont été mesurés pour chaque souris au jour 59. L'infection de Plasmodium a augmenté les titres d'anticorps anti-Ig PbMIF par 10 fois (Fig. 6A) dans 1'ARN/PbMIF par rapport à des souris d'ARN/GFP. En outre, les titres sériques d'IgG anti-Plasmodium ont été mesurés au jour 59 par ELISA IgG anti-souris sur des lysats de globules rouges parasités. L'infection de Plasmodium a augmenté les titres d'Ig anti-Plasmodium par 5 fois (Fig. 6B) dans ARN/PbMIF par rapport aux souris d'ARN/GFP.

La parasitémie suite au nouveau défi avec Plasmodium au jour 59

La parasitémie a été évaluée au jours 5, 8, 11 et 14 après le deuxième défi (jours 59-73) comme décrit dans l'exemple 1.

Comme le montre la Fig. 7, la vaccination ARN/PbMIF a nettement réduit la parasitémie (5 log au jour 14 postinfection) après le re-défi de Plasmodium au jour 59. Évaluation des effets d' ΆΚΝ/PbMIF sur le phénotype de cellules T spécifiques au Plasmodium

Les souris ont été euthanasiées au jour 7 après la deuxième infection et la réponse des cellules T et le phénotype ont été analysés avec la production de cytokines. Des cellules spléniques ont été isolées sur 4 à 5 souris par groupe expérimental et analysées pour coloration CD62L et IL-7Ra . CD62L et IL-7Ra identifient les différents sous-ensembles de cellules T répondant à P. berghei (CD4+ Ki67hl). Les résultats sont résumés dans le tableau 3.

Tableau 3

Ainsi, la neutralisation PbMIF augmente le vivier de cellules CD4+T mémoires répondant à P. berghei-.

Impact du vaccin ARN/PbMIF sur les cellules T spécifiques de Plasmodium

Les phénotypes de cellules T observées après la première infection par Plasmodium (jour 7 post-infection, données de l'étude dans l'exemple 1) (Fig. 8A) ont été comparés aux phénotypes des cellules T observés après seconde infection par Plasmodium (jour 7) (Fig. 8B).

Comme on peut le voir sur les figures 8A et 8B, le vaccin ARN/PbMIF-CNE favorise le développement de cellules Tmem spécifiques au Plasmodium (CD62L+ IL-7Ra+) au cours d'une première infection par P. berghei et ces cellules Tmem augmentent encore pendant la deuxième infection.

De plus, l'épuisement de cellules T, comme indiqué par les cellules Tmen spécifique au Plasmodium exprimant PD-1, a été réduit chez les souris immunisées par ARN/PbMIF par rapport aux souris immunisées par ARN/GFP (Fig. 8C).

Production de cytokines de cellules T par les sous-ensembles de cellules T sensibles au Plasmodium

La production d'IFNy par Tem (cellules mémoire effectrice de courte durée) est réduite chez les animaux immunisés au PbMIF. Cela peut refléter une réponse des cellules T spécifiques au Plasmodium moins inflammatoire (et plus efficace). Aucun changement évident dans les cellules T produisant du TNF n'a été noté. (Données non présentées)

Conclusions (2)

Les vaccins de l'autoréplication ARN sont bien tolérés et produisent de fortes réponses humorales au Plasmodium MIF (PbMIF). La première et la deuxième vaccination a induit une réponse chez 50 % et 95 % des souris immunisées, respectivement, avec un titre beaucoup plus élevé après la deuxième vaccination et de nouveau après infection PbA.

La vaccination d'ARN/PbMIF (CNE) a neutralisé l'activité PbMIF du Plasmodium , comme en témoigne l'amélioration de la différenciation de la mémoire des cellules T CD4. Les effets de cette neutralisation sont :

Plus grand nombre de cellules de Stéphane et une plus forte réponse humorale anticorps anti-Plasmodium. Après le défi principal avec P. berghei, il y a une diminution mesurable et significative de parasitémie (0,5 log).

Le nouveau défi après la guérison de la première infection a comme conséquence une nouvelle expansion de nombres Tmen et une réduction significative de la parasitémie (5 log).

La vaccination par RNA/PbMIF permet le développement des cellules T mémoires et fournit une protection significative contre le re-défi du paludisme. L'ARN/PbMIF peut être un candidat-vaccin viable, soit indépendant ou en combinaison avec d'autres vaccins candidats contre Plasmodium, où il s'agirait de promouvoir des réponses des cellules T mémoires de longue durée. EXEMPLE 3 : TRANSFERT PASSIF D'UN ANTICORPS POLYCLONAL ANTI-PBMIF

IgG a été purifiée d'un lapin immunisé avec PbMIF recombinante (IgG Anti-PbMIF) ou d'un lapin non vacciné (Ctrl IgG) et 200 pg en injection intrapéritonéale à des souris C57BL/6 à -6 heures, 24 heures, 48 heures et 72 heures après l'infection avec des globules rouges parastiés d'l x 106 P. berghei . La parasitémie a été énumérée par PCR quantitative du sang au jour 7 de post-infection.

Comme illustré à la figure 9, le transfert passif de l'anticorps anti-PbMIF réduit de manière significative la parasitémie dans le modèle de souris infectée du P. berghei du paludisme.

Dans une autre étude, 200 pg d'IgG sérum purifié par chromatographie des protéines-G (Pierce) de GFP (témoin) ou immunisées au PbMIF et de souris infectées par PbA était administré i.p. aux souris naïves BALB/c ou C57BL/6 (dépendantes de paludisme cérébral) et suivi par une infection PbA (Fig. 10 a). Une administration i.p. était effectuée les jours -1, 1, 2 et 3 post-infection. Chez les souris C57BL/6, le paludisme cérébral était surveillé et les symptômes classés par le Coma murin rapide et échelle de comportement (50) , où 16 = aucun signe, 15-11 = doux symptomatique, 10-08 = signes prodromiques d'expérimental cérébral contre le paludisme (ECM), 07-04 = ECM. Les souris agoniques ont été immédiatement sacrifiées. L'administration d'IgG à partir souris immunisées PbMIF dans des souris naïves BALB / c qui ont été infectées avec PbA fournit une protection partielle, avec une hausse retardée de la parasitémie, une réduction de .30 % du pic de parasitémie, et une prolongation de 30 % du temps de survie (Fig. 10B) Lorsqu'étudié dans le modèle de mortalité aiguë C57BL / 6 de malaria cérébrale, IgG de la GFP (témoin) des souris immunisées n'a pas montré de protection : toutes les souris ont développé des signes neurologiques et sont devenues moribondes entre les jours 6-7 post-infection (Fig. 10C). En revanche, chez les souris C57BL/6 qui ont reçu IgG de souris immunisées PbMIF, puis ont été infectées par PbA, il y avait un retard marqué dans le temps de développer une maladie neurologique, maladie moins grave, et un taux de 30 % de survie, avec une protection complète de manifestations neurologiques. Le paludisme cérébral est une complication uniformément mortelle d'infection PbA chez les souris C57BL/6 et l'effet protecteur de l'immunoglobuline se produit malgré une parasitémie équivalent entre les groupes jusqu'au le moment de létalité (jour 6), après quoi les souris survivantes ont éliminés de leurs parasites (données non présentées).

EXEMPLE 4 : EFFET PROTECTEUR DES CELLULES T CD4 CHEZ DES SOURIS VACCINÉES

Des souris BALB/c (CD45.2+) vaccinées avec le RNA/PbMIF-CNE ou avec le vaccin RNA/GFP-CNE ont été infectées par injection intrapéritonéale de 106 globules rouges RBC infectés au PbA au jour 0 et traitées avec chloroquine les jours 7 à 10. Quatre semaines avant que les souris infectées ne soient réinfectés et au jour 7 de post-infection, les splénocytes ont été isolés et les cellules T CD4 ont été incubées avec chloroquine 10 mM pendant 2 h à 37 °C et CFSE étiqueté. 5 x 106 cellules T CD4 (CD45.2+) étaient ensuite transférés i.v. dans les souris naïves CD45.1 BALB/c. Toutes les souris CD45.1 étaient infectées par PbA (1 x 106 iRBCs) au jour 3 post-transfert (Fig. 11 a) . Le cours de l'infection chez les souris transférées avec les cellules T CD4 de donneurs RNA/GFP-CNE ou RNA/PMIF-CNE a été suivi par la détermination de parasitémie de FACS. Au jour 7 après infection, les souris ont été euthanasiées et les cellules de donneurs CD4 + CD45. 2 + récupérées, quantifiées, et leur prolifération évaluée par dilution CFSE. L'infection a été établie chez des souris receveuses ayant reçu des cellules T CD4 dans le groupe GFP (témoin) , comme en témoignent l'augmentation parasitémie, mais pas chez les souris qui ont reçu des cellules T CD4 de la PbMIF de donneurs immunisés (Fig. 11B).

La parasitémie a été significativement réduite chez les souris transférées avec les lymphocytes T CD4 provenant de donneurs ARN/PMIF-CNE-vaccinés par rapport aux souris témoins transférées avec les cellules T CD4 provenant de donneurs GFP-CNE-immunisés. Ainsi, le transfert adoptif de cellules T CD4 de souris vaccinées PMIF a également conféré une protection contre le re-défi de parasite. En fait, les cellules T CD4 PbMIF de souris immunisées confèrent une protection complète contre 1' infection de P. berghei au stade sanguin.

La protection conférée par le transfert adoptif de cellules T CD4 de donneurs immunisés PbMIF a été associée à un nombre plus élevé de la prolifération des cellules T CD4 (CFSE10) (Fig. 11C), des niveaux plus élevés de la production d'IFN-γ (Fig. 11D), et a réduit l'expression du marqueur d'épuisement PD-1 (Fig. 11E) par rapport à des cellules T CD4 par transfert adoptif dans le groupe témoin.

Ces données indiquent que la réponse augmentée des cellules T CD4 qui se développe après une immunisation chez des souris infectées PbMIF offre une protection complète contre l'infection et est suffisante pour empêcher l'établissement d'une infection au stade sanguin.

On comprendra que l'invention ait été décrite à titre d'exemple seulement et modifications peuvent être apportées tout en restant dans la portée et l'esprit de l'invention.

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[50] Carroll et al., (2010) PLoS ONE 5, el3124. L'invention comprend au moins les modes de réalisation numérotés suivants : 1. Une méthode pour fournir une immunité protectrice contre une infection parasitaire chez un sujet dans le besoin, comprenant l'administration d'une quantité immunologique efficace d'une composition au sujet, dans laquelle la composition comprend : (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène de facteur d'inhibition (MIF) de la migration des macrophages ; (ii) un antigène MIF parasite ; ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite. 2. Une méthode selon le mode de réalisation 1 dans laquelle la composition comprend un vaccin à base d'ARN. 3. Une méthode selon le mode de réalisation 1 ou 2 dans laquelle l'immunité protectrice se caractérise par une mémoire immunitaire protectrice contre le parasite et/ou une population de cellules T mémoires sensibles au parasite. 4. Une méthode selon un des modes de réalisation précédents dans laquelle l'antigène MIF parasite comprend un polypeptide MIF de longueur pleine ou un fragment de celui-ci immunogène. 5. La méthode selon un quelconque des modes de réalisation 1 et 3, dans laquelle la composition comprend un vaccin à base d'acides nucléiques comportant de l'acide nucléique qui encode un antigène MIF parasite. 6. La méthode selon le mode de réalisation 5 dans laquelle le vaccin à base d'acide nucléique est un vaccin à base d'ARN. 7. La méthode selon le mode de réalisation 6 dans laquelle le vaccin à base d'acide nucléique comprend une molécule d'ARN autoreproducteur. 8. La méthode selon le mode de réalisation 7 dans laquelle l'ARN autoreproducteur est un réplicon d'ARN dérivé d'alphavirus . 9. La méthode selon un des modes de réalisation précédents dans laquelle la composition comprend un système de livraison de nano-émulsion cationique (CNE). 10. La méthode selon un des modes de réalisation 1 à 8, dans laquelle la composition comprend un système de livraison de nanoparticules (TNL) de lipides. 11. La méthode selon un des modes de réalisation précédents, où la composition comprend un ou plusieurs adjuvants. 12. La méthode selon le mode de réalisation 1, 3 ou 4 dans laquelle l'anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite comprend un anticorps polyclonal. 13. La méthode selon le mode de réalisation 1, 3 ou 4 dans laquelle l'anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite est un anticorps humanisé ou chimérique. 14. La méthode selon un quelconque des modes de réalisation précédents dans laquelle le parasite est un parasite protozoaire. 15. La méthode selon le mode de réalisation 14 dans laquelle le protozoaire est un parasite apicomplexe. 16. La méthode selon le mode de réalisation 15 dans laquelle le protozoaire appartient au genre Plasmodium. 17. La méthode selon le mode de réalisation 14 dans laquelle le protozoaire appartient à un genre choisi dans le groupe, composé de : Plasmodium, Toxoplasma, Babesia,

Eimeria, Theileria, Neospora, Sarcocystis, Leishmania, et Trypanosoma. 18. La méthode selon un des modes de réalisation 1 à 13 dans laquelle le parasite est un helminthe parasite. 19. La méthode selon le mode de réalisation 18 dans laquelle l'helminthe parasite est un nématode. 20. La méthode selon le mode de réalisation 18 ou 19 dans laquelle l'helminthe parasite appartient à un genre choisi dans le groupe, composé de : Ancyclostoma, Necator, Brugia,

Wuchereria, Loa, Mansonella, Trichinella, Trichuris, Ascaris, Anisakis, Dracunculus, Strongyloid.es, Haemonchus, Schistosoma et Fasciola. 21. la méthode selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents dans laquelle deux ou plusieurs doses de la composition sont administrées au sujet. 22. Le procédé selon le mode de réalisation 21 dans lequel les deux doses sont administrées à au moins 1 semaine d'intervalle, environ 2 semaines, environ 3 semaines, environ 4 semaines, environ 6 semaines, environ 8 semaines, environ 10 semaines, environ 12 semaines ou environ 16 semaines d'intervalle. 23. Le procédé selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents dans lequel le sujet est un vertébré. 24. Le procédé selon le mode de réalisation 23 dans lequel le sujet est un mammifère. 25. Le procédé selon le mode de réalisation 24 dans lequel le sujet est un être humain. 26. Le procédé selon le mode de réalisation 24 dans lequel le sujet est un mammifère vétérinaire. 27. Le procédé selon le mode de réalisation 26 dans lequel le mammifère vétérinaire est un chat, chien, cheval, vache, mouton, cerf, chèvre ou porc. 28. Le procédé selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents dans lequel la composition comprend en outre une séquence d'acide nucléique qui encode un antigène parasite supplémentaire. 29. Le procédé selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents dans lequel la composition comprend en outre un antigène parasite supplémentaire. 30. Le procédé selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents dans lequel la composition est administrée au sujet en combinaison avec une autre composition qui comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène parasite supplémentaires. 31. Le procédé selon l'un quelconque des modes de réalisation précédents dans lequel la composition est administrée au sujet en combinaison avec une autre composition qui comprend un antigène de parasite supplémentaire. 32. Une composition pour une utilisation dans un procédé pour fournir une immunité protectrice contre une infection parasitaire chez un sujet en ayant besoin, qui comprend une quantité immunologique efficace d': (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ; (ii) un antigène MIF parasite ; ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite. 33. La composition selon le mode de réalisation 32 pour une utilisation dans une méthode selon l'un des modes de réalisation 1 à 31. 34. Une composition comprenant une quantité immunologique efficace d' : (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ; ou (ii) un antigène MIF parasite ; dans laquelle l'antigène MIF provient d'un parasite protozoaire. 35. La composition selon le mode de réalisation 34, dans laquelle le protozoaire est un parasite apicomplexe, tel que Plasmodium. 36. La composition selon le mode de réalisation 34 ou 35, dans laquelle le protozoaire appartient à un genre choisi dans le groupe, composé de : Plasmodium, Toxoplasma, Babesia,

Eimeria, Theileria, Neospora, Sarcocystis, Leishmania et Trypanosoma. 37. Une composition comprenant une quantité immunologique efficace d' : (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ; ou (ii) un antigène MIF parasite ; dans laquelle l'antigène MIF est un helminthe parasite qui appartient à un genre choisi dans le groupe composé de : Ancyclostoma, Necator, Brugia, Wuchereria, Loa, Mansonella, Trichinella, Trichuris, Ascaris, Anisakis, Dracunculus, Strongyloides, Haemonchus, Schistosoma et Fasciola. 38. La composition selon l'un quelconque des modes de réalisation 34 à 37, où l'antigène MIF parasite comprend un polypeptide MIF de longueur pleine ou un fragment immunogène de celui-ci. 39. La composition selon l'un des modes de réalisation 34 à 38 qui comprend un vaccin à base d'acide nucléique comprenant la séquence d'acides nucléiques qui encode un antigène MIF parasite. 40. La composition selon le mode de réalisation 39 dans laquelle le vaccin à base d'acide nucléique est un vaccin à base d'ARN. 41. La composition selon le mode de réalisation 40 dans laquelle le vaccin à base d'acide nucléique comprend une molécule d'ARN autoreproducteur. 42. La composition selon le mode de réalisation 41 dans laquelle l'ARN autoreproducteur est un réplicon d'ARN dérivé d'alphavirus . 43. La composition selon un des modes de réalisation de 34 à 42, qui comprend un système de livraison de nanoémulsion cationique (CNE). 44. La composition selon un des modes de réalisation 34 à 42, qui comprend un système de livraison de nanoparticules (LNP) de lipides. 45. La composition selon un des modes de réalisation de 34 à 44, qui comprend un ou plusieurs adjuvants. 46. La composition selon l'un quelconque des modes de réalisation 34 à 45, dans laquelle la composition comprend en plus une séquence d'acides nucléiques qui encode un antigène parasite supplémentaire. 47. La composition selon l'un quelconque des modes de réalisation 34 à 46 dans laquelle la composition comprend en plus un antigène parasite supplémentaire. 48. Une méthode d'amélioration une réponse immunitaire à un antigène non-MIF de parasite chez un sujet, comprenant l'administration d'une quantité immunologique efficace d'une composition au sujet, dans laquelle la composition comprend : (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ; (ii) un antigène MIF parasite ; ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite. 49. La méthode selon le mode de réalisation 48 qui comprend l'administration de l'antigène de parasite non-MIF au sujet. 50. La méthode selon le mode de réalisation 48 qui est une méthode selon l'un des modes de réalisation 1-31. 51. Une méthode pour fournir une immunité protectrice contre une infection parasitaire chez un sujet en ayant besoin, composée de l'administration des cellules T CD4 sensibles au parasite isolées d'un hôte compatible, dans laquelle l'hôte a été vacciné avec une composition comprenant (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ; ou (ii) un antigène MIF parasite. 52. La méthode selon le mode de réalisation 51 dans laquelle on a administré à l'hôte compatible une composition selon une méthode de l'un des modes de réalisation 1-31.

Claims (18)

1. REVENDICATIONS

   1. Une composition pour une utilisation dans une méthode pour fournir une immunité protectrice contre une infection parasitaire chez un sujet en ayant besoin, qui comprend une quantité immunologique efficace d'une ou plusieurs d': (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène de facteur d'inhibition de la migration des macrophages (MIF) ; (ii) un antigène MIF parasite ; ou (iii) un anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite.
2. 2. La composition pour une utilisation selon la revendication 1 (i) dans laquelle la composition comprend un vaccin à base d'ARN.
3. 3. La composition pour une utilisation selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle l'immunité protectrice se caractérise par une mémoire immunitaire protectrice contre le parasite et/ou une population efficace de cellules T mémoires sensibles au parasite.
4. 4. La composition pour une utilisation selon la revendication 1, 2 ou 3 dans laquelle la composition comprend un vaccin à base d'acide nucléique comprenant la séquence d'acides nucléiques qui encode un antigène MIF parasite ; par exemple, où le vaccin à base d'acide nucléique est un vaccin à base d'ARN, qui peut comprendre une molécule d'ARN autoreproducteur, tel qu'un réplicon d'ARN dérivé d'alphavirus.
5. 5. La composition pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle la composition comprend un système de livraison de nano-émulsion cationique (CNE) ou un système de livraison de nanoparticules (LNP) de lipides.
6. 6. La composition pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la composition comprend un ou plusieurs adjuvants.
7. 7. La composition pour une utilisation selon la revendication 1, dans laquelle l'anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite comprend un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal.
8. 8. La composition pour une utilisation selon la revendication 1, dans laquelle l'anticorps qui se lie spécifiquement à un antigène MIF parasite est un anticorps monoclonal humain, humanisé ou chimérique.
9. 9. La composition pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le parasite est un parasite protozoaire, par exemple où (i) le protozoaire est un parasite apicomplexane ; et/ou (ii) le protozoaire appartient à un genre choisi dans le groupe, composé de : Plasmodium, Toxoplasma, Babesia, Eimeria, Theileria, Neospora, Sarcocystis, Leishmania, et Trypanosoma.
10. 10. La composition pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans laquelle le parasite est un helminthe parasite, comme un nématode.
11. 11. La composition pour utilisation selon la revendication 10, dans laquelle l'helminthe parasite appartient à un genre choisi dans le groupe, composé de : Ancyclostoma, Necator, Brugia, Wuchereria, Loa, Mansonella, Trichinella, Trichuris, Ascaris, Anisakis, Dracunculus, Strongyloides, Haemonchus, Schistosoma et Fasciola.
12. 12. La composition pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le sujet est un vertébré, tel qu'un mammifère, par exemple un humain ou un mammifère vétérinaire.
13. 13. La composition pour une utilisation selon l'une quelconque des revendication précédentes, dans laquelles : (a) la composition comprend en outre une séquence d'acide nucléique qui encode un antigène parasite supplémentaires, et/ou (b) la composition comprend en outre un antigène parasite supplémentaire, et/ou (c) la composition est administrée au sujet en combinaison avec une autre composition qui comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène parasite supplémentaire ; et/ou (d) la composition est administrée au sujet en combinaison avec une autre composition qui comprend un antigène parasite supplémentaire.
14. 14. Une composition comprenant une quantité immunologique efficace d' : (i) un acide nucléique comprenant une séquence qui encode un antigène MIF parasite ; ou (ii) un antigène MIF parasite ; dans laquelle l'antigène de la MIF vient de : (a) un parasite protozoaire; ou (b) un helminthe parasite qui appartient à un genre choisi dans le groupe, composé de : Ancyclostoma, Necator, Brugia, Wuchereria, Loa, Mansonella, Trichinella, Trichuris, Ascaris, Anisakis, Dracunculus, Strongyloides, Haemonchus, Schistosoma et Fasciola.
15. 15. La composition selon la revendication 14 dans laquelle le protozoaire parasite est un parasite apicomplexe et/ou appartient à un genre choisi dans le groupe, composé de : Plasmodium, Toxoplasma, Babesia, Eimeria, Theileria, Neospora, Sarcocystis, Leishmania et Trypanosoma.
16. 16. La composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 15, dans laquelle l'antigène MIF parasite est un polypeptide MIF de pleine longueur ou un fragment immunogène de celui-ci.
17. 17. La composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, qui comprend un vaccin à base d'acide nucléique comprenant la séquence d'acide nucléique qui encode pour un antigène MIF parasite ; par exemple, dans laquelle le vaccin à base d'acide nucléique est un vaccin à base d'ARN, par exemple une molécule d'ARN autoreproducteur, qui peut être un réplicon d'ARN dérivé d'alphavirus.
18. 18. La composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, qui comprend un système de livraison de nano-émulsion cationique (CNE) ou un système de livraison de nanoparticules (LNP) de lipides.