Virtuelle Reaktionsgefässe
Beschreibung
Verfahren zum kostengünstigen Herstellen von modifizierten Oberflächeneigenschaften sowie die durch das Verfahren hergestellten Oberflächen und ihrer Anwendung in technischen und wissenschaftlichen Verfahren und Analysen.
Heutzutage werden vermehrt Verfahren, wissenschaftliche Analysen und Experimente in automatisierten oder miniaturisierten Anwendungen realisiert. Dabei sind neben der Einsparung kostspieliger Reagenzien durch Anwendung kleiner Volumina auch die erhöhte Reproduzierbarkeit innerhalb automatisierter Verfahren und Methoden eines der Ziele.
Dabei kann es sich bei den Verfahren um physikalische, biologische, chemische, biochemische, diagnostische oder qualitätsanalytische Verfahren und/oder Analysemethoden handeln. Dabei ist es unwesentlich, ob nur ein Verfahren (z.
B. ein Herstellung-, Aufreinigungssverfahren, etc.) realisiert oder statische oder dynamische Eigenschaften und/oder Phänomene beobachtet werden. So können z.B. die dynamischen Messungen eine Enzymreaktionen und/oder Bindereaktionen betreffen, die über einen bestimmten Zeitraum hinweg gemessen/beobachtet werden können. In einer speziellen Anwendungsform kann die Suche nach geeigneten Kristallisationsbedingungen von chemischen Produkten oder Biomolekülen von Interesse sein, wie sie z.B. in der Anmeldung WO/04/012841 beschrieben werden. Auch komplexe Systeme, wie z.B. einzelne Zellen oder Zellverbünde können analysiert und/oder beobachtet werden.
Sehr oft kommen in diesen Zusammenhängen Probengefässe zum Einsatz, wobei eine grössere Anzahl an Probengefässen, öfters auch "Wells" genannt, zu einem Gebinde zusammengefasst werden.
Dabei werden die Probengefässe oft in Form einer Matrix angeordnet, wie dies z.B. in so genannten Mikroplatten der Fall ist, die zum Beispiel mit Anordnungen von 8*12, 16*24 oder 32*48 Wells oder Kavitäten realisiert werden können. Auch ist dem Fachmann bekannt, dass Mikroplatten nach international festgelegten Standards wie dem SBS-Standard realisiert werden können (Society of Biomolecular Science; www.sbsonline.org). Verfahren und Analysemethoden müssen aber nicht notgedrungener Weise innerhalb einer Mikroplatte realisiert werden. So gibt es auch Verfahren, wie z.B. die MALDI Massenspektrometrie, wobei der Analyt mit einer geeigneten Matrix versetzt wird und dieses Gemisch auf ein so genanntes Target deponiert wird. Auch hier werden oft die oben genannten Matrixanordnungen gewählt, ohne das hier notgedrungener Weise Probenkavitäten zum Einsatz kommen.
Wichtig ist, dass der Analyt anhand seiner Position auf dem Probenträger eindeutig identifiziert werden kann und sich dieser nicht mit anderen Analyten vermischt und so genannte Kontaminationen ausgeschlossen werden.
Dem Fachmann ist des weiteren bekannt, dass bei der Anwendung von Mikroplatten mit Probengefässen des Öfteren Probleme durch den Einschluss von Glasbläschen (z.B. während des Befüllens) entstehen, wodurch Analyseverfahren nicht ordnungsgemäss durchgeführt werden können, da z.B. der Boden der Probengefässes nicht ausreichend oder gänzlich abgedeckt/benetzt wird. Auch kann es durch eine Überfüllung der Probenkavitäten zu einer Kontamination von weiteren Probengefässen kommen, da eine Gasblase das Volumen des Probengefässes um ihr Volumen mindert. So kann es durchaus von Vorteil sein, z.B.
Lösungen nicht durch Probengefässe an einem Ort zu binden, sondern dies durch andere Herangehensweisen zu realisieren. Dies kann z.B. durch virtuelle Wells realisiert werden. So beschreibt z.B. die Anmeldung DE_10120959 eine aus mehreren Schichten aufgebaute Probenträgerplatte. Hinsichtlich einer sicheren Abgrenzung der flüssigen Proben wurde eine Auftrennung der Probenplatte in benetzbare und weniger benetzbare Bereiche beschrieben.
Ein wesentlicher Nachteil besteht jedoch darin, dass durch den beschriebenen schichtweisen Aufbau der Probenträge[phi]latte dessen Herstellung aufwendig ist und Substanzen im System eingebracht werden, die bei spektroskopischen Verfahren oft nicht erwünscht sind, da sie mit letzteren interferieren können.
Für viele Verfahren ist es des weiteren wünschenswert, die Oberflächeneigenschaften der Probengefässe derart einzustellen, das technische und wissenschaftliche Verfahren leichter anwendbar, kostengünstiger, reproduzierbarer oder erst realisierbar werden. So beschreibt zum Beispiel das Patent DE_19754978 die Realisierung hydrophiler Anker für eine vereinfachte Vorbereitung von Probenträger im Bereich der Proteinanalytik mittels MALDI-Massenspektrometrie.
Durch die Anwendung von hydrophilen Anke[phi]unkten konnte ein so genanntes Probentarget bereitgestellt werden, welches neben einer vordefinierten Ortsauflösung der Probe auch eine höhere Sensitivität für die Messmethode erhalten wird, die es dem Anwender z.B. ermöglicht, ein bereits bestehendes Verfahren mit einer geringeren Menge des Analyten anzuwenden. Dies geschieht unter anderem dadurch, dass ein Tropfen der Analyt/Matrix-Mischung beim Austrocknen nicht auf den hydrophoben Regionen adheriert und somit mit sinkendem Volumen sich auf einen Anke[phi]unkt hin konzentriert. Beispielsweise wurde als mögliche Hydrophobisierung die Verwendung von Silikonen und Alkylchlorsilanen genannt und die Ausbildung hydrophiler Regionen durch eine Zerstörung der hydrophoben Schicht durch Aufdrucken von chemisch verändernden oder enzymatisch abbauenden Substanzlösungen genannt.
Eine genaue Vorgehensweise wurde nicht beschrieben, noch wurden hydrophile Anker einer genauen Geometrie/Grösse beschrieben sondern Anker als genügend kleine Punkte genannt. Insbesondere wurde gezeigt, dass durch vordefinierte Strukturen in Form einer ortsgenauen Matrix (präzises Raster) im Falle einer Probenplatte in einfacher Weise Analysen mit den jeweiligen Geräten durchgeführt werden können, ohne aufwendige Positionierungen zwischen den Messungen vorzunehmen. Auch die Applikation von hydrophilen Flüssigkeiten auf hydrophile Anke[phi]unkte erleichtert die Applikation von geringeren Flüssigkeitsmengen sowie die Reproduzierbarkeit der Flüssigkeitsabgabe, z.B. durch automatisierte und insbesondere kontaktbasierte liquid-handling Systeme.
Auch kann die Beobachtung und Analyse von Verfahren erheblich erleichtert werden.
So können z.B. bei der Anwendung hydrophiler Anke[phi]unkte wässrige Lösungen auf örtlich definierten Regionen begrenzt werden. Somit kann durch die geeignete Wahl der Natur, Geometrie und Ausdehnung der Oberflächenstrukturierung ein Messprozess effizienter gestaltet werden oder gar erst ermöglicht werden.
Insbesondere kann so z.B. im Rahmen von Kristallisationsexperimenten der Tropfen der Proteinlösung sehr ortsdefiniert sein und eine reproduzierbare, z.B. kreisförmige Form annehmen, was sich auf die Anwendung von Bildanalyseverfahren und weiteren Verfahren vorteilhaft auswirkt. So kann z.B. der Radius eines runden hydrophilen Anke[phi]unktes derart gewählt werden, dass ein Tropfen eines gegebenen Volumens eine Halbkugel ausbildet (s. Bild 3 B/C).
Selbst bei Anwendung des in der Anmeldung WO/04/012841 beschriebenen Kristallisationsverfahrens (welches hiermit in seiner Gesamtheit in der Beschreibung der vorliegenden Anmeldung integriert wird) bleibt das sich durch Diffusionsprozesse des Wassers verändernde Volumen der Probe auf einen kontrollierten Bereich auf dem Probenträger erhalten. Dabei kann sich je nach Wahl der Reservoirlösung das Probenvolumen durch die Diffusion verringern oder vergrössern. Es wird dem Fachmann ersichtlich, dass eine voreingestellte Probenlokalisierung und Probengeometrie z.B. für die Anwendung analytischer Messverfahren ein Vorteil gegenüber nicht ortsdefinierten Probenvolumen besteht. So kann z.B. bei der Anwendung von LaserStreulichtmessungen mittels einer Dunkelfeldoptik (s.
Bild 2) sichergestellt werden, dass durch eine definierte Adhäsion zum Glasboden eines Probenträgers die Interferenz zwischen zusätzlichen Grenzflächen (Bild 3 A) vermieden werden kann, was die Anwendung von Streulichtmessungen wesentlich vereinfacht (s. Bild 3). So wird z.B. die Reproduzierbarkeit von Messungen oder eine korrekte Messung einer Konzentrationsreihe zur Bestimmung des zweiten Virialkoeffizienten ermöglicht, da die Streulichtintensität bei unterschiedlich starken Einflüssen zusätzlicher Grenzflächen eine Bestimmung nicht erlauben würde. Insbesondere könnte die Überlagerung der Foki des Anregungsstrahles sowie der des Detektionsstrahles nicht in einheitlicher Weise von einer Probenposition zur Anderen gewährleistet werden, was zu starken konzentrationsunabhängigen Schwankungen des gemessenen Streulichtes führt.
Auch würde eine Interaktion des Anregungsstrahles mit unterschiedlichen Ölen, je nach Verfahrens stand (s. Bild 1) wegen der leicht unterschiedlichen Brechungsindices der verschiedenen Öle nicht einheitlich ermöglicht. Bei Bereitstellung einer Messgeometrie, die eine Beeinflussung des Messprozesses ausschliessen würde, könnte z.B. in ersten Optimierungszyklen die Messung des zweiten Virialkoeffizienten zur Identifikation des Kristallisationsfensters herangezogen werden, wobei die Lösungsparameter sukzessive angepasst werden. Anschliessend könnte nach der Identifikation des Kristallisationsfensters die initialen Lösungsparameter optimal eingestellt werden und der Diffusionsprozess initiiert werden, mit dem Ziel durch eine Repositionierung im Phasendiagramm möglichst grosse Kristalle zu züchten.
Da die Proteinlösung je nach Verfahrensstand in Kontakt mit verschiedenen Phasen ist, wäre es wünschenswert, jegliche Interaktion der Messmethode mit den Phasen I und II (s. Bild 1) zu vermeiden. Dies wird z.B. im Falle der Laserstreulichtmessungen durch eine Kombination zwischen einer konfokalen Dunkelfeldoptik für den Anregungsstrahl und einer konfokalen Detektionsoptik in Kombination mit genau definierten Proben (virtuellen Wells) realisiert (s. Bild 3, B und C). Die Anwendung eines einheitlichen und vordefmierbaren hydrophilen Anke[phi]unktes/Ankerfeldes ist somit für dieses Verfahren wünschenswert. Wie bereits oben erwähnt, sind bereits mehrere Verfahren zur Generierung von hydrophil/hydrophob strukturierten Oberflächen beschrieben worden. Bisher wurde aber kein einfaches und kostengünstiges Verfahren beschrieben.
Die Erstellung einer extrem hydrophoben Glasplatte und die anschliessende Generierung von hydrophylen Regionen mittels einer photokatalytisch aktivierten Oxidation ist beschreiben worden {Conversion of a solid surface from super-hydrophobic to super hydrophylic by photocatalytic remote oxidation and photocatalytic lithography; Wakana Kubo and Tetsu Tatsuma; Applied Surface Science; 243:125-128 (2005)}. Dieses Verfahren ist jedoch nur recht aufwendig zu realisieren und ist durch die Verwendung von Photomasken nur bedingt preisgünstig. Auch ist das Verfahren nicht schnell und daher für die Massenproduktion modifizierter Oberflächen weniger geeignet.
Die Anmeldung US_2004/0018615_A1 beschreibt virtuelle Probengefässe (Wells) sowie Methoden für den Transfer von Flüssigkeiten, die durch die Abgrenzung von hydrophilen Regionen durch hydrophobe Regionen realisiert wird.
Als hydrophobe Region wurden 120 Mikrometer dicke Beschichtung aus Teflon beschrieben.
Die Anmeldung EP_1364702_A2 beschreibt ein photolytographisches Verfahren, wobei die hydrophobe Region in nicht geschützte Regionen z.B. durch ein Sauerstoffplasma abgetragen wird. Dieses Verfahren ist ebenfalls aufwendig und nicht kostengünstig zu realisieren.
Die Bereitstellung hydrophiler Ankerregionen wird durch das hier beschriebene Verfahren überraschenderweise und sehr kostengünstig realisiert.
Im Wesentlichen wird das Verfahren in wenigen Stufen realisiert:
1) Reinigung und/oder Aktivierung der zu behandelnden hydrophilen/hydrophoben Oberfläche (z.B. ein hydrophiles Glassubstrat).
2) Aufbringen einer dünnen hydrophoben/hydrophilen Schicht.
3) Entfernen der hydrophoben/hydrophilen Schicht durch eine chemische Reaktion durch eine aufgetragene Substanz.
4) Reinigen der behandelten Oberfläche.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zu behandelnde Oberfläche aus Glas, wird eine hydrophobe Schicht durch eine Silanisierung hergestellt und die hydrophobe Schicht durch eine basische Katalyse entfernt. In einer bervorzugten Ausführungsform werden Verfahren zum Aufbringen und/oder Entfernen der hydrophoben Schicht derart gewählt, dass ein Minimum an Chemikalien benötigt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird auf die Verwendung von organischen Lösungsmitteln für Reinigungsschritte gänzlich verzichtet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die chemische Substanz der Dritten Stufe durch ein einfaches Verfahren ortsaufgelöst aufgetragen, wie z.B. durch Schablonendruck, Siebdruck, Stempelverfahren, automatisierte Pipettierautomaten und Drucker (kontaktbasiert oder kontaktfrei), Aufsprühen durch eine Maske, händig, etc.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist die chemische Substanz der 3. Stufe wasserlöslich und/oder einer wasserlöslichen Substanz zugegeben, die von einstellbarer Viskosität ist, wie z.B. Polyethylenglykol oder andere wasserlösliche biologische Polymere mit einstellbaren Kettenlängen/Viskositäten oder einer Mischung letzterer.
In einer weiteren Ausführungsform besteht der vierte Schritt aus einer Reinigung mit Wasser, welches zur besseren Reinigunswirkung temperiert werden kann.
In einem bevorzugten Verfahren wird die hydrophobe Schicht auf beiden Seiten des Substrates entfernt. Dabei kann die hydrophobe Schicht auf der probenabgewandten Seite des Substrates auf einer identischen, grösseren oder auf der gesamten Fläche des Substrates entfernt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann die probenabgewandten Seite durch die in Punkt 2 realiserten hydrophoben/hydrophilen Schicht gänzlich verschont werden. Wenn das Substrat transparent ist, so sind die darauf vorhandenen hydrophilen Regionen nur schwer oder gar nicht zu identifizieren.
Bei der automatisierten Probenapplikation kann die genau definierte Position für die Applikation genutzt werden, wobei leichte Positionierfehler automatisch korrigiert werden, sobald eine Kontakt mit der hydrophilen Region erreicht wird (siehe DE_19754978). Beim händigen Auftragen kann in einer bevorzugten Ausführungsform eine Unterlage genutzt werden, auf der die hydrophilen Regionen markiert sind. Diese wird z.B. unter den Probenträger gelegt und zeigt somit dem Anwender den Ort der hydrophilen Regionen an. Beispiel 1 :
Ein Glassubstrat (Deckglas mit einer Dicke von 0,17 mm) wird 30-240 Minuten bei 350[deg.] gereinigt und aktiviert.
Das Glas wird langsam abgekühlt und in einen Behälter mit einigen Miko- bis Millilitern Sigmacoat (chloriniertes Organopolysiloxan in Heptan; SigmaChemical Co.) und nach Etablierung eines leichten Vakuums 30 bis 240 Minuten inkubiert und dadurch Silanisiert. Die Silanisierung kann für 30 Minuten auf 100[deg.]C erwärmt werden, wodurch eine stabilere Silanisierung erhalten wird und überschüssiges Sigmacoat entfernt wird. Auf dem silaniserten Glas wird anschliessend mittels Schablonendruck oder manuell ein mit 200mM KOH (Endkonzentration) versetztes Polyethylenglykolgemisch aus hoch- und niedermolekularem Molekulargewicht ortsgenau appliziert.
Nach einer Inkubation von einigen Minuten wird das behandelte Glas mit reichlich temperiertem Wasser gereinigt und in einen Trockenschrank getrocknet.
Bild 1 : Kristallisationsverfahren nach WO/04/012841
Bild 2: Geometrie einer Streulichtmessung mittes konfokaler Dnkelfeldoptik und konfokaler Detektionsoptik
Bild 3: verschiedene Messgeometrien je nach Geometrie des Probenvolumens, A: hydrophober Probenträger und Interaktion des Anregungsstrahls mit dem Probenvolumen umgebenden Medium. B: Probenvolumen mit definiertem
Anke[phi]unk, wobei der Fokus des Anregungsstrahles Mittig im Probenvolumen positioniert ist. C: gleich wie B, wobei jedoch der Fokus näher am Gefässboden des Probenvolumens ist.
Bild 4: Geometrie von zwei Proben mit verschiedenen Volumina innerhalb von Paraffmöl auf zwei durch das beschriebene Verfahren generierte hydrophile Anke[phi]unkte gleicher Ausdehnung.
Virtual reaction vessels
description
Process for the cost-effective production of modified surface properties and the surfaces produced by the process and their use in technical and scientific processes and analyzes.
Nowadays, processes, scientific analyzes and experiments in automated or miniaturized applications are increasingly being realized. Besides saving expensive reagents by using small volumes, the increased reproducibility within automated procedures and methods is one of the goals.
The methods may be physical, biological, chemical, biochemical, diagnostic or quality-analytical methods and / or analysis methods. It is immaterial whether only one method (z.
As a production, Aufreinigungssverfahren, etc.) realized or static or dynamic properties and / or phenomena are observed. Thus, e.g. the dynamic measurements relate to enzyme reactions and / or binding reactions that can be measured / observed over a period of time. In a particular application, the search for suitable crystallization conditions of chemical products or biomolecules may be of interest, e.g. in application WO / 04/012841. Even complex systems, such as individual cells or cell networks can be analyzed and / or monitored.
Very often, sample vessels are used in these contexts, with a larger number of sample vessels, often also called "wells", being combined into one container.
The sample vessels are often arranged in the form of a matrix, e.g. in so-called microplates is the case, for example, can be realized with arrangements of 8 * 12, 16 * 24 or 32 * 48 wells or wells. It is also known to the person skilled in the art that microplates can be realized according to internationally defined standards such as the SBS standard (Society of Biomolecular Science, www.sbsonline.org). However, methods and methods of analysis need not necessarily be realized within a microplate. So there are also methods such as the MALDI mass spectrometry, wherein the analyte is mixed with a suitable matrix and this mixture is deposited on a so-called target. Again, the above-mentioned matrix arrangements are often chosen without the sample cavities forced here being used.
It is important that the analyte can be clearly identified by its position on the sample carrier and that it is not mixed with other analytes and so-called contaminations are excluded.
It is further known to those skilled in the art that problems arise from the inclusion of glass bubbles (e.g., during filling) in the use of microplates with sample vessels, whereby analysis procedures can not be properly performed, e.g. the bottom of the sample vessel is not sufficiently covered or wetted. Also, overfilling of the sample cavities can lead to contamination of further sample vessels, since a gas bubble reduces the volume of the sample vessel by its volume. So it can be quite beneficial, e.g.
Do not bind solutions by sample vessels in one place, but to realize this by other approaches. This can e.g. be realized by virtual wells. Thus, e.g. the application DE_10120959 a sample carrier plate constructed from several layers. With regard to a reliable delimitation of the liquid samples, a separation of the sample plate into wettable and less wettable areas was described.
A significant disadvantage, however, is that the described layered structure of the sample support latte its production is complex and substances are introduced into the system, which are often not desirable in spectroscopic methods, since they can interfere with the latter.
For many methods, it is further desirable to adjust the surface properties of the sample vessels so that the technical and scientific methods are easier to use, cheaper, more reproducible or only feasible. For example, the patent DE_19754978 describes the realization of hydrophilic anchors for a simplified preparation of sample carriers in the field of protein analysis by means of MALDI mass spectrometry.
Through the use of hydrophilic anchoring sites, it was possible to provide a so-called sample target, which, in addition to a predefined local resolution of the sample, is also given a higher sensitivity for the measuring method, which allows the user e.g. allows to apply an already existing procedure with a lower amount of the analyte. This is due, inter alia, to the fact that a drop of the analyte / matrix mixture does not adhere to the hydrophobic regions during drying and thus concentrates with a sinking volume onto an anchoring point. For example, the possible hydrophobization has been mentioned as the use of silicones and alkylchlorosilanes and the formation of hydrophilic regions by destruction of the hydrophobic layer by printing on chemically changing or enzymatically degrading substance solutions.
An exact procedure was not described, nor were hydrophilic anchors of an exact geometry / size described but anchors called sufficiently small points. In particular, it has been shown that by means of predefined structures in the form of a location-accurate matrix (precise grid) in the case of a sample plate, analyzes can be carried out with the respective devices in a simple manner, without making expensive positioning between the measurements. Also, the application of hydrophilic liquids to hydrophilic anchoring sites facilitates the application of smaller quantities of liquid as well as the reproducibility of liquid delivery, e.g. through automated and in particular contact-based liquid-handling systems.
Also, the observation and analysis of procedures can be greatly facilitated.
Thus, e.g. in the application of hydrophilic anchoring, aqueous solutions may be limited to locally defined regions. Thus, by the appropriate choice of the nature, geometry and extent of surface structuring, a measurement process can be made more efficient or even made possible.
In particular, e.g. in the context of crystallization experiments, the droplets of protein solution be very localized and a reproducible, e.g. take a circular shape, which has an advantageous effect on the application of image analysis methods and other methods. Thus, e.g. The radius of a round hydrophilic Anke [phi] are chosen such that a drop of a given volume forms a hemisphere (see Figure 3 B / C).
Even with the use of the crystallization process described in the application WO / 04/012841 (which is hereby incorporated in its entirety in the description of the present application), the volume of the sample which changes by diffusion processes of the water to a controlled area on the sample carrier is retained. Depending on the choice of reservoir solution, the sample volume may decrease or increase due to the diffusion. It will be apparent to those skilled in the art that a preset sample location and sample geometry are e.g. there is an advantage over non-defined sample volumes for the application of analytical measuring methods. Thus, e.g. in the application of laser scattered light measurements by means of a dark field optics (s.
Figure 2) ensures that a defined adhesion to the glass bottom of a sample carrier avoids the interference between additional interfaces (Figure 3 A), which considerably simplifies the application of scattered light measurements (see Figure 3). For example, the reproducibility of measurements or a correct measurement of a concentration series for the determination of the second virial coefficient allows, since the scattered light intensity would not allow a determination with different strong influences of additional interfaces. In particular, the superposition of the Foki of the excitation beam and the detection beam could not be guaranteed in a uniform manner from one sample position to another, resulting in strong concentration-independent fluctuations of the measured scattered light.
Also, an interaction of the excitation beam with different oils, depending on the method stood (see Figure 1) because of the slightly different refractive indices of the different oils is not uniform. If a measurement geometry were provided that would preclude influencing the measurement process, it would be possible, for example, to in the first optimization cycles, the measurement of the second virial coefficient is used to identify the crystallization window, wherein the solution parameters are adapted successively. Subsequently, after the identification of the crystallization window, the initial solution parameters could be optimally adjusted and the diffusion process initiated, with the aim of growing as large crystals as possible by repositioning in the phase diagram.
Since the protein solution is in contact with different phases depending on the state of the process, it would be desirable to avoid any interaction of the measuring method with phases I and II (see Figure 1). This is e.g. in the case of laser scattered light measurements, a combination of confocal dark field optics for the excitation beam and confocal detection optics in combination with precisely defined samples (virtual wells) is realized (see Figures 3, B and C). The use of a uniform and predefinable hydrophilic anchoring / anchoring field is thus desirable for this process. As already mentioned above, several methods for the generation of hydrophilic / hydrophobic structured surfaces have already been described. So far, however, no simple and inexpensive method has been described.
The creation of an extremely hydrophobic glass plate and the subsequent generation of hydrophilic regions by photocatalytic oxidation has been described. Wakana Kubo and Tetsu Tatsuma; Applied Surface Science; 243: 125-128 (2005)}. However, this method is only very complicated to implement and is only partially reasonably priced by the use of photomasks. Also, the process is not fast and therefore less suitable for mass production of modified surfaces.
The application US_2004 / 0018615_A1 describes virtual sample vessels (wells) and methods for the transfer of liquids, which is realized by the delimitation of hydrophilic regions by hydrophobic regions.
As a hydrophobic region, a 120 micron Teflon coating was described.
The application EP_1364702_A2 describes a photolytographic process wherein the hydrophobic region is in unprotected regions e.g. is removed by an oxygen plasma. This method is also complicated and not inexpensive to implement.
The provision of hydrophilic anchor regions is realized by the method described here surprisingly and very inexpensively.
In essence, the process is realized in a few stages:
1) Purification and / or activation of the hydrophilic / hydrophobic surface to be treated (e.g., a hydrophilic glass substrate).
2) Applying a thin hydrophobic / hydrophilic layer.
3) Removal of the hydrophobic / hydrophilic layer by a chemical reaction by a coated substance.
4) Clean the treated surface.
In a preferred embodiment, the surface to be treated is glass, a hydrophobic layer is prepared by silanization, and the hydrophobic layer is removed by basic catalysis. In a preferred embodiment, methods for applying and / or removing the hydrophobic layer are selected such that a minimum of chemicals is needed. In a preferred embodiment, the use of organic solvents for cleaning steps is completely dispensed with.
In a preferred embodiment, the third-stage chemical is applied in a spatially-resolved manner by a simple method, e.g. through stencil printing, screen printing, stamping processes, automated pipetting machines and printers (contact-based or non-contact), spraying through a mask, by hand, etc.
In a preferred embodiment, the third stage chemical is added to water soluble and / or to a water soluble substance which is of adjustable viscosity, e.g. Polyethylene glycol or other water-soluble biological polymers with adjustable chain lengths / viscosities or a mixture of the latter.
In a further embodiment, the fourth step consists of a cleaning with water, which can be tempered for better cleaning effect.
In a preferred method, the hydrophobic layer is removed on both sides of the substrate. In this case, the hydrophobic layer can be removed on the sample side facing away from the substrate on an identical, larger or on the entire surface of the substrate. In a further embodiment, the side facing away from the sample can be completely spared by the hydrophobic / hydrophilic layer realized in point 2. If the substrate is transparent, the hydrophilic regions present on it are difficult or impossible to identify.
In the automated sample application, the well-defined position can be used for the application, whereby slight positioning errors are corrected automatically as soon as contact with the hydrophilic region is achieved (see DE_19754978). When applied by hand, in a preferred embodiment, a pad can be used on which the hydrophilic regions are marked. This is e.g. placed under the sample holder and thus indicates to the user the location of the hydrophilic regions. Example 1 :
A glass substrate (cover glass 0.17 mm thick) is cleaned and activated for 30-240 minutes at 350 °.
The glass is slowly cooled and incubated in a container containing several micron to milliliters of Sigmacoat (chlorinated organopolysiloxane in heptane; Sigma Chemical Co.) and after establishing a slight vacuum for 30 to 240 minutes, thereby silanizing. The silanization can be heated to 100 ° C for 30 minutes to give a more stable silanization and remove excess sigmoid. Subsequently, by means of stencil printing or manually, a polyethylene glycol mixture of high molecular weight and low molecular weight molecular weight mixed with 200 mM KOH (final concentration) is applied to the silanized glass in a location-specific manner.
After incubation for a few minutes, the treated glass is cleaned with plenty of tempered water and dried in a drying oven.
Figure 1: Crystallization process according to WO / 04/012841
Figure 2: Geometry of a scattered light measurement using confocal field-effect optics and confocal detection optics
Figure 3: different measurement geometries depending on the geometry of the sample volume, A: hydrophobic sample carrier and interaction of the excitation beam with the medium surrounding the sample volume. B: Sample volume with defined
Anke [phi] unk, where the focus of the excitation beam is positioned centrally in the sample volume. C: same as B, but the focus is closer to the vessel bottom of the sample volume.
Figure 4: Geometry of two samples with different volumes within paraffin oil on two hydrophilic anchoring sites of the same extent generated by the described method.