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Procédé de récolte d'une protéine
L'invention concerne un procédé de récolte d'une protéine microbienne à partir de la culture d'un microorganisme qui produit cette protéine.
L'invention concerne également une composition contenant la protéine microbienne obtenue par le procédé de récolte.
Industriellement, les protéines microbiennes sont produites par culture d'un microorganisme dans un fermenteur contenant un milieu nutritif liquide adéquat. La culture obtenue en fin de fermentation contient une certaine quantité de la protéine voulue, mais également d'autres protéines, ainsi que la biomasse cellulaire, des impuretés diverses et des produits de dégradation du milieu nutritif.
La fermentation terminée, il est donc nécessaire de séparer ces divers produits en vue de récupérer la protéine voulue. De plus, la protéine est traitée de façon à obtenir une préparation commerciale répondant aux critères de pureté et de stabilité souhaités. Ces traitements sont des opérations connues telles que centrifugation, filtration, évaporation, précipitation, séchage. Ces traitements sont adaptés en fonction des caractéristiques de la protéine voulue.
Dans ce contexte, divers procédés de récolte ont déjà été proposés. Ainsi, un procédé de récolte d'une enzyme à partir de la culture d'un microorganisme est décrit dans le brevet U. S. 4,673, 647. Un agent de précipitation est ajouté à la culture en fin de fermentation. Au précipité formé qui contient l'enzyme, est ajouté un polyol. Une solution contenant le polyol et l'enzyme est obtenue.
Un procédé de récolte d'une lipase produite par une souche de Fusarium oxysporum est également décrit dans la demande de brevet européen 0 130 064.
Le pH de la culture, obtenue en fin de fermentation, est ajusté à 8,0. Puis, la culture est floculée par l'addition de chlorure de calcium, d'agents floculants et de Triton X-100 (0,5 % poids/volume). La culture floculée est centrifugée. Puis, le culot de centrifugation est remis en suspension, le pH de cette suspension est ajusté à 4,5. Un précipité est formé. On centrifuge de nouveau, puis on ajoute au surnageant de centrifugation du Triton X-100. On centrifuge de nouveau. Le culot de centrifugation est remis en suspension, puis diafiltré. La suspension obtenue est ensuite ultrafiltrée et concentrée. Le filtrat obtenu est de nouveau filtré, puis précipité par de l'acétone. Ce procédé est relativement compliqué.
Les très nombreuses étapes entraînent de façon inévitable des pertes de produits, donc
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un rendement faible, mais également des altérations de la lipase, telles que des altérations de la structure de la protéine et des propriétés de la lipase. Le produit final obtenu a donc une activité enzymatique faible et détériorée et est, de plus, instable.
De même, un autre procédé de récolte d'une enzyme à partir de la culture d'un microorganisme, qui produit cette enzyme, est décrit dans une demande de brevet européen 0 574 050. A la culture en fin de fermentation sont ajoutés au moins deux tensioactifs nonioniques, tel que le Triton X-114, un agent floculant, et un sel, tel que chlorure, sulfate ou phosphate de magnésium, de calcium ou de sodium. Trois phases sont obtenues : une phase aqueuse, une phase détergente contenant l'enzyme et une phase solide contenant la biomasse. Pour séparer ces phases, il est nécessaire d'être en possession d'un appareil de séparation spécial capable de séparer trois phases, tel qu'un décanteur équipé de deux sorties liquides et d'une sortie solide.
De plus, la phase détergente contenant l'enzyme et les tensioactifs est particulièrement visqueuse, car elle contient une grande quantité de tensioactifs (plus de 50 gll de tensioactifs sont en effet mis en oeuvre), elle est donc difficile à traiter. Ce procédé est nécessairement suivi par d'autres étapes de séparation en vue d'obtenir une composition enzymatique industriellement acceptable. Par ailleurs, ce procédé présente le désavantage de
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générer des volumes importants de rejets, contenant des quantités non c négligeables de matière utile, telle que notamment les tensioactifs et des solvants organiques. De ce fait, ce procédé ne permet pas de produire, de manière économique et écologique, une composition riche en enzyme.
En conséquence, il y a actuellement un besoin pour un procédé de récolte d'une protéine microbienne qui soit simple à mettre en oeuvre, économique, rapide, et qui permette d'obtenir un rendement élevé en protéine. Il y a également un besoin pour un procédé de récolte d'une protéine microbienne qui permette d'obtenir cette protéine microbienne sans altération de sa structure et de ses propriétés et avec une activité élevée, et notamment, dans le cas d'une enzyme, avec une activité enzymatique élevée.
L'invention vise à remédier aux inconvénients des procédés connus décrits ci-dessus, en fournissant un procédé amélioré permettant d'obtenir, de manière économique, à partir de la culture d'un microorganisme une protéine microbienne, sans engendrer des rejets volumineux de matières, ni des pertes prohibitives de matière utile.
La présente invention a pour premier but de fournir un procédé de récolte
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d'une protéine microbienne à partir de la culture d'un microorganisme qui produit cette protéine, ce procédé étant simple à mettre en oeuvre et ne nécessitant aucun appareil spécial de séparation.
La présente invention a pour autre but de fournir un procédé de récolte d'une protéine microbienne permettant d'obtenir la protéine avec un rendement élevé.
La présente invention a également pour but de fournir un procédé de récolte d'une protéine microbienne, procédé qui soit économique, ne nécessitant pas de recyclage compliqué et mettant en oeuvre une quantité de produits industriellement et économiquement raisonnable.
La présente invention a pour but de fournir un procédé de récolte d'une protéine microbienne, qui est, en même temps, un procédé de concentration et de purification pour la protéine.
La présente invention a, de plus, pour but de fournir un procédé de récolte d'une protéine microbienne permettant d'obtenir une protéine microbienne pratiquement pure, c'est-à-dire ne contenant pratiquement plus de protéines contaminantes.
La présente invention a pour but de fournir un procédé de récolte d'une protéine microbienne permettant d'obtenir directement une composition protéinique stabilisée et concentrée.
La présente invention a également pour but important de fournir un procédé de récolte d'une protéine microbienne permettant d'obtenir directement un produit fini, c'est-à-dire une composition protéinique vendable en l'état sans traitement ultérieur.
La présente invention a pour but de préparer et de fournir une composition protéinique obtenue par le procédé de récolte décrit ci-dessus.
A cet effet, l'invention concerne un procédé de récolte d'une protéine microbienne à partir de la culture d'un microorganisme qui produit cette protéine, caractérisé en ce que ce procédé comprend : a) une première étape dans laquelle on élimine, de la culture du microorganisme, au moins une partie de la fraction aqueuse et une partie des impuretés solubles que contient la culture, et on obtient une suspension contenant les microorganismes et la protéine, b) une deuxième étape dans laquelle on ajoute au moins un tensioactif nonionique et un alcool à la suspension obtenue à la première étape, et on obtient une suspension contenant les microorganismes, la protéine, le tensioactif
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nonionique et l'alcool, et c) une troisième étape dans laquelle on élimine les microorganismes, de la suspension obtenue à la deuxième étape,
et on obtient une composition contenant la protéine microbienne, le tensioactif nonionique et l'alcool.
L'invention permet ainsi d'obtenir la protéine microbienne purifiée et concentrée.
Par protéine microbienne, on entend toute protéine produite par un microorganisme. Généralement, la protéine microbienne est une protéine hydrophobe. Habituellement, la protéine microbienne est une enzyme. De préférence, la protéine microbienne est une enzyme choisie parmi les hydrolases, les transferases, les oxidoréductases et les isomerases. De manière particulièrement préférée, la protéine microbienne est une hydrolase. De manière tout particulièrement préférée, la protéine microbienne est une estérase, telle qu'une lipase, une phosphatase, une cutinase, une lipoprotéinelipase ; une glycosidase, telle qu'une glucosidase, une dextranase, une cellulase, une amylase, une galactosidase, une pullulanase, une xylanase ; une peptidase, telle qu'une protéase. D'excellents résultats ont été obtenus avec une lipase.
Cette définition inclut les protéines naturelles et les protéines modifiées, telles que les protéines dont la séquence de nucléotides ou d'acides aminés a été modifiée par des techniques de génie génétique ou par des techniques de mutagénèse.
Généralement, la protéine microbienne provient d'une bactérie, d'un champignon ou d'un virus. Habituellement, la protéine microbienne provient d'une bactérie ou d'un champignon. De préférence, la protéine provient d'une bactérie choisie parmi les Bacillus, Pseudomonas, Alcaligenes, Streptococcus et Streptomyces, ou d'un champignon choisi parmi les Aspergillus, Geotrichum, Humicola, Trichoderma, Penicillium, Rhizopus et Fusarium. De manière particulièrement préférée, la protéine provient d'une bactérie choisie parmi les Bacillus, Pseudomonas et Alcaligenes. De bons résultats ont été obtenus lorsque la protéine microbienne provient d'un Pseudomonas. D'excellents résultats ont été obtenus lorsque la protéine microbienne provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis, et notamment de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 (LMG P-15151).
Cette définition inclut les protéines microbiennes provenant de microorganismes qui sont des dérivés ou des mutants. Par dérivé d'un microorganisme, on entend tout microorganisme modifié naturellement, c'est-à-
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dire par sélection naturelle. Par mutant d'un microorganisme, on entend tout microorganisme modifié artificiellement. Les mutants peuvent être obtenus par les techniques connues de modification, telles que rayonnement ultra-violet, rayons X, agents mutagènes ou génie génétique. Ces techniques sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans SAMBROOK et al., 1989, chapitre 15. Des exemples d'agents mutagènes sont notamment décrits par R Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 365-368.
Généralement, la protéine microbienne est extracellulaire, intracellulaire ou liée à la membrane de la cellule. Habituellement, la protéine microbienne est liée à la membrane de la cellule.
Selon l'invention, la première étape comprend l'élimination d'au moins une partie de la fraction aqueuse et une partie des impuretés solubles que contient la culture du microorganisme.
Cette première étape permet d'éliminer une grande partie de la fraction aqueuse, et de préférence la majorité de la fraction aqueuse.
Cette première étape permet d'éliminer une grande partie des impuretés solubles, et de préférence la majorité des impuretés solubles.
La suspension obtenue lors de la première étape se présente sous la forme d'un culot ou d'un gâteau selon la technique mise en oeuvre.
Cette première étape peut être réalisée par des techniques connues de l'homme du métier telles que centrifugation, filtration, précipitation, séchage ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
Généralement, la première étape est réalisée par une technique choisie parmi centrifugation, filtration, précipitation, ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques. Habituellement, la première étape est réalisée par une technique choisie parmi centrifugation, filtration qui inclut l'ultrafiltration, la microfiltration et/ou la diafiltration, ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques. De préférence, la première étape est réalisée par centrifugation ou filtration.
De façon avantageuse, la première étape comprend l'addition d'un agent floculant à la culture. Généralement, l'agent floculant est choisi parmi les polymères d'acrylamide, les copolymères d'acrylamide et d'acrylate, les polyamines quaternaires et les polysaccharides. Habituellement, l'agent floculant
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est choisi parmi les polyamines quaternaires. De préférence, l'agent floculant est choisi parmi les polyamines quaternaires vendues sous la marque OPTIFLOC De bons résultats ont été obtenus avec l'agent floculant vendu sous la marque OPTIFLOC FC205 (SOLVAY).
Selon l'invention, la deuxième étape comprend l'addition d'au moins un tensioactif nonionique et un alcool à la suspension obtenue à la première étape.
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Par tensioactif nonionique, on entend un composé amphiphile qui ne se dissocie pas en ions dans une solution aqueuse. Le tensioactif nonionique est choisi parmi les éthoxylates, les esters d'acides gras et de composés polyhydroxylés, et les oxydes d'amine. Généralement, le tensioactif nonionique est choisi parmi les éthoxylates.
Les éthoxylates sont également connus sous le nom d'alcools aliphatiques polyéthoxylés (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1994,5e édition, Vol A25, pages 785-787) ou d'alcools gras éthoxylés.
Habituellement, le tensioactif nonionique est choisi parmi les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 10 à environ 20 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation compris entre environ 2 et environ 40. De préférence, le tensioactif nonionique est choisi parmi les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 10 à environ 18 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation compris entre environ 2 et environ 20. De manière particulièrement préférée, le tensioactif nonionique est choisi parmi les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation compris entre environ 3 et environ 11.
De manière tout particulièrement préférée, le tensioactif nonionique est choisi parmi les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation compris entre environ 3 et environ 9.
De bons résultats ont été obtenus avec un tensioactif nonionique choisi parmi les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation de 3, tel que le produit vendu sous la marque MARLIPAL 24/30 par Hüls AG ; les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation de 6, tel que le produit vendu sous la marque MARLIPAL 24/60 par Hüls AG ; les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation de 7, tel que le produit vendu sous la marque MARLIPAL 24/70 par Huis AG ;
et les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone
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et ayant un degré d'éthoxylation de 9 tel que le produit vendu sous la marque MARLIPAL 24/90 par Hüls AG.
D'excellents résultats ont été obtenus avec les alcools aliphatiques polyéthoxylés contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation de 9 tel que le produit vendu sous la marque MARLIPAL 24/90 par Hüls AG.
Généralement, on met en oeuvre moins de 10 g de tensioactif nonionique par litre de culture. Habituellement, on met en oeuvre moins de 5 g de tensioactif nonionique par litre de culture. De préférence, on met en oeuvre moins de 1 g de tensioactif nonionique par litre de culture.
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Généralement, on met en oeuvre plus de 0, 01 g de tensioactifnonionique par litre de culture. Habituellement, on met en oeuvre plus de 0, 05 g de tensioactif nonionique par litre de culture. De préférence, on met en oeuvre plus de 0, 1 g de tensioactif nonionique par litre de culture.
De manière particulèrement préférée, on met en oeuvre de 0, 1 g à 1 g de tensioactif nonionique par litre de culture.
Par alcool, on entend un composé comportant au moins un groupement fonctionnel-OH. Généralement, on met en oeuvre un alcool aliphatique.
Habituellement, on met en oeuvre un polyol. De préférence on met en oeuvre un diol ou un triol. De manière particulièrement préférée, on met en oeuvre le 1,2- éthanediol, le 1, 2-propandiol, le 1,3-butanediol ou le glycérol.
D'excellents résultats ont été obtenus avec le 1,2-propanediol (propylène glycol).
Généralement, on met en oeuvre moins de 75 % (volume) d'alcool par volume de culture. Habituellement, on met en oeuvre moins de 60 % (volume) d'alcool par volume de culture. De préférence, on met en oeuvre moins de 50 % (volume) d'alcool par volume de culture.
Généralement, on met en oeuvre plus de 5 % (volume) d'alcool par volume de culture. Habituellement, on met en oeuvre plus de 10 % (volume) d'alcool par volume de culture. De préférence, on met en oeuvre plus de 15 % (volume) d'alcool par volume de culture.
De manière particulèrement préférée, on met en oeuvre de 10 à 50 % (volume) d'alcool par volume de culture.
Dans une variante préferée de l'invention, on ajoute au moins un sel au cours de la deuxième étape du procédé.
Par sel, on entend un composé formé d'un anion et d'un cation.
Généralement, le sel est un sel minéral.
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Habituellement, le sel est choisi dans le groupe de composés dans lequel les cations sont le sodium, le potassium, le magnésium et l'ammonium De préférence, le sel est choisi dans le groupe de composés dans lequel les cations sont le sodium et le magnésium.
Habituellement, le sel est choisi dans le groupe de composés dans lequel les anions sont des sulfates, des chlorures, des phosphates, des carbonates, des citrates et un mélange de ceux-ci. De préférence, le sel est choisi dans le groupe de composés dans lequel les anions sont des sulfates, des chlorures, des phosphates, et un mélange de ceux-ci.
De manière particulièrement préférée, le sel est un chlorure de calcium, un chlorure de sodium ou un mélange de ceux-ci. D'excellents résultats ont été obtenus avec un mélange de chlorure de calcium et de chlorure de sodium.
Généralement, on met en oeuvre moins de 100 mM de sel par volume de culture. Habituellement, on met en oeuvre moins de 80 mM de sel par volume de culture. De préférence, on met en oeuvre moins de 70 mM de sel par volume de culture.
Généralement, on met en oeuvre plus de 5 mM de sel par volume de culture. Habituellement, on met en oeuvre plus de 10 mM de sel par volume de culture. De préférence, on met en oeuvre plus de 20 mM de sel par volume de culture.
De manière particulèrement préférée, on met en oeuvre de 20 à 70 mM de sel par volume de culture. De bons résultats ont été obtenus en mettant en oeuvre de 20 à 40 mM de chlorure de sodium et de 10 à 20 mM de chlorure de calcium par volume de culture.
Dans une variante préférée de l'invention, on ajoute au moins un tampon au cours de la deuxième étape du procédé. Généralement, le tampon est un tampon ayant un pH compris entre environ 7 et environ 12. Habituellement, le tampon est un tampon ayant un pH compris entre environ 7,5 et environ 11. De préférence, le tampon est un tampon ayant un pH compris entre environ 8 et environ 10,5. De manière particulèrement préférée, le tampon est un tampon ayant un pH compris entre environ 8,5 et environ 10. De bons résultats ont été obtenus avec un tampon ayant un pH d'environ 9,5. D'excellents résultats ont été obtenus avec du 2-amino-2-hydroxyméthyl-l, 3-propanediol (Tris à pH 9,5).
Dans la variante particulièrement préférée de l'invention, on ajoute, au cours de la deuxième étape du procédé, un tensioactif nonionique, un alcool, un sel et un tampon. De préférence, le tensioactif nonionique est un alcool
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aliphatique polyéthoxylé contenant d'environ 12 à environ 14 atomes de carbone et ayant un degré d'éthoxylation de 9. De préférence, l'alcool est le 1,2propanediol. De préférence, le sel est le chlorure de calcium et le chlorure de sodium. De préférence, le tampon est un tampon à pH 9,5, tel que le 2-amino-2- hydroxyméthyl-l, 3-propanediol.
Au cours de la deuxième étape, la suspension peut être agitée ou non.
Si la suspension est agitée, l'agitation est de préférence une agitation axiale. Habituellement, l'agitation est une agitation d'environ 5 à 200 tours par minute. De préférence, l'agitation est une agitation d'environ 10 à 100 tours par minute.
La deuxième étape est réalisée à une température qui n'altère pas la protéine microbienne. Généralement, la deuxième étape est réalisée à une
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température comprise entre environ 2 C et environ 40 C Habituellement, la deuxième étape est réalisée à une température comprise entre environ 5 C et environ 30 C. De préférence, la deuxième étape est réalisée à une température comprise entre environ 10 C et environ 20 C.
Selon l'invention, la troisième étape comprend l'éliminination des microorganismes, de la suspension obtenue à la deuxième étape, une composition contenant la protéine microbienne, le tensioactif nonionique et l'alcool étant obtenue.
Au cours de cette troisième étape, on soumet la suspension obtenue à la deuxième étape à un traitement permettant d'éliminer les microorganismes. Un tel traitement de séparation solide-liquide est connu de l'homme du métier. Des exemples de traitement sont notamment la centrifugation, la filtration, ou une combinaison de ces techniques. Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
Ce traitement peut être réalisé par une technique choisie parmi centrifugation, filtration qui inclut l'ultrafiltration, la filtration sur filtre presse, la microfiltration et/ou la diafiltration, ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques. De préférence, ce traitement est réalisé par centrifugation ou filtration.
L'invention concerne également une composition contenant la protéine microbienne obtenue par le procédé de récolte.
La composition selon l'invention contient de plus des additifs.
Les additifs, compris dans la composition selon l'invention, sont connus de
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l'homme du métier et sont choisis selon l'utilisation envisagée de la composition.
Ils doivent être compatibles avec la protéine microbienne et ne pas affecter son activité. Dans le cas d'une enzyme, ils ne doivent pas affecter l'activité enzymatique de cette enzyme. Habituellement, ces additifs sont des stabilisants, des agents de conservation et des agents de formulation.
Cependant, dans la plupart des cas, il n'est plus nécessaire d'ajouter des stabilisants. En effet, un des avantages de l'invention réside dans l'obtention d'une composition déjà stabilisée, puisque contenant un tensioactif nonionique, un alcool et des sels, ceux-ci sont connus pour être des composés qui stabilisent les protéines.
Des exemples d'additifs, ajoutés à des compositions détergentes, sont en particulier décrits dans la demande de brevet britannique 1372034, dans la
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demande de brevet européen 0218272, dans la demande de brevet européen 0 430 315, la demande de brevet européen 0 341 999, la demande de brevet international WO 94/03578, la demande de brevet international WO 94/25556 et la demande de brevet international WO 91/00910.
La composition selon l'invention a des débouchés multiples dans diverses industries, telles que, par exemple, les industries alimentaires, les industries pharmaceutiques ou les industries chimiques.
La composition selon l'invention contenant la lipase peut notamment être utilisée en détergence. La présente invention concerne également l'utilisation de la composition contenant la lipase, telle que définie ci-dessus, en détergence. Dans ce cadre, elle fait partie de compositions de détergence.
La présente invention concerne donc également les compositions de détergence contenant la lipase. Les composants des compositions de détergence sont connus de l'homme du métier et sont adaptés selon l'utilisation envisagée de la composition. De tels composants sont notamment des enzymes, telles que par exemple des protéases, amylases et/ou cellulases ; des agents de charge, tels que du tripolyphosphate de sodium ; des agents de blanchiment, tels que du perborate ; des additifs de formulation ; des tensioactifs. Les compositions de détergence de l'invention peuvent être utilisées, selon leur formulation, comme poudre, granule ou liquide lessiviels pour laver le linge ; comme produit détachant pour détacher ou dégraisser des objets ou détacher le linge préalablement au nettoyage ; et comme poudre, granule ou liquide pour laver la vaisselle.
Les compositions détergentes selon l'invention peuvent également contenir d'autres substances choisies en fonction du domaine spécial d'application de la
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composition détergente. Parmi celles-ci, on peut citer les azurants optiques, les inhibiteurs de ternissement, les agents d'antiredéposition des salissures, les
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désinfectants, les inhibiteurs de corrosion, les parfums, les colorants, les agents régulateurs de pH.
Les compositions détergentes de l'invention peuvent être utilisées, selon leur formulation, comme poudre, granule ou liquide lessiviels pour laver le linge ; comme produit détachant pour détacher ou dégraisser des objets ou détacher le linge préalablement au nettoyage ; et comme poudre, granule ou liquide pour laver la vaisselle.
La présente invention est illustrée par les exemples suivants.
Exemple 1 : Production de la lipase par la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est mise en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu A gélosé à 30 C durant 24 heures.
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISM (LMG culture collection) sous le numéro LMG P-15151 le 12 octobre 1994.
Le milieu A gélosé contient 10 g/1 de tryptone (DIFCO), 5 g/l d'extrait de
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levure, 5 g/l de NaCI, 20 g/1 d'agar, 2, 5 g/l de NaHC03, 7, 5 g/1 de Na2C03.
Tryptone, extrait de levure, NACI, agar, qui composent le milieu A, sont mélangés avec 900 ml d'eau distillée, ensuite stérilisés à 121 C durant 30 minutes. Le pH est ajusté à 9, 5 par l'addition de 100 ml de tampon carbonate prélablement stérilisé (contenant 25 g/l de NaHC03 et 75 g/l de Na2C03).
Puis, à partir de cette culture on réalise une culture dans 25 ml d'un milieu liquide B.
Le milieu B contient 10 g/l de tryptone (DIFCO), 5 g/l d'extrait de levure, 10 g/l de NaCI. Le milieu est stérilisé à 121 C durant 30 minutes. Le pH du milieu est ajusté à 9,5 en ajoutant 10 % (v/v) d'un tampon carbonate qui contient 53 g/1 de Na2C03 et 42 g/l de NaHC03.
La culture est réalisée, dans des fioles de 250 ml, à 30 C sous agitation orbitale à raison de 200 révolutions par minute avec une amplitude d'environ 2,54 cm.
Après 16 heures d'incubation, on introduit 1 ml de cette culture dans un fiole de 2000 ml contenant 200 ml de milieu liquide B stérilisé. La culture est réalisée à 30 C sous agitation orbitale à raison de 200 révolutions par minute
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avec une amplitude d'environ 2,54 cm.
Après 16 heures d'incubation, on introduit cette culture dans un fermenteur de 20 litres contenant 13 litres du milieu liquide C stérilisé.
Le milieu C contient K2HP04 2,5 g/l, KH2PO4 2,5 g/l, MgS04. 7H20
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1 g/l, (NH4) 2S04 2 g/l, (NHCO 2 g/l, CaC12 1 g/ !, farine de soja 20 g/1, extrait de levure 2 g/l, glucose 10 g/1, antimousse MAZUOL (MAZER CHEMICALS) 1 g/l. Le pH est ajusté à 8, 5 par de l'hydroxyde de sodium 5 N après stérilisation dans le fermenteur (30 minutes à 121 C). Le milieu est stérilisé dans le fermenteur 30 minutes à 121 C. Le glucose est stérilisé, à part, à pH 4,0 (pH ajusté avec de l'acide phosphorique normal) durant 30 minutes à 121 C. Le pH du milieu est maintenu à 8,5 par de l'hydroxyde de sodium 5 N.
La culture dans le fermenteur est réalisée à une température de 30 C, sous une pression de 0,15. 105 Pa (Pa = Pascal) (0,15 bar), avec une aération de 0,3 VVM (volume d'air par volume de milieu de culture par minute), avec une agitation axiale de 200 tours par minutes, la régulation d'oxygène dissous étant fixée à 10 % (v/v) de saturation par régulation de la vitesse d'agitation
L'abréviation % (v/v) représente un pourcentage exprimé en volume par volume. L'abréviation % (v/p) représente un pourcentage exprimé en volume par poids. L'abréviation % (p/v) représente un pourcentage exprimé en poids par volume. L'abréviation % (p/p) représente un pourcentage exprimé en poids par poids
Après 50 heures de fermentation, on mesure l'activité enzymatique de la culture, ainsi obtenue, par la technique décrite ci-après.
L'hydrolyse de la trioléine est quantifiée par la neutralisation des acides gras libérés sous l'action de la lipase. Cette mesure est effectuée à l'aide d'un appareil de titrage automatique, appareil qui maintient le pH constant à une valeur de consigne par l'addition de NaOH 0, 01 N.
Une unité lipase (LU) est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la libération d'une micromole d'acide gras par minute dans les conditions standards de l'essai décrit ci-après.
On mélange 10 g de Trioléine (ROTH 5423.1) et 10 g de gomme arabique (FLUKA 51200) dans 100 ml d'eau distillée. On émulsionne ce mélange à l'aide d'un mélangeur ULTRA-TURAX à 13500 tours par minutes (agitation axiale) durant 3 fois 5 minutes, en maintenant le mélange sous azote et dans un bain de glace.
On prépare un tampon de dilution contenant 2,34 g/1 de NaCI, 2,94 g/1 de
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CaC12 2H20 et 0,61 g/l de Tris (2-amino-2-hydroxyméthyl-l, 3-propanediol).
On utilise un appareil de titrage automatique, muni d'une burette contenant du NaOH 0,01 N, d'une sonde de température et d'une sonde de pH et équipé d'un réacteur thermostatisé.
Dans le réacteur thermostatisé à 30 C, on introduit un barreau magnétique d'agitation, 10 ml d'émulsion de trioléine et 20 ml de tampon de dilution. Le pH de la solution, ainsi obtenue, est ajusté à 9,5 avec NaOH 0,1 N Puis, on introduit 0,5 ml de l'échantillon à tester contenant la lipase, l'échantillon est éventuellement dilué de telle sorte qu'il ne contienne qu'un maximum de 5 LU.
On contrôle le pH pendant les deux premières minutes avec NaOH 0,01 N. Puis, on enregistre la consommation de soude entre 2 et 4 minutes, tout en maintenant le pH constant (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = VI en ml).
Ensuite, on réalise le même essai en remplacant l'échantillon contenant la lipase par 0,5 ml de tampon de dilution (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = V2 en ml).
On détermine une unité lipase (LU) comme suit : 1 LU/ml = (VI-V2) x dilution éventuelle de l'échantillon x 10
Par cette méthode, une activité lipase est détectée dans la culture.
Exemple 2 : Récolte de la lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
On ajoute à la culture, telle qu'obtenue en fin de fermentation à l'exemple 1, 1 % (p/p) d'agent floculant OPTIFLOC FC205 (SOLVAY) sous la forme d'une solution à 10 % (p/p). Le mélange est agité doucement (agitation axiale de 50 tours par minute) pendant 1 heure à 15 C.
On centrifuge le mélange 10 minutes à 8500 tours par minutes (BECKMAN J21, rotor JA10) à une température de 4 C. On élimine le surnageant de centrifugation.
On reprend le culot de centrifugation avec un tampon d'élution, 1 ml de culture étant repris avec 1 ml de tampon d'élution. Le tampon d'élution comprend Tris 3 mM, NaCI 24 mM, CaC12 12 mM, alcool aliphatique polyéthoxylé ayant de 12 à 14 atomes de carbone et un degré d'éthoxylation égal à 9 (éthoxylate) (nombre de groupement EO (oxyde d'éthylène) égal à 9) vendu sous la marque MARLIPAL 24/90 (Société HULS AG) 0,3 g/1 et propylène glycol 40 % (v/v).
Le mélange est agité doucement (agitation axiale de 50 tours par minute) pendant 15 minutes à 15 C, afin de remettre en suspension le culot de
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centrifugation.
Puis, on centrifuge la suspension, ainsi obtenue, 10 minutes à 8500 tours par minutes à une température de 4 C. On élimine le culot de centrifugation. On mesure l'activité enzymatique du surnageant de centrifugation par la technique décrite à l'exemple 1.
L'activité enzymatique du surnageant de centrifugation est égale à 116 % de l'activité enzymatique de la culture telle qu'obtenue en fin de fermentation à l'exemple 1.
Exemple 3 : Récolte de la lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
On reproduit exactement le procédé décrit à l'exemple 2 à l'exception du tampon d'élution.
Dans cet exemple, le tampon d'élution utilisé comprend Tris 4 mM, NaCI 32 mM, CaC12 16 mM, MARLIPAL 24/90 0,4 g/1 et propylène glycol 20 % (v/v).
L'activité enzymatique du surnageant de centrifugation est égale à 98 % de l'activité enzymatique de la culture telle qu'obtenue en fin de fermentation à l'exemple 1.
Exemple 4R (de comparaison) : Récolte de la lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
On reproduit exactement le procédé décrit à l'exemple 2 à l'exception du tampon d'élution.
Dans cet exemple, le tampon d'élution utilisé comprend Tris 3 mM, NaCI 24 mM, CaC12 12 mM. Il ne contient pas de propylène glycol.
L'activité enzymatique du surnageant de centrifugation est égale à 14 % de l'activité enzymatique de la culture telle qu'obtenue en fin de fermentation à l'exemple 1.
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Method for harvesting a protein
The invention relates to a method of harvesting a microbial protein from the culture of a microorganism which produces this protein.
The invention also relates to a composition containing the microbial protein obtained by the harvesting process.
Industrially, microbial proteins are produced by culturing a microorganism in a fermenter containing an adequate liquid nutrient medium. The culture obtained at the end of fermentation contains a certain amount of the desired protein, but also other proteins, as well as the cellular biomass, various impurities and products of degradation of the nutritive medium.
The fermentation finished, it is therefore necessary to separate these various products in order to recover the desired protein. In addition, the protein is treated so as to obtain a commercial preparation which meets the desired criteria of purity and stability. These treatments are known operations such as centrifugation, filtration, evaporation, precipitation, drying. These treatments are adapted according to the characteristics of the desired protein.
In this context, various harvesting methods have already been proposed. Thus, a method of harvesting an enzyme from the culture of a microorganism is described in U.S. Patent 4,673,647. A precipitation agent is added to the culture at the end of fermentation. To the precipitate formed which contains the enzyme, a polyol is added. A solution containing the polyol and the enzyme is obtained.
A method for harvesting a lipase produced by a strain of Fusarium oxysporum is also described in European patent application 0 130 064.
The pH of the culture, obtained at the end of fermentation, is adjusted to 8.0. Then, the culture is flocculated by the addition of calcium chloride, flocculating agents and Triton X-100 (0.5% w / v). The flocculated culture is centrifuged. Then, the centrifugation pellet is resuspended, the pH of this suspension is adjusted to 4.5. A precipitate is formed. Centrifuge again, then add to the centrifuge supernatant of Triton X-100. Centrifuge again. The centrifugation pellet is resuspended, then diafiltered. The suspension obtained is then ultrafiltered and concentrated. The filtrate obtained is again filtered, then precipitated with acetone. This process is relatively complicated.
The very many steps inevitably lead to product losses, therefore
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low yield, but also alterations in lipase, such as alterations in the structure of the protein and properties of the lipase. The final product obtained therefore has a weak and deteriorated enzymatic activity and is, moreover, unstable.
Similarly, another method of harvesting an enzyme from the culture of a microorganism, which produces this enzyme, is described in a European patent application 0 574 050. At the end of fermentation culture are added at least two nonionic surfactants, such as Triton X-114, a flocculating agent, and a salt, such as magnesium, calcium or sodium chloride, sulfate or phosphate. Three phases are obtained: an aqueous phase, a detergent phase containing the enzyme and a solid phase containing the biomass. To separate these phases, it is necessary to have a special separation device capable of separating three phases, such as a decanter equipped with two liquid outlets and a solid outlet.
In addition, the detergent phase containing the enzyme and the surfactants is particularly viscous, because it contains a large amount of surfactants (more than 50 gll of surfactants are in fact used), it is therefore difficult to treat. This process is necessarily followed by other separation steps in order to obtain an industrially acceptable enzymatic composition. Furthermore, this method has the disadvantage of
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generate large volumes of waste containing significant quantities of useful material, such as surfactants and organic solvents. Therefore, this process does not allow to produce, economically and ecologically, a composition rich in enzyme.
Consequently, there is currently a need for a method for harvesting a microbial protein which is simple to implement, economical, rapid, and which makes it possible to obtain a high yield of protein. There is also a need for a process for harvesting a microbial protein which makes it possible to obtain this microbial protein without altering its structure and its properties and with high activity, and in particular, in the case of an enzyme, with high enzyme activity.
The invention aims to remedy the drawbacks of the known methods described above, by providing an improved method making it possible to obtain, economically, from the culture of a microorganism a microbial protein, without generating bulky releases of materials. , nor prohibitive losses of useful material.
The main object of the present invention is to provide a harvesting method
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of a microbial protein from the culture of a microorganism which produces this protein, this process being simple to implement and requiring no special apparatus for separation.
Another object of the present invention is to provide a method for harvesting a microbial protein making it possible to obtain the protein with a high yield.
The present invention also aims to provide a process for harvesting a microbial protein, a process which is economical, does not require complicated recycling and uses a quantity of products industrially and economically reasonable.
The present invention aims to provide a method of harvesting a microbial protein, which is, at the same time, a method of concentration and purification for the protein.
The present invention further aims to provide a method of harvesting a microbial protein making it possible to obtain a practically pure microbial protein, that is to say one which contains practically no more contaminating proteins.
The present invention aims to provide a method of harvesting a microbial protein making it possible to directly obtain a stabilized and concentrated protein composition.
The present invention also has the important object of providing a process for harvesting a microbial protein making it possible to directly obtain a finished product, that is to say a protein composition which can be sold as it is without further processing.
The aim of the present invention is to prepare and provide a protein composition obtained by the harvesting process described above.
To this end, the invention relates to a process for harvesting a microbial protein from the culture of a microorganism which produces this protein, characterized in that this process comprises: a) a first step in which, from the culture of the microorganism, at least part of the aqueous fraction and part of the soluble impurities contained in the culture, and a suspension containing the microorganisms and the protein is obtained, b) a second step in which at least one nonionic surfactant is added and an alcohol in the suspension obtained in the first step, and a suspension is obtained containing the microorganisms, the protein, the surfactant
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nonionic and alcohol, and c) a third step in which the microorganisms are removed from the suspension obtained in the second step,
and a composition is obtained containing the microbial protein, the nonionic surfactant and the alcohol.
The invention thus makes it possible to obtain the purified and concentrated microbial protein.
By microbial protein is meant any protein produced by a microorganism. Generally, the microbial protein is a hydrophobic protein. Usually the microbial protein is an enzyme. Preferably, the microbial protein is an enzyme chosen from hydrolases, transferases, oxidoreductases and isomerases. In a particularly preferred manner, the microbial protein is a hydrolase. Very particularly preferably, the microbial protein is an esterase, such as a lipase, a phosphatase, a cutinase, a lipoproteinelipase; a glycosidase, such as a glucosidase, a dextranase, a cellulase, an amylase, a galactosidase, a pullulanase, a xylanase; a peptidase, such as a protease. Excellent results have been obtained with a lipase.
This definition includes natural proteins and modified proteins, such as proteins whose nucleotide or amino acid sequence has been modified by genetic engineering techniques or by mutagenesis techniques.
Generally, the microbial protein comes from a bacterium, a fungus or a virus. Usually the microbial protein comes from a bacteria or fungus. Preferably, the protein comes from a bacterium chosen from Bacillus, Pseudomonas, Alcaligenes, Streptococcus and Streptomyces, or from a fungus chosen from Aspergillus, Geotrichum, Humicola, Trichoderma, Penicillium, Rhizopus and Fusarium. In a particularly preferred manner, the protein comes from a bacterium chosen from Bacillus, Pseudomonas and Alcaligenes. Good results have been obtained when the microbial protein comes from a Pseudomonas. Excellent results have been obtained when the microbial protein comes from a strain of Pseudomonas wisconsinensis, and in particular from the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92. 677/1 (LMG P-15151).
This definition includes microbial proteins from microorganisms that are derivatives or mutants. By derivative of a microorganism is meant any naturally modified microorganism, that is to say
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say by natural selection. By mutant of a microorganism is meant any artificially modified microorganism. The mutants can be obtained by known modification techniques, such as ultraviolet radiation, X-rays, mutagens or genetic engineering. These techniques are known to those skilled in the art and are described in particular in SAMBROOK et al., 1989, chapter 15. Examples of mutagenic agents are described in particular by R Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p . 365-368.
Generally, the microbial protein is extracellular, intracellular or linked to the cell membrane. Usually, the microbial protein is linked to the cell membrane.
According to the invention, the first step comprises the elimination of at least part of the aqueous fraction and part of the soluble impurities which the culture of the microorganism contains.
This first step makes it possible to eliminate a large part of the aqueous fraction, and preferably the majority of the aqueous fraction.
This first step makes it possible to remove a large part of the soluble impurities, and preferably the majority of the soluble impurities.
The suspension obtained during the first stage is in the form of a pellet or a cake according to the technique used.
This first step can be carried out by techniques known to those skilled in the art such as centrifugation, filtration, precipitation, drying or a combination of one or the other of these techniques. Examples of such techniques are notably described by R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
Generally, the first step is carried out by a technique chosen from centrifugation, filtration, precipitation, or a combination of one or the other of these techniques. Usually, the first step is carried out by a technique chosen from centrifugation, filtration which includes ultrafiltration, microfiltration and / or diafiltration, or a combination of one or the other of these techniques. Preferably, the first step is carried out by centrifugation or filtration.
Advantageously, the first step comprises the addition of a flocculating agent to the culture. Generally, the flocculating agent is chosen from acrylamide polymers, acrylamide and acrylate copolymers, quaternary polyamines and polysaccharides. Usually the flocculating agent
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is chosen from quaternary polyamines. Preferably, the flocculating agent is chosen from the quaternary polyamines sold under the brand OPTIFLOC Good results have been obtained with the flocculating agent sold under the brand OPTIFLOC FC205 (SOLVAY).
According to the invention, the second step comprises the addition of at least one nonionic surfactant and an alcohol to the suspension obtained in the first step.
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By nonionic surfactant is meant an amphiphilic compound which does not dissociate into ions in an aqueous solution. The nonionic surfactant is chosen from ethoxylates, esters of fatty acids and polyhydroxy compounds, and amine oxides. Generally, the nonionic surfactant is chosen from ethoxylates.
Ethoxylates are also known as polyethoxylated aliphatic alcohols (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1994.5th edition, Vol A25, pages 785-787) or ethoxylated fatty alcohols.
Usually, the nonionic surfactant is chosen from polyethoxylated aliphatic alcohols containing from about 10 to about 20 carbon atoms and having a degree of ethoxylation of between about 2 and about 40. Preferably, the nonionic surfactant is chosen from aliphatic alcohols polyethoxylates containing from approximately 10 to approximately 18 carbon atoms and having a degree of ethoxylation of between approximately 2 and approximately 20. In a particularly preferred manner, the nonionic surfactant is chosen from polyethoxylated aliphatic alcohols containing from approximately 12 to approximately 14 carbon atoms and having a degree of ethoxylation of between about 3 and about 11.
Very particularly preferably, the nonionic surfactant is chosen from polyethoxylated aliphatic alcohols containing from approximately 12 to approximately 14 carbon atoms and having a degree of ethoxylation of between approximately 3 and approximately 9.
Good results have been obtained with a nonionic surfactant chosen from polyethoxylated aliphatic alcohols containing from about 12 to about 14 carbon atoms and having a degree of ethoxylation of 3, such as the product sold under the trademark MARLIPAL 24/30 by Hüls AG; polyethoxylated aliphatic alcohols containing from about 12 to about 14 carbon atoms and having a degree of ethoxylation of 6, such as the product sold under the trademark MARLIPAL 24/60 by Hüls AG; polyethoxylated aliphatic alcohols containing from about 12 to about 14 carbon atoms and having a degree of ethoxylation of 7, such as the product sold under the trademark MARLIPAL 24/70 by Huis AG;
and polyethoxylated aliphatic alcohols containing from about 12 to about 14 carbon atoms
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and having a degree of ethoxylation of 9 such as the product sold under the trademark MARLIPAL 24/90 by Hüls AG.
Excellent results have been obtained with polyethoxylated aliphatic alcohols containing from about 12 to about 14 carbon atoms and having a degree of ethoxylation of 9 such as the product sold under the trademark MARLIPAL 24/90 by Hüls AG.
Generally, less than 10 g of nonionic surfactant is used per liter of culture. Usually, less than 5 g of nonionic surfactant is used per liter of culture. Preferably, less than 1 g of nonionic surfactant is used per liter of culture.
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Generally, more than 0.01 g of nonionic surfactant is used per liter of culture. Usually, more than 0.05 g of nonionic surfactant is used per liter of culture. Preferably, more than 0.1 g of nonionic surfactant is used per liter of culture.
Particularly preferably, 0.1 g to 1 g of nonionic surfactant are used per liter of culture.
The term alcohol is understood to mean a compound comprising at least one functional group — OH. Generally, an aliphatic alcohol is used.
Usually, a polyol is used. Preferably, a diol or a triol is used. In a particularly preferred manner, 1,2-ethanediol, 1,2-propandiol, 1,3-butanediol or glycerol are used.
Excellent results have been obtained with 1,2-propanediol (propylene glycol).
Generally, less than 75% (volume) of alcohol is used per culture volume. Usually, less than 60% (volume) of alcohol is used per culture volume. Preferably, less than 50% (volume) of alcohol is used per culture volume.
Generally, more than 5% (volume) of alcohol is used per culture volume. Usually, more than 10% (volume) of alcohol is used per culture volume. Preferably, more than 15% (volume) of alcohol is used per culture volume.
Particularly preferably, 10 to 50% (volume) of alcohol are used per culture volume.
In a preferred variant of the invention, at least one salt is added during the second step of the process.
By salt is meant a compound formed of an anion and a cation.
Generally, the salt is a mineral salt.
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Usually the salt is chosen from the group of compounds in which the cations are sodium, potassium, magnesium and ammonium Preferably, the salt is chosen from the group of compounds in which the cations are sodium and magnesium .
Usually the salt is selected from the group of compounds in which the anions are sulfates, chlorides, phosphates, carbonates, citrates and a mixture thereof. Preferably, the salt is selected from the group of compounds in which the anions are sulfates, chlorides, phosphates, and a mixture thereof.
Particularly preferably, the salt is calcium chloride, sodium chloride or a mixture of these. Excellent results have been obtained with a mixture of calcium chloride and sodium chloride.
Generally, less than 100 mM of salt is used per culture volume. Usually, less than 80 mM of salt is used per culture volume. Preferably, less than 70 mM of salt is used per culture volume.
Generally, more than 5 mM of salt is used per culture volume. Usually, more than 10 mM of salt is used per culture volume. Preferably, more than 20 mM of salt are used per culture volume.
Particularly preferably, 20 to 70 mM of salt are used per culture volume. Good results have been obtained using 20 to 40 mM of sodium chloride and 10 to 20 mM of calcium chloride per culture volume.
In a preferred variant of the invention, at least one buffer is added during the second step of the process. Generally, the buffer is a buffer having a pH between about 7 and about 12. Usually, the buffer is a buffer having a pH between about 7.5 and about 11. Preferably, the buffer is a buffer having a pH between about 8 and about 10.5. Particularly preferably, the buffer is a buffer having a pH between about 8.5 and about 10. Good results have been obtained with a buffer having a pH of about 9.5. Excellent results have been obtained with 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (Tris at pH 9.5).
In the particularly preferred variant of the invention, a nonionic surfactant, an alcohol, a salt and a buffer are added during the second step of the process. Preferably, the nonionic surfactant is an alcohol
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Polyethoxylated aliphatic containing from about 12 to about 14 carbon atoms and having a degree of ethoxylation of 9. Preferably, the alcohol is 1,2propanediol. Preferably, the salt is calcium chloride and sodium chloride. Preferably, the buffer is a buffer at pH 9.5, such as 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol.
During the second stage, the suspension can be agitated or not.
If the suspension is agitated, the agitation is preferably an axial agitation. Usually the agitation is about 5 to 200 revolutions per minute. Preferably, the agitation is agitation of about 10 to 100 revolutions per minute.
The second step is carried out at a temperature which does not alter the microbial protein. Generally, the second step is performed at a
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temperature between approximately 2 C and approximately 40 C Usually, the second stage is carried out at a temperature ranging between approximately 5 C and approximately 30 C. Preferably, the second stage is carried out at a temperature ranging between approximately 10 C and approximately 20 C .
According to the invention, the third step comprises the elimination of the microorganisms, from the suspension obtained in the second step, a composition containing the microbial protein, the nonionic surfactant and the alcohol being obtained.
During this third step, the suspension obtained in the second step is subjected to a treatment making it possible to eliminate the microorganisms. Such a solid-liquid separation treatment is known to a person skilled in the art. Examples of processing include centrifugation, filtration, or a combination of these techniques. Examples of such techniques are notably described by R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p. 267-276.
This treatment can be carried out by a technique chosen from centrifugation, filtration which includes ultrafiltration, filtration on a filter press, microfiltration and / or diafiltration, or a combination of one or the other of these techniques. Preferably, this treatment is carried out by centrifugation or filtration.
The invention also relates to a composition containing the microbial protein obtained by the harvesting process.
The composition according to the invention additionally contains additives.
The additives, included in the composition according to the invention, are known from
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those skilled in the art and are chosen according to the intended use of the composition.
They must be compatible with the microbial protein and not affect its activity. In the case of an enzyme, they must not affect the enzyme activity of that enzyme. Usually these additives are stabilizers, preservatives and formulants.
However, in most cases it is no longer necessary to add stabilizers. Indeed, one of the advantages of the invention lies in obtaining a composition which is already stabilized, since containing a nonionic surfactant, an alcohol and salts, these are known to be compounds which stabilize proteins.
Examples of additives, added to detergent compositions, are in particular described in British patent application 1372034, in the
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European patent application 0218272, in European patent application 0 430 315, European patent application 0 341 999, international patent application WO 94/03578, international patent application WO 94/25556 and international patent application WO 91/00910.
The composition according to the invention has multiple outlets in various industries, such as, for example, the food industries, the pharmaceutical industries or the chemical industries.
The composition according to the invention containing the lipase can in particular be used in detergency. The present invention also relates to the use of the composition containing the lipase, as defined above, in detergency. In this context, it is part of detergency compositions.
The present invention therefore also relates to detergent compositions containing lipase. The components of the detergency compositions are known to those skilled in the art and are adapted according to the intended use of the composition. Such components are in particular enzymes, such as for example proteases, amylases and / or cellulases; bulking agents, such as sodium tripolyphosphate; bleaching agents, such as perborate; formulation additives; surfactants. The detergency compositions of the invention can be used, depending on their formulation, as washing powder, granule or liquid for washing clothes; as a stain remover for detaching or degreasing objects or detaching laundry prior to cleaning; and as a powder, granule or liquid for washing dishes.
The detergent compositions according to the invention may also contain other substances chosen according to the special field of application of the
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detergent composition. Among these, mention may be made of optical brighteners, tarnish inhibitors, anti-deposition agents for soiling,
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disinfectants, corrosion inhibitors, perfumes, dyes, pH regulating agents.
The detergent compositions of the invention can be used, depending on their formulation, as washing powder, granule or liquid for washing clothes; as a stain remover for detaching or degreasing objects or detaching laundry prior to cleaning; and as a powder, granule or liquid for washing dishes.
The present invention is illustrated by the following examples.
Example 1: Production of the lipase by the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1
The Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain is cultured on a petri dish containing the agar medium A at 30 ° C. for 24 hours.
The strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 was deposited in the collection named BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISM (LMG culture collection) under the number LMG P-15151 on October 12, 1994.
Agar medium A contains 10 g / l of tryptone (DIFCO), 5 g / l of extract of
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yeast, 5 g / l of NaCl, 20 g / l of agar, 2.5 g / l of NaHCO3, 7.5 g / l of Na2CO3.
Tryptone, yeast extract, NACI, agar, which make up medium A, are mixed with 900 ml of distilled water, then sterilized at 121 C for 30 minutes. The pH is adjusted to 9.5 by the addition of 100 ml of previously sterilized carbonate buffer (containing 25 g / l of NaHCO3 and 75 g / l of Na2CO3).
Then, from this culture, a culture is carried out in 25 ml of a liquid medium B.
Medium B contains 10 g / l of tryptone (DIFCO), 5 g / l of yeast extract, 10 g / l of NaCl. The medium is sterilized at 121 C for 30 minutes. The pH of the medium is adjusted to 9.5 by adding 10% (v / v) of a carbonate buffer which contains 53 g / l of Na2CO3 and 42 g / l of NaHCO3.
The culture is carried out in 250 ml flasks at 30 ° C. with orbital stirring at the rate of 200 revolutions per minute with an amplitude of approximately 2.54 cm.
After 16 hours of incubation, 1 ml of this culture is introduced into a 2000 ml flask containing 200 ml of sterilized liquid medium B. The culture is carried out at 30 C with orbital stirring at the rate of 200 revolutions per minute
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with an amplitude of about 2.54 cm.
After 16 hours of incubation, this culture is introduced into a 20 liter fermenter containing 13 liters of sterilized liquid medium C.
Medium C contains K2HP04 2.5 g / l, KH2PO4 2.5 g / l, MgS04. 7.20am
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1 g / l, (NH4) 2S04 2 g / l, (NHCO 2 g / l, CaC12 1 g /!, Soy flour 20 g / 1, yeast extract 2 g / l, glucose 10 g / 1, defoamer MAZUOL (MAZER CHEMICALS) 1 g / l. The pH is adjusted to 8.5 with 5 N sodium hydroxide after sterilization in the fermenter (30 minutes at 121 C.) The medium is sterilized in the fermenter for 30 minutes at 121 C. The glucose is sterilized separately at pH 4.0 (pH adjusted with normal phosphoric acid) for 30 minutes at 121 C. The pH of the medium is maintained at 8.5 with hydroxide sodium 5 N.
The culture in the fermenter is carried out at a temperature of 30 C, under a pressure of 0.15. 105 Pa (Pa = Pascal) (0.15 bar), with aeration of 0.3 VVM (volume of air per volume of culture medium per minute), with axial stirring of 200 revolutions per minute, the regulation of dissolved oxygen being fixed at 10% (v / v) saturation by regulating the stirring speed
The abbreviation% (v / v) represents a percentage expressed in volume by volume. The abbreviation% (v / p) represents a percentage expressed by volume by weight. The abbreviation% (w / v) represents a percentage expressed by weight per volume. The abbreviation% (w / w) represents a percentage expressed in weight by weight
After 50 hours of fermentation, the enzyme activity of the culture thus obtained is measured by the technique described below.
The hydrolysis of triolein is quantified by the neutralization of the fatty acids released under the action of lipase. This measurement is carried out using an automatic titration apparatus, which maintains the pH constant at a set value by the addition of NaOH 0.01 N.
A lipase unit (LU) is defined as the quantity of enzyme which catalyzes the release of one micromole of fatty acid per minute under the standard conditions of the test described below.
10 g of Triolein (ROTH 5423.1) and 10 g of gum arabic (FLUKA 51200) are mixed in 100 ml of distilled water. This mixture is emulsified using an ULTRA-TURAX mixer at 13,500 rpm (axial stirring) for 3 times 5 minutes, keeping the mixture under nitrogen and in an ice bath.
A dilution buffer containing 2.34 g / l of NaCl, 2.94 g / l of
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CaC12 2H20 and 0.61 g / l of Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol).
An automatic titration apparatus is used, equipped with a burette containing 0.01 N NaOH, a temperature probe and a pH probe and equipped with a thermostatically controlled reactor.
Into the reactor thermostatically controlled at 30 ° C., a magnetic stirring bar, 10 ml of triolein emulsion and 20 ml of dilution buffer are introduced. The pH of the solution thus obtained is adjusted to 9.5 with 0.1 N NaOH. Then, 0.5 ml of the test sample containing the lipase is introduced, the sample is optionally diluted so that it only contains a maximum of 5 LU.
The pH is controlled for the first two minutes with 0.01 N NaOH. Then, the soda consumption is recorded between 2 and 4 minutes, while keeping the pH constant (volume of soda consumed between 2 and 4 minutes = VI in ml ).
Then, the same test is carried out by replacing the sample containing the lipase with 0.5 ml of dilution buffer (volume of soda consumed between 2 and 4 minutes = V2 in ml).
A lipase unit (LU) is determined as follows: 1 LU / ml = (VI-V2) x possible dilution of the sample x 10
By this method, lipase activity is detected in the culture.
EXAMPLE 2 Harvest of the Lipase from the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 Strain
To the culture, as obtained at the end of fermentation in Example 1, is added 1% (w / w) of flocculating agent OPTIFLOC FC205 (SOLVAY) in the form of a 10% solution (w / w ). The mixture is stirred gently (axial agitation of 50 revolutions per minute) for 1 hour at 15 C.
The mixture is centrifuged for 10 minutes at 8500 revolutions per minute (BECKMAN J21, rotor JA10) at a temperature of 4 C. The supernatant from centrifugation is removed.
The centrifugation residue is taken up with an elution buffer, 1 ml of culture being taken up with 1 ml of elution buffer. The elution buffer comprises 3 mM Tris, 24 mM NaCl, 12 mM CaCl 2, polyethoxylated aliphatic alcohol having from 12 to 14 carbon atoms and a degree of ethoxylation equal to 9 (ethoxylate) (number of EO groups (oxide of ethylene) equal to 9) sold under the brand MARLIPAL 24/90 (Company HULS AG) 0.3 g / 1 and propylene glycol 40% (v / v).
The mixture is stirred gently (axial agitation of 50 revolutions per minute) for 15 minutes at 15 ° C., in order to resuspend the pellet of
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centrifugation.
Then, the suspension thus obtained is centrifuged for 10 minutes at 8500 rpm at a temperature of 4 C. The centrifugation residue is eliminated. The enzymatic activity of the centrifugation supernatant is measured by the technique described in Example 1.
The enzymatic activity of the centrifugation supernatant is equal to 116% of the enzymatic activity of the culture as obtained at the end of fermentation in Example 1.
EXAMPLE 3 Harvest of Lipase from the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 Strain
The process described in Example 2 is reproduced exactly with the exception of the elution buffer.
In this example, the elution buffer used comprises Tris 4 mM, NaCI 32 mM, CaC12 16 mM, MARLIPAL 24/90 0.4 g / 1 and propylene glycol 20% (v / v).
The enzymatic activity of the centrifugation supernatant is equal to 98% of the enzymatic activity of the culture as obtained at the end of fermentation in Example 1.
EXAMPLE 4R (for comparison): Harvest of the lipase from the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain
The process described in Example 2 is reproduced exactly with the exception of the elution buffer.
In this example, the elution buffer used comprises 3 mM Tris, 24 mM NaCl, 12 mM CaCl 2. It does not contain propylene glycol.
The enzymatic activity of the centrifugation supernatant is equal to 14% of the enzymatic activity of the culture as obtained at the end of fermentation in Example 1.