BE1007099A5 - Activite medicamenteuse de l'aspartame. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne l'utilisation de l'aspartame afin de combattre les effets toxiques causés chez l'animal comme chez l'homme par les toxines fongiques de la famille des ochratoxines. L'activité de l'aspartame se caractérise par la suppresion des effets génotoxiques, apparitions d'adduits à l'ADN et modifications de la méthylation de l'ADN causés par les ochratoxines. L'aspartame contrecarre également la nephrotoxicité ainsi que les atteintes testiculaires causées par ces toxines.

Description

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  ACTIVITE MEDICAMENTEUSE DE L'ASPARTAME. 
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 L'aspartame, N-L-a-Aspartyl-L-phenylalanine - 1 - methyl ester, est une molécule bien connue, utilisée quotidiennement par des millions de personnes pour son pouvoir édulcorant exceptionnel. Elle est commercialisée, entre autres, sous les marques Canderel et NutraSweet. L'objet de cette invention porte sur une utilisation nouvelle de l'aspartame comme médicament. 



  L'invention concerne l'utilisation de l'aspartame afin de combattre les effets toxiques causés chez l'animal comme chez l'homme par les toxines fongiques de la famille des ochratoxines. 



  L'invention se rapporte à l'activité médicamenteuse de l'aspartame qui favorise l'excrétion, notament l'excrétion urinaire, des ochratoxines. Cette activité médicamenteuse est également remarquable par le fait qu'elle contrecarre les modifications de l'ADN induites par les toxines de la famille des Ochratoxines. L'invention porte donc également sur l'effet l'activité de l'aspartame à rencontre de l'effet génotoxique des ochratoxines. 



  L'invention concerne aussi l'activité de l'aspartame vis-à-vis la nephrotoxicité et de la toxicité testiculaire induites par   11 exposition   aux ochratoxines Les ochratoxines sont des métabolites toxiques dont la production a initialement été décrite chez le champignon   Aspergillus ochraceus   Wilh. (Van der merwe et al., 1965, Nature, 205,1112-1113). Ensuite, il a a été découvert que d'autres champignons de la famille des Aspergillus, et aussi de la famille des 

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 Penicillium produisaient ce type de toxines (Harvig et al, 1983, Hand. of foodb. of Biol. orig ; 193-238). Ces champignons, que   l'on   appelle couramment des moisissures, sont particulièrement répandus. Ils colonisent les céréales et les légumes durant leur stockage.

   Les toxines que produisent ces champignons contaminent alors les denrées et entrent dans la chaîne alimentaire. Elles sont alors retrouvées également dans les produits animaux (Kuiper-Goodman et Scott, 1989, Biomed. and envir. Sci, 2,179-248). 



  Trois types d'ochratoxines ont été décrites, l'ochratoxine A, son dérivé non chloré B, et l'ester éthylique ou méthylique C (The Merck Index,   11th   edition) ainsi que des dérivés, la plus étudiée étant   l'ochratoxine   A, en abrégé OTA. La toxicité de la forme C est comparable à celle de la forme A. 



  L'ochratoxine A ingérée par voie orale, qui est la voie naturelle de contamination, est rapidement absorbée par la paroi gastrique. Dans le flux sanguin, l'ochratoxine se lie à la sérum albumine (Galtier et   al.,   1981, Food Cosm. Tox, 19,735-738) ce qui a pour effet d'augmenter sa durée de vie dans l'organisme. A titre d'exemple la demi-vie de l'ochratoxine est de 500 heures chez le singe   (Hagelberg,   (1989) $), de 72 à 120 heures chez le porc (Galtier et al, 1980, Food Cosm. Tox, 18,493-496). La toxine est excrétée par voie urinaire et fécale. 



  Les effets toxiques de l'ochratoxine A sont bien connus, sa principale action s'exerce sur le rein. Les études de toxicité subchronique menées chez le rat avec des doses allant de 15 à 370   g/kg,   soit l'équivalent d'une contamination naturelle de la nourriture à 0,2 à 5 ppm ont montré des altérations physiologiques. L'ochratoxine a une incidence néfaste sur la fonction testiculaire du rat et par conséquence 

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 sur les niveaux de testostérone.

   Il faut noter que l'ochratoxine A   s'est   montrée néphrotoxique pour toutes les espèces animales étudiées à ce jour (Delacruz and Bach, 1990, J.,   Biopharm.,     Sc.,   1,277- 304).   L'ochratoxine   A a également été identifiée comme l'agent responsable d'une pathologie humaine importante connue comme la Néphropathie Endémique des Balkans (Castegnero et al. 1990, Arch. Geschw., 60, 295-303) Des études épidémiologiques récentes montrent que l'incidence de la contamination humaine par l'ochratoxine est élevée puisqu'en France près de 20% de la population testée présentaient des taux sériques de 0,1 ng/ml (Creppy et al 1991 in Mycotoxin, Endemic Nephropathy and urinary Tract Tumours, International Agency for Research on Cancer scientific pub, 145-151).

   Il est probable que des études   épidémiologiques   à venir feront apparaître l'ampleur de ravages causés par cette toxine fongique. Il est à craindre qu'aucune population humaine ne soit à l'abri de l'exposition du fait de la vaste répartition géographique des moisissures contaminantes. 



  L'ochratoxine A inhibe la synthèse des protéines en entrant en compétition avec la phénylalanine pour la fixation sur le tRNA spécifique (Bunge et al., 1978, Biochem. Biophys. Res. Com., 83,398-405). Cette inhibition qui se marque principalement au niveau du foie, des reins et de la rate, peut être levée par l'addition de phénylalanine (Creppy et al, 1984, Foods Chem. Tox., 22,883-886). De plus, l'ochratoxine interfère avec le métabolisme des glucides et des lipides, ainsi qu'avec la fonction mitochondriale. 



  Un autre aspect particulièrement inquiétant de la toxicité de l'ochratoxine est son action tératogène. 



  Elle traverse la barrière placentaire chez le porc (Barnikol et Thalman, 1988, Tier. Umsch., 43,74-82) et elle affecte le développement du système nerveux. 

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  L'ochratoxine est génotoxique. Elle provoque des cassures mono-brins de l'ADN et provoque des adduits à l'ADN (Pfohl-Leszkowicz et al 1991, in Mycotoxin, Endemic Nephropathy and Urinary Tract Tumours, International Agency for Research on Cancer scientific pub, 245-253). Les adduits à   l'ADN   sont des bases azotées modifiées par liaisons covalentes de différents xénobiotiques. La présence de ces adduits signe les premières étapes de la transformation cancéreuse. Un autre effet inquiétant de l'ochratoxine 
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 est la modification des taux de méthyl-d-cytosine de l'ADN cellulaire. Les populations humaines exposées à   1'ochratoxine   A, comme celles qui souffrent de la Néphropathie Endémique des Balkans, montrent une incidence anormalement élevée de cancer du tractus urinaire.

   Cette observation a conduit au classement de l'ochratoxine A comme agent cancérogène potentiel par l'Agence Internationale de Recherche sur le Cancer (Lyon). Notons que le tropisme apparent des ochratoxines pour le testicule est particulièrement préoccupant quand on considère que ce sont les lignées germinales qui sont exposées aux risques de génotoxicité. 



  Les ochratoxines apparaissent donc comme un danger sérieux pour la santé humaine et animale, et l'action génotoxique est particulièrement préoccupante. Des recherches ont été menées afin de trouver les traitements qui limiteraient les effets nocifs de ces toxines. La superoxide dismutase associée à la catalase permettent de contrôler, dans une certaine mesure, ces effets génotoxiques. Elle diminue la fréquence des adduits à   l 1 ADN.   Cependant l'applicabilité in vivo dune thérapeutique basée sur la superoxyde dismutase et la catalase est problématique car elle se heurte à la difficulté de faire pénétrer les protéines dans l'organisme.

   Le seul moyen efficace   jusqu 1 à present   restant l'injection ou 

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 la voie parentérale avec toutes les difficultés qui sont liées à ce mode d'administration. De plus les effets secondaires d'un tel traitement sont loin d'être tous connus. 



  On l'a vu plus haut, la phénylalanine lèverait l'inhibition de la synthèse des protéines par l'ochratoxine. L'hypothèse que la phénylalanine contrecarre également les effets génotoxiques de   l'ochratoxines   était séduisante. Cependant la mise à l'épreuve de cette hypothèse sur le système expérimental du testicule de souris-démontra au contraire que la phénylalanine potentialisait la génotoxicité de l'ochratoxine. Cet effet se traduisait par une augmentation sensible du nombre d'adduits à   l'ADN   La phénylalanine n'ayant pas confirmé les espoirs mis en elle, le processus de recherche continua sur base de dérivés de cette molécule. C'est ainsi que l'aspartame, qui contient un résidu phénylalanine, fut testé. 



  Il apparut que l'administration orale de l'aspartame à des animaux artificiellement contaminés avec l'ochratoxine A diminuait ou éliminait totalement les adduits. 



  Il s'agit ici d'une amélioration marquante du traitement des effets nocifs des ochratoxines car une molécule unique, dont la sécurité d'emploi est très grande puisqu'elle est utilisée massivement par l'industrie alimentaire, permet de traiter efficacement les différentes facettes de la toxicité des ochratoxines. L'activité de l'aspartame à rencontre de l'apparition d'adduits à   l'ADN   ainsi que les modifications de la méthylation de l'ADN, qui sont des symptômes classiques de génotoxicité, permet de 

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 penser que le champ d'action de cette molécule puisse   s'étendre   à une large variété d'effets génotoxiques de causes multiples.

   Les traitements envisagés   jusqu'à   présent, qui n'avaient jamais quitté le laboratoire, ne s'adressaient qu'à l'inhibition de la synthèse des protéines pour la phénylalanine et à la diminution du taux d'adduit du DNA pour la superoxyde dismutase associée à la catalase. De plus l'efficacité de l'aspartame sur chacun de ces deux effets est supérieure à celle des traitements antérieurs. 



  La présente invention a pour objet une utilisation nouvelle de l'aspartame comme médicament. 



  Une activité médicamenteuse remarquable de l'aspartame est sa faculté d'empêcher la génotoxicité induite par les ochratoxines. La génotoxicité peut être caractérisée par la présence d'adduits à l'ADN. Une modification du taux de 5-methyl-d-cytosine est également un signe de génotoxicité causé par les ochratoxines. Ces deux phénomènes peuvent apparaître simultanément ou non. 



  Dans un aspect particulièrement avantageux, l'invention porte sur la propriété que possède   11 aspartame   de stimuler   11 excrétion   de l'ochratoxine. 



  Les effets bénéfiques de l'excrétion accrue de la toxine sont dans la réduction du temps d'exposition à la toxine. 



  L'invention a également pour objet l'utilisation de   11 aspartame comme   médicament pour lutter contre la néphrotoxicité induite par les ochratoxines. L'intérêt de cette invention vaut autant pour le bétail et la basse-cour que pour les êtres humains puisqu'il a été démontré que la Néphropathie Endémique des Balkans était causée par cette toxine et qu'il est probable 

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 que 11 incidence sur la santé humaine des effets de cette toxine soit actuellement sous-estimée. 



  L'invention porte également sur l'utilisation de l'aspartame pour lutter contre les autres effets nocifs des ochratoxines comme la toxicité testiculaire. 



  Suivant   11 invention, 11 aspartame   peut être administré afin de lutter contre les phénomènes de génotoxicité. 



  Selon un aspect particulier   de -11 invention,   11 aspartame peut être administré préventivement pour empêcher l'apparition des effets toxiques de   1lochratoxine.   Les effets toxiques étant entre autres la néphrotoxicité, la génotoxicité ainsi que la toxicité testiculaire. 



  L'aspartame peut être administré par toutes les voie classiques d'administration d'un médicament et plus particulièrement les voies orale, rectale ou parentérale. 



  Lorsqu'il est administrable par voie orale l'aspartame est dosé à 0,3 à 300 mg par kg de poids vif et avantageusement entre 3 et 30 mg par kg. 



  L'aspartame peut être combiné à d'autre substance ou médicament à action préventive comme le sélénium, les vitamines et plus particulièrement les vitamines C et E. 



   Exemple 1 : Effets de l'aspartame sur la néphrotoxicité de l'ochratoxine A (OTA). 



   A) Augmentation de 11 élimination urinaire de 11 OTA chez le rat et la souris. 

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 La première expérience est réalisée par gavage (sonde oesophagienne) de rats mâles de souche Wistar (Sexal France) pendant 21 jours. 



  Le lot témoin reçoit l'OTA seule à raison de 289   gg/kg   toutes les 48 h. 



  Le second lot est gavé par la même quantité d'OTA supplémentée par l'aspartame (25mg/kg). 



  24 h. avant le sacrifice, les animaux sont mis dans des cages métaboliques. 



  La seconde expérience a été réalisée sur des souris mâles de souche Swiss (Iffa-Credo, France), traitées par gavage unique avec les mêmes   quantités d'OTA   et d'OTA additionné d'aspartame que pour les rats. 



  24 h. après, les souris sont sacrifiées et l'urine est prélevée directement par ponction de la vessie. 



  Après prélèvement, les urines sont clarifiées puis   l'OTA   est dosée selon le protocole suivant : La méthode d'extraction est basée sur le coefficient de partage de l'OTA selon le pH entre les phases aqueuse et organique (Bauer et   Garés, 1987,   Z. Veterinârmed. B., 34,613-627 ; Hietanen et al., 1986, Drug Met. Dis., 14,118-126.). 



  L'échantillon à doser est acidifié par une solution HCl 0, 1 M/Mg C12   0, 2   M (v/v). Le pH est ajusté à 2,5 à l'aide de   HC1     IM.   LIOTA est extraite du milieu aqueux par 10 ml de   CHC13.   Après agitation vigoureuse pendant 3 min., la phase organique est récupérée. 



  Cette dernière est extraite par 2 fois 8 ml d'une solution   NaHC03   0,1 M. La phase aqueuse est alors récupérée, acidifiée à pH 2,5 puis réextraite par 10 ml de CHC13. 



  Ce dernier est prélevé puis évaporé à sec. Le résidu obtenu est repris par du méthanol et l'analyse de l'OTA est réalisée directement par HPLC. 



  L'éluant utilisé est composé du mélange suivant (ml) : méthanol/acetonitrile/acétate de Na 5 nM/acide acétique glacial   (300/300/400/14). L'élution   se fait avec un débit de 1 ml/min., le volume d'injection 

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 étant de 50 l, la colonne utilisée est une Sphérisorb ODS,   ICjUm     (30   x 0,   25   cm). 



  La détection est basée sur les propriétés de fluorescence de l'OTA et ses dérivés (Ex=340 nm, Em=465   nm.).   



  La confirmation de l'OTA est réalisée par   11 obtention   du dérivé   méthylé   et hydrolyse enzymatique postcolonne. 



   La formation du méthyl-ester est réalisée par le traitement de l'extrait à l'aide de la solution   méthano1/BF3   14% pendant 15 min à   600C   (AOAC. Methods, 1980,26, 96-102) la dégradation enzymatique se fait, après évaporation à sec, par addition de 100   gl   de solution de   carboxypeptidase A (37 mg prot./mg ; 55UI/mg prot. ) et   900   gl   de solution Tris 0, 08M/NaCl 2M, pH 7,5. (Hult et al., 1982, Arch.   Toxicol.,   51,313-321). 



  Résultats : Dosage de l'OTA dans l'urine chez le rat et la souris traités par l'OTA : Effets de l'aspartame. 
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<tb> 
<tb> rat <SEP> (ng/ml) <SEP> souris <SEP> (ng/ml)
<tb> gavage <SEP> OTA <SEP> seul <SEP> 185 <SEP> 2522 <SEP> 7
<tb> gavage <SEP> OTA <SEP> + <SEP> 280 <SEP> ¯ <SEP> 55 <SEP> 40 <SEP> ¯ <SEP> 17
<tb> aspartame
<tb> 
 B) Diminution de la protéinurie : Le dosage des protéines dans les urines est réalisé par la méthode de Bradford (1976, Anal. Biochem., 72,248-254). 



  Les animaux utilisés sont les mêmes rats que ceux utilisés précédemment. 



  Résultats : Effets de l'aspartame sur la protéinurie des rats gavés avec   289    g/kg/48 H. pendant 21 jours. 

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<tb> 
<tb> protéinurie
<tb> (mg/24H)
<tb> témoins <SEP> 4, <SEP> 68 <SEP> 0, <SEP> 37
<tb> gavage <SEP> OTA <SEP> seul <SEP> 7, <SEP> 14 <SEP> 1, <SEP> 47
<tb> gavage <SEP> OTA <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 6
<tb> 
 Exemple 2 : Effets   bénéfiques   de l'aspartame sur la génotoxicité de l'OTA sur le modèle testiculaire de rat. 



  La génotoxicité est suivie par la détection et la quantification des adduits à l'ADN ainsi que l'évaluation du taux de la 5-méthyl-d-cytosine (m5dC). 



  A/Les adduits à l'ADN Cette expérience est menée sur des rats mâles de souche Wistar gavés soit avec   l'OTA   seule (289   g/kg),   soit avec la même quantité d'OTA supplémentée par l'aspartame (25 mg/kg). 



  Après sacrifice des rats, les testicules sont rapidement prélevés, rincés avec NaCl 0,9% puis stockés   à-80 C jusqu'à l'analyse.   



  Cette dernière nécessite au préalable l'extraction et la purification de l'ADN selon le protocole suivant : le testicule est broyé dans un ml de tampon (Tris 100 mM, EDTA 50   MM,   NaCl 500 mM,   $   mercapto-éthanol 10 mM, SDS 1, 25%, pH 8). 
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  Après incubation à 600C pendant 10 min., on ajoute à 11 hamogénat brut 25 cl de solution de protéinase K à 20 mg/ml dans le tampon (NaCl 0, 1 M, EDTA 20 MM, Tris   50mM, pH   8). 



  Après une heure d'incubation à 37 C, les protéines sont précipitées en ajoutant 800 cl d'acétate de K 6M à pH S. Le surnageant est récupéré après centrifugation   (10 000g, 30 min. ), les filaments sont prélevés après   précipitation par 2 volumes d'éthanol (2 heures   à-   200C). 

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  Le précipité est repris par 500 gl du tampon précédent après lavage à l'éthanol et centrifugation. 



  Cet ADN brut est traité par 1   1   du mélange enzymatique (ribonucléase pancréatique A à 10 mg/ml et ribonucléase Tl à 5 000 UI/ml) à   370C   pendant 3 heures afin   d'éliminer 1'UN   résiduel. On ajoute alors un volume de phénol saturé en Tris-HCl. Après 20 min. d'agitation suivie d'une centrifugation à 10 000 g, le surnageant est prélevé et traité par le Sevag (chloroforme/alcool isoamylique : 24/1). 



  Une dernière précipitation de   l 1 ADN est effectuée   en 
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 ajoutant 2 volumes d'ethoxy-éthanol. Après incubation, 2 heures à-20 C, l'ADN est récupéré par centrifugation 10 000 g pendant 30 min. Après plusieurs lavages à l'éthoxy-éthanol, l'ADN pur est dissous dans de l'eau distillée. 



  Le dosage de 1 1 ADN est réalisé par spectrophotométrie UV. 



  La détection et la quantification des adduits à l'ADN se fait en plusieurs étapes (Randerath et coll., 1989, Carcinogenesis, 10, 1231-1239) sur l'ADN lyophilisé. L'étape enzymatique consiste en l'hydrolyse de cet ADN en nucléosides-3'P par addition du mélange enzymatique suivant :   11   de phosphodièstérase de rate (26 U/ml),   11   de nucléase de staphylocoque (500 U/ml), 2 cl de tampon succinate (200 mM)/CaC12 (lOOmM) à pH 6 et 6   gl   H20 et incubation 4 heures à   37OC.   



  Afin d'hydrolyser spécifiquement le P en 31 des nucléosides normaux, la nucléase Pi (1,5 gl de nucléase PI à 4  m/ml) est ajoutée dans le mélange réactionnel suivant : 1.6   gl   de ZnCl2 (lmM), 1, 6  l d'acétate de Na (1 M, pH 5) et 0,3   jul   H20. Au bout de 45 min à 37 C, la réaction est stoppée par addition de 3   gl   de Tris-base 500 mM. 



   Le marquage spécifique des nucléosides   3'P   se fait à l'aide de la T4 polynucléotide kinase dans le milieu alcalin composé de 2 gl de tampon Bicine, 100   Ci   de 

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 32P-ATP, 0,16   1   de T4 polynucléotide kinase (30 U/ l) et de 2,84 H20. 



   L'ATP résiduel est hydrolysé par addition de 2   gl   de solution d'apyrase (8 U/ml) à   370C   pendant 30 min. 



   Une série de chromatographies est réalisée pour purifier et isoler les adduits : - Migration Dl : Elle est réalisée sur couche mince (polyéthylèneimine-cellulose) avec du phosphate monosodique 2,3 M à pH 5,7 pendant 16 heures. 



  La zone contenant les adduits est découpée puis transférée pour subir une chromatographie bidimensionnelle. 



  - Migrations D2 et D3 : La D2 est effectuée sur le même type de support   (PEI-cellulose)   avec un solvant composé d'urée 8,5 M/formate de Li 5,3 M pH 3,5 dilué à 90%. Après lavage (H20) et séchage, D3 est effectuée perpendiculairement à D2 avec   l'éludant   suivant :   NaH2P04   0,7 M/urée 7 M dilué à 85 % à pH 6,4. 



  - Migration D4 : Il s'agit d'un lavage qui s'effectue dans le même sens que D3 par utilisation de NaH2P04 1,7 M à pH 6. 



  Les plaques sont autoradiographiées par fluorographie, les adduits sont récupérés, quantifiés et exprimés en nombre d'adduits pour 109 nucléotides. 



  B) La méthylation de la d-cytosine Le dosage de la 5-méthyl-d-cytosine se fait sur l'ADN hydrolysé (comme pour les adduits) avant d'employer la nucléase   PI,   les nucléotides sont marqués au 32P par utilisation du milieu réactionnel : 5  Ci de   32P,   1  l ATP à 1   mM,   3 U de T4 polynucléotide kinase, 1   gl   de tampon (Tris-HCl 50   mM,   pH9, MgC12 10   mM,   spermidine 1   mM,   ss-mercaptoéthanol 15 mM) et 7,4  l H20, une heure à 37 C. 



  LIATP résiduel est hydrolysé par addition de 2   J. Ll   d'apyrase au   1/125è,     ill   du mélange de   51nucléosides   et 7  l H20 à   370C   pendant 30 min. Sont alors ajoutés 10  l de nucléase PI (0,25  g/ l) et 1  l d'acétate 

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 d'ammonium à pH 4,5 à   37 C   durant 2 heures pour l'obtention des 5'nucléosides. 



  Une chromatographie bidimensionnelle est alors réalisée avec les éluants suivants : D1   (50ml   d'acide isobutyrique 10,7 M/1, 1 ml   d'ammoniaque/28,   9 ml H20) 16 heures ; D2, après séchage (100 ml de phosphate de Na 0,1 M/60 g de sulfate d'ammonium/2 ml de 1propanol) 2 heures. 



  Les spots sont alors récupérés puis quantifiés. 



  Les résultats sont exprimés en %   (% m5dC   = [m5dC]/ [m5dC] + [dC]). 



  Résultats : Effets de l'aspartame sur le nombre d'adduits à l'ADN dans le testicule de rats gavés avec 289  g/kg   d'OTA.   
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<tb> 
<tb> nbr. <SEP> d'adduits <SEP> pour
<tb> 109 <SEP> nucléotides
<tb> gavage <SEP> avec <SEP> OTA <SEP> seul10, <SEP> 5
<tb> gavage <SEP> avec <SEP> OTA <SEP> + <SEP> aspartame
<tb> 
 Effets de l'aspartame sur le nombre d'adduits à   l'ADN   pour 109 nucléotides dans le testicule de souris gavées par 289  g/kg   d'OTA.   
 EMI13.2 
 
<tb> 
<tb> nombre <SEP> d'
<tb> adduits
<tb> gavage <SEP> avec <SEP> OTA <SEP> seul14, <SEP> 5
<tb> gavage <SEP> avec <SEP> OTA <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 8, <SEP> 0
<tb> 
 Effets de l'aspartame sur le taux de m5dC dans le 
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 testicule de rats gavés avec 289 gg/kg d'OTA. 
 EMI13.4 
 
<tb> 
<tb> 



  % <SEP> de <SEP> m5dC
<tb> témoins <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> ¯ <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> gavage <SEP> avec <SEP> OTA <SEP> seul7, <SEP> 8 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> gavage <SEP> avec <SEP> OTA <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 3
<tb> 
 

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 Exemple 3 : Etude des effets de l'aspartame sur la synthèse des protéines in-vitro. 



  A) Modèle 1 : Cellules de testicules de souris en culture primaire. 



  Des testicules de souris sont prélevés et les cellules obtenues par dissociation enzymatique (collagénase) sont mises en culture primaire. 



  La synthèse des protéines est suivie par incorporation de leucine tritiée. 



  L'OTA avec ou sans aspartame (dans le même rapport qu'en in-vivo) est directement introduite dans le milieu au début de l'incubation dans un volume de proportion inférieure à 1%, le témoin est préparé dans les mêmes conditions. 



  Résultats : Effets de l'OTA et de l'aspartame sur la synthèse des protéines dans les cellules testiculaires de souris en culture primaire. 
 EMI14.1 
 
<tb> 
<tb> traitement <SEP> des <SEP> cellules <SEP> incorporation <SEP> de
<tb> leucine <SEP> (CAM)
<tb> témoins <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> 500
<tb> OTA <SEP> 0,25 <SEP> pu <SEP> 13 <SEP> 800 <SEP> 600
<tb> OTA <SEP> 2,5 <SEP> Hum <SEP> 14 <SEP> 600 <SEP> 100
<tb> OTA <SEP> 0,25 <SEP> J. <SEP> 1M <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 13 <SEP> 100 <SEP> 800
<tb> OTA <SEP> 2,5 <SEP> M+ <SEP> aspartame <SEP> 10 <SEP> 400 <SEP> 300
<tb> 
 B) Modèle 2 : Culture de cellules rein (VERO). 



  Les cellules VERO sont mis en culture dans le milieu   RPMI   supplémenté par 10% de sérum de veau foetal, 4% de glutamine et 2% de gentamycin. 



  La synthèse des protéines est suivie par la technique du pulse en utilisant la leucine tritiée. 



  LIOTA est ajoutée dans le milieu avec ou sans aspartame et comparé avec le témoin préparé dans les mêmes conditions. 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 Résultats : Effets de l'OTA et de l'aspartame sur la synthèse des protéines dans les cellules VERO. 
 EMI15.1 
 
<tb> 
<tb> traitement <SEP> des <SEP> cellules <SEP> pourcentage <SEP> de <SEP> synthèse
<tb> protéique
<tb> témoins <SEP> 100
<tb> OTA <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> pu <SEP> 90
<tb> OTA <SEP> 12 <SEP>  M <SEP> 55
<tb> OTA <SEP> 0,12 <SEP>  M <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 113
<tb> OTA <SEP> 12 <SEP>  M <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 71
<tb> 

Claims (16)

REVENDICATIONS.

1. Utilisation de l'aspartame en tant que principe actif pour la composition d'un médicament.

2. Utilisation d'une composition contenant une quantité efficace d'aspartame suivant la revendication 1 qui se caractérise en ce que l'activité médicamenteuse est antidotique des effets nocifs causés par les toxines de la famille des ochratoxines.

3. Utilisation d'une composition contenant une quantité efficace d'aspartame suivant les revendications 1 et 2 pour la protection contre les effets génotoxiques causés par les toxines de la famille des ochratoxines.

4. Utilisation d'une composition contenant une quantité efficace d'aspartame suivant les revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le traitement réduit le nombre d'adduits à l'ADN.

5. Utilisation d'une composition contenant une quantité efficace d'aspartame suivant les revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le traitement normalise le taux de 5méthyl cytosine modifié suite aux effets toxiques des ochratoxines.

6. Utilisation d'une composition contenant une quantité efficace d'aspartame suivant les revendications 1 et 2 pour la protection contre les effets néphrotoxiques causés par les toxines de la famille des ochratoxines, y compris la Néphropathie Endémique des Balkans.

7. Utilisation d'une composition contenant une quantité efficace d'aspartame suivant les revendications 1, 2 et 6 caractérisée en ce que le traitement réduit la protéinurie.

8. Utilisation d'une composition contenant une quantité efficace d'aspartame suivant les revendications 1, 2 et 6 caractérisée en ce que le traitement augmente l'élimination urinaire des ochratoxines. <Desc/Clms Page number 17>

9. Utilisation d'une composition contenant une quantité efficace d'aspartame suivant les revendications 1 et 2 pour la protection contre les effets toxiques sur le testicule causés par les toxines de la famille des ochratoxines.

10. Utilisation d'une composition contenant une quantité efficace d'aspartame suivant les revendications 1, 2 et 9 caractérisée en ce que le traitement rétablit les niveaux normaux de testostérones, déréglés par une exposition aux ochratoxines.

11. Présentations galéniques de l'aspartame pour utilisation selon les revendications 1 à 10.

12. Présentations galéniques de l'aspartame selon la revendication 11 caractérisées en ce qu'elles forment un prémélange destiné à l'alimentation animale.

13. Présentations galéniques selon la revendication 12 caractérisées en ce que l'aspartame est enrobé ou microencapsulé de manière à rendre son gout imperceptible.

14. Un mode préféré de présentation galénique selon la revendication 11 en comprimé, gélule ou autre, caractérisée en ce qu'elle s'adresse à l'administration humaine par voie orale.

15. Présentation galénique selon les revendications 11 à 14 caractérisée en ce qu'elle assure un dosage en aspartame de 0.3 à 300 mg/kg de poids vif.

16. Présentation galénique selon la revendication 15 caractérisée en ce qu'elle assure un dosage en aspartame de 3 à 30 mg/kg de poids vif.