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ACTIVITE MEDICAMENTEUSE DE L'ASPARTAME.
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L'aspartame, N-L-a-Aspartyl-L-phenylalanine - 1 - methyl ester, est une molécule bien connue, utilisée quotidiennement par des millions de personnes pour son pouvoir édulcorant exceptionnel. Elle est commercialisée, entre autres, sous les marques Canderel et NutraSweet. L'objet de cette invention porte sur une utilisation nouvelle de l'aspartame comme médicament.
L'invention concerne l'utilisation de l'aspartame afin de combattre les effets toxiques causés chez l'animal comme chez l'homme par les toxines fongiques de la famille des ochratoxines.
L'invention se rapporte à l'activité médicamenteuse de l'aspartame qui favorise l'excrétion, notament l'excrétion urinaire, des ochratoxines. Cette activité médicamenteuse est également remarquable par le fait qu'elle contrecarre les modifications de l'ADN induites par les toxines de la famille des Ochratoxines. L'invention porte donc également sur l'effet l'activité de l'aspartame à rencontre de l'effet génotoxique des ochratoxines.
L'invention concerne aussi l'activité de l'aspartame vis-à-vis la nephrotoxicité et de la toxicité testiculaire induites par 11 exposition aux ochratoxines Les ochratoxines sont des métabolites toxiques dont la production a initialement été décrite chez le champignon Aspergillus ochraceus Wilh. (Van der merwe et al., 1965, Nature, 205,1112-1113). Ensuite, il a a été découvert que d'autres champignons de la famille des Aspergillus, et aussi de la famille des
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Penicillium produisaient ce type de toxines (Harvig et al, 1983, Hand. of foodb. of Biol. orig ; 193-238). Ces champignons, que l'on appelle couramment des moisissures, sont particulièrement répandus. Ils colonisent les céréales et les légumes durant leur stockage.
Les toxines que produisent ces champignons contaminent alors les denrées et entrent dans la chaîne alimentaire. Elles sont alors retrouvées également dans les produits animaux (Kuiper-Goodman et Scott, 1989, Biomed. and envir. Sci, 2,179-248).
Trois types d'ochratoxines ont été décrites, l'ochratoxine A, son dérivé non chloré B, et l'ester éthylique ou méthylique C (The Merck Index, 11th edition) ainsi que des dérivés, la plus étudiée étant l'ochratoxine A, en abrégé OTA. La toxicité de la forme C est comparable à celle de la forme A.
L'ochratoxine A ingérée par voie orale, qui est la voie naturelle de contamination, est rapidement absorbée par la paroi gastrique. Dans le flux sanguin, l'ochratoxine se lie à la sérum albumine (Galtier et al., 1981, Food Cosm. Tox, 19,735-738) ce qui a pour effet d'augmenter sa durée de vie dans l'organisme. A titre d'exemple la demi-vie de l'ochratoxine est de 500 heures chez le singe (Hagelberg, (1989) $), de 72 à 120 heures chez le porc (Galtier et al, 1980, Food Cosm. Tox, 18,493-496). La toxine est excrétée par voie urinaire et fécale.
Les effets toxiques de l'ochratoxine A sont bien connus, sa principale action s'exerce sur le rein. Les études de toxicité subchronique menées chez le rat avec des doses allant de 15 à 370 g/kg, soit l'équivalent d'une contamination naturelle de la nourriture à 0,2 à 5 ppm ont montré des altérations physiologiques. L'ochratoxine a une incidence néfaste sur la fonction testiculaire du rat et par conséquence
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sur les niveaux de testostérone.
Il faut noter que l'ochratoxine A s'est montrée néphrotoxique pour toutes les espèces animales étudiées à ce jour (Delacruz and Bach, 1990, J., Biopharm., Sc., 1,277- 304). L'ochratoxine A a également été identifiée comme l'agent responsable d'une pathologie humaine importante connue comme la Néphropathie Endémique des Balkans (Castegnero et al. 1990, Arch. Geschw., 60, 295-303) Des études épidémiologiques récentes montrent que l'incidence de la contamination humaine par l'ochratoxine est élevée puisqu'en France près de 20% de la population testée présentaient des taux sériques de 0,1 ng/ml (Creppy et al 1991 in Mycotoxin, Endemic Nephropathy and urinary Tract Tumours, International Agency for Research on Cancer scientific pub, 145-151).
Il est probable que des études épidémiologiques à venir feront apparaître l'ampleur de ravages causés par cette toxine fongique. Il est à craindre qu'aucune population humaine ne soit à l'abri de l'exposition du fait de la vaste répartition géographique des moisissures contaminantes.
L'ochratoxine A inhibe la synthèse des protéines en entrant en compétition avec la phénylalanine pour la fixation sur le tRNA spécifique (Bunge et al., 1978, Biochem. Biophys. Res. Com., 83,398-405). Cette inhibition qui se marque principalement au niveau du foie, des reins et de la rate, peut être levée par l'addition de phénylalanine (Creppy et al, 1984, Foods Chem. Tox., 22,883-886). De plus, l'ochratoxine interfère avec le métabolisme des glucides et des lipides, ainsi qu'avec la fonction mitochondriale.
Un autre aspect particulièrement inquiétant de la toxicité de l'ochratoxine est son action tératogène.
Elle traverse la barrière placentaire chez le porc (Barnikol et Thalman, 1988, Tier. Umsch., 43,74-82) et elle affecte le développement du système nerveux.
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L'ochratoxine est génotoxique. Elle provoque des cassures mono-brins de l'ADN et provoque des adduits à l'ADN (Pfohl-Leszkowicz et al 1991, in Mycotoxin, Endemic Nephropathy and Urinary Tract Tumours, International Agency for Research on Cancer scientific pub, 245-253). Les adduits à l'ADN sont des bases azotées modifiées par liaisons covalentes de différents xénobiotiques. La présence de ces adduits signe les premières étapes de la transformation cancéreuse. Un autre effet inquiétant de l'ochratoxine
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est la modification des taux de méthyl-d-cytosine de l'ADN cellulaire. Les populations humaines exposées à 1'ochratoxine A, comme celles qui souffrent de la Néphropathie Endémique des Balkans, montrent une incidence anormalement élevée de cancer du tractus urinaire.
Cette observation a conduit au classement de l'ochratoxine A comme agent cancérogène potentiel par l'Agence Internationale de Recherche sur le Cancer (Lyon). Notons que le tropisme apparent des ochratoxines pour le testicule est particulièrement préoccupant quand on considère que ce sont les lignées germinales qui sont exposées aux risques de génotoxicité.
Les ochratoxines apparaissent donc comme un danger sérieux pour la santé humaine et animale, et l'action génotoxique est particulièrement préoccupante. Des recherches ont été menées afin de trouver les traitements qui limiteraient les effets nocifs de ces toxines. La superoxide dismutase associée à la catalase permettent de contrôler, dans une certaine mesure, ces effets génotoxiques. Elle diminue la fréquence des adduits à l 1 ADN. Cependant l'applicabilité in vivo dune thérapeutique basée sur la superoxyde dismutase et la catalase est problématique car elle se heurte à la difficulté de faire pénétrer les protéines dans l'organisme.
Le seul moyen efficace jusqu 1 à present restant l'injection ou
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la voie parentérale avec toutes les difficultés qui sont liées à ce mode d'administration. De plus les effets secondaires d'un tel traitement sont loin d'être tous connus.
On l'a vu plus haut, la phénylalanine lèverait l'inhibition de la synthèse des protéines par l'ochratoxine. L'hypothèse que la phénylalanine contrecarre également les effets génotoxiques de l'ochratoxines était séduisante. Cependant la mise à l'épreuve de cette hypothèse sur le système expérimental du testicule de souris-démontra au contraire que la phénylalanine potentialisait la génotoxicité de l'ochratoxine. Cet effet se traduisait par une augmentation sensible du nombre d'adduits à l'ADN La phénylalanine n'ayant pas confirmé les espoirs mis en elle, le processus de recherche continua sur base de dérivés de cette molécule. C'est ainsi que l'aspartame, qui contient un résidu phénylalanine, fut testé.
Il apparut que l'administration orale de l'aspartame à des animaux artificiellement contaminés avec l'ochratoxine A diminuait ou éliminait totalement les adduits.
Il s'agit ici d'une amélioration marquante du traitement des effets nocifs des ochratoxines car une molécule unique, dont la sécurité d'emploi est très grande puisqu'elle est utilisée massivement par l'industrie alimentaire, permet de traiter efficacement les différentes facettes de la toxicité des ochratoxines. L'activité de l'aspartame à rencontre de l'apparition d'adduits à l'ADN ainsi que les modifications de la méthylation de l'ADN, qui sont des symptômes classiques de génotoxicité, permet de
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penser que le champ d'action de cette molécule puisse s'étendre à une large variété d'effets génotoxiques de causes multiples.
Les traitements envisagés jusqu'à présent, qui n'avaient jamais quitté le laboratoire, ne s'adressaient qu'à l'inhibition de la synthèse des protéines pour la phénylalanine et à la diminution du taux d'adduit du DNA pour la superoxyde dismutase associée à la catalase. De plus l'efficacité de l'aspartame sur chacun de ces deux effets est supérieure à celle des traitements antérieurs.
La présente invention a pour objet une utilisation nouvelle de l'aspartame comme médicament.
Une activité médicamenteuse remarquable de l'aspartame est sa faculté d'empêcher la génotoxicité induite par les ochratoxines. La génotoxicité peut être caractérisée par la présence d'adduits à l'ADN. Une modification du taux de 5-methyl-d-cytosine est également un signe de génotoxicité causé par les ochratoxines. Ces deux phénomènes peuvent apparaître simultanément ou non.
Dans un aspect particulièrement avantageux, l'invention porte sur la propriété que possède 11 aspartame de stimuler 11 excrétion de l'ochratoxine.
Les effets bénéfiques de l'excrétion accrue de la toxine sont dans la réduction du temps d'exposition à la toxine.
L'invention a également pour objet l'utilisation de 11 aspartame comme médicament pour lutter contre la néphrotoxicité induite par les ochratoxines. L'intérêt de cette invention vaut autant pour le bétail et la basse-cour que pour les êtres humains puisqu'il a été démontré que la Néphropathie Endémique des Balkans était causée par cette toxine et qu'il est probable
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que 11 incidence sur la santé humaine des effets de cette toxine soit actuellement sous-estimée.
L'invention porte également sur l'utilisation de l'aspartame pour lutter contre les autres effets nocifs des ochratoxines comme la toxicité testiculaire.
Suivant 11 invention, 11 aspartame peut être administré afin de lutter contre les phénomènes de génotoxicité.
Selon un aspect particulier de -11 invention, 11 aspartame peut être administré préventivement pour empêcher l'apparition des effets toxiques de 1lochratoxine. Les effets toxiques étant entre autres la néphrotoxicité, la génotoxicité ainsi que la toxicité testiculaire.
L'aspartame peut être administré par toutes les voie classiques d'administration d'un médicament et plus particulièrement les voies orale, rectale ou parentérale.
Lorsqu'il est administrable par voie orale l'aspartame est dosé à 0,3 à 300 mg par kg de poids vif et avantageusement entre 3 et 30 mg par kg.
L'aspartame peut être combiné à d'autre substance ou médicament à action préventive comme le sélénium, les vitamines et plus particulièrement les vitamines C et E.
Exemple 1 : Effets de l'aspartame sur la néphrotoxicité de l'ochratoxine A (OTA).
A) Augmentation de 11 élimination urinaire de 11 OTA chez le rat et la souris.
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La première expérience est réalisée par gavage (sonde oesophagienne) de rats mâles de souche Wistar (Sexal France) pendant 21 jours.
Le lot témoin reçoit l'OTA seule à raison de 289 gg/kg toutes les 48 h.
Le second lot est gavé par la même quantité d'OTA supplémentée par l'aspartame (25mg/kg).
24 h. avant le sacrifice, les animaux sont mis dans des cages métaboliques.
La seconde expérience a été réalisée sur des souris mâles de souche Swiss (Iffa-Credo, France), traitées par gavage unique avec les mêmes quantités d'OTA et d'OTA additionné d'aspartame que pour les rats.
24 h. après, les souris sont sacrifiées et l'urine est prélevée directement par ponction de la vessie.
Après prélèvement, les urines sont clarifiées puis l'OTA est dosée selon le protocole suivant : La méthode d'extraction est basée sur le coefficient de partage de l'OTA selon le pH entre les phases aqueuse et organique (Bauer et Garés, 1987, Z. Veterinârmed. B., 34,613-627 ; Hietanen et al., 1986, Drug Met. Dis., 14,118-126.).
L'échantillon à doser est acidifié par une solution HCl 0, 1 M/Mg C12 0, 2 M (v/v). Le pH est ajusté à 2,5 à l'aide de HC1 IM. LIOTA est extraite du milieu aqueux par 10 ml de CHC13. Après agitation vigoureuse pendant 3 min., la phase organique est récupérée.
Cette dernière est extraite par 2 fois 8 ml d'une solution NaHC03 0,1 M. La phase aqueuse est alors récupérée, acidifiée à pH 2,5 puis réextraite par 10 ml de CHC13.
Ce dernier est prélevé puis évaporé à sec. Le résidu obtenu est repris par du méthanol et l'analyse de l'OTA est réalisée directement par HPLC.
L'éluant utilisé est composé du mélange suivant (ml) : méthanol/acetonitrile/acétate de Na 5 nM/acide acétique glacial (300/300/400/14). L'élution se fait avec un débit de 1 ml/min., le volume d'injection
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étant de 50 l, la colonne utilisée est une Sphérisorb ODS, ICjUm (30 x 0, 25 cm).
La détection est basée sur les propriétés de fluorescence de l'OTA et ses dérivés (Ex=340 nm, Em=465 nm.).
La confirmation de l'OTA est réalisée par 11 obtention du dérivé méthylé et hydrolyse enzymatique postcolonne.
La formation du méthyl-ester est réalisée par le traitement de l'extrait à l'aide de la solution méthano1/BF3 14% pendant 15 min à 600C (AOAC. Methods, 1980,26, 96-102) la dégradation enzymatique se fait, après évaporation à sec, par addition de 100 gl de solution de carboxypeptidase A (37 mg prot./mg ; 55UI/mg prot. ) et 900 gl de solution Tris 0, 08M/NaCl 2M, pH 7,5. (Hult et al., 1982, Arch. Toxicol., 51,313-321).
Résultats : Dosage de l'OTA dans l'urine chez le rat et la souris traités par l'OTA : Effets de l'aspartame.
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<tb>
<tb> rat <SEP> (ng/ml) <SEP> souris <SEP> (ng/ml)
<tb> gavage <SEP> OTA <SEP> seul <SEP> 185 <SEP> 2522 <SEP> 7
<tb> gavage <SEP> OTA <SEP> + <SEP> 280 <SEP> ¯ <SEP> 55 <SEP> 40 <SEP> ¯ <SEP> 17
<tb> aspartame
<tb>
B) Diminution de la protéinurie : Le dosage des protéines dans les urines est réalisé par la méthode de Bradford (1976, Anal. Biochem., 72,248-254).
Les animaux utilisés sont les mêmes rats que ceux utilisés précédemment.
Résultats : Effets de l'aspartame sur la protéinurie des rats gavés avec 289 g/kg/48 H. pendant 21 jours.
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<tb>
<tb> protéinurie
<tb> (mg/24H)
<tb> témoins <SEP> 4, <SEP> 68 <SEP> 0, <SEP> 37
<tb> gavage <SEP> OTA <SEP> seul <SEP> 7, <SEP> 14 <SEP> 1, <SEP> 47
<tb> gavage <SEP> OTA <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 6
<tb>
Exemple 2 : Effets bénéfiques de l'aspartame sur la génotoxicité de l'OTA sur le modèle testiculaire de rat.
La génotoxicité est suivie par la détection et la quantification des adduits à l'ADN ainsi que l'évaluation du taux de la 5-méthyl-d-cytosine (m5dC).
A/Les adduits à l'ADN Cette expérience est menée sur des rats mâles de souche Wistar gavés soit avec l'OTA seule (289 g/kg), soit avec la même quantité d'OTA supplémentée par l'aspartame (25 mg/kg).
Après sacrifice des rats, les testicules sont rapidement prélevés, rincés avec NaCl 0,9% puis stockés à-80 C jusqu'à l'analyse.
Cette dernière nécessite au préalable l'extraction et la purification de l'ADN selon le protocole suivant : le testicule est broyé dans un ml de tampon (Tris 100 mM, EDTA 50 MM, NaCl 500 mM, $ mercapto-éthanol 10 mM, SDS 1, 25%, pH 8).
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Après incubation à 600C pendant 10 min., on ajoute à 11 hamogénat brut 25 cl de solution de protéinase K à 20 mg/ml dans le tampon (NaCl 0, 1 M, EDTA 20 MM, Tris 50mM, pH 8).
Après une heure d'incubation à 37 C, les protéines sont précipitées en ajoutant 800 cl d'acétate de K 6M à pH S. Le surnageant est récupéré après centrifugation (10 000g, 30 min. ), les filaments sont prélevés après précipitation par 2 volumes d'éthanol (2 heures à- 200C).
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Le précipité est repris par 500 gl du tampon précédent après lavage à l'éthanol et centrifugation.
Cet ADN brut est traité par 1 1 du mélange enzymatique (ribonucléase pancréatique A à 10 mg/ml et ribonucléase Tl à 5 000 UI/ml) à 370C pendant 3 heures afin d'éliminer 1'UN résiduel. On ajoute alors un volume de phénol saturé en Tris-HCl. Après 20 min. d'agitation suivie d'une centrifugation à 10 000 g, le surnageant est prélevé et traité par le Sevag (chloroforme/alcool isoamylique : 24/1).
Une dernière précipitation de l 1 ADN est effectuée en
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ajoutant 2 volumes d'ethoxy-éthanol. Après incubation, 2 heures à-20 C, l'ADN est récupéré par centrifugation 10 000 g pendant 30 min. Après plusieurs lavages à l'éthoxy-éthanol, l'ADN pur est dissous dans de l'eau distillée.
Le dosage de 1 1 ADN est réalisé par spectrophotométrie UV.
La détection et la quantification des adduits à l'ADN se fait en plusieurs étapes (Randerath et coll., 1989, Carcinogenesis, 10, 1231-1239) sur l'ADN lyophilisé. L'étape enzymatique consiste en l'hydrolyse de cet ADN en nucléosides-3'P par addition du mélange enzymatique suivant : 11 de phosphodièstérase de rate (26 U/ml), 11 de nucléase de staphylocoque (500 U/ml), 2 cl de tampon succinate (200 mM)/CaC12 (lOOmM) à pH 6 et 6 gl H20 et incubation 4 heures à 37OC.
Afin d'hydrolyser spécifiquement le P en 31 des nucléosides normaux, la nucléase Pi (1,5 gl de nucléase PI à 4 m/ml) est ajoutée dans le mélange réactionnel suivant : 1.6 gl de ZnCl2 (lmM), 1, 6 l d'acétate de Na (1 M, pH 5) et 0,3 jul H20. Au bout de 45 min à 37 C, la réaction est stoppée par addition de 3 gl de Tris-base 500 mM.
Le marquage spécifique des nucléosides 3'P se fait à l'aide de la T4 polynucléotide kinase dans le milieu alcalin composé de 2 gl de tampon Bicine, 100 Ci de
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32P-ATP, 0,16 1 de T4 polynucléotide kinase (30 U/ l) et de 2,84 H20.
L'ATP résiduel est hydrolysé par addition de 2 gl de solution d'apyrase (8 U/ml) à 370C pendant 30 min.
Une série de chromatographies est réalisée pour purifier et isoler les adduits : - Migration Dl : Elle est réalisée sur couche mince (polyéthylèneimine-cellulose) avec du phosphate monosodique 2,3 M à pH 5,7 pendant 16 heures.
La zone contenant les adduits est découpée puis transférée pour subir une chromatographie bidimensionnelle.
- Migrations D2 et D3 : La D2 est effectuée sur le même type de support (PEI-cellulose) avec un solvant composé d'urée 8,5 M/formate de Li 5,3 M pH 3,5 dilué à 90%. Après lavage (H20) et séchage, D3 est effectuée perpendiculairement à D2 avec l'éludant suivant : NaH2P04 0,7 M/urée 7 M dilué à 85 % à pH 6,4.
- Migration D4 : Il s'agit d'un lavage qui s'effectue dans le même sens que D3 par utilisation de NaH2P04 1,7 M à pH 6.
Les plaques sont autoradiographiées par fluorographie, les adduits sont récupérés, quantifiés et exprimés en nombre d'adduits pour 109 nucléotides.
B) La méthylation de la d-cytosine Le dosage de la 5-méthyl-d-cytosine se fait sur l'ADN hydrolysé (comme pour les adduits) avant d'employer la nucléase PI, les nucléotides sont marqués au 32P par utilisation du milieu réactionnel : 5 Ci de 32P, 1 l ATP à 1 mM, 3 U de T4 polynucléotide kinase, 1 gl de tampon (Tris-HCl 50 mM, pH9, MgC12 10 mM, spermidine 1 mM, ss-mercaptoéthanol 15 mM) et 7,4 l H20, une heure à 37 C.
LIATP résiduel est hydrolysé par addition de 2 J. Ll d'apyrase au 1/125è, ill du mélange de 51nucléosides et 7 l H20 à 370C pendant 30 min. Sont alors ajoutés 10 l de nucléase PI (0,25 g/ l) et 1 l d'acétate
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d'ammonium à pH 4,5 à 37 C durant 2 heures pour l'obtention des 5'nucléosides.
Une chromatographie bidimensionnelle est alors réalisée avec les éluants suivants : D1 (50ml d'acide isobutyrique 10,7 M/1, 1 ml d'ammoniaque/28, 9 ml H20) 16 heures ; D2, après séchage (100 ml de phosphate de Na 0,1 M/60 g de sulfate d'ammonium/2 ml de 1propanol) 2 heures.
Les spots sont alors récupérés puis quantifiés.
Les résultats sont exprimés en % (% m5dC = [m5dC]/ [m5dC] + [dC]).
Résultats : Effets de l'aspartame sur le nombre d'adduits à l'ADN dans le testicule de rats gavés avec 289 g/kg d'OTA.
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<tb>
<tb> nbr. <SEP> d'adduits <SEP> pour
<tb> 109 <SEP> nucléotides
<tb> gavage <SEP> avec <SEP> OTA <SEP> seul10, <SEP> 5
<tb> gavage <SEP> avec <SEP> OTA <SEP> + <SEP> aspartame
<tb>
Effets de l'aspartame sur le nombre d'adduits à l'ADN pour 109 nucléotides dans le testicule de souris gavées par 289 g/kg d'OTA.
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<tb>
<tb> nombre <SEP> d'
<tb> adduits
<tb> gavage <SEP> avec <SEP> OTA <SEP> seul14, <SEP> 5
<tb> gavage <SEP> avec <SEP> OTA <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 8, <SEP> 0
<tb>
Effets de l'aspartame sur le taux de m5dC dans le
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testicule de rats gavés avec 289 gg/kg d'OTA.
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<tb>
<tb>
% <SEP> de <SEP> m5dC
<tb> témoins <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> ¯ <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> gavage <SEP> avec <SEP> OTA <SEP> seul7, <SEP> 8 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> gavage <SEP> avec <SEP> OTA <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 3
<tb>
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Exemple 3 : Etude des effets de l'aspartame sur la synthèse des protéines in-vitro.
A) Modèle 1 : Cellules de testicules de souris en culture primaire.
Des testicules de souris sont prélevés et les cellules obtenues par dissociation enzymatique (collagénase) sont mises en culture primaire.
La synthèse des protéines est suivie par incorporation de leucine tritiée.
L'OTA avec ou sans aspartame (dans le même rapport qu'en in-vivo) est directement introduite dans le milieu au début de l'incubation dans un volume de proportion inférieure à 1%, le témoin est préparé dans les mêmes conditions.
Résultats : Effets de l'OTA et de l'aspartame sur la synthèse des protéines dans les cellules testiculaires de souris en culture primaire.
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<tb>
<tb> traitement <SEP> des <SEP> cellules <SEP> incorporation <SEP> de
<tb> leucine <SEP> (CAM)
<tb> témoins <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> 500
<tb> OTA <SEP> 0,25 <SEP> pu <SEP> 13 <SEP> 800 <SEP> 600
<tb> OTA <SEP> 2,5 <SEP> Hum <SEP> 14 <SEP> 600 <SEP> 100
<tb> OTA <SEP> 0,25 <SEP> J. <SEP> 1M <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 13 <SEP> 100 <SEP> 800
<tb> OTA <SEP> 2,5 <SEP> M+ <SEP> aspartame <SEP> 10 <SEP> 400 <SEP> 300
<tb>
B) Modèle 2 : Culture de cellules rein (VERO).
Les cellules VERO sont mis en culture dans le milieu RPMI supplémenté par 10% de sérum de veau foetal, 4% de glutamine et 2% de gentamycin.
La synthèse des protéines est suivie par la technique du pulse en utilisant la leucine tritiée.
LIOTA est ajoutée dans le milieu avec ou sans aspartame et comparé avec le témoin préparé dans les mêmes conditions.
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Résultats : Effets de l'OTA et de l'aspartame sur la synthèse des protéines dans les cellules VERO.
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<tb>
<tb> traitement <SEP> des <SEP> cellules <SEP> pourcentage <SEP> de <SEP> synthèse
<tb> protéique
<tb> témoins <SEP> 100
<tb> OTA <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> pu <SEP> 90
<tb> OTA <SEP> 12 <SEP> M <SEP> 55
<tb> OTA <SEP> 0,12 <SEP> M <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 113
<tb> OTA <SEP> 12 <SEP> M <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 71
<tb>
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MEDICINAL ACTIVITY OF ASPARTAME.
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Aspartame, N-L-a-Aspartyl-L-phenylalanine - 1 - methyl ester, is a well-known molecule used daily by millions of people for its exceptional sweetening power. It is marketed, among others, under the brands Canderel and NutraSweet. The object of this invention relates to a new use of aspartame as a medicament.
The invention relates to the use of aspartame in order to combat the toxic effects caused in animals and in humans by fungal toxins of the ochratoxin family.
The invention relates to the medicinal activity of aspartame which promotes the excretion, in particular the urinary excretion, of ochratoxins. This drug activity is also remarkable for the fact that it counteracts the DNA modifications induced by toxins of the Ochratoxin family. The invention therefore also relates to the effect of the activity of aspartame against the genotoxic effect of ochratoxins.
The invention also relates to the activity of aspartame with respect to nephrotoxicity and testicular toxicity induced by exposure to ochratoxins Ochratoxins are toxic metabolites whose production was initially described in the fungus Aspergillus ochraceus Wilh. (Van der Merwe et al., 1965, Nature, 205, 1112-1113). Then it was discovered that other fungi from the Aspergillus family, and also from the
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Penicillium produced this type of toxin (Harvig et al, 1983, Hand. Of foodb. Of Biol. Orig; 193-238). These fungi, commonly known as molds, are particularly common. They colonize cereals and vegetables during storage.
The toxins produced by these fungi then contaminate food and enter the food chain. They are then also found in animal products (Kuiper-Goodman and Scott, 1989, Biomed. And envir. Sci, 2,179-248).
Three types of ochratoxins have been described, ochratoxin A, its non-chlorinated derivative B, and ethyl or methyl ester C (The Merck Index, 11th edition) as well as derivatives, the most studied being ochratoxin A, abbreviated as OTA. The toxicity of form C is comparable to that of form A.
Ochratoxin A taken orally, which is the natural route of contamination, is rapidly absorbed from the stomach wall. In the blood stream, ochratoxin binds to serum albumin (Galtier et al., 1981, Food Cosm. Tox, 19,735-738) which has the effect of increasing its lifespan in the organism. For example, the half-life of ochratoxin is 500 hours in monkeys (Hagelberg, (1989) $), 72 to 120 hours in pigs (Galtier et al, 1980, Food Cosm. Tox, 18,493 -496). The toxin is excreted via the urine and feces.
The toxic effects of ochratoxin A are well known, its main action is on the kidney. Subchronic toxicity studies in rats with doses ranging from 15 to 370 g / kg, the equivalent of natural contamination of food at 0.2 to 5 ppm, have shown physiological changes. Ochratoxin adversely affects the testicular function of the rat and therefore
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on testosterone levels.
It should be noted that ochratoxin A has been shown to be nephrotoxic for all the animal species studied to date (Delacruz and Bach, 1990, J., Biopharm., Sc., 1,277-304). Ochratoxin A has also been identified as the agent responsible for an important human pathology known as Endemic Balkan Nephropathy (Castegnero et al. 1990, Arch. Geschw., 60, 295-303) Recent epidemiological studies show that the incidence of human contamination by ochratoxin is high since in France almost 20% of the population tested had serum levels of 0.1 ng / ml (Creppy et al 1991 in Mycotoxin, Endemic Nephropathy and urinary Tract Tumors , International Agency for Research on Cancer scientific pub, 145-151).
It is likely that future epidemiological studies will reveal the extent of the ravages caused by this fungal toxin. It is to be feared that no human population is safe from exposure due to the wide geographic distribution of contaminating molds.
Ochratoxin A inhibits protein synthesis by competing with phenylalanine for binding to specific tRNA (Bunge et al., 1978, Biochem. Biophys. Res. Com., 83,398-405). This inhibition, which is mainly marked in the liver, kidneys and spleen, can be lifted by the addition of phenylalanine (Creppy et al, 1984, Foods Chem. Tox., 22,883-886). In addition, ochratoxin interferes with carbohydrate and lipid metabolism, as well as with mitochondrial function.
Another particularly worrying aspect of the toxicity of ochratoxin is its teratogenic action.
It crosses the placental barrier in pigs (Barnikol and Thalman, 1988, Tier. Umsch., 43,74-82) and it affects the development of the nervous system.
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Ochratoxin is genotoxic. It causes DNA single-strand breaks and causes DNA adducts (Pfohl-Leszkowicz et al 1991, in Mycotoxin, Endemic Nephropathy and Urinary Tract Tumours, International Agency for Research on Cancer scientific pub, 245-253) . DNA adducts are nitrogenous bases modified by covalent bonds of different xenobiotics. The presence of these adducts signals the first stages of cancerous transformation. Another worrying effect of ochratoxin
EMI4.1
is the modification of methyl-d-cytosine levels in cellular DNA. Human populations exposed to ochratoxin A, such as those suffering from Endemic Balkan Nephropathy, show an abnormally high incidence of cancer of the urinary tract.
This observation led to the classification of ochratoxin A as a potential carcinogenic agent by the International Agency for Research on Cancer (Lyon). Note that the apparent tropism of ochratoxins for the testis is particularly worrying when we consider that it is the germ lines that are exposed to the risks of genotoxicity.
Ochratoxins therefore appear to be a serious danger to human and animal health, and genotoxic action is of particular concern. Research has been done to find treatments that would limit the harmful effects of these toxins. The superoxide dismutase associated with catalase makes it possible to control, to a certain extent, these genotoxic effects. It decreases the frequency of adducts to DNA. However, the in vivo applicability of a therapy based on superoxide dismutase and catalase is problematic because it comes up against the difficulty of getting proteins into the body.
The only effective way until now remains the injection or
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the parenteral route with all the difficulties associated with this mode of administration. In addition, the side effects of such a treatment are far from all known.
As we saw above, phenylalanine would lift the inhibition of protein synthesis by ochratoxin. The hypothesis that phenylalanine also counteracts the genotoxic effects of ochratoxins was attractive. However, testing this hypothesis on the experimental system of the mouse testis-demonstrated on the contrary that phenylalanine potentiated the genotoxicity of ochratoxin. This effect resulted in a significant increase in the number of DNA adducts. Phenylalanine did not confirm the hopes placed in it, the research process continued on the basis of derivatives of this molecule. This is how aspartame, which contains a phenylalanine residue, was tested.
It appeared that the oral administration of aspartame to animals artificially contaminated with ochratoxin A reduced or completely eliminated the adducts.
This is a significant improvement in the treatment of the harmful effects of ochratoxins because a single molecule, the safety of which is very high since it is used massively by the food industry, makes it possible to effectively treat the different facets ochratoxin toxicity. The activity of aspartame against the appearance of DNA adducts as well as changes in DNA methylation, which are classic symptoms of genotoxicity, makes it possible to
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think that the field of action of this molecule can extend to a wide variety of genotoxic effects from multiple causes.
The treatments considered until now, which had never left the laboratory, were only intended to inhibit protein synthesis for phenylalanine and to decrease the rate of DNA adduct for superoxide dismutase associated with catalase. In addition, the efficacy of aspartame on each of these two effects is greater than that of previous treatments.
The present invention relates to a new use of aspartame as a medicament.
A remarkable medicinal activity of aspartame is its ability to prevent the genotoxicity induced by ochratoxins. Genotoxicity can be characterized by the presence of DNA adducts. A change in the level of 5-methyl-d-cytosine is also a sign of genotoxicity caused by ochratoxins. These two phenomena may appear simultaneously or not.
In a particularly advantageous aspect, the invention relates to the property possessed by 11 aspartame of stimulating the excretion of ochratoxin.
The beneficial effects of increased toxin excretion are in reducing the time of exposure to the toxin.
The invention also relates to the use of 11 aspartame as a medicament for combating nephrotoxicity induced by ochratoxins. The interest of this invention applies as much to livestock and backyard as to human beings since it has been shown that Endemic Balkan Nephropathy was caused by this toxin and that it is probable
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that the impact on human health of the effects of this toxin is currently underestimated.
The invention also relates to the use of aspartame to combat the other harmful effects of ochratoxins such as testicular toxicity.
According to the invention, 11 aspartame can be administered in order to combat the phenomena of genotoxicity.
According to a particular aspect of the invention, aspartame can be administered preventively to prevent the onset of the toxic effects of lochratoxin. The toxic effects being inter alia nephrotoxicity, genotoxicity as well as testicular toxicity.
Aspartame can be administered by all the conventional routes of administration of a drug and more particularly the oral, rectal or parenteral routes.
When administered orally aspartame is dosed at 0.3 to 300 mg per kg of bodyweight and advantageously between 3 and 30 mg per kg.
Aspartame can be combined with other preventive substances or drugs such as selenium, vitamins and more particularly vitamins C and E.
Example 1: Effects of aspartame on the nephrotoxicity of ochratoxin A (OTA).
A) Increase in 11 urinary excretion of 11 OTA in rats and mice.
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The first experiment is carried out by gavage (esophageal probe) of male rats of Wistar strain (Sexal France) for 21 days.
The control batch receives the OTA alone at a rate of 289 gg / kg every 48 h.
The second batch is force-fed with the same amount of OTA supplemented with aspartame (25 mg / kg).
24h. before the sacrifice, the animals are put in metabolic cages.
The second experiment was carried out on male mice of Swiss strain (Iffa-Credo, France), treated by single gavage with the same amounts of OTA and OTA supplemented with aspartame as for rats.
24h. afterwards, the mice are sacrificed and the urine is collected directly by puncturing the bladder.
After sampling, the urine is clarified and the OTA is assayed according to the following protocol: The extraction method is based on the partition coefficient of OTA according to the pH between the aqueous and organic phases (Bauer and Garés, 1987, Z. Veterinârmed. B., 34,613-627; Hietanen et al., 1986, Drug Met. Dis., 14,118-126.).
The sample to be assayed is acidified with 0.1 M HCl solution / 0.2 M C12 0.2 M (v / v). The pH is adjusted to 2.5 using HC1 IM. LIOTA is extracted from the aqueous medium with 10 ml of CHCl3. After vigorous stirring for 3 min, the organic phase is recovered.
The latter is extracted with 2 times 8 ml of a 0.1 M NaHCO 3 solution. The aqueous phase is then recovered, acidified to pH 2.5 and then re-extracted with 10 ml of CHCl 3.
The latter is removed and then evaporated to dryness. The residue obtained is taken up in methanol and the analysis of the OTA is carried out directly by HPLC.
The eluent used is composed of the following mixture (ml): methanol / acetonitrile / 5 nM Na acetate / glacial acetic acid (300/300/400/14). The elution is done with a flow rate of 1 ml / min., The injection volume
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being 50 l, the column used is a Spherisorb ODS, ICjUm (30 x 0.25 cm).
Detection is based on the fluorescence properties of OTA and its derivatives (Ex = 340 nm, Em = 465 nm.).
The OTA is confirmed by obtaining the methylated derivative and postcolumn enzymatic hydrolysis.
The formation of the methyl ester is carried out by treating the extract using the 14% methano1 / BF3 solution for 15 min at 600C (AOAC. Methods, 1980,26, 96-102) the enzymatic degradation takes place , after evaporation to dryness, by addition of 100 g of carboxypeptidase A solution (37 mg prot./mg; 55IU / mg prot.) and 900 g of Tris 0.08M / 2M NaCl solution, pH 7.5. (Hult et al., 1982, Arch. Toxicol., 51,313-321).
Results: Determination of OTA in urine in rats and mice treated with OTA: Effects of aspartame.
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<tb>
<tb> rat <SEP> (ng / ml) <SEP> mouse <SEP> (ng / ml)
<tb> gavage <SEP> OTA <SEP> only <SEP> 185 <SEP> 2522 <SEP> 7
<tb> gavage <SEP> OTA <SEP> + <SEP> 280 <SEP> ¯ <SEP> 55 <SEP> 40 <SEP> ¯ <SEP> 17
<tb> aspartame
<tb>
B) Decrease in proteinuria: The determination of proteins in the urine is carried out by the method of Bradford (1976, Anal. Biochem., 72, 248-254).
The animals used are the same rats as those used previously.
Results: Effects of aspartame on the proteinuria of rats force-fed with 289 g / kg / 48 h for 21 days.
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EMI10.1
<tb>
<tb> proteinuria
<tb> (mg / 24H)
<tb> indicators <SEP> 4, <SEP> 68 <SEP> 0, <SEP> 37
<tb> gavage <SEP> OTA <SEP> only <SEP> 7, <SEP> 14 <SEP> 1, <SEP> 47
<tb> gavage <SEP> OTA <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 6
<tb>
Example 2: Beneficial effects of aspartame on the genotoxicity of OTA on the rat testis model.
Genotoxicity is followed by the detection and quantification of DNA adducts as well as the evaluation of the level of 5-methyl-d-cytosine (m5dC).
A / DNA adducts This experiment is carried out on male rats of Wistar strain force-fed either with OTA alone (289 g / kg), or with the same amount of OTA supplemented with aspartame (25 mg / kg).
After the rats have been sacrificed, the testes are quickly removed, rinsed with 0.9% NaCl and then stored at -80 ° C until analysis.
The latter requires the extraction and purification of the DNA beforehand according to the following protocol: the testis is ground in a ml of buffer (Tris 100 mM, EDTA 50 MM, NaCl 500 mM, $ mercapto-ethanol 10 mM, SDS 1.25%, pH 8).
EMI10.2
After incubation at 600C for 10 min, 25 cl of proteinase K solution 20 mg / ml in buffer (0.1 M NaCl, 20 MM EDTA, 50 mM Tris, pH 8) are added to 11 crude hamogenates.
After an hour of incubation at 37 ° C., the proteins are precipitated by adding 800 cl of 6M K acetate at pH S. The supernatant is recovered after centrifugation (10,000 g, 30 min.), The filaments are removed after precipitation by 2 volumes of ethanol (2 hours at -200C).
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The precipitate is taken up in 500 g of the preceding buffer after washing with ethanol and centrifugation.
This crude DNA is treated with 1 l of the enzyme mixture (pancreatic ribonuclease A at 10 mg / ml and ribonuclease T1 at 5,000 IU / ml) at 370C for 3 hours in order to remove the residual ONE. A volume of phenol saturated with Tris-HCl is then added. After 20 min. stirring followed by centrifugation at 10,000 g, the supernatant is removed and treated with Sevag (chloroform / isoamyl alcohol: 24/1).
A final precipitation of DNA is carried out in
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adding 2 volumes of ethoxy-ethanol. After incubation for 2 hours at -20 ° C., the DNA is recovered by centrifugation at 10,000 g for 30 min. After several washes with ethoxy-ethanol, the pure DNA is dissolved in distilled water.
The assay of 1 1 DNA is carried out by UV spectrophotometry.
Detection and quantification of DNA adducts is carried out in several stages (Randerath et al., 1989, Carcinogenesis, 10, 1231-1239) on lyophilized DNA. The enzymatic step consists in the hydrolysis of this DNA into nucleosides-3'P by addition of the following enzymatic mixture: 11 of spleen phosphodiesterase (26 U / ml), 11 of staphylococcus nuclease (500 U / ml), 2 cl of succinate buffer (200 mM) / CaCl2 (100 mM) at pH 6 and 6 gl H2O and incubation for 4 hours at 37OC.
In order to specifically hydrolyze P at 31 of normal nucleosides, the nuclease Pi (1.5 g of nuclease PI at 4 m / ml) is added to the following reaction mixture: 1.6 g of ZnCl2 (lmM), 1.6 l Na acetate (1 M, pH 5) and 0.3 µl H2O. After 45 min at 37 ° C., the reaction is stopped by adding 3 g of 500 mM Tris-base.
The specific labeling of 3'P nucleosides is carried out using T4 polynucleotide kinase in the alkaline medium composed of 2 g of Bicine buffer, 100 Ci
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32P-ATP, 0.16 1 of T4 polynucleotide kinase (30 U / l) and 2.84 H2O.
The residual ATP is hydrolyzed by adding 2 g of apyrase solution (8 U / ml) at 370C for 30 min.
A series of chromatographies is carried out to purify and isolate the adducts: - Migration Dl: It is carried out on a thin layer (polyethyleneimine-cellulose) with monosodium phosphate 2.3 M at pH 5.7 for 16 hours.
The zone containing the adducts is cut out then transferred to undergo a two-dimensional chromatography.
- D2 and D3 migrations: D2 is performed on the same type of support (PEI-cellulose) with a solvent composed of 8.5 M urea / 5.3 M Li formate pH 3.5 diluted to 90%. After washing (H2O) and drying, D3 is carried out perpendicular to D2 with the following eludant: 0.7 M NaH2PO4 / 7 M urea diluted to 85% at pH 6.4.
- Migration D4: This is a washing which is carried out in the same direction as D3 by using NaH2PO4 1.7 M at pH 6.
The plates are autoradiographed by fluorography, the adducts are recovered, quantified and expressed in number of adducts for 109 nucleotides.
B) Methylation of d-cytosine The assay of 5-methyl-d-cytosine is carried out on the hydrolysed DNA (as for the adducts) before using the PI nuclease, the nucleotides are labeled with 32P by using the reaction medium: 5 Ci of 32P, 1 l ATP at 1 mM, 3 U of T4 polynucleotide kinase, 1 gl of buffer (50 mM Tris-HCl, pH9, 10 mM MgC12, 1 mM spermidine, 15 mM ss-mercaptoethanol) and 7.4 l H20, one hour at 37 C.
Residual LIATP is hydrolyzed by the addition of 2 J L of 1/125 apyrase, ill of the mixture of 51 nucleosides and 7 l H2O at 370C for 30 min. 10 l of nuclease PI (0.25 g / l) and 1 l of acetate are then added.
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of ammonium at pH 4.5 at 37 C for 2 hours to obtain the 5'nucleosides.
A two-dimensional chromatography is then carried out with the following eluents: D1 (50 ml of isobutyric acid 10.7 M / 1, 1 ml of ammonia / 28.9 ml H2O) 16 hours; D2, after drying (100 ml of 0.1 M Na phosphate / 60 g of ammonium sulphate / 2 ml of 1propanol) 2 hours.
The spots are then collected and then quantified.
The results are expressed in% (% m5dC = [m5dC] / [m5dC] + [dC]).
Results: Effects of aspartame on the number of DNA adducts in the testis of rats force-fed with 289 g / kg of OTA.
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<tb>
<tb> nbr. <SEP> of adducts <SEP> for
<tb> 109 <SEP> nucleotides
<tb> gavage <SEP> with <SEP> OTA <SEP> alone10, <SEP> 5
<tb> gavage <SEP> with <SEP> OTA <SEP> + <SEP> aspartame
<tb>
Effects of aspartame on the number of DNA adducts per 109 nucleotides in the testis of mice force-fed with 289 g / kg of OTA.
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<tb>
<tb> number <SEP> of
<tb> adducts
<tb> gavage <SEP> with <SEP> OTA <SEP> alone14, <SEP> 5
<tb> gavage <SEP> with <SEP> OTA <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 8, <SEP> 0
<tb>
Effects of aspartame on the level of m5dC in the
EMI13.3
testis of rats force-fed with 289 gg / kg of OTA.
EMI13.4
<tb>
<tb>
% <SEP> of <SEP> m5dC
<tb> indicators <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> ¯ <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> gavage <SEP> with <SEP> OTA <SEP> alone7, <SEP> 8 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> gavage <SEP> with <SEP> OTA <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 3
<tb>
<Desc / Clms Page number 14>
Example 3: Study of the effects of aspartame on protein synthesis in-vitro.
A) Model 1: Mouse testis cells in primary culture.
Mouse testes are removed and the cells obtained by enzymatic dissociation (collagenase) are placed in primary culture.
Protein synthesis is followed by incorporation of tritiated leucine.
OTA with or without aspartame (in the same ratio as in-vivo) is directly introduced into the medium at the start of the incubation in a volume of proportion less than 1%, the control is prepared under the same conditions.
Results: Effects of OTA and aspartame on protein synthesis in testicular cells of primary culture mice.
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<tb>
<tb> treatment <SEP> of <SEP> cells <SEP> incorporation <SEP> of
<tb> leucine <SEP> (CAM)
<tb> indicators <SEP> 10 <SEP> 000 <SEP> 500
<tb> OTA <SEP> 0.25 <SEP> pu <SEP> 13 <SEP> 800 <SEP> 600
<tb> OTA <SEP> 2.5 <SEP> Hum <SEP> 14 <SEP> 600 <SEP> 100
<tb> OTA <SEP> 0.25 <SEP> J. <SEP> 1M <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 13 <SEP> 100 <SEP> 800
<tb> OTA <SEP> 2.5 <SEP> M + <SEP> aspartame <SEP> 10 <SEP> 400 <SEP> 300
<tb>
B) Model 2: Culture of kidney cells (VERO).
VERO cells are cultured in RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum, 4% glutamine and 2% gentamycin.
Protein synthesis is followed by the pulse technique using tritiated leucine.
LIOTA is added to the medium with or without aspartame and compared with the control prepared under the same conditions.
<Desc / Clms Page number 15>
Results: Effects of OTA and aspartame on protein synthesis in VERO cells.
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<tb>
<tb> processing <SEP> of <SEP> cells <SEP> percentage <SEP> of <SEP> synthesis
<tb> protein
<tb> cookies <SEP> 100
<tb> OTA <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> or <SEP> 90
<tb> OTA <SEP> 12 <SEP> M <SEP> 55
<tb> OTA <SEP> 0.12 <SEP> M <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 113
<tb> OTA <SEP> 12 <SEP> M <SEP> + <SEP> aspartame <SEP> 71
<tb>