AT413485B - Mit einem pharmazeutikum beschichteter stent - Google Patents

Description

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AT 413 485 B

Die Erfindung bezieht sich auf einen Stent zur Stabilisierung von Blutgefäßen.

In Zusammenhang mit Koronarinterventionen und insbesondere im Zusammenhang mit der perkutanen transluminalen Koronarangioplastie (PTCA) wurde gezeigt, daß der Langzeiterfolg 5 dieser nichtchirurgischen Therapieform durch eine relativ hohe Restenoserate von bis zu 35 % stark eingeschränkt wird. Die Implantation von Koronarstents ist zur Zeit die einzige Methode, von der bewiesen werden konnte, daß sie die Häufigkeit der Restenose nach perkutanen Koronarinterventionen reduziert. Obwohl in den BENESTENT- und STRESS-Studien eine signifikante Reduktion des Auftretens von Restenose nach Stenten von de novo-Läsionen nachgewiesen io werden konnte, trat trotzdem in 20-30 % der Fälle eine In-Stent-Restenose auf.

In zahlreichen Studien konnte gezeigt werden, daß sowohl die Ballonangioplastie als auch die Stentimplantation ein Verletzen und Zerreißen der Plaques sowie der Gefäßwand bewirken, was in weiterer Folge zu neointimaler Hyperplasie mit Proliferation glatter Muskelzellen führt. 15 Diese glatten Muskelzellen produzieren und modulieren die extrazelluläre Matrix in der neu gebildeten Intima. Außerdem führt die Verletzung der Media zu einer lokalen Entzündungsreaktion, wobei nachgewiesen werden konnte, daß die Einwanderung von Lymphozyten, Makrophagen und Monozyten an der Neubildung der Intima beteiligt sind. 20 Im Zuge der Neubildung der Intima stellt sich wie in allen Geweben ein zelluläres Gleichgewicht ein, welches vom Verhältnis zwischen Zeilproliferation und Zelltod und insbesondere vom programmierten Zelltod, der sogenannten Apoptose, abhängt.

Die Erfindung zielt nun darauf ab, einen Stent mit einem Pharmazeutikum zur Vorbeugung 25 gegen Restenosen nach einem Gefäßeingriff zu schaffen, mit welchem die neointimale Proliferation nach Eingriffen wie einer Ballonangioplastie oder einer Stentimplantation reduziert werden kann und gleichzeitig entzündliche Prozesse vermindert werden, wodurch die Gefahr einer Restenose verringert werden kann. Zur Lösung dieser Aufgabe besteht die Erfindung im wesentlichen darin, daß der Sent mit Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-Chlormethylketon (Ac-WAD-CMK) als 30 Kaspase-Inhibiator beschichtet ist.

Im Zuge von Untersuchungen zur Beeinflussung der Zellfunktion wurde u. a. auch eine Vielzahl an Substanzen, die eine Apoptose induzieren bzw. unterdrücken können, eingesetzt, um ihre Auswirkungen auf verschiedene pathologische Veränderungen zu erforschen. Als wichtigster 35 Modulator der Apoptose konnte in diesem Zusammenhang eine Gruppe von Proteasen identifiziert werden, welche als Kaspasen bezeichnet sind. Unter Kaspasen wird eine Familie von Aspartasesäurespezifischen Cystein-Proteasen verstanden, wobei prinzipiell gegenwärtig etwa 14 Mitglieder dieser Enzymfamilie bekanntgeworden sind und ihre Gene geklont wurden. Kaspasen spielen gemäß derartiger Untersuchungen eine wichtige Rolle bei Entzündungsreak-40 tionen. Kaspase-1 (auch interleukin-1beta converting enzyme), das erste aus der Familie der Kaspasen identifizierte Enzym, spielt eine essentielle Rolle in der Produktion mehrerer Zytokine, einschließlich lnterleukin-1-Beta sowie interferon-gamma-inducing factor.

Die Erfindung beruht hiebei auf der Hypothese, daß Kaspase-Inhibitoren die neointimale Prolife-45 ration nach Ballonangioplastie und Stentimplantation durch eine erhöhte Zellfunktionstüchtigkeit unter gleichzeitiger Verminderung der entzündlichen Prozesse reduziert. Eine Reduktion der neointimalen Proliferation ist hiebei eine Folge der Verschiebung des eingangs genannten intrazellulären Gleichgewichtes, wobei davon ausgegangen wird, daß eine Apoptoseinhibition gleichsinnig die Zellproliferation verringert. Hiebei wurde der Wirkstoff Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-50 Chlormethylketon (Ac-YVAD-CMK) als Kaspase-Inhibitor aufgefunden.

Der Wirkstoff kann prinzipiell beliebig in eine pharmazeutisch verträgliche Form gebracht werden und beispielsweise in Blutgefäße injiziert werden. Eine besonders wirksame Darreichungsform besteht aber nun darin, daß der Wirkstoff in eine pharmazeutisch unbedenkliche Matrix 55 eingebettet wird und als Beschichtung für implantierbare Stents eingesetzt wird. Mit einer derar- 3

AT 413 485 B tigen Matrix kann das Freisetzungsverhalten gesteuert werden.

Insbesondere im Zusammenhang mit der Verringerung der Gefahr einer Restenose nach einer Stentimplantation ist eine lokale Freisetzung des Wirkstoffes besonders bevorzugt. Aus diesem 5 Grunde ist der erfindungsgemäße Stent zur Stabilisierung von Blutgefäßen im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß er mit einem Kaspase-Inhibitor beschichtet ist, wobei bevorzugt Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-Chlormethylketon (Ac-YVAD-CMK) eingesetzt wird. In besonders einfacher Weise ist der Stent hiebei so ausgebildet, daß der Kaspase-1 Inhibitor in einer Polymermatrix auf den Stent aufgebracht ist. Die Polymermatrix kann hiebei beispielsweise für eine Freiset-io zung des Wirkstoffes in einem Zeitraum von 1 bis 3 Tagen als "fast release'-Matrix oder für eine Freisetzung bis 30 Tage als "slow release "-Matrix eingestellt werden.

Bei Tierversuchen wurde die Wirkungsweise und der Erfolg der erfindungsgemäß auf Stents aufgebrachten Pharmazeutika bereits untersucht. In Koronararterien von Schweinen wurden 15 hiebei bereits 30 Minuten nach einer Ballon-Angioplastie eine erhöhte Zahl apoptotischer glatter Muskelzellen nachgewiesen. Eine getrennte Analyse der Media, Adventitia und Neointima zeigte unterschiedliche zeitliche Veränderungen der Apoptoserate, wobei die jeweils höchste Anzahl an apoptotischen glatten Muskelzellen, Entzündungszellen und Fibroblasten der Adventitia 18 Stunden, 6 Stunden bzw. 7 Tage nach PTCA gefunden werden konnten. Zum Zwecke 20 der quantitativen Bestimmung der Apoptoserate in verschiedenen Zelltypen und verschiedenen Gefäßwandschichten nach Ballon-Angioplastie und Stentimplantation wurde im einzelnen wie folgt vorgegangen:

Haussschweine (mit einem Gewicht von zwischen 20 und 30 kg), die mit normalem Futter ohne 25 zusätzliche Fettbeigaben während der ganzen Studie gefüttert wurden, wurden über Nacht nüchtern gehalten und mittels 30 mg/kg Ketamin, 12 mg Azepromazin und 1 Ampulle Rubinol i.m. sediert. Zusätzlich wurden 5 mg/kg Thiopental vor der Intubation verabreicht. Nach endotrachealer Intubation wurden die Schweine mit einer Mischung aus 20% reinem Sauerstoff sowie 80% Atemluft künstlich beatmet. Nach einer Gabe von 0,1 mg Fentanyl sowie 2,5 mg 30 Acepromazin im Bolus wurde die Anästhesie mit 0,08 mg/kg Fentanyl (0,05 mg/ml Tropfinfusion) aufrechterhalten. Zur antibiotischen Abschirmung wurden Procain-Penicillin G (200.000 ΙΕ/ml) sowie Dihydrostreptomycinsulfat (200 mg/10 kg Körpergewicht) intramuskulär verabreicht. 35 Unter sterilen Bedingungen wurde eine Arteriotomie der A. carotis communis dextra durchgeführt und eine 7F-Schleuse eingeführt. Während des gesamten Eingriffes wurden Puls, arterieller Blutdruck und Körpertemperatur registriert, zusätzlich wurden mittels arterieller Blutproben die Blutgase sowie der Säure-Basenhaushalt kontrolliert. Nach Verabreichung von 200 lU/kg Körpergewicht Heparin sowie 250 mg Azetylsalizylsäure wurde ein 7F Führungskatheter in die 40 Aorta ascendens vorgeschoben. Zusätzlich wurden 400 IE Heparin pro Stunde als kontinuierliche Tropfinfusion verabreicht. Die Angiographie der rechten und linken Koronararterie wurde mittels nicht-ionischen Kontrastmittels nach intrakoronarer Gabe von 200 pg Nitroglyzerin durchgeführt. 45 Eine Arterie des linken Gefäßbaumes (entweder A. interventricularis ant. oder A. circumflexa) wurde nach dem Zufallsprinzip für die Stentimplantation ausgewählt, die andere Arterie wurde für die Ballonangioplastie verwendet. Die Arteria coronaria dextra verblieb als unbehandeltes Kontrollgefäß. so Um eine Verletzung der Arterie durch Überdehnung zu erreichen, wurde für die Ballonangioplastie ein Ballon so ausgewählt, daß sich zumindest ein Ballon/Gefäß-Verhältnis von 1,3:1 ergab. Das Gefäß wurde mit einem Ballon an derselben Stelle 3 mal für 30 Sekunden mit einem Druck von 6 atm dilatiert. 55 Weiters wurden Stents mit 15 mm Länge standardmäßig implantiert. Der Stentdurchmesser 4

AT 413 485 B wurde so gewählt, daß sich ein Stent/Gefäß-Verhältnis von 1,1:1 ergab. Der Stentballon wurde zur Implantation 3 mal für 30 Sekunden mit einem Druck von 6 bar aufgeblasen.

Nach einer Kontrollangiographie der behandelten Gefäße wurde eine Angiographie der rechten 5 Koronararterie durchgeführt. Dann wurden der Führungskatheter sowie die Schleuse entfernt, die Arteriotomiestelle ligiert und die Faszie sowie die Haut vernäht. Danach wurde die Anästhesie beendet und als Antibiotika Trimethoprim sowie Sulfadoxin verabreicht, zur Schmerzbekämpfung wurde Metamizol verabreicht. Zusätzlich wurden während der gesamten Überlebenszeit nach der Intervention 250 mg Azetylsalizylsäure pro Tag per os verabreicht, um akute bzw. io subakute Stentthrombosen zu verhindern.

Nach 4 Wochen Überlebenszeit wurden eine Kontrollangiographie des rechten und linken Koronarsystems gemacht sowie eine intravaskuläre Ultraschalluntersuchung des Stents und der mittels Ballon dilatierten Stelle durchgeführt. Danach wurden die Schweine durch intravenöse 15 Injektion von 10 ml gesättigter Kaliumlösung eingeschläfert. Die Herzen wurden den Tieren entnommen und mit Kochsalzlösung gespült, bevor mittels gepufferten Formaldehyds (4 %) eine Druckfixation durchgeführt wurde (ca. 100-110 mmHg Perfusionsdruck). Danach wurden die Koronararterien vom Herzen abpräpariert, für 24 Stunden in gepuffertes Formaldehyd (2 %) eingelegt und in Paraffin eingebettet. Vor der Einbettung wurde der Stent unter dem Mikroskop 20 entfernt, um eine grobe Verletzung des Gefäßes zu vermeiden.

Im Zuge dieser Methodik wurde für die Feststellung der pharmazeutischen Wirksamkeit des Apoptoseinhibitors Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-Chlormethylketon (Ac-YVAD-CMK) ausgewählt, da dieser Apoptoseinhibitor nicht nur zu den potentesten Inhibitoren zählt, sondern auch eine 25 entzündungshemmende Wirkung besitzt. Im Rahmen des Versuches wurde das Pharmazeuti-kum über einen Perfusionsballon lokal verabreicht, wobei ein mehrlumiger Katheter zum Einsatz gelangte, der aus einem proximalen Infusionsanschlußstück, einem Katheterkörper sowie distalen Infusionsregionen mit 4 getrennten Lumina bestand. Die Verabreichung erfolgte an einer Tiergruppe, wohingegen eine weitere Gruppe als Kontrollgruppe diente. Die neointimale Prolife-30 ration wurde mittels IVUS makroskopisch beurteilt, wobei die Analysen 4 Wochen nach der Ballonangioplastie bzw. Stentimplantation vorgenommen wurden. Alle IVUS-Aufzeichnungen wurden off line mit Hilfe eines computerunterstützten IVUS-Analysesystems ausgewertet, wobei die qualitative IVUS-Analyse eine Bewertung der Plaquezusammensetzung (hart bzw. weich, Thrombus, Plaqueeinriß bzw. Kalzifizierung) und Ekzentrizität beinhaltete. Die neointimale 35 Proliferation wurde als Durchschnitt von 3 Werten errechnet, wobei darüber hinaus histologische Untersuchungen vorgenommen wurden. Zu diesem Zwecke wurden Schnitte von jedem Arteriensegment mit Hämatoxylin-Eosin und Verhoeff-van-Gieson-Elastin gefärbt, um die durch die Intervention verursachte Gefäßverletzung sowie ihr Ausmaß darzustellen. 40 Die quantitative Auswertung der Gefäßverletzung sowie die neointimale Antwort auf die Stentimplantation wurde von den van Gieson-gefärbten Schnitten nach einer von Schwartz et al. beschriebenen Methode durchgeführt. Jedem Stentdraht wurde eine Verletzungsschwere entsprechend der Lage des Drahtes in den histologischen Gefäßwandabschnitten zugeordnet. 45 Für die Identifikation von Makrophagen und glatten Muskelzellen wurden anti-Hasen-Makrophagen-Antikörper von Mäusen (RAM 11, DAKO Corp.) und anti-Hasen-glatte-Muskelzellen-Alpha-Aktin monoklonale Antikörper, ebenfalls von Mäusen, verwendet. Durch Markieren der Schnitte mit einem Mausantikörper gegen PCNA (=proliferating cell nuclear antigen; clone PC 10, DAKO) wurden proliferierende Zellen dargestellt. Dazu wurde das Gewe-50 be mit primären Antikörpern für 1 Stunde in einer befeuchteten Kammer bei 37°C inkubiert. Die Antikörperbindung wurde mittels der indirekten Biotin-Streptavadin Horseradish Peroxidase-(Amersham) oder alkalischen Phospatase-Methode (Sigma) erreicht. Alle Färbungen wurden den Anweisungen des Herstellers entsprechend durchgeführt. 55 Schließlich erfolgte eine in situ-Darstellung apoptotischer Zellen. Hiebei wurde der terminal

Claims (2)

1. 5 AT 413 485 ß transferase-mediated dUTP nick end labeling Kit (TUNEL, ein in situ Apoptose-Darstellungskit) nach den Anweisungen des Herstellers verwendet. Nach Fixierung und Permeabilisation wurden positive Kontrollen mit DNAse behandelt um DNA-Strangbrüche zu erreichen, negative Kontrollen wurden anstatt mit der TUNEL-Reaktionsmischung mit der Markierungslösung (ohne 5 terminal transferase) gefärbt. Eine erfolgte Antikörperbindung wurde mit Diaminobenzidin (Pier-ce) sichtbar gemacht, das eine Braunfärbung bewirkt. Im Zuge dieser Untersuchungen konnte für mit dem erfindungsgemäßen Apoptoseinhibitor behandelte Abschnitte bzw. Bereiche von Blutgefäßen eine Verringerung des Plaquevolumens io auf etwa 1/6, eine Verringerung der maximalen Plaquefläche auf etwa 1/3 und des stenotisier-ten Flächenbereiches auf etwa 40 % gegenüber der Messung an der Kontrollgruppe nachgewiesen werden. Es wurden jeweils 7 Tiere für die Kontrollgruppe und 7 Tiere für die erfindungsgemäße Behandlung ausgewählt. 15 Patentansprüche: 1. Stent zur Stabilisierung von Blutgefäßen, dadurch gekennzeichnet, daß er mit Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-Chlormethylketon (Ac-YVAD-CMK) als Kaspase-Inhibitor beschichtet ist. 20
2. 2. Stent nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kaspase-Inhibitor in einer Polymermatrix auf den Stent aufgebracht ist. 25 Keine Zeichnung 30 35 40 45 50