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Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Diagnose eines zystischen Ovarialkarzi- noms in einem Individuum oder einer Zellkultur.
Das Ovarialkarzinom ist eine Tumorerkrankung, die vermehrt in der weissen Bevölkerung in Eu- ropa auftritt. Pro Jahr erkranken etwa 15 von 100 000 Frauen am Ovarialkarzinom, wobei diese Erkrankung die Hauptursache für die Mortalität unter allen gynäkologischen Erkrankungen darstellt.
Die Zahl der Fälle der Erkrankungen an Ovarialkarzinomen nimmt mit dem Alter zu, wobei etwa 3% der Frauen unter 30,25% der Frauen zwischen 40 und 50 und 35% der Frauen über 50 diese Tumorart aufweisen.
Trotz bereits gut entwickelter Verfahren zur Diagnose und Therapie, sind Ovarialkarzino- merkrankungen nur schlecht prognostizierbar. Frühe Symptome, die zur Identifizierung dieser Erkrankung in einem frühen Stadium herangezogen werden könnten, sind nicht bekannt. In den meisten Fällen treten die Symptome erst in einem späten Stadium der Krankheit auf und sind unspezifisch. Üblicherweise kommt es zu einer Vermehrung der Abdomenmasse aufgrund von Asziten. Die allgemein übliche therapeutische Behandlung umfasst operative Tumorentfernung zusammen mit einer Chemotherapie, wobei die Überlebensrate von dem Ausmass, in dem sich der Tumor im Abdomen und Pelvis verbreitet hat, abhängt.
Ovarialkarzinome werden aufgrund von histopathologischen Graden klassifiziert: G1 = stark dif- ferenziert, G2 = mässig differenziert, G3 = wenig differenziert, GB = Grenztumor (borderline tumor), Gx = der Grad kann nicht bestimmt werden. Die Verteilung des Tumors wird gemäss FIGO (Interna- tional Federation of Gynecology and Obstetrics) in Stadien I bis IV klassifiziert, wobei die Stadien I bis lll in Untergruppen a, b und c unterteilt werden. Die histologische Typisierung von Ovarialtumo- ren erfolgt entsprechend der WHO (Weltgesundheitsorganisation). Die drei Hauptkategorien sind Epitheltumor, Genitalgrat - Stromatumore und Keimzellen-Tumore. Zusätzlich zu diesen Gruppen existieren andere histologisch definierte Tumore, wobei diese jedoch selten im Bereich des Eier- stocks vorkommen.
Von allen Ovarialtumoren tritt der Epitheltumor am häufigsten auf (55%). Etwa 30% aller Tumo- re sind serös und 15% muzinös, 75% sind benign, 15% malign und 10% sind Grenztumore.
Um das Tumorgewebe und die Tumorverbreitung zu klassifizieren und analysieren, sind histo- logische und zytologische Evaluierungen der Asziten notwendig. Aufgrund von zytogenetischen Ergebnissen von Eierstocktumoren konnte gefunden werden, dass diese häufig in Verbindung mit DNA-Amplifikation der chromosomalen Region 20 q12-q13 auftritt, ähnlich der bereits bekannten Amplifikation in Brustkrebs. Zusätzlich wurde die Genamplifikation von c-erbB-2 und FGF-3 (INT-2) mit onkogenen Prozessen in Verbindung gebracht.
Weiters können Ovarialtumore mit Hilfe verschiedener Tumormarker, wie beispielsweise CA 125, CA 19-9, AFP, Neopterin, Interleukin-8, Interleukin-12 und hCG, detektiert werden.
Zusätzlich zu diesen recht unspezifischen Proteinmarkern wurde die Forschung auf neue Mar- ker mit diagnostischem Wert konzentriert, um zwischen malignen und benignen Ovarialtumoren unterscheiden zu können und um Ovarialkrebs bereits in einem frühen Stadium detektieren zu können. Lösliche Zeiladhäsionsmoleküle, wie das sCD44-Protein, sE-Cadherin und sICAM-1 wurden sowohl in Ovarialkrebs als auch im Serum von Patienten gefunden. Neuere Untersuchun- gen zeigten, dass die Abwesenheit des c-Kit-Proteins in Ovarialkrebs mit einer sehr niedrigen Überlebensrate in Zusammenhang gebracht wird, wobei Patienten mit c-Kit im Tumorgewebe eine höhere Überlebensrate zeigen.
Die Cytosolwerte von uPA, PAI-1 und VEGF zeigen eine signifikante Korrelation mit malignen Entwicklungen und einer geringen Überlebensrate. Es wurden im Serum von Patienten mit malig- nen Ovarialkarzinomen erhöhte VEGF- und suPAR-Werte gefunden. Dennoch führte eine weitere Untersuchung der Seren von Patienten mit Ovarialkarzinomen im Hinblick auf uPA, PAI-1, HER-2 und VEGF nicht zur Detektion eines verlässlichen Tumorindikators, der zur diagnostischen Tu- mormarkierung in einem frühen Stadium verwendet werden könnte. Die Aussagekraft von Apopto- sis-assoziierten Proteinen (ARP), wie FAS und dessen Liganden FAS-L, in Ovarialkrebs im Hin- blick auf Tumorentwicklung und allgemeine Überlebensrate wurde untersucht. Es wurde dabei festgestellt, dass eine Korrelation zwischen den hohen Werten von FAS-L und einer geringen Überlebensrate besteht.
Dasselbe scheint für den Fall eines erhöhten Serumgehalts von FAS zu gelten. Weiters waren die FAS-Serummengen höher in Patienten mit Ovarialkrebs als in Patienten mit benignen Ovarialzysten. Eine ähnliche Korrelation wurde für p53 (ein weiteres ARP) gezeigt, da
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erhöhte p53-Werte mit Ovarialkrebs in Zusammenhang gebracht wurden, und geringe p53-Werte mit Ovarialzysten. Der weite Bereich von p53-Konzentrationen erschwert jedoch die prognostische Evaluierung. Ähnliche Unterschiede der p53-Konzentrationen mit einem ähnlich weiten Konzentra- tionsbereich wurden im Serum von Patienten mit malignen Ovarialtumoren gefunden, verglichen mit dem Serum von Patienten mit benignen Ovarialzysten.
Es wurde keine Korrelation zwischen der p53-Expression in Ovarialkrebs und der Expression des p21-Proteins (ein Cyclin-abhängiger Kinaseinhibitor) gefunden.
Es besteht somit die Notwendigkeit eines Tumormarkers, der auf zuverlässige Weise eine Ova- rialtumorerkrankung bereits im frühen Stadium detektieren kann bzw. die Prognose der Entwick- lung eines solchen Tumors erlaubt. Weiters ist es für eine sinnvolle Diagnose mit anschliessender Therapie notwendig, rasch und zuverlässig mit Hilfe eines Markers zwischen benignen, malignen und semimalignen Ovarialtumoren zu unterscheiden.
Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäss durch das eingangs angeführte Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Schritte umfasst: - Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer dem Indivi- duum entnommenen Probe oder der Zellkultur, - Vergleichen der ermittelten Konzentration (en) zumindest einem Referenzwert, wobei ein zystisches Ovarialkarzinom diagnostiziert wird, wenn die ermittelte(n) Konzentration (en) über dem Referenzwert liegt (liegen).
Es wurde nun zum ersten Mal gefunden, dass ein Zusammenhang zwischen der Konzentration von Calgranulin A bzw. Calgranulin B in einem Individuum und der Diagnose eines zystischen Ovarialkarzinoms besteht : Wird ein zystisches Ovarialkarzinom diagnostiziert, so wurde in diesem Individuum ebenfalls eine Überexpression von Calgranulin A und/oder Calgranulin B gefunden im Vergleich zu gesunden Individuen bzw. Individuen mit benignen Ovarialtumoren. Damit wird nun erstmals ein Marker für ein zystisches Ovarialkarzinom zur Verfügung gestellt, der spezifisch und reproduzierbar nicht nur zwischen gesunden Personen und Personen, die an zystischen Ovarial- karzinomen erkrankt sind, unterscheiden kann, sondern auch zwischen malignen und benignen Ovarialtumoren.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird unter "diagnostizieren" auch die Unterscheidung zwischen semimalignen und benignen bzw. semimalignen und malignen Ovarialtumoren verstan- den : Patienten mit semimalignen Ovarialtumoren zeigen eine höhere Konzentration von Calgranu- lin A und/oder Calgranulin B als Patienten mit benignen Ovarialtumoren oder gesunden Patienten.
Desgleichen zeigen Patienten mit malignen Ovarialkarzinomen eine höhere Konzentration an Calgranulin A und/oder Calgranulin B als Patienten mit semimalignen Ovarialkarzinomen. Obwohl semimaligne Ovarialkarzinome sehr selten vorkommen, ist die Diagnose eines solchen Grenzfalles wichtig. Mit Hilfe der Feststellung der Calgranulin A/B Konzentration wird die Diagnose wesentlich erleichtert und eine hochspezifische und rasche Diagnose wird nun mit Hilfe dieses neuen Verfah- rens ermöglicht.
Calgranulin A, auch MRP8 genannt, und Calgranulin B, auch MRP14 genannt, sind Myeloid- verwandte Proteine (myeloid-related proteins) und gehören zu der S100-Familie der Calcium- Bindungs-proteine. Calgranulin A und Calgranulin B werden coexprimiert und bilden ein Zellen- oberflächen- und Cytoskelett-assoziiertes Heterodimer nach Calciummobilisierung. Dieses Hetero- dimer wird im Cytoplasma von Granulozyten und einer Subpopulation von Blutmonozyten expri- miert.
Diese Proteine werden bereits in verschiedenen Analyseverfahren verwendet :
So beschreibt Hellmann et al. (Toxicol-Sci, 2001 Mai; 61 (1 ):154-63), dass MRP8 und MRP14 in Lungenkarzinomen unterexprimiert werden, verglichen mit normalen gesunden Lungenzellen.
In Fung et al. (Life-Sci. 2000 Juli 14 ; 67 (8):923-36) wird beschrieben, dass in malignen NPE- Zellen (nasopharyngealen Epithelzellen) die Expression von neuen Genen, u. a. von Calgranulin A und Calgranulin B, supprimiert war, wobei diese differenzierte Expression von Calgranulin A und Calgranulin B in nicht-malignen und malignen NPE-Zellen durch RT-PCR-Analysen bestätigt wurde.
In der Veröffentlichung von Jungblut et al. (Electrophoresis 1999 Juli; 20(10):2100-10) wird of- fenbart, dass Calgranulin B in colorectalen Krebszellen überexprimiert wird.
In Stulik et al. (Clin-Chim-Acta. 1997 Sept. 8; 265(1):41-55) wird eine Studie beschrieben, in
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der gefunden wurde, dass Calgranulin B in entzündeten preneoplastischen und neoplastischen Läsionen der Colonmucosa überexprimiert wird.
Endress et al. (Lung-Cancer 1997 Aug.; 18(1):35-46) berichten über die Rolle von Makropha- gen im menschlichen Lungenkarzinom, wobei gezeigt wurde, dass MRP8 und MRP14 positive Makrophagen in Lungenkarzinom in geringerer Anzahl vorhanden waren, während diese in 2710 positiven Zellen vermehrt vorhanden waren.
In Schluesener et al. (Acta-Neuropathol-(Berl). 1998 Dez.; 96 (6):575-80) beschrieben, dass MRP8 und MRP14 in mikroglialen Zellen in Patienten mit humaner zerebraler Malaria (CM) exprimiert werden.
Im Artikel von Schmid et al. (Hum-Pathol. 1995 März ; wird eine Untersuchung be- schrieben, in der festgestellt wurde, dass die Konzentrationen von MRP8 und MRP14 im Serum von Patienten mit aktiver Crohn-Krankheit erhöht sind, wobei angenommen wird, dass diese erhöh- ten Konzentrationen durch eine aktive Sekretion durch Granulozyten, Monozyten und Epithelzellen hervorgerufen werden.
In Koike et al. (J-Biochem-(Tokio) 1998 Juni; 123(6):1079-87) wird eine Studie beschrieben, in der die Proteine MRP8 und MRP14 (migration inhibitory factor-related proteins) in Zusammenhang mit 2 menschlichen Leukämie-Zellkulturen gebracht werden.
Die WO 00/26668 A2 offenbart ein Verfahren zur Diagnose von Krebs, wobei Werte von S 100-AG, S 100-A7, S 100-A8 bzw. S 100-A9 in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit einer Person gemessen werden und mit einem Kontrollwert verglichen werden. Eine erhöhte Konzentra- tion, zumindest eines dieser Proteine, lässt auf eine Krebserkrankung, insbesondere Brust-, Dick- darm- bzw. Lungenkrebs, schliessen.
In Y. LI et al., "Study on dendritic cell phenotypic antigens in human ovarien ephital carcinoma", Zhongguo Mianyxue Zazhi, 17 (10), 2001,-seuteb 567-568, CAPLUS Zusammenfassung, AN 2001:859303, erhalten über die CAPLUS Datenbank, STN-International, Karlsruhe (DE); wird beschrieben, dass die Anzahl von positiven dendritischen Zellen in Ovarialkarzinomen signifikant erhöht ist und die Expressionsstärke von CD1c und S 100 geringer in Ovarialkarzinomen als in normalen Ovarialgeweben ist.
E. C. ILG et al., "Expression Pattern of S 100 Calcium-Binding Proteins in Human Tumors", Int.
J. Cancer, 68,1996, Seiten 325-332 ; die Expression von S 100 Proteinen in Tumoren, wobei jedoch lediglich S 100-A1, S 100-A2, S 100-A4, S 100-A6 und S 100 B getestet wurden, nicht jedoch S 100-A8 und S 100-A9.
Auch in A. Mueller et al., "Subcellular distribution of S 100 proteins in tumor cells and their relo- cation in response to calcium activation ; Histochem. Cell. Biol., 111,1999, Seiten 453-459 ; zwar S 100 Proteine im Zusammenhang mit Tumorzellen gebracht, jedoch werden hier lediglich S 100-A6, S 100-A4 und S 100-A2 getestet, nicht jedoch S 100-A8 und S 100-A9.
Es sind demnach verschiedene Erkrankungen bekannt, die in einem Zusammenhang mit einer Über- oder Unterexpression von Calgranulin A bzw. Calgranulin B stehen. Es wurde jedoch ein Zusammenhang zwischen zystischen Ovarialkarzinomen und der Konzentration von Calgranulin A bzw. Calgranulin B bislang nicht erwähnt oder nahegelegt. Die nun neu entdeckte und überra- schende Tatsache, dass in Patienten mit zystischem Ovarialkarzinom Calgranulin A bzw. Calgra- nulin B überexprimiert wird bzw. werden, kann nun als Basis für neue, effiziente und stabile Marker für zystische Ovarialkarzinome verwendet werden.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung betreffen Calgranulin A und Calgranulin B Proteine der S 100-Familie der Calciumbindungsproteine, nämlich die Proteine MRP8 (S 100-A8) und MRP14 (S 100-A9) wie sie beispielsweise in Eue et al. (Int-Immunol. 2000 Nov; 12(11 ):1593-604) beschrieben sind.
Unter "Individuum" wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung insbesondere ein Mensch aber auch ein Säugetier verstanden, das an zystischem Ovarialkarzinom erkranken kann.
Die "Zellkultur" betrifft jegliche in vitro-Züchtung von Zellen, insbesondere Ovarialzellen, wobei diese beispielsweise aus einem gesunden Individuum entnommen worden sein können und die Entstehung bzw. Entwicklung eines zystischen Ovarialkarzinoms anhand dieser Zellkultur unter- sucht werden kann. Selbstverständlich kann die Zellkultur aber auch eine Kultur von Zellen sein, die aus einem Patienten mit einer positiven Diagnose für zystisches Ovarialkarzinom entnommen worden sind.
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Die Konzentration von Calgranulin A/B wird in einer dem Individuum entnommenen Probe be- stimmt, wobei die Probe vorzugsweise eine Körper- oder Organflüssigkeit bzw. eine Organ- oder Gewebeprobe ist, etwa Serum, Zystenflüssigkeit, Eierstockgewebe aber auch Urin, usw.. Im Falle der Zellkultur wird die Konzentration entweder in der Zellkultur direkt oder in einer der Zellkultur entnommenen Probe, z. B. Überstand oder die Zellen selbst, bestimmt.
Die Konzentration wird gemäss einem geeigneten Verfahren bestimmt, wobei das Verfahren je nach der Art der Probe, den labortechnischen Möglichkeiten, der Anzahl der zu bestimmenden Proben, aber auch nach der gewünschten Genauigkeit ausgewählt wird. Die Calgranulin A/B- Konzentration kann beispielsweise elektrophoretisch, chromatographisch, immunologisch, colori- mietrisch bzw. durch eine Kombination dieser Verfahren durchgeführt werden. Da bereits eine Reihe von anti-Calgranulin A/B-Antikörper zur Verfügung stehen, eignen sich immunologische Tests ausgesprochen gut, wobei diese entweder direkt an der Gewebsprobe durchgeführt werden können, oder aber auch in der Flüssigkeit, beispielsweise mit Hilfe von ELISA-Tests.
Zur Unterscheidung zwischen malignen bzw. semimalignen und benignen Ovarialtumoren bzw. gesunden Patienten ist der Referenzwert der Calgranulin A/B-Gehalt in einer entsprechenden "gesunden" oder "benignen" Probe oder Zellkultur, d. h. einer einem Individuum, das nicht an zystischem Ovarialkarzinom erkrankt ist, entnommenen Probe bzw. einer Zellkultur, die kein zysti- sches Ovarialkarzinom aufweist. Zur Unterscheidung zwischen malignen und semimalignen Ovari- alkarzinomen ist der Referenzwert der Calgranulin A/B-Gehalt z. B. in einer entsprechenden "se- mimalignen" Probe oder Zellkultur bzw. der Grenz-Calgranulin A/B-Gehalt, d. h. der maximale semimaligne bzw. minimale maligne Calgranulin A/B-Gehalt in einer entsprechenden Probe bzw.
Zellkultur. Solche Werte können beispielsweise aus Vergleichskurven oder -tabellen herausgele- sen werden bzw. können auch durch eine früher oder parallel durchgeführte Bestimmung ermittelt werden. Dabei soll der Referenzwert vorzugsweise aus einer entsprechenden Probe stammen, d. h., wird die Konzentration in Zystenflüssigkeit bestimmt, so sollte der Referenzwert ebenfalls von Zystenflüssigkeit sein.
Liegt nun die ermittelte Konzentration über dem Referenzwert, so bedeutet dies eine Überex- pression von Calgranulin A/B im Vergleich zum Referenz- bzw. Normalwert, wobei dies eine Er- krankung (malign oder semimalign) an zystischem Ovarialkarzinom bedeutet. Dabei kann entweder die Konzentration von Calgranulin A oder die von Calgranulin B oder auch die Konzentrationen beider Proteine bestimmt werden, wobei selbstverständlich der Referenzwert die entsprechende Konzentration sein soll, d. h. ebenfalls entweder Calgranulin A oder Calgranulin B oder beide zu- sammen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass sich insbesondere die Calgranulin A-Konzentration für eine Diagnose eignet.
Vorzugsweise ist der Referenzwert die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer einem gesunden Individuum entnommenen Probe oder in einer Karzinom-freien Zellkultur.
Dieser Referenzwert ist insbesondere günstig zur Unterscheidung von (semi)malignen und be- nignen Tumoren bzw. gesunden Personen. Dabei wird unter "einem gesunden Individuum" wie oben bereits festgestellt ein entsprechendes Individuum verstanden, das frei von zystischem Ovarialkarzinom ist. Selbstverständlich soll das Individuum, aus dem der Referenzwert bestimmt wird, dasselbe sein, wie das, in dem die Calgranulin A/B-Konzentration ermittelt wird. Das heisst, wird in einem Menschen die Konzentration bestimmt, so soll der Referenzwert ebenfalls in einem (anderen) Menschen in einer entsprechenden Probe bestimmt werden. Dasselbe gilt für die Zellkul- tur, wobei hier auf die Art des Gewebes bzw. das Wachstumsstadium der Zellen geachtet werden soll, um eine möglichst aussagekräftige und reproduzierbare Feststellung hinsichtlich des Krank- heitsgrades durchführen zu können.
Um Untersuchungsfehler auszuschalten, ist es dabei günstig, beide Bestimmungen gleichzeitig in Parallelversuchen durchzuführen. Dabei können auch mehrere Proben zur Bestimmung des Referenzwertes herangezogen werden, um einen Referenz-Mittelwert zu bilden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der po- sitiven oder negativen Entwicklung eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Individuum oder einer Zellkultur, das die Schritte umfasst: - Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer dem Individuum oder der Zellkultur entnommenen Probe, - Vergleichen der ermittelten Konzentration (en) dem entsprechenden Konzentrati-
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onswert einer zu einem früheren Zeitpunkt demselben Individuum oder derselben Zellkultur ent- nommenen Probe, wobei eine positive Entwicklung des zystischen Ovarialkarzinoms bestimmt wird, wenn die ermittelte(n) Konzentration (en) über dem Konzentrationswert der früher entnomme- nen Probe liegt (liegen).
Hier gelten dieselben Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen wie oben bereits beschrieben. Dieses Verfahren erlaubt die Feststellung der Entwicklung der Erkrankung, wobei eine positive Entwicklung ein Ausbreiten bzw. Wachstum des zystischen Ovari- alkarzinoms bedeutet, d. h. eine Verschlechterung des Krankheitszustandes, und eine negative Entwicklung eine Verkleinerung bzw. gar Verschwinden des zystischen Ovarialkarzinoms, d. h. eine Verbesserung des Krankheitszustandes bedeutet.
Der frühere Zeitpunkt kann etwa der Konzentrationswert vor ein paar Tagen, einer Woche, Mo- naten oder gar Jahren sein. Dabei kann der Konzentrationswert jener sein, der zu dem früheren Zeitpunkt ermittelt wurde. Um mögliche Bestimmungsungenauigkeit zu verhindern, ist es jedoch auch möglich, den Konzentrationswert gleichzeitig an beiden Proben durchzuführen, wobei die zu dem früheren Zeitpunkt entnommene Probe in einer geeigneten Form, etwa in gefrorenem Zu- stand, konserviert wurde.
Mit diesem Verfahren ist es möglich, nicht nur die Entwicklung des zystischen Ovarialkarzi- noms an sich zu bestimmen, sondern auch den Einfluss von verschiedenen Substanzen, etwa Medikamenten, auf das zystische Ovarialkarzinom. Auf diese Weise können Therapien überwacht werden. Im Fall von Zellkulturen ist es weiters auch möglich, krebserregende Substanzen zu detektieren bzw. zu untersuchen.
Vorzugsweise ist die dem Individuum entnommene Probe ausgewählt aus der Gruppe beste- hend aus Zystenflüssigkeit, Zystengewebe, Serum und Harn. Insbesondere Zystenflüssigkeit und Serum haben sich als geeignet für das erfindungsgemässe Verfahren herausgestellt, wobei diese Proben auf einfache Weise im Laufe von Routineuntersuchungen entnommen werden können, was eine sehr unkomplizierte und nicht aufwendige Art der Detektion bzw. Untersuchung von zysti- schen Ovarialkarzinomen darstellt.
Ein besonders vorteilhaftes Verfahren besteht darin, dass die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B immunologisch bestimmt wird. Diese immunologischen Bestimmungen sind besonders günstig, da eine Reihe von polyklonalen als auch monoklonalen Antikörpern, die spezi- fisch für Calgranulin A und Calgranulin B sind, existieren. Immunologische Verfahren können sowohl in Flüssigkeit als auch auf Geweben durchgeführt werden. Beispiele solcher Verfahren sind Standard-ELISA, Sandwich-ELISA, immunohistochemische Verfahren, etc., wobei diese Verfahren nicht nur ein Detektieren von Calgranulin A/B ermöglichen, sondem auch ein genaues Quantifizie- ren.
Vorzugsweise wird die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B unter Verwen- dung von monoklonalen Antikörpern bestimmt. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch und können gemäss gängigen Methoden auf sehr einfache und kostengünstige Weise hergestellt wer- den. Andererseits existieren monoklonale Antikörper, die spezifisch für Calgranulin A/B sind, be- reits und sind leicht erhältlich.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren besteht darin, dass die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B durch Messen der entsprechenden mRNA oder Fragementen davon be- stimmt wird. Das Messen von mRNA-Molekülen kann nach jedem gängigen Verfahren durchge- führt werden, insbesondere durch Hybridisierungsreaktionen oder PCR, wobei es genügt, eine spezifische Region im mRNA-Molekül nachzuweisen. Auch dieses Verfahren kann direkt in der Probe durchgeführt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Detektion eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Individuum oder einer Zellkultur, das - ein Reagenz zum Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B und - ein Calgranulin A und/oder Calgranulin B Referenzmittel umfasst.
Das Reagens zur Bestimmung der Konzentration von Calgranulin A/B hängt dabei natürlich von dem jeweiligen Detektionsverfahren ab, wobei der Kit selbstverständlich auch zwei oder mehr Reagenzien umfassen kann, wenn diese für das Detektionsverfahren notwendig sind. Das Rea- gens kann z. B. Antikörper, Puffer mit Nachweissubstanzen und Ähnliches, umfassen. Zusätzlich können weitere Detektionsmittel, etwa fluoreszierende, radioaktive oder chromogene Substanzen bzw. auch sekundäre Antikörper vorgesehen sein.
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Das Referenzmittel ist beispielsweise eine Probe umfassend eine standardisierte Konzentrati- on von Calgranulin A/B, beispielsweise in einem Puffer oder auch in einer der jeweiligen Körper- flüssigkeit- oder Zellkultur-Probe entsprechenden Lösung. Das Referenzmittel kann aber auch aus einem einfachen Vergleichswert, einer Vergleichstabelle oder einer Vergleichskurve bestehen.
Vorzugsweise umfasst das Reagens zur Bestimmung der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper. Dabei ist es von Vorteil, wenn die Antikörper in einer bestimmten Konzentration im Reagens vorliegen, wobei die anti- Calgranulin A- und anti-Calgranulin B-Antikörper getrennt voneinander aber auch zusammen im Reagens vorgesehen werden können. Die Antikörper können dabei an Marker gebunden sein, etwa an fluoreszierende, radioaktive oder chromogene Gruppen bzw. können im Kit weiter Sekun- därantikörper, die spezifisch für die Primärantikörper sind, vorgesehen sein.
Vorzugsweise sind die Antikörper an einem festen Träger immobilisiert. Dadurch wird ermög- licht, dass die Proben lediglich auf den festen Träger aufgetragen bzw. über diesen darüber fliessen können, wobei Calgranulin A/B über die Antikörper an dem festen Träger immobilisiert werden.
Anschliessend können Waschschritte durchgeführt werden und die Detektion entweder direkt am festen Träger oder nach einem Eluieren im Eluat. Der Träger kann beispielsweise eine Chroma- tographiesäule, ein Filter, eine Mikrotiterplatte, Well, etc. sein.
Weiters ist es günstig, wenn der Kit einen festen Träger zur Immobilisierung von Calgranulin A und/oder Calgranulin B umfasst. Dieser feste Träger kann beispielsweise mit den natürlichen Bindungspartnern von Calgranulin A/B, deren Analogen, Teilen von Antikörpern und Ähnlichem vorgesehen werden. Nach Immobilisierung von Calgranulin A/B kann die Detektion wiederum entweder direkt auf dem festen Träger, etwa mit Hilfe von markierten oder unmarkierten Antikör- pern, oder nach einem Elutionsschritt im Eluat durchgeführt werden. Auch hier kann als Träger einer der oben definierten Träger vorgesehen sein.
Besonders bevorzugt umfasst das Referenzmittel eine standardisierte Menge an Calgranulin A und/oder Calgranulin B. Dadurch wird ein Kit zur Verfügung gestellt, der eine Parallelbestimmung des Referenzwertes gewährleistet, wodurch mögliche Ungenauigkeiten beim Bestimmungsverfah- ren ausgeschaltet werden.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform besteht darin, dass das Referenzmittel eine Reihe von standardisierten Calgranulin A und/oder Calgranulin B Proben umfasst. Diese Proben können z. B. bestimmte Krankheitsgrade darstellen, so dass mit Hilfe lediglich eines Bestimmungsverfah- rens das Ausmass bzw. Stadium der Erkrankung festgestellt werden kann.
Calgranulin A und/oder Calgranulin B-Inhibitoren können zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von zystischen Ovarialkarzinomen verwendet werden. Da die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B im direkten Zusammenhang mit einer Erkrankung an zysti- schen Ovarialkarzinomen steht, kann eine Verminderung der Konzentration von Calgranulin A/B bzw. ein völliges Ausschalten von Calgranulin A/B eine Erkrankung verhindern bzw. als Therapie für einen bereits an zystischen Ovarialkarzinomen erkrankten Patienten herangezogen werden.
Unter Calgranulin A und/oder Calgranulin B-Inhibitoren werden Substanzen, Moleküle oder Protei- ne verstanden, die beispielsweise die Expression von Calgranulin A/B auf Transkriptionsebene bzw. Translationsebene verhindert oder vermindert, bereits exprimierte Proteine spezifisch angrei- fen und gegebenenfalls zerstören, die Aktivität von exprimiertem Calgranulin A/B Proteinen blo- ckiert etc.. Insbesondere werden unter Calgranulin A/B-Inhibitoren Calgranulin A/B Antikörper verstanden, insbesondere monoklonale Antikörper sowie auch Antikörper-Fragmente. Weiters könnten auch nicht-aktive Calgranulin A/B-Analoga eingesetzt werden, die kompetitiv mit dem natürlichen Calgranulin A/B wirken. Weiters könnten als Calgranulin A/B-Inhibitoren solche einge- setzt werden, die in Gene-silencing, Knockout bzw. Antisense-Verfahren eingesetzt werden.
Selbstverständlich können hier wiederum entweder Calgranulin A- oder Calgranulin B-Inhibitoren verwendet werden. Es ist aber auch möglich, beide in einem abgestimmten Verhältnis zueinander in einem Medikament zu verwenden. Bei einer derartigen Behandlung eines Patienten mit zysti- schem Ovarialkarzinom wird dem Patienten eine ausreichende Menge an Calgranulin A und/oder Calgranulin B-Inhibitoren verabreicht. Hier gelten wiederum die oben genannten Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen, wobei die Verabreichung insbesondere oral oder intravenös geschieht. Unter "Behandlung" wird sowohl die Behandlung von malignen oder semimalignen Karzinomen verstanden als auch die Verhinderung einer Verschlechterung der Erkrankung im Falle
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eines benignen Karzinoms.
Weiters wird auch die Verhinderung einer Erkrankung an einem gesunden Patienten verstanden.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der nachfolgenden Figuren und Beispiele, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, noch näher erläutert, wobei die Figuren 1 bis 3 die Ergebnisse von 2D-Gel-Elektrophorese-Untersuchungen verschiedener Proben und die Fig. 4 und 5 die Aminosäuresequenzen von MRP8 und MRP14 zeigen.
Beispiel 1
Flüssigkeiten von malignen, benignen und grenzwertigen Ovarialtumoren wurden während der Operation bzw. im Laufe einer Routineuntersuchung gesammelt. Nach dem Zentrifugieren wurden diese Proben in Aliquote eingeteilt und wie die Pellets eingefroren. Am selben Tag wurden weiters Blutproben derselben Patienten gesammelt, wobei die Überstände nach Zentrifugation ebenfalls in Pellets geteilt und eingefroren wurden.
Es wurde eine quantitative Analyse der Aliquoten der Flüssigkeitsproben durchgeführt, um die Gesamtmenge an Protein gemäss dem Lowry-Verfahren zu bestimmen. Für die analytischen Untersuchungen der Flüssigkeiten und der Seren mittels 2D-Gel-Elektrophorese wurden denaturierende Agenzien zu den Aliquoten zugesetzt, um die Proteine zu dissozieren und die DisulfidbrückenBindungen zu reduzieren.
In einem ersten Schritt wurde die Trennung der Proteine mittels IEF (isoelektrischer Fokussierung) in einem elektrischen Feld (pH 3-10) durchgeführt. Anschliessend wurde eine zweite Trennung der Proteine in einem Akrylamidgradientengel (9-16%) durchgeführt. Die Proteinspots, die in der zweiten Dimension positionieren, sind somit durch zwei unabhängige Parameter charakterisiert, einerseits durch die isoelektrische Fokussierung und andererseits durch das Molekulargewicht. Die Proteinspots auf dem 2D-Gel werden mit Hilfe einer modifizierten Silberfärbungsmethode gemäss Blum sichtbar gemacht. Dieses Verfahren erlaubt die Identifizierung von mehr als 100 Proteinen in der Flüssigkeit verschiedener Ovarialtumore und in dem Serum der Patienten, so dass die unterschiedlichen Proteinmuster miteinander verglichen werden können.
Beispiel 2
Es wurden 13 maligne und 13 benigne Ovarialtumore untersucht, wobei einerseits die zystische Flüssigkeit und andererseits das Serum dieser 26 Patienten durch 2D-Gel-Elektrophorese analysiert wurden. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, wurden die Proben mehrmals unter einzelnen Bedingungen durch 2D-Gel-Elektrophorese untersucht, insgesamt wurden 235 Gele durchgeführt (s. Tabellen 1 und 2).
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Tabelle 1: Maligne zystische Ovarialtumore
EMI8.1
<tb> Nr. <SEP> Diagnose <SEP> Malignitäts-Grad <SEP> 2D-Gele <SEP> Gesamtprotein:mg/ml
<tb> (FIGO) <SEP> Zysten <SEP> Serum <SEP> Zysten <SEP> Serum
<tb> 1 <SEP> 16191229 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> II <SEP> IIb <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 55 <SEP> 61
<tb> Mucinöses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> II <SEP> IIb <SEP> 23 <SEP> 2 <SEP> 65 <SEP> 61
<tb> 2 <SEP> 40020252 <SEP> Endometriotisches <SEP> Zystadenokar- <SEP> II <SEP> Ia <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 45 <SEP> 50
<tb> zinom
<tb> 3 <SEP> 36130461 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> I <SEP> Ib <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 19 <SEP> 49
<tb> 4 <SEP> 04010221 <SEP> Undifferenziertes <SEP> Zystadenokar- <SEP> II <SEP> Ib <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 19 <SEP> 38
<tb> zinom
<tb> 5 <SEP> 77270223 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> III <SEP> Ia <SEP> 2
<SEP> 3 <SEP> 43 <SEP> 47
<tb> 6 <SEP> 94240661 <SEP> Mucinöses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> I <SEP> Ia <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 36 <SEP> 55
<tb> 7 <SEP> 95080861 <SEP> Mucinöses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> I <SEP> Ia <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 50 <SEP> 60
<tb> 8 <SEP> 63211146 <SEP> Undifferenziertes <SEP> Zystadenokar- <SEP> II <SEP> IIb <SEP> 27 <SEP> 2 <SEP> 63 <SEP> 42
<tb> zinom
<tb> 9 <SEP> 67230452 <SEP> 'Mucinöses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> II <SEP> IIa <SEP> 8 <SEP> 5 <SEP> 79 <SEP> 80
<tb> 10 <SEP> 45291053 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> I <SEP> IIIb <SEP> 9 <SEP> 3 <SEP> 62 <SEP> 53
<tb> 11 <SEP> 97280346 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> II <SEP> Ia <SEP> 19 <SEP> 5 <SEP> 69 <SEP> 70
<tb> 12 <SEP> 62070158 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> II <SEP> IIIc <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> 75 <SEP> 76
<tb> 13 <SEP> 77030522 <SEP> Seröses <SEP>
Zystadenokarzinom <SEP> III <SEP> IIIC <SEP> 9 <SEP> 5 <SEP> 75 <SEP> 70
<tb> Total <SEP> 2D-Gele <SEP> 115 <SEP> 38'
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
5
10
15
20
25 30 35 40 45 50 55 Tabelle 2 : Nicht-maligne zystische Ovarialtumore
EMI9.1
<tb> Nr. <SEP> Diagnose <SEP> histologische <SEP> 2D-Gele <SEP> Gesamtproteine:
mg/ml
<tb> Untersuchung <SEP> Zysten <SEP> Serum <SEP> Zysten <SEP> Serum
<tb> 1 <SEP> 87150523 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 60 <SEP> 65
<tb> 2 <SEP> 24291249 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 5 <SEP> 78 <SEP> 63
<tb> 3 <SEP> 7310362 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 70 <SEP> 60
<tb> 4 <SEP> 40270616 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 60 <SEP> 76
<tb> 5 <SEP> 55170949 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 47 <SEP> 60
<tb> 6 <SEP> 58060165 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 79 <SEP> 71
<tb> 7 <SEP> 72110223 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP>
Malignität <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 74 <SEP> 67
<tb> 8 <SEP> 65201072 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 70 <SEP> '65
<tb> 9 <SEP> 26060978 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 47 <SEP> 44
<tb> 10 <SEP> 77270135 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 106 <SEP> 81
<tb> 11 <SEP> 29191274 <SEP> Sactosalpinx <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 7 <SEP> 3 <SEP> 47 <SEP> 60
<tb> 12 <SEP> 69130175 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 90 <SEP> 65
<tb> 13 <SEP> 56030868 <SEP> Dermoide <SEP> Zysten <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 41 <SEP> 63
<tb> Total <SEP> 2D-Gele <SEP> 38 <SEP> 24 <SEP>
<tb>
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In Fig.
1 bis 3 sind die Ergebnisse gezeigt, wobei Fig.la und 3a Proben aus einem Patienten mit muzinösem Zystenkarzinom Grad II/FIGO 11b, Fig. 2a eine Probe aus einem Patienten mit serösem Zystenkarzinom zeigen. "C" bedeutet Zystenflüssigkeit und "S" Serum. Die Ergebnisse zeigen, dass die Proteinmuster der Ovarialkrebs-Flüssigkeiten signifikant verschieden sind im Vergleich zu den Ovarialzysten-Flüssigkeiten. Insbesondere im unteren Molekularbereich zwischen 10 und 25 kD (s. breiter Pfeil in Figuren 1 bis 3) sind zahlreiche zusätzliche Proteinspots sowohl in der Zystenflüssigkeit als auch im Serum der Patienten mit Ovarialkrebs zu sehen (s. Figuren 1a bis 3a) verglichen mit Patienten mit benignen Ovarialzysten (s. Figuren 1 b bis 3b).
Mittels partieller Aminosäure-Sequenzanalyse wurden die Proteinspots 1 als Calgranulin A (Fig.4) und 2 als Calgranulin B (Fig.5) identifiziert, wobei die jeweilige Sequenz mit ihren Aminosäuren als auch als schematische Darstellung gezeigt ist, "M" die mittlere Masse, "S" Sequenz und "P" Position bedeu- ten. Die mit 100-300 ng Protein pro Spot vorliegende Proteinmenge bezogen auf die im 2D-Gel untersuchte Gesamt-Proteinmenge von 100 g ist auch für immunologische Tests ausreichend.
Die Lokalisierung dieser beiden Proteine im 2D-Gel wurde erstmalig durchgeführt.
Die Untersuchungen an Proben von Patienten zeigen zusätzliche Proteinspots, die nur bei Pa- tienten mit malignen Tumoren vorkommen. In einem der Patienten haben sich Abdomenasziten zusätzlich zum serösen Zystadenokarzinom im Laufe der Erkrankung entwickelt. In dieser Unter- suchung der Proteine mittels 2D-Gel-Elektrophorese sind die Zystenflüssigkeit und die Aszitenflüs- sigkeit einander sehr ähnlich.
Weiters wurden zusätzliche Proteine im unteren Molekularbereich zwischen 10 und 20 kD in den Serumproben der 13 Patienten mit Ovarialkrebs gefunden. Diese zusätzlichen Proteine im Serum zeigen starke Ähnlichkeiten in ihrer elektrophoretischen Positionierung mit denen, die in den Zystenflüssigkeiten der entsprechenden Ovarialkrebs-Patienten gefunden wurden. Im Serum von Patienten mit gutartigen Ovarialzysten sind diese zusätzlichen Proteine nicht nachweisbar vorhan- den.
PATENTANSPRÜCHE:
1. Verfahren zur Diagnose eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Individuum, insbe- sondere in einem Menschen oder in einem Säugetier, oder einer Zellkultur, dadurch ge- kennzeichnet, dass es die Schritte umfasst: - Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer dem In- dividuum entnommenen Probe oder der Zellkultur, - Vergleichen der ermittelten Konzentration (en) zumindest einem Referenzwert, wobei ein zystisches Ovarialkarzinom diagnostiziert wird, wenn die ermittelte(n) Konzentrati- on(en) über dem Referenzwert liegt (liegen).
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The present application relates to a method for diagnosing cystic ovarian cancer in an individual or a cell culture.
Ovarian carcinoma is a tumor that is becoming increasingly common in the white population in Europe. About 15 out of 100,000 women develop ovarian cancer each year, and this disease is the main cause of mortality among all gynecological diseases.
The number of cases of ovarian cancer increases with age, with about 3% of women under 30.25% of women between 40 and 50 and 35% of women over 50 having this type of tumor.
Despite well-developed methods of diagnosis and therapy, ovarian carcinoma diseases are difficult to predict. Early symptoms that could be used to identify this condition at an early stage are not known. In most cases, the symptoms only appear at a late stage of the disease and are non-specific. There is usually an increase in the abdominal mass due to ascites. The most common therapeutic treatment involves surgical tumor removal along with chemotherapy, with survival depending on the extent to which the tumor has spread to the abdomen and pelvis.
Ovarian carcinomas are classified on the basis of histopathological degrees: G1 = strongly differentiated, G2 = moderately differentiated, G3 = not very differentiated, GB = borderline tumor, Gx = the degree cannot be determined. The distribution of the tumor is classified according to FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) in stages I to IV, stages I to III being subdivided into subgroups a, b and c. The histological typing of ovarian tumors is carried out according to the WHO (World Health Organization). The three main categories are epithelial tumor, genital ridge - stromal tumors and germ cell tumors. In addition to these groups, there are other histologically defined tumors, although these rarely occur in the area of the ovary.
The epithelial tumor is the most common of all ovarian tumors (55%). About 30% of all tumors are serous and 15% mucinous, 75% are benign, 15% malignant and 10% are borderline tumors.
Histological and cytological evaluations of the ascites are necessary to classify and analyze the tumor tissue and tumor spread. Based on cytogenetic results of ovarian tumors, it was found that this frequently occurs in connection with DNA amplification of the chromosomal region 20 q12-q13, similar to the already known amplification in breast cancer. In addition, gene amplification of c-erbB-2 and FGF-3 (INT-2) has been associated with oncogenic processes.
Furthermore, ovarian tumors can be detected with the aid of various tumor markers, such as, for example, CA 125, CA 19-9, AFP, neopterin, interleukin-8, interleukin-12 and hCG.
In addition to these rather unspecific protein markers, research was focused on new markers with diagnostic value in order to be able to distinguish between malignant and benign ovarian tumors and to be able to detect ovarian cancer at an early stage. Soluble cell adhesion molecules such as the sCD44 protein, sE-cadherin and sICAM-1 have been found in both ovarian cancer and patient serum. Recent studies have shown that the absence of c-kit protein in ovarian cancer is associated with a very low survival rate, with c-kit patients showing a higher survival rate in tumor tissue.
The cytosol values of uPA, PAI-1 and VEGF show a significant correlation with malignant developments and a low survival rate. Increased VEGF and suPAR values were found in the serum of patients with malignant ovarian cancer. However, further examination of sera from patients with ovarian cancer for uPA, PAI-1, HER-2 and VEGF did not result in the detection of a reliable tumor indicator that could be used for early diagnosis of tumor markers. The informative value of apoptosis-associated proteins (ARP), such as FAS and its ligand FAS-L, in ovarian cancer with regard to tumor development and overall survival was examined. It was found that there is a correlation between the high values of FAS-L and a low survival rate.
The same seems to apply in the case of an increased serum level of FAS. Furthermore, the FAS serum levels were higher in patients with ovarian cancer than in patients with benign ovarian cysts. A similar correlation was shown for p53 (another ARP) because
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increased p53 values have been associated with ovarian cancer, and low p53 values with ovarian cysts. However, the wide range of p53 concentrations complicates the prognostic evaluation. Similar differences in p53 concentrations with a similarly broad concentration range were found in the serum of patients with malignant ovarian tumors compared to the serum of patients with benign ovarian cysts.
No correlation was found between p53 expression in ovarian cancer and expression of the p21 protein (a cyclin-dependent kinase inhibitor).
There is therefore a need for a tumor marker which can reliably detect an ovarian tumor disease at an early stage or which allows the development of such a tumor to be predicted. Furthermore, for a meaningful diagnosis with subsequent therapy, it is necessary to quickly and reliably differentiate between benign, malignant and semimalignant ovarian tumors with the help of a marker.
This object is now achieved according to the invention by the method mentioned at the outset, which is characterized in that it comprises the steps: determining the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B in a sample taken from the individual or the cell culture, comparing the determined concentration (s) of at least one reference value, a cystic ovarian cancer being diagnosed if the determined concentration (s) is (are) above the reference value.
It has now been found for the first time that there is a connection between the concentration of calgranulin A or calgranulin B in an individual and the diagnosis of cystic ovarian cancer: If cystic ovarian cancer is diagnosed, overexpression of calgranulin A and / or Calgranulin B found compared to healthy individuals or individuals with benign ovarian tumors. This is the first time that a marker for cystic ovarian cancer has been made available that can specifically and reproducibly differentiate not only between healthy people and people suffering from cystic ovarian cancer, but also between malignant and benign ovarian tumors.
In the context of the present application, "diagnose" also means the distinction between semimalignant and benign or semimalignant and malignant ovarian tumors: patients with semimalignant ovarian tumors show a higher concentration of calgranulin A and / or calgranulin B than patients with benign ovarian tumors or healthy patients.
Similarly, patients with malignant ovarian cancer show a higher concentration of calgranulin A and / or calgranulin B than patients with semi-malignant ovarian cancer. Although semimalignant ovarian cancer is very rare, the diagnosis of such a borderline case is important. With the help of the determination of the Calgranulin A / B concentration, the diagnosis is made considerably easier and a highly specific and rapid diagnosis is now possible with the help of this new method.
Calgranulin A, also called MRP8, and calgranulin B, also called MRP14, are myeloid-related proteins and belong to the S100 family of calcium binding proteins. Calgranulin A and Calgranulin B are co-expressed and form a cell surface and cytoskeleton-associated heterodimer after calcium mobilization. This heterodimer is expressed in the cytoplasm of granulocytes and a subpopulation of blood monocytes.
These proteins are already used in various analysis methods:
For example, Hellmann et al. (Toxicol-Sci, 2001 May; 61 (1): 154-63) that MRP8 and MRP14 are under-expressed in lung carcinomas compared to normal healthy lung cells.
In Fung et al. (Life-Sci. 2000 July 14; 67 (8): 923-36) describes that in malignant NPE cells (nasopharyngeal epithelial cells) the expression of new genes, u. a. of calgranulin A and calgranulin B was suppressed, this differentiated expression of calgranulin A and calgranulin B in non-malignant and malignant NPE cells being confirmed by RT-PCR analyzes.
In the publication by Jungblut et al. (Electrophoresis 1999 July; 20 (10): 2100-10) discloses that calgranulin B is overexpressed in colorectal cancer cells.
In Stulik et al. (Clin-Chim-Acta. 1997 Sept. 8; 265 (1): 41-55) describes a study in
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who was found to overexpress calgranulin B in inflamed preneoplastic and neoplastic lesions of the colon mucosa.
Endress et al. (Lung-Cancer 1997 Aug .; 18 (1): 35-46) report on the role of macrophages in human lung carcinoma, whereby it was shown that MRP8 and MRP14 positive macrophages were present in fewer cases in lung carcinoma, while in 2710 positive cells were increasingly present.
In Schluesener et al. (Acta-Neuropathol- (Berl). 1998 Dec .; 96 (6): 575-80) described that MRP8 and MRP14 are expressed in microglial cells in patients with human cerebral malaria (CM).
In the article by Schmid et al. (Hum-Pathol. March 1995; a study is described in which it was found that the concentrations of MRP8 and MRP14 in the serum of patients with active Crohn's disease are increased, which is believed to be due to increased concentrations active secretion is caused by granulocytes, monocytes and epithelial cells.
In Koike et al. (J-Biochem- (Tokyo) 1998 June; 123 (6): 1079-87) describes a study in which the proteins MRP8 and MRP14 (migration inhibitory factor-related proteins) are associated with 2 human leukemia cell cultures ,
WO 00/26668 A2 discloses a method for diagnosing cancer, wherein values of S 100-AG, S 100-A7, S 100-A8 and S 100-A9 are measured in a sample of a person's biological fluid and with a Control value can be compared. An increased concentration, at least one of these proteins, suggests cancer, in particular breast, colon or lung cancer.
In Y. LI et al., "Study on dendritic cell phenotypic antigens in human ovaries ephital carcinoma", Zhongguo Mianyxue Zazhi, 17 (10), 2001, -seuteb 567-568, CAPLUS abstract, AN 2001: 859303, obtained via the CAPLUS database, STN-International, Karlsruhe (DE); describes that the number of positive dendritic cells in ovarian cancer is significantly increased and the expression level of CD1c and S 100 is lower in ovarian cancer than in normal ovarian tissue.
E.C. ILG et al., "Expression Pattern of S 100 Calcium Binding Proteins in Human Tumors", Int.
J. Cancer, 68, 1996, pages 325-332; the expression of S 100 proteins in tumors, but only S 100-A1, S 100-A2, S 100-A4, S 100-A6 and S 100 B were tested, but not S 100-A8 and S 100-A9.
Also in A. Mueller et al., "Subcellular distribution of S 100 proteins in tumor cells and their relation in response to calcium activation; Histochem. Cell. Biol., 111, 1999, pages 453-459; S 100 proteins in connection with tumor cells, but only S 100-A6, S 100-A4 and S 100-A2 are tested here, but not S 100-A8 and S 100-A9.
Accordingly, various diseases are known which are related to an overexpression or underexpression of calgranulin A or calgranulin B. However, no connection between cystic ovarian cancer and the concentration of calgranulin A or calgranulin B has been mentioned or suggested. The now newly discovered and surprising fact that patients with cystic ovarian cancer Calgranulin A or Calgranulin B are overexpressed can now be used as the basis for new, efficient and stable markers for cystic ovarian cancer.
In the context of the present application, calgranulin A and calgranulin B relate to proteins of the S 100 family of calcium binding proteins, namely the proteins MRP8 (S 100-A8) and MRP14 (S 100-A9) as described, for example, in Eue et al. (Int-Immunol. 2000 Nov; 12 (11): 1593-604).
In the context of the present application, “individual” is understood to mean in particular a human being but also a mammal which can develop cystic ovarian cancer.
The "cell culture" relates to any in vitro cultivation of cells, in particular ovarian cells, which may have been taken from a healthy individual, for example, and the development or development of cystic ovarian cancer can be examined on the basis of this cell culture. Of course, the cell culture can also be a culture of cells that have been removed from a patient with a positive diagnosis for cystic ovarian cancer.
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The concentration of calgranulin A / B is determined in a sample taken from the individual, the sample preferably being a body or organ fluid or an organ or tissue sample, such as serum, cyst fluid, ovarian tissue but also urine, etc. Im In the case of cell culture, the concentration is either in the cell culture directly or in a sample taken from the cell culture, e.g. B. supernatant or the cells themselves determined.
The concentration is determined according to a suitable method, the method being selected depending on the type of sample, the laboratory possibilities, the number of samples to be determined, but also on the desired accuracy. The calgranulin A / B concentration can be carried out, for example, electrophoretically, chromatographically, immunologically, colorimetrically or by a combination of these methods. Since a number of anti-calgranulin A / B antibodies are already available, immunological tests are extremely suitable, which can either be carried out directly on the tissue sample, or else in the liquid, for example with the aid of ELISA tests.
To differentiate between malignant or semimalignant and benign ovarian tumors or healthy patients, the reference value is the calgranulin A / B content in a corresponding "healthy" or "benign" sample or cell culture, ie. H. a sample taken from an individual who is not suffering from cystic ovarian carcinoma or a cell culture which has no cystic ovarian carcinoma. To differentiate between malignant and semi-malignant ovarian cancer, the reference value is the calgranulin A / B content z. B. in a corresponding "semimalignen" sample or cell culture or the limit calgranulin A / B content, d. H. the maximum semimalignant or minimum malignant calgranulin A / B content in a corresponding sample or
Cell culture. Such values can, for example, be read from comparison curves or tables or can also be determined by a determination carried out earlier or in parallel. The reference value should preferably come from a corresponding sample, i. that is, if the concentration in cyst fluid is determined, the reference value should also be of cyst fluid.
If the determined concentration is now above the reference value, this means an overexpression of calgranulin A / B in comparison to the reference or normal value, whereby this means a disease (malignant or semimalignant) of cystic ovarian cancer. Either the concentration of calgranulin A or that of calgranulin B or the concentrations of both proteins can be determined, the reference value of course being the corresponding concentration, i. H. likewise either Calgranulin A or Calgranulin B or both together. However, it has been shown that the calgranulin A concentration is particularly suitable for diagnosis.
The reference value is preferably the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B in a sample taken from a healthy individual or in a carcinoma-free cell culture.
This reference value is particularly favorable for distinguishing between (semi) malignant and benign tumors or healthy people. As already stated above, “a healthy individual” is understood to mean a corresponding individual who is free from cystic ovarian cancer. Of course, the individual from whom the reference value is determined should be the same as that in which the calgranulin A / B concentration is determined. This means that if the concentration is determined in a person, the reference value should also be determined in a (different) person in a corresponding sample. The same applies to the cell culture, whereby attention should be paid to the type of tissue or the growth stage of the cells in order to be able to make a meaningful and reproducible determination of the degree of disease.
In order to eliminate examination errors, it is favorable to carry out both determinations simultaneously in parallel experiments. Several samples can also be used to determine the reference value in order to form a reference mean.
A further aspect of the present application relates to a method for determining the positive or negative development of a cystic ovarian carcinoma in an individual or a cell culture, which comprises the steps: determining the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B in an individual or the sample taken from the cell culture, - comparing the determined concentration (s) with the corresponding
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value of a sample taken earlier from the same individual or the same cell culture, whereby a positive development of the cystic ovarian cancer is determined if the determined concentration (s) is (are) higher than the concentration value of the previously taken sample.
The same definitions and preferred embodiments as described above apply here. This method allows the development of the disease to be determined, a positive development meaning that the cystic ovarian cancer is spreading or growing. H. a worsening of the disease state, and a negative development a reduction or even disappearance of the cystic ovarian cancer, d. H. means an improvement in the state of the disease.
The earlier point in time can be the concentration value a few days, a week, months or even years ago. The concentration value can be that which was determined at the earlier point in time. In order to prevent possible inaccuracy of determination, however, it is also possible to carry out the concentration value on both samples at the same time, the sample taken at the earlier point in time being preserved in a suitable form, for example in a frozen state.
With this procedure it is possible to determine not only the development of cystic ovarian cancer itself, but also the influence of various substances, such as medication, on cystic ovarian cancer. In this way, therapies can be monitored. In the case of cell cultures, it is also possible to detect or investigate carcinogenic substances.
The sample taken from the individual is preferably selected from the group consisting of cyst fluid, cyst tissue, serum and urine. In particular, cyst fluid and serum have been found to be suitable for the method according to the invention, these samples being able to be taken in a simple manner in the course of routine examinations, which is a very uncomplicated and inexpensive way of detecting or examining cystic ovarian cancer.
A particularly advantageous method consists in that the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B is determined immunologically. These immunological determinations are particularly favorable since a number of polyclonal as well as monoclonal antibodies which are specific for calgranulin A and calgranulin B exist. Immunological procedures can be carried out both in liquid and on tissues. Examples of such methods are standard ELISA, sandwich ELISA, immunohistochemical methods, etc., these methods not only making it possible to detect calgranulin A / B, but also an exact quantification.
The concentration of calgranulin A and / or calgranulin B is preferably determined using monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies are highly specific and can be produced in a very simple and cost-effective manner using standard methods. On the other hand, monoclonal antibodies specific for calgranulin A / B already exist and are readily available.
Another preferred method is that the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B is determined by measuring the corresponding mRNA or fragments thereof. The measurement of mRNA molecules can be carried out by any conventional method, in particular by hybridization reactions or PCR, it being sufficient to detect a specific region in the mRNA molecule. This method can also be carried out directly in the sample.
Another aspect of the present invention relates to a kit for the detection of cystic ovarian cancer in an individual or a cell culture, which comprises - a reagent for determining the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B and - a calgranulin A and / or calgranulin B reference agent.
The reagent for determining the concentration of calgranulin A / B naturally depends on the respective detection method, although the kit can of course also comprise two or more reagents if these are necessary for the detection method. The reagent can e.g. B. Antibodies, buffers with detection substances and the like. Additional detection means, for example fluorescent, radioactive or chromogenic substances or also secondary antibodies, can also be provided.
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The reference agent is, for example, a sample comprising a standardized concentration of calgranulin A / B, for example in a buffer or also in a solution corresponding to the respective body fluid or cell culture sample. The reference means can also consist of a simple comparison value, a comparison table or a comparison curve.
The reagent for determining the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B preferably comprises antibodies, in particular monoclonal antibodies. It is advantageous if the antibodies are present in the reagent in a certain concentration, the anti-calgranulin A and anti-calgranulin B antibodies being able to be provided separately from one another but also together in the reagent. The antibodies can be bound to markers, for example to fluorescent, radioactive or chromogenic groups, or further secondary antibodies which are specific for the primary antibodies can be provided in the kit.
The antibodies are preferably immobilized on a solid support. This makes it possible for the samples to be applied only to the solid support or to flow over it, with calgranulin A / B being immobilized on the solid support via the antibodies.
Then washing steps can be carried out and the detection either directly on the solid support or after elution in the eluate. The carrier can be, for example, a chromatography column, a filter, a microtiter plate, well, etc.
Furthermore, it is advantageous if the kit comprises a solid support for immobilizing calgranulin A and / or calgranulin B. This solid support can be provided, for example, with the natural binding partners of calgranulin A / B, their analogs, parts of antibodies and the like. After immobilization of calgranulin A / B, the detection can again be carried out either directly on the solid support, for example with the aid of labeled or unlabeled antibodies, or after an elution step in the eluate. Here too, one of the carriers defined above can be provided as the carrier.
The reference agent particularly preferably comprises a standardized amount of calgranulin A and / or calgranulin B. This provides a kit which ensures parallel determination of the reference value, thereby eliminating possible inaccuracies in the determination method.
A further advantageous embodiment consists in the reference agent comprising a series of standardized calgranulin A and / or calgranulin B samples. These samples can e.g. B. represent certain degrees of disease, so that the extent or stage of the disease can be determined using only one determination method.
Calgranulin A and / or calgranulin B inhibitors can be used in the manufacture of a medicament for the treatment of cystic ovarian cancer. Since the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B is directly related to a disease of cystic ovarian cancer, a reduction in the concentration of calgranulin A / B or a complete switching off of calgranulin A / B can prevent a disease or as Therapy for a patient already suffering from cystic ovarian cancer.
Calgranulin A and / or calgranulin B inhibitors are understood to mean substances, molecules or proteins which, for example, prevent or reduce the expression of calgranulin A / B at the transcription level or translation level, specifically attack and, if appropriate, destroy proteins which are already expressed Activity of expressed calgranulin A / B proteins blocked etc. In particular, calgranulin A / B inhibitors are understood to mean calgranulin A / B antibodies, in particular monoclonal antibodies and also antibody fragments. In addition, non-active calgranulin A / B analogs could also be used, which act competitively with natural calgranulin A / B. Furthermore, calgranulin A / B inhibitors could be those which are used in gene silencing, knockout or antisense processes.
Of course, either calgranulin A or calgranulin B inhibitors can be used here. However, it is also possible to use both in a coordinated relationship to one another in one medication. In such a treatment of a patient with cystic ovarian cancer, the patient is administered a sufficient amount of calgranulin A and / or calgranulin B inhibitors. The definitions and preferred embodiments mentioned above again apply here, the administration taking place in particular orally or intravenously. "Treatment" means both the treatment of malignant or semi-malignant carcinomas and the prevention of worsening of the disease in the case
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of a benign carcinoma.
The prevention of a disease in a healthy patient is also understood.
The present invention will now be explained in more detail with reference to the following figures and examples, to which, however, it should not be restricted, FIGS. 1 to 3 the results of 2D gel electrophoresis examinations of various samples and FIGS. 4 and 5 show the amino acid sequences of MRP8 and MRP14.
example 1
Liquids from malignant, benign, and borderline ovarian tumors were collected during surgery or during routine examination. After centrifugation, these samples were aliquoted and frozen like the pellets. Blood samples from the same patients were also collected on the same day, and the supernatants were also divided into pellets and frozen after centrifugation.
A quantitative analysis of the aliquots of the liquid samples was carried out in order to determine the total amount of protein according to the Lowry method. For the analytical analysis of the liquids and the sera by means of 2D gel electrophoresis, denaturing agents were added to the aliquots in order to dissociate the proteins and to reduce the disulfide bonds.
In a first step, the proteins were separated using IEF (isoelectric focusing) in an electric field (pH 3-10). A second separation of the proteins was then carried out in an acrylic amide gradient gel (9-16%). The protein spots that position in the second dimension are thus characterized by two independent parameters, on the one hand by the isoelectric focusing and on the other hand by the molecular weight. The protein spots on the 2D gel are made visible using a modified silver staining method according to Blum. This method enables the identification of more than 100 proteins in the fluid of various ovarian tumors and in the serum of the patients, so that the different protein patterns can be compared with one another.
Example 2
13 malignant and 13 benign ovarian tumors were examined, whereby the cystic fluid and the serum of these 26 patients were analyzed by 2D gel electrophoresis. In order to obtain reproducible results, the samples were examined several times under individual conditions by 2D gel electrophoresis, a total of 235 gels were carried out (see Tables 1 and 2).
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Table 1: Malignant cystic ovarian tumors
EMI8.1
<tb> No. <SEP> diagnosis <SEP> degree of malignancy <SEP> 2D gels <SEP> total protein: mg / ml
<tb> (FIGO) <SEP> cysts <SEP> serum <SEP> cysts <SEP> serum
<tb> 1 <SEP> 16191229 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> II <SEP> IIb <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 55 <SEP> 61
<tb> Mucinous <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> II <SEP> IIb <SEP> 23 <SEP> 2 <SEP> 65 <SEP> 61
<tb> 2 <SEP> 40020252 <SEP> endometriotic <SEP> cystadenocar- <SEP> II <SEP> Yes <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 45 <SEP> 50
<tb> zinom
<tb> 3 <SEP> 36130461 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> I <SEP> Ib <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 19 <SEP> 49
<tb> 4 <SEP> 04010221 <SEP> undifferentiated <SEP> cystadenocar- <SEP> II <SEP> Ib <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 19 <SEP> 38
<tb> zinom
<tb> 5 <SEP> 77270223 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> III <SEP> Yes <SEP> 2
<SEP> 3 <SEP> 43 <SEP> 47
<tb> 6 <SEP> 94240661 <SEP> Mucinous <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> I <SEP> Yes <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 36 <SEP> 55
<tb> 7 <SEP> 95080861 <SEP> Mucinous <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> I <SEP> Yes <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 50 <SEP> 60
<tb> 8 <SEP> 63211146 <SEP> undifferentiated <SEP> cystadenocar- <SEP> II <SEP> IIb <SEP> 27 <SEP> 2 <SEP> 63 <SEP> 42
<tb> zinom
<tb> 9 <SEP> 67230452 <SEP> 'Mucinous <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> II <SEP> IIa <SEP> 8 <SEP> 5 <SEP> 79 <SEP> 80
<tb> 10 <SEP> 45291053 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> I <SEP> IIIb <SEP> 9 <SEP> 3 <SEP> 62 <SEP> 53
<tb> 11 <SEP> 97280346 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> II <SEP> Yes <SEP> 19 <SEP> 5 <SEP> 69 <SEP> 70
<tb> 12 <SEP> 62070158 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> II <SEP> IIIc <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> 75 <SEP> 76
<tb> 13 <SEP> 77030522 <SEP> Serious <September>
cystadenocarcinoma <SEP> III <SEP> IIIC <SEP> 9 <SEP> 5 <SEP> 75 <SEP> 70
<tb> total <SEP> 2D gels <SEP> 115 <SEP> 38 '
<Tb>
<Desc / Clms Page number 9>
5
10
15
20
25 30 35 40 45 50 55 Table 2: Non-malignant cystic ovarian tumors
EMI9.1
<tb> No. <SEP> diagnosis <SEP> histological <SEP> 2D gels <SEP> total proteins:
mg / ml
<tb> investigation <SEP> cysts <SEP> serum <SEP> cysts <SEP> serum
<tb> 1 <SEP> 87150523 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> none <SEP> malignancy <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 60 <SEP> 65
<tb> 2 <SEP> 24291249 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> none <SEP> malignancy <SEP> 5 <SEP> 78 <SEP> 63
<tb> 3 <SEP> 7310362 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> none <SEP> malignancy <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 70 <SEP> 60
<tb> 4 <SEP> 40270616 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> none <SEP> malignancy <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 60 <SEP> 76
<tb> 5 <SEP> 55170949 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> none <SEP> malignancy <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 47 <SEP> 60
<tb> 6 <SEP> 58060165 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> none <SEP> malignancy <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 79 <SEP> 71
<tb> 7 <SEP> 72110223 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> none <September>
malignancy <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 74 <SEP> 67
<tb> 8 <SEP> 65201072 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> none <SEP> malignancy <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 70 <SEP> '65
<tb> 9 <SEP> 26060978 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> none <SEP> malignancy <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 47 <SEP> 44
<tb> 10 <SEP> 77270135 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> none <SEP> malignancy <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 106 <SEP> 81
<tb> 11 <SEP> 29191274 <SEP> Sactosalpinx <SEP> none <SEP> malignancy <SEP> 7 <SEP> 3 <SEP> 47 <SEP> 60
<tb> 12 <SEP> 69130175 <SEP> Serious <SEP> cystadenocarcinoma <SEP> none <SEP> malignancy <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 90 <SEP> 65
<tb> 13 <SEP> 56030868 <SEP> dermoids <SEP> cysts <SEP> none <SEP> malignancy <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 41 <SEP> 63
<tb> total <SEP> 2D gels <SEP> 38 <SEP> 24 <September>
<Tb>
<Desc / Clms Page number 10>
In Fig.
1 to 3 the results are shown, with Fig.la and 3a showing samples from a patient with mucinous cystic carcinoma grade II / FIGO 11b, FIG. 2a showing a sample from a patient with serous cystic carcinoma. "C" means cyst fluid and "S" serum. The results show that the protein patterns of the ovarian cancer fluids are significantly different compared to the ovarian cyst fluids. In the lower molecular range between 10 and 25 kD in particular (see broad arrow in FIGS. 1 to 3), numerous additional protein spots can be seen both in the cyst fluid and in the serum of the patients with ovarian cancer (see FIGS. 1a to 3a) compared to patients with benign ovarian cysts (see Figures 1 b to 3b).
By means of partial amino acid sequence analysis, protein spots 1 were identified as calgranulin A (FIG. 4) and 2 as calgranulin B (FIG. 5), the respective sequence with its amino acids and also as a schematic representation being shown, "M" the mean mass , "S" sequence and "P" position mean. The amount of protein present with 100-300 ng protein per spot, based on the total amount of protein of 100 g examined in the 2D gel, is also sufficient for immunological tests.
The localization of these two proteins in the 2D gel was carried out for the first time.
The studies on samples from patients show additional protein spots that only occur in patients with malignant tumors. In one of the patients, abdomen ascites developed in addition to serous cystadenocarcinoma in the course of the disease. In this examination of the proteins using 2D gel electrophoresis, the cyst fluid and the ascitic fluid are very similar to one another.
Furthermore, additional proteins in the lower molecular range between 10 and 20 kD were found in the serum samples of the 13 patients with ovarian cancer. These additional proteins in the serum show strong similarities in their electrophoretic positioning to those found in the cyst fluids of the corresponding ovarian cancer patients. These additional proteins are undetectable in the serum of patients with benign ovarian cysts.
CLAIMS:
1. A method for diagnosing cystic ovarian cancer in an individual, in particular in a human or in a mammal, or in a cell culture, characterized in that it comprises the steps: - Determining the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B. in a sample taken from the individual or the cell culture, - comparing the determined concentration (s) of at least one reference value, a cystic ovarian cancer being diagnosed if the determined concentration (s) is (are) above the reference value ,