<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung betnfft einen molekularbiologischen Test-Kit für den Nachweis der bakteriellen Gene SLT1, SLT2 und rfbE.
Enterohaemorrhagische Stämme von Escherichia coli (EHEC), vor allem des Serotyps 0157:H7, haben als Lebensmittelpathogene in den letzten Jahren hauptsächlich in den USA, aber auch in einigen anderen Ländern durch die Verursachung von sporadischen, aber oft dramatischen und seit 1993 immer häufiger auftretenden Ausbrüchen von Erkrankungen für Aufmerksamkeit gesorgt. Infektionen traten vor allem durch den Verzehr von nicht vollständig durchgebratenem Fleisch (Hamburger), aber auch durch den Konsum von Rohmilch, Joghurt, Mettwurst, Apfel-Cider, Salat, Gemüse oder Keimlingen auf. Weitere Gefahrenquellen stellen mangelnde Hygiene mit Übertragung von Person zu Person sowie Trink- und Gebrauchswasser dar (Feng, P (1995): Escherichia coli Serotype 0157:H7: Novel Vehicles of Infection and Emergence of Phenotypic Variants. Emerg Infect Dis 1 (2) : 47-52).
Die Symptome einer Infektion mit enterohämorrhagischen E. coli reichen von wässriger über blutige Diarrhoe bis zu Schädigungen der Niere wie dem Hämolytisch-Urämischen Syndrom (HUS), das unter Umständen zum Tode führen kann (Griffin, PM, and Tauxe, RV (1991) : The Epidemiology of Infections Caused by Escherichia coli 0157:H7, Other Enterohemorrhagic E. coli, and the Associated Hemolytic Uremic Syndrome. Epidemiol Rev 13 : Besonders gefährdet sind naturgemäss Kinder, alte Menschen und Menschen mit Immunschwäche.
Der Nachweis von enterohämorrhagischen E. coli erfolgt in der Regel mittels klassischer mikro- biologischer, biochemischer und serologischer Methoden (Ausstrich auf Platte, biochemische Charakterisierung, Agglutinationstests, Enzyme-Linked Immonosorbent Assay - ELISA) und Metho- den der Zellkultur (z. B. Toxintest mit Verozellen), in letzter Zeit wird aber auch der Nachweis mittels modernerer molekularbiologischer oder immunologischer Verfahren immer wichtiger (Paton, AW, and Paton, JC (1998) : Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx1, stx2' eaeA, Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfb0111, and rfb0157- J Clin Microbiol 36 (2) : 598-602 ; Y, Zhang, Q, and Meitzler, JC (1999) : Rapid and sensitive detection of Escherichia coli 0157:H7 in bovine faeces by a multiplex PCR.
J Appl Micro- biol 87 : 867-876 ; Fratamico, PM, Bagi, LK, and Pepe, T (2000) : A Multiplex Polymerase Chain Reaction and Identification of Escherichia coli 0157:H7 in Foods and Bovine Feces. J Food Prot 63 (8) : 1032-1037 ; Ohiso, I, et al. (2000) : A fluorescence polarization assay using oligonucleotide probes for the rapid detection of verotoxin-producing Escherichia coli. J Biotechnol 81 : 15-25 ; Zhang, P, et al. (2000) : Rapid SLT Gene Detection on Polyethylene-Coacrylic Acid Film without Molecular labels or Surface-Fouling Agents. Anal Biochem 282 : Stokes, DL, Griffin, GD, and Vo-Dinh, T (2001):Detection of E. coli using a microfluidics-based antibody biochip detection system. Fresenius J Anal Chem 369: 295-301).
Chemical Abstract 134: 306102x berichtet über PCR-Testsysteme zum Nachweis von entero- hämorrhagischen E. coli - Genen mittels spezifischer Primer, deren Nukleotidsequenzen eng mit den die Schlüsselfaktoren der E. coli - Pathogenizität steuernden Genen, wie SLT1, SLT2, rfbE, verbunden sind.
Die DE 198 14 828 A beschreibt ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure, wobei mit Hilfe zweier Primer Amplifikate eines Teilstücks der Nukleinsäure hergestellt, diese mit einer Sonde hybridisiert und die resultierenden Hybride nachgewiesen werden.
Da enterohämorrhagische E. coli - Stämme einige genetische Besonderheiten aufweisen, die sie von nicht-pathogenen E. coli - Stämmen unterscheiden, können sie durch den Einsatz moleku- larbiologischer Verfahren, die diese Unterschiede nutzen, spezifisch detektiert werden. Die wich- tigsten für EHEC typischen Gene sind die Toxingene SLT1 und SLT2, sowie deren Varianten.
Deren Genprodukte sind zu einem grossen Teil für die Symptome einer Infektion mit EHEC verant- wortlich. Ein weiteres wichtiges Gen für einen Pathogenitätsfaktor von EHEC ist das eae-Gen. Da die allermeisten Epidemien von EHEC-Stämmen des Serotyps 0157:H7 ausgelöst werden, ist der Nachweis dieses Typs besonders wichtig. Gene, die charakteristisch für diesen Serotyp sind, sind beispielsweise die Gene rfbE, ein Gen aus dem Biosyntheseweg des 0157-Antigens, und fliC, das Gen für das H7-Antigen. Zumindest die beiden Gene für die Toxine SLT1 und SLT2 und das 0157-spezifische Gen rfbE sind wichtig für einen Test zur Routineuntersuchung von Lebensmit- teln, um die gefährlichen Krankheitserreger eindeutig als EHEC zu erkennen.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, ein Testinstrument bereitzustellen, mit welchem die drei
<Desc/Clms Page number 2>
für einen Nachweis von enterohämorrhagischen Escherichia coli - Stämmen bzw. des Serotyps 0157:H7 von E. coli - Stämmen erforderlichen Gene ohne grösseren apparativen und zeitlichen Aufwand in einer einzigen Reaktion detektiert werden können. Insbesondere soll dabei die Ver- wendung mutagener oder giftiger Substanzen vermieden werden. Es soll somit ein verlässliches Werkzeug für die Routineanalytik in der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln aber auch zur Cha- rakterisierung von aus beliebigen Quellen isolierten unbekannten E. coli - Stämmen zur Verfügung gestellt werden.
Angestrebt wurde ein Testinstrument, das auch einfach ausgestatteten Labors in möglichst kurzer Zeit (1 Arbeitstag) den Nachweis der charakteristischen EHEC-Gene ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss durch einen Test-Kit für den Nachweis der bakteriellen Gene SLT1, SLT2 und rfbE gelöst, welcher jeweils ein Primerpaar zur Amplifizierung mindestens eines Teils des SLT1-Gens, des SLT2-Gens und des rfbE-Gens in einer einzigen Reaktion und jeweils sowohl ein an einer festen Oberfläche immobilisiertes Oligonucleotid als Fangsonde als auch ein Oligonucleotid als Detektorsonde zur Hybridisierung der mit den Primern gewonnenen Amplifikate enthält.
Verglichen mit konventionellen Methoden (Plattenausstrich u. biochemische bzw. serologische Charakterisierung von Einzelkolonien oder ELISA) bietet der beschriebene molekularbiologische Nachweis von EHEC mittels des erfindungsgemässen Test-Kits wesentliche Vorteile. Da es für EHEC weder ein hundertprozentig verlässliches Selektionsmedium noch einen eindeutigen bioche- mischen Test gibt, ist eine Detektion mittels mikrobiologischer, biochemischer und serologischer Verfahren schwierig. Andere Bakteriengattungen wie Escherichia hermannii oder Hafnia spp. besitzen beispielsweise einen ähnlichen biochemischen Phänotyp wie 0157:H7, bzw. gibt es oft Kreuzreaktionen von Anti-0157-Seren mit anderen Bakterien wie Citrobacter freundii oder Yersinia enterocolitica.
Abgesehen davon sagt das Vorhandensein des 0157 Antigens alleine noch nichts darüber aus, ob es sich um einen pathogenen Organismus handelt (Feng, P (1995): Escherichia coli Serotype 0157:H7: Novel Vehicles of Infection and Emergence of Phenotypic Variants. Emerg Infect Dis 1 (2) : 47-52).
Oftmals kann die Diagnostik nur von Speziallabors durchgeführt werden. Kommerzielle ELISA- Tests, die das Genprodukt der SLT-Gene mit Hilfe von Antikörpern detektieren, sind zwar ebenfalls erhältlich, jedoch hängt ein erfolgreicher Nachweis davon ab, ob das entsprechende Genprodukt überhaupt gebildet wird. Weiters sind vor allem von SLT 2 mehrere Varianten bekannt, die sich in ihren antigenen Determinanten unterscheiden und nicht von allen Tests erkannt werden. Existie- rende molekularbiologische oder modernere immunologische Tests wiederum erfordern oft den Umgang mit mutagenen oder giftigen Substanzen wie etwa Ethidiumbromid (Zhang, P, et al.
(2000) : Rapid SLT Gene Detection on Polyethylene-Coacrylic Acid Film without Molecular labels or Surface-Fouling Agents. Anal Biochem 282 : die Anschaffung teurer optischer Spezialap- parate (Ohiso, I, et al. (2000) : A fluorescence polarization assay using oligonucleotide probes for the rapid detection of verotoxin-producing Escherichia coli. J Biotechnol 81 : 15-25 ; Stokes, DL, Griffin, GD, and Vo-Dinh, T (2001): Detection of E. coli using a microfluidics-based antibody biochip detection system. Fresenius J Anal Chem 369 : Chizhikov, V., Rasooly, A., Chumakov, K., und Levy, D. D. (2001): Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl. Environ. Microbiol.
67 (7) : 3258-3263) oder sind nicht so sensitiv wie die unten beschriebene Methode mittels des erfindungsgemässen Test-Kits (Paton, AW, and Paton, JC (1998) : Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx1' stx2, eaeA, Enterohe- morrhagic E. coli hlyA, rfbO111, and rfb0157. J Clin Microbiol 36 (2) : 598-602 ; Y, Zhang, Q, and Meitzler, JC (1999) : Rapid and sensitive detection of Escherichia coli 0157:H7 in bovine faeces by a multiplex PCR. J Appl Microbiol 87 : 867-876 ; Fratamico, PM, Bagi, LK, and Pepe, T (2000) : A Multiplex Polymerase Chain Reaction and Identification of Escherichia coli 0157:H7 in Foods and Bovine Feces. J Food Prot 63 (8) : 1032-1037 ; Ohiso,I, et al.
(2000) : A fluorescence polarization assay using oligonucleotide probes for the rapid detection of verotoxin-producing Escherichia coli.
J Biotechnol 81:15-25).
Beispielsweise beschreiben Fratamico et al. (J Food Prot 63 (8) : 1032-1037) eine Multiplex- PCR mit 5 Genen aus EHEC, mit der eine Sensitivität von 1 cfu/g Lebensmittel (Faschiertes) erreicht werden konnte, und zwar bei einer Anreicherungszeit von 12 Stunden, Testung eines einzigen Stammes und Verwendung von Agarosegelelektrophorese anstatt Hybridisierung. Die hier beschriebene Methode kann jedoch 1-10 cfu/25 g unter Verwendung 5 verschiedener Stämme
<Desc/Clms Page number 3>
nachweisen (allerdings wurden 12 Stunden nach Inokulation keine Proben gezogen, sondern erst nach 15 Stunden) und erfordert gleichzeitig nicht den Umgang mit Agarosegelen bzw. Ethidium- bromid. Ausserdem steigert eine Hybridisierung nicht nur die Sensitivität eines molekularbiologi- schen Tests durch Signalamplifikation bei der Detektion, sondern auch die Spezifität.
Gerade bei Multiplex-PCRs kann es durch die erhöhte Anzahl der verwendeten Primer zu un- spezifischen Reaktionen kommen, die in Gelen zu unspezifischen Banden führen und die Testin- terpretation stark beeinträchtigen können (Chizhikov, V., Rasooly, A., Chumakov, K., und Levy, D.
D. (2001):Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl. Environ. Microbiol. 67 (7) : 3258- 3263). Die deutsche Norm DIN10134: .Allgemeine verfahrensspezifische Anforderungen zum Nachweis von Mikroorganismen mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Lebensmitteln" schreibt beispielsweise vor, dass eine Verifizierung eines PCR-Ergebnisses durch Hybridisierung oder Sequenzierung erfolgen muss.
Die Kombination von Voranreicherung, DNA-Amplifizierung und Detektion durch den erfin- dungsgemässen Test-Kit erlaubt auch standardmässig ausgestatteten Routinelabors, EHEC schnell und sicher nachzuweisen. Lediglich ein Thermocycler und ein Wasserbad sind an zusätzlichen Apparaten notwendig. Wesentlich ist dabei, dass gleichzeitig drei für EHEC typische Gene in einem einzigen Schritt (Multiplex-Verfahren sowohl für Amplifizierung als auch für Hybridisierung) identifi- ziert werden können, wobei diese drei absolut notwendig für die Bewertung einer Probe auf EHEC des Serotyps 0157 sind (SLT1, SLT2, rfbE) und - in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung - das vierte Gen (fliC) weitere Informationen über den Serotyp liefert.
Die DNA- Sequenzen wurden dabei so ausgewählt, dass alle wichtigen Varianten der SLT-Gene und ein bzw. zwei Gene, die den für die meisten Erkrankungen verantwortlichen Serotyp 0157:H7 charakterisie- ren, erkannt werden, auch wenn diese Genprodukte aufgrund der momentanen physiologischen Situation von EHEC in einer Probe zum Zeitpunkt der Probennahme nicht gebildet werden. Somit ist eine verlässliche und sensitive Detektion von enterohämorrhagischen SLT-bildenden Escherichia coli - Stämmen bzw. des E. coli Serotyps 0157:H7, der auch bei Fehlen der SLT-Gene offensicht- lich in seltenen Fällen HUS auslösen kann, relativ einfach und schnell möglich.
Neben dem Nachweis des Serotyps 0157:H7 ist aber auch die Detektion von SLT-Genen mög- lich, die auch in anderen E. coli-Serotypen und sogar in anderen Bakteriengattungen vorkommen und dort die gleiche Erkrankung verursachen können (Paton, AW, and Paton, JC (1996): Entero- bacter cloacae Producing a Shiga-Like Toxin II-Related Cytotoxin Associated with a Case of He- molytic-Uremic Syndrome. J Clin Microbiol 34 (2) : 463-465 ; H, et al. (1995) : Verotoxi- genic Citrobacter freundii associated with severe gastroenteritis and cases of haemolytic uraemic syndrome in a nursery school: green butter as the infection source. Epidemiol Infect 114: 441-450).
Die gemäss der Erfindung erstellbaren Protokolle stellen somit ein sehr wertvolles Werkzeug für die Routineanalytik in der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln, aber auch zur Charakterisierung von aus beliebigen Quellen isolierten unbekannten E. coli - Stämmen dar.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Test-Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass das Primer- paar zur Amplifizierung des SLT1-Gens die Nukleotidsequenzen 5'-GCT ATA CCA CGT TAC AGC GTG TTG C-3' und 5'-GCT CTT GCC ACA GAC TGC GTC A-3' aufweist.
Vorzugsweise weist die Fangsonde zur Hybridisierung des SLT1-Gen-Amplifikats die Nukleo- tidsequenz 5'-TTT TTT TTT TTT TAT CTG CAT CCC CGT ACG ACT GA-3' auf. Die Nucleotidse- quenz der Detektorsonde ist bevorzugt 5'-ATA AGA AGT AGT CAA CGA ATG GCG A-3'.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Test-Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass das Primerpaar zur Amplifizierung des SLT2-Gens die Nukleotidsequenzen 5'-TTT CCA TGA CAA CGG ACA GC-3' und 5'-CCA CTG AAC TCC ATT AAC GCC-3' aufweist.
Vorzugsweise weist die Fangsonde zur Hybridisierung des SLT2-Gen-Amplifikats die Nukleo- tidsequenz 5'-TTT TTT TTT TTT GAC TGA TTT GCA TTC CGG AAC G-3' auf. Die Nucleotidse- quenz der Detektorsonde ist bevorzugt 5'-TGC GAC ACG TTG CAG AGT GGT AT-3'.
Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Test-Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass das Primerpaar zur Amplifizierung des rfbE-Gens die Nukleotidsequenzen 5'-CAC ACT TAT TGG ATG GTC TCA ATT C-3' und 5'-TTT CCG AGT ACA TTG GCA TCG-3' aufweist.
Vorzugsweise weist die Fangsonde zur Hybridisierung des rfbE-Gen-Amplifikats die Nukleotid- sequenz 5'-TTT TTT TTT TTT ACT GGC CTT GTT TCG ATG AGT TTA T-3' auf. Die Nucleotidse- quenz der Detektorsonde ist bevorzugt 5'-CTC TTT CCT CTG CGG TCC TAG TT-3'.
<Desc/Clms Page number 4>
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfasst der Test-Kit weiters ein Primerpaar zur Amplifizierung mindestens eines Teils des fliC-Gens in derselben Reaktion und sowohl ein an derselben festen Oberfläche immobilisiertes Oligonucleotid als Fangsonde als auch ein Oligonucleotid als Detektorsonde zur Hybridisierung der mit den Primern gewonnenen Amplifikate für den Nachweis des fliC-Gens.
Da dieses für das H7-Antigen des EHEC-Serotyps 0157:H7 charakteristische Gen auch bei Fehlen der SLT-Gene für eine HUS-Erkrankung verantwortlich sein kann, liefert dessen Nachweis eine zusätzliche wertvolle Information in der Lebensmittelqualitätskontrolle.
Bei dieser bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung weist das Primerpaar zur Amplifizierung des fliC-Gens vorzugsweise die Nukleotidsequenzen 5'-CCA ACA AAG CTG CAA CGG TAA G-3' und 5'-GTG ACT TTA TCG CCA TTC CCT AAT T-3'auf.
Vorzugsweise weist die Fangsonde zur Hybridisierung des fliC-Gen-Amplifikats die Nukleotidsequenz 5'-TTT TTT TTT TTT CAT AAA GAC CTG TCG TGG TGT TTA A-3' auf. Die Nucleotidsequenz der Detektorsonde ist bevorzugt 5'-TTC GCG CCA GCA GAA GTT AAA TCA-3'.
Nachfolgend sind DNA-Sequenzen und Methoden zur Verwendung im erfindungsgemässen Test-Kit zum Nachweis von Fragmenten aus vier für EHEC charakteristischen Genen beschrieben, wobei diese Fragmente durch die Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase gemeinsam in derselben Reaktion amplifiziert werden. Die dabei entstehenden doppelstrangigen DNA-Fragmente werden danach in Einzelstränge zerlegt (denaturiert), und einer der jeweiligen Einzelstränge wird mittels Hybridisierung mit an einer beliebigen festen Oberfläche (Membran, Mikrotiterplatte, Elektrode, Chip, Polystyrolkügelchen oder Ähnliches) gebundenen Oligonukleotiden (Fangsonden), deren Nukleotidsequenzen jeweils komplementär zu den betreffenden Einzelsträngen sind, gebunden.
Gleichzeitig erfolgt eine Hybridisierung dieses Komplexes mit weiteren jeweils passenden Oligonukleotiden (Detektorsonden), die an weitere jeweils komplementäre Stellen der DNA-Einzelstränge binden, und die mit einer Markierung versehen sind, die optisch, autoradiographisch, elektrochemisch oder enzymatisch direkt oder indirekt detektierbar ist (siehe Fig. 1).
Die einzelnen DNA-Sequenzen (Primerpaare) für die Amplifizierung von drei bzw. vier für EHEC charakteristischen Genabschnitte wurden insbesondere geeignet zur gemeinsamen Verwendung in einer einzigen Reaktion (Multiplex-Reaktion) entworfen, wobei mindestens SLT1, SLT2 und rfbE in einer Reaktion enthalten sein müssen. Ausserdem wurde angestrebt, möglichst kleine und in ihrer Grösse ähnliche Amplifizierungsprodukte zu bilden, um eine möglichst hohe und auch ähnliche Amplifizierungseffizienz für die einzelnen Genabschnitte und eine möglichst kurze Reaktionszeit bei der Amplifzierung zu erreichen.
Die DNA-Sequenzen für die an die feste Oberfläche gebundenen Fangsonden sowie für die markierten Detektorsonden wurden weiters so gewählt, dass für alle DNA-Sequenzen eine spezifische Hybridisierung und somit auch ein spezifischer Nachweis unter den gleichen Bedingungen ermöglicht wird (Multiplex-Hybridisierung).
Zur Amplifizierung eines Teils des SLT1-Gens aus EHEC haben sich DNA-Sequenzen gemäss der Ansprüche 2 und 3 als besonders effektiv erwiesen. Die in den Ansprüchen 6 und 7 geoffenbarten DNA-Sequenzen sind auf die Amplifizierung des in EHEC ebenfalls vorkommenden SLT2-Gens und der meisten seiner Varianten gerichtet. Die Gegenstände der Ansprüche 10 und 11bilden DNA-Sequenzen, die geeignet zur Amplifizierung eines Teils des rfbE-Gens aus E. coliStämmen (insbesondere 0157:H7), die das 0157 - Antigen aufweisen, sind. Die Primer, die in den Ansprüchen 15 und 16 beschrieben sind, dienen der Amplifizierung eines Teils des fliC-Gens aus E coli - Stämmen (insbesondere 0157:H7), die das H7 - Antigen besitzen. Die Fangsonden und die Detektorsonden zum Nachweis der jeweiligen Amplifikate sind in den Ansprüchen 4, 5, 8, 9, 12, 13,17 und 18 beschrieben.
Im Folgenden wird die Erfindung durch einen ein mehrteiliges, beschreibendes Beispiel umfassenden Beispielsteil näher erläutert.
Beispielsteil:
Material und Methoden:
Bakterien-Stämme : Enterohämorrhagische Escherichia coli-Stämme stammen von der American Type Culture Collection (ATCC). Tabelle 1 zeigt eine Auflistung der verwendeten Stämme und
<Desc/Clms Page number 5>
der Gene, die jeweils vorhanden sind. Als Negativkontrollstamm wurde ein nicht-pathogener Wild- typstamm aus der firmeneigenen Stammsammlung verwendet, der aus Wasser isoliert worden war. Die Stämme wurden auf Plate-Count-Agarplatten gehalten, Über-Nacht-Kulturen wurden in flüssigem LB-Medium hergestellt.
Ziel-Sequenzen: Die DNA-Sequenzen für SLT-, rfbE - und fliC - Gene, die für das Design von geeigneten Oligonukleotiden verwendet wurden, stammen aus der GenBank Datenbank der NIH (National Institutes of Health, www.ncbi.nlm.nih.gov) und wurden mit Hilfe von DNA-Analyse- software wie GeneRunner (www.qenerunner.com) bzw. PC/Gene (Intelligenetics Inc., Genf, Schweiz) aufbereitet und analysiert. Nach multiplen Sequenzvergleichen (Higgins, D. G. und Sharp, P. M. (1988) : CLUSTAL : package for performing multiple sequence alignment on a micro- computer. Gene 73 (1):237-244) wurden stark konservierte Bereiche der jeweiligen Gene ausge- sucht. In diesen Bereichen wurden dann Amplifizierungsprimer, Fangsonden und Detektorsonden festgelegt (Rychlik, W., Spencer, W. J., and Rhoads, R.
E.: (1990) : Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucl. Acids Res. 18 (21): 6409-6412), wobei darauf geachtet wurde, dass sich die Annealingtemperaturen aller primer für die Multiplex-Amplifizierungs- reaktion nicht zu stark voneinander unterscheiden. Ebenso wurde versucht, Sonden mit möglichst ähnlicher Schmelztemperatur zu finden. So sollte ein gleichzeitiger Nachweis aller bisher bekann- ten Varianten aller betreffenden Gene unter denselben Bedingungen erreicht werden.
Primer-Oligonukleotide, Fangsonden und Detektorsonden : Sequenzen der Primer und Sonden sind in Tabelle 2 angegeben. Fangsonden weisen am 5'- Ende zusätzlich zur spezifischen Sequenz 12 Desoxy-Thymidine als "Abstandshalter" (Spacer) zur Membran auf. Sämtliche Oligo- nukleotide ausgenommen markierte Detektorsonden wurden von VBC-GENOMICS Bioscience GmbH, Rennweg 95B, 1030 Wien, Österreich, bezogen, Detektorsonden wurden von der Firma DNA Technology A/S (Science Park Aarhus, Gustav Wieds Vej 10A, DK-8000 Aarhus,Dänemark) bezogen und waren im beschriebenen Fall mit dem Enzym Alkalische Phosphatase gekoppelt (Hermanson, G. T : Conjugation to DNA. In: Bioconjugate Techniques, Kapitel 17, S.
662-668, Academic Press, San Diego, California, USA, ISBN 0-12-342336-8). Oligonukleotide wurden mittels Phosphoramidit-Chemie (Beaucage, S. L., und Caruthers, M. H. (1981) : Deoxynu- cleoside phosphoramidites - a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis.
Tetrahedron Lett. 22 : in automatisierten Systemen synthetisiert.
Immobilisierung der Fangsonden auf Membranen zur Verwendung als Teststreifchen : Fang- sonden wurden in 6xSSC (20x SSC = 3M NaCI und 0,3M Tri-Natriumcitrat-Dihydrat) in einer Kon- zentration von 2 g / l gelöst. Je 1 g (0,5 l) der jeweiligen Fangsonden wurden nebeneinander auf in Streifchen geschnittene positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics GmbH, Engel- horngasse 3, A-1211 Wien, Österreich) mittels Mikropipette aufgetragen. Als Negativkontrolle diente 1 g denaturierte Heringsperma-DNA (Roche Diagnostics GmbH, Engelhorngasse 3, A-1211 Wien, Österreich). Die aufgetragene DNA wurde mittels UV-crosslinking immobilisiert (3 Minuten, UV-C Lampe, Abstand ca. 30 cm). Reihenfolge von links nach rechts: SLT1-CPD, SLT2-CPD, RFB-CPD1, FLI-CPD, Heringsperma-DNA.
Fleischproben: Faschiertes gemischtes Schweine- und Rindfleisch wurde bei einem Fleisch- hauer gekauft und bis zur Verwendung gekühlt aufbewahrt.
Keimzahlbestimmung: Nach Kalibrierung der Messmethode für alle verwendeten Stämme durch Vergleich der Ergebnisse mit den Ergebnissen aus der Plate-Count-Methode (Kolonienzahl auf Platten) wurde die Keimzahl der zur Inokulation verwendeten Über-Nacht-Kulturen von EHEC mittels BacTrac 4100 - Analysesystem (SY-LAB Geräte GmbH, Tullnerbachstrasse 61-65,3011 Neupurkersdorf, Österreich) nach Vorgabe des Herstellers impedimetrisch bestimmt.
Anzucht und Voranreicherung: Je 25 g Faschiertes wurden in Stomacherbeutel mit Filterein- satz (Bagfilter von Interscience, F-78860 St. Nom, Frankreich) eingewogen, mit 225 ml Anreiche- rungsmedium (gepuffertes Peptonwasser von Oxoid (CM 509) + 5 g/ L Lactose) versetzt, im Stomacher eine Minute lang homogenisiert, mit Verdünnungen von EHEC- Über-Nacht-Kulturen mit bekannter Keimzahl inokuliert und bei 37 C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Beimpfung (4,6, 8 und 15 Stunden) wurden für DNA-Extraktionen Proben entnommen.
DNA-Amplifizierunq einzelner Genabschnitte: Alle Amplifizierungsreaktionen erfolgten stan- dardmässig mittels thermostabiler DNA-Polymerase (Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Schare, S. S., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B., und Erlich, H. A. (1988) : Primerdirected enzymatic
<Desc/Clms Page number 6>
amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487-491).Aufamplifizie- rungen für einzelne Genabschnitte wurden mit folgendem Zeit/Temperaturprofil in einem GP-001 Thermocycler (Corbette Research, 1/14 Hilly St., Mortlake 2137, N. S.W. Australien) und in einem Volumen von 25 l durchgeführt : 15 Minuten 95 C, dann 40 Zyklen mit 30 Sekunden 94 C, 30 Sekunden 60 C und 30 Sekunden 72 C, abschliessende Extension 10 Minuten bei 72 C.
Reaktionsbedingungen (Endkonzentrationen): 1xAmplifizierungspuffer, 2,5 mM MgCI2, Nukleo- tidmix (je 200 uM dATP, dGTP, dCTP und dTTP oder je 200 uM dATP, dGTP, dCTP und 600 uM dUTP), je 1 uM SLT1-f1, SLT1-r1, SLT2-f1, SLT2-r2, RFB-f1, RFB-r1, FLI-f1 und FLI-r1, 1-2,5 U thermostabile DNA-Polymerase, bei Bedarf und Verwendung von dUTP statt dTTP: 1 U Uracil-N- Glycosylase (Roche Diagnostics GmbH, Engelhorngasse 3, A-1211 Wien, Österreich).
Nukleotid- mix von Roche, einzelne Nukleotide sowie Amplifizierungspuffer und DNA-Polymerase von Genec- raft, Tresckow-Strasse 10, D-48163 Münster, Bundesrepublik Deutschland.
EMI6.1
segelen aufgetrennt, wobei 1x TBE (0,09 M Tris-Base, 0,09M Borsäure, 0,002M EDTA) als Lauf- puffer und eine 100 Basenpaar-Leiter (Life Technologies GmbH, Haus 223, A-5090 Lofer, Öster- reich) als Molekulargewichtsmarker verwendet wurden. Gele wurden danach mit Ethidiumbromid gefärbt und mittels Bildverarbeitungssystem dokumentiert (Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Mania- tis, T.: Molecular Cloning. A laboratory manual, 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Kapitel 6).
Reinigung amplifizierter Fragmente aus Einzelamplifizierungen: Um die Grenze der Nachweis- barkeit für die einzelnen Genabschnitte zu bestimmen, wurden Fragmente aus einem Agarosegel nach einer Elektrophorese ausgeschnitten und mittels eines Spin Column Kits (QIAquick Gel Extraction Kit von Qiagen, Max-Volmer-Strasse 4, D-40724 Hilden, Bundesrepublik Deutschland) aufgereinigt.
Testdurchführung :
DNA-Extraktion :
Genomische DNA aus EHEC-Stämmen und aus dem Negativkontrollstamm (Reinkulturen) wurde mittels kommerziell erhältlicher Spin Column Kits (NucleoSpin TM Tissue Kit von Macherey- Nagel GmbH & Co.KG, P.O. Box 10 13 52, D-52313 Düren bzw. High Pure PCR Template Prepa- ration Kit von Roche Diagnostics GmbH, Engelhorngasse 3, A-1211 Wien, Österreich) aus einfa- chen Über-Nacht-Kulturen isoliert.
DNA aus den Fleischproben wurde durch folgendes Vorgehen isoliert: - Zentrifugation von 1 ml Kulturüberstand der Fleischprobe in 1,5 ml Röhrchen in einer Eppen- dorfzentrifuge (5 Minuten, 16. 000 g) - Abheben und Verwerfen des Überstands, Aufnahme der sedimentierten Bakterien in 1 ml sterilem destilliertem Wasser, gründliche Resuspendierung - Abzentrifugieren der Bakterien wie oben und Resuspendierung des Bakterien-Pellets in 100 l (bei 4-8 Stunden Inkubation) bzw. 200 l (15 Stunden Inkubation) sterilem destilliertem Was- ser.
- Erhitzen der Bakteriensuspension auf 100 C (20 Minuten, Heizblock) - Abzentrifugieren der Zellreste wie oben und Transfer von 80 bzw. 170 l des resultierenden Überstandes in frische Röhrchen.
- Aufbewahrung der Proben bis zur Amplifizierung bei -20 C.
Multiplex-DNA-Amplifizierung:
Multiplex-Aufamplifizierungen wurden mit folgendem Zeit/Temperaturprofil in einem GP-001 Thermocycler (Corbette Research, 1/14 Hilly St., Mortlake 2137, N.S.W. Australien) und einem Volumen von 25 l durchgeführt : 15 Minuten Denaturierung bei 95 C, dann 2 Zyklen mit 30 Se- kunden Denaturierung bei 94 C, 30 Sekunden Annealing bei 65 C und 30 Sekunden Extension bei 72 C. Anschliessend 40 Zyklen mit 30 Sekunden Denaturierung bei 94 C, 30 Sekunden An- nealing, wobei die Temperatur 5 Zyklen lang in jedem Zyklus um 1 C abgesenkt wurde, bis 60 C erreicht waren (Touchdown-Amplifizierung), 30 Sekunden 72 C, abschliessende Extension 10 Minuten bei 72 C.
Reaktionsbedingungen (Endkonzentrationen): 1x Amplifizierungspuffer, 2,5 mM MgCI2, Nukleo-
<Desc/Clms Page number 7>
tidmix (je 200 uM dATP, dGTP, dCTP und dTTP oder je 200 M dATP, dGTP, dCTP und 600 uM dUTP), je 0,15 uM SLT1-f1 und SLT1-r1, je 1 uM SLT2-f1, SLT2-r2, RFB-f1, RFB-r1, FLI-f1 und FLI-r1, 1-2,5 U thermostabile DNA-Polymerase, bei Bedarf und Verwendung von dUTP statt dTTP: 1 U Uracil-N-Glycosylase (Roche Diagnostics GmbH, Engelhorngasse 3, A-1211 Wien, Österreich). Nukleotidmix von Roche, einzelne Nukleotide von Genecraft, Tresckow-Strasse 10, D-48163 Münster, Bundesrepublik Deutschland.
Hybridisierung: Prähybridisierungslösung (Endkonzentrationen) : 5xSSC (20x SSC = 3M NaCI und 0,3M Tri-Natriumcitrat-Dihydrat), 0,1% N-Lauroylsarcosin, 0,02% SDS, 1% Blocking Reagenz (Roche), 100 g / ml denaturierte Heringsperma-DNA (Roche). Hybridisierungslösung (Endkonzentrationen): 5xSSC, 0,1% N-Lauroylsarcosin, 0,02% SDS, 1 % Blocking Reagenz (Roche), 70 pM SLT1-CO, 1 nM SLT2-CO, 136 pM RFB-CO, 1 nM FLI-CO.
- Die Streifchen mit den immobilisierten Fangsonden wurden in Prähybridisierungslösung bei
42 C im Schüttelwasserbad zum Abblocken freier Stellen auf der Membran inkubiert (0,5 ml pro Streifchen, ca. 15 Minuten).
- 10 l der Proben aus der Multiplex-Amplifizierungsreaktion wurden mit 1 l 1 N NaOH versetzt und 10 Minuten bei 37 C denaturiert.
- Denaturierte DNA einer Probe und ein vorgeblocktes Streifchen wurden jeweils gemeinsam in
0,5 ml vorgewärmter Hybridisierungslösung für 15 Minuten bei 42 C inkubiert (in einem steri- len 2 ml Plastikröhrchen).
- Danach wurde das Streifchen zweimal mit mindestens 2 ml Waschlösung (0,1xSSC, 0,1%
SDS) bei 42 C für mindestens 5 Minuten gewaschen.
Farbdetektion : Die Detektion erfolgte in diesem Beispiel enzymatisch mittels Umsetzung von Nitroblau-Tetrazolium-Chlorid und 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat durch die an die Detektorsonden gekoppelte Alkalische Phosphatase. Verwendet wurde hierfür der Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate Kit von Bio-Rad Laboratories Ges. m. b. H. (Auhofstrasse 78D, A-1130 Wien, Österreich).
- Die Streifchen wurden kurz in Substratpuffer ohne Substrate (0,1 M Tris/HCI, pH 9,5) ge- schwenkt.
- Inkubation der Streifchen in Substratpuffer mit Substraten (1 ml pro Streifchen) bei 37 C (bis zu 2 Stunden).
- Abbbruch der Farbreaktion durch Schwenken der Streifchen in destilliertem Wasser und Aus- wertung des Ergebnisses unmittelbar nach Trocknen der Streifchen.
Ergebnisse :
EMI7.1
zierungs- und Hybridisierungsbedingungen lieferten sehr gute Ergebnisse mit allen verwendeten Proben. Die Signale für die einzelnen Gene waren genügend stark und unterschieden sich auch nicht zu sehr in ihrer Intensität. Es wurden keine Kreuzreaktionen zwischen den verschiedenen Amplifikaten festgestellt, ausser einer ganz leichten Reaktion zwischen SLT1-Fragment und RFB-CPD. Dieses Problem konnte durch Verwendung der alternativen Fangsonde RFB-CPD1 gelöst werden.
Spezifität. Sensitivität : Mit dem beschriebenen Multiplex-Assay konnten < 5 ng gereinigtes amplifiziertes Fragment (SLT1, SLT2, RFB oder FLI) reproduzierbar nachgewiesen werden. Dies ist eine höhere Sensitivität als sie routinemässig beispielsweise in einer Agarosegelelektrophorese durch Färbung der DNA mit Ethidiumbromid möglich ist. Eine Hybridisierung nach erfolgter Amplifi- zierung erhöht also die Sensitivität (siehe auch Paton, AW, and Paton, JC (1998) : Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx1, stx2' eaeA, Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbOm, and rfbO157. J Clin Microbiol 36 (2) : 598-602).
In Versuchen mit gereinigter genomischer DNA aus 5 verschiedenen EHEC-Stämmen konnten je nach Stamm bei Vorliegen von 10 bis 100 Genomäquivalenten pro Assay alle in den jeweiligen Stämmen vorhandenen Gene gefunden werden (Abbildung 2).
Versuche mit künstlich kontaminierten Fleischproben zeigten, dass bei einer Anreicherungszeit von 8 Stunden bei 4 von 5 Stämmen der Nachweis aller vorhandenen Gene bei einer Inokulati- onsmenge von 1-10 EHEC/ 25 g Faschiertem und in einem Fall bei einer Inokulationsmenge von
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
werden. (Abbildung 3).
Tabelle 1: Verwendete ATCC-Stämme von Escherichia coli TCC-Nummer Bescbreibung Scrotyp Vorhandene ATCC-Nummer Beschreibung Toxingene ATCC 43889 Aus Faeces eines HUS*-Patienten,NOrth Carolina 0157:H7 SLT2 ATCC 43890 Aus hurmanen Faceces, Calfonmien O157 :H7 SLTI
EMI8.2
EDL 933 O157:H7 SLT1,SLT2 ATCC 35150 Aus humanen Faeces, Stamm EDL 931 O138:K81(B):H14 SLT2-Variante ATCC 23545 Aus Schwein (Edema Discase) O138 :K81(B):H14 SLTs-Variante * Haemolytisch-Uraemisches Syndrom
<Desc/Clms Page number 9>
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Tabelle 2: Primer-Oligonukleotide, Fangsonden und Detektorsonden Name Sequenz Funktion
EMI9.1
SLT1-CO 5'-ATA AGA AGT AGT CAA CGA ATG GCG A-3' Detektorsonde fur SLTI-Amplifikat SLT2-fl 5-CCA CTG TGA CAA CGG ACA GC-3' Forward Primer für SLT2-Gen
EMI9.2
<Desc / Clms Page number 1>
The invention relates to a molecular biological test kit for the detection of the bacterial genes SLT1, SLT2 and rfbE.
Enterohaemorrhagic strains of Escherichia coli (EHEC), especially of the serotype 0157: H7, have been used as food pathogens in the past few years mainly in the United States, but also in some other countries, by causing sporadic, but often dramatic, and more and more frequent occurrences since 1993 Outbreaks of illnesses attracted attention. Infections occurred primarily through the consumption of meat that was not fully roasted (hamburgers), but also through the consumption of raw milk, yogurt, sausage, apple cider, lettuce, vegetables or seedlings. Further sources of danger are poor hygiene with transmission from person to person and drinking and service water (Feng, P (1995): Escherichia coli Serotype 0157: H7: Novel Vehicles of Infection and Emergence of Phenotypic Variants. Emerg Infect Dis 1 (2): 47-52).
The symptoms of infection with enterohaemorrhagic E. coli range from watery to bloody diarrhea to damage to the kidney such as hemolytic-uremic syndrome (HUS), which can possibly lead to death (Griffin, PM, and Tauxe, RV (1991): The Epidemiology of Infections Caused by Escherichia coli 0157: H7, Other Enterohemorrhagic E. coli, and the Associated Hemolytic Uremic Syndrome.Epidemiol Rev 13: Naturally, children, the elderly and people with immunodeficiency are particularly at risk.
Enterohaemorrhagic E. coli is usually detected using classic microbiological, biochemical and serological methods (smear on plate, biochemical characterization, agglutination tests, enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA) and methods of cell culture (e.g. Toxin test with Vero cells), but more recently, detection using modern molecular biological or immunological methods has become increasingly important (Paton, AW, and Paton, JC (1998): Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx1, stx2 'eaeA, Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfb0111, and rfb0157- J Clin Microbiol 36 (2): 598-602; Y, Zhang, Q, and Meitzler, JC (1999): Rapid and sensitive detection of Escherichia coli 0157: H7 in bovine faeces by a multiplex PCR.
J Appl Microbiol 87: 867-876; Fratamico, PM, Bagi, LK, and Pepe, T (2000): A Multiplex Polymerase Chain Reaction and Identification of Escherichia coli 0157: H7 in Foods and Bovine Feces. J Food Prot 63 (8): 1032-1037; Ohiso, I, et al. (2000): A fluorescence polarization assay using oligonucleotide probes for the rapid detection of verotoxin-producing Escherichia coli. J Biotechnol 81: 15-25; Zhang, P, et al. (2000): Rapid SLT Gene Detection on Polyethylene-Coacrylic Acid Film without Molecular labels or Surface-Fouling Agents. Anal Biochem 282: Stokes, DL, Griffin, GD, and Vo-Dinh, T (2001): Detection of E. coli using a microfluidics-based antibody biochip detection system. Fresenius J Anal Chem 369: 295-301).
Chemical Abstract 134: 306102x reports on PCR test systems for the detection of enterohemorrhagic E. coli genes using specific primers, the nucleotide sequences of which are closely linked to the genes controlling the key factors of E. coli pathogenicity, such as SLT1, SLT2, rfbE ,
DE 198 14 828 A describes a method for the detection of a nucleic acid, wherein amplificates of a section of the nucleic acid are produced using two primers, these are hybridized with a probe and the resulting hybrids are detected.
Since enterohaemorrhagic E. coli strains have some genetic peculiarities that distinguish them from non-pathogenic E. coli strains, they can be specifically detected by using molecular biological methods that use these differences. The most important genes typical for EHEC are the toxin genes SLT1 and SLT2 and their variants.
Their gene products are largely responsible for the symptoms of an infection with EHEC. Another important gene for a pathogenicity factor of EHEC is the eae gene. Since the vast majority of epidemics are caused by EHEC strains of serotype 0157: H7, the detection of this type is particularly important. Genes that are characteristic of this serotype are, for example, the genes rfbE, a gene from the biosynthetic pathway of the 0157 antigen, and fliC, the gene for the H7 antigen. At least the two genes for the toxins SLT1 and SLT2 and the 0157-specific gene rfbE are important for a test for routine food testing in order to clearly identify the dangerous pathogens as EHEC.
The invention has for its object to provide a test instrument with which the three
<Desc / Clms Page number 2>
genes required for the detection of enterohaemorrhagic Escherichia coli strains or of the serotype 0157: H7 of E. coli strains can be detected in a single reaction without major expenditure of equipment and time. In particular, the use of mutagenic or toxic substances should be avoided. It is intended to provide a reliable tool for routine analysis in the quality control of food but also for the characterization of unknown E. coli strains isolated from any source.
The aim was to develop a test instrument that enables even simply equipped laboratories to detect the characteristic EHEC genes in the shortest possible time (1 working day).
This object is achieved according to the invention by a test kit for the detection of the bacterial genes SLT1, SLT2 and rfbE, which each have a primer pair for amplifying at least a part of the SLT1 gene, the SLT2 gene and the rfbE gene in a single reaction and each contains both an oligonucleotide immobilized on a solid surface as a capture probe and an oligonucleotide as a detector probe for hybridizing the amplified products obtained with the primers.
Compared with conventional methods (plate smear and biochemical or serological characterization of individual colonies or ELISA), the described molecular biological detection of EHEC by means of the test kit according to the invention offers significant advantages. As there is neither a 100% reliable selection medium nor a clear biochemical test for EHEC, detection using microbiological, biochemical and serological methods is difficult. Other bacterial genera such as Escherichia hermannii or Hafnia spp. have, for example, a similar biochemical phenotype as 0157: H7, or there are often cross-reactions of anti-0157 sera with other bacteria such as Citrobacter freundii or Yersinia enterocolitica.
Apart from that, the presence of the 0157 antigen alone does not indicate whether it is a pathogenic organism (Feng, P (1995): Escherichia coli Serotype 0157: H7: Novel Vehicles of Infection and Emergence of Phenotypic Variants. Emerg Infect Dis 1 (2): 47-52).
Diagnostics can often only be carried out by special laboratories. Commercial ELISA tests that detect the gene product of the SLT genes with the aid of antibodies are also available, but successful detection depends on whether the corresponding gene product is formed at all. Furthermore, several variants of SLT 2 are known, which differ in their antigenic determinants and are not recognized by all tests. Existing molecular biological or more modern immunological tests, in turn, often require handling mutagenic or toxic substances such as ethidium bromide (Zhang, P, et al.
(2000): Rapid SLT Gene Detection on Polyethylene-Coacrylic Acid Film without Molecular labels or Surface-Fouling Agents. Anal Biochem 282: the purchase of expensive special optical devices (Ohiso, I, et al. (2000): A fluorescence polarization assay using oligonucleotide probes for the rapid detection of verotoxin-producing Escherichia coli. J Biotechnol 81: 15-25; Stokes , DL, Griffin, GD, and Vo-Dinh, T (2001): Detection of E. coli using a microfluidics-based antibody biochip detection system. Fresenius J Anal Chem 369: Chizhikov, V., Rasooly, A., Chumakov, K., and Levy, DD (2001): Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl. Environments. Microbiol.
67 (7): 3258-3263) or are not as sensitive as the method described below using the test kit according to the invention (Paton, AW, and Paton, JC (1998): Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx1 'stx2, eaeA, Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbO111, and rfb0157. J Clin Microbiol 36 (2): 598-602; Y, Zhang, Q, and Meitzler, JC (1999): Rapid and sensitive detection of Escherichia coli 0157: H7 in bovine faeces by a multiplex PCR. J Appl Microbiol 87: 867-876; Fratamico, PM, Bagi, LK, and Pepe, T (2000): A Multiplex Polymerase Chain Reaction and Identification of Escherichia coli 0157: H7 in Foods and Bovine Feces. J Food Prot 63 (8): 1032-1037; Ohiso, I, et al.
(2000): A fluorescence polarization assay using oligonucleotide probes for the rapid detection of verotoxin-producing Escherichia coli.
J Biotechnol 81: 15-25).
For example, Fratamico et al. (J Food Prot 63 (8): 1032-1037) a multiplex PCR with 5 genes from EHEC, with which a sensitivity of 1 cfu / g food (prepared) could be achieved, namely with an enrichment time of 12 hours, testing of a single strain and using agarose gel electrophoresis instead of hybridization. However, the method described here can be 1-10 cfu / 25 g using 5 different strains
<Desc / Clms Page number 3>
detect (however, no samples were taken 12 hours after inoculation, but only after 15 hours) and at the same time do not require handling agarose gels or ethidium bromide. In addition, hybridization not only increases the sensitivity of a molecular biological test through signal amplification during detection, but also the specificity.
In multiplex PCRs in particular, the increased number of primers used can lead to unspecific reactions which lead to unspecific bands in gels and can severely impair test interpretation (Chizhikov, V., Rasooly, A., Chumakov, K ., and Levy, D.
D. (2001): Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl. Environ. Microbiol. 67 (7): 3258-3263). The German standard DIN10134: "General procedure-specific requirements for the detection of microorganisms with the polymerase chain reaction (PCR) in food" stipulates, for example, that a PCR result must be verified by hybridization or sequencing.
The combination of pre-enrichment, DNA amplification and detection by the test kit according to the invention also allows routine laboratories equipped as standard to quickly and reliably detect EHEC. Only a thermal cycler and a water bath are required on additional equipment. It is essential that three genes typical of EHEC can be identified at the same time in a single step (multiplex method for both amplification and hybridization), these three being absolutely necessary for the evaluation of a sample for EHEC of serotype 0157 ( SLT1, SLT2, rfbE) and - in a preferred embodiment of the invention - the fourth gene (fliC) provides further information about the serotype.
The DNA sequences were selected so that all important variants of the SLT genes and one or two genes that characterize the serotype 0157: H7 responsible for most diseases are recognized, even if these gene products are due to the current physiological Situation of EHEC in a sample at the time of sampling cannot be formed. Reliable and sensitive detection of enterohaemorrhagic SLT-forming Escherichia coli strains or the E. coli serotype 0157: H7, which can obviously trigger HUS in rare cases even if the SLT genes are missing, is therefore relatively simple and quick ,
In addition to the detection of serotype 0157: H7, it is also possible to detect SLT genes that also occur in other E. coli serotypes and even in other bacterial genera and can cause the same disease there (Paton, AW, and Paton , JC (1996): Enterobacter cloacae Producing a Shiga-Like Toxin II-Related Cytotoxin Associated with a Case of Hemolytic-Uremic Syndrome. J Clin Microbiol 34 (2): 463-465; H, et al. ( 1995): Verotoxigenic Citrobacter freundii associated with severe gastroenteritis and cases of haemolytic uraemic syndrome in a nursery school: green butter as the infection source. Epidemiol Infect 114: 441-450).
The protocols which can be drawn up according to the invention thus represent a very valuable tool for routine analysis in the quality control of foods, but also for the characterization of unknown E. coli strains isolated from any source.
A preferred embodiment of the test kit is characterized in that the primer pair for amplifying the SLT1 gene has the nucleotide sequences 5'-GCT ATA CCA CGT TAC AGC GTG TTG C-3 'and 5'-GCT CTT GCC ACA GAC TGC GTC A-3 '.
The capture probe for hybridizing the SLT1 gene amplificate preferably has the nucleotide sequence 5'-TTT TTT TTT TTT TAT CTG CAT CCC CGT ACG ACT GA-3 '. The nucleotide sequence of the detector probe is preferably 5'-ATA AGA AGT AGT CAA CGA ATG GCG A-3 '.
A further preferred embodiment of the test kit is characterized in that the primer pair for amplifying the SLT2 gene has the nucleotide sequences 5'-TTT CCA TGA CAA CGG ACA GC-3 'and 5'-CCA CTG AAC TCC ATT AAC GCC-3' having.
For the hybridization of the SLT2 gene amplificate, the capture probe preferably has the nucleotide sequence 5'-TTT TTT TTT TTT GAC TGA TTT GCA TTC CGG AAC G-3 '. The nucleotide sequence of the detector probe is preferably 5'-TGC GAC ACG TTG CAG AGT GGT AT-3 '.
Yet another preferred embodiment of the test kit is characterized in that the primer pair for amplifying the rfbE gene has the nucleotide sequences 5'-CAC ACT TAT TGG ATG GTC TCA ATT C-3 'and 5'-TTT CCG AGT ACA TTG GCA TCG -3 '.
The capture probe for hybridizing the rfbE gene amplificate preferably has the nucleotide sequence 5'-TTT TTT TTT TTT ACT GGC CTT GTT TCG ATG AGT TTA T-3 '. The nucleotide sequence of the detector probe is preferably 5'-CTC TTT CCT CTG CGG TCC TAG TT-3 '.
<Desc / Clms Page number 4>
In a preferred embodiment of the invention, the test kit further comprises a pair of primers for the amplification of at least a part of the fliC gene in the same reaction and both an oligonucleotide immobilized on the same solid surface as a capture probe and an oligonucleotide as a detector probe for hybridizing those obtained with the primers Amplificates for the detection of the fliC gene.
Since this gene, which is characteristic of the H7 antigen of the EHEC serotype 0157: H7, can also be responsible for HUS disease in the absence of the SLT genes, its detection provides additional valuable information in food quality control.
In this preferred embodiment of the invention, the primer pair for amplifying the fliC gene preferably has the nucleotide sequences 5'-CCA ACA AAG CTG CAA CGG TAA G-3 'and 5'-GTG ACT TTA TCG CCA TTC CCT AAT T-3'.
The capture probe for hybridizing the fliC gene amplificate preferably has the nucleotide sequence 5'-TTT TTT TTT TTT CAT AAA GAC CTG TCG TGG TGT TTA A-3 '. The nucleotide sequence of the detector probe is preferably 5'-TTC GCG CCA GCA GAA GTT AAA TCA-3 '.
The following describes DNA sequences and methods for use in the test kit according to the invention for the detection of fragments from four genes characteristic of EHEC, these fragments being amplified together in the same reaction by using a thermostable DNA polymerase. The resulting double-stranded DNA fragments are then broken down into single strands (denatured), and one of the respective single strands is hybridized with oligonucleotides (capture probes) bound to any solid surface (membrane, microtiter plate, electrode, chip, polystyrene beads or similar) Nucleotide sequences are each complementary to the relevant single strands.
At the same time, this complex is hybridized with further suitable oligonucleotides (detector probes) which bind to further complementary sites of the DNA single strands and which are provided with a label which can be detected optically, autoradiographically, electrochemically or enzymatically directly or indirectly (see Fig. 1).
The individual DNA sequences (primer pairs) for the amplification of three or four gene segments characteristic of EHEC were especially designed to be used together in a single reaction (multiplex reaction), whereby at least SLT1, SLT2 and rfbE must be contained in one reaction , In addition, efforts have been made to form amplification products that are as small as possible and similar in size in order to achieve the highest possible and also similar amplification efficiency for the individual gene sections and the shortest possible reaction time during amplification.
The DNA sequences for the capture probes bound to the solid surface and for the labeled detector probes were also selected so that a specific hybridization and thus also a specific detection is made possible under the same conditions for all DNA sequences (multiplex hybridization).
DNA sequences according to claims 2 and 3 have proven to be particularly effective for the amplification of part of the SLT1 gene from EHEC. The DNA sequences disclosed in claims 6 and 7 are directed to the amplification of the SLT2 gene which also occurs in EHEC and most of its variants. The subject matters of claims 10 and 11 form DNA sequences suitable for amplifying a portion of the rfbE gene from E. coli strains (particularly 0157: H7) containing the 0157 antigen. The primers described in claims 15 and 16 serve to amplify part of the fliC gene from E coli strains (in particular 0157: H7) which have the H7 antigen. The capture probes and the detector probes for detecting the respective amplificates are described in claims 4, 5, 8, 9, 12, 13, 17 and 18.
The invention is explained in more detail below by means of an example part comprising a multi-part, descriptive example.
Example part:
Material and methods:
Bacterial strains: Enterohaemorrhagic Escherichia coli strains are from the American Type Culture Collection (ATCC). Table 1 shows a list of the strains used and
<Desc / Clms Page number 5>
of the genes that are present. A non-pathogenic wild-type strain from the company's own strain collection, which had been isolated from water, was used as the negative control strain. The strains were kept on plate count agar plates, overnight cultures were prepared in liquid LB medium.
Target sequences: The DNA sequences for SLT, rfbE and fliC genes that were used for the design of suitable oligonucleotides come from the NIH GenBank database (National Institutes of Health, www.ncbi.nlm.nih. gov) and were prepared and analyzed using DNA analysis software such as GeneRunner (www.qenerunner.com) or PC / Gene (Intelligenetics Inc., Geneva, Switzerland). After multiple sequence comparisons (Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1988): CLUSTAL: package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene 73 (1): 237-244), highly conserved areas of the respective genes were selected. Amplification primers, capture probes and detector probes were then determined in these areas (Rychlik, W., Spencer, W. J., and Rhoads, R.
E .: (1990): Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucl. Acids Res. 18 (21): 6409-6412), taking care that the annealing temperatures of all primers for the multiplex amplification reaction do not differ too much from one another. Attempts were also made to find probes with a melting temperature that was as similar as possible. In this way, simultaneous detection of all previously known variants of all relevant genes should be achieved under the same conditions.
Primer oligonucleotides, capture probes and detector probes: Sequences of the primers and probes are given in Table 2. In addition to the specific sequence, capture probes have 12 deoxy-thymidines at the 5 'end as "spacers" to the membrane. All oligonucleotides except labeled detector probes were obtained from VBC-GENOMICS Bioscience GmbH, Rennweg 95B, 1030 Vienna, Austria. Detector probes were obtained from DNA Technology A / S (Science Park Aarhus, Gustav Wieds Vej 10A, DK-8000 Aarhus, Denmark) and in the case described were coupled with the enzyme alkaline phosphatase (Hermanson, G. T: Conjugation to DNA. In: Bioconjugate Techniques, chapter 17, p.
662-668, Academic Press, San Diego, California, USA, ISBN 0-12-342336-8). Oligonucleotides were determined using phosphoramidite chemistry (Beaucage, S.L., and Caruthers, M.H. (1981): Deoxynucleoside phosphoramidites - a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis.
Tetrahedron Lett. 22: synthesized in automated systems.
Immobilization of the capture probes on membranes for use as test strips: capture probes were dissolved in 6xSSC (20x SSC = 3M NaCI and 0.3M trisodium citrate dihydrate) at a concentration of 2 g / l. 1 g (0.5 l) of each capture probe was applied side by side to a positively charged nylon membrane cut into strips (Roche Diagnostics GmbH, Engelhorngasse 3, A-1211 Vienna, Austria) using a micropipette. 1 g of denatured herring sperm DNA was used as a negative control (Roche Diagnostics GmbH, Engelhorngasse 3, A-1211 Vienna, Austria). The applied DNA was immobilized using UV crosslinking (3 minutes, UV-C lamp, distance approx. 30 cm). Order from left to right: SLT1-CPD, SLT2-CPD, RFB-CPD1, FLI-CPD, herring sperm DNA.
Meat samples: Mashed mixed pork and beef were purchased from a butcher and kept refrigerated until used.
Bacterial count determination: After calibration of the measuring method for all strains used by comparing the results with the results from the plate count method (number of colonies on plates), the bacterial count of the overnight cultures used for inoculation was determined by EHEC using the BacTrac 4100 analysis system (SY -LAB Geräte GmbH, Tullnerbachstrasse 61-65,3011 Neupurkersdorf, Austria) determined impedimetrically according to the manufacturer's instructions.
Cultivation and pre-enrichment: 25 g of minced meat was weighed into stomacher bags with filter insert (bag filter from Interscience, F-78860 St. Nom, France), with 225 ml enrichment medium (buffered peptone water from Oxoid (CM 509) + 5 g / L Lactose), homogenized in a Stomacher for one minute, inoculated with dilutions of EHEC overnight cultures with a known bacterial count and incubated at 37 ° C. Samples were taken for DNA extractions at various times after inoculation (4.6, 8 and 15 hours).
DNA amplification of individual gene sections: All amplification reactions were carried out as standard using thermostable DNA polymerase (Saiki, RK, Gelfand, DH, Stoffel, S., Schare, SS, Higuchi, R., Horn, GT, Mullis, KB, and Erlich , HA (1988): Primer-directed enzymatic
<Desc / Clms Page number 6>
amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487-491). Amplifications for individual gene sections were carried out with the following time / temperature profile in a GP-001 thermal cycler (Corbette Research, 1/14 Hilly St., Mortlake 2137, NSW Australia) and in a volume of 25 l carried out: 15 minutes 95 C, then 40 cycles with 30 seconds 94 C, 30 seconds 60 C and 30 seconds 72 C, final extension 10 minutes at 72 C.
Reaction conditions (final concentrations): 1x amplification buffer, 2.5 mM MgCl2, nucleotide mix (200 uM dATP, dGTP, dCTP and dTTP or 200 uM dATP, dGTP, dCTP and 600 uM dUTP), 1 uM SLT1-f1, SLT1 -r1, SLT2-f1, SLT2-r2, RFB-f1, RFB-r1, FLI-f1 and FLI-r1, 1-2.5 U thermostable DNA polymerase, if required and using dUTP instead of dTTP: 1 U uracil -N- glycosylase (Roche Diagnostics GmbH, Engelhorngasse 3, A-1211 Vienna, Austria).
Nucleotide mix from Roche, individual nucleotides as well as amplification buffer and DNA polymerase from Genecaft, Tresckow-Strasse 10, D-48163 Münster, Federal Republic of Germany.
EMI6.1
sail separated, using 1x TBE (0.09 M Tris base, 0.09M boric acid, 0.002M EDTA) as running buffer and a 100 base pair ladder (Life Technologies GmbH, house 223, A-5090 Lofer, Austria) ) were used as molecular weight markers. Gels were then stained with ethidium bromide and documented using an image processing system (Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T .: Molecular Cloning. A laboratory manual, 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Chapter 6).
Purification of amplified fragments from individual amplifications: In order to determine the limit of detectability for the individual gene sections, fragments were cut out of an agarose gel after electrophoresis and using a spin column kit (QIAquick Gel Extraction Kit from Qiagen, Max-Volmer-Strasse 4, D-40724 Hilden, Federal Republic of Germany).
Test execution:
DNA extraction:
Genomic DNA from EHEC strains and from the negative control strain (pure cultures) was obtained using commercially available spin column kits (NucleoSpin ™ Tissue Kit from Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, PO Box 10 13 52, D-52313 Düren or High Pure PCR Template preparation kit from Roche Diagnostics GmbH, Engelhorngasse 3, A-1211 Vienna, Austria) isolated from simple overnight cultures.
DNA from the meat samples was isolated by the following procedure: - centrifugation of 1 ml of culture supernatant from the meat sample in 1.5 ml tubes in an Eppendorf centrifuge (5 minutes, 16,000 g) - removal and discarding of the supernatant, absorption of the sedimented bacteria into 1 ml sterile distilled water, thorough resuspension - centrifuging the bacteria as above and resuspending the bacterial pellet in 100 l (with 4-8 hours incubation) or 200 l (15 hours incubation) sterile distilled water.
- heating the bacterial suspension to 100 C (20 minutes, heating block) - centrifuging the cell residues as above and transferring 80 or 170 l of the resulting supernatant into fresh tubes.
- Storage of samples until amplification at -20 C.
Multiplex DNA amplification:
Multiplex amplifications were carried out with the following time / temperature profile in a GP-001 thermal cycler (Corbette Research, 1/14 Hilly St., Mortlake 2137, NSW Australia) and a volume of 25 l: 15 minutes denaturation at 95 C, then 2 cycles with 30 seconds denaturation at 94 C, 30 seconds annealing at 65 C and 30 seconds extension at 72 C. Then 40 cycles with 30 seconds denaturation at 94 C, 30 seconds annealing, the temperature for 5 cycles in each cycle was lowered by 1 C until 60 C was reached (touchdown amplification), 30 seconds 72 C, final extension 10 minutes at 72 C.
Reaction conditions (final concentrations): 1x amplification buffer, 2.5 mM MgCl2, nucleo-
<Desc / Clms Page number 7>
tidmix (200 uM dATP, dGTP, dCTP and dTTP or 200 M dATP, dGTP, dCTP and 600 uM dUTP), 0.15 uM SLT1-f1 and SLT1-r1, 1 uM SLT2-f1, SLT2-r2 , RFB-f1, RFB-r1, FLI-f1 and FLI-r1, 1-2.5 U thermostable DNA polymerase, if required and using dUTP instead of dTTP: 1 U uracil-N-glycosylase (Roche Diagnostics GmbH, Engelhorngasse 3, A-1211 Vienna, Austria). Roche nucleotide mix, individual nucleotides from Genecraft, Tresckow-Strasse 10, D-48163 Munster, Federal Republic of Germany.
Hybridization: pre-hybridization solution (final concentrations): 5xSSC (20x SSC = 3M NaCI and 0.3M trisodium citrate dihydrate), 0.1% N-lauroylsarcosine, 0.02% SDS, 1% blocking reagent (Roche), 100 g / ml denatured herring sperm DNA (Roche). Hybridization solution (final concentrations): 5xSSC, 0.1% N-lauroylsarcosine, 0.02% SDS, 1% blocking reagent (Roche), 70 pM SLT1-CO, 1 nM SLT2-CO, 136 pM RFB-CO, 1 nM FLI CO.
- The strips with the immobilized capture probes were added in prehybridization solution
Incubate 42 C in a shaking water bath to block free spots on the membrane (0.5 ml per strip, approx. 15 minutes).
10 l of the samples from the multiplex amplification reaction were mixed with 1 l of 1 N NaOH and denatured at 37 C for 10 minutes.
- Denatured DNA from a sample and a preblocked strip were taken together in each
Incubate 0.5 ml of preheated hybridization solution for 15 minutes at 42 C (in a sterile 2 ml plastic tube).
- The strip was then washed twice with at least 2 ml washing solution (0.1xSSC, 0.1%
SDS) washed at 42 C for at least 5 minutes.
Color detection: In this example, the detection was carried out enzymatically by reaction of nitro blue tetrazolium chloride and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate by means of the alkaline phosphatase coupled to the detector probes. The Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate Kit from Bio-Rad Laboratories Ges. M. b. H. (Auhofstrasse 78D, A-1130 Vienna, Austria).
- The strips were briefly swirled into substrate buffer without substrates (0.1 M Tris / HCl, pH 9.5).
Incubation of the strips in substrate buffer with substrates (1 ml per strip) at 37 C (up to 2 hours).
- The color reaction is aborted by swirling the strips in distilled water and evaluating the result immediately after the strips have dried.
Results :
EMI7.1
Ornamental and hybridization conditions gave very good results with all samples used. The signals for the individual genes were sufficiently strong and did not differ too much in their intensity. No cross-reactions between the different amplificates were found, except for a very slight reaction between the SLT1 fragment and the RFB-CPD. This problem could be solved by using the alternative capture probe RFB-CPD1.
Specificity. Sensitivity: With the described multiplex assay <5 ng purified amplified fragment (SLT1, SLT2, RFB or FLI) can be reproducibly detected. This is a higher sensitivity than is routinely possible, for example in agarose gel electrophoresis, by staining the DNA with ethidium bromide. Hybridization after amplification has thus increased the sensitivity (see also Paton, AW, and Paton, JC (1998): Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx1, stx2 'eaeA, Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbOm, and rfbO157. J Clin Microbiol 36 (2): 598-602).
In experiments with purified genomic DNA from 5 different EHEC strains, depending on the strain, if there were 10 to 100 genome equivalents per assay, all genes present in the respective strains could be found (Figure 2).
Experiments with artificially contaminated meat samples showed that with an enrichment time of 8 hours in 4 out of 5 strains the detection of all existing genes with an inoculation amount of 1-10 EHEC / 25 g minced and in one case with an inoculation amount of
<Desc / Clms Page number 8>
EMI8.1
become. (Figure 3).
Table 1: ATCC strains of Escherichia coli used TCC number Description Scrotype Existing ATCC number Description Toxin genes ATCC 43889 from faeces of a HUS * patient, North Carolina 0157: H7 SLT2 ATCC 43890 from hurricane faces, Calfonmien O157: H7 SLTI
EMI8.2
EDL 933 O157: H7 SLT1, SLT2 ATCC 35150 From human faeces, strain EDL 931 O138: K81 (B): H14 SLT2 variant ATCC 23545 From pig (Edema Discase) O138: K81 (B): H14 SLTs variant * Haemolytic- Uremic syndrome
<Desc / Clms Page number 9>
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Table 2: Primer oligonucleotides, capture probes and detector probes Name Sequence Function
EMI9.1
SLT1-CO 5'-ATA AGA AGT AGT CAA CGA ATG GCG A-3 'detector probe for SLTI amplificate SLT2-fl 5-CCA CTG TGA CAA CGG ACA GC-3' forward primer for SLT2 gene
EMI9.2