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Die Erfindung betrifft neue Verwendungen von Taurin oder Taurinderivaten.
Taurin (Aminoethylsulfonsäure) ist ein Metabolit der schwefelhältigen Aminosäure Cystein. Für Taurin sind eine Reihe von medizinischen Indikationen beschrieben worden, wie z. B. Behandeln von Herzinsuffizienz oder Epilepsie.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, neue Verwendungen für Taurin oder Taurinderivate zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von Taurin oder Taurinderivaten zur Herstellung eines Präparates zur Hinaufregulierung des Expressionsniveaus von Genen, die ausgewählt sind aus den Genen gemäss Fig. 1 bis 17.
Überraschenderweise hat sich erfindungsgemäss herausgestellt, dass die Expression der Gene für diese Faktoren und Proteine gezielt durch Taurin modifiziert wird. Die erfindungsgemässe Verwendung bezieht sich dabei vor allem auf die Veränderung des Expressionsniveaus in Hirnzellen und Herzgewebe von Säugetieren, insbesondere von Menschen.
Unter Taurinderivaten werden erfindungsgemäss chemische Verbindungen verstanden, die durch Einführung ein oder mehrerer funktioneller Gruppen ins Taurinmolekül oder durch Einbau von Taurin in Peptid-Moleküle hergestellt werden können, z. B. Glutamyltaurin, Acomprosat oder Taurin enthaltende Peptide.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird das Expressionsniveau von Genen, die ausgewählt sind aus den Genen, wie sie in den Fig. 1 bis 17 für die erfindungsgemäss erhaltenen Klone 07, D5, D4, D13, P6, P5, D10, D3, P3, P9, P16, D8, D6, P12, P27 und P7 dargestellt sind, hinaufreguliert.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde untersucht, welche Gene in vivo beim Säuger durch Gabe von Taurin oder Taurinderivaten in ihrer Expression modifiziert werden. Dabei wurde die Technologie der subtraktiven Hybridisierung (Labudova et al., Life Sciences 62 (1998), S. 431-437, Golubnitchaya-Labudova et al., Life Sciences 62 (1998), S. 697-712) angewendet.
Hierbei wurde mRNA aus Organen von mit Taurin behandelten Ratten sowie aus unbehandelten Ratten gewonnen, subtraktiv hybridisiert, so dass nur diejenigen Gene detektiert werden, die spezifisch für die eine oder für die andere Gruppe von Tieren sind. Die Detektion der subtrahierten mRNAs erfolgte, wie beschrieben, durch reverse Transkription in cDNA und Amplifikation durch PCR sowie anschliessender Sequenzierung. Schliesslich wurden die Sequenzen in der EMBLGenbank auf Homologie überprüft.
Es zeigte sich, dass mit der erfindungsgemäss angewendeten subtraktiven Hybridisierung auch DNA-Moleküle aufgefunden werden konnten, die nicht zum Stand der Technik gehören.
Die Erfindung wird an Hand des nachfolgenden Beispiels sowie der Zeichnungsfiguren näher erläutert.
Es zeigen :
Fig. 1 : Ein Alignment von Klon D7 mit dem tuf2-Gen SRTUF2 (X67058) aus Streptomyces ramocissimus ;
Fig. 2 : Ein Alignment von Klon D5 mit dem rpfN-Gen XCRPFNG X67249 aus Xanthomonas campestris ;
Fig. 3 : Ein Alignment von Klon D4 mit dem merR-Gen PSMERGE9 (Z33489) aus Pseudomonas sp. ;
Fig. 4 : Ein Alignment von Klon D13 mit dem Leukemia inhibitory factor (LIF) S73374 aus Methanococcus spp. ;
Fig. 5 : Ein Alignment von Klon P6 mit der Transposase TNIA aus Klebsiella aerogenes ;
Fig. 6 : Ein Alignment von Klon P5 mit der Transposase TNIA aus Klebsiella aerogenes ;
Fig. 7 : Ein Alignment von Klon D10 mit der DNA-Gyrase SCDNAGYR (L27063) aus Streptomyces coelicolor ;
Fig. 8 :
Ein Alignment von Klon D3 mit der DNA-Helicase (AP006675) aus Rhodobacter marinus ;
Fig. 9 : Ein Alignment von Klon P3 mit der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (EC 1. 1. 1. 205) (IMP-Dehydrogenase, IMPO) aus Methanococcus jannashii ;
Fig. 10 : Ein Alignment von Klon P9 mit P53 (TP53) aus Homo sapiens ;
Fig. 11 : Ein Alignment von Klon P16 mit dem Transformations-Suppressor P53 aus Homo ++sapins;
Fig. 12 : Ein Alignment von Klon D8 mit dem Apoptose related protein (AF017986) aus Homo
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sapiens ;
Fig. 13 : Ein Alignment von Klon D6 mit P53 aus Homo sapiens ;
Fig. 14 : Ein Alignment von Klon P12 mit dem"outer membrane channel protein"SRPC von Pseudomonas putida ;
Fig. 15 :
Ein Alignment von Klon P27 mit dem YKOW-Protein aus Bacillus subtilis ;
Fig. 16 : Ein Alignment von Klon P4 mit ENVZ von Salmonella typhimurium ; und
Fig. 17 : Ein Alignment von Klon P7 mit ENVZ von Salmonella typhimurium.
Beispiel :
6 Sprague-Dawley-Ratten, 12 Wochen alt, weiblich, wurden drei Wochen lang oral mit 100 mg/kg Körpergewicht Taurin (Sigma) gefüttert. 6 Tiere dienten als Kontrolle (ohne Taurin). Alle Tiere hatten freien Zugang zu Trinkwasser und Rattenkuchen (Altromin@) und wurden unter einem Tag-Nacht-Rhythmus (4) gehalten. Am Ende der Fütterungsperiode wurden sie durch Halsdislokation getötet, das gesamte Hirn und das gesamte ventrikuläre Gewebe wurden entnommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
Die Pools an Hirn und Herz von mit Taurin behandelten und von unbehandelten Ratten wurden in flüssigen Stickstoff gegeben und für die Isolierung von mRNA zerkleinert.
Die Isolierung von mRNA wurde mit dem Quick Prep Micro mRNA-Reinigungs-Kit (Pharmacia Biotech Inc., Uppsala, Schweden) ausgeführt.
1 Mikrogramm von mRNA von jeder (der zwei) Präparationen wurde mit einem cDNAKlonierungs-Kit (Gibco-Life Technologies, Eggenstein, Deutschland) gualitätsgeprüft, wobei der Einbau von [aipha-P] dATP (Amersham, Buckinghamshire, GB) mit nachfolgender Elektrophorese auf 1 % Agarose, gefolgt von Autoradiographie verwendet wurde. Der Reflektionsfilm (Dupont NEF 496) wurde dem Gel bei Raumtemperatur für eine Zeitspanne von zwei Stunden exponiert.
Erstellen der subtraktiven Bank :
Jeweils 10 Mikrogramm mRNA aus dem Hirn der Tiere wurden durch UV-Bestrahlung bei 360 nm nach den Anleitungen des Subtraktor-Kits (Invitrogen, Leek, Niederlande) biotinyliert.
Jeweils 1 Mikrogramm der mRNA-Pools von den Hirnproben der Taurin-behandelten Ratten wurde einer reversen Transkriptasereaktion (Subtraktor-Kit, Fa. Invitrogen) unterworfen und die cDNAPools wurden mit den entsprechenden biotinylierten mRNAs aus den Kontrollen hybridisiert. Die Substraktions-Hybridisierungsmischung wurde mit Streptavidin entsprechend dem oben erwähnten Subtraktor-Kit inkubiert und so die biotinylierten Moleküle (nicht einschliesslich biotinylierte mRNA und Hybrid [biotinyliertes mRNA/cDNA]) komplexiert. Die Streptavidinkomplexe wurden durch mehrfache Phenol-Chloroformextraktion abgetrennt und die subtrahierten cDNAs wurden aus der wässerigen Phase durch Alkoholfällung abgetrennt.
Um die subtrahierten cDNAs zu vervielfältigen und zu kloneren, wurden sie mit Not)-Linkern ligiert, gefolgt von Not !-Verdau. Diese Not t-gehinkten cDNAs wurden in die Not l-Stelle des SPORT 1-Klonierungsvektors (cDNA-Kionierungssatz, Gibco) ligiert.
Um die subtrahierten cDNAs zu visualisieren, wurden sie unter Verwendung universeller Primer I 5'-GT AAAACGACGGCCAGT -3'
11 5'-ACAGCTATGACCATG-3' aus der multiplen Klonierungsstelle des sPORT-1-Vektors (cDNA-Klonierungs-Kit, Gibco) amplifiziert. Die amplifizierten cDNAs wurden auf 1 % Agarose-Elektrophorese analysiert.
Kloneren von subtrahierten Not-l-gelinkten cDNAs :
Not !-gehinkte cDNAs, die mit sPORT 1-Vektor ligiert waren, wurden für die Transformation von hochkompetenten INFalpha F'E. coli-Zellen (Invitrogen, Leek, Niederlande) verwendet. Die plattierten Klone wurden mit dem Plasmid-Isolations-Kit (Quiagen, Hilden, Deutschland) analysiert und
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mit EcoRl/Hindl1l verdaut. Rekombinante Klone wurden sequenziert.
Homologien der erhaltenen Sequenzen wurden durch computerunterstützten Vergleich der Daten aus der Genbanksequenz-Bank : fastA@ebi. ac. uk (GBALL, Gen Bank, EMBL, Heidelberg, Deutschland) bestimmt. Das dort verfügbare Programm kann vorzugsweise für die erfindungsgemässe Identitätsberechnung für die DNA-oder RNA-Sequenzen herangezogen werden.
Subtraktive Hybridisierung wurde kreuzweise ausgeführt, d. h. Taurin-Proben mRNA-Subtraktion von Kontrolle und umgekehrt im 1 : 3-Niveau (Taurin-mRNA : Kontrolle mRNA).
Ergebnisse :
Alle Sequenzen, die aus der subtraktiven Bank erhalten wurden, wurden wenigstens dreifach nach unten oder aufwärts reguliert, da das Niveau der mRNA, die für die Subtraktion verwendet wurden, auf 1 : 3 eingestellt war (s. Labudova et al. (1998).
Beispiele für taurinsensitive Gene, die durch Tauringabe hinaufreguliert werden, sind in den Fig. 1 bis 17 angegeben.