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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität und Verminderung von Fettsäureverunreinigungen von pankreatischen Lipasen.
Lipasen (Triacylglycerinhydrolasen [EC 3. 1. 1. 3]) sind Enzyme, die wasserunlösliche Triglyceride an der Grenzfläche Wasser/01 hydrolysieren. Diese Enzyme spielen nicht nur physiologisch eine wichtige Rolle (in dem sie beispielsweise Fett im Verdauungstrakt hydrolysieren) sondern werden auch industriell grossflächig eingesetzt, um Triglyceride umzuestern. Lipasen sind überraschend vielseitige Biokatalysatoren, die in der Lage sind, eine grosse Anzahl synthetischer Substrate zu acylieren oder zu deacylieren, wobei sie im allgemeinen hoch regioselektiv wirken (R. D.
Schmid, etal., Angew. Chemie 110 (1998), S. 1695-1720).
Lipasen können aus einer Vielzahl unterschiedlicher Quellen isoliert werden, aber nach Wahl werden Schweinepankreas oder bestimmte Mikroorganismen genutzt (Enzymes in Industry : Production and Applications, Hrsg. W. Gerhartz, VCH Weinheim (1990), S. 89).
Heute werden Lipasen grosstechnisch in der Fettchemie (zur Herstellung von Seifen, Fettsäuren, Fetten mit verbesserter Streichfähigkeit, Kakaobutteräquivalenten, Tnglyceriden mit hohem Verdauungswert), in Waschmitteln (zur Entfernung von Fettverschmutzungen sowie zur in situHerstellung von Persäuren als Bleichmittel), in der Papierherstellung, in der Milchindustrie (insbesondere in der Käseherstellung) oder als Biokatalysatoren in der organischen Synthese sowie In der Medizin verwendet (Schmid et al., Angew. Chem. 110 (1998), S. 1695-1720).
Da die Isolierung von reinen Lipasen sehr aufwendig ist, werden für industrielle Anwendungen, bei welchen die Verwendung grösserer Mengen der Enzyme notwendig ist, vorwiegend rohe Lipasepräparationen (geringer Reinheit) verwendet. Diese enthalten in der Regel noch hohe Anteile an anderen Proteinen, Lipide, Fettsäuren und Kohlehydratanteile
Insbesondere Fettsäureverunreinigungen haben sich bei kommerzielle Lipasen als durchwegs störend herausgestellt (S. Misra et al., Lipids 19 (4) (1984), S. 302-303)
Pankreatische Lipasepräparationen werden z. B. aus Schweinepankreas isoliert und können auch noch Esterasen, Proteasen und Amylasen enthalten. Von den tierischen Lipasen ist bekannt, dass sie vorzugsweise die Hydrolyse von Fettsäuren mit mehr als 12 C-Atomen bewirken und dies zum Grossteil an der C-1-Position des Triglycerids.
Die Reaktionsgeschwindigkeit sinkt beträchtlich In der Substratreihenfolge Tri-, DI- und Monoglyceride (Emzymes in Industry : ProductIon and Appiications, Hrsg. W. Gerhartz, VCH Weinheim (1990), S. 89-90).
Schweinepankreaslipase ist eine Triacylglycerinlipase mit einer Sequenz von 449 Aminosäuren und sieben Dlsulfidbrücken. Schweinepankreaslipase ist die am genauesten beschriebene pankreatische Lipase. Sie wird als Biokatalysator In der Lebensmittelindustrie und zur Geschmacksstoffherstellung verwendet sowie für organische Synthesen, z. B. für regioselektive Esterifizierungen, fur enantioselektive Hydrolyse von Mesoverbindungen, zur regioselektiven Acylierung von Hydroxyverbindungen, für lipasekatalysierte Synthese von Zuckerestern und für viele andere Verwendungen In industriellem Massstab. Schweinepankreaslipase wurde auch als Biokatalysator zur Veresterung von Glycidol (J. F. Martins, Biotechnol. Bioeng. 44 (1994), S. 119-124 und J. F. Martins, Enzyme Microb.
Technol. 16 (1994), S. 785-790) und zur enzymatischen Hydrolyse von Triolen und dessen partiellen Glyceriden im überkritischen COs verwendet (G. Glowacz, Chem. Phys. Lipids 79 (1996), S. 101-106)
Die Behandlung von Enzympräparationen mit überkritischen Fluiden wird im Stand der Technik für zwei wesentliche Prozesse beschrieben. Zum einen werden überkritische Fluide zur Extraktion aus biologischen Präparationen von Fettsäuren und Lipiden verwendet. Proteine sind in überkritischen Fluiden schlecht löslich und verbleiben nach der Extraktion im Rückstand (J. P. K. Weder, Cafe Cacao The 34 (2) (1990), S. 87-96). Dieses Verfahren wurde auch zur ersten Aufreinigung von einer Esterasepräparation geringer Reinheit verwendet (Steinberger et al., Gemeinsame Jahrestagung 1998 OBG/OGGGT).
Zum zweiten kann die enzymatische Aktivität von Proteinen in Anwesenheit von überkritischen Fluiden verändert und gezielt gesteuert werden Dieser Umstand spielt insbesondere in der Entwicklung neuer Strategien zur organischen Synthese unter Verwendung von Biokatalysatoren eine Rolle (Cernia et al., Methods in Enzymol. 286 (1997), S. 495-508 ; Kamat et al., Crit. Rev. Biotechnol. 15 (1) (1995), S. 41-71).
Obgleich bei der organischen Synthese In der Regel Biokatalysatoren hoher Stabilität eingesetzt werden (Proteasen, Lipasen oder Hydrolasen gelten im allgemeinen als stabile Enzyme),
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kommt es in Abhängigkeit von den gewählten Bedingungen (Druck, Temperatur etc. ) und Prozessschritten (Entspannungs- und Kompressionsschritte) zu einer beträchtlichen Enzymaktivierung.
Giessauf et al., Progress in Biotechnology 15, Hrsg. A. Ballesteros, F. J. Plou, J. L. Iborra, P. J. Hal- ling, Elsevier, Amsterdam (1998), S. 471-476, berichteten, dass verschiedene Lipasen und Esterasen bei Behandlung mit überkritischem CO2 um bis zur Hälfte ihrer Ausgangsaktivität verlieren können (vgl. auch Kamat et al., Biotechnol. Bioeng. 46 (1995), S. 610-620)). Bei vielen industriell verwendeten Enzymen hat sich aber gezeigt, dass diese durchaus in überkritischen Fluiden hinsichtlich ihrer Aktivität keine Einbussen an Aktivität erleiden müssen.
Speziell überkritisches CO2 gilt als ein sehr vorteilhaftes Lösungsmedium, da es eine niedrige Toxizität besitzt, keine Rückstände im behandelten Material verbleiben und in seinem Gebrauch geringe Kosten verursacht und daher auch für Prozesse verwendet werden kann, bei welchen Nahrungsmittelkomponenten für Mensch und Tier hergestellt werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung von Enzymen mit überkritischen Flui- den so zu nutzen, dass damit qualitativ verbesserte Biokatalysatoren hergestellt werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität von pankreatischen Lipasen, welches sich dadurch auszeichnet, dass eine Präparation, enthaltend pankreatische Lipasen, mit überkritischen Fluiden behandelt wird.
Überraschenderweise stellte sich heraus, dass Enzyme, wie pankreatische Lipasen, insbeson- dere die Lipase isoliert aus Schweinepankreas, durch Behandlung mit überkritischen Fluiden eine massgebliche Aktivitätserhöhung erfahren.
Während bislang im Stand der Technik angenommen worden ist, dass eine Behandlung mit überkritischen Fluiden bestenfalls zur Erhaltung der Ausgangsaktivität dienen kann und eher mit zum Teil erheblichen Aktivitätsverlusten gerechnet werden muss, zeigte sich erfindungsgemäss, dass mit der Behandlung mit überkritischen Fluiden, insbesondere mit überkritischem CO2, eine massgebliche Aktivitätssteigerung von pankreatischen Lipasepräparationen herbeigeführt werden kann.
Da kleine Aktivitätsunterschiede (10-20 %) nach Behandlung mit überkritischen Fluiden aufgrund der möglichen Messvarianz nicht unbedingt als relevant erachtet werden können, wird erfindungsgemäss unter Aktivitätserhöhung eine Erhöhung von zumindest 50 %, ausgehend von der Ausgangsaktivität, verstanden.
Erfindungsgemäss hat sich gezeigt, dass die Aktivitätserhöhung mit der erfindungsgemässen Behandlung um 100 %, insbesondere um 400 %, ja sogar auf über 600 %, gesteigert werden kann.
Demgegenüber war im Stand der Technik, wie erwähnt, beschrieben, dass die Aktivität von Enzymen bei einer Behandlung mit überkritischen Fluiden bestenfalls erhalten blieb. Beschrieben wurde für Lipasen bislang als höchster Wert eine Steigerung von 10 4, 1 % (Giessauf et al. (gemeinsame Jahrestagung 1998 OBG/ÖGGGT) ; dieser Wert kann jedoch auf Grund der erwähnten Messungenauigkeiten nicht wirklich als Erhöhung der Aktivität angesehen werden).
Überkritische Fluide sind dadurch charakterisiert, dass sie unter Temperatur- und Druckbedingungen existieren, die über deren kritischen Punkt liegen. Der kritische Punkt ist definiert als der Punkt, bei welchem die flüssige und die gasförmige Phase nicht unterscheidbar werden. Ein Fluid ist überkritisch, wenn dessen Temperatur und dessen Druck über dem kritischen Punkt liegt. Die Eigenschaften liegen zwischen Flüssigkeiten und Gasen : Dichte fast wie bei Flüssigkeiten, hohe Löslichkeiten, hohe molekulare Diffusion, niedere Viskosität, hohe Kompressibilität, etc..
Als überkritisches Fluid, mit welchem die erfindungsgemässe Behandlung vorgenommen wird, kann prinzipiell jedes geeignete Medium verwendet werden, insbesondere das für Lipasesysteme schon beschriebene CO2, weiters Fluoroform, Ethan, Schwefelhexafluorid, Ethylen und Propan, wobei überkritisches CO2 erfindungsgemäss besonders bevorzugt ist.
Die Temperatur, bei welcher die Behandlung durchgeführt wird, richtet sich vor allem nach dem überkritischen Fluid, besonders hohe Aktivitätssteigerungen lassen sich durchführen, wenn die Behandlung in eine Temperaturbereich zwischen 65 bis 85 C durchgeführt wird. Temperaturen > 120 C sind in der Regel nicht mehr relevant, da eine thermische Zersetzung und Inaktivierung der Enzyme zu erwarten ist.
Auch der Druck, der bei der Behandlung angewendet wird, richtet sich in der Hauptsache nach der Natur des überkritischen Fluids, bevorzugt ist ein Bereich von 100 bis 600 bar. Drücke > 1000 bar sind aus technischen Gründen in der Regel nicht mehr relevant.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemässe Behandlung durch
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Druckänderung durchgeführt.
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich besonders gut zur Behandlung von Präparationen geringer Reinheit (Proteingehalt < 80 %), die nach der Behandlung direkt für industrielle Zwecke verwendet werden können, ohne dass weitere aufwendige Reinigungsschritte noch vorgesehen werden müssten. Die erfindungsgemässe Aktivitätserhöhung führt dann in einfacher Weise zu einer Verdoppelung, Verdreifachung oder gar Versechsfachung der Enzymaktivität dieser rohen Aufarbeitungen.
Demgemäss werden erfindungsgemäss besonders bevorzugt rohe Lipasepräparationen behandelt, die einen Proteingehalt von unter 80 Gew.-%, vorzugsweise von unter 20 Gew.-% aufweisen.
Damit können die gängigen Rohpräparate an pankreatischer Lipase (diese enthalten in der Regel um 5 bis 15 % Protein) besonders vorteilhaft im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt werden.
Die eingesetzte Lipasepräparation ist dabei vorzugsweise Iyophilisiert und weist dabei einen Feuchtigkeitsgehalt von unter 50 Gew.-%, vorzugsweise unter 20 Gew.-%, auf.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Lipasepräparation, die gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren erhältlich ist. Wenn pankreatische Lipasen erfindungsgemäss beispielsweise mit überkritischem CO2 behandelt werden, zeichnen sie sich durch ihre erhöhte Aktivität aus und dadurch, dass die Aktivität dieser Präparationen durch einen erneuten Behandlungszyklus mit überkritischen Fluiden nicht mehr im gleichen Ausmass wie bei der ersten Behandlung gesteigert werden kann, insbesondere, wenn die erfindungsgemässe Behandlung vollständig erfolgt ist, was in der Regel der Fall ist, wenn die Präparation etwa 24 Stunden oder länger behandelt wurde.
Die besten Resultate werden erfindungsgemäss mit der Lipase aus Schweinepankreas und ähnlichen Lipasen erzielt, da diese besonders viele Disulfidbrucken besitzt. Die pankreatische Lipase aus Schwein (Mastschwein) weist 449 Aminosäuren auf und ist beispielsweise in Fournier et al. Eur. J. Biochem. 170 (1987), 369-171 beschrieben. Dieses Enzym weist sechs Disulfidbrü- cken auf. Es hat sich gezeigt, dass ein erhöhter Gehalt an Disulfidbrücken, also mehr als 3, vorzugsweise mehr als 5 Disulfidbrücken, in der erfindungsgemäss zu behandelnden Lipase zu deutlicheren Aktivitätssteigerungen führt.
Schliesslich betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer Behandlung mit überkritischen Fluiden zur Steigerung der Aktivität von Enzympräparationen. Erfindungsgemäss konnte erstmals gezeigt werden, dass die Behandlung mit überkritischen Fluiden zu einer signifikanten Erhöhung der Aktivität von pankreatischen Lipasen (also Steigerungen um 50 % oder mehr) geführt hat. Damit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit überkritischen Fluiden, insbesondere mit überkritischem CO2, tatsächlich zu einer Erhöhung einer Enzymaktivität führen kann, und nicht, wie bislang im Stand der Technik allgemein angenommen-nur eine Gefahr von Aktivitätsveriusten beinhaltet.
Die erfindungsgemässe Behandlung mit überkritischen Fluiden kann vorzugsweise auch zur Verminderung von Fettsäureverunreinigungen bei Lipasen (vgl. Misra et al., Lipids 19 (4) (1984), S. 302-303) verwendet werden, ohne dass es dabei zu (weiteren) Aktivitatsverlusten kommt.
Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele sowie der Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht eingeschränkt werden soll, näher erläutert.
Es zeigen :
Fig. 1a : Die Änderung der Aktivität nach Behandlung von Schweinepankreaslipase mit über- kritischem CO2 in Abhängigkeit von der Temperatur (Dauer der Behandlung 1 Stun- de).
Fig. 1b : Die Abhängigkeit der Aktivitätszunahme von der Zeit bei 75 C, und
Fig. 1c : Die Abhängigkeit der Aktivitätszunahme von Entspannungs- und Kompressions- schritten bei 35 C.
Beispiel :
In Vorstudien wurden bereits die Stabilitäten von verschiedenen Enzymen (Lipase von Candida rugosa, Lipase AY von Candida rugosa, Lipase PS von Pseudomonas species und Esterase EP10 bei der Behandlung mit überkritischem CO2 miteinander verglichen, wobei bestenfalls gleichbleibende Aktivitäten bei einer 24-stündigen Inkubation bei 75 C und 150 bar erzielt werden konn-
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ten (Giessauf et al. gemeinsame Jahrestagung 1998 ÖBG/ÖGGGT)).
Behandlung von Schweinepankreaslipase mit überkritischem CO2
Für die Bestimmung der Aktivitätszunahme in Abhängigkeit von der Temperatur wurden rund 40 mg Enzym (mit-20 U/mg Pulver von FLUKA (CH), It. Katalog [1 U entspricht der Enzymmenge, die 1 ! Mol Ölsäure pro Minute bei pH = 8, 0 und 370C freisetzt und 20 U/mg von SERVA (Heidelberg) in ein Papierfilter gegeben und dieser in einen Enzymreaktor (mit 140 mi Innenvolumen) gelegt. Der Enzymreaktor, der mittels eines Waserbades (gefüllt mit Wasser oder Ethylenglykol) thermostatisiert wurde, ist mit CO2 auf einen Druck von 150 bar aufgepumpt worden und das Enzym ist bei unterschiedlichen Temperaturen (Fig. 1a) für unterschiedliche Zeitspannen (Fig. 1b) und in Abhängigkeit von Druckänderungsschritten (Fig. 1c) im überkritischen CO2 inkubiert worden.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1a-1c dargestellt. Es zeigte sich, dass eine einstündige Inkubation bei Temperaturen unter 650C zu keinem signifikanten Verlust oder Erhöhung der Enzymaktivitäten führte, wie es bei anderen Enzymen beobachtet worden ist. Eine einstündige Inkubation bei 75 C und 150 bar führt zu einer Erhöhung der Aktivität auf einen Wert von 242, 6 % des Ausgangswertes (0, 453 U/g Enzympulver). Im Vergleich dazu zeigten die Esterase aus Pseudomonas marginata, die Lipase von Candida rugosa und die Lipase AY von Candida rugosa keinen derartigen Effekt. Bei diesen Enzymen konnte nur eine Verringerung oder kein Effekt auf die enzymatische Aktivität durch Behandlung mit überkritischem CO2 bei Temperaturen von über 750C beobachtet werden.
Bei der Erhöhung der Aktivität von Schweinepankreaslipase konnte ein zeitabhängiger Effekt beobachtet werden.
Wie in Fig. 1 b gezeigt wird, kommt es innerhalb der ersten Stunden der Inkubation zu einem schnellen Anstieg der Aktivität, bis eine Aktivität von 3, 90 U/g Enzympulver nach 24 Stunden Inkubation erhalten wurde. Dies entspricht einer 860 %igen Aktivitätssteigerung.
Stabilität gegen Druckerhöhung/Druckabfallschritten
Hierbei wurden die Enzyme vor jedem Druckabfall für 1 Stunde bei 150 bar und 350 behandelt.
Unmittelbar nachdem der Druck die atmosphärischen Werte wieder erreicht hatte, wurde erneut der Druck erhöht. Diese Druckerhöhungs/Druckabfall-Zyklen wurden 30 mal durchgeführt, wobei die Lipaseproben über Nacht bei 4 C gelagert wurden.
Die Ergebnisse der Tests bezüglich der Druckbeständigkeit von Schweinepankreaslipase sind in Fig. 1c dargestellt. Sogar nach mehreren Druckzyklen zeigte dieses Enzym eine Erhöhung der Aktivität bis zu einem Wert von 0, 88 U/g Enzympulver, was einer Aktivitätserhöhung von 191 % entspricht und dies, obwohl gemäss dem Stand der Technik derartige Druckänderungszyklen oft für massgebliche Aktivitätsverluste verantwortlich gemacht wurden (Kasche et al., Biotechnol. Lett. 10 (1988), S. 569-574). (So konnte bislang lediglich für a-Amylase bei Anwesenheit von Mikroorganismen eine geringfügige (21 und 35 %) Aktivitätssteigerung bei Behandlung mit überkritischem CO2 (200 Atmosphären, 2 Stunden, 35 C) beobachtet werden (Kamihira et al., Agric. Biol. Chem.
51 (1987), S. 407-412)).
Behandlung mit überkritischem CO2
Für die übrige Untersuchung der Erhöhung der Aktivität der Enzyme zu überkritischem Kohlendioxid (75 C/24h und 150 bar) wurden rund 500 mg von Enzym eingesetzt und in der üblichen Apparatur behandelt. Jedoch wurde das Enzym anstatt es in einem Papierfilter einzuwickeln in ein kleines Becherglas gegeben, das mittels Papierfilter (welcher mit Draht fixiert wurde) verschlossen war.
Tabelle 1
Steigerung der Aktivität von PPL (Fluka) durch Inkubation von 500 mg in überkritischem
EMI4.1
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EMI5.1
<tb>
<tb> Inkubationszeit <SEP> Aktivitätssteigerung <SEP> relative <SEP> Aktivität
<tb> [U/g] <SEP> [%]
<tb> unbehandeltes <SEP> Enzym <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP> : <SEP> t <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 1, <SEP> 90 <SEP> 0, <SEP> 21 <SEP> 335
<tb> 8 <SEP> 2, <SEP> 53 <SEP> :
<SEP> t <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 447
<tb> 24 <SEP> 3, <SEP> 43 <SEP> 0, <SEP> 40 <SEP> 605
<tb> 50 <SEP> 3, <SEP> 40 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 43 <SEP> 600 <SEP>
<tb>
Die Erhöhung der Aktivität von Schweinepankreaslipase ist in Tabelle 1 gezeigt, wobei das Enzympulver, das 24 Stunden bei 750C inkubiert wurde, die höchste Aktivitätssteigerung zeigte und in der weiteren Folge der Experimente als Vergleich zwischen behandelter und unbehandelter Schweinepankreaslipase herangezogen wurde. Es zeigte sich, dass keine weitere Erhöhung der Aktivität durch Verlängerung der Inkubationsdauer von 24 Stunden auf 50 Stunden erreicht werden konnte.
Mit dieser Resistenz gegen weitere Aktivitätssteigerungen mit dem erfindungsgemässen Verfahren unterscheiden sich erfindungsgemäss erhältliche Enzympräparationen von den im Stand der Technik geoffenbarten Präparationen.
Es wurden ähnliche Resultate erzielt, wenn das Experiment in einem 140 mi-Enzymreaktor, der sich in einem mit Wasser oder Diethylenglykol gefüllten Wasserbad befindet, oder in einem 300 mlExtraktor durchgeführt wurde. Die Behandlung von 500 mg Enzympulver für 24 Stunden bei 750C und 150 bar resultierte im Extraktor in 615 % Aktivitätssteigerung und im 140 ml-Enzymreaktor in einer 605 %-igen Aktivitätssteigerung. Die Aktivitätszunahme bleibt bei gleicher Lagerung, wie für die unbehandelten Enzyme von den Herstellern (Vertreibern) empfohlen, über mindestens 6 Monate erhalten.
Weiters wurde Schweinepankreaslipase für 24 Stunden bei 75 C in einem Trockner behandelt (mit Luft/Sauerstoff bei Atmosphärendruck), um die Möglichkeit auszuschalten, dass der erfinderische Effekt durch partielle thermale Umfaltung des Proteins herbeigeführt wird. Hierbei wurde nur eine geringe Erhöhung der Aktivität von 0, 57 U/g (unbehandelt) auf 0, 91 0, 09 U/g festgestellt (159, 7 % Aktivitätssteigerung bei Behandlung mit 750C im Trockenschrank) gegenüber der Aktivität nach Behandlung mit überkritischem CO2 (3, 4 U/g).
Bestimmung der Enzymaktivitäten
Nach der Behandlung mit überkritischem CO2 wurden die Filter, auf den sich die Enzympräparationen befanden, aus dem Enzymreaktor entfernt, in mit Drehverschlüssen verschliessbaren Plastikröhrchen verstaut und im Kühlschrank oder Gefrierschrank mindestens 12 Stunden vor der Analyse gelagert.
Beim Lipase-Assay wurden 100 ut einer Substratlösung (6 mg DGGR (1, 2-0-Dilauryl-racglycero-3-glutarsäure-resorufinester), aufgelöst in 12 ml einer 1-1 Mischung aus Dioxan und Thesit (10 % w/v) in destilliertem Wasser) zu 900 J der Enzymlösung (0, 1 M KH2P04, pH 6, 8, bei einer Enzymkonzentration von 0, 555 mg Lipase/mt) zugegeben. Die Zunahme der Absorption bei . =572 nm nach einer Wartezeit von 100 Sekunden wurde für die Messung der Enzymaktivitäten verwendet. Alle Absorptionsmessungen wurden bei 250C mit einem Shimadzu UV 160A-Spektrophotometer mit Lauda RM6-Temperaturkontrolle durchgeführt.
Eine Lipaseeinheit wurde als die Enzymaktivität, die pro min bei pH 6, 8 und 24 C 1, 0 Mol Resorufln aus DGGR freisetzt, definiert.
Proteinbestimmung
Zur Messung des Proteingehaltes wurde das Verfahren von Bradford (M. M. Bradford, Anal.
Biochem. 72 (1976), 248-254) verwendet. Hierbei wurde die Reagenslösung durch Auflösung von 100 mg SERVA Blau G in 50 ml 95 % Ethanol hergestellt. Nach Zugabe von 100 ml 85 %iger (w/v) H3P04 wurde die Lösung mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 1 I verdünnt. Alle Testlösungen (und Rinderserumalbumin-Standardlösungen) wurden durch Auflösen der Proteine in 0, 15 M NaCI-Lösung hergestellt. 1 00 I der Standardlösungen (Proteinkonzentration 0, 1 - 1 mg/mi) und die Testlösungen (1 mg/mi) wurden mit 5 mi der Bradford-Reagenslösung vermischt und nach
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5 min die Absorption bei 595 nm gegen einen Leerwert bestimmt.
Für die eingesetzten Schweinepankreaslipasen wurden demgemäss ein Proteingehalt von 5, 7 : f : 0, 7 % (Serva) und 15, 3 i 0, 4 % (Fluka) festgestellt. Nach 24-stündiger Behandlung mit überkritischem CO2 bei 75 C und 150 bar wurde für die Lipase von Fluka ein Proteingehalt von 14, 9 0, 5 % festgestellt, wodurch sich ergibt, dass kein signifikanter Unterschied (p < 0, 05) des Proteingehaltes vor oder nach der Behandlung mit überkritischem CO2 eintritt, wodurch wiederum belegt wurde, dass die relative Aktivitätsänderung der Aktivität in Einheiten pro g Festsubstanz Identisch mit den Änderungen der spezifischen Aktivität in Units/g Protein ist.
Messung des Gewichtsverlustes
Zur Bestimmung des Gewichtsverlustes von Schweinepankreaslipase wurden rund 500 mg (siehe Tabelle 1) abgewogen in einem 25 ml-Becherglas mittels Papierfilter verschlossen. Dieses Becherglas wurde in einen vorgeheizten Extraktor (300 ml) gegeben und für 24 h bei 150 bar und 750C unter Verwendung eines Speed SFE-Instruments (Applied Separations) inkubiert. Das Becherglas und das Enzympulver wurden vor und unmittelbar nach der Behandlung mit überkritischem CO2 abgewogen. Der Extrakt wurde in einem Schott-Röhrchen, welches mit dem CO2-Aus- lass verbunden war, disengagiert. Vor und nach Druckabfall wurde das Röhrchen abgewogen. Nach Beendigung wurde der Extrakt bei-20 C in einem Gefrierschrank gelagert.
Tabelle 2
Gewichtsverlust von Lipase aus Schweinepankreas durch Behandlung mit überkritischen CO2
EMI6.1
<tb>
<tb> Gew. <SEP> Anteil <SEP> der <SEP> Röhrchen+Enzym <SEP> vor <SEP> Röhrchen+Enzym <SEP> nach <SEP> Gewichts- <SEP> Extrakt <SEP>
<tb> eingesetzten <SEP> Behandlung <SEP> mit <SEP> Behandlung <SEP> mit <SEP> über-verlust <SEP>
<tb> Lipase <SEP> uberkritischem <SEP> CO2 <SEP> kritischem <SEP> CO2
<tb> 498,0 <SEP> mg <SEP> 13,7710 <SEP> g <SEP> 13,7503 <SEP> g <SEP> 20,7 <SEP> mg <SEP> 1,2 <SEP> mg
<tb> (4,2%*)
<tb> 504, <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 13, <SEP> 4615 <SEP> g <SEP> 13, <SEP> 4432 <SEP> g <SEP> 19, <SEP> 2 <SEP> mg <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> mg <SEP>
<tb> (4, <SEP> 1%*)
<tb> 519, <SEP> 9mg <SEP> 24, <SEP> 9536g <SEP> 24, <SEP> 9243g <SEP> 29, <SEP> 3mg <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP> mg <SEP>
<tb> (5.
<SEP> 6%*) <SEP>
<tb>
* Relativer Gewichtsverlust in %, bezogen auf die Einwaage (Die Bestimmung des gewichtsverlustes wurde sofort nach der Entspannung durchgeführt).
In Tabelle 2 ist der Gewichtsverlust von Schweinepankreaslipase nach Behandlung mit trockenem überkritischen CO2 von drei Extraktionen mit rund 500 mg Enzympulver angeführt. Ein mittlerer Gewichtsverlust von 4, 6 : ! : 0, 8 % (durch mehrminütiges Aussetzen an Luftfeuchtigkeit aber sinkt dieser Wert wieder) konnte beobachtet werden. Im Glasröhrchen, das mit dem Auslass verbunden war, wurden nur 0, 47 0, 28 % des Extraktes gefunden. Durch Verwendung eines Feuchtigkeitsanalysators (Sartorius MA30-Feuchtigkeitsanalysator) konnte ein Gewichtsverlust (Feuchtigkeitsgehalt) von 4, 99 % für die unbehandelte Lipase (Literaturwert : 5, 5 % gemäss Karl-Fischer-Titration), und nur 3, 13 % für die mit kritischem CO2 behandelte Lipase festgestellt werden.
Damit wurde gezeigt, dass der Lipasepräparation durch Behandlung mit überkritischem CO2 Feuchtigkeit entzogen wurde.
Extrakt-Analyse
Die Analyse der Veresterung bei freien Fettsäuren zu Fettsäuremethylestern (FAME) wurde mittels BFs/MeOH als Veresterungsreagens mit geringfügigen Änderungen gegenüber der von Sattler et al. für Lipoproteinextrakte beschriebenen Methode durchgeführt (Anal. Biochem. 198 (1991), 184-190). Zum Extrakt wurden 0,5 mi Toluol und 1, 0 ml BF3/MeOH zugegeben und die
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Veresterung bei 1100C 90 min lang in verschraubbaren Röhrchen mit Teflondichtung in einem Trockner durchgeführt. Nach Abkühlung wurden 2 mi destilliertes Wasser zugegeben und dreimal mit n-Hexan (3 ml) extrahiert. Die Extrakte wurden bei Raumtemperatur unter einem Stickstoffstrom getrocknet und in 300 ml Methylenchlorid aufgenommen und der Gaschromatographieanalyse zugeführt.
Die Ester wurden auf einer 60 m x 0, 323 mm i. d. DB-WAX-Säule (J. & W. Scientific) mit einer Filmdicke von 0, 5) im chromatographiert. Die Analyse wurde mit einem Hewlett-Packard HP5890 Series it-Chromatographen mit temperaturkontrolliertem Autosampler (2 C) und einem Flammenionisierungsdetektor (FID/Detektortemperatur 300 C) durchgeführt. Wasserstoff wurde als Carriergas mit einer Flussrate von 0, 934 ml/min verwendet Das folgende Temperaturprogramm wurde verwendet : 2100C (4 min), 210-240 C (5 C pro min) und 240 C.
Nach der Derivatisierung, wie für die Analyse der freien Fettsäuren verwendet, wurden im Extrakt die in Tabelle 3 aufgelisteten Fettsäuren identifiziert.
Tabelle 3
Fettsäureanalyse des PPL-Extraktes, analysiert mittels Gaschromatographie
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<tb>
<tb> Freie <SEP> Fettsäureretative <SEP> Peakf <SEP> ! <SEP> äche <SEP>
<tb> Myristinsäure <SEP> (C14 <SEP> : <SEP> 0) <SEP> 3, <SEP> 3% <SEP>
<tb> Palmitinsäure <SEP> (C16 <SEP> : <SEP> 0) <SEP> 35, <SEP> 3 <SEP> % <SEP>
<tb> Palmitoleinsäure <SEP> (C16 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> 1, <SEP> 6% <SEP>
<tb> Stearinsäure <SEP> (C18 <SEP> : <SEP> 0) <SEP> 23, <SEP> 6% <SEP>
<tb> Oleinsäure <SEP> (C18 <SEP> 1) <SEP> 18, <SEP> 5% <SEP>
<tb> Linolsäure <SEP> (C18 <SEP> :
<SEP> 2) <SEP> 3, <SEP> 6% <SEP>
<tb> relative <SEP> Fläche <SEP> aller <SEP> identifi-85, <SEP> 9 <SEP> % <SEP>
<tb> relative <SEP> Fläche <SEP> aller <SEP> identifi- <SEP> 85,9%
<tb> zierter <SEP> Peaks
<tb>
Die gesamte Peakfläche während einer Retentionszeit von 16 min wurde als 100 % festgesetzt.
Als Hauptkomponenten konnten Palmitinsäure, Stearinsäure und Oleinsäure festgestellt werden. Damit konnte auch gezeigt werden, dass durch Behandlung mit überkritischem Kohlendioxid Fettsäureverunreinigungen zumindest verringert werden können.
Weiters wurden Untersuchungen bezüglich der Disulfidbrücken (durch gemäss Ellman, Arch Biochem. Biophys. 82 (1959) 70-77), der freien Aminogruppen (Lysine) (gemäss Kakade et al., Anal. Biochem. 27 (1969), 273-280), des Carbonylgehaltes (Fields et al., Biochem. J. 121 (1971), 587-589) und der Tryptophanfluoreszenz (Emissionsspektrum bei 300C mit einem Perkin-Elmer LS50 B-Spektrofluorimeter, Anregungen durch 280 nm, Emission durch 300-420 nm, Anre- gung/Emissionsschlitz 3 nm, Scangeschwindigkelt 100 nm/min) durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Behandlung mit überkritischem CO2 zu keiner Veränderung der Anzahl der Disulfidbrücken, der Anzahl an Lysinen und der Tryptophanfluoreszenzemission führte und keine Zunahme an Carbonylgruppen als etwaiges Resultat oxidativer Änderungen auftrat.
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The invention relates to a method for increasing the activity and reducing fatty acid contamination of pancreatic lipases.
Lipases (triacylglycerol hydrolases [EC 3. 1. 1. 3]) are enzymes that hydrolyze water-insoluble triglycerides at the water / 01 interface. These enzymes not only play an important role physiologically (by hydrolyzing fat in the digestive tract, for example), but are also used on a large industrial scale to re-triglycerides. Lipases are surprisingly versatile biocatalysts that are able to acylate or deacylate a large number of synthetic substrates, and are generally highly regioselective (R.D.
Schmid, et al., Angew. Chemie 110 (1998), pp. 1695-1720).
Lipases can be isolated from a variety of different sources, but pig pancreas or certain microorganisms can be used if desired (Enzymes in Industry: Production and Applications, ed. W. Gerhartz, VCH Weinheim (1990), p. 89).
Today, lipases are used on an industrial scale in fat chemistry (for the production of soaps, fatty acids, fats with improved spreadability, cocoa butter equivalents, tnglycerides with a high digestive value), in detergents (for removing grease soiling and for in-situ production of peracids as bleach), in paper production, in used in the milk industry (especially in cheese production) or as biocatalysts in organic synthesis and in medicine (Schmid et al., Angew. Chem. 110 (1998), pp. 1695-1720).
Since the isolation of pure lipases is very complex, crude lipase preparations (low purity) are mainly used for industrial applications in which the use of larger amounts of the enzymes is necessary. These usually contain high levels of other proteins, lipids, fatty acids and carbohydrates
In particular, fatty acid impurities have been found to be entirely disruptive in commercial lipases (S. Misra et al., Lipids 19 (4) (1984), pp. 302-303)
Pancreatic lipase preparations are e.g. B. isolated from pig pancreas and may also contain esterases, proteases and amylases. Animal lipases are known to preferentially cause the hydrolysis of fatty acids with more than 12 carbon atoms, and for the most part at the C-1 position of the triglyceride.
The reaction rate drops considerably in the substrate order tri-, DI- and monoglycerides (Emzymes in Industry: ProductIon and Appiications, ed. W. Gerhartz, VCH Weinheim (1990), pp. 89-90).
Porcine pancreatic lipase is a triacylglycerol lipase with a sequence of 449 amino acids and seven dlsulfide bridges. Porcine pancreatic lipase is the most precisely described pancreatic lipase. It is used as a biocatalyst in the food industry and for flavor production as well as for organic syntheses, e.g. B. for regioselective esterifications, for enantioselective hydrolysis of meso compounds, for regioselective acylation of hydroxy compounds, for lipase-catalyzed synthesis of sugar esters and for many other uses on an industrial scale. Porcine pancreatic lipase has also been used as a biocatalyst for the esterification of glycidol (J.F. Martins, Biotechnol. Bioeng. 44 (1994), pp. 119-124 and J.F. Martins, Enzyme Microb.
Technol. 16 (1994), pp. 785-790) and for the enzymatic hydrolysis of triplets and their partial glycerides in supercritical COs (G. Glowacz, Chem. Phys. Lipids 79 (1996), pp. 101-106)
The treatment of enzyme preparations with supercritical fluids is described in the prior art for two essential processes. On the one hand, supercritical fluids are used for extraction from biological preparations of fatty acids and lipids. Proteins are poorly soluble in supercritical fluids and remain in the residue after extraction (J. P. K. Weder, Cafe Cacao The 34 (2) (1990), pp. 87-96). This procedure was also used for the first purification of a low-purity esterase preparation (Steinberger et al., Joint Annual Meeting 1998 OBG / OGGGT).
Secondly, the enzymatic activity of proteins can be changed and specifically controlled in the presence of supercritical fluids. This fact plays a role in particular in the development of new strategies for organic synthesis using biocatalysts (Cernia et al., Methods in Enzymol. 286 (1997) , Pp. 495-508; Kamat et al., Crit. Rev. Biotechnol. 15 (1) (1995), pp. 41-71).
Although biocatalysts of high stability are generally used in organic synthesis (proteases, lipases or hydrolases are generally considered stable enzymes),
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Depending on the selected conditions (pressure, temperature etc.) and process steps (relaxation and compression steps) there is considerable enzyme activation.
Giessauf et al., Progress in Biotechnology 15, ed. A. Ballesteros, FJ Plou, JL Iborra, PJ Haling, Elsevier, Amsterdam (1998), pp. 471-476, reported that various lipases and esterases when treated with can lose supercritical CO2 by up to half of their initial activity (cf. also Kamat et al., Biotechnol. Bioeng. 46 (1995), pp. 610-620)). With many industrially used enzymes, however, it has been shown that, in supercritical fluids, their activity does not have to suffer any loss of activity.
Supercritical CO2 in particular is considered to be a very advantageous solvent medium because it has a low toxicity, no residues remain in the treated material and its use is low in cost and can therefore also be used for processes in which food components for humans and animals are produced.
The object of the present invention is to use the treatment of enzymes with supercritical fluids in such a way that qualitatively improved biocatalysts can be produced.
The present invention relates to a method for increasing the activity of pancreatic lipases, which is characterized in that a preparation containing pancreatic lipases is treated with supercritical fluids.
Surprisingly, it was found that enzymes, such as pancreatic lipases, in particular the lipase isolated from pig pancreas, experience a significant increase in activity through treatment with supercritical fluids.
While it has hitherto been assumed in the prior art that treatment with supercritical fluids can at best serve to maintain the initial activity and rather considerable loss of activity can be expected in some cases, it has been shown according to the invention that treatment with supercritical fluids, in particular with supercritical CO2 , a significant increase in activity of pancreatic lipase preparations can be brought about.
Since small activity differences (10-20%) after treatment with supercritical fluids cannot necessarily be considered relevant due to the possible measurement variance, an increase in activity according to the invention is understood to mean an increase of at least 50% based on the initial activity.
According to the invention, it has been shown that the increase in activity can be increased by 100%, in particular by 400%, even to over 600%, with the treatment according to the invention.
In contrast, it was described in the prior art, as mentioned, that the activity of enzymes was at best preserved when treated with supercritical fluids. So far, the highest value for lipases has been described as an increase of 104.1% (Giessauf et al. (Joint annual conference 1998 OBG / ÖGGGT); however, due to the measurement inaccuracies mentioned, this value cannot really be regarded as an increase in activity).
Supercritical fluids are characterized by the fact that they exist under temperature and pressure conditions that are above their critical point. The critical point is defined as the point at which the liquid and gaseous phases cannot be distinguished. A fluid is supercritical if its temperature and pressure are above the critical point. The properties lie between liquids and gases: density almost like liquids, high solubility, high molecular diffusion, low viscosity, high compressibility, etc.
In principle, any suitable medium can be used as the supercritical fluid with which the treatment according to the invention is carried out, in particular the CO2 already described for lipase systems, furthermore fluoroform, ethane, sulfur hexafluoride, ethylene and propane, with supercritical CO2 being particularly preferred according to the invention.
The temperature at which the treatment is carried out depends primarily on the supercritical fluid, and particularly high increases in activity can be carried out if the treatment is carried out in a temperature range between 65 to 85.degree. Temperatures> 120 C are generally no longer relevant, since thermal decomposition and inactivation of the enzymes can be expected.
The pressure which is used in the treatment also depends primarily on the nature of the supercritical fluid, a range from 100 to 600 bar being preferred. For technical reasons, pressures> 1000 bar are generally no longer relevant.
According to a preferred embodiment, the treatment according to the invention is carried out
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Pressure change carried out.
The method according to the invention is particularly well suited for the treatment of preparations of low purity (protein content <80%) which, after the treatment, can be used directly for industrial purposes without the need for further complex cleaning steps. The increase in activity according to the invention then leads in a simple manner to a doubling, tripling or even a six-fold increase in the enzyme activity of these crude work-ups.
Accordingly, crude lipase preparations which have a protein content of less than 80% by weight, preferably less than 20% by weight, are particularly preferably treated according to the invention.
This means that the common raw preparations of pancreatic lipase (these generally contain around 5 to 15% protein) can be used particularly advantageously in the process according to the invention.
The lipase preparation used is preferably lyophilized and has a moisture content of less than 50% by weight, preferably less than 20% by weight.
According to a further aspect, the present invention relates to a lipase preparation which can be obtained by the process according to the invention. If pancreatic lipases are treated according to the invention with, for example, supercritical CO2, they are distinguished by their increased activity and by the fact that the activity of these preparations can no longer be increased to the same extent as in the first treatment by a renewed treatment cycle with supercritical fluids, in particular when the treatment according to the invention has been carried out completely, which is usually the case if the preparation has been treated for about 24 hours or longer.
According to the invention, the best results are achieved with the lipase from pig pancreas and similar lipases, since this has a particularly large number of disulfide bridges. The pancreatic lipase from pig (fattening pig) has 449 amino acids and is described, for example, in Fournier et al. Eur. J. Biochem. 170 (1987), 369-171. This enzyme has six disulfide bridges. It has been shown that an increased content of disulfide bridges, that is to say more than 3, preferably more than 5 disulfide bridges, leads to clearer increases in activity in the lipase to be treated according to the invention.
Finally, the present invention also relates to the use of a treatment with supercritical fluids to increase the activity of enzyme preparations. According to the invention, it was possible to show for the first time that treatment with supercritical fluids led to a significant increase in the activity of pancreatic lipases (ie increases of 50% or more). It could thus be shown that the treatment with supercritical fluids, in particular with supercritical CO2, can actually lead to an increase in enzyme activity and not, as was previously assumed in the prior art, only involves a risk of activity losses.
The treatment according to the invention with supercritical fluids can preferably also be used to reduce fatty acid contamination in lipases (cf. Misra et al., Lipids 19 (4) (1984), pp. 302-303) without there being any (further) loss of activity comes.
The invention is explained in more detail with reference to the following examples and the drawing figures, to which, however, it should not be restricted.
Show it :
Fig. 1a: The change in activity after treatment of porcine pancreatic lipase with supercritical CO2 as a function of temperature (duration of treatment 1 hour).
Fig. 1b: The dependence of the increase in activity on time at 75 C, and
Fig. 1c: The dependence of the increase in activity on relaxation and compression steps at 35 C.
For example:
Preliminary studies have already compared the stabilities of various enzymes (Lipase from Candida rugosa, Lipase AY from Candida rugosa, Lipase PS from Pseudomonas species and Esterase EP10 in the treatment with supercritical CO2, at best consistent activities during a 24-hour incubation at 75 C and 150 bar can be achieved
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ten (Giessauf et al. Joint Annual Meeting 1998 ÖBG / ÖGGGT)).
Treatment of porcine pancreatic lipase with supercritical CO2
For the determination of the increase in activity as a function of the temperature, around 40 mg of enzyme (with-20 U / mg powder from FLUKA (CH), It. Catalog [1 U corresponds to the amount of enzyme, 1 mol of oleic acid per minute at pH = 8 , 0 and 370C is released and 20 U / mg from SERVA (Heidelberg) is placed in a paper filter and placed in an enzyme reactor (with 140 ml internal volume), which is thermostatted using a water bath (filled with water or ethylene glycol) was inflated with CO2 to a pressure of 150 bar and the enzyme was incubated at different temperatures (Fig. 1a) for different periods of time (Fig. 1b) and depending on pressure change steps (Fig. 1c) in the supercritical CO2.
The results are shown in Figures 1a-1c. It was shown that incubation for one hour at temperatures below 650C did not result in a significant loss or increase in enzyme activities, as was observed with other enzymes. A one-hour incubation at 75 C and 150 bar leads to an increase in activity to a value of 242.6% of the starting value (0.453 U / g enzyme powder). In comparison, the esterase from Pseudomonas marginata, the lipase from Candida rugosa and the lipase AY from Candida rugosa showed no such effect. With these enzymes, only a reduction or no effect on the enzymatic activity by treatment with supercritical CO2 at temperatures above 750C could be observed.
A time-dependent effect was observed when increasing the activity of porcine pancreatic lipase.
As shown in Fig. 1b, there is a rapid increase in activity within the first hours of incubation until an activity of 3.90 U / g enzyme powder is obtained after 24 hours of incubation. This corresponds to an 860% increase in activity.
Stability against pressure increase / pressure drop steps
Here, the enzymes were treated at 150 bar and 350 for 1 hour before each pressure drop.
Immediately after the pressure returned to atmospheric levels, the pressure was increased again. These pressure increase / decrease cycles were performed 30 times with the lipase samples stored at 4 C overnight.
The results of the tests for the pressure resistance of porcine pancreatic lipase are shown in Fig. 1c. Even after several pressure cycles, this enzyme showed an increase in activity up to a value of 0.88 U / g enzyme powder, which corresponds to an increase in activity of 191%, and this despite the fact that, according to the prior art, such pressure change cycles were often held responsible for significant activity losses ( Kasche et al., Biotechnol. Lett. 10 (1988), pp. 569-574). (So far, only a slight (21 and 35%) increase in activity could be observed for a-amylase in the presence of microorganisms when treated with supercritical CO2 (200 atmospheres, 2 hours, 35 C) (Kamihira et al., Agric. Biol. Chem ,
51 (1987), pp. 407-412)).
Treatment with supercritical CO2
For the rest of the investigation of the increase in the activity of the enzymes to supercritical carbon dioxide (75 C / 24h and 150 bar), around 500 mg of enzyme were used and treated in the usual apparatus. However, instead of wrapping it in a paper filter, the enzyme was placed in a small beaker sealed with a paper filter (which was fixed with wire).
Table 1
Increase the activity of PPL (Fluka) by incubating 500 mg in supercritical
EMI4.1
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EMI5.1
<Tb>
<tb> Incubation time <SEP> Activity increase <SEP> Relative <SEP> activity
<tb> [U / g] <SEP> [%]
<tb> untreated <SEP> enzyme <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP>: <SEP> t <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 1, <SEP> 90 <SEP> 0, <SEP> 21 <SEP> 335
<tb> 8 <SEP> 2, <SEP> 53 <SEP>:
<SEP> t <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 447
<tb> 24 <SEP> 3, <SEP> 43 <SEP> 0, <SEP> 40 <SEP> 605
<tb> 50 <SEP> 3, <SEP> 40 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 43 <SEP> 600 <SEP>
<Tb>
The increase in the activity of porcine pancreatic lipase is shown in Table 1, the enzyme powder which was incubated for 24 hours at 750C showing the highest increase in activity and was subsequently used as a comparison between treated and untreated porcine pancreatic lipase. It was shown that no further increase in activity could be achieved by extending the incubation period from 24 hours to 50 hours.
With this resistance to further increases in activity with the method according to the invention, enzyme preparations obtainable according to the invention differ from the preparations disclosed in the prior art.
Similar results were obtained when the experiment was performed in a 140 ml enzyme reactor placed in a water bath filled with water or diethylene glycol or in a 300 ml extractor. Treatment of 500 mg of enzyme powder for 24 hours at 750C and 150 bar resulted in a 615% increase in activity in the extractor and a 605% increase in activity in the 140 ml enzyme reactor. The increase in activity is maintained for at least 6 months with the same storage as recommended by the manufacturers (distributors) for the untreated enzymes.
Furthermore pork pancreatic lipase was treated for 24 hours at 75 C in a dryer (with air / oxygen at atmospheric pressure) in order to eliminate the possibility that the inventive effect is brought about by partial thermal refolding of the protein. Here, only a slight increase in activity from 0.57 U / g (untreated) to 0.91.09.09 U / g was found (159.7% increase in activity when treated with 750C in a drying cabinet) compared to the activity after treatment with supercritical CO2 (3, 4 U / g).
Determination of enzyme activities
After treatment with supercritical CO2, the filters on which the enzyme preparations were located were removed from the enzyme reactor, stowed in plastic tubes which can be closed with twist locks, and stored in the refrigerator or freezer at least 12 hours before the analysis.
In the lipase assay, 100 μl of a substrate solution (6 mg DGGR (1,2-0-dilauryl-racglycero-3-glutaric acid resorufine ester), dissolved in 12 ml of a 1-1 mixture of dioxane and thesite (10% w / v ) in distilled water) to 900 J of the enzyme solution (0.1 M KH2P04, pH 6.8, at an enzyme concentration of 0.555 mg lipase / mt). The increase in absorption at. = 572 nm after a waiting time of 100 seconds was used for the measurement of the enzyme activities. All absorption measurements were made at 250C with a Shimadzu UV 160A spectrophotometer with Lauda RM6 temperature control.
A lipase unit was defined as the enzyme activity that releases 1.0 mole of resorufln from DGGR per min at pH 6, 8 and 24 C.
protein determination
The method of Bradford (M. M. Bradford, Anal.
Biochem. 72 (1976), 248-254). The reagent solution was prepared by dissolving 100 mg SERVA Blau G in 50 ml 95% ethanol. After adding 100 ml of 85% (w / v) H3P04, the solution was diluted to a volume of 1 l with distilled water. All test solutions (and bovine serum albumin standard solutions) were prepared by dissolving the proteins in 0.15 M NaCl solution. 100 l of the standard solutions (protein concentration 0.1-1 mg / ml) and the test solutions (1 mg / ml) were mixed with 5 ml of the Bradford reagent solution and after
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5 min the absorption at 595 nm was determined against a blank value.
Accordingly, a protein content of 5, 7: f: 0, 7% (Serva) and 15, 3 i 0, 4% (Fluka) was found for the pork pancreatic lipases used. After 24-hour treatment with supercritical CO2 at 75 C and 150 bar, a protein content of 14.9 90.5% was found for the lipase from Fluka, which means that there was no significant difference (p <0.05) in the protein content or after treatment with supercritical CO2, which in turn has been demonstrated that the relative change in activity in units per g of solid substance is identical to the changes in specific activity in units / g of protein.
Weight loss measurement
To determine the weight loss of porcine pancreatic lipase, around 500 mg (see Table 1) were weighed out in a 25 ml beaker and sealed using a paper filter. This beaker was placed in a preheated extractor (300 ml) and incubated for 24 h at 150 bar and 750C using a Speed SFE instrument (Applied Separations). The beaker and the enzyme powder were weighed before and immediately after the treatment with supercritical CO2. The extract was disengaged in a Schott tube, which was connected to the CO2 outlet. The tube was weighed before and after the pressure drop. After completion, the extract was stored at -20 C in a freezer.
Table 2
Weight loss of pancreatic lipase from treatment with supercritical CO2
EMI6.1
<Tb>
<tb> wt. <SEP> portion <SEP> of the <SEP> tubes + enzyme <SEP> before <SEP> tubes + enzyme <SEP> after <SEP> weight- <SEP> extract <SEP>
<tb> used <SEP> treatment <SEP> with <SEP> treatment <SEP> with <SEP> over-loss <SEP>
<tb> Lipase <SEP> supercritical <SEP> CO2 <SEP> critical <SEP> CO2
<tb> 498.0 <SEP> mg <SEP> 13.7710 <SEP> g <SEP> 13.7503 <SEP> g <SEP> 20.7 <SEP> mg <SEP> 1.2 <SEP> mg
<tb> (4.2% *)
<tb> 504, <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 13, <SEP> 4615 <SEP> g <SEP> 13, <SEP> 4432 <SEP> g <SEP> 19, <SEP> 2 <SEP > mg <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> mg <SEP>
<tb> (4, <SEP> 1% *)
<tb> 519, <SEP> 9mg <SEP> 24, <SEP> 9536g <SEP> 24, <SEP> 9243g <SEP> 29, <SEP> 3mg <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP> mg < September>
<tb> (5th
<SEP> 6% *) <SEP>
<Tb>
* Relative weight loss in%, based on the weight (the weight loss was determined immediately after relaxation).
Table 2 shows the weight loss of pig pancreatic lipase after treatment with dry supercritical CO2 from three extractions with around 500 mg of enzyme powder. An average weight loss of 4, 6:! : 0.8% (due to exposure to humidity for several minutes but this value drops again) could be observed. Only 0.47.28% of the extract was found in the glass tube connected to the outlet. Using a moisture analyzer (Sartorius MA30 moisture analyzer) resulted in a weight loss (moisture content) of 4.99% for the untreated lipase (literature value: 5.5% according to Karl Fischer titration), and only 3.13% for those with critical CO2 treated lipase can be found.
It was shown that moisture was removed from the lipase preparation by treatment with supercritical CO2.
Extract Analysis
The analysis of the esterification with free fatty acids to fatty acid methyl esters (FAME) was carried out using BFs / MeOH as the esterification reagent with slight changes compared to that of Sattler et al. method described for lipoprotein extracts performed (Anal. Biochem. 198 (1991), 184-190). 0.5 ml of toluene and 1.0 ml of BF3 / MeOH were added to the extract and the
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Esterification carried out at 1100C for 90 min in screwable tubes with Teflon seals in a dryer. After cooling, 2 ml of distilled water were added and extracted three times with n-hexane (3 ml). The extracts were dried at room temperature under a stream of nitrogen and taken up in 300 ml of methylene chloride and subjected to gas chromatography analysis.
The esters were on a 60 m x 0.323 mm i. d. DB-WAX column (J. & W. Scientific) with a film thickness of 0.5) chromatographed. The analysis was carried out using a Hewlett-Packard HP5890 Series it chromatograph with temperature-controlled autosampler (2 C) and a flame ionization detector (FID / detector temperature 300 C). Hydrogen was used as the carrier gas with a flow rate of 0.934 ml / min. The following temperature program was used: 2100C (4 min), 210-240 C (5 C per min) and 240 C.
After derivatization, as used for the analysis of the free fatty acids, the fatty acids listed in Table 3 were identified in the extract.
Table 3
Fatty acid analysis of the PPL extract, analyzed by gas chromatography
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<Tb>
<tb> Free <SEP> fatty acid substitutes <SEP> Peakf <SEP>! <SEP> area <SEP>
<tb> Myristic acid <SEP> (C14 <SEP>: <SEP> 0) <SEP> 3, <SEP> 3% <SEP>
<tb> Palmitic acid <SEP> (C16 <SEP>: <SEP> 0) <SEP> 35, <SEP> 3 <SEP>% <SEP>
<tb> Palmitoleic acid <SEP> (C16 <SEP>: <SEP> 1) <SEP> 1, <SEP> 6% <SEP>
<tb> stearic acid <SEP> (C18 <SEP>: <SEP> 0) <SEP> 23, <SEP> 6% <SEP>
<tb> Oleic acid <SEP> (C18 <SEP> 1) <SEP> 18, <SEP> 5% <SEP>
<tb> linoleic acid <SEP> (C18 <SEP>:
<SEP> 2) <SEP> 3, <SEP> 6% <SEP>
<tb> relative <SEP> area <SEP> of all <SEP> identifi-85, <SEP> 9 <SEP>% <SEP>
<tb> relative <SEP> area <SEP> of all <SEP> identifi- <SEP> 85.9%
<tb> decorated <SEP> peaks
<Tb>
The total peak area during a retention time of 16 min was set at 100%.
The main components identified were palmitic acid, stearic acid and oleic acid. This also showed that treatment with supercritical carbon dioxide can at least reduce fatty acid contamination.
Furthermore, investigations were carried out regarding the disulfide bridges (by according to Ellman, Arch Biochem. Biophys. 82 (1959) 70-77), the free amino groups (lysines) (according to Kakade et al., Anal. Biochem. 27 (1969), 273-280 ), the carbonyl content (Fields et al., Biochem. J. 121 (1971), 587-589) and tryptophan fluorescence (emission spectrum at 300C with a Perkin-Elmer LS50 B spectrofluorimeter, excitation by 280 nm, emission by 300-420 nm, excitation / emission slit 3 nm, scanning speed 100 nm / min). It was shown that the treatment with supercritical CO2 did not change the number of disulfide bridges, the number of lysines and tryptophan fluorescence emission and there was no increase in carbonyl groups as a result of oxidative changes.