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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mercaptoacyl-L-prolinen der allgemeinen Formel
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in welcher n 0 oder 1 bedeutet.
Es ist bekannt, dass die Mercaptoacylderivate des L-Prolins als blutdrucksenkende Mittel dienen und durch Hydrolyse der Thioestergruppe von Verbindungen der allgemeinen Formel
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in welcher Rl für Methyl oder Phenyl steht, und anschliessende Reinigung der erhaltenen Produkte durch Ionenaustausch (US-PS Nr. 4, 105, 776, 8. 8. 1978) bzw. durch mehrfache Extraktion (EP-A-8831) zugänglich sind.
Ebenso ist es bekannt, dass Mercaptoacylderivate des L-Prolins durch saure Hydrolyse der niederen Alkylester des L-Prolins der allgemeinen Formel
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in welcher R, für eine Methyl- oder Phenylgruppe und R2 für eine niedere Alkylgruppe stehen, und anschliessende Hydrolyse der Thioesterschutzgruppe (US-PS Nr. 4, 105, 776) erhalten werden.
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welchem man das L-Prolin acyliert und anschliessend die Disulfidbindung des erhaltenen 1-[ Di- thiobis- (2-methyl-3-propionyl)]-bis-L-prolins durch Reduktion mittels Zink spaltet (US-PS Nr. 4, 105, 776).
Es wurde nun gefunden, dass man erfindungsgemäss Mercaptoacyl-L-proline der allgemeinen Formel (I) dadurch erhält, dass man auf an sich bekannte Weise das 4-Nitrobenzylprolinat der Formel
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worin n wie oben definiert ist, umsetzt und im erhaltenen 4-Nitrobenzylester des 1- (Dithiobisacyl) - - bis-L-prolins der allgemeinen Formel
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in welcher n die obige Bedeutung hat, die Estergruppe entweder auf bekannte Weise durch alkali- sche Hydrolyse oder elektrolytisch spaltet und die Disulfidbindung elektrolytisch spaltet, wobei die elektrolytischen Spaltungen mittels einer Hg-Elektrode in einer Zelle, in welcher der Kathoden- raum vom Anodenraum durch eine Membran getrennt ist, ausgeführt werden.
Die elektrolytische Spaltung der Ester- und Disulfidbindungen wird vorzugsweise in einer
Stufe ausgeführt, wobei als Anolyt ein Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise
Methanol bzw. einem Benzol-Methanolgemisch, und Wasser, das auf einen PH-Wert von 1 angesäuert ist, verwendet wird.
Wenn man die elektrolytische Spaltung der Ester- und Disulfidbindungen in zwei Stufen aus- führt, wird in der Stufe der Esterspaltung als Anolyt ein Gemisch aus einem organischen Lösungs- mittel, vorzugsweise Methanol bzw. einem Benzol-Methanolgemisch, und einer wässerigen Lösung eines Acetatpuffers mit einem PH-Wert von 6 verwendet, welches in der Stufe der Spaltung der
Disulfidbindung auf einen PH-Wert von 1, vorzugsweise mittels HSO, angesäuert wird.
Das 4-Nitrobenzylprolinat ist als solches unstabil und wird als Hydrobromidsalz hergestellt und aufbewahrt. Darum wird beim vorliegenden Verfahren aus praktischen Gründen vom Hydrobromidsalz des 4-Nitrobenzylprolinats ausgegangen, aus welchem durch Zugabe einer Base "in situ" das 4-Nitrobenzylprolinat freigesetzt wird.
Die 4-Nitrobenzylester des l- (Dithiobisacyl)-bis-L-prolins sind neue, bisher nicht beschriebene Verbindungen und werden durch Acylierung von 4-Nitrobenzylprolinat (V) mittels einer niederen Dithiobisalkylcarbonsäure (VI) gemäss der allgemein bekannten"Carbodiimidmethode"zur Bildung der Peptidbindung erhalten. Nach beendeter Reaktion werden die präzipitierten Produkte durch Filtration abgetrennt und das Acylierungsprodukt wird durch Auswaschen mit Wasser und durch Behandlung mit einem sauren und einem basischen Ionenaustauscher gereinigt.
Es soll betont werden, dass die elektrolytische Spaltung gemäss der zweiten Stufe des erfindungsgemässen Verfahrens ein äusserst sauberes Verfahren ist, welches keine Katalysatoren, die beim chemischen Verfahren nötig sind, erfordert. Die Möglichkeit, dass die Spaltung der Esterund der Disulfidbindung in einer Stufe und in einer Zelle ausgeführt werden kann, ist ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens im Vergleich mit den bisher bekannten Verfahren, gemäss welchen jede der angeführten Reaktionen gesondert ausgeführt werden muss : die Spaltung der Esterbindung wurde durch Hydrolyse oder katalytische Hydrogenolyse und die Spaltung der Disulfidbindung durch Reduktion mittels Zink erzielt.
Das Endprodukt des erfindungsgemässen Verfahrens wird aus der Reaktionslösung durch Verdampfen des Lösungsmittels, Extraktion der wässerigen Lösung mit Methylenchlorid und Einengen des Extraktes erhalten.
Die elektrolytische Spaltung einer Disulfidbindung ist in der anschliessenden Arbeitsvorschrift 1 und die elektrolytische Spaltung eines 4-Nitrobenzyl-carbonsäureesters in der anschliessenden Arbeitsvorschrift 2 illustriert :
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b) 1- (3-Mercapto-2-methylpropionyl) -L-prolin aus dem 4-Nitrobenzylester des 1-[ [Dithiobis- (2-me- thyl-3-propionyl)]-bis-L-prolins
Variante A a) Der gemäss Stufe a) erhaltene 4-Nitrobenzylester des l- [Dithio-bis- (2-methyl-3-pro- pionyl)]-bis-L-prolins (2, 1 g, 6 mMol) wurde in 36 ml Methanol gelöst. Der auf 0 C ab- gekühlten Lösung wurden 3, 6 ml 5 n Natronlauge zugegeben und es wurde 45 min lang bei Raumtemperatur gerührt.
Anschliessend wurde das Methanol verdampft, der Rückstand wurde mit 30 ml Wasser vermischt und der abgeschiedene Niederschlag des 4-Nitrobenzyl- alkohols wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde dreimal mit jeweils 10 ml Äther extrahiert und anschliessend mit 1 n Schwefelsäure neutralisiert.
ss t) Die erhaltene Lösung wurde dann durch Zugabe von 4 ml Methanol und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 32 ml sowie 6 ml 40%iger Schwefelsäure für die elektrolyti- sche Stufe des Verfahrens vorbereitet.
Der Aufbau der Elektrolysenzelle sowie der Verlauf des Prozesses wurden in Arbeitsvor- schrift 1 beschrieben.
Nach der Elektroreduktion wurde das Methanol aus der Lösung verdampft, dem wässerigen
Rückstand wurden 6 g Natriumchlorid zugegeben und mit sechs 20 ml-Portionen Methylen- chlorid extrahiert. Nach dem Trocknen der vereinigten Extrakte über Magnesiumsulfat und dem Verdampfen des Methylenchlorids wurden 1, 02 g (78, 3% d. Th., bezogen auf die
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441-[ Dithiobis- (2-methyl-3-propionyl) ] -bis-L-prolin (1, 12 g, 4 mMol) wurde in 40 ml eines
Methanol-Wasser-Gemisches (2 : 1) gelöst. Der Lösung wurden 8 ml 40%iger Schwefelsäure zugegeben und es wurde eine elektrolytische Spaltung auf die in Arbeitsvorschrift 1 be- schriebene Weise ausgeführt.
Nach beendeter Elektrolyse wurde aus der Lösung das Methanol durch Verdampfen ent- fernt, anschliessend wurden 5 g Natriumchlorid zugegeben und die Extraktion mittels fünf
15 ml-Portionen Methylenchlorid ausgeführt. Die vereinigten Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft.
Ausbeute : 1, 04 g ; 94% d. Th. Das Chromatogramm (Chromatographie wie in Arbeitsvorschrift 1, Rf = 0, 44) und das IR-Spektrum des Produktes entsprechen einer Originalprobe des 1- (3-Mercapto-2-methylpropionyl)-L-prolins.
Variante B Diese Verfahrensweise vereinigt die elektrolytische Spaltung der Ester- sowie der Disulfidbindungen in derselben Zelle, wobei man die Reaktion nach der ersten Stufe unterbrechen und das Zwischenprodukt isolieren konnte.
Der 4-Nitrobenzylester des 1- [Dithiobis- (2-methyl-3-propionyl) ] -bis-L-prolins (2, 1 g, 6 mMol) wurde in 60 ml Methanol gelöst. Die Methanollösung wurde mit einer wässerigen Lösung von 2 g Natriumacetat-Trihydrat in 10 ml Wasser, deren PH-Wert durch Zugabe von Essigsäure auf 6, 0 eingestellt worden war, versetzt. Die derart hergestellte Lösung wurde in eine in Arbeitsvorschrift 2 beschriebene Elektrolysenzelle, in welcher als Anolyt ein Gemisch aus 10 ml Methanol und 10 ml 20%iger Schwefelsäure diente, eingetragen.
Unter Rühren mit einem Magnetrührer bei Raumtemperatur und einer Stromdichte von 0,8 A/dm2 dauerte die Elektrolyse um 50% länger, als theoretisch berechnet worden war.
Dann wurden - ohne Reaktionsunterbrechung - in den Kathodenraum der Zelle 8 ml 40%iger Schwefelsäure zugetropft und die Reaktion wurde bei einer Stromdichte von 1 A/dm2 um 50% über die theoretisch berechnete Zeitdauer weitergeführt. Die Isolierung des Produktes, wie sie bei der Variante A beschrieben wurde, ergab 1, 08 g (83% d. Th.) des 1-(3-Mercapto-3-methylpropionyl)-L-prolins, welches gemäss seinem Chromatogramm und IR-Spektrum einer Originalprobe entsprach.
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The invention relates to a process for the preparation of mercaptoacyl-L-prolines of the general formula
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in which n means 0 or 1.
It is known that the mercaptoacyl derivatives of L-proline serve as hypotensive agents and by hydrolysis of the thioester group of compounds of the general formula
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in which Rl is methyl or phenyl, and subsequent purification of the products obtained by ion exchange (US Pat. Nos. 4, 105, 776, August 8, 1978) or by multiple extraction (EP-A-8831) are accessible.
It is also known that mercaptoacyl derivatives of L-proline by acid hydrolysis of the lower alkyl esters of L-proline of the general formula
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in which R represents a methyl or phenyl group and R2 represents a lower alkyl group, and subsequent hydrolysis of the thioester protecting group (US Pat. No. 4, 105, 776) are obtained.
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which one acylates the L-proline and then cleaves the disulfide bond of the 1- [di-thiobis (2-methyl-3-propionyl)] bis-L-proline obtained by reduction by means of zinc (US Pat. No. 4, 105 , 776).
It has now been found that, according to the invention, mercaptoacyl-L-prolines of the general formula (I) are obtained by the 4-nitrobenzylprolinate of the formula which is known per se
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wherein n is as defined above, and in the resulting 4-nitrobenzyl ester of 1- (dithiobisacyl) - - bis-L-proline of the general formula
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in which n has the above meaning, cleaves the ester group either in a known manner by alkaline hydrolysis or electrolytically and cleaves the disulfide bond electrolytically, the electrolytic cleavages being carried out by means of a mercury electrode in a cell in which the cathode space passes from the anode space a membrane is separated.
The electrolytic cleavage of the ester and disulfide bonds is preferably carried out in one
Stage carried out, preferably as a mixture of an organic solvent as anolyte
Methanol or a benzene-methanol mixture, and water that is acidified to a pH of 1, is used.
If the electrolytic cleavage of the ester and disulfide bonds is carried out in two stages, a mixture of an organic solvent, preferably methanol or a benzene-methanol mixture, and an aqueous solution of an acetate buffer is used as the anolyte in the stage of the ester cleavage used a pH value of 6, which in the stage of cleavage of
Disulfide bond is acidified to a pH of 1, preferably by means of HSO.
As such, 4-nitrobenzyl prolinate is unstable and is manufactured and stored as the hydrobromide salt. For this reason, for practical reasons, the present process starts from the hydrobromide salt of 4-nitrobenzylprolinate, from which the 4-nitrobenzylprolinate is released "in situ" by adding a base.
The 4-nitrobenzyl esters of l- (dithiobisacyl) -bis-L-proline are new compounds not previously described and are formed by acylation of 4-nitrobenzylprolinate (V) using a lower dithiobisalkylcarboxylic acid (VI) according to the generally known "carbodiimide method" the peptide bond. After the reaction has ended, the precipitated products are separated off by filtration and the acylation product is purified by washing with water and by treatment with an acidic and a basic ion exchanger.
It should be emphasized that the electrolytic cleavage according to the second stage of the process according to the invention is an extremely clean process which does not require any catalysts which are necessary in the chemical process. The possibility that the cleavage of the ester and the disulfide bond can be carried out in one step and in one cell is a further advantage of the process according to the invention in comparison with the previously known processes, according to which each of the reactions mentioned must be carried out separately: Ester bonding was achieved by hydrolysis or catalytic hydrogenolysis and the disulfide bond was cleaved by reduction using zinc.
The end product of the process according to the invention is obtained from the reaction solution by evaporating the solvent, extracting the aqueous solution with methylene chloride and concentrating the extract.
The electrolytic cleavage of a disulfide bond is illustrated in the subsequent working procedure 1 and the electrolytic cleavage of a 4-nitrobenzyl-carboxylic acid ester in the subsequent working procedure 2:
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b) 1- (3-Mercapto-2-methylpropionyl) -L-proline from the 4-nitrobenzyl ester of 1- [[dithiobis- (2-methyl-3-propionyl)] - bis-L-proline
Variant A a) The 4-nitrobenzyl ester of l- [dithio-bis- (2-methyl-3-propionyl)] - bis-L-proline (2.1 g, 6 mmol) obtained in step a) was obtained in 36 ml of methanol dissolved. 3.6 ml of 5N sodium hydroxide solution were added to the solution, which had cooled to 0 ° C., and the mixture was stirred at room temperature for 45 minutes.
The methanol was then evaporated, the residue was mixed with 30 ml of water and the deposited precipitate of the 4-nitrobenzyl alcohol was filtered off. The filtrate was extracted three times with 10 ml ether and then neutralized with 1N sulfuric acid.
ss t) The solution obtained was then prepared for the electrolytic stage of the process by adding 4 ml of methanol and water to a total volume of 32 ml and 6 ml of 40% sulfuric acid.
The structure of the electrolysis cell and the course of the process were described in working instruction 1.
After the electroreduction, the methanol was evaporated from the solution, the aqueous one
6 g of sodium chloride were added to the residue and extracted with six 20 ml portions of methylene chloride. After drying the combined extracts over magnesium sulfate and evaporating the methylene chloride, 1.02 g (78.3% of theory, based on the
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441- [Dithiobis (2-methyl-3-propionyl)] bis-L-proline (1, 12 g, 4 mmol) was dissolved in 40 ml of a
Methanol-water mixture (2: 1) dissolved. 8 ml of 40% strength sulfuric acid were added to the solution and electrolytic cleavage was carried out in the manner described in procedure 1.
After the electrolysis had ended, the methanol was removed from the solution by evaporation, then 5 g of sodium chloride were added and the extraction was carried out using five
15 ml portions of methylene chloride. The combined extracts were dried over magnesium sulfate and evaporated under reduced pressure.
Yield: 1.04 g; 94% of theory Th. The chromatogram (chromatography as in method 1, Rf = 0, 44) and the IR spectrum of the product correspond to an original sample of 1- (3-mercapto-2-methylpropionyl) -L-proline.
Variant B This procedure combines the electrolytic cleavage of the ester and disulfide bonds in the same cell, it being possible to interrupt the reaction after the first stage and to isolate the intermediate.
The 4-nitrobenzyl ester of 1- [dithiobis (2-methyl-3-propionyl)] bis-L-proline (2.1 g, 6 mmol) was dissolved in 60 ml methanol. The methanol solution was mixed with an aqueous solution of 2 g of sodium acetate trihydrate in 10 ml of water, the pH of which had been adjusted to 6.0 by adding acetic acid. The solution prepared in this way was introduced into an electrolysis cell described in working instruction 2, in which a mixture of 10 ml of methanol and 10 ml of 20% strength sulfuric acid served as the anolyte.
With stirring with a magnetic stirrer at room temperature and a current density of 0.8 A / dm2, the electrolysis took 50% longer than was theoretically calculated.
Then - without interrupting the reaction - 8 ml of 40% sulfuric acid were added dropwise into the cathode compartment of the cell and the reaction was continued at a current density of 1 A / dm2 by 50% over the theoretically calculated time period. The isolation of the product, as described for variant A, gave 1.08 g (83% of theory) of 1- (3-mercapto-3-methylpropionyl) -L-proline, which according to its chromatogram and IR Spectrum corresponded to an original sample.
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