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Die Erfindung betrifft die Verwendung eines wasserunlöslichen Proteinpräparates, insbesondere Enzym- präparates, wobei das Protein an ein vernetztes Copolymerisat gebunden ist, das aus copolymerisierten Ein- heiten von
A 0, l-50 Gew.-% o ;, ss-monoolefinisch ungesättigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen
B 35 - 90 Gew. -% Estern von Diolen und/oder Polyolen mit Acrylsäure oder Methacrylsäure und
C 5 - 60 Gew.
-% mindestens eines hydrophilen Monomeren mit mindestens einer Carboxyl-, Aminocarbonyl-, Sulfo- oder Sulfonylgruppe besteht-wobei die Summe der Prozentgehalte A bis C 100 beträgt-und die vernetzten Copolymerisate Schüttvolumina von 2 bis 20 ml/g und spezifische Oberflächen von 1 bis 400 m ?/g besitzen und nach der Verseifung der Anhydridgruppen 0, 02bis 11 Milliäquivalente Säure pro Gramm enthalten, zur Durchführung einer durch Proteine katalysierbaren Reaktion wie z. B. der hydrolytischen Spaltung von Substraten, insbesondere zur Spaltung von Penicillinen unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure.
Die covalente Bindung von Substanzen an unlösliche polymere Träger hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Besondere Vorteile bietet die Fixierung von katalytisch wirksamen Verbindungen, z. B. Enzymen, da sie in dieser Form nach beendeter Umsetzung leicht abgetrennt und mehrfach wiederverwendet werden können.
Als Träger mit reaktiven Gruppen wurden bereits mehrfach Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und Vinylverbindungen vorgeschlagen. Copolymeren des Maleinsäureanhydrids mit Äthylen und Monovinylverbindungen werden jedoch bei der Umsetzung mit wässerigen Enzymlösungen mehr oder weniger wasserlöslich, so dass vor oder während der Umsetzung zweckmässig ein zusätzlicher Vernetzer z. B. ein Diamin zugesetzt wird. So erhaltene Enzympräparate sind relativ schlecht filtrierbar und besitzen lösliche Anteile, was zu Verlusten an gebundenem Enzym führt (vgl. E. Katchalski, Biochemistry 3 [1964], S. 1905 bis 1919).
Ferner wurden Copolymerisate aus Acrylamid und Maleinsäure beschrieben, die durch nachträgliches Erhitzen in die Anhydridform überführt werden. Diese Produkte sind relativ schwach vernetzt, quellen sehr stark in Wasser und besitzen eine nur mässige mechanische Stabilität, was zu Abriebsverlusten bei der Anwendung dieser Harze führt (vgl. deutsche Offenlegungsschrift 1 908 290).
Ausserdem wurden stark vernetzte Trägerpolymeren durch Copolymerisation von Maleinsäureanhydrid mit Divinyläthern hergestellt. Auf Grund der alternierenden Copolymerisationsart der Monomeren enthalten diese Polymeren einen sehr hohen Anteil an Anhydridgruppen - in den angegebenen Beispielen jeweils über 50 Gew.-% Maleinsäureanhydrid-, der durch das Molekulargewicht des Vinyläthermonomeren bestimmt wird und daher nur in relativ engen Grenzen dem jeweiligen Verwendungszweck angepasst werden kann (vgl. deut- sehe Offenlegungsschrift 2 008 990).
In der deutschen Offenlegungsschrift 1 917 057 werden sehr verschiedene Trägermaterialien beschrieben, an welche das Enzym Penicillinacylase gebunden werden kann. Unter anderem werden dort ÄthylenMaleinsäureanhydrid-Polymerharze, Acrylsäureharze und auch Polysaccharide als mögliche Träger angegeben. Davon sind die Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Polymerharze (EMA) den Harzen gemäss der Erfindung am ehesten vergleichbar. Bei Nacharbeitung des Beispiels 3 dieser Offenlegungsschrift wurde, wie das Vergleichsbeispiel zeigt, ein gelartiges Enzympräparat enthalten, welches nach der Spaltung von Penicillinen zu 6-Aminopenicillansäure nur durch Zentrifugation abgetrennt werden kann.
Präparate mit einer derartigen Gel-Struktur sind jedoch für eine wirtschaftliche Verwertung im grosstechnischen Verfahren nicht gut geeignet. Hingegen können die erfindungsgemäss verwendeten unlöslichen Enzympräparate, welche pulverige Substanzen darstellen, z. B. durch eine einfache Filtration oder sogar lediglich durch Sedimentation abgetrennt werden. Der Produktionsverlauf wird hiedurch sehr einfach und liegt kostenmässig sehr günstig.
Bei der Nacharbeitung konnte nur eine sehr ungünstige Ausbeute an unlöslichem Enzym erreicht werden.
In 160 ml Gel wurden nur 9, 6 Einheiten an unlöslichem Enzym gefunden. Eine derartig geringe spezifische Aktivität ermöglicht eine enzymatische Hydrolyse von lediglich etwa 3g Penicillin-G-Kalium innerhalb einer Reaktionszeit von 9 h. Demgemäss ist eine Verwendung der Harze gemäss der deutschen Offenlegungschrift 1917 057 zu einer grosstechnischen Herstellung von 6-APS mit wesentlichen Nachteilen behaftet.
Im Gegensatz hiezu können in überraschender Weise gemäss der Erfindung Enzympräparate mit hohen spezifischen Aktivitäten hergestellt werden. So sind z. B. zur enzymatischen Spaltung von 129 g PenicillinG-Kalium nur 79 g feuchtes Enzymharz erforderlich. Als ,-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 4 bis 5 Kohlenstoffatomen die für die Herstellung der Copolymerisate benötigt werden, seien namentlich genannt : Maleinsäure-, Itaconsäure-oder Ci- traconaäureanhydrid, insbesondere Maleinsäureanhydrid. Für die Copolymerisation können auch Mischungen
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dieser Anhydride eingesetzt werden.
Die zu verwendenden Ester von Diolen und/oder Polyolen mit Acrylsäure oder Methacrylsäure leiten sich von Verbindungen mit mindestens 2 alkoholischen oderphenolischen, vorzugsweise alkoholischen OH-
Gruppen bzw. deren Umsetzungsprodukten mit Alkylenoxyden mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise
2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Gemischen dieser Alkylenoxyde ab, wobei an 1 Mol der Hydroxylgruppen tra- genden Verbindung 1 bis 104,bevorzugt 1 bis 10 Alkylenoxydbausteine anpolymorisiert sind.
Beispielhaft seien Alkylenoxyde, Äthylenoxyd, Propylenoxyd, Butylenoxyd, Trimethylenoxyd, Tetra- methylenoxyd, Bis-chlormethyl-oxacyclobutan, Styroloxyd, vorzugsweise Äthylenoxyd und Propylenoxyd ge- nannt.
Es ist auch durchaus möglich, Umsetzungsprodukte von Verbindungen mit mindestens 2 Zerewitinoff- aktiven Wasserstoffatomen, die sich nicht von Alkoholen oder Phenolen ableiten, mit den obengenannten Al- kylenoxyden zur Herstellung der Di-und/oder Poly- (Meth) Acrylate zu verwenden.
Die einzusetzenden Ester von Diolen und/oder Polyolen mit Acrylsäure oder Methacrylsäure werden nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Umsetzung der Di-und/oder Polyole mit (Meth) Acrylsäurechlorid in Gegenwart von in etwa äquimolaren Mengen, bezogen auf Säurechlorid, an tert. Aminen wie Tri- äthylamin, bei Temperaturen unter 200C, in Anwesenheit von Benzol gewonnen (vgl. deutsche Offenlegungs- schrift 1907666)..
Als Di-bzw. Polyole mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 12 Kohlenstoffatomen kommen z. B. in Frage : Äthylenglykol, Propandiol-1, 2, Propandiol-1, 3, Butandiole insbesondere Butan- diol-1, 4, Hexandiole, Dekandiole, Glycerin, Trimethylolpropan, Pentaerythrit, Sorbit, Sucrose und deren Umsetzungsprodukte mit Alkylenoxyden, wie vorstehend angegeben. Auch Poly-bis-chlormethyl-oxacyclo- butan oder Polystyroloxyd sind geeignet. Es können auch Gemische aus Di- und Polyolen eingesetzt werden.
Vorzugsweise werden Diacrylate bzw. Dimethacrylate von Diolen mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1 bis 10 Molen Alkylenoxyd mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat verwendet.
Besonders vorteilhaft sind die Dimethacrylate von Äthylenglykol, Diäthylenglykol, Triäthylenglykol, Tetraäthylenglykol oder höheren Polyalkylglykolen mit Molgewichten bis 500 oder deren Gemische.
Die dritte Gruppe der Copolymerisationskomponenten besteht aus einfach ungesättigten, hydrophilen Mo- nomeren. Als solche können alle polymerisierbaren, einfach ungesättigten Verbindungen, welche keine gegen Anhydridgruppen reaktiven funktionellen Gruppen besitzen und hydrophile Polymeren bilden, verwendet werden.
Die hydrophilen Monomeren besitzen vorzugsweise mindestens eine Carboxyl-, Aminocarbonyl-, Sulfooder Sulfamoyigruppe, wobei die Aminogruppen des Aminoearbonyl- oder Sulfamoylrestes gegebenenfalls durch Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder durch Alkoxymethyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen im Alkoxyrest substituiert sein können.
Beispielsweise seien Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäurehalbester mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen im Alkoholrest, N-Vinyllactame wie N-Vinylpyrrolidon, Methacrylamid, N-substituierte (Meth) Acrylamide wie N-Methyl-und N-Methoxymethyl- (meth)-acrylamid und N-Acryloyl-dimethyltaurin genannt.
Sie werden je nach der gewünschten Hydrophilie und Quellbarkeit der Copolymeren und der Länge der Polyalkylenoxydkette (n) des mehrwertigen (Meth)-acrylesters in Mengen von 5 bis 60 Gew.-% der Mono- merenmischung zugesetzt. Ausser der Hydrophilie beeinflusst der Zusatz dieser Monomeren überraschenderweise auch die Struktur der Polymeren, was bei der Herstellung von Perlpolymerisaten von ganz besonderem Vorteil ist, da hier die Auswahl der zur Monomerenmischung zufügbarenVerdünnungsmittel durch die Bedingungen der Unlöslichkeit in Paraffinkohlenwasserstoffen und der Inertheit gegenAnhydridgruppen stark einge- schränkt wird.
Auf Grund der Variationsbreite in der Zusammensetzung der Monomerenmischung können innerhalb eines sehr weiten Bereiches Hydrophilie, Vernetzungsdichte, Quellbarkeit und Anhydridgruppengehalt der Copolymerisate dem jeweiligen Verwendungszweck optimal angepasst werden.
Falls gewünscht, können neben den zu verwendenden Di-und/oder Poly- (Meth) Acrylaten auch üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel mit mindestens 2 nichtkonjugierten Doppelbindungen, etwa Divinyladi- pat, Methylenbisacrylamid, Triacrylformal oder Triallylcyanurat in Mengen von etwa 0, 01 bis 30 Gew.-% der Monomerenmischung zugesetzt werden.
Die Polymerisation kann z. B. in einem organischen Lösungsmittel als Fällungspolymerisation durchgeführt werden, wobei die Polymeren bereits kurz nach dem Einsetzen der Polymerisation auszufallen beginnen. An sich sind alle gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel geeignet. Besonders günstige Lösungsmittel sind aliphatische, cycloaliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, sowie halogensubsti- tuierte Kohlenwasserstoffe, Alkylaromaten und Carbonsäureester.
Beispielsweise seien genannt : Heptan, Octan, Isooctan, Benzinfraktionen mit Siedepunkten von etwa 60 bis 200 C, Cyclohexan, Benzol, Toluol, Xylole, Chlorbenzol, Dichlorbenzole, Äthylacetat, Butylacetat.
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Die Polymerisation wird bei Temperaturen von etwa 20 bis 2000C, vorzugsweise 50 bis 1000C in Ab- hängigkeit von der Zerfallsgeschwindigkeit der Initiatoren und meistens unterhalb des Siedepunktes der Lösungsmittel und bei Perlpolymerisationen unterhalb der Mischungstemperatur der beiden Phasen durchgeführt. Ausserdem ist es in der Regel vorteilhaft, in inerter Atmosphäre unter Abwesenheit von Sauerstoff zu polymerisieren.
Die durch Fällungspolymerisation erhaltenen Copolymerisate sind farblose bis schwach gelb gefärbte, pulverige Substanzen mit Schüttvolumina von 1, 5 bis 30 ml/g, vorzugsweise 2 bis 20 ml/g und spezifischen Oberflächen von 0, 1 bis 500 m2/g, bevorzugt 1 bis 400 m2/g. Der nach Verseifung der Anhydridgruppen titrimetrisch bestimmte Gehalt an Carboxylgruppen liegt bei 0, 01 bis 14 mÄquiv/g, vorzugsweise bei 0, 02 bis 11 mÄquiv/g.
Die Suspensionspolymerisate sind weisse oder schwach gefärbte Perlen, die in einigen Fällen unregelmässig geformt sein können und einen Durchmesser von 0, 03 bis 3 mm, vorzugsweise 0, 05 bis 0, 5 mm und
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Schüttvolumina von etwa 1, 4 bis 8 ml/g, vorzugsweise 1, 4 bis 5 ml/g, besitzen. Ihr nach der Hydrolyse der Anhydridgruppen bestimmter Carboxylgruppengehalt beträgt 0, 01 bis 14 mAquiv/g, vorzugsweise 0, 02 bis
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Grund ihrer hohen Vernetzungsdichte sind die Copolymerisate in allen Lösungsmitteln unlöslich. Molekular- gewichte sind daher nicht bestimmbar.
Die Copolymerisate können in Wasser auf das 1, l-bis Sfache ihres Schüttvolumen quellen. Sie eignen sich vorzüglich als Trägerharze zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymeri- sate reagieren können. Ausserdem besitzen sie eine ausgezeichnete mechanische Stabilität und damit prak- tisch keinen Abrieb.
Die oben beschriebenen Trägerharze binden alle Substanzen, die eine funktionelle Gruppe tragen, die be- fähigt ist, mit der Anhydridgruppe des Polymeren zu reagieren. Bei den Proteinen und Peptiden sind dies vor allem die endständigen Aminogruppen des Lysins und die freien Aminogruppen der Peptidkettenenden. Man geht hiebei so vor, dass man zu einer gerührten wässerigen Lösung des Proteins bei einer Temperatur zwi- schen 0 und 300C die benötigte Polymerenmenge zugibt.
Das Gewichtsverhältnis von Protein zu Trägerharz kann in weiten Grenzen variiert und dem späteren Verwendungszweck angepasst werden. Gute Ausbeuten erhält man bei einem Verhältnis von 1 Gew.-Teil Protein zu 4 bis 10 Gew.-Teilen polymerem Träger. Die optimalen Verhältnisse sind jedoch sowohl von der Zusammensetzung und der Struktur des Polymeren als auch von der Art des Proteins abhängig.
Bei zahlreichen Enzymen ist es auch zweckmässig, Stabilisatoren zuzusetzen. Als solche kommen Poly- äthylenglykole oder nichtionische Netzmittel zur Abschwächung von Denaturierung an Oberflächen in Frage, sowie die bekannten SH-Reagentien oder Metallionen bei speziellen Enzymen. Das pH wird zweckmässig mit einem PH-Staten auf dem für die betreffende Bindung optimalen pH-Wert gehalten. Dieser pH-Wert liegt in einem Bereich von 2 bis 9, vorzugsweise 5 bis 7.
Beim Einsatz von Penicillinacylase hat es sich als zweckmässig erwiesen, zwischen PH 5, 7 und 6, 8 zu arbeiten. Dabei müssen zur Konstanthaltung des pH-Wertes anorganische Basen (z. B. Alkalilaugen) oder organische Basen (z. B. tert. organ. Amine) zugesetzt werden. Der Fortschritt der Reaktion Ist am Verbrauch der zur pH-Konstanthaltung nötigen Menge an Base ersichtlich.
Bei Raumtemperatur werden bis zur Beendigung der Reaktion etwa 16 h, bei 40C bis zu 40 h benötigt. Das Harz wird hierauf abgesaugt und zur Ablösung eines kleinen Anteiles an ionogen gebundenem Protein mit Puffern bzw. Salzen im Konzentrationsbereich von 0, 2 bis 1 M gewaschen.
Die gebundene Substanz wird entweder durch Elementaranalyse oder bei Enzymen oder Inhibitoren durch die enzymatische Aktivität bzw. die Hemmung der enzymatischen Aktivität bestimmt. Die Ausbeuten an gebundener Substanz sind von der Art der Substanz und der Zusammensetzung des Polymeren abhängig. So wurden z. B. Aminosäuren und niedermolekulare Peptide praktisch vollständig angekoppelt ; aber auch bei den Proteinen liegen die Ausbeuten an gebundener enzymatischer Aktivität bei 20 bis Uber 90% der eingesetzten Aktivität.
Nach dem Stand der Technik (deutsche Offenlegungsschrift 1935 711 und 2 008 990) wird die Ankoppelung der Proteine in Pufferlösungen in Konzentrationen von 0, 05 bis 0, 2 M vorgenommen. Arbeitet man ohne Puffer, so steigt der Anteil des ionogen gebundenen Proteins (deutsche Offenlegungsschrift 1935711). Überra- schenderweise zeigte sich, dass bei den erfindungsgemäss verwendeten Harzen die Koppelung in möglichst ionenfreiemMedium maximale Ausbeuten an covalent gebundenem Enzym ergibt. Das PH kann bei dieser Arbeitsweise durch einen pH-Staten sehr genau auf dem optimalen Wert konstant gehalten werden.
Die Anwendung von Enzymharzenist technisch von besonderer Bedeutung, da mit ihrer Hilfe technisch wertvolle Produkte hergestellt werden können. Die vorherige Bindung der biologischen Katalysatoren nach dem vorliegenden Verfahren gestattet durch ganz einfache Separationsprozesse ihre vollständige Abtrennung aus der Reaktionsmischung und ermöglicht die, aus wirtschaftlichen Gründen entscheidende, vielfache Wiederverwendung. Darüber hinaus wird in den meisten Fällen die Stabilität der empfindlichen und teuren Proteine entscheidend verbessert.
Im folgenden werden einige Beispiele der Anwendung von trägergebundenen Substanzen angegeben.
Die Gruppe der Proteasen, wie Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Elastase kann z. B. zur Herstellung von Proteinhydrolysaten für mikrobiologische Prozesse verwendet werden. Ausserdem können die Enzyme auch zur Entfernung von antigenen Proteinen aus pharmazeutischen Wirkstoffen dienen.
Acylasen werden technisch zur Herstellung von 6-Aminopenicillansä. ure aus Penicillinen oder zur Trennung von Racematen acylierte Aminosäuren verwendet. Trägergebunden Amylase kann zum hydrolytischen Abbau von Starke verwendet werden.
Spezielle Hydrolasen, wie Asparaginase oder Urease können in gebundener Form im extrakorporalen Kreislauf therapeutisch eingesetzt werden.
Diese und zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten sind in der Literatur beschrieben worden, Sie-
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linen aus 6-APS ausgenutzt werden.
Die Reaktionstemperatur der enzymatischen Spaltung beträgt vorzugsweise 380C. Bei niedrigeren Tem- peraturen nimmt die Aktivität des Enzyms ab. Wird die Spaltung z. B. bei 250C durchgeführt, muss doppelt soviel Enzym wie bei 380C eingesetzt werden, wenn gleiche Reaktionszeiten erzielt werden sollen.
Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt bei gegebener Temperatur von der spezifischen Aktivität und der
Menge der trägergebundenen Penicillinacylase ab. Ausserdem ist die Reaktionsgeschwindigkeit abhängig von dem Verhältnis der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase zur Konzentration des Penicillins. Ein
Spaltungsansatz mit einer Konzentration von 100000 IU Im ! Penicillin G-Kalium ist nach 10 h bei PH 7, 8 und
380C vollständig zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolysiert, wenn pro Einheit Penicillinacylase 3. 105
Einheiten Penicillin G eingesetzt werden [eine Enzymeinheit (U) ist definiert als die Aktivität, die 1 p. Mol 6-Nitro-3 (phenylacetyl) -amino-benzoesäure (NIPAB) pro Minute bei 250C hydrolysiert].
Der Anteil an trockenem Enzymharz beträgt nur 0, 5 bis 1% des Reaktionsgemisches. Werden pro 105 IU
Penicillin G 2 Einheiten Penicillinacylase eingesetzt, so dauert die vollständige Spaltung nur 2 h. Es sind auch noch kürzere Reaktionszeiten bei Einsatz von noch mehr gebundener Pencillinacylase, bei Verwendung z. B. von trägergebundener Penicillinacylase aus kristallisiertem Enzym, möglich.
Die trägergebundene Penicillinacylase kann perlförmig hergestellt werden und zeichnet sich durch eine hohe mechanische Stabilität und ein vergleichsweise hohes spez. Gewicht aus. Diese Eigenschaften ermöglichen bei vielfachen Einsatz eine Verwendung über lange Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen ferner bei Batch-Prozessen eine intensive Rührung und eine einfache Abtrennung durch Zentrifugierenohne Verlust durch mechanische Beanspruchung z. B. durch Abrieb. Somit werden in Batch-Prozessen klare Filtrate erhalten, die ohne zusätzliche Filtration zur Gewinnung des Endproduktes, der 6-APS, weiterverarbeitet werden können.
Die trägergebundene Penicillinacylase erlaubt ebenso eine schnelle und einfache Filtration, da durch die mechanische Stabilität keine die Filterfläche verstopfenden Feinstanteile entstehen. Weitere Vorteile bietet das Harz im Batch-Prozess wegen des vergleichsweise hohen spez. Gewichtes, das ein schnelles Absetzen des Harzes bedingt, so dass nach Beendigung des Prozesses die überstehende Lösung leicht abgehebert werden kann. Daraus ergibt sich eine Vereinfachung der Verfahrensführung, da das Harz beim Batch-Prozess im Reaktionsgefäss verbleiben und direkt für die nächste Spaltung verwendet werden kann.
Die Eigenschaften des Polymerisates ermöglichen ferner die Verwendung der trägergebundenen Penicillinacylase nicht nur in Batch-Prozessen, sondern auch in kontinuierlichen Verfahren z. B. in Reaktionssäulen, wobei die Perlform die erforderliche, hohe Durchflussgeschwindigkeit erlaubt.
Die bei der enzymatischen Spaltung gebildete 6-APS wird nachAbtrennung des Enzymharzes aus der Reaktionslösung nach bekannten Verfahren gewonnen (s. z. B. deutsche Patentschrift Nr. 1111778) und bei pH 4, 3 kristallisiert. Bei der Spaltung von Penicillin mit der trägergebundenen Penicillinacylase werden wesentlich höhere Ausbeuten an 6-APS erhalten, als bei Verwendung von E. coli-Schlamm aber auch höhere Ausbeuten, als bei der Verwendung eines Enzymharzes aus Penicillinacylase gebunden an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, N, N'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäureanhydrid. So wurde, wie in den Beispielen 8 und 9 gezeigt wird, 6-APS in einer Ausbeute von etwa 90% d. Th. isoliert.
Die so hergestellte 6-APS enthält keine Proteine als Verunreinigung. Die so hergestellte 6-APS enthält auch praktisch keine Polymeren, die bei andern Verfahrensweisen entstehen können. Allergene Nebenwirkungen, die auf Proteine oder Polymeren zurückgeführt werden, sind bei der erfindungsgemäss hergestellten 6-APS ausgeschlossen.
Die trägergebundene Penicillinacylase gestattet einen vielfachen Einsatz über einen langen Zeitraum.
Auch hienach ist die Enzymaktivität noch praktisch vollständig erhalten.
Die Siedepunkte in den Beispielen wurden bei Normaldruck bestimmt.
Bei s pie 1 1 a) : 70 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 1 1 Benzol gelöst und zunächst 4 h bei 600C polymerisiert. Dann gibt man 1 g Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Benzin (Kp. 100 bis 1400C) zu und polymerisiert 2 h bei 70 C und 2 h bei 800C.
Das pulverige Polymere wird gründlich mit Petroläther (Kp. 30 bis 500C) gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 96 g Schüttvolumen : 8, 8 ml/g
Quellvolumen in Wasser : 12, 4 ml/g spez. Oberfläche : 8, 6 m2/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 3, 85 m Äquiv/g Bei s pie 1 1 b) : 6 g des nach Beispiel la) hergestellten Trägerharzes werden in einer Lösung von 610 UPenicillinacylase in 150 ml Wasser suspendiert. Durch Zugabe von 1 N-NaOH mit einem pli-Staten wird
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der pH-Wert auf 6, 3 gehalten und die Suspension 20 h bei 250C gerührt.
Dann saugt man über eine Glasfritte G 3 ab und wäscht mit je 300 ml 0, 05 M-Phosphatpuffer pH 7, 5, der 1 M-Natriumchlorid enthält, und mit demselben Puffer ohne Natriumchlorid. Durch weiteres Waschen kann keine Aktivität mehr eluiert werden. Überstand und Waschlösungen werden vereinigt und ihre enzymatische Aktivität bestimmt, m einer aliquoten Menge wird die enzymatisohe Aktivität des feuchten Harzes gemes- sen.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung 610 U Überstand + Waschlösungen 112 U
Trägerharz nach der Umsetzung 561 U d. s. 92% der Ausgangsaktivität
Die enzymatische Aktivität derPenicillinacylase wird colorimetrisch oder titrimetrisch mit 0, 002 M-6Nitro-3-(N-phenylacetyl)-aminobenzoesäure (NIPAB) als Substrat bei PH 7, 5 und 250C gemessen. Der mo-
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heit (U) entspricht dem Umsatz von 1 Mol Substrat pro Minute.
Beispiel lc) : In einer Lösung von 40ml Urease in 32 ml Wasser werden 400 mg nach Bei- spiel 1a) hergestellten Trägerharzes suspendiert. Bei ständigem Rühren bei Raumtemperatur wird der pH-Wert durch Zugabe von lN-Natronlauge auf PH 6,0 konstant gehalten. Nach 16 h ist die Reaktion been- det, das Harz wird abgesaugt und wie in Beispiel lb) mit Puffer gewaschen.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität
Ausgangslösung 168 U Überstand + Waschlösungen 64,5 U
Trägerharz nach der Umsetzung 87 U d. s. 52% der Ausgangsaktivität
Die enzymatische Aktivität der Urease wird titrimetrisch mit 0, 17 M-Harnstoff als Substrat, bei 250C und pH 6, 1 bestimmt. 1 Einheit (U) entspricht der Enzymmenge, die 1 Mol Harnstoff d. h. 2 juMol Salzsäure pro Minute verbraucht.
Beispiel Id) : In einer Lösung von 100 mg Trypsin in 32 ml 0,02M-Calciumchlorid werden 500mg des nach Beispiel la) hergestellten Trägerharzes suspendiert. Unter ständigem Rühren bei 40C wird der pH-Wert durch Zugabe von IN-Natronlauge auf PH 6,3 konstant gehalten. Nach 16 h wird das Harz abgesaugt und wie in Beispiel lb) mit Puffer gewaschen.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität
Ausgangslösung 110 U Überstand + Waschlösungen 15,6 U
Trägerharz nach der Umsetzung 64 U d. s. 58% der Ausgangsaktivität
Die enzymatische Aktivität wurde colorimetrisch nach Tuppy, Z. Physiol. Chem. 329 [1962], S. 278, mit Benzol-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) als Substrat gemessen. 1 Einheit (U) entspricht der Spaltung von 1 J. L Mol SUbstrat pro Minute bei 250C und pH 7, 8.
Beispiel 2a): Eine Lösung von 80g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 10g Methaorylsäure, 10g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 11 Benzol wird unter langsamem Rühren 4 h bei 600C, 2 h bei 70 C und 1 h bei 800C polymerisiert. Das Polymere wird abfiltriert, dreimal in Benzol ausgerührt, mit Petroläther gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 70 g
Schüttvolumen : 7,0 ml/g
Quellvolumen in Wasser : 8, 2 ml/g spez. Oberfläche : 5, 3m2/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 2,55 mÄquiv/g
Beispiel 2b) : 1 g des nach Beispiel 2a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel lb) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei PH 6,3 umgesetzt.
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Ergebnis :
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung 118 U Überstand + Waschlösungen 21 U
Trägerharz nach der Umsetzung 82 U d. s. 69% der Ausgangsaktivität
Beispiel 3a):60g Tetraäthylenglykoldimethacrylat,30g Methacrylaäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1g Azoisobuttersäurenitril werden in 200 ml Acetonitril gelöst, Diese Lösung wird in 11 Benzin (Kp. 100 bis 1400C), welches 5 g eines Gemisches von Glycerinmono-und-dioleat enthält, suspendiert und 22 h bei 600C polymerisiert.
Die Polymerperlen werden abfiltriert, dreimal in Benzol und anschliessend zweimal in Petroläther (Kp. 30 bis 500C) suspendiert und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 94 g weisse Kugeln Schüttvolumen : 4, 4 ml/g Quellvolumen in Wasser : 5, 5 ml/g spez. Oberfläche : 6, 6 m2/g mittlerer Partikeldurchmesser :#200
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 4, 3 mXquiv/g Beispiel 3b): 1 g des nach Beispiel 3a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel1b) mit
Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei PH 6, 3 umgesetzt.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)
Ausgangslösung 118 U Überstand + Waschlösungen 43 U
Trägerharz nach der Umsetzung 96 U d. s. 81% der Ausgangsaktivität
Beispiel4a):EineLösungvon2100gTetraäthylenglykoldimethacrylat,600gMethacrylaäure,300g Maleinsäureanhydrid und 30 g Azoisobuttersäurenitril in 7,5 1 Acetonitril wird in 211 Benzin (Kp. 100 bis 1400C), in dem 150 g eines Gemisches von Glycerinmomo-und-dioleat gelöst wurden, suspendiert und 1 h bei 50 C und 20 h bei 600C polymerisiert.
Das Perlpolymerisat wird abgesaugt, zweimal mit Toluolund einmal mit Petroläther (Kp. 30 bis 500C) ausgerührt und bei 600C getrocknet.
Ausbeute : 2, 95 kg Schüttvolumen : 4,7 ml/g
Quellvolumen in Wasser : 5, 4 ml/g mittlerer Partikeldurchmesser : zirka 0, 3 mm
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 4, 0 mÄquiv/g Beispiel 4b) : Ig des nach Beispiel 4a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel lb) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6, 3 umgesetzt.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test) in der Ausgangslösung 107 U Überstand und Waschlösungen 27 U
Trägerharz nach der Umsetzung 67 U d. s. 63% der Ausgangsaktivität Bei s pie 1 4 c) : 20 g des nach Beispiel 4a) hergestellten Polymeren werden bei Raumtemperatur in 600ml einer Lösung von 1, 0 gunspezifischer Elastase aus Schweinepankreas unter Rühren eingetragen. Das PH wird hiebei auf 5, 8 konstant gehalten. Nach einer Reaktionszeit von 16 h wird das Harz abgesaugt und in der in Beispiel lb) beschriebenen Weise aufgearbeitet.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität (Casein-Test)
Ausgangslösung 2180 E Überstand + Waschlösungen 992 E
Trägerharz nach der Umsetzung 1225 E d. s. 56% der Ausgangsaktivität
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Die enzymatische Aktivität der unspezifischen Elastase wird titrimetrisch mit Casein als Substrat (Konzentration 11,9 mg/ml) bei pH 8,0 und 250C bestimmt. 1 Einheit (U) entspricht einem Verbrauch von 1 J. lMol Kalilauge pro Minute.
Beispiel 5a): Eine Lösung von 80g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 10g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 300 ml Acetonitril wird analog zu Beispiel 3a) polymerisiert.
Ausbeute : 92 g weisse, eiförmige Partikel Schüttvolumen : 2, 5 ml/g
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spez. Oberfläche : 1, 7 m2/g mittlerer Partikeldurchmesser : 125 J. l
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 3, 5 mÄquiv/g
Beispiel 5b): 1 g des nach Beispiel 5a) bergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel 1b) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)
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Überstand + Waschlösungen 34 U Trägerharz nach der Umsetzung 61 U d. s. 52% der Ausgangsaktivität
EMI9.3
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6a) : Eine Lösung von 50 g Athylenglykoldimethacrylat, 40gMethacrylaäure, lOgMalein-Beispiel 7c : Ig des nach Beispiel 7b) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel lb) mit Penicillinacylase in 32 ml Wasser bei PH 6, 3 umgesetzt.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)
EMI10.1
Überstand + Waschlösung 26 U
Trägerharz nach der Umsetzung 38 U d. s. 36% der Ausgangsaktivität
Beispiel8a):EineLösungvon50gTetraäthylenglykoldimethaorylat,40gN-Vinylpyrrolidon10g Maleinsäureanhydrid und 1 g Dicyclohexylpercarbonat in 200 ml Acetonitril wird in 11 Benzin (Kp. 100 bis 1400C), welches 5 g eines Gemisches von Glycerinmono-und-dioleaten enthält, suspendiertund unter Rühren zunächst 18 h auf 500C erwärmt. Dann gibt man 1 g des Initiators nach und rührt weitere 8 h bei 600C. Die Polymerlmgeln werden mit Benzol und Petroläther gründlich gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 54 g klare Perlen Schüttvolumen : l, 6 ml/g
EMI10.2
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 3, 3 m.. quiv/g
Gehalt an Stickstoff-3, 4% A 27% N-Vinylpyrrolidon.
Beispiel8b):1gdesnachBeispiel8a)hergestelltenPolymerenweidanalogzuBeispiel1b)mitPenicillinacylase in 33 ml Wasser bei PH 6, 3 umgesetzt.
EMI10.3
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:Ergebnis : Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test) Ausgangslösung 107 U Überstand + Waschlösungen 49 U Trägerharz nach der Umsetzung 25 U d. s. 23% der Ausgangsaktivität
EMI11.2
lla) : Setzt man imAnsatz von 10a) statt N-Methoxymethyl-acrylamid 30 g N-Methoxyme-thylmethacrylamid ein, so erhält man folgendes Ergebnis :
Ausbeute : 94 g Schüttvolumen : 2, 4 ml/g
EMI11.3
in Wasser : 3, 9 ml/gErgebnis :
Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)
EMI11.4
Überstand + Waschlösungen 60 U
Trägerharz nach der Umsetzung 24 U d. s. 22% der Ausgangsaktivität Beispiel 12 : 76, 1 kg (Feuchtgewicht) trägergebundener Penioillinaoylase dargestollt gemässBeispiel 4b) mit einer Aktivität von 737000 U (NIPAB-Test) und 125 kg Penicillin G-Kalium (Reinheit 98%) werden nacheinander zu 2000l Wasser gegeben und bei 380C gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsansatzes wird durch laufende Zugabe von Triäthylamin konstant bei 7, 8 gehalten. Nach 8 h wird kein Triäthylamin mehr aufgenommen. Die trägergebundene Penicillinacylase wird abzentrifugiert, mit jeweils 60 1 Wasser und 801 0, 2 M Phosphatpuffer, PH 6, 5, nachgewaschen und für weitere Spaltungsansätze erneut eingesetzt.
Das Filtrat einschliesslich Waschwasser wird im Vakuum auf 300 l eingeengt. Die 6-APS wird durch Zugabe von halbkonzentrierter Salzsäure am isoelektrischen Punkt bei pH 4, 3 in Gegenwart von 200 l Methylisobutylketon ausgefällt. Nach 1 h wird abfiltriert, mit 200 1 Wasser und dann mit 200 1 Aceton nachgewa-
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Reinheit 98%.
Die trägergebundene Penicillinacylase wurde nacheinander zu insgesamt 30 Ansätzen eingesetzt. Auch nach 30 Spaltungen ist die trägergebundene Penicillinacylase nicht verbraucht. Die Reaktionszeit verändert sich nicht. Aufgearbeitet wurde wie vorstehend beschrieben. Die erzielten 6-APS-Ausbeuten sind nachstehend zusammengestellt :
1. Spaltung 91, 9% d. Th.
2. Spaltung 91, 4% d. Th.
3. Spaltung 91, 6% d. Th.
4. Spaltung 91, 0% d. Th.
5. Spaltung 91, 2% d. Th.
6. Spaltung 90, 3% d. Th.
7. Spaltung 91, 5% d. Th.
8. Spaltung 90, 9% d. Th.
9. Spaltung 91, 9% d. Th.
10. Spaltung 90, 7% d. Th.
11. Spaltung 91, 2% d. Th.
12. Spaltung 90, 1% d. Th.
13. Spaltung 90, 9% d. Th.
14. Spaltung 90, 7% d. Th.
15. Spaltung 91, 0% d. Th.
16. Spaltung 90, 2% d. Th.
17. Spaltung 90, 3% d. Th.
18. Spaltung 89, 9% d. Th.
19. Spaltung 89, 8% d. Th.
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1%Vergleichsbeispiel : (Beispiel 3 der deutschen Offenlegungsschrift 1917057):
10 g Äthylen-Maleinsäureanhydrid wurden in 1250 ml 0,05 M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7, 6 gerührt. Dann wurden 100 ml 1%ige Hydrazinhydratlösung zugesetzt und 2 min danach 17,4 ml einer Lösung mit 1150 EinheitenPenicillinacylase (NIPAB-Test, Einheitendefinition wie vorher angegeben). Der Proteingehalt der Enzymlösung betrug 20 mg/ml. Die Mischung wurde 2 h in einem Eisbad gerührt und über Nacht im Kühlraum bei 50C gehalten. Das Präparat war gelartig und konnte nur durch Zentrifugieren abgetrennt werden.
Nach dem Auswaschen mit jeweils 250 ml 1M NaCl, 0, 5M NaH CO, 1M NaCl und Wasser wurden 160 g einer gelartigen Substanz erhalten. Die enzymatische Aktivität betrug 0,06 Einheiten/g, das sind nur 0, 83% der eingesetzten Enzymaktivität.
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The invention relates to the use of a water-insoluble protein preparation, in particular an enzyme preparation, the protein being bound to a crosslinked copolymer made up of copolymerized units of
A 0.1 -50% by weight of o;, ß-monoolefinically unsaturated dicarboxylic acid anhydrides with 4 to 9 carbon atoms
B 35-90% by weight of esters of diols and / or polyols with acrylic acid or methacrylic acid and
C 5 - 60 wt.
-% of at least one hydrophilic monomer with at least one carboxyl, aminocarbonyl, sulfo or sulfonyl group - the sum of the percentages A to C being 100 - and the crosslinked copolymers bulk volumes from 2 to 20 ml / g and specific surfaces from 1 to 400 m? / G and, after the saponification of the anhydride groups, contain 0.02 to 11 milliequivalents of acid per gram, for carrying out a reaction that can be catalyzed by proteins, such as. B. the hydrolytic cleavage of substrates, especially for the cleavage of penicillins with the formation of 6-aminopenicillanic acid.
The covalent binding of substances to insoluble polymeric carriers has become increasingly important in recent years. The fixation of catalytically active compounds such. B. enzymes, as they can be easily separated in this form after the reaction has ended and reused several times.
Copolymers of maleic anhydride and vinyl compounds have already been proposed several times as carriers with reactive groups. Copolymers of maleic anhydride with ethylene and monovinyl compounds, however, are more or less soluble in water when reacted with aqueous enzyme solutions, so that an additional crosslinker z. B. a diamine is added. Enzyme preparations obtained in this way are relatively difficult to filter and have soluble fractions, which leads to losses of bound enzyme (cf. E. Katchalski, Biochemistry 3 [1964], pp. 1905 to 1919).
In addition, copolymers of acrylamide and maleic acid have been described which are converted into the anhydride form by subsequent heating. These products are relatively weakly crosslinked, swell very strongly in water and have only moderate mechanical stability, which leads to abrasion losses when these resins are used (cf. German Offenlegungsschrift 1 908 290).
In addition, highly crosslinked carrier polymers were produced by copolymerizing maleic anhydride with divinyl ethers. Due to the alternating type of copolymerization of the monomers, these polymers contain a very high proportion of anhydride groups - in each of the examples above 50% by weight maleic anhydride - which is determined by the molecular weight of the vinyl ether monomer and is therefore only adapted to the respective application within relatively narrow limits can be (see German Offenlegungsschrift 2 008 990).
German Offenlegungsschrift 1 917 057 describes very different carrier materials to which the enzyme penicillin acylase can be bound. Among other things, ethylene maleic anhydride polymer resins, acrylic acid resins and also polysaccharides are given as possible carriers. Of these, the ethylene maleic anhydride polymer resins (EMA) are most comparable to the resins according to the invention. When example 3 of this laid-open specification was reworked, as the comparative example shows, a gel-like enzyme preparation was contained which, after the cleavage of penicillins to 6-aminopenicillanic acid, can only be separated off by centrifugation.
Preparations with such a gel structure are, however, not well suited for economic utilization in large-scale industrial processes. In contrast, the insoluble enzyme preparations used according to the invention, which are powdery substances, e.g. B. be separated by a simple filtration or even simply by sedimentation. This makes the production process very simple and very inexpensive in terms of cost.
When reworking, only a very poor yield of insoluble enzyme could be achieved.
Only 9.6 units of insoluble enzyme were found in 160 ml of gel. Such a low specific activity enables enzymatic hydrolysis of only about 3 g of penicillin G-potassium within a reaction time of 9 h. Accordingly, the use of the resins according to German Offenlegungsschrift 1917 057 for the large-scale production of 6-APS has significant disadvantages.
In contrast to this, enzyme preparations with high specific activities can surprisingly be produced according to the invention. So are z. B. for the enzymatic cleavage of 129 g penicillin G potassium only 79 g moist enzyme resin is required. As monoolefinically unsaturated dicarboxylic acid anhydrides with 4 to 9 carbon atoms, preferably 4 to 5 carbon atoms, which are required for the preparation of the copolymers, the following may be mentioned: maleic acid, itaconic acid or citraconic anhydride, in particular maleic anhydride. Mixtures can also be used for the copolymerization
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these anhydrides are used.
The esters to be used of diols and / or polyols with acrylic acid or methacrylic acid are derived from compounds with at least 2 alcoholic or phenolic, preferably alcoholic OH-
Groups or their reaction products with alkylene oxides having 2 to 8 carbon atoms, preferably
2 to 4 carbon atoms or mixtures of these alkylene oxides, 1 to 104, preferably 1 to 10, alkylene oxide units being polymerized onto 1 mol of the compound bearing hydroxyl groups.
Examples are alkylene oxides, ethylene oxide, propylene oxide, butylene oxide, trimethylene oxide, tetra-methylene oxide, bis-chloromethyl-oxacyclobutane, styrene oxide, preferably ethylene oxide and propylene oxide.
It is also entirely possible to use reaction products of compounds having at least 2 Zerewitinoff-active hydrogen atoms, which are not derived from alcohols or phenols, with the abovementioned alkylene oxides to prepare the di- and / or poly (meth) acrylates.
The esters of diols and / or polyols with acrylic acid or methacrylic acid to be used are prepared by known methods, for example by reacting the diols and / or polyols with (meth) acrylic acid chloride in the presence of approximately equimolar amounts, based on acid chloride, of tert. Amines such as triethylamine, obtained at temperatures below 200C, in the presence of benzene (cf. German Offenlegungsschrift 1907666).
As Di or. Polyols with at least 2 carbon atoms, preferably 2 to 12 carbon atoms, come, for. B. in question: ethylene glycol, propanediol-1, 2, propanediol-1, 3, butanediols, in particular butanediol-1,4, hexanediols, decanediols, glycerol, trimethylolpropane, pentaerythritol, sorbitol, sucrose and their reaction products with alkylene oxides, as above specified. Poly-bis-chloromethyl-oxacyclo-butane or polystyrene oxide are also suitable. Mixtures of diols and polyols can also be used.
Diacrylates or dimethacrylates of diols with 2 to 4 carbon atoms and / or reaction products of one mole of these diols with 1 to 10 moles of alkylene oxide with 2 to 4 carbon atoms or trimethylolpropane trimethacrylate are preferably used.
The dimethacrylates of ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, tetraethylene glycol or higher polyalkylglycols with molecular weights of up to 500 or mixtures thereof are particularly advantageous.
The third group of copolymerization components consists of monounsaturated, hydrophilic monomers. As such, it is possible to use all polymerizable, monounsaturated compounds which have no functional groups which are reactive towards anhydride groups and which form hydrophilic polymers.
The hydrophilic monomers preferably have at least one carboxyl, aminocarbonyl, sulfo or sulfamoyl group, where the amino groups of the amino carbonyl or sulfamoyl radical can optionally be substituted by alkyl groups with 1 to 4 carbon atoms or by alkoxymethyl with 1 to 4 carbon atoms in the alkoxy radical.
Examples include acrylic acid, methacrylic acid, maleic acid half esters with 1 to 8 carbon atoms in the alcohol residue, N-vinyl lactams such as N-vinylpyrrolidone, methacrylamide, N-substituted (meth) acrylamides such as N-methyl- and N-methoxymethyl- (meth) acrylamide and N- Called acryloyl-dimethyltaurine.
Depending on the desired hydrophilicity and swellability of the copolymers and the length of the polyalkylene oxide chain (s) of the polyvalent (meth) acrylic ester, they are added to the monomer mixture in amounts of 5 to 60% by weight. In addition to the hydrophilicity, the addition of these monomers surprisingly also influences the structure of the polymers, which is of particular advantage in the preparation of bead polymers, since the choice of diluents that can be added to the monomer mixture is greatly restricted by the conditions of insolubility in paraffinic hydrocarbons and the inertness to anhydride groups becomes.
Due to the breadth of variation in the composition of the monomer mixture, the hydrophilicity, crosslinking density, swellability and anhydride group content of the copolymers can be optimally adapted to the particular intended use within a very wide range.
If desired, in addition to the di- and / or poly (meth) acrylates to be used, commonly used crosslinking agents with at least 2 nonconjugated double bonds, such as divinyl adipate, methylenebisacrylamide, triacryl formal or triallyl cyanurate, in amounts of about 0.01 to 30 wt. -% of the monomer mixture are added.
The polymerization can e.g. B. be carried out as precipitation polymerization in an organic solvent, the polymers beginning to precipitate shortly after the start of the polymerization. All solvents which are inert towards anhydride groups are suitable per se. Particularly favorable solvents are aliphatic, cycloaliphatic and aromatic hydrocarbons, as well as halogen-substituted hydrocarbons, alkyl aromatics and carboxylic acid esters.
Examples include: heptane, octane, isooctane, gasoline fractions with boiling points of about 60 to 200 ° C., cyclohexane, benzene, toluene, xylenes, chlorobenzene, dichlorobenzenes, ethyl acetate, butyl acetate.
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The polymerization is carried out at temperatures from about 20 to 2000C, preferably 50 to 1000C, depending on the rate of decomposition of the initiators and mostly below the boiling point of the solvent and, in the case of bead polymerizations, below the mixing temperature of the two phases. In addition, it is usually advantageous to polymerize in an inert atmosphere in the absence of oxygen.
The copolymers obtained by precipitation polymerization are colorless to pale yellow, powdery substances with bulk volumes of 1.5 to 30 ml / g, preferably 2 to 20 ml / g and specific surface areas of 0.1 to 500 m2 / g, preferably 1 to 400 m2 / g. The content of carboxyl groups, determined titrimetrically after saponification of the anhydride groups, is from 0.01 to 14 meq / g, preferably from 0.02 to 11 meq / g.
The suspension polymers are white or pale colored pearls, which in some cases may be irregularly shaped and have a diameter of 0.03 to 3 mm, preferably 0.05 to 0.5 mm and
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Bulk volumes of about 1.4 to 8 ml / g, preferably 1.4 to 5 ml / g. Their carboxyl group content, determined after the hydrolysis of the anhydride groups, is from 0.01 to 14 meq / g, preferably from 0.02 to
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Because of their high crosslinking density, the copolymers are insoluble in all solvents. Molecular weights cannot therefore be determined.
The copolymers can swell in water to 1.1 to 5 times their bulk volume. They are particularly suitable as carrier resins for fixing substances that can react with the anhydride groups of the copolymers. They also have excellent mechanical stability and therefore practically no abrasion.
The carrier resins described above bind all substances that carry a functional group that is capable of reacting with the anhydride group of the polymer. In the case of proteins and peptides, these are mainly the terminal amino groups of the lysine and the free amino groups of the peptide chain ends. The procedure here is to add the required amount of polymer to a stirred aqueous solution of the protein at a temperature between 0 and 30 ° C.
The weight ratio of protein to carrier resin can be varied within wide limits and adapted to the later application. Good yields are obtained at a ratio of 1 part by weight of protein to 4 to 10 parts by weight of polymeric carrier. However, the optimum ratios depend both on the composition and structure of the polymer and on the type of protein.
In the case of numerous enzymes, it is also advisable to add stabilizers. As such, polyethylene glycols or nonionic wetting agents can be used to reduce denaturation on surfaces, as well as the known SH reagents or metal ions for special enzymes. The pH is expediently kept at the optimum pH value for the bond in question with a pH stat. This pH is in the range from 2 to 9, preferably from 5 to 7.
When using penicillin acylase, it has proven to be useful to work between PH 5, 7 and 6, 8. To keep the pH constant, inorganic bases (e.g. alkaline solutions) or organic bases (e.g. tertiary organic amines) must be added. The progress of the reaction can be seen from the consumption of the amount of base necessary to keep the pH constant.
At room temperature, it takes about 16 hours to complete the reaction, and up to 40 hours at 40C. The resin is then suctioned off and washed with buffers or salts in the concentration range from 0.2 to 1M to detach a small portion of ionically bound protein.
The bound substance is determined either by elemental analysis or, in the case of enzymes or inhibitors, by the enzymatic activity or the inhibition of the enzymatic activity. The yields of bound substance depend on the type of substance and the composition of the polymer. So were z. B. amino acids and low molecular weight peptides are almost completely coupled; but also in the case of proteins, the yields of bound enzymatic activity are 20 to over 90% of the activity used.
According to the state of the art (German Offenlegungsschrift 1935 711 and 2 008 990), the proteins are coupled in buffer solutions in concentrations of 0.05 to 0.2 M. If you work without a buffer, the proportion of ionically bound protein increases (German Offenlegungsschrift 1935711). Surprisingly, it was found that in the case of the resins used according to the invention, the coupling in a medium that is as ion-free as possible gives maximum yields of covalently bound enzyme. With this method of operation, the pH can be kept constant very precisely at the optimum value by means of a pH stat.
The use of enzyme resins is of particular technical importance, since with their help technically valuable products can be produced. The prior binding of the biological catalysts according to the present process allows their complete separation from the reaction mixture through very simple separation processes and enables them to be reused multiple times, which is crucial for economic reasons. In addition, in most cases the stability of the sensitive and expensive proteins is significantly improved.
Some examples of the use of carrier-bound substances are given below.
The group of proteases such as trypsin, chymotrypsin, papain, elastase can, for. B. used for the production of protein hydrolyzates for microbiological processes. In addition, the enzymes can also be used to remove antigenic proteins from active pharmaceutical ingredients.
Acylases are used industrially for the production of 6-aminopenicillansä. ure from penicillins or used for the separation of racemates acylated amino acids. Carrier-bound amylase can be used for the hydrolytic breakdown of starch.
Special hydrolases such as asparaginase or urease can be used therapeutically in bound form in the extracorporeal circuit.
These and numerous other possible applications have been described in the literature, you-
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linen from 6-APS can be used.
The reaction temperature of the enzymatic cleavage is preferably 380C. The activity of the enzyme decreases at lower temperatures. If the split z. B. carried out at 250C, twice as much enzyme must be used as at 380C if the same reaction times are to be achieved.
The reaction rate depends on the specific activity and the temperature at a given temperature
Amount of the carrier-bound penicillin acylase. In addition, the rate of reaction depends on the ratio of the amount of carrier-bound penicillin acylase to the concentration of penicillin. One
Fission approach with a concentration of 100,000 IU Im! Penicillin G potassium is at pH 7, 8 and after 10 h
380C completely hydrolyzed to 6-APS and phenylacetic acid if penicillin acylase 3. 105 per unit
Units of penicillin G are used [one enzyme unit (U) is defined as the activity that 1 p. Moles of 6-nitro-3 (phenylacetyl) -amino-benzoic acid (NIPAB) hydrolyzed per minute at 250C].
The proportion of dry enzyme resin is only 0.5 to 1% of the reaction mixture. Are per 105 IU
If penicillin G 2 units of penicillin acylase are used, complete cleavage takes only 2 hours. There are also even shorter reaction times when using even more bound pencillin acylase, when using z. B. of carrier-bound penicillin acylase from crystallized enzyme, possible.
The carrier-bound penicillin acylase can be produced in the shape of a pearl and is characterized by high mechanical stability and a comparatively high spec. Weight off. With multiple use, these properties enable use over long periods of time. These properties also enable intensive stirring and simple separation by centrifugation without loss due to mechanical stress, e.g. B. by abrasion. Clear filtrates are thus obtained in batch processes, which can be further processed without additional filtration to obtain the end product, the 6-APS.
The carrier-bound penicillin acylase also allows quick and easy filtration, since the mechanical stability does not result in any fine particles clogging the filter surface. The resin offers further advantages in the batch process because of the comparatively high spec. Weight that causes the resin to settle quickly so that the supernatant solution can easily be siphoned off after the process has ended. This results in a simplification of the procedure, since the resin remains in the reaction vessel during the batch process and can be used directly for the next cleavage.
The properties of the polymer also allow the use of the carrier-bound penicillin acylase not only in batch processes, but also in continuous processes such. B. in reaction columns, the bead shape allowing the required high flow rate.
The 6-APS formed in the enzymatic cleavage is obtained after the enzyme resin has been separated off from the reaction solution by known processes (see e.g. German Patent No. 1111778) and crystallized at pH 4.3. When penicillin is cleaved with the carrier-bound penicillin acylase, significantly higher yields of 6-APS are obtained than when using E. coli sludge, but also higher yields than when using an enzyme resin made from penicillin acylase bound to a copolymer of acrylamide, N, N'-methylenebisacrylamide and maleic anhydride. As shown in Examples 8 and 9, 6-APS was obtained in a yield of about 90% of theory. Th. Isolated.
The 6-APS thus produced does not contain any proteins as an impurity. The 6-APS produced in this way also contains practically no polymers which can be produced in other processes. Allergenic side effects which are attributed to proteins or polymers are excluded with the 6-APS produced according to the invention.
The carrier-bound penicillin acylase allows multiple use over a long period of time.
Even after this, the enzyme activity is still practically completely retained.
The boiling points in the examples were determined at normal pressure.
With pie 1 1 a): 70 g of tetraethylene glycol dimethacrylate, 20 g of methacrylic acid, 10 g of maleic anhydride and 1 g of azoisobutyronitrile are dissolved in 1 l of benzene and initially polymerized for 4 hours at 60.degree. Then 1 g of azoisobutyronitrile and 200 ml of gasoline (boiling point 100 to 1400 ° C.) are added and the mixture is polymerized for 2 hours at 70 ° C. and 2 hours at 80 ° C.
The powdery polymer is washed thoroughly with petroleum ether (boiling point 30 to 50 ° C.) and dried in vacuo.
Yield: 96 g bulk volume: 8.8 ml / g
Swelling volume in water: 12.4 ml / g spec. Surface: 8.6 m2 / g
Acid content after saponification of the anhydride groups = 3.85 m equiv / g For pie 1 1 b): 6 g of the carrier resin prepared according to Example la) are suspended in a solution of 610 UPenicillin acylase in 150 ml of water. By adding 1 N NaOH with a pli-stat
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the pH was kept at 6.3 and the suspension was stirred at 250C for 20 h.
It is then filtered off with suction through a G 3 glass frit and washed with 300 ml each of 0.05 M phosphate buffer pH 7.5, which contains 1 M sodium chloride, and with the same buffer without sodium chloride. No more activity can be eluted by further washing. The supernatant and washing solutions are combined and their enzymatic activity is determined; the enzymatic activity of the moist resin is measured in an aliquot.
Result :
Enzymatic activities (NIPAB test)
Starting solution 610 U supernatant + washing solutions 112 U
Carrier resin after the reaction 561 U d. s. 92% of the initial activity
The enzymatic activity of penicillin acylase is measured colorimetrically or titrimetrically with 0.002 M-6Nitro-3- (N-phenylacetyl) -aminobenzoic acid (NIPAB) as substrate at pH 7, 5 and 250C. The mo-
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unit (U) corresponds to the conversion of 1 mol of substrate per minute.
Example lc): 400 mg of the carrier resin prepared according to Example 1a) are suspended in a solution of 40 ml of urease in 32 ml of water. With constant stirring at room temperature, the pH is kept constant at 6.0 by adding 1N sodium hydroxide solution. The reaction has ended after 16 hours, the resin is filtered off with suction and washed with buffer as in Example 1b).
Result :
Enzymatic activity
Starting solution 168 U supernatant + washing solutions 64.5 U
Carrier resin after conversion 87 U d. s. 52% of the initial activity
The enzymatic activity of urease is titrimetrically determined with 0.17 M urea as substrate, at 250C and pH 6.1. 1 unit (U) corresponds to the amount of enzyme that 1 mol of urea d. H. 2 juMol hydrochloric acid consumed per minute.
Example Id): 500 mg of the carrier resin prepared according to Example la) are suspended in a solution of 100 mg of trypsin in 32 ml of 0.02M calcium chloride. With constant stirring at 40C, the pH is kept constant at pH 6.3 by adding 1N sodium hydroxide solution. After 16 h, the resin is suctioned off and washed with buffer as in Example 1b).
Result :
Enzymatic activity
Starting solution 110 U supernatant + washing solutions 15.6 U
Carrier resin after the reaction 64 U d. s. 58% of the initial activity
The enzymatic activity was determined colorimetrically according to Tuppy, Z. Physiol. Chem. 329 [1962], p. 278, measured with benzene-arginine-p-nitroanilide (BAPNA) as substrate. 1 unit (U) corresponds to the cleavage of 1 J. L mol SUbstrate per minute at 250C and pH 7.8.
Example 2a): A solution of 80 g of tetraethylene glycol dimethacrylate, 10 g of methaoryl acid, 10 g of maleic anhydride and 1 g of azoisobutyronitrile in 11 benzene is polymerized with slow stirring for 4 h at 60 ° C., 2 h at 70 ° C. and 1 h at 80 ° C. The polymer is filtered off, stirred three times in benzene, washed with petroleum ether and dried in vacuo.
Yield: 70 g
Bulk volume: 7.0 ml / g
Swelling volume in water: 8.2 ml / g spec. Surface: 5, 3m2 / g
Acid content after saponification of the anhydride groups = 2.55 meq / g
Example 2b): 1 g of the polymer prepared according to example 2a) is reacted analogously to example lb) with penicillin acylase in 33 ml of water at pH 6.3.
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Result :
Enzymatic activities (NIPAB test)
Starting solution 118 U supernatant + washing solutions 21 U
Carrier resin after the reaction 82 U d. s. 69% of the initial activity
Example 3a): 60 g of tetraethylene glycol dimethacrylate, 30 g of methacrylic acid, 10 g of maleic anhydride and 1 g of azoisobutyronitrile are dissolved in 200 ml of acetonitrile. This solution is dissolved in 11 gasoline (boiling point 100 to 1400C), which contains 5 g of a mixture of glycerol mono and dioleate, suspended and polymerized at 600C for 22 h.
The polymer beads are filtered off, suspended three times in benzene and then twice in petroleum ether (boiling point 30 to 50 ° C.) and dried in vacuo.
Yield: 94 g of white spheres bulk volume: 4.4 ml / g swelling volume in water: 5.5 ml / g spec. Surface: 6, 6 m2 / g mean particle diameter: # 200
Acid content after saponification of the anhydride groups = 4.3 mXquiv / g Example 3b): 1 g of the polymer prepared according to Example 3a) is used analogously to Example 1b)
Penicillin acylase in 33 ml of water at pH 6, 3 implemented.
Result :
Enzymatic activity (NIPAB test)
Starting solution 118 U supernatant + washing solutions 43 U
Carrier resin after the reaction 96 U d. s. 81% of the initial activity
Example 4a): A solution of 2100 g of tetraethylene glycol dimethacrylate, 600 g of methacrylic acid, 300 g of maleic anhydride and 30 g of azoisobutyronitrile in 7.5 l of acetonitrile is dissolved in 211 gasoline (boiling point 100 to 1400 C) in which 150 g of a mixture of glycerol mono-and-di-oleate were suspended and dissolved for 1 hour polymerized at 50 C and 20 h at 600C.
The bead polymer is filtered off with suction, stirred twice with toluene and once with petroleum ether (boiling point 30 to 50 ° C.) and dried at 60 ° C.
Yield: 2.95 kg bulk volume: 4.7 ml / g
Swell volume in water: 5.4 ml / g mean particle diameter: about 0.3 mm
Acid content after saponification of the anhydride groups = 4.0 meq / g Example 4b): Ig of the polymer prepared according to Example 4a) is reacted with penicillin acylase in 33 ml of water at pH 6.3 in a manner analogous to Example 1b).
Result :
Enzymatic activity (NIPAB test) in the starting solution 107 U supernatant and washing solutions 27 U
Carrier resin after the reaction 67 U d. s. 63% of the initial activity At pie 1 4 c): 20 g of the polymer prepared according to Example 4a) are introduced at room temperature in 600 ml of a solution of 1.0 gun-specific elastase from pig pancreas with stirring. The pH is kept constant at 5.8. After a reaction time of 16 hours, the resin is filtered off with suction and worked up in the manner described in Example lb).
Result :
Enzymatic activity (casein test)
Starting solution 2180 U supernatant + washing solutions 992 U
Carrier resin after conversion 1225 E d. s. 56% of the initial activity
<Desc / Clms Page number 9>
The enzymatic activity of the unspecific elastase is determined titrimetrically with casein as substrate (concentration 11.9 mg / ml) at pH 8.0 and 250C. 1 unit (U) corresponds to a consumption of 1 J. lMol potassium hydroxide solution per minute.
Example 5a): A solution of 80 g of tetraethylene glycol dimethacrylate, 10 g of methacrylic acid, 10 g of maleic anhydride and 1 g of azoisobutyronitrile in 300 ml of acetonitrile is polymerized analogously to Example 3a).
Yield: 92 g of white, egg-shaped particles. Bulk volume: 2.5 ml / g
EMI9.1
spec. Surface: 1.7 m2 / g mean particle diameter: 125 J. l
Acid content after saponification of the anhydride groups = 3.5 meq / g
Example 5b): 1 g of the polymer prepared according to Example 5a) is reacted analogously to Example 1b) with penicillin acylase in 33 ml of water at pH 6.3.
Result :
Enzymatic activity (NIPAB test)
EMI9.2
Supernatant + washing solutions 34 U carrier resin after the reaction 61 U d. s. 52% of the initial activity
EMI9.3
<Desc / Clms Page number 10>
6a): A solution of 50 g of ethylene glycol dimethacrylate, 40 g of methacrylic acid, 10 gMalein example 7c: Ig of the polymer prepared according to example 7b) is reacted with penicillin acylase in 32 ml of water at pH 6.3, analogously to example lb).
Result :
Enzymatic activity (NIPAB test)
EMI10.1
Supernatant + washing solution 26 U
Carrier resin after the reaction 38 U d. s. 36% of the initial activity
Example 8a): A solution of 50 g of tetraethylene glycol dimethaorylate, 40 g of N-vinylpyrrolidone, 10 g of maleic anhydride and 1 g of dicyclohexyl percarbonate in 200 ml of acetonitrile is suspended in 11 gasoline (boiling point 100 to 1400 ° C.), which contains 5 g of a mixture of glycerol mono-and-diolate, with stirring, for 18 hours warmed up. Then 1 g of the initiator is added and the mixture is stirred at 60 ° C. for a further 8 h. The polymer beads are washed thoroughly with benzene and petroleum ether and dried in vacuo.
Yield: 54 g clear pearls bulk volume: 1.6 ml / g
EMI10.2
Acid content after saponification of the anhydride groups = 3.3 m .. equiv / g
Content of nitrogen-3, 4% A 27% N-vinylpyrrolidone.
Example 8b): 1g of the polymer willow prepared according to Example 8a) is reacted analogously to Example 1b) with penicillin acylase in 33 ml of water at pH 6.3.
EMI10.3
<Desc / Clms Page number 11>
EMI11.1
: Result: Enzymatic activity (NIPAB test) starting solution 107 U supernatant + washing solutions 49 U carrier resin after the reaction 25 U d. s. 23% of the initial activity
EMI11.2
lla): If 30 g of N-methoxymethyl methacrylamide are used instead of N-methoxymethyl-acrylamide in 10a), the following result is obtained:
Yield: 94 g bulk volume: 2.4 ml / g
EMI11.3
in water: 3, 9 ml / g Result:
Enzymatic activity (NIPAB test)
EMI11.4
Supernatant + washing solutions 60 U
Carrier resin after the reaction 24 U d. s. 22% of the initial activity Example 12: 76.1 kg (wet weight) of carrier-bound Penioillinaoylase presented according to Example 4b) with an activity of 737,000 U (NIPAB test) and 125 kg of penicillin G-potassium (purity 98%) are added successively to 2000 l of water and stirred at 380C. The pH of the reaction mixture is kept constant at 7.8 by continuously adding triethylamine. After 8 hours, no more triethylamine is taken up. The carrier-bound penicillin acylase is centrifuged off, washed with 60 l of water and 801 0.2 M phosphate buffer, pH 6.5, and used again for further cleavage approaches.
The filtrate including wash water is concentrated to 300 l in vacuo. The 6-APS is precipitated by adding half-concentrated hydrochloric acid at the isoelectric point at pH 4.3 in the presence of 200 l of methyl isobutyl ketone. After 1 h it is filtered off, rewashed with 200 l of water and then with 200 l of acetone
EMI11.5
Purity 98%.
The carrier-bound penicillin acylase was used successively for a total of 30 batches. Even after 30 cleavages, the carrier-bound penicillin acylase is not used up. The response time does not change. Work-up was carried out as described above. The 6-APS yields achieved are summarized below:
1st cleavage 91.9% d. Th.
2nd cleavage 91.4% d. Th.
3rd cleavage 91.6% d. Th.
4. Cleavage 91.0% d. Th.
5. cleavage 91.2% d. Th.
6. Cleavage 90, 3% d. Th.
7. cleavage 91.5% d. Th.
8. Cleavage 90.9% d. Th.
9. Cleavage 91.9% d. Th.
10. Cleavage 90.7% d. Th.
11. Cleavage 91, 2% d. Th.
12. Cleavage 90, 1% d. Th.
13. Cleavage 90.9% d. Th.
14. Cleavage 90.7% d. Th.
15. Cleavage 91.0% d. Th.
16. Cleavage 90.2% d. Th.
17. Cleavage 90.3% d. Th.
18. Cleavage 89.9% d. Th.
19. Cleavage 89.8% d. Th.
<Desc / Clms Page number 12>
EMI12.1
<Desc / Clms Page number 13>
1% comparative example: (Example 3 of German Offenlegungsschrift 1917057):
10 g of ethylene maleic anhydride were stirred in 1250 ml of 0.05 M phosphate buffer at a pH of 7.6. 100 ml of 1% hydrazine hydrate solution were then added and, 2 minutes later, 17.4 ml of a solution containing 1150 units of penicillin acylase (NIPAB test, unit definition as given above). The protein content of the enzyme solution was 20 mg / ml. The mixture was stirred in an ice bath for 2 h and kept at 50 ° C. in the cold room overnight. The preparation was gel-like and could only be separated by centrifugation.
After washing out with 250 ml each of 1M NaCl, 0.5M NaH CO, 1M NaCl and water, 160 g of a gel-like substance were obtained. The enzymatic activity was 0.06 units / g, that is only 0.83% of the enzyme activity used.