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Die Erfindung betrifft die Verwendung eines wasserunlöslichen Proteinpräparates, insbesondere Enzympräparates, wobei das Protein an ein vernetztes Copolymerisat gebunden ist, das aus copolymerisierten Einheiten von
A) 0, 1 bis 50 Gew. -% a, ss-monoole6nisch ungesättigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4 bis 9 C-Atomen und
B) 99, 9 bis 50 Gew.-% Di-und/oder Poly- (Meth) Acrylaten von Di-und/oder Polyolen besteht, wobei die vernetzten Copolymerisate Schüttvolumina von 2 bis 20 ml/g, spezifische Oberflächen von 1 bis
400 m2/g besitzen und nach der Verseifung der Anhydridgruppen 0, 02 bis lOMiIliäquivalente Säure pro Gramm enthalten, zur Durchführung einer durch Proteine, insbesondere Enzyme, katalysierbaren
Reaktion, wie z.
B. der hydrolytischen Spaltung von Substraten, insbesondere von Penicillinen unter
Bildung von 6-Aminopenicillansäure.
Die covalente Bindung von Substanzen an unlösliche polymere Träger hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Besondere Vorteile bietet die Fixierung von katalytisch wirksamen Verbindungen, z. B. Enzymen, da sie in dieser Form nach beendeter Umsetzung leicht abgetrennt und mehrfach wiederverwendet werden können.
Als Träger mit reaktiven Gruppen wurden bereits mehrfach Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und
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So erhaltene Enzympräparate sind relativ schlecht filtrierbar und besitzen lösliche Anteile, was zu Verlusten an gebundenem Enzym führt (vergl. E. Katchalski, Biochemistry 3, [1964], S. 1905 bis 1919).
Ferner wurden Copolymerisate aus Acrylamid und Maleinsäure beschrieben, die durch nachträgliches
Erhitzen in die Anhydridform überführt werden. Diese Produkte sind relativ schwach vernetzt, quellen sehr stark in Wasser und besitzen eine nur mässige mechanische Stabilität, was zu Abriebsverlusten bei der Anwendung dieser Harze führt (vergl. deutsche Offenlegungsschrift 1908290).
Ausserdem wurden stark vernetzte Trägerpolymere durch Copolymerisation von Maleinsäureanhydrid mit
Divinyläthern hergestellt. Auf Grund der alternierenden Copolymerisationsart der Monomeren enthalten diese
Polymeren einen sehr hohen Anteil an Anhydridgruppen-in den angegebenen Beispielen jeweils über 50 Gew.-% Maleinsäureanhydrid-, der durch das Molekulargewicht des Vinyläthermonomeren bestimmt wird und daher nur in relativ engen Grenzen dem jeweiligen Verwendungszweck angepasst werden kann (vergl. deutsche
Offenlegungsschrift 2008996).
In der deutschen Offenlegungsschrift 1917057 werden sehr verschiedene Trägermaterialien beschrieben, an welche das Enzym Penicillinacylase gebunden werden kann. Unter anderem werden dort Äthylen-Maleinsäure- anhydrid-Polymerharze, Acrylsäureharze und auch Polysaccharide als mögliche Träger angegeben. Davon sind die Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Polymerharze (EMA) den Harzen gemäss der Erfindung am ehesten vergleichbar. Bei
Nacharbeitung des Beispiels 3 dieser Offenlegungsschrift wurde, wie das Vergleichsbeispiel zeigt, ein gelartiges
Enzympräparat erhalten, welches nach der Spaltung von Penicillinen zu 6-Aminopenicillansäure nur durch
Zentrifugation abgetrennt werden kann. Präparate mit einer derartigen Gel-Struktur sind jedoch für eine wirtschaftliche Verwertung im grosstechnischen Verfahren nicht gut geeignet.
Hingegen können die erfindungsgemäss verwendeten unlöslichen Enzympräparate, welche pulvrige Substanzen darstellen, z. B. durch eine einfache Filtration oder sogar lediglich durch Sedimentation abgetrennt werden. Der Produktionsverlauf wird hiedurch sehr einfach und liegt kostenmässig sehr günstig. Bei der Nacharbeitung konnte nur eine sehr ungünstige Ausbeute an unlöslichem Enzym erreicht werden. In 160 ml Gel wurden nur 9, 6 Einheiten an unlöslichem Enzym gefunden. Eine derartig geringe spezifische Aktivität ermöglicht eine enzymatische Hydrolyse von lediglich etwa 3 g Penicillin-G-Kalium innerhalb einer Reaktionszeit von 9 h. Demgemäss ist eine Verwendung der Harze gemäss der deutschen Offenlegungsschrift 1917057 zu einer grosstechnischen Herstellung von 6-APS mit wesentlichen Nachteilen behaftet.
Im Gegensatz hiezu können in überraschender Weise gemäss der Erfindung Enzympräparate mit hohen spezifischen Aktivitäten hergestellt werden. So sind z. B. zur enzymatischen Spaltung von 129 g Penicillin-G-Kalium nur 79 g feuchtes Enzymharz erforderlich.
Die gemäss der deutschen Offenlegungsschrift 1945680 mit dem Enzym zu kuppelnden Polymere sind Copolymerisate aus z. B. Maleinsäureanhydrid mit Polyacrylaten. Diese Produkte sind jedoch ausnahmslos in Wasser oder organischen Lösungsmitteln löslich. Die unter Verwendung von Anhydriden der Acrylsäure und Methacrylsäure hergestellten Produkte, die in der deutschen Offenlegungsschrift 1695662 beschrieben sind, stellen lineare und nur schwach vernetzte Produkte dar.
Als für die Herstellung der Copolymerisate benötigte a, ss-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen seien namentlich genannt : Maleinsäure-, Itaconsäure-oder Citraconsäureanhydrid, insbesondere Maleinsäureanhydrid. Für die Copolymerisation können auch Mischungen dieser Anhydride eingesetzt werden.
Die zu verwendenden Di-und/oder Polymethacrylate bzw. Di-und/oder Polyacrylate von Di-und/oder Polyolen leiten sich von Verbindungen mit mindestens 2 alkoholischen oder phenolischen, vorzugsweise
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alkoholischen OH-Gruppen bzw. deren Umsetzungsprodukten mit Alkylenoxyden mit 2 bis 8
Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Gemischen dieser Alkylenoxyde ab, wobei an
1 Mol der Hydroxylgruppen tragenden Verbindung 1 bis 104, bevorzugt 1 bis 20 Alkylenoxydbausteine anpolymerisiert sind. Beispielsweise seien Alkylenoxyde, Äthylenoxyd, Propylenoxyd, Butylenoxyd,
Trimethylenoxyd, Tetramethylenoxyd, Bis-chlormethyl-oxacyclobutan, Styroloxyd, vorzugsweise Äthylenoxyd und Propylenoxyd genannt.
Es ist auch durchaus möglich, Umsetzungsprodukte von Verbindungen mit mindestens 2 Zerewitinoff-aktiven Wasserstoffatomen, die sich nicht von Alkoholen oder Phenolen ableiten, mit den obengenannten Alkylenoxyden zur Herstellung der Di-und/oder Poly (Meth) Acrylate zu verwenden.
Die Di-und Poly (Meth) Acrylate von Di-und Polyolen werden nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Umsetzung der Di-und/oder Polyole mit (Meth) Acrylsäurechlorid in Gegenwart von in etwa äquimolaren
Mengen bezogen auf Säurechlorid, an tert. Aminen wie Triäthylamin, bei Temperaturen unter 20 C, in
Anwesenheit von Benzol gewonnen (vergl. deutsche Offenlegungsschrift 1907666).
Als Di-bzw. Polyole mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 12 Kohlenstoffatomen kommen z. B. in Frage : Äthylenglykol, Propandiol-1, 2, Propandiol-1, 3, Butandiole insbesondere Butandiol-1, 4,
Hexandiole, Dekandiole, Glyzerin, Trimethylolpropan, Pentaerythrit, Sorbit, Sucrose und deren
Umsetzungsprodukte mit Alkylenoxyden, wie vorstehend angegeben. Auch Poly- bis-chlormethyl-oxacyclobutan oder Polystyroloxyd sind geeignet. Es können auch Gemische aus Di-und Polyolen eingesetzt werden.
Vorzugsweise werden Diacrylate bzw. Dimethacrylate von Diolen mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder
Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1 bis 20 Molen Alkylenoxyd mit 2 bis 4
Kohlenstoffatomen bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat verwendet.
Besonders vorteilhaft sind die Dimethacrylate von Äthylenglykol, Diäthylenglykol, Triäthylenglykol,
Tetraäthylenglykol oder höheren Polyalkylenglykolen mit Molgewichten bis 1000 oder deren Gemische.
Falls gewünscht, könnten neben den Di-und/oder Poly (Meth) Acrylaten auch üblicherweise verwendete
Vernetzungsmittel mit mindestens 2 nichtkonjugierten Doppelbindungen, etwa Divinyladipat, Methylen- bisacrylamid, Triacrylformal oder Triallylcyanurat in Mengen von etwa 0, 01 bis 30 Gew.-% der
Monomerenmischung zugesetzt werden.
Auf Grund der möglichen Variationsbreite in der Zusammensetzung der Monomerenmischung können innerhalb eines sehr weiten Bereiches Hydrophilie, Vernetzungsdichte, Quellbarkeit und Anhydridgruppengehalt der erfindungsgemässen Copolymerisate dem jeweiligen Verwendungszweck angepasst werden.
Die Polymerisation kann z. B. in einem organischen Lösungsmittel als Fällungspolymerisation durchgeführt werden, wobei die Polymeren bereits kurz nach dem Einsetzen der Polymerisation auszufallen beginnen. An sich sind alle gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel geeignet. Besonders günstige Lösungsmittel sind aliphatische, cycloaliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe sowie halogensubstituierte Kohlenwasser- stoffe, Alkylaromaten und Carbonsäureester.
Beispielsweise seien genannt : Heptan, Octan, Isooctan, Benzinfraktionen mit Siedepunkten von etwa 60 bis 200 C, Cyclohexan, Benzol, Toluol, Xylole, Chlorbenzol, Dichlorbenzole, Äthylacetat, Butylacetat.
Die Lösungsmittel sollen vorzugsweise einen Siedepunkt von mindestens 60 C besitzen und im Vakuum gut aus dem Fällungspolymerisat entfernbar sein. Für 1 Teil der Monomerenmischung verwendet man etwa 2 bis
50, bevorzugt 5 bis 20 Gew.-Teile, des Lösungsmittels. Die Eigenschaften der Copolymerisate, besonders das Schüttgewicht und die spezifische Oberfläche werden durch Art und Menge des Lösungsmittels wesentlich beeinflusst.
In vielen Fällen ist es vorteilhaft, Gemische der obengenannten Lösungsmittel zu verwenden, oder die Polymerisation in einem Lösungsmittel für das Polymere zu beginnen und im Verlauf der Polymerisation kontinuierlich ein Fällungsmittel für das Polymere zuzugeben. Das Fällungsmittel kann auch zu bestimmten Zeitpunkten in einer oder mehreren Portionen zugegeben werden. Ausserdem kann die Monomerenmischung zusammen mit einem geeigneten Initiator als Lösung oder ohne Lösungsmittel in eine vorgelegte Lösungsmittelmenge eingespeist werden, so dass während der Polymerisation eine gleichmässige, geringe Monomerkonzentration aufrecht erhalten wird.
Durch Verwendung von (Meth)-Acrylmonomeren unterschiedlicher Hydrophilie und Variation der Polymerisationsbedingungen lassen sich innerhalb eines sehr weiten Bereiches Produkte mit dem jeweiligen Verwendungszweck angepasster Quellbarkeit, Dichte und spezifischer Oberfläche bei guter mechanischer Stabilität herstellen.
Die Copolymerisate können auch durch Suspensionspolymerisation hergestellt werden. Die gebrächlichste Art der Perlpolymerisation, bei der die Monomeren, gegebenenfalls unter Zusatz eines organischen Lösungsmittels, in Wasser suspendiert werden, lässt sich in diesem Fall nur mit geringem Erfolg anwenden, da das Anhydrid sehr rasch hydrolysiert, die entstehende Dicarbonsäure hauptsächlich in die Wasserphase übergeht und nur in geringer Menge in das Polymere eingebaut wird. Daher wird die Suspensionspolymerisation zweckmässig in organischem Medium durchgeführt. Die Monomeren und der Initiator werden in einem mit Paraffinen nicht mischbaren, gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel wie z. B.
Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd oder Hexamethylphosphorsäuretriamid gelöst und meistens unter Zusatz von Dispergatoren in der zusammenhängenden Phase verteilt. Als zusammenhängende Phase eignen sich besonders
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Paraffinkohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan, Octan und höhere Homologe, Cycloaliphaten wie Cyclohexan sowie Paraffingemische wie Benzinfraktionen oder Paraffinöl. Das Volumenverhältnis, zusammenhängende Phase :
Monomerphase beträgt 1 : 1 bis 10 : 1, vorzugsweise 2 : 1 bis 5 : 1.
Zur Stabilisierung der Suspension können beispielsweise Glycerin-mono- und -dioleate sowie Gemische dieser Verbindungen, Sorbitan-mono- und -trioleate bzw. -stearate, Polyäthylenglykolmonoäther mit Stearyl- bzw. Laurylalkohol oder Nonylphenol, Polyäthylenglykolmonoester mit ölsäure, Stearinsäure und andern
Fettsäuren mit mehr als 10 C-Atomen sowie das Na-Salz des Sulfobernsteinsäuredioctylesters verwendet werden.
Diese Stoffe werden in Mengen von vorzugsweise 0, 1 bis 10%, bezogen auf die Monomerenmischung, eingesetzt und im allgemeinen in der Kohlenwasserstoffphase gelöst. Die Partikelgrösse der Suspensionspolymerisate kann ausser durch Vergrösserung der Rührgeschwindigkeit durch Zugabe von 0, 1 bis 2%, bezogen auf Monomere, einer weiteren oberflächenaktiven Substanz, z. B. eines Alkylsulfonates verringert werden.
Die Polymerisation wird durch radikalische Initiatoren ausgelöst. Geeignete Initiatoren sind z. B.
Azoverbindungen oder Perverbindungen. Die zur Polymerisationsaulösung gebräuchlichste Azoverbindung ist das Azoisobuttersäurenitril. Als Perverbindungen kommen hauptsächlich Diacylperoxyde wie Dibenzoylperoxyd oder Percarbonate wie Diisopropyl- und Dicyclohexylpercarbonat in Frage, es können jedoch auch Dialkylperoxyde, Hydroperoxyde und in organischen Lösungsmitteln wirksame Redoxsysteme zur Initiierung verwendet werden.
Die Initiatoren werden in Mengen von 0, 01 bis 10%, vorzugsweise 0, 1 bis 3%, bezogen auf die Gewichtsmenge der Monomermischung zugesetzt.
Die Polymerisation wird bei Temperaturen von etwa 20 bis 200 C, vorzugsweise 50 bis 100 C in Abhängigkeit von der Zerfallsgeschwindigkeit der Initiatoren und meistens unterhalb des Siedepunktes der Lösungsmittel und bei Perlpolymerisationen unterhalb der Mischungstemperatur der beiden Phasen durchgeführt. Ausserdem ist es in der Regel vorteilhaft, in inerter Atmosphäre unter Abwesenheit von Sauerstoff zu polymerisieren.
Die durch Fällungspolymerisation erhaltenen Copolymerisate sind farblose bis schwach gelb gefärbte, pulvrige Substanzen mit Schüttvolumina von 1, 5 bis 30 ml/g, vorzugsweise 2 bis 20 ml/g, und spezifischen Oberflächen von 0, 1 bis 500 m2/g, bevorzugt 1 bis 400 m2fg. Der nach Verseifung der Anhydridgruppen titrimetrisch bestimmte Gehalt an Carboxylgruppen liegt bei 0, 02 bis 10 mÄquiv/g, vorzugsweise bei 0, 4 bis 4 mÄquiv/g. Die Suspensionspolymerisate sind weisse oder schwach gefärbte Perlen, die in einigen Fällen unregelmässig geformt sein können und einen Durchmesser von 0, 03 bis 1 mm, vorzugsweise 0, 05 bis 0, 5 mm, und Schüttvolumina von etwa 1, 4 bis 8 ml/g, vorzugsweise 1, 4 bis 5 ml/g, besitzen.
Ihr nach der Hydrolyse der Anhydridgruppen bestimmter Carboxylgruppengehalt beträgt 0, 02 bis 10 mAquiv/g, vorzugsweise 0, 4 bis 4 mAquiv/g.
Die Copolymerisate enthalten die copolymerisierten Einheiten statistisch verteilt. Auf Grund ihrer hohen Vernetzungsdichte sind die Copolymerisate in allen Lösungsmitteln unlöslich. Molekulargewichte sind daher nicht bestimmbar.
Die Copolymerisate können in Wasser auf das 1, 1- bis 2, 5-fache ihres Schüttvolumens quellen. Sie eignen sich vorzüglich als Trägerharze zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymerisate reagieren können.
Die Trägerharze werden bei Temperaturen zwischen 0 und 300C direkt in die wässerige Lösung des zu bindenden Stoffes, vorzugsweise in die wässerige Lösung eines Proteins eingetragen, wobei der PH-Wert konstant zu halten ist.
Sollten Proteine an die Copolymerisate gebunden werden, so arbeitet man zweckmässigerweise mit einem
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5in Frage.
Im Gegensatz zu den Erfahrungen der Literatur mit anderen Harzen, nach denen die Umsetzung in gepufferten Lösungen durchgeführt wird, waren die Ausbeuten an gebundenem Enzym mit den oben beschriebenen Harzen umso besser, je niedriger der Salzgehalt der Lösungen war.
Das Gewichtsverhältnis von gebundener Substanz, beispielsweise Protein bzw. Peptid zu Trägerharz kann in weiten Grenzen variiert und dem späteren Verwendungszweck angepasst werden. Gute Ausbeuten erhält man bei einem Verhältnis von 1 Gew.-Teil Protein zu 4 bis 10 Gew.-Teilen polymerem Träger. Die optimalen Verhältnisse sind jedoch sowohl von der Zusammensetzung und der Struktur des Polymeren als auch von der Art des Proteins abhängig. Bei zahlreichen Enzymen ist es zweckmässig, Stabilisatoren der Enzymlösung zuzusetzen.
Als solche kommen Polyäthylenglykole oder nichtionische Netzmittel zur Abschwächung der Denaturierung an Oberflächen in Frage sowie die bekannten SH-Reagentien oder Metallionen bei speziellen Enzymen.
Die notwendige Reaktionszeit ist abhängig von der Art des Polymeren. Im Normalfall ist die Reaktion nach 20 h bei Raumtemperatur abgeschlossen. Bei 40C läuft die Reaktion besser noch etwas länger. Bei
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präparativen Ansätzen wird der Ansatz nicht früher als 2 h nach Beendigung der Alkalizugabe durch den
PH-Staten abgebrochen. Das Polymere mit dem gebundenen Protein wird hierauf abgesaugt oder abzentrifugiert und der Rückstand mit Salzlösungen hoher Ionenstärke, beispielsweise 1 M-Natriumchloridlösung, und anschliessend mit einem Puffer gewaschen, in dem das Enzym stabil ist. Bei der Waschung mit Lösungen hoher
Salzkonzentration wird ionogen gebundenes Protein vom Träger abgelöst.
Zur Beurteilung des Erfolges der Proteinbindung wurde bei Enzymen die enzymatische Aktivität sowohl im
Polymeren als auch in der Restlösung und in den Waschwassern bestimmt. Bei Proteinen ohne spezifische
Wirkung wurde der Stickstoffgehalt im Polymeren nach Kjeldahl bestimmt. Die Ausbeuten bei der
Proteinbildung liegen zwischen 10 und über 90%. Betrachtet man die enzymatische Aktivität, so ist es in einigen
Fällen vorteilhaft, keinen zu grossen Überschuss an Polymermaterial zu verwenden, da sonst zwar das Protein vollständig gebunden wird, die Aktivität jedoch darunter leidet.
Die Trägerharze sind geeignet, alle Substanzen zu binden, die eine funktionelle Gruppe tragen, die befähigt ist, mit der Anhydridgruppe des Polymeren zu reagieren. Bei den Proteinen und Peptiden sind dies vor allem die endständigen Aminogruppen des Lysins und die freien Aminogruppen der Peptidkettenenden.
An Träger gebundene Peptide und Proteine sind von grosser wissenschaftlicher und technischer Bedeutung.
Die in den meisten Fällen teuren und instabilen Enzyme werden durch die Bindung an das Harz wesentlich stabilisiert. Ausserdem gestattet die leichte und vollständige Rückgewinnung des Enzymharzes eine vielfache
Anwendung über lange Zeitspannen.
Folgende Proteine können beispielsweise an die Copolymerisate fixiert werden :
Enzyme : Hydrolasen wie Proteasen, beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Elastase ; Amidasen, beispielsweise Asparaginase, Glutaminase, Urease ; Acyltransferasen, beispielsweise Penicillinacylase ; Lyasen, beispielsweise Hyaluronidase.
Andere Proteine, wie Plasmabestandteile, Globuline (Antikörper).
Polypeptide, wie Kallikrein-Inhibitor oder Insulin. Aminosäuren wie Lysin oder Alanin.
Die einzusetzenden Proteine werden im allgemeinen aus Bakterien, Pilzen, Aktinomyceten oder aus tierischem Material gewonnen.
Einige Beispiele für technisch wichtige Umsetzungen mit gebundenen Enzymen sind der hydrolytische Abbau der Stärke durch covalent gebundene Amylase, die Klärung von Fruchtsäften u. a. durch gebundene Pektinase, die Herstellung enzymatisch abgebauter Eiweisshydrolysate, die Hydrolyse von Penicillinen zur 6-Aminopenicillansäure. Ausserdem wurden auch gebundene Enzyme, Peptide u. a. zur Isolierung von Inhibitoren durch Affinitätschromatographie und umgekehrt gebundene Inhibitoren zur Isolierung von Enzymen verwendet.
Andere Anwendungen liegen im Gebiet der Medizin. Ein Beispiel ist die Verwendung von gebundener L-Asparaginase oder Urease in einem extrakorporalen Kreislauf zur Erniedrigung des Asparagin- bzw.
Harnstoffspiegels im Blut.
Diese und zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten sind in der Literatur beschrieben worden. Siehe dazu z. B. die Zusammenfassungen in Chem. Eng. News v. [15. 2. 1971], S. 86 und Rev. Pure a. Appl. Chem. 21,83 [1971].
Ein wichtiges Beispiel für die Verwendung der Proteinpräparate stellt die Spaltung von Penicillinen mit Hilfe von PeniciIIinacylase dar, welche an die erfindungsgemäss eingesetzten Copolymerisate gebunden ist.
Zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure (6APS) können Penicilline mit Hilfe von Acylasen aus Mikroorganismen wie z. B. Bakterien, insbesondere E. coli, Erwinia oder Actinomyceten wie Streptomyces, Micromonospora, Nocardia und Pilzen wie Fusarium und Hefe gespalten werden.
Gemäss dem Verfahren der deutschen Patentschrift Nr. 1111778 zur Herstellung von 6-APS wird eine Penicillin G-Lösung mit einem Bakterienschlamm versetzt, der das Enzym Penicillinacylase (E. C. 3. 5. 1. 11) enthält. Durch die Einwirkung des Enzyms wird die seitenständige Carbonamidgruppierung des Penicillins abgespalten, ohne dass der ss-Lactamring geöffnet wird.
Die Verwendung von Suspensionen von Mikroorganismen hat folgende Nachteile : a) Die Suspension von Mikroorganismen enthält ausser der intracellulären Penicillinacylase weitere
Proteine und Enzyme sowie Bestandteile aus dem Nährmedium oder deren Umwandlungsprodukte, die bei der Fermentation entstanden sind. Diese Verunreinigungen lassen sich bei der Aufarbeitung nicht vollständig aus der kristallisierten 6-APS auswaschen. b) Die Suspension von Mikroorganismen kann wirtschaftlich zweckmässig nur einmal eingesetzt werden. c) Die Suspension von Mikroorganismen enthält Verunreinigungen und andere Enzyme, die Penicillin und/oder 6-APS durch Öffnung des ss-Lactamringes inaktivieren. d) Die Suspension enthält nur kleine Mengen an Penicillinacylase. Der Einsatz von mehr Enzymmaterial, z.
B. zur Erzielung kurzer Reaktionszeiten und damit besserer 6-APS-Ausbeuten bei geringerem Gehalt von Fremdprodukten ist praktisch nicht möglich. e) Die Betriebsausbeuten an 6-APS hängen von der schwankenden Penicillinacylase-Bildung in den jeweiligen Fermentationsansätzen ab. f) Die vollständige Abtrennung suspendierter Mikroorganismen erfordert bei der Aufarbeitung der
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6-APS-Ansätze einen zusätzlichen Arbeitsvorgang, der Ausbeuteeinbussen bedingt. Zur Entfernung von proteinartigen Verunreinigungen, die allergene Reaktionen hervorrufen können, sind weitere
Reinigungsschritte nötig (brit. Patentschriften Nr. 1, 169, 696 ; Nr. 1, 078, 847 und Nr. 1, 114, 311).
Alle genannten Nachteile werden vermieden, wenn man an Stelle einer Suspension von Mikroorganismen eine Penicillinacylase verwendet, die durch kovalente Bindung an einen wasserunlöslichen Träger erhalten wird.
Versuche, 6-APS durch enzymatische Spaltung von Penicillinen mit trägergebundener Penicillinacylase herzustellen, sind zwar bekannt, (siehe dazu deutsche Offenlegungsschriften 1917057 und 1907365), konnten jedoch nicht in einen technischen Massstab übergeführt werden. Die Gründe dafür liegen einmal bei den mechanischen Eigenschaften des verwendeten Trägermaterials, das zu hohem Abrieb führt, zum andern konnten bei mässigen Verfahrensausbeuten nur geringe spezifische Aktivitäten an trägergebundener Penicillinacylase erreicht werden.
Auch ein gemäss einem unveröffentlichten Vorschlag verwendetes unlösliches Enzym, das durch kovalente
Bindung der Penicillinacylase an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, N, N'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäureanhydrid gewonnen wurde, hat für die Spaltung von Penicillin im technischen Massstab Nachteile, da es stark quillt und mechanisch nicht stabil ist. Diese Nachteile beeinträchtigen die mehrmalige Wiederverwendung des so hergestellten Harzes im technischen Massstab.
Es wurde nun gefunden, dass die genannten Nachteile vermieden werden, wenn eine an einen erfindungsgemässen wasserunlöslichen Träger gebundene Penicillinacylase zur Spaltung von Penicillinen verwendet wird.
Die Spaltung von Penicillinen mit trägergebundener Penicillinacylase lässt sich einfach und auch im grosstechnischen Massstab durchführen. Das trägergebundene unlösliche Enzym wird in einer Lösung mit 75000 bis 150000 lU/ml Penicillin, z. B. Penicillin G oder Penicillin V suspendiert. Die enzymatische Spaltung wird bei konstantem pervert im Bereich von 6 bis 9 vornehmlich im Bereich des PH-Optimums der jeweils gebundenen
Penicillinacylase z. B. bei PH 7, 8 durchgeführt. Zur Neutralisation des abgespaltenen Acylrestes z. B. der
Phenylessigsäure oder der Phenoxyessigsäure verwendet man wässerige Alkalilösungen z. B. Kali-oder Natronlauge oder organische Amine, vorzugsweise Triäthylamin.
Aus dem Verbrauch der Base ist die
Reaktionsgeschwindigkeit und die Beendigung der Spaltung zu ersehen. Die Penicillinacylase katalysiert sowohl die Spaltung von Penicillin zur 6-APS als auch die Resynthese der Penicilline aus den Spaltprodukten. Das
Gleichgewicht ist abhängig vom pH-Wert des Mediums.
Bei kleineren pH-Werten verschiebt sich das Gleichgewicht zugunsten des Ausgangsproduktes Penicillin.
Dies kann zur Umacylierung von Penicillinen in Gegenwart anderer Acylreste oder zur Synthese von Penicillinen aus 6-APS ausgenutzt werden.
Die Reaktionstemperatur der enzymatischen Spaltung beträgt vorzugsweise 38 C. Bei niedrigeren Temperaturen nimmt die Aktivität des Enzyms ab. Wird die Spaltung z. B. bei 25 C durchgeführt, muss doppelt soviel Enzym wie bei 38 C eingesetzt werden, wenn gleiche Reaktionszeiten erzielt werden sollen.
Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt bei gegebener Temperatur von der spezifischen Aktivität und der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase ab. Ausserdem ist die Reaktionsgeschwindigkeit abhängig von dem Verhältnis der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase zur Konzentration des Penicillins.
Ein Spaltungsansatz mit einer Konzentration von 100000 lU/ml (1 mg Penicillin G-Kalium entspricht 1598 IU (internationale Einheiten)) Penicillin G-Kalium ist nach 10 h bei PH 7, 8 und 380e vollständig zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolysiert, wenn pro Einheit Penicillinacylase 3. lOs Einheiten Penicillin G eingesetzt werden (eine Enzymeinheit (U) ist definiert als die Aktivität, die ljuMol (6-Nitro-3 (Phenylacetyl-) aminobenzoesäure (NIPAB) pro min bei 25 C hydrolysiert). Der Anteil an trockenem Enzymharz beträgt nur 0, 5 bis 1% des Reaktionsgemisches. Werden pro 105 IU Penicillin G, 2 Einheiten Penicillinacylase eingesetzt, so dauert die vollständige Spaltung nur 2 h.
Es sind auch noch kürzere Reaktionszeiten bei Einsatz von noch mehr gebundener Penicillinacylase, bei Verwendung z. B. von trägergebundener Penicillinacylase aus kristallisiertem Enzym, möglich.
Die erfindungsgemäss verwendete trägergebundene Penicillinacylase kann perlförmig hergestellt werden und zeichnet sich durch eine hohe mechanische Stabilität und ein vergleichsweise hohes spezifisches Gewicht aus.
Diese Eigenschaften ermöglichen bei vielfachem Einsatz eine Verwendung über lange Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen ferner bei Batch-Prozessen eine intensive Rührung und eine einfache Abtrennung durch Zentrifugieren ohne Verlust durch mechanische Beanspruchung z. B. durch Abrieb. Somit werden in Batch-Prozessen klare Filtrate erhalten, die ohne zusätzliche Filtration zur Gewinnung des Endproduktes, der 6-APS, weiterverarbeitet werden können. Die erfmdungsgemäss hergestellte trägergebundene Penicillinacylase erlaubt ebenso eine schnelle und einfache Filtration, da durch die mechanische Stabilität keine die Filterfläche verstopfenden Feinstanteile entstehen.
Weitere Vorteile bietet das Harz im Batch-Prozess wegen des vergleichsweise hohen spezifischen Gewichts, das ein schnelles Absetzen des Harzes bedingt, so dass nach Beendigung des Prozesses die überstehende Lösung leicht abgehebert werden kann. Daraus ergibt sich eine Vereinfachung der Verfahrensführung, da das Harz beim Batch-Prozess im Reaktionsgefäss verbleiben und direkt für die nächste Spaltung verwendet werden kann.
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Die Eigenschaften des Polymerisates ermöglichen ferner die Verwendung der trägergebundenen Penicillinacylase nicht nur in Batch-Prozessen, sondern auch in kontinuierlichen Verfahren z. B. in Reaktionssäulen, wobei die Perlform die erforderliche, hohe Durchflussgeschwindigkeit ermöglicht.
Die bei der enzymatischen Spaltung gebildete 6-APS wird nach Abtennung des Enzymharzes aus der Reaktionslösung nach bekannten Verfahren gewonnen (siehe z. B. deutsche Patentschrift Nr. 1, 111, 778) und bei PH 4, 3 kristallisiert. Bei der Spaltung von Penicillin mit der erfindungsgemäss hergestellten trägergebundenen Penicillinacylase werden wesentlich höhere Ausbeuten an 6-APS erhalten als bei Verwendung von E. coli-Schlamm aber auch höhere Ausbeuten, als bei der Verwendung des Enzymharzes nach der österr. Patentschrift Nr. 319471 erreicht. So wurde, wie in den Beispielen 8 und 9 gezeigt wird, 6-APS in einer Ausbeute von etwa 90% d. Th. isoliert. Die so hergestellte 6-APS enthält keine Proteine als Verunreinigung.
Die so hergestellte 6-APS enthält auch praktisch keine Polymeren, die bei andern Verfahrensweisen entstehen können. Allergene Nebenwirkungen, die auf Proteine oder Polymere zurückgeführt werden, sind bei der erfindungsgemäss hergestellten 6-APS ausgeschlossen.
Die trägergebundene Penicillinacylase gestattet einen vielfachen Einsatz über einen langen Zeitraum. Auch hienach ist die Enzymaktivität noch praktisch vollständig erhalten.
Die in den folgenden Beispielen angegebenen Siedepunkte wurden bei Normaldruck bestimmt.
Beispiel l : Die enzymatische Aktivität einer Penicillinacylase, deren Herstellung nachstehend beschrieben ist, wurde colorimetrisch oder titrimetrisch mit 0, 002 M-6-Nitro-3- (N-phenylacetyl) -aminobenzoe- säure (NIPAB) als Substrat bei PH 7, 5 und 25 C gemessen. Der molare Extinktionskoeffizient der entstehenden
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pro min.
Herstellung der Penicillinacylase : a) 80 g Tetra thylenglykoldimethacrylat, 20 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 11 Benzol gelöst und unter Rühren 4 h auf 60 C erwärmt. Dann gibt man 1 g
Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Benzin (Kp 100 bis 140 C) zu und polymerisiert weitere 5 h bei
70 C. Das pulvrige Polymere wird abgesaugt, einmal in Benzol und dreimal in Petroläther (Kp 30 bis 50 C) aufgeschlämmt und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 94 g Schüttvolumen : 3, 5 ml/g
Quellvolumen in Wasser : 4, 7 ml/g spezifische Oberfläche : 5 m2/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 3, 5 mÄquiv/g b) 1 g des nach a) hergestellten Trägerharzes wird in 30 ml einer wässerigen Lösung von 132 U
Penicillinacylase (spezifische Aktivität 1 U/mg Protein (Biuret)) suspendiert. Unter Konstanthaltung des PH-Wertes auf 6, 3 durch Zugabe von 1 N-Natronlauge mit einem PH-Staten wird die Suspension 20 h bei 25 C gerührt. Anschliessend saugt man über eine Glasfritte G3 ab und wäscht das Harz mit
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ohne Natriumchlorid. Durch weiteres Waschen wird die Aktivität des Harzes nicht mehr verändert.
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung : 132 U Überstand + Waschwasser : 12 U
Harz nach der Umsetzung : 86 U das sind 65% der Ausgangsaktivität.
Beispiel 2 : Enzymatische Aktivität einer am Trägerharz gebundenen Asparaginase (Asparagin-Hydrolyse)
Ausgangslösung : 21000 U überstand nach der Umsetzung : 3360 U
Trägerharz nach der Umsetzung : 3910 U das sind 19% der Ausgangsaktivität.
Herstellung der am Trägerharz gebundenen Asparaginase : a) Eine Lösung von 90 g Äthylenglykoldimethacrylat, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g
Azoisobuttersäurenitril in 11 Benzol wird unter Rühren zunächst bei 60 C polymerisiert. Nach 4 h gibt man 200 ml Benzin (Kp 100 bis 140 ) und 1 g Azoisobuttersäurenitril zu und polymerisiert 2 h bei 70 und 2 h bei 80 C weiter. Anschliessend saugt man das Polymere ab, wäscht gründlich mit
Petroläther (Kp 30 bis 500C) und trocknet im Vakuum.
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Ausbeute : 97 g Schüttvolumen : 6, 4 ml/g
Quellvolumen in Wasser : 8, 0 ml/g spezifische Oberfläche : 298 m2/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 1, 5 mÄquiv/g b) 6 g des nach a) erhaltenen Trägerharzes wurden mit 590 U Asparaginase in 165 ml Wasser umgesetzt.
Ergebnis :
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung : 590 U überstand + Waschwasser : 26 U
Trägerharz nach der Umsetzung : 352 U das sind 60% der Ausgangsaktivität.
Beispiel 3 :
A) 1 g eines Trägerharzes, dessen Herstellung nachstehend beschrieben ist, wurden zu einer Lösung von
50 mg unspezifischer Elastase mit einer enzymatischen Aktivität von 139 U in 32 ml Wasser gegeben. Der Ansatz wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt, wobei das PH auf 5, 8 konstant gehalten wurde. Nach der Umsetzung wurde das Harz abgesaugt und mit 50 ml 1
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M-Phosphatpuffer PH 7, 5 gewaschen.
Ergebnis :
Ausgangslösung : 139 E überstand und Waschlösungen : 51 E am Trägerharz gebunden : 15 E das sind 11% der Ausgangsaktivität.
Hiebei wurde die enzymatische Aktivität titrimetrisch mit Casein als Substrat (Konzentration
11, 9 mg/ml) bei pH 8, 0 und 250C bestimmt. 1 Einheit (E) entspricht einem Verbrauch von 1,Mol
Kalilauge pro min.
B) 1 g des Trägerharzes wurde zu einer Lösung von 50 mg Urease kristallisiert (Merck) in 32 ml Wasser gegeben. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur 16 h gerührt, wobei das PH auf 6, 3 konstant gehalten wurde. Die Aufarbeitung erfolgte wie in Beispiel lb angegeben.
Ergebnis :
Ausgangslösung : 5013 U überstand und Waschlösungen : 1397 U am Trägerharz gebunden : 1405 U das sind 28% der Ausgangsaktivität.
Die enzymatische Aktivität der Urease wurde titrimetrisch mit 0, 17 M-Harnstoff als Substrat bei
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min spaltet.
C) 0, 4 g des Trägerharzes wurden mit 40 mg Glutathion in reduzierter Form*) in 32 ml Wasser 16 h bei einem konstanten pH-Wert von 6, 3 bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Harz wurde abgesaugt und mit einer Lösung von 1 N-Natriumchlorid in 0, 05 M-Phosphatpuffer PET 7,5 und anschliessend mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen des Harzes im Vakuum bei 100 C über Phosphorpentoxyd wurden 0, 47 g erhalten. Die Stickstoffbestimmung nach Dumas ergab einen Wert von 1, 1% N, der einem Gehalt von 8, 04% oder 37, 8 mg Glutathion entspricht. Das sind 94% der eingesetzten Menge an Glutathion.
*) Bemerkung : Glutathion stellt bei biochemischen Reaktionen einen überträger bei Redoxprozessen dar. Hiebei wird das Glutathion in die Disulfidform übergefiihrt. Das hier angeführte Glutathion-Präparat ist also als Reduktionsmittel bei empfindlichen Biochemikalien insbesondere bei Enzymen, in welchen die Disulfidgruppen in SH-Gruppen umgewandelt werden sollen, einsetzbar.
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Herstellung des Trägerharzes : Die Copolymerisation von 90 g Diäthylenglykoldimethacrylat mit 10 g Maleinsäureanhydrid unter den Bedingungen von Beispiel 2a ergibt :
Ausbeute : 96 g Schüttvolumen : 5, 5 ml/g Quellvolumen in Wasser : 6, 7 ml/g spezifische Oberfläche : 9, 2 m2/g
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Beispiel 4 :
A) Die Umsetzung eines Trägerharzes, dessen Herstellung anschliessend beschrieben ist, mit
Penicillin-Acylase analog zu Beispiel lb liefert folgende Ergebnisse :
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung : 123 U Überstand + Waschlösungen : 13 U
Trägerharz nach der Umsetzung : 79 U das sind 64% der Ausgangsaktivität.
B) 0, 4 g des Trägerharzes wurden zu einer Lösung von 40 mg Trypsin in 32 ml 0, 01
M-Calciumchloridlösung gegeben und 16 h bei Raumtemperatur unter Konstanthaltung des
PH-Wertes auf 6, 3 gerührt. Das Harz wurde abgesaugt und nach Beispiel lb gewaschen.
Enzymatische Aktivität in der Ausgangslösung : 44 U in Überstand und Waschlösungen : 5, 2 U am Harz gebunden : 8, 3 U das sind 19% der Ausgangsaktivität.
Die enzymatische Aktivität wurde colorimetrisch nach Tuppy, Z. Physiol. Chem. 329 [1962] 278, mit Benzoyl-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) als Substrat gemessen. 1 Einheit (U) entspricht der
Spaltung von 1, Mol Substrat bei 250C und PH 7, 8.
C) 1 g des Trägerharzes wurde zu einer Lösung von 50 rng unspezifìscher Elastase in 32 ml Wasser gegeben. Die Suspension wurde 16 h bei Raumtemperatur unter Konstanthaltung des PH-Wertes auf
5, 8 gerührt. Die Aufarbeitung und titrimetrische Bestimmung der Enzymaktivitäten mit Casein als
Substrat wurde wie in Beispiel 3A angegeben durchgeführt.
Enzymatische Aktivität in der Ausgangslösung : 139 U in Überstand und Waschlösungen : 32 U am Harz gebunden : 36 U das sind 26% der Ausgangsaktivität.
Herstellung des Trägerharzes : 80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Maleinsäureanhydrid und
1 g Porofor N werden in 11 Benzol gelöst und unter langsamem Rühren 16 h bei 800C polymerisiert. Das Polymere wird analog zu Beispiel la aufgearbeitet.
Ausbeute : 95 g Schüttvolumen : 2, 5 ml/g Quellvolumen : 3, 0 ml/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 2, 6 mÄquiv/g Beispiel 5 : 0, 4 g eines Trägerharzes, dessen Herstellung nachstehend beschrieben ist, wurden mit 40 mg Glutathion in 32 ml Wasser 16 h unter Konstanthaltung von PH 6, 3 bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde abgesaugt und nach Beispiel 3C gewaschen und getrocknet. Es wurden 0, 46 g Harz erhalten, das 0, 9% N nach Dumas enthielt. Dem entspricht ein Gehalt von 6, 6% oder 30, 4 mg Glutathion das sind 76% der eingesetzten Menge.
Herstellung des Trägerharzes : In einem Rührgefäss werden 11 Benzin (Kp 100 bis 140 C) und 1 g Azoisobuttersäurenitril 1 h auf 90 C erwärmt. Dann wird bei 800C eine Lösung von 95 g Athylenglykoldimethacrylat, 5 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril innerhalb 3 h zugetropft
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und weitere 2 h bei der gleichen Temperatur gerührt. Das Polymere wird abgesaugt, mehrmals mit Benzol und
Petroläther (Kp 30 bis 500C) gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 96 g Schüttvolumen : 14 ml/g
Quellvolumen in Wasser : 18, 2 ml/g spezifische Oberfläche : 70 m2/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 0, 5 mÄquiv/g Beispiel 6 : Die Umsetzung eines wie nachstehend beschrieben hergestellten Trägerharzes mit
Penicillin-Acylase lieferte folgende Ergebnisse :
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung : 107 U Überstand und Waschlösungen : 28 U
Trägerharz nach der Umsetzung : 55 U das sind 51% der Ausgangsaktivität.
Herstellung des Trägerharzes : Eine Lösung von 62, 5 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 37, 5 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 150 ml Butylacetat und 11 Benzin (Kp 100 bis 1400C) wird unter Rühren 2 h bei 70 C, 2 h bei 750C und 1, 5 h bei 900C polymerisiert. Das Polymere wird abgesaugt, 24 h im Soxhlet-Extraktor mit Benzol extrahiert und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 77g
Schüttvolumen :7,3ml/g
Quellvolumen in Wasser : 8, 2 ml/g spezifische Oberfläche : 19, 4 m2/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 4, 0 mÄquiv/g.
Beispiel 7 : Die Umsetzung eines wie nachstehend beschrieben hergestellten Trägerharzes mit Penicillin-Acylase lieferte folgende Ergebnisse :
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung : 107 U Überstand und Waschlösungen : 51 U
Trägerharz nach der Umsetzung : 19 U das sind 18% der Ausgangsaktivität.
Herstellung des Trägerharzes : Eine Lösung von 90 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1, 0 g Azoisobuttersäurenitril in 200 ml Acetonitril wird in 1000 ml Benzin (Kp 100 bis 1400C), in dem 5 g eines Gemisches von Glycerin-mono-und-dioleat gelöst wurden, suspendiert. Das Reaktionsgemisch wird bis zur Bildung fester Perlen (etwa 2h) bei 600C und anschliessend 20h bei 650C polymerisiert. Das Polymerisat wird abfiltriert, dreimal in Benzol und dreimal in Petroläther (Kp 30 bis 50 C) aufgeschlämmt und im Vakuum bei 500C getrocknet.
Ausbeute : 94 g mittlerer Teilchendurchmesser : - 0, 35 mm Schüttvolumen : 2, 8 ml/g
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Beispiele für die Penicillinspaltung Beispiel 8 : 79g feuchte trägergebundene Penicillinacylase mit einer Aktivität von 687 U (NIPAB-Test), die durch Bindung von Penicillinacylase an ein Copolymerisat aus Äthylenglykoldimethacrylat und Maleinsäureanhydrid dargestellt worden ist, werden mit 129 g Penicillin G-Kalium (Reinheit 98%) in 2000 ml Wasser 9 h bei 380C gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsansatzes wird hiebei durch laufende Zugabe von Triäthylamin konstant bei 7, 8 gehalten. Die Aufnahme an Triäthylamin kommt mit Beendigung der Reaktion zum Stillstand.
Die trägergebundene Penicillinacylase wird abzentrifugiert oder abgesaugt, mit jeweils 200 ml Wasser und 0, 2 M-Phosphatpuffer PH 6, 5 nachgewaschen ; sie ist damit für einen neuen Ansatz bereit. Das Filtrat,
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einschliesslich der Waschlösungen wird im Vakuum auf 300 ml eingeengt. Die 6-APS wird durch Zugabe von halbkonzentrierter Salzsäure am isoelektrischen Punkt bei PH4, 3 in Gegenwart von 200 ml Methylisobutylketon ausgefällt. Nach einer Stunde wird abgesaugt, mit 200 ml Wasser und dann mit 200 ml Aceton nachgewaschen.
Die 6-APS wird im Vakuum bei 400C getrocknet ; Schmelzpunkt 2080C. Die Ausbeute an 6-APS beträgt 67, 8 g, das sind 90, 5% der Theorie. Die Reiheit beträgt 98%.
Beispiel 9 : 60 g feuchte, trägergebundene Penicillinacylase mit einer Aktivität von 673 U (NIPAB-Test), die durch Bindung von Penicillinacylase an ein Copolymerisat aus Tetraäthylenglykoldimethacrylat und Maleinsäureanhydrid hergestellt worden ist, werden mit 129 g Penicillin G-Kalium in 2000 ml Wasser 9 h bei 38 C gerührt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylamin auf 7, 8 konstant gehalten. Die weitere Aufarbeitung wird analog zu Beispiel 8 durchgeführt. Die Ausbeute an 6-APS beträgt 65, 3 g, das sind 87% der Theorie.
Vergleichsbeispiel : (Beispiel 3 der deutschen Offenlegungsschrift 1917057) : 10 g Äthylen-Maleinsäureanhydrid wurden in 1250 ml 0, 05 m Phosphatpuffer bei einem PH-Wert von 7, 6 gerührt. Dann wurden 100 ml l% ige Hydrazinhydratlösung zugesetzt und 2 min danach 17, 4 ml einer Lösung mit 1150 Einheiten Penicillinacylase (NIPAB-Test, Einheitendefinition wie vorher angegeben). Der Proteingehalt der Enzymlösung betrug 20 mg/ml. Die Mischung wurde 2 h in einem Eisbad gerührt und über Nacht im Kühlraum bei 50C gehalten. Das Präparat war gelartig und konnte nur durch Zentrifugieren abgetrennt werden. Nach dem
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Substanz erhalten. Die enzymatische Aktivität betrug 0, 06 Einheiten/g, das sind nur 0, 83% der eingesetzten Enzymaktivität.
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The invention relates to the use of a water-insoluble protein preparation, in particular an enzyme preparation, the protein being bound to a crosslinked copolymer which is composed of copolymerized units of
A) 0.1 to 50% by weight of a, ß-monoole6nically unsaturated dicarboxylic acid anhydrides with 4 to 9 carbon atoms and
B) 99.9 to 50% by weight di- and / or poly (meth) acrylates of di- and / or polyols, the crosslinked copolymers having bulk volumes of 2 to 20 ml / g, specific surface areas of 1 to
400 m2 / g and, after the saponification of the anhydride groups, contain 0.02 to 10% acid per gram, in order to carry out a catalysis by proteins, in particular enzymes
Reaction, such as
B. the hydrolytic cleavage of substrates, especially penicillins
Formation of 6-aminopenicillanic acid.
The covalent binding of substances to insoluble polymeric carriers has become increasingly important in recent years. The fixation of catalytically active compounds such. B. enzymes, as they can be easily separated in this form after the reaction has ended and reused several times.
As carriers with reactive groups, copolymers of maleic anhydride and
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Enzyme preparations obtained in this way are relatively difficult to filter and have soluble fractions, which leads to losses of bound enzyme (see E. Katchalski, Biochemistry 3, [1964], pp. 1905 to 1919).
Furthermore, copolymers of acrylamide and maleic acid have been described, which by subsequent
Heating can be converted into the anhydride form. These products are relatively weakly crosslinked, swell very strongly in water and have only moderate mechanical stability, which leads to abrasion losses when using these resins (see German Offenlegungsschrift 1908290).
In addition, highly crosslinked carrier polymers were made by copolymerizing maleic anhydride with
Divinyl ethers made. Because of the alternating type of copolymerization the monomers contain
Polymers have a very high proportion of anhydride groups - in each of the examples above 50% by weight maleic anhydride - which is determined by the molecular weight of the vinyl ether monomer and can therefore only be adapted to the respective intended use within relatively narrow limits (cf.
Offenlegungsschrift 2008996).
The German Offenlegungsschrift 1917057 describes very different carrier materials to which the enzyme penicillin acylase can be bound. Among other things, ethylene-maleic anhydride polymer resins, acrylic acid resins and also polysaccharides are given as possible carriers. Of these, the ethylene maleic anhydride polymer resins (EMA) are most comparable to the resins according to the invention. At
Reworking of example 3 of this laid-open specification became, as the comparative example shows, a gel-like
Enzyme preparation obtained, which after the cleavage of penicillins to 6-aminopenicillanic acid only by
Centrifugation can be separated. Preparations with such a gel structure are, however, not well suited for economic utilization in large-scale industrial processes.
In contrast, the insoluble enzyme preparations used according to the invention, which are powdery substances, e.g. B. be separated by a simple filtration or even simply by sedimentation. This makes the production process very simple and very inexpensive in terms of cost. When reworking, only a very poor yield of insoluble enzyme could be achieved. Only 9.6 units of insoluble enzyme were found in 160 ml of gel. Such a low specific activity enables enzymatic hydrolysis of only about 3 g of penicillin G-potassium within a reaction time of 9 hours. Accordingly, the use of the resins according to German Offenlegungsschrift 1917057 for the large-scale production of 6-APS has significant disadvantages.
In contrast to this, enzyme preparations with high specific activities can surprisingly be produced according to the invention. So are z. B. for the enzymatic cleavage of 129 g penicillin G potassium only 79 g moist enzyme resin is required.
According to the German Offenlegungsschrift 1945680 to be coupled with the enzyme polymers are copolymers of z. B. maleic anhydride with polyacrylates. However, all of these products are soluble in water or organic solvents. The products made using anhydrides of acrylic acid and methacrylic acid, which are described in German Offenlegungsschrift 1695662, are linear and only weakly crosslinked products.
The a, ß-monoolefinically unsaturated dicarboxylic acid anhydrides with 4 to 9 carbon atoms, preferably with 4 to 5 carbon atoms, required for the preparation of the copolymers include: maleic, itaconic or citraconic anhydride, in particular maleic anhydride. Mixtures of these anhydrides can also be used for the copolymerization.
The di- and / or polymethacrylates or di- and / or polyacrylates of di- and / or polyols to be used are derived from compounds having at least 2 alcoholic or phenolic compounds, preferably
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alcoholic OH groups or their reaction products with alkylene oxides with 2 to 8
Carbon atoms, preferably 2 to 4 carbon atoms or mixtures of these alkylene oxides, with an
1 mol of the compound bearing hydroxyl groups has 1 to 104, preferably 1 to 20 alkylene oxide units polymerized on. For example, alkylene oxides, ethylene oxide, propylene oxide, butylene oxide,
Trimethylene oxide, tetramethylene oxide, bis-chloromethyl-oxacyclobutane, styrene oxide, preferably called ethylene oxide and propylene oxide.
It is also entirely possible to use reaction products of compounds having at least 2 Zerewitinoff-active hydrogen atoms, which are not derived from alcohols or phenols, with the abovementioned alkylene oxides to prepare the di- and / or poly (meth) acrylates.
The di- and poly (meth) acrylates of di- and polyols are prepared by known methods, for example by reacting the di- and / or polyols with (meth) acrylic acid chloride in the presence of approximately equimolar
Amounts based on acid chloride, of tert. Amines such as triethylamine, at temperatures below 20 C, in
Presence of benzene obtained (see German Offenlegungsschrift 1907666).
As Di or. Polyols with at least 2 carbon atoms, preferably 2 to 12 carbon atoms, come, for. B. in question: ethylene glycol, propanediol-1, 2, propanediol-1, 3, butanediols especially butanediol-1,4,
Hexanediols, decanediols, glycerine, trimethylolpropane, pentaerythritol, sorbitol, sucrose and their
Reaction products with alkylene oxides, as indicated above. Poly-bis-chloromethyl-oxacyclobutane or polystyrene oxide are also suitable. Mixtures of diols and polyols can also be used.
Diacrylates or dimethacrylates of diols having 2 to 4 carbon atoms and / or are preferred
Reaction products of one mole of these diols with 1 to 20 moles of alkylene oxide with 2 to 4
Carbon atoms or trimethylolpropane trimethacrylate used.
The dimethacrylates of ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol,
Tetraethylene glycol or higher polyalkylene glycols with molecular weights up to 1000 or mixtures thereof.
If desired, besides the di- and / or poly (meth) acrylates, commonly used ones could also be used
Crosslinking agents with at least 2 non-conjugated double bonds, such as divinyl adipate, methylene bisacrylamide, triacryl formal or triallyl cyanurate in amounts of about 0.01 to 30% by weight of the
Monomer mixture are added.
Due to the possible range of variation in the composition of the monomer mixture, the hydrophilicity, crosslinking density, swellability and anhydride group content of the copolymers according to the invention can be adapted to the particular application within a very wide range.
The polymerization can e.g. B. be carried out as precipitation polymerization in an organic solvent, the polymers beginning to precipitate shortly after the start of the polymerization. All solvents which are inert towards anhydride groups are suitable per se. Particularly favorable solvents are aliphatic, cycloaliphatic and aromatic hydrocarbons and halogen-substituted hydrocarbons, alkyl aromatics and carboxylic acid esters.
Examples include: heptane, octane, isooctane, gasoline fractions with boiling points of about 60 to 200 ° C., cyclohexane, benzene, toluene, xylenes, chlorobenzene, dichlorobenzenes, ethyl acetate, butyl acetate.
The solvents should preferably have a boiling point of at least 60 ° C. and should be easily removable from the precipitation polymer in vacuo. For 1 part of the monomer mixture use about 2 to
50, preferably 5 to 20 parts by weight of the solvent. The properties of the copolymers, especially the bulk density and the specific surface area, are significantly influenced by the type and amount of solvent.
In many cases it is advantageous to use mixtures of the abovementioned solvents or to start the polymerization in a solvent for the polymer and to continuously add a precipitant for the polymer in the course of the polymerization. The precipitant can also be added in one or more portions at specific times. In addition, the monomer mixture can be fed into an initially charged amount of solvent together with a suitable initiator as a solution or without a solvent, so that a uniform, low monomer concentration is maintained during the polymerization.
By using (meth) acrylic monomers of different hydrophilicity and varying the polymerization conditions, products with swellability, density and specific surface area with good mechanical stability can be produced within a very wide range.
The copolymers can also be prepared by suspension polymerization. The most common type of bead polymerization, in which the monomers are suspended in water, optionally with the addition of an organic solvent, can only be used with little success in this case, since the anhydride hydrolyzes very quickly, and the dicarboxylic acid formed mainly passes into the water phase and is incorporated into the polymer only in small amounts. The suspension polymerization is therefore expediently carried out in an organic medium. The monomers and the initiator are immiscible with paraffins, inert to anhydride solvents such. B.
Acetonitrile, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide or hexamethylphosphoric acid triamide dissolved and mostly distributed in the continuous phase with the addition of dispersants. As a coherent phase are particularly suitable
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Paraffinic hydrocarbons such as hexane, heptane, octane and higher homologues, cycloaliphatics such as cyclohexane and paraffin mixtures such as gasoline fractions or paraffin oil. The volume ratio, contiguous phase:
Monomer phase is 1: 1 to 10: 1, preferably 2: 1 to 5: 1.
To stabilize the suspension, glycerine mono- and dioleates and mixtures of these compounds, sorbitan mono- and trioleates or stearates, polyethylene glycol monoethers with stearyl or lauryl alcohol or nonylphenol, polyethylene glycol monoesters with oleic acid, stearic acid and others can be used
Fatty acids with more than 10 carbon atoms and the sodium salt of sulfosuccinic acid dioctyl ester can be used.
These substances are used in amounts of preferably 0.1 to 10%, based on the monomer mixture, and are generally dissolved in the hydrocarbon phase. The particle size of the suspension polymers can, in addition to increasing the stirring speed, by adding 0.1 to 2%, based on monomers, of a further surface-active substance, e.g. B. an alkyl sulfonate can be reduced.
The polymerization is triggered by radical initiators. Suitable initiators are e.g. B.
Azo compounds or per compounds. The azo compound most commonly used for polymerization solution is azoisobutyronitrile. Mainly diacyl peroxides such as dibenzoyl peroxide or percarbonates such as diisopropyl and dicyclohexyl percarbonate come into consideration as per compounds, but dialkyl peroxides, hydroperoxides and redox systems effective in organic solvents can also be used for initiation.
The initiators are added in amounts of 0.01 to 10%, preferably 0.1 to 3%, based on the amount by weight of the monomer mixture.
The polymerization is carried out at temperatures of about 20 to 200 ° C., preferably 50 to 100 ° C., depending on the rate of decomposition of the initiators and mostly below the boiling point of the solvent and, in the case of bead polymerizations, below the mixing temperature of the two phases. In addition, it is usually advantageous to polymerize in an inert atmosphere in the absence of oxygen.
The copolymers obtained by precipitation polymerization are colorless to pale yellow colored, powdery substances with bulk volumes of 1.5 to 30 ml / g, preferably 2 to 20 ml / g, and specific surfaces of 0.1 to 500 m2 / g, preferably 1 to 400 m2fg. The carboxyl group content, determined titrimetrically after the saponification of the anhydride groups, is from 0.02 to 10 meq / g, preferably from 0.4 to 4 meq / g. The suspension polymers are white or slightly colored pearls, which in some cases can be irregularly shaped and have a diameter of 0.03 to 1 mm, preferably 0.05 to 0.5 mm, and bulk volumes of about 1.4 to 8 ml / g , preferably 1.4 to 5 ml / g.
Their carboxyl group content determined after hydrolysis of the anhydride groups is from 0.02 to 10 meq / g, preferably from 0.4 to 4 meq / g.
The copolymers contain the copolymerized units in a randomly distributed manner. Because of their high crosslinking density, the copolymers are insoluble in all solvents. Molecular weights cannot therefore be determined.
The copolymers can swell in water to 1.1 to 2.5 times their bulk volume. They are particularly suitable as carrier resins for fixing substances which can react with the anhydride groups of the copolymers.
The carrier resins are introduced directly into the aqueous solution of the substance to be bound, preferably in the aqueous solution of a protein, at temperatures between 0 and 30 ° C., the pH value being kept constant.
If proteins should be bound to the copolymers, it is expedient to work with one
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5in question.
In contrast to the experience of the literature with other resins, according to which the reaction is carried out in buffered solutions, the yields of bound enzyme with the resins described above were the better, the lower the salt content of the solutions.
The weight ratio of bound substance, for example protein or peptide to carrier resin, can be varied within wide limits and adapted to the later intended use. Good yields are obtained at a ratio of 1 part by weight of protein to 4 to 10 parts by weight of polymeric carrier. However, the optimum ratios depend both on the composition and structure of the polymer and on the type of protein. In the case of numerous enzymes, it is advisable to add stabilizers to the enzyme solution.
As such, polyethylene glycols or non-ionic wetting agents can be used to reduce denaturation on surfaces, as well as the known SH reagents or metal ions in the case of special enzymes.
The necessary reaction time depends on the type of polymer. The reaction is normally complete after 20 hours at room temperature. At 40C the reaction runs better a little longer. At
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preparative approaches, the approach is not earlier than 2 h after the addition of alkali by the
PH status canceled. The polymer with the bound protein is then sucked off or centrifuged off and the residue is washed with salt solutions of high ionic strength, for example 1 M sodium chloride solution, and then with a buffer in which the enzyme is stable. When washing with solutions higher
Salt concentration, ionically bound protein is detached from the carrier.
To assess the success of protein binding, the enzymatic activity of enzymes in both the
Polymers as well as in the residual solution and in the wash water. For proteins without a specific
Effect was determined by the nitrogen content in the polymer according to Kjeldahl. The yields in the
Protein formation is between 10 and over 90%. If one looks at enzymatic activity, it is in some
In some cases it is advantageous not to use too large an excess of polymer material, as otherwise the protein will be completely bound, but the activity will suffer as a result.
The carrier resins are suitable for binding all substances which carry a functional group which is capable of reacting with the anhydride group of the polymer. In the case of proteins and peptides, these are mainly the terminal amino groups of the lysine and the free amino groups of the peptide chain ends.
Peptides and proteins bound to carriers are of great scientific and technical importance.
The enzymes, which are expensive and unstable in most cases, are substantially stabilized by their binding to the resin. In addition, the easy and complete recovery of the enzyme resin allows multiple
Use over long periods of time.
For example, the following proteins can be fixed to the copolymers:
Enzymes: hydrolases such as proteases, for example trypsin, chymotrypsin, papain, elastase; Amidases, for example asparaginase, glutaminase, urease; Acyl transferases, e.g. penicillin acylase; Lyases, for example hyaluronidase.
Other proteins such as plasma components, globulins (antibodies).
Polypeptides such as kallikrein inhibitor or insulin. Amino acids like lysine or alanine.
The proteins to be used are generally obtained from bacteria, fungi, actinomycetes or from animal material.
Some examples of technically important reactions with bound enzymes are the hydrolytic degradation of starch by covalently bound amylase, the clarification of fruit juices and the like. a. through bound pectinase, the production of enzymatically degraded protein hydrolysates, the hydrolysis of penicillins to 6-aminopenicillanic acid. In addition, bound enzymes, peptides and the like were also used. a. used for the isolation of inhibitors by affinity chromatography and vice versa bound inhibitors for the isolation of enzymes.
Other uses are in the medical field. An example is the use of bound L-asparaginase or urease in an extracorporeal circuit to lower the asparagine or urease.
Urea level in the blood.
These and numerous other uses have been described in the literature. See z. B. the abstracts in Chem. Eng. News v. [15. 2. 1971], p. 86 and Rev. Pure et al. Appl. Chem. 21.83 [1971].
An important example of the use of protein preparations is the cleavage of penicillins with the aid of penicillin acylase, which is bound to the copolymers used according to the invention.
For the production of 6-aminopenicillanic acid (6APS) penicillins can with the help of acylases from microorganisms such. B. bacteria, especially E. coli, Erwinia or actinomycetes such as Streptomyces, Micromonospora, Nocardia and fungi such as Fusarium and yeast are cleaved.
According to the method of the German patent specification No. 1111778 for the production of 6-APS, a penicillin G solution is mixed with a bacterial sludge which contains the enzyme penicillin acylase (E.C. 3. 5. 1. 11). As a result of the action of the enzyme, the carbonamide grouping on the side of the penicillin is split off without the β-lactam ring being opened.
The use of suspensions of microorganisms has the following disadvantages: a) In addition to the intracellular penicillin acylase, the suspension of microorganisms contains others
Proteins and enzymes as well as components from the nutrient medium or their conversion products that have arisen during fermentation. These impurities cannot be completely washed out of the crystallized 6-APS during work-up. b) The suspension of microorganisms can only be used once for economic reasons. c) The suspension of microorganisms contains impurities and other enzymes which inactivate penicillin and / or 6-APS by opening the ß-lactam ring. d) The suspension contains only small amounts of penicillin acylase. The use of more enzyme material, e.g.
B. to achieve short reaction times and thus better 6-APS yields with a lower content of foreign products is practically not possible. e) The operating yields of 6-APS depend on the fluctuating penicillin acylase formation in the respective fermentation batches. f) The complete separation of suspended microorganisms requires when working up the
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6-APS approaches an additional work process that causes a loss of yield. For the removal of proteinaceous contaminants that can cause allergenic reactions, there are others
Cleaning steps necessary (British patents No. 1, 169, 696; No. 1, 078, 847 and No. 1, 114, 311).
All the disadvantages mentioned are avoided if, instead of a suspension of microorganisms, a penicillin acylase is used, which is obtained by covalent bonding to a water-insoluble carrier.
Attempts to produce 6-APS by enzymatic cleavage of penicillins with carrier-bound penicillin acylase are known (see German Offenlegungsschriften 1917057 and 1907365), but could not be converted to an industrial scale. The reasons for this lie on the one hand in the mechanical properties of the carrier material used, which leads to high abrasion, on the other hand, only low specific activities of carrier-bound penicillin acylase could be achieved with moderate process yields.
Also an insoluble enzyme used according to an unpublished proposal that is produced by covalent
Binding of penicillin acylase to a copolymer of acrylamide, N, N'-methylenebisacrylamide and maleic anhydride has disadvantages for the cleavage of penicillin on an industrial scale, since it swells a lot and is not mechanically stable. These disadvantages affect the repeated reuse of the resin produced in this way on an industrial scale.
It has now been found that the disadvantages mentioned are avoided if a penicillin acylase bound to a water-insoluble carrier according to the invention is used to cleave penicillins.
The cleavage of penicillins with carrier-bound penicillin acylase can be carried out easily and also on an industrial scale. The carrier-bound insoluble enzyme is in a solution with 75,000 to 150,000 IU / ml penicillin, e.g. B. penicillin G or penicillin V suspended. The enzymatic cleavage is perverted at a constant in the range from 6 to 9, primarily in the range of the pH optimum of the respectively bound
Penicillin acylase e.g. B. carried out at PH 7, 8. To neutralize the cleaved acyl radical z. B. the
Phenylacetic acid or phenoxyacetic acid, aqueous alkali solutions are used, for. B. potassium or sodium hydroxide solution or organic amines, preferably triethylamine.
From the consumption of the base is the
Reaction rate and the completion of the cleavage can be seen. The penicillin acylase catalyzes both the cleavage of penicillin to 6-APS and the resynthesis of the penicillins from the cleavage products. The
Equilibrium depends on the pH value of the medium.
At lower pH values, the equilibrium shifts in favor of the starting product penicillin.
This can be used for the transacylation of penicillins in the presence of other acyl residues or for the synthesis of penicillins from 6-APS.
The reaction temperature of the enzymatic cleavage is preferably 38 C. At lower temperatures, the activity of the enzyme decreases. If the split z. B. carried out at 25 C, twice as much enzyme must be used as at 38 C if the same reaction times are to be achieved.
At a given temperature, the reaction rate depends on the specific activity and the amount of the carrier-bound penicillin acylase. In addition, the rate of reaction depends on the ratio of the amount of carrier-bound penicillin acylase to the concentration of penicillin.
A cleavage approach with a concentration of 100,000 lU / ml (1 mg penicillin G potassium corresponds to 1598 IU (international units)) penicillin G potassium is completely hydrolyzed to 6-APS and phenylacetic acid after 10 h at pH 7, 8 and 380e, if 3. 10s units of penicillin G are used per unit of penicillin acylase (one enzyme unit (U) is defined as the activity which hydrolyzes ljuMol (6-nitro-3 (phenylacetyl) aminobenzoic acid (NIPAB) per minute at 25 C) dry enzyme resin is only 0.5 to 1% of the reaction mixture.If 2 units of penicillin acylase are used per 105 IU penicillin G., complete cleavage takes only 2 hours.
There are also shorter reaction times when using even more bound penicillin acylase, when using z. B. of carrier-bound penicillin acylase from crystallized enzyme, possible.
The carrier-bound penicillin acylase used according to the invention can be produced in the shape of a pearl and is characterized by high mechanical stability and a comparatively high specific weight.
With multiple use, these properties enable use over long periods of time. These properties also enable intensive stirring and simple separation by centrifugation without loss due to mechanical stress, e.g. B. by abrasion. Clear filtrates are thus obtained in batch processes, which can be further processed without additional filtration to obtain the end product, the 6-APS. The carrier-bound penicillin acylase produced according to the invention also allows quick and simple filtration, since the mechanical stability does not result in any fine components clogging the filter surface.
The resin offers further advantages in the batch process because of the comparatively high specific weight, which causes the resin to settle quickly so that the excess solution can easily be siphoned off after the process has ended. This results in a simplification of the procedure, since the resin remains in the reaction vessel during the batch process and can be used directly for the next cleavage.
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The properties of the polymer also allow the use of the carrier-bound penicillin acylase not only in batch processes, but also in continuous processes such. B. in reaction columns, the pearl shape allowing the required high flow rate.
The 6-APS formed in the enzymatic cleavage is obtained after the enzyme resin has been separated off from the reaction solution by known processes (see, for example, German patent specification No. 1, 111, 778) and crystallized at PH 4, 3. When penicillin is cleaved with the carrier-bound penicillin acylase produced according to the invention, significantly higher yields of 6-APS are obtained than when using E. coli sludge but also higher yields than when using the enzyme resin according to Austrian Patent No. 319471. As shown in Examples 8 and 9, 6-APS was obtained in a yield of about 90% of theory. Th. Isolated. The 6-APS thus produced does not contain any proteins as an impurity.
The 6-APS produced in this way also contains practically no polymers which can be produced in other processes. Allergenic side effects that are attributed to proteins or polymers are excluded with the 6-APS produced according to the invention.
The carrier-bound penicillin acylase allows multiple use over a long period of time. Even after this, the enzyme activity is still practically completely retained.
The boiling points given in the following examples were determined at normal pressure.
Example 1: The enzymatic activity of a penicillin acylase, the preparation of which is described below, was colorimetrically or titrimetrically with 0.002 M-6-nitro-3- (N-phenylacetyl) -aminobenzoic acid (NIPAB) as substrate at pH 7.5 and 25 C measured. The molar extinction coefficient of the resulting
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per min.
Preparation of the penicillin acylase: a) 80 g of tetraethylene glycol dimethacrylate, 20 g of maleic anhydride and 1 g of azoisobutyronitrile are dissolved in 1 1 benzene and heated to 60 ° C. for 4 hours while stirring. Then give 1 g
Azoisobutyronitrile and 200 ml of gasoline (boiling point 100 to 140 ° C.) and polymerized for a further 5 h
70 C. The powdery polymer is suctioned off, slurried once in benzene and three times in petroleum ether (boiling point 30 to 50 C) and dried in vacuo.
Yield: 94 g bulk volume: 3.5 ml / g
Swell volume in water: 4.7 ml / g specific surface area: 5 m2 / g
Acid content after saponification of the anhydride groups: 3.5 meq / g b) 1 g of the carrier resin prepared according to a) is dissolved in 30 ml of an aqueous solution of 132 U
Penicillin acylase (specific activity 1 U / mg protein (biuret)) suspended. While keeping the pH constant at 6.3 by adding 1N sodium hydroxide solution with a pH stat, the suspension is stirred at 25 ° C. for 20 h. It is then suctioned off through a G3 glass frit and the resin is washed with it
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without sodium chloride. Further washing does not change the activity of the resin.
Enzymatic activities (NIPAB test)
Starting solution: 132 U supernatant + wash water: 12 U
Resin after the reaction: 86 U that is 65% of the initial activity.
Example 2: Enzymatic activity of an asparaginase bound to the carrier resin (asparagine hydrolysis)
Initial solution: 21000 U survived after implementation: 3360 U
Carrier resin after the reaction: 3910 U that is 19% of the initial activity.
Preparation of the asparaginase bound to the carrier resin: a) A solution of 90 g of ethylene glycol dimethacrylate, 10 g of maleic anhydride and 1 g
Azoisobutyronitrile in 11-benzene is initially polymerized at 60 ° C. with stirring. After 4 hours, 200 ml of gasoline (boiling point 100 to 140) and 1 g of azoisobutyronitrile are added, and polymerization is continued for 2 hours at 70 ° C. and 2 hours at 80 ° C. The polymer is then suctioned off and washed thoroughly with it
Petroleum ether (bp 30 to 500C) and dries in vacuo.
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Yield: 97 g bulk volume: 6.4 ml / g
Swell volume in water: 8.0 ml / g specific surface area: 298 m2 / g
Acid content after saponification of the anhydride groups: 1.5 meq / g b) 6 g of the carrier resin obtained according to a) were reacted with 590 U asparaginase in 165 ml of water.
Result :
Enzymatic activities (NIPAB test)
Starting solution: 590 U supernatant + washing water: 26 U
Carrier resin after conversion: 352 U that is 60% of the initial activity.
Example 3:
A) 1 g of a carrier resin, the preparation of which is described below, were added to a solution of
50 mg of unspecific elastase with an enzymatic activity of 139 U in 32 ml of water. The batch was stirred for 16 h at room temperature, the pH being kept constant at 5.8. After the reaction, the resin was suctioned off and 50 ml of 1
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M-phosphate buffer PH 7, 5 washed.
Result :
Starting solution: 139 U supernatant and washing solutions: 51 U bound to the carrier resin: 15 U that is 11% of the starting activity.
Here, the enzymatic activity was titrimetrically with casein as substrate (concentration
11.9 mg / ml) at pH 8, 0 and 250C. 1 unit (E) corresponds to a consumption of 1. Mol
Potassium hydroxide per min.
B) 1 g of the carrier resin was added to a solution of 50 mg of urease crystallized (Merck) in 32 ml of water. The batch was stirred at room temperature for 16 hours, the pH being kept constant at 6.3. Work-up was carried out as indicated in Example Ib.
Result :
Starting solution: 5013 U supernatant and washing solutions: 1397 U bound to the carrier resin: 1405 U that is 28% of the starting activity.
The enzymatic activity of urease was titrimetrically with 0.17 M-urea as substrate
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min splits.
C) 0.4 g of the carrier resin were reacted with 40 mg of glutathione in reduced form *) in 32 ml of water for 16 hours at a constant pH of 6.3 at room temperature. The resin was filtered off with suction and washed with a solution of 1 N sodium chloride in 0.05 M phosphate buffer PET 7.5 and then with water. After drying the resin in vacuo at 100 ° C. over phosphorus pentoxide, 0.47 g were obtained. The nitrogen determination according to Dumas gave a value of 1.1% N, which corresponds to a content of 8.04% or 37.8 mg of glutathione. That is 94% of the amount of glutathione used.
*) Note: In biochemical reactions, glutathione is a carrier in redox processes. Here, the glutathione is converted into the disulfide form. The glutathione preparation listed here can therefore be used as a reducing agent for sensitive biochemicals, in particular for enzymes in which the disulfide groups are to be converted into SH groups.
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Production of the carrier resin: The copolymerization of 90 g of diethylene glycol dimethacrylate with 10 g of maleic anhydride under the conditions of Example 2a gives:
Yield: 96 g bulk volume: 5.5 ml / g swelling volume in water: 6.7 ml / g specific surface area: 9.2 m2 / g
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Example 4:
A) The implementation of a carrier resin, the production of which is described below, with
Penicillin acylase analogous to example lb gives the following results:
Enzymatic activities (NIPAB test)
Starting solution: 123 U supernatant + washing solutions: 13 U
Carrier resin after the reaction: 79 U that is 64% of the initial activity.
B) 0.4 g of the carrier resin were added to a solution of 40 mg of trypsin in 32 ml of 0.01
M calcium chloride solution given and 16 h at room temperature while keeping the
PH value to 6.3 stirred. The resin was suctioned off and washed according to Example 1b.
Enzymatic activity in the starting solution: 44 U in the supernatant and washing solutions: 5, 2 U bound to the resin: 8, 3 U that is 19% of the starting activity.
The enzymatic activity was determined colorimetrically according to Tuppy, Z. Physiol. Chem. 329 [1962] 278, measured with benzoyl-arginine-p-nitroanilide (BAPNA) as substrate. 1 unit (U) corresponds to
Cleavage of 1. mole of substrate at 250C and PH 7, 8.
C) 1 g of the carrier resin was added to a solution of 50 mg of unspecific elastase in 32 ml of water. The suspension was left on for 16 h at room temperature while keeping the pH constant
5, 8 stirred. The work-up and titrimetric determination of the enzyme activities with casein as
Substrate was carried out as indicated in Example 3A.
Enzymatic activity in the starting solution: 139 U in the supernatant and washing solutions: 32 U bound to the resin: 36 U that is 26% of the starting activity.
Preparation of the carrier resin: 80 g of tetraethylene glycol dimethacrylate, 20 g of maleic anhydride and
1 g of Porofor N is dissolved in 1 liter of benzene and polymerized for 16 hours at 80 ° C. with slow stirring. The polymer is worked up analogously to Example la.
Yield: 95 g bulk volume: 2.5 ml / g swelling volume: 3.0 ml / g
Acid content after saponification of the anhydride groups: 2.6 meq / g Example 5: 0.4 g of a carrier resin, the preparation of which is described below, was stirred with 40 mg of glutathione in 32 ml of water for 16 hours while keeping the pH 6.3 constant at room temperature. The resin was filtered off with suction and washed and dried according to Example 3C. 0.46 g of resin were obtained which contained 0.9% N according to Dumas. This corresponds to a level of 6, 6% or 30, 4 mg glutathione that is 76% of the amount used.
Production of the carrier resin: 11 gasoline (boiling point 100 to 140 ° C.) and 1 g of azoisobutyronitrile are heated to 90 ° C. for 1 hour in a stirred vessel. A solution of 95 g of ethylene glycol dimethacrylate, 5 g of maleic anhydride and 1 g of azoisobutyronitrile is then added dropwise at 80 ° C. over the course of 3 hours
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and stirred for a further 2 h at the same temperature. The polymer is suctioned off, several times with benzene and
Petroleum ether (boiling point 30 to 50 ° C.) and dried in vacuo.
Yield: 96 g bulk volume: 14 ml / g
Swell volume in water: 18.2 ml / g specific surface area: 70 m2 / g
Acid content after saponification of the anhydride groups: 0.5 meq / g Example 6: The reaction of a carrier resin prepared as described below with
Penicillin acylase gave the following results:
Enzymatic activities (NIPAB test)
Starting solution: 107 U supernatant and washing solutions: 28 U
Carrier resin after the reaction: 55 U that is 51% of the initial activity.
Preparation of the carrier resin: A solution of 62.5 g of tetraethylene glycol dimethacrylate, 37.5 g of maleic anhydride and 1 g of azoisobutyronitrile in 150 ml of butyl acetate and 11 gasoline (boiling point 100 to 1400C) is stirred for 2 hours at 70 C, 2 hours at 750C and 1 , Polymerized for 5 h at 900C. The polymer is filtered off with suction, extracted with benzene in a Soxhlet extractor for 24 hours and dried in vacuo.
Yield: 77g
Bulk volume: 7.3 ml / g
Swell volume in water: 8.2 ml / g specific surface area: 19.4 m2 / g
Acid content after saponification of the anhydride groups: 4.0 meq / g.
Example 7 The reaction of a carrier resin prepared as described below with penicillin acylase gave the following results:
Enzymatic activities (NIPAB test)
Starting solution: 107 U supernatant and washing solutions: 51 U
Carrier resin after the reaction: 19 U that is 18% of the initial activity.
Preparation of the carrier resin: A solution of 90 g of tetraethylene glycol dimethacrylate, 10 g of maleic anhydride and 1.0 g of azoisobutyronitrile in 200 ml of acetonitrile is poured into 1000 ml of gasoline (boiling point 100 to 1400C) in which 5 g of a mixture of glycerol mono- and dioleate were dissolved, suspended. The reaction mixture is polymerized until solid beads are formed (about 2 hours) at 60 ° C. and then for 20 hours at 650 ° C. The polymer is filtered off, slurried three times in benzene and three times in petroleum ether (boiling point 30 to 50 ° C.) and dried in vacuo at 50 ° C.
Yield: 94 g mean particle diameter: - 0.35 mm bulk volume: 2.8 ml / g
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Examples of penicillin cleavage Example 8: 79 g of moist, carrier-bound penicillin acylase with an activity of 687 U (NIPAB test), which has been produced by binding penicillin acylase to a copolymer of ethylene glycol dimethacrylate and maleic anhydride, are obtained with 129 g of penicillin G potassium (purity 98 %) in 2000 ml of water for 9 h at 380C. The pH of the reaction mixture is kept constant at 7.8 by continuously adding triethylamine. The uptake of triethylamine comes to a standstill when the reaction has ended.
The carrier-bound penicillin acylase is centrifuged off or suctioned off, washed with 200 ml of water and 0.2 M phosphate buffer PH 6.5; she is ready for a new approach. The filtrate,
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including the washing solutions, it is concentrated to 300 ml in vacuo. The 6-APS is precipitated by adding half-concentrated hydrochloric acid at the isoelectric point at pH4.3 in the presence of 200 ml of methyl isobutyl ketone. After one hour, it is suctioned off, washed with 200 ml of water and then with 200 ml of acetone.
The 6-APS is dried in vacuo at 40 ° C .; Melting point 2080C. The yield of 6-APS is 67.8 g, that is 90.5% of theory. The purity is 98%.
Example 9: 60 g of moist, carrier-bound penicillin acylase with an activity of 673 U (NIPAB test), which has been produced by binding penicillin acylase to a copolymer of tetraethylene glycol dimethacrylate and maleic anhydride, are mixed with 129 g of penicillin G potassium in 2000 ml of water 9 Stirred at 38 C h. The pH is kept constant at 7.8 by adding triethylamine. The further work-up is carried out analogously to Example 8. The yield of 6-APS is 65.3 g, that is 87% of theory.
Comparative example: (Example 3 of German Offenlegungsschrift 1917057): 10 g of ethylene maleic anhydride were stirred in 1250 ml of 0.05 M phosphate buffer at a pH of 7.6. 100 ml of 1% strength hydrazine hydrate solution were then added and, 2 min thereafter, 17.4 ml of a solution containing 1150 units of penicillin acylase (NIPAB test, unit definition as given above). The protein content of the enzyme solution was 20 mg / ml. The mixture was stirred in an ice bath for 2 h and kept at 50 ° C. in the cold room overnight. The preparation was gel-like and could only be separated by centrifugation. After this
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Preserve substance. The enzymatic activity was 0.06 units / g, that is only 0.83% of the enzyme activity used.