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Verfahren zur Herstellung eines lebenden Mumpsvirus
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Tod führen können.
Allgemein betrachtet betrifft die Erfindung die Anpassung und Fortpflanzung von Mumpsvirus in
Gewebekulturen, welche auf bereits Embryonen enthaltenden Hühnereiern hergestellt werden. Insbe- sondere ist die Erfindung gerichtet auf die Entwicklung eines lebenden, verdünnten Mumpsvirus-Impf- stoffes, welche einem Reihen Durchgang durch eine Hühnerembryo-Gewebekultur folgt. Dieses Ver- fahren umfasst die nachfolgenden Stufen :
A. Die Isolierung des virulenten Virus in irgendeiner Art von Kulturzellen oder Embryonen ent- haltenden Hühnereiern und seine Anpassung an die Hühnerembryo-Gewebekultur ;
B. die Entwicklung des verdünnten, lebenden Virus durch eine Vielzahl von Reihen-Durchgängen in Hühnerembryo-Gewebekulturen und
C. die Herstellung des Impfstoffes aus diesem verdünnten lebenden Virus. Diese Stufen werden nachfolgend getrennt erläutert.
A. Isolierung und Anpassung des virulenten Virus.
Die Isolierung und Anpassung des Mumpsvirus kann in einer Hühnerembryo-Gewebekultur erreicht werden unter Verwendung von klinischem Material (z. B. einem Rachenabstrich) oder von Virus, welches zuvor in Embryonen enthaltenden Hühnereiern fortgepflanzt wurde. Die Inkubation der infizierten Kulturen kann bei 30 bis 340 C (am günstigsten 320 C) oder bei 35 bis 380 C (am günstigsten bei 360 C) ausgeführt werden.
Ein Beispiel für Isolierungsverfahrensweisen ist folgendes :
Das Mumpsvirus wurde in Embryonen enthaltenden Hühnereiern aus klinischem Material isoliert, d. h. von Personen, welche an Mumps erkrankt waren.
B. Entwicklung des verdünnten Impfstoffes aus lebendem Mumpsvirus.
Das Virus, welches gemäss A als Mumpsvirus festgestellt ist, wird Glasflaschen zugefügt, welche Hühnerembryo-Gewebekulturen enthalten, die aus zerkleinerten und mit Trypsin versehenen, annähernd 10 Tage alten Hühnerembryos hergestellt sind. Das Kulturmedium kann jedes sein, welches das Zellwachstum unterstützt und es kann beispielsweise das bekannte "Medium 199" sein, welchem Kälberserum zugefügt worden ist. Nach Zusatz des Virus werden die infizierten Zellenkulturen in aufeinanderfolgenden Durchgängen bei 30 bis 380 C während wechselnder Zeitspannen bebrütet und während dieser Zeit repliziert sich das Virus und wird verdünnt. Dann werden die virushaitigen Flüssigkeiten gewonnen und in gefrorenem Zustand oder bei einer andern tiefen Temperatur, welche die Infektionsfähigkeit des Mittels erhält, gelagert.
Die oben erwähnten Reihen-Durchgänge werden unter Verwendung von verdünntem Impfmaterial ausgeführt und mehrfache Ernten werden in verschiedenen Zeitspannen gesammelt. Man führt Bestimmungen der Ansteckungsfähigkeit in "HeLa", GrUnaffen-Nierengewebe oder Hühnerembryo-Gewebe- kulturen aus.
C. Herstellung des Impfstoffes.
Es hat sich gezeigt, dass das nach diesem wiederholten Reihen-Durchgang gewonnene Mumpsvirus für Affen und Nagetiere nicht pathogen ist, nur geringe, wenn überhaupt klinische Reaktion bei menschlichen Empfängern bewirkt und einen bedeutenden Antikörperspiegel hervorruft. Die Ansteckungsfähigkeit des Virus wird mittels eines geeigneten Stabilisators, wie Sucrose, menschlichem Eiweiss, Glutamin, Phosphat oder Mischungen davon stabilisiert. Nach der Titration zur Bestimmung seiner Wirksamkeit wird das angesammelte Virus unterteilt und in Ampullen zum Gebrauch abgefüllt. Das Produkt kann in gefrorenem Zustand gelagert und verteilt werden oder vorzugsweise aus dem gefrorenem Zustand getrocknet und von Feuchtigkeit freigehalten werden.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung :
Beispiel 1 : Das Impfmaterial wird nach der oben unter A beschriebenen Verfahrensweise erhalten.
9 bis 11 Tage alte Hühnerembryos werden nach dem Entfernen der Köpfe und Extremitäten unter aseptischen Bedingungen fein zerkleinert und das zerkleinerte Gewebe unter mehrfachem Wechsel von 'Hanks'BSS" (Hanks, T. H. und Wallace, R. E., Proc. Soc. Exper. Biol. Med., 71, S. 146 bis 200 z gewaschen. Das gewaschene Gewebe wird bei 360 C mit Trypsin versehen unter Verwendung von 0, 251o Trypsin"Difco 1 : 250"in Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan-Kochsalz-Puffer während 2 bis 3 h. Die Trypsin-Zellen-Suspension wird durch zwei Lagen steriler Gaze gewonnen und bei L500 Umdr/min 5 min zentrifugiert. Zusammengewachsene Zellen werden im Kulturmedium zur wei- : eren Behandlung neuerlich suspendiert.
Das Kulturmedium besteht aus Medium 199, welches Wo Agamma-Kälberserum (30 min auf 560 C erhitzt) und 50 mcg/ml Neomycin enthält. Die Flaschen-
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Process for producing a live mumps virus
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Can lead to death.
In general terms, the invention relates to adaptation and reproduction of mumps virus in
Tissue cultures that are produced on chicken eggs that already contain embryos. In particular, the invention is directed to the development of a live, dilute mumps virus vaccine which follows a serial pass through a chick embryo tissue culture. This process comprises the following stages:
A. Isolation of the virulent virus in any type of cultured cell or embryo-containing chicken egg and its adaptation to chicken embryo tissue culture;
B. the development of the diluted, live virus through a variety of serial passages in chick embryo tissue cultures and
C. the manufacture of the vaccine from this diluted live virus. These stages are explained separately below.
A. Isolation and adaptation of the virulent virus.
Isolation and adaptation of the mumps virus can be accomplished in chicken embryo tissue culture using clinical material (e.g., a throat swab) or virus previously propagated in embryo-containing chicken eggs. The incubation of the infected cultures can be carried out at 30 to 340 C (best 320 C) or at 35 to 380 C (best at 360 C).
An example of isolation practices is as follows:
The mumps virus has been isolated from clinical material in chicken eggs containing embryos; H. of people who were sick with mumps.
B. Development of the diluted vaccine from live mumps virus.
The virus, which is found to be mumps virus according to A, is added to glass bottles which contain chicken embryo tissue cultures which have been produced from crushed and trypsinized chicken embryos approximately 10 days old. The culture medium can be any which supports cell growth and it can be, for example, the known "medium 199" to which calf serum has been added. After the virus has been added, the infected cell cultures are incubated in successive rounds at 30 to 380 C for varying periods of time, during which time the virus replicates and is diluted. Then the virus-containing fluids are obtained and stored in a frozen state or at another low temperature that maintains the infectiousness of the agent.
The serial runs mentioned above are carried out using dilute inoculum and multiple harvests are collected at different times. Determinations of the infectiousness are carried out in "HeLa", green monkey kidney tissue or chicken embryo tissue cultures.
C. Manufacture of the vaccine.
The mumps virus recovered after this repeated series run has been shown to be non-pathogenic to monkeys and rodents, to produce little, if any, clinical response in human recipients, and to produce significant levels of antibodies. The infectiousness of the virus is stabilized by means of a suitable stabilizer, such as sucrose, human protein, glutamine, phosphate or mixtures thereof. After titration to determine its effectiveness, the accumulated virus is divided and filled into ampoules for use. The product can be stored and distributed in the frozen state or, preferably, dried from the frozen state and kept free of moisture.
The following examples serve to explain:
Example 1: The inoculum is obtained according to the procedure described under A above.
9 to 11 day old chicken embryos are finely comminuted after the heads and extremities have been removed under aseptic conditions and the comminuted tissue is changed repeatedly from 'Hanks' BSS "(Hanks, TH and Wallace, RE, Proc. Soc. Exper. Biol. Med ., 71, p. 146 to 200. The washed fabric is trypsinized at 360 ° C. using 0.2510 trypsin "Difco 1: 250" in tris (hydroxymethyl) aminomethane saline buffer for 2 to 3 hours The trypsin cell suspension is obtained through two layers of sterile gauze and centrifuged at L500 rpm for 5 min. Cells that have grown together are resuspended in the culture medium for further treatment.
The culture medium consists of medium 199, which contains Wo agamma calf serum (heated to 560 ° C. for 30 min) and 50 mcg / ml neomycin. The bottles-
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