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Verfahren zur Herstellung von Gibberellin-Säure
EMI1.1
bleibt, um den Erfordernissen des Pilzes während der Bildung der Gibberellin-Säure entsprechen zu können.
Ein Medium, das für die Stufe bzw. Stufen des aktiven Wachstums geeignet ist, soll Kohlen- stoffquellen (d. i. ein Zucker, z. B. Sucrose oder
Glucose oder ein mehrwertiger Alkohol, z. B.
Glyzerin), Stickstoffquellen (z. B. ein Ammonium- salz, ein Nitrat, Maisquellwasser [corn steep liquor] oder ein abgebautes Protein, wie z. B. ein Pepton oder andere assimilierbaren Stickstoff enthaltende Quellen), ferner Magnesium, Schwefel (zweckmässigerweise Magnesiumsulfat), Kalium,
Phosphor (zweckmässigerweise Kaliumdiphosphat) und Spuren von Metallen, wie z. B. Eisen,
Kupfer, Zink, Mangan und Molybdän enthalten.
Die Stickstoffkonzentration in dieser Stufe soll 0, 017-0, 25 gj100 cm3, z. B. in Form von 0, 05 bis 0, 75 g/100 cm3 Ammoniumnitrat und vor- zugsweise 0, 07-0, 17 g/100 cm3 Stickstoff, z. B. in Form von 0, 2 bis 0, 5 g/100 cm3 Ammoniumnitrat betragen. Die Konzentration des Kohlenstoffes, der z. B. in Form eines Zuckers, z. B. von Sucrose, Glucose oder einem mehrwertigen Alkohol, z. B. Glyzerin vorliegen kann, wird dann so gewählt, dass für das aktive Wachstum des Pilzes ein sogenanntes ausgeglichenes Medium vorhanden ist, d. h., dass das Verhältnis der Konzentration an Kohlenstoff zur Konzentration an Stickstoff, vorzugsweise zwischen den Werten 10 : I und 25 : I liegt. Ein für das aktive Wachstum geeignetes typisches ausgeglichenes Medium enthält z.
B. 0, 24g/100cm3 Ammoniumnitrat und 3, 18 gj100 cm3 Glucosemonohydrat, was einem Verhältnis von C : N von 14 : 1 entspricht oder 0, 48 gj100 cm3 Ammoniumnitrat und 10 g/100 cm3 Glucosemonohydrat, was einem Verhältnis von C : N von 21 : 5 gleichkommt.
In dem bevorzugten unausgeglichenen Medium eines hohen Kohlenstoff/Stickstoffverhältnisses, in welchem das aktive Wachstum gehemmt und Gibberellin-Säure gebildet wird, liegt ein geeigneter C : N-Verhältnisbereich zwischen 25 : 1 bis 200 : 1. Die Auswahl der Stickstoffkonzentration in dem Medium wird von dem erforderlichen Wachstum, das vorsichgehen soll, bevor es infolge eines Mangels an Stickstoff gehemmt wird, abhängig sein. Bei Beginn der Säurebildungsstufe ist ein gewisses Wachstum von
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Vorteil, um die Fermentatorenkapazität voll auszunützen, wobei sich ein Stickstoffgehalt in dem unausgeglichenen Medium eignet, der zwischen 0, 14-0, 17 g/100 cm3, z. B. in Form von 0, 11 bis 0, 5 g/100 cm3 Ammoniumnitrat liegt.
Ein bevorzugterer c : N-Verhä1tnisbereich liegt in der Grössenordnung von 30 : 1 bis 55 : 1 und auf Basis eines Stickstoffgehaltes in dem unausgeglichenen Medium von zwischen 0, 04 bis 0, 17 g/100 cm3, wobei der entsprechende Kohlenstoffgehalt in diesem Medium zwischen 1, 2 und 9, 4 g/100 cm3 gelegen ist. Eine geeignete Stickstoffquelle zur Bildung dieser erwünschten Stickstoffkonzentration ist z. B. 0, 11 bis 0, 5 g/100 cm3 Ammoniumnitrat ; eine geeignete Kohlenstoffquelle zur Herstellung der erwünschten Kohlenstoffkonzentration ist z. B. durch 3, 3-26 g/lOO cm3 Glucosemonohydrat gegeben.
Mit Ausnahme von Kohlenstoff und Stickstoff können die Konzentrationen der andern Nährmittel jenen gleich sein, die bei der Stufe des aktiven Wachstums in ausgeglichenen Medien eingesetzt werden.
Sich besonders eignende Kohlenstoffkonzentrationen, z. B. in Form von Glucosemonohydrat und Stickstoffkonzentrationen, z. B. in Form von Ammoniumnitrat sind folgende :
EMI2.1
<tb>
<tb> Konzen- <SEP> Konzentration <SEP> an <SEP> Kohlenstoff- <SEP> tration <SEP> an <SEP> StickstoffGlucosemo- <SEP> konzen- <SEP> Ammonium- <SEP> konzen- <SEP> Verhältnis
<tb> nohydrat <SEP> tration <SEP> nitrat <SEP> tration <SEP> C <SEP> :
N <SEP> (N-1)
<tb> Gew./Vol.% <SEP> Gew. <SEP> /Vol.% <SEP> Gew./Vol.% <SEP> Gew./Vol.%
<tb> 11,11 <SEP> 4,0 <SEP> 0,24 <SEP> 0,084 <SEP> 47,6
<tb> 8,0 <SEP> 2,88 <SEP> 0,24 <SEP> 0,084 <SEP> 34,3
<tb> 12,6 <SEP> 4,54 <SEP> 0,36 <SEP> 0,126 <SEP> 36,0
<tb> 20 <SEP> 7,2 <SEP> 0,4 <SEP> 0,14 <SEP> 51,4
<tb> 12 <SEP> 4,32 <SEP> 0,3 <SEP> 0,105 <SEP> 41,1
<tb> 10 <SEP> 3,6 <SEP> 0,24 <SEP> 0,084 <SEP> 42,9
<tb> 5,5 <SEP> 1,98 <SEP> 0,12 <SEP> 0,042 <SEP> 47,1
<tb> 20 <SEP> 7,2 <SEP> 0,44 <SEP> 0,154 <SEP> 46,8
<tb>
Um die metabolische Herstellung von Gibberel- lin-Säure in zwei oder mehr Stufen auszuführen, soll das ausgeglichene Mycel, das zur Herstellung dieser Säure verwendet werden soll, so schnell und so ökonomisch wie möglich gezüchtet werden.
Dies kann erfolgen, indem das Mycel bei Bedingungen wachsen gelassen wird, in welchen die Wachstumsgeschwindigkeit gross ist, wobei dann das Mycel verwendet wird, um ein weitaus grösseres Volumen an unausgeglichenem säure- produzierenden" Medium zu impfen, wodurch während der unproduktiven Wachstumsperiode die Fermentatorenkapazität verbessert wird.
Ferner wurde gefunden, dass in einem Mehrstufenverfahren das Mycel in der unausge- glichenen "säureproduzierenden"Stufe Säure mit einer grösseren Geschwindigkeit bildet, als dies der Fall ist, wenn das Mycel in dem gleichen unausgeglichenen Medium in einem Einstufenverfahren, wie in Beispiel 1 erläutert, kultiviert wird.
Im Verlauf der Säurebildung in dem unausgeglichenen Medium, kann der als Kohlenstoffquelle dienende Zusatz, z. B. Glucose in gewissen Zeitabständen portionenweise hinzugefügt werden, um eine bestimmte Kohlenstoffkonzentration, z. B. in Form von 2 bis 10 g/100 cm3 eines Zuckers, z. B. Glucose innerhalb des Nährmediums aufrecht zu erhalten und dadurch die Bildung von grösseren Mengen zu ermöglichen.
Die Erfindung wird an Hand folgender Beispiele ohne Einschränkung auf dieselben erläutert.
Beispiel 1 : In einem Zweistufenverfahren wurde die erste Stufe in einem Fermentationsgefäss ausgeführt, das 301 des folgenden Mediums enthielt :
EMI2.2
<tb>
<tb> Glucosemonohydrat <SEP> 10 <SEP> gj10U <SEP> cm"
<tb> Ammoniumnitrat......... <SEP> 0, <SEP> 48 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Kaliumdiphosphat........ <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat................ <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb>
EMI2.3
*) Dieses Konzentrat hatte folgende Zusammensetzung :
EMI2.4
<tb>
<tb> Ferrosulfatheptahydrat............ <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Kupfersulfatpentahydrat........... <SEP> 0, <SEP> 015 <SEP> g
<tb> Zinksulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g
<tb> Mangansulfatheptahydrat.......... <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g
<tb> Kaliummolybdat <SEP> (K2Mo04)....... <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> 100 <SEP> cm3
<tb>
Das Medium zeigte ein C : N-Verhältnis von 21, 5 : 1.
Das Medium wurde mit einem aktiven Stamm des Gibberella fujikuroi geimpft (Muster hinterlegt in den Sammlungen von Kulturen des Commonwealth Mycological Institute, Kew, des Bureau voor Schimmelcultures, Baarn und des Northern Utilisation Research and Development Division of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA) und wurde bei einer Temperatur von 26, 2 C und Durchleitung eines Luftstromes von 15 l/min gehalten, bis das Mycel auf ein Trockengewicht von 16 mg/l gewachsen war, was nach 100 Stunden erreicht wurde.
3 l dieser belüfteten Kultur wurden dann verwendet, um 30 l eines für die zweite Stufe bestimmten Mediums zu inokulieren, das folgende Zusammensetzung hatte :
EMI2.5
<tb>
<tb> Glucosemonohydrat...... <SEP> 20 <SEP> g/100 <SEP> cm3
<tb> Ammoniumnitrat <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Kaliumdiphosphat........ <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Konzentrat <SEP> nicht <SEP> wesentlicher <SEP> Zusätze*)....... <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> cm3/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb>
*) Die Zusammensetzung des Konzentrates war die gleiche wie oben.
Dieses Medium zeigte ein C : N-Verhältnis von 85, 5 : 1.
Die Züchtung wurde in diesem Medium bei einer Temperatur von 26, 2 C bei Durchleitung eines Luftstromes von 15 l/min fortgesetzt.
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Als Vergleichsversuch wurde ein mit einer Agarkultur inokulierter Einstufenansatz in ein Medium, das mit obigem Medium der zweiten Stufe identisch war, unter denselben Temperaturund Durchlüftungsbedingungen einfliessen gelassen.
Die folgende Tabelle zeigt die Konzentrationen (mit Korrekturen für die Verdampfung) von Gibberellin-Säure in beiden Medien bei fortschreitender Züchtung : Gibberellin-Säure mg/l
EMI3.1
<tb>
<tb> Alter <SEP> (Stunden <SEP> Einstufen- <SEP> Zweistufen- <SEP>
<tb> nach <SEP> der <SEP> Inoku <SEP> verfahren <SEP>
<tb> lation) <SEP> verfahren <SEP> zweite <SEP> Stufe
<tb> 48, <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 66, <SEP> 0 <SEP> 21
<tb> 89, <SEP> 6 <SEP> 63
<tb> 115, <SEP> 8 <SEP> 108
<tb> 138, <SEP> 3 <SEP> 151
<tb> 141, <SEP> 9 <SEP> Spur
<tb> 166, <SEP> 0 <SEP> 19
<tb> 185, <SEP> 7 <SEP> 169
<tb> 189, <SEP> 6 <SEP> 35
<tb> 215, <SEP> 8 <SEP> 60
<tb> 234, <SEP> 4 <SEP> 273
<tb> 238, <SEP> 3 <SEP> 72
<tb> 285, <SEP> 7 <SEP> 127
<tb> 305, <SEP> 8 <SEP> 353
<tb> 334, <SEP> 4 <SEP> 160
<tb> 401, <SEP> 7 <SEP> 413
<tb> 405, <SEP> 8 <SEP> 218
<tb> 501,
<SEP> 7 <SEP> 308
<tb>
Die Tabelle zeigt deutlich :
1. dass bei Beginn der Säurebildung die Bildungsgeschwindigkeit in der zweiten Stufe des Zweistufenverfahrens grösser ist, als in dem Einstufenverfahren und
2. dass, wenn dafür gesorgt wird, dass während der ersten Stufe genügend Mycel gebildet wird, um zehn Ansätze der zweiten Stufe zu inokulieren, die ursprüngliche Wachstumsphase ausgedrückt in Stunden der Fermentatorenkapazität weit niedriger ist, als in dem Einstufenverfahren.
Beispiel 2 : Herstellung des Inokulums (Wachstumsstufe).
In einem 1135 1 (250 Gallon) fassenden Fermentationsgefäss wird ein Nährmedium folgender Zusammensetzung hergestellt :
EMI3.2
<tb>
<tb> Glucosemonohydrat...... <SEP> 12 <SEP> g/100 <SEP> cm"
<tb> Ammoniumnitrat <SEP> 0, <SEP> 48 <SEP> gj100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Kaliumdiphosphat........ <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Konzentrat <SEP> nicht <SEP> wesentlicher <SEP> Zusätze*)....... <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> cm3/lOO <SEP> cm3 <SEP>
<tb>
Wasser zum Auffüllen auf 4541 (100 Gallons) *) Die Zusammensetzung dieses Konzentrats entspricht der in Beispiel l angegebenen.
Das Medium zeigte ein C : N-Verhältnis von 25, 6 : 1.
Das Nährmedium wird sterilisiert, dann abgekühlt und mit einer Kleiekultur von Gibberella fujikuroi inokuliert. Hierauf wird das Medium gerührt, bei einer Temperatur von 26 C gehalten und mit einem Luftstrom von 0, 5 Vol.- Luft/Vol. Kulturmedium/min während 66, 5 Stunden belüftet. Es entwickelt sich ein dickes Mycelwachstum ; das Mycel kann zur Inokulation der Erzeugungsfermentationen verwendet werden. Die Analyse ergibt, dass der Stickstoffgehalt des Mediums fast erschöpft ist.
Erzeugungsfermentation (Säurebildungsstufe).
In einem 1135 l (250 Gallon) Fermentationsgefäss wird ein Nährmedium folgender Zusammensetzung hergestellt :
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<tb>
<tb> Glucosemonohydrat...... <SEP> 12 <SEP> g/100 <SEP> cm3
<tb> Ammoniumnitrat......... <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> gj100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Kaliumdiphosphat........ <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Konzentrat <SEP> nicht <SEP> wesentlicher <SEP> Zusätze*)....... <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> cm3/lOO <SEP> cm3 <SEP>
<tb>
Wasser zum Auffüllen auf 658, 31 (145 Gallons) *) Der Zusatz war der gleiche wie in Beispiel l.
Dieses Medium zeigte ein C : N-Verhältnis von 41, 1 : 1.
Das Medium wird sterilisiert, abgekühlt und mit 68, 1 I (15 Gallons) des oben beschriebenen Inokulums beimpft, hierauf wird gerührt, bei einer Temperatur von 26 C gehalten und schliesslich mit einem Luftstrom von 0, 5 Vol.-Luft/Vol.- Kulturmedium/min belüftet.
Die folgende Tabelle zeigt die Konzentration an gebildeter GibberellinSäure in dem Medium bei fortschreitender Fermentation :
EMI3.4
<tb>
<tb> Alter <SEP> (Stunden <SEP> nach <SEP> Gibberellin-Säure
<tb> der <SEP> Inokulation) <SEP> (mg/l)
<tb> 49 <SEP> 43
<tb> 74 <SEP> 124
<tb> 78 <SEP> 238
<tb> 122 <SEP> 348
<tb> 145 <SEP> 394
<tb> 167 <SEP> 386
<tb> 194 <SEP> 436
<tb> 218 <SEP> 362
<tb>
Der Inhalt des Fermentationsgefässes wird dann filtriert und das Filtrat (600 1) mit Äthylacetat zur Entfernung der Gibberellin-Säure extrahiert, die dann mittels bekannter Verfahren, z. B. durch Konzentration und Reinigung durch Kristallisation isoliert wird. Man erhält auf diese Weise 204, 1 g Gibberellin-Säure als ein farbloses kristallines Pulver, F = 233-235 C unter Zersetzung.
Beispiel 3 : Das Verfahren gemäss Beispiel 2 wird wiederholt, wobei jedoch die 12 g/100 cm3 Glucosemonohydrat und die 0, 3 g/lOO cm3
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Ammoniumnitrat, die in dem Nährmedium zur Erzeugungsfermentation verwendet worden waren, ersetzt werden durch 10 g/100 cm3 Glucosemonohydrat und 0, 24 gj100 cm3 Ammonium- nitrat. Die folgende Tabelle zeigt die Konzentration an Gibberellin-Säure in dem Medium bei fortschreitender Fermentation.
Das Medium zeigte ein C : N-Verhältnis von 42, 9 : 1.
EMI4.1
<tb>
<tb>
Alter <SEP> (Stunden <SEP> nach <SEP> Gibberellin-Säure
<tb> der <SEP> Inokulation) <SEP> (mg/l)
<tb> 49 <SEP> 52
<tb> 74 <SEP> IM <SEP>
<tb> 98 <SEP> 226
<tb> 122 <SEP> 336
<tb> 145 <SEP> 324
<tb> 167 <SEP> 332
<tb>
Der Inhalt des Fermentationsgefässes wird dann filtriert und das Filtrat (577 1) zur Entfernung der gebildeten Säure mit Äthylacetat extrahiert ; die Säure wird mittels bekannter Verfahren durch Konzentration und Reinigung durch Kristallisation isoliert. Man erhält auf diese Weise 140, 8 g Gibberellin-Säure als farbloses, kristallines Pulver, F = 233-235 0 C unter Zersetzung.
Beispiel 4 : Das Verfahren gemäss Beispiel 2 wird wiederholt, wobei jedoch die 12 g/100 cm3 Glucosemonohydrat und die 0, 3 gjlOO cm3 Ammoniumnitrat in dem Nährmedium, das während der Erzeugungsfermentation verwendet worden war, ersetzt werden durch 12, 6 g/100 cm3 Glucosemonohydrat und 0, 36 g/100 cm3 Ammoniumnitrat. Die folgende Tabelle gibt die Konzentration an gebildeter Säure in dem Medium bei fortschreitender Fermentation an :
Das Medium zeigte ein C : N-Verhältnis von 36, 0 : 1.
EMI4.2
<tb>
<tb>
Alter <SEP> (Stunden <SEP> nach <SEP> Gibberellin-Säure
<tb> der <SEP> Inokulation) <SEP> (mg/l) <SEP>
<tb> 108 <SEP> 30
<tb> 132 <SEP> 80
<tb> 156 <SEP> 158
<tb> 177 <SEP> 246
<tb> 201 <SEP> 298
<tb> 225 <SEP> 370
<tb> 249 <SEP> 390
<tb>
Die Säure kann nach bekannten Verfahren, z. B. nach dem am Ende des Beispiels 2 angegebenen, isoliert werden.
Beispiel 5 : Das Verfahren gemäss Beispiel 2 wird wiederholt, wobei jedoch die 12 g/100 cm3 Glucosemonohydrat und die 0, 3 g/100 cm3 Ammoniumnitrat in dem Nährmedium, das zur Erzeugungsfermentation verwendet worden war, ersetzt werden durch 11, 11 g/100 cm3 Glucosemonohydrat und 0, 24 g/100 cm3 Ammonium- nitrat. Die folgende Tabelle zeigt die Konzentration an Gibberellin-Säure in dem Medium bei fortschreitender Fermentation :
Das Medium zeigte ein C : N-Verhältnis von 47, 6 : 1.
EMI4.3
<tb>
<tb>
Alter <SEP> (Stunden <SEP> nach <SEP> Gibberellin-Säure
<tb> der <SEP> Inokulation) <SEP> (mg/l)
<tb> 132 <SEP> 66
<tb> 156 <SEP> 100
<tb> 177 <SEP> 158
<tb> 225 <SEP> 270
<tb> 249 <SEP> 292
<tb> 273 <SEP> 320
<tb> 296 <SEP> 368
<tb>
Die Säure kann nach bekannten Verfahren, z. B. nach dem am Ende des Beispiels 2 angegebenen Verfahren, isoliert werden.
Beispiel 6 : Ein Inokulum wird nach dem am Beginn des Beispiels 1 beschriebenen Verfahren für die Wachstumsstufe hergestellt und dann für die Säurebildungsstufe (zweite Ver- fahrensstufe), wie unten beschrieben, verwendet.
Erzeugungsfermentation.
Ein Nährmedium folgender Zusammensetzung wird hergestellt :
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<tb>
<tb> Glucosemonohydrat...... <SEP> 16 <SEP> g/100 <SEP> cm3
<tb> Ammoniumnitrat <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> gjlOO <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Kaliumdiphosphat........ <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> gjl00 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Konzentrat <SEP> nicht <SEP> wesentlicher <SEP> Zusätze*)....... <SEP> 0,2 <SEP> cm3/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb>
Wasser zum Auffüllen auf 75 1 *) Das Konzentrat ist das gleiche wie in Beispiel 1.
Das Medium zeigte ein C : N-Verhältnis von 41, 1 : 1.
Das Medium wird sterilisiert, dann abekühlt und mit 2, 5 1 des oben beschriebenen Inokulums
EMI4.5
Tabelle zeigt die Konzentration an GibberellinSäure in dem Medium bei fortschreitender Fermentation.
EMI4.6
<tb>
<tb>
Alter <SEP> (Stunden <SEP> nach <SEP> Gibberellin-Säure
<tb> der <SEP> Inokulation) <SEP> (mg/l)
<tb> 75 <SEP> 10
<tb> 88 <SEP> 42
<tb> 93 <SEP> 60
<tb> 100 <SEP> 88
<tb> 111 <SEP> 107
<tb> 136 <SEP> 198
<tb> 148 <SEP> 206
<tb> 160 <SEP> 253
<tb>
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Die gebildete Säure kann nach bekannten Ver- fahren, z. B. nach dem am Ende des Beispiels 2 beschriebenen Verfahren, isoliert werden.
Beispiel 7 : Gemäss dem am Beginn des Beispiels 1 beschriebenen Verfahren wird ein Ino- kulum hergestellt und dieses dann für die zweite
Verfahrensstufe, wie unten beschrieben, ver- wendet.
Erzeugungsfermentation.
Es wird ein Nährmedium folgender Zu- sammensetzung hergestellt :
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<tb>
<tb> Glucosemonohydrat...... <SEP> 20 <SEP> g/lUU <SEP> cm" <SEP>
<tb> Ammoniumnitrat <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Kaliumdiphosphat........ <SEP> 0,5 <SEP> g/100 <SEP> cm#
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Konzentrat <SEP> nicht <SEP> wesentlicher <SEP> Zusätze*) <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> cm3/100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb>
Wasser zum Auffüllen auf 75 1 *) Das Konzentrat ist das gleiche wie in Beispiel 1.
Das Medium zeigte ein C : N-Verhältnis von 51, 4 : 1.
Das Medium wird sterilisiert, dann abgekühlt und mit 2, 5 1 des weiter oben beschriebenen Inokulums geimpft. Hierauf wird das Medium gerührt, bei 260 C gehalten und mit einem Luftstrom von 0,5 Vol.-Luft/Vol.-Knlturmedium/ min belüftet. Die folgende Tabelle zeigt die Konzentration an gebildeter Säure in dem Medium bei fortschreitender Fermentation :
EMI5.2
<tb>
<tb> Alter <SEP> (Stunden <SEP> nach <SEP> Gibberellin-Säure
<tb> der <SEP> Inokulation) <SEP> (mg/l) <SEP>
<tb> 82 <SEP> 6
<tb> 106 <SEP> 46
<tb> 118 <SEP> 79
<tb> 130 <SEP> 133
<tb> 142 <SEP> 138
<tb> 154 <SEP> 229
<tb>
Die Säure kann nach bekannten Verfahren, z. B. nach dem am Ende des Beispiels 2 beschriebenen Verfahren, isoliert werden.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von GibberellinSäure durch Züchtung eines aktiven Stammes von Pilzen der Gattung Gibberella fujikuroi in einer durchlüfteten, Kohlehydrat und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Nährlösung, wobei in einer Wachstumsstufe ein C- und N-Über- schuss in der Nährlösung und anschliessend in einer Säurebildungsstufe der N-Vorrat schliesslich aufgebraucht und die Säure schliesslich aus der Nährlösung isoliert wird, dadurch gekennzeichnet, dass während der Wachstumsstufe ein C : N-Verhältnis von 10 : 1 bis 25 : 1 und eine N-Konzentration von 0, 017 bis 0,25 g/ 100 cm3 Nährlösung und in der Säurebildungsstufe ein C :
N-Verhältnis von über 25 : 1 bis 200 : 1 und eine N-Konzentration von 0, 017 bis
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Process for the production of gibberellic acid
EMI1.1
remains in order to be able to meet the requirements of the fungus during the formation of the gibberellic acid.
A medium suitable for the stage or stages of active growth is said to be carbon sources (i.e. a sugar, e.g., sucrose or
Glucose or a polyhydric alcohol, e.g. B.
Glycerine), nitrogen sources (for example an ammonium salt, a nitrate, corn steep liquor or a degraded protein such as a peptone or other assimilable nitrogen-containing sources), also magnesium, sulfur (expediently magnesium sulfate ), Potassium,
Phosphorus (conveniently potassium diphosphate) and traces of metals, such as. B. iron,
Contains copper, zinc, manganese and molybdenum.
The nitrogen concentration in this stage should be 0.017-0.25 gj100 cm3, e.g. B. in the form of 0.05 to 0.75 g / 100 cm3 ammonium nitrate and preferably 0.07-0.17 g / 100 cm3 nitrogen, e.g. B. in the form of 0.2 to 0.5 g / 100 cm3 of ammonium nitrate. The concentration of carbon that z. B. in the form of a sugar, e.g. B. of sucrose, glucose or a polyhydric alcohol, e.g. B. glycerine can be present, is then chosen so that a so-called balanced medium is available for the active growth of the fungus, i. This means that the ratio of the concentration of carbon to the concentration of nitrogen is preferably between the values 10: 1 and 25: 1. A typical balanced medium suitable for active growth contains e.g.
B. 0.24 g / 100 cm3 ammonium nitrate and 3.18 g / 100 cm3 glucose monohydrate, which corresponds to a C: N ratio of 14: 1 or 0.48 g / 100 cm3 ammonium nitrate and 10 g / 100 cm3 glucose monohydrate, which corresponds to a ratio of C: N of 21: 5 equals.
In the preferred high carbon / nitrogen ratio imbalanced medium in which active growth is inhibited and gibberellic acid is formed, a suitable C: N ratio range is between 25: 1 to 200: 1. The selection of nitrogen concentration in the medium is made by the required growth to be taken before it is inhibited due to a lack of nitrogen. At the beginning of the acidification stage there is a certain growth of
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Advantage to fully utilize the fermenter capacity, whereby a nitrogen content in the unbalanced medium is suitable that is between 0.14-0.17 g / 100 cm3, e.g. B. in the form of 0.11 to 0.5 g / 100 cm3 of ammonium nitrate.
A more preferred c: N ratio range is on the order of 30: 1 to 55: 1 and based on a nitrogen content in the unbalanced medium of between 0.04 to 0.17 g / 100 cm3, the corresponding carbon content in this medium between 1, 2 and 9, 4 g / 100 cm3. A suitable nitrogen source to produce this desired concentration of nitrogen is e.g. B. 0.11 to 0.5 g / 100 cm3 ammonium nitrate; a suitable carbon source for producing the desired carbon concentration is e.g. B. given by 3.3-26 g / 100 cm3 glucose monohydrate.
With the exception of carbon and nitrogen, the concentrations of the other nutrients can be the same as those used in the stage of active growth in balanced media.
Particularly suitable carbon concentrations, e.g. B. in the form of glucose monohydrate and nitrogen concentrations, e.g. B. in the form of ammonium nitrate are the following:
EMI2.1
<tb>
<tb> Concentration <SEP> Concentration <SEP> at <SEP> Carbon <SEP> tration <SEP> at <SEP> Nitrogen Glucose- <SEP> Concentrated <SEP> Ammonium- <SEP> Concentrated <SEP> Ratio
<tb> nohydrate <SEP> tration <SEP> nitrate <SEP> tration <SEP> C <SEP>:
N <SEP> (N-1)
<tb> wt / vol% <SEP> wt% <SEP> / vol% <SEP> wt / vol% <SEP> wt / vol%
<tb> 11.11 <SEP> 4.0 <SEP> 0.24 <SEP> 0.084 <SEP> 47.6
<tb> 8.0 <SEP> 2.88 <SEP> 0.24 <SEP> 0.084 <SEP> 34.3
<tb> 12.6 <SEP> 4.54 <SEP> 0.36 <SEP> 0.126 <SEP> 36.0
<tb> 20 <SEP> 7.2 <SEP> 0.4 <SEP> 0.14 <SEP> 51.4
<tb> 12 <SEP> 4.32 <SEP> 0.3 <SEP> 0.105 <SEP> 41.1
<tb> 10 <SEP> 3.6 <SEP> 0.24 <SEP> 0.084 <SEP> 42.9
<tb> 5.5 <SEP> 1.98 <SEP> 0.12 <SEP> 0.042 <SEP> 47.1
<tb> 20 <SEP> 7.2 <SEP> 0.44 <SEP> 0.154 <SEP> 46.8
<tb>
In order to carry out the metabolic production of gibberelic acid in two or more stages, the balanced mycelium which is to be used for the production of this acid should be grown as quickly and as economically as possible.
This can be done by growing the mycelium in conditions where the rate of growth is high, then using the mycelium to inoculate a far greater volume of unbalanced acid-producing medium, thereby improving fermenter capacity during the unproductive growing season becomes.
Furthermore, it has been found that in a multistage process the mycelium in the unbalanced "acid-producing" stage forms acid at a greater rate than is the case when the mycelium in the same unbalanced medium in a one-step process as explained in Example 1, is cultivated.
In the course of acid formation in the unbalanced medium, the additive serving as a carbon source, e.g. B. glucose can be added in portions at certain time intervals to achieve a certain carbon concentration, e.g. B. in the form of 2 to 10 g / 100 cm3 of a sugar, e.g. B. to maintain glucose within the nutrient medium and thereby enable the formation of larger quantities.
The invention is illustrated with the aid of the following examples without being restricted to the same.
Example 1: In a two-step process, the first step was carried out in a fermentation vessel containing 301 of the following medium:
EMI2.2
<tb>
<tb> glucose monohydrate <SEP> 10 <SEP> gj10U <SEP> cm "
<tb> ammonium nitrate ......... <SEP> 0, <SEP> 48 <SEP> g / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Potassium diphosphate ........ <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Magnesium sulfate heptahydrate ................ <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb>
EMI2.3
*) This concentrate had the following composition:
EMI2.4
<tb>
<tb> Ferrous sulfate heptahydrate ............ <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g
<tb> copper sulfate pentahydrate ........... <SEP> 0, <SEP> 015 <SEP> g
<tb> zinc sulphate heptahydrate <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g
<tb> Manganese sulfate heptahydrate .......... <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g
<tb> Potassium molybdate <SEP> (K2Mo04) ....... <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g
<tb> water <SEP> 100 <SEP> cm3
<tb>
The medium showed a C: N ratio of 21.5: 1.
The medium was inoculated with an active strain of Gibberella fujikuroi (sample deposited in the collections of cultures of the Commonwealth Mycological Institute, Kew, the Bureau voor Schimmelcultures, Baarn and the Northern Utilization Research and Development Division of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA) and was kept at a temperature of 26.2 C and passing through an air flow of 15 l / min until the mycelium had grown to a dry weight of 16 mg / l, which was reached after 100 hours.
3 liters of this aerated culture was then used to inoculate 30 liters of a medium intended for the second stage, which had the following composition:
EMI2.5
<tb>
<tb> Glucose monohydrate ...... <SEP> 20 <SEP> g / 100 <SEP> cm3
<tb> ammonium nitrate <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> g / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Potassium diphosphate ........ <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Magnesium sulfate heptahydrate <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Concentrate <SEP> not <SEP> essential <SEP> additives *) ....... <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> cm3 / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb>
*) The composition of the concentrate was the same as above.
This medium showed a C: N ratio of 85.5: 1.
Cultivation was continued in this medium at a temperature of 26.2 ° C. with a flow of air of 15 l / min.
<Desc / Clms Page number 3>
As a comparative experiment, a one-stage batch inoculated with an agar culture was allowed to flow into a medium identical to the above medium of the second stage under the same temperature and aeration conditions.
The following table shows the concentrations (with corrections for evaporation) of gibberellic acid in both media as the culture progresses: gibberellic acid mg / l
EMI3.1
<tb>
<tb> Age <SEP> (hours <SEP> one-step- <SEP> two-step- <SEP>
<tb> after <SEP> of the <SEP> Inoku <SEP> proceed <SEP>
<tb> lation) <SEP> process <SEP> second <SEP> stage
<tb> 48, <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 66, <SEP> 0 <SEP> 21
<tb> 89, <SEP> 6 <SEP> 63
<tb> 115, <SEP> 8 <SEP> 108
<tb> 138, <SEP> 3 <SEP> 151
<tb> 141, <SEP> 9 <SEP> track
<tb> 166, <SEP> 0 <SEP> 19
<tb> 185, <SEP> 7 <SEP> 169
<tb> 189, <SEP> 6 <SEP> 35
<tb> 215, <SEP> 8 <SEP> 60
<tb> 234, <SEP> 4 <SEP> 273
<tb> 238, <SEP> 3 <SEP> 72
<tb> 285, <SEP> 7 <SEP> 127
<tb> 305, <SEP> 8 <SEP> 353
<tb> 334, <SEP> 4 <SEP> 160
<tb> 401, <SEP> 7 <SEP> 413
<tb> 405, <SEP> 8 <SEP> 218
<tb> 501,
<SEP> 7 <SEP> 308
<tb>
The table clearly shows:
1. that at the start of acid formation, the rate of formation in the second stage of the two-stage process is greater than in the one-stage process and
2. That if it is ensured that enough mycelium is formed during the first stage to inoculate ten batches of the second stage, the initial growth phase, in terms of hours of fermenter capacity, is far lower than in the one-stage process.
Example 2: Preparation of the inoculum (growth stage).
A nutrient medium of the following composition is prepared in a 1135 l (250 gallon) fermentation vessel:
EMI3.2
<tb>
<tb> Glucose monohydrate ...... <SEP> 12 <SEP> g / 100 <SEP> cm "
<tb> ammonium nitrate <SEP> 0, <SEP> 48 <SEP> gj100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Magnesium sulfate heptahydrate <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Potassium diphosphate ........ <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Concentrate <SEP> not <SEP> essential <SEP> additives *) ....... <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> cm3 / lOO <SEP> cm3 <SEP>
<tb>
Water to make up to 4541 (100 gallons) *) The composition of this concentrate corresponds to that given in Example 1.
The medium showed a C: N ratio of 25.6: 1.
The nutrient medium is sterilized, then cooled and inoculated with a bran culture of Gibberella fujikuroi. The medium is then stirred, kept at a temperature of 26 C and with an air flow of 0.5 vol. Air / vol. Culture medium aerated / min for 66.5 hours. Thick mycelial growth develops; the mycelium can be used to inoculate the production fermentations. The analysis shows that the nitrogen content of the medium is almost exhausted.
Production fermentation (acidification stage).
A nutrient medium with the following composition is prepared in a 1135 l (250 gallon) fermentation vessel:
EMI3.3
<tb>
<tb> Glucose monohydrate ...... <SEP> 12 <SEP> g / 100 <SEP> cm3
<tb> ammonium nitrate ......... <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> gj100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Magnesium sulfate heptahydrate <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Potassium diphosphate ........ <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Concentrate <SEP> not <SEP> essential <SEP> additives *) ....... <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> cm3 / lOO <SEP> cm3 <SEP>
<tb>
Water to make up to 658.31 (145 gallons) *) The addition was the same as in Example 1.
This medium showed a C: N ratio of 41.1: 1.
The medium is sterilized, cooled and inoculated with 68.1 l (15 gallons) of the inoculum described above, then stirred, kept at a temperature of 26 ° C. and finally with an air flow of 0.5 vol.air / vol. Aerated culture medium / min.
The following table shows the concentration of gibberellic acid formed in the medium as the fermentation progresses:
EMI3.4
<tb>
<tb> Age <SEP> (hours <SEP> after <SEP> gibberellic acid
<tb> of the <SEP> inoculation) <SEP> (mg / l)
<tb> 49 <SEP> 43
<tb> 74 <SEP> 124
<tb> 78 <SEP> 238
<tb> 122 <SEP> 348
<tb> 145 <SEP> 394
<tb> 167 <SEP> 386
<tb> 194 <SEP> 436
<tb> 218 <SEP> 362
<tb>
The contents of the fermentation vessel are then filtered and the filtrate (600 l) is extracted with ethyl acetate to remove the gibberellic acid, which is then extracted by known methods, e.g. B. is isolated by concentration and purification by crystallization. In this way, 204.1 g of gibberellic acid is obtained as a colorless crystalline powder, mp = 233-235 ° C. with decomposition.
Example 3: The process according to Example 2 is repeated, but with the 12 g / 100 cm3 of glucose monohydrate and the 0.3 g / 100 cm3
<Desc / Clms Page number 4>
Ammonium nitrate, which had been used in the nutrient medium for production fermentation, is replaced by 10 g / 100 cm3 of glucose monohydrate and 0.24 g / 100 cm3 of ammonium nitrate. The following table shows the concentration of gibberellic acid in the medium as fermentation progresses.
The medium showed a C: N ratio of 42.9: 1.
EMI4.1
<tb>
<tb>
Age <SEP> (hours <SEP> after <SEP> gibberellic acid
<tb> of the <SEP> inoculation) <SEP> (mg / l)
<tb> 49 <SEP> 52
<tb> 74 <SEP> IM <SEP>
<tb> 98 <SEP> 226
<tb> 122 <SEP> 336
<tb> 145 <SEP> 324
<tb> 167 <SEP> 332
<tb>
The contents of the fermentation vessel are then filtered and the filtrate (577 l) is extracted with ethyl acetate to remove the acid formed; the acid is isolated by known methods by concentration and purification by crystallization. In this way, 140.8 g of gibberellic acid are obtained as a colorless, crystalline powder, mp = 233-235 ° C. with decomposition.
Example 4: The process according to Example 2 is repeated, but the 12 g / 100 cm3 of glucose monohydrate and the 0.3 g / 100 cm3 of ammonium nitrate in the nutrient medium that was used during the production fermentation are replaced by 12.6 g / 100 cm3 Glucose monohydrate and 0.36 g / 100 cm3 ammonium nitrate. The following table shows the concentration of acid formed in the medium as the fermentation progresses:
The medium showed a C: N ratio of 36.0: 1.
EMI4.2
<tb>
<tb>
Age <SEP> (hours <SEP> after <SEP> gibberellic acid
<tb> of the <SEP> inoculation) <SEP> (mg / l) <SEP>
<tb> 108 <SEP> 30
<tb> 132 <SEP> 80
<tb> 156 <SEP> 158
<tb> 177 <SEP> 246
<tb> 201 <SEP> 298
<tb> 225 <SEP> 370
<tb> 249 <SEP> 390
<tb>
The acid can by known methods, e.g. B. after that given at the end of Example 2, are isolated.
Example 5: The method according to Example 2 is repeated, but the 12 g / 100 cm3 glucose monohydrate and the 0.3 g / 100 cm3 ammonium nitrate in the nutrient medium that was used for production fermentation are replaced by 11.11 g / 100 cm3 of glucose monohydrate and 0.24 g / 100 cm3 of ammonium nitrate. The following table shows the concentration of gibberellic acid in the medium as fermentation progresses:
The medium showed a C: N ratio of 47.6: 1.
EMI4.3
<tb>
<tb>
Age <SEP> (hours <SEP> after <SEP> gibberellic acid
<tb> of the <SEP> inoculation) <SEP> (mg / l)
<tb> 132 <SEP> 66
<tb> 156 <SEP> 100
<tb> 177 <SEP> 158
<tb> 225 <SEP> 270
<tb> 249 <SEP> 292
<tb> 273 <SEP> 320
<tb> 296 <SEP> 368
<tb>
The acid can by known methods, e.g. B. by the method given at the end of Example 2, isolated.
Example 6: An inoculum is prepared according to the process described at the beginning of Example 1 for the growth stage and then used for the acid formation stage (second process stage), as described below.
Production fermentation.
A nutrient medium of the following composition is prepared:
EMI4.4
<tb>
<tb> Glucose monohydrate ...... <SEP> 16 <SEP> g / 100 <SEP> cm3
<tb> ammonium nitrate <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> gjlOO <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Potassium diphosphate ........ <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Magnesium sulfate heptahydrate <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> gjl00 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Concentrate <SEP> not <SEP> essential <SEP> additives *) ....... <SEP> 0.2 <SEP> cm3 / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb>
Water to make up to 75 1 *) The concentrate is the same as in example 1.
The medium showed a C: N ratio of 41.1: 1.
The medium is sterilized, then cooled and mixed with 2.5 l of the inoculum described above
EMI4.5
Table shows the concentration of gibberellic acid in the medium as fermentation progresses.
EMI4.6
<tb>
<tb>
Age <SEP> (hours <SEP> after <SEP> gibberellic acid
<tb> of the <SEP> inoculation) <SEP> (mg / l)
<tb> 75 <SEP> 10
<tb> 88 <SEP> 42
<tb> 93 <SEP> 60
<tb> 100 <SEP> 88
<tb> 111 <SEP> 107
<tb> 136 <SEP> 198
<tb> 148 <SEP> 206
<tb> 160 <SEP> 253
<tb>
<Desc / Clms Page number 5>
The acid formed can by known methods, for. B. by the method described at the end of Example 2, isolated.
Example 7: According to the method described at the beginning of example 1, an inoculum is produced and this is then used for the second
Process stage as described below is used.
Production fermentation.
A nutrient medium of the following composition is produced:
EMI5.1
<tb>
<tb> Glucose monohydrate ...... <SEP> 20 <SEP> g / lUU <SEP> cm "<SEP>
<tb> ammonium nitrate <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> g / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Potassium diphosphate ........ <SEP> 0.5 <SEP> g / 100 <SEP> cm #
<tb> Magnesium sulfate heptahydrate <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Concentrate <SEP> not <SEP> essential <SEP> additives *) <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> cm3 / 100 <SEP> cm3 <SEP>
<tb>
Water to make up to 75 1 *) The concentrate is the same as in example 1.
The medium showed a C: N ratio of 51.4: 1.
The medium is sterilized, then cooled and inoculated with 2.5 liters of the inoculum described above. The medium is then stirred, kept at 260 ° C. and aerated with an air flow of 0.5 volume air / volume medium / min. The following table shows the concentration of acid formed in the medium as the fermentation progresses:
EMI5.2
<tb>
<tb> Age <SEP> (hours <SEP> after <SEP> gibberellic acid
<tb> of the <SEP> inoculation) <SEP> (mg / l) <SEP>
<tb> 82 <SEP> 6
<tb> 106 <SEP> 46
<tb> 118 <SEP> 79
<tb> 130 <SEP> 133
<tb> 142 <SEP> 138
<tb> 154 <SEP> 229
<tb>
The acid can by known methods, e.g. B. by the method described at the end of Example 2, isolated.
PATENT CLAIMS:
1. Process for the production of gibberellic acid by cultivating an active strain of fungi of the genus Gibberella fujikuroi in an aerated nutrient solution containing carbohydrate and assimilable nitrogen, with an excess of C and N in the nutrient solution in a growth stage and then in an acid formation stage the N supply is finally used up and the acid is finally isolated from the nutrient solution, characterized in that a C: N ratio of 10: 1 to 25: 1 and an N concentration of 0.017 to 0.25 g / 100 cm3 nutrient solution and in the acidification stage a C:
N ratio of over 25: 1 to 200: 1 and an N concentration of 0.017 to
EMI5.3