AT11772U1 - DEVICE FOR IDENTIFYING CELLS - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Identifizierung von Zellen in einer Probe durch Messung des Infrarot-Absorptionsvermögens der Probe bei zumindest zwei Wellenlängen, wobei die Vorrichtung umfasst: eine Lichtquelle, die Infrarotstrahlung bei den zumindest zwei Wellenlängen emittiert und zumindest eine Leuchtdiode (LED) (c, i) umfasst, eine im Strahlengang der Lichtquelle angeordnete Probenhalterung (h), eine Photodiode (j) als Detektor, eine Optik (d, f) zur Parallelrichtung des von der Lichtquelle emittierten Lichtstrahls zur Fokussierung desselben auf die Probe sowie des aus der Probe austretenden Lichtstrahls auf den Detektor (j), sowie eine mit dem Detektor (j) verbundene Recheneinheit zur Aufnahme, Speicherung, Umrechnung und Ausgabe der gemessenen bzw. umgerechneten Daten.The invention relates to an apparatus for identifying cells in a sample by measuring the infrared absorbance of the sample at at least two wavelengths, the apparatus comprising: a light source emitting infrared radiation at the at least two wavelengths and at least one light emitting diode (LED) (c , i), a sample holder (h) arranged in the beam path of the light source, a photodiode (j) as detector, optics (d, f) for the parallel direction of the light beam emitted by the light source for focusing the same on the sample and that from the sample emanating light beam to the detector (j), as well as an associated with the detector (j) computing unit for recording, storage, conversion and output of the measured or converted data.
Description
österreichisches Patentamt AT 11 772 U1 2011-04-15Austrian Patent Office AT 11 772 U1 2011-04-15
Beschreibungdescription
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Messgerät zur Identifizierung von Zellen in einer Probe durch Messung des Infrarot-Absorptionsvermögens.The present invention relates to a meter for identifying cells in a sample by measuring the infrared absorbance.
[0001] Bezüglich der Identifizierung von Zellen mittels Infrarotspektroskopie ist aus Arbeiten zahlreicher Autoren, in jüngerer Vergangenheit u.a. von Fabian et al., Biochim. Biophys. Acta 1758, 874-882 (2006), sowie von Maziak et al., Cancer Detect. Prev. 31, 244-253 (2007), bekannt, dass eine Unterscheidung zwischen normalem oder gesundem Gewebe und pathologischem, z.B. kanzerösem, Gewebe mittels FTIR-Spektroskopie durch Vergleich der Intensitäten charakteristischer Banden möglich ist. Veränderungen der Zellen bewirken nämlich, dass das Ausmaß bzw. die Art der durch Infrarotstrahlung angeregten Schwingungen von Molekülen oder funktionellen Gruppen in bestimmten Regionen oder Abschnitten von Körperzellen variiert.With regard to the identification of cells by means of infrared spectroscopy is from the work of many authors, u.a. by Fabian et al., Biochim. Biophys. Acta 1758, 874-882 (2006), as well as Maziak et al., Cancer Detect. Prev. 31, 244-253 (2007), discloses that a distinction between normal or healthy tissue and pathological, e.g. cancerous tissue by FTIR spectroscopy by comparing the intensities of characteristic bands is possible. Namely, changes in the cells cause the extent or type of infrared radiation-excited vibrations of molecules or functional groups to vary in particular regions or portions of somatic cells.
[0002] In Fig. 1 ist ein Beispiel für einen solchen Vergleich anhand von gesundem und malignem Ösophagus-Gewebe dargestellt (Quelle: Maziak et al., s.o.), wobei gut zu erkennen ist, dass das maligne Gewebe in den Wellenzahl-Bereichen von etwa 1000-1600 cm-1 und rund um 3000 cm'1 besonders stark von den Absorbanzwerten des normalen Gewebes abweicht. Diese Absorbanzunterschiede können durch mathematische Ableitung der Messkurven für ausgewählte Abschnitte des Spektrums gegebenenfalls noch weiter verdeutlicht werden.In Fig. 1, an example of such a comparison on the basis of healthy and malignant esophageal tissue is shown (source: Maziak et al., Supra), where it is well recognized that the malignant tissue in the wavenumber ranges of about 1000-1600 cm-1 and around 3000 cm'1 deviates particularly strongly from the Absorbanzwerten of the normal tissue. These differences in absorbance may be further clarified by mathematical derivation of the traces for selected portions of the spectrum.
[0003] Trotz der erwiesenen generellen Nützlichkeit von FTIR-Spektroskopie zur Diagnose sind die Verfahren nach dem Stand der Technik dennoch mit mehreren Nachteilen behaftet. Zum einen sind die verwendeten Spektrometer in der Regel ortsgebunden, d.h. nicht oder nur schwer transportierbar. Zum anderen ist eine aufwändige Kühlung der Messanordnung, z.B. mit flüssigem Stickstoff oder Helium, erforderlich, um reproduzierbare Messwerte zu erhalten. Darüber hinaus sind die Geräte in Anschaffung und Betrieb sehr teuer. Oftmals ist das untersuchte Gewebe einem oder mehreren Markierungs- oder Färbeschritten zu unterziehen, woraus verhältnismäßig hohe Kosten für jedes einzelne, damit aufgenommene Spektrum und die anschließende Diagnose resultieren.Despite the proven general usefulness of FTIR spectroscopy for diagnosis, the methods of the prior art still have several disadvantages. First, the spectrometers used are usually fixed in place, i. not or hardly transportable. On the other hand, a complicated cooling of the measuring arrangement, e.g. with liquid nitrogen or helium, required to obtain reproducible readings. In addition, the equipment in purchase and operation are very expensive. Often, the examined tissue is subjected to one or more labeling or staining steps, resulting in relatively high costs for each individual spectrum taken up and the subsequent diagnosis.
[0004] Ziel der Erfindung war daher die Bereitstellung einer Vorrichtung, mittels derer auf wirtschaftlichere, einfachere und raschere Weise zwischen unterschiedlichen Gewebearten unterschieden werden kann und die nicht zwangsläufig ortsgebunden sein sollte.The aim of the invention was therefore to provide a device by means of which a more economical, easier and faster way between different types of tissue can be distinguished and should not necessarily be localized.
[0005] Im Zuge ihrer diesbezüglichen Forschungen haben die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes herausgefunden, dass es nicht erforderlich ist, das IR-Spektrum von Zellen über einen mehr oder weniger breiten Wellenlängenbereich aufzunehmen, sondern dass es vielmehr ausreicht, lediglich Messungen bei wenigen, konkret zumindest zwei, diskreten Wellenlängen durchzuführen, um aus dem in der Folge ermittelten Verhältnis der erhaltenen Messwerte zueinander Korrelationen mit der Art oder dem Zustand der untersuchten Zellen anstellen zu können. Dies wird dadurch ermöglicht, dass die Verhältnisse der Absorbanzen bei spezifischen Wellenlängen für individuelle Zelltypen charakteristische Werte annehmen.In the course of their research in this regard, the inventors of the present application found that it is not necessary to record the IR spectrum of cells over a more or less wide wavelength range, but that it is sufficient, only measurements at a few, specifically at least to perform two discrete wavelengths in order to be able to make correlations with the type or state of the examined cells from the subsequently determined ratio of the obtained measured values. This is made possible by the fact that the ratios of the absorbances at specific wavelengths assume characteristic values for individual cell types.
[0006] Derartige Messungen bei diskreten Wellenlängen können freilich mit einer deutlich einfacher aufgebauten Vorrichtung als einem herkömmlichen FTIR-Spektrometer vorgenommen werden, mit der die obigen Nachteile des Standes der Technik teilweise oder sogar gänzlich vermieden werden können.Such measurements at discrete wavelengths can of course be made with a much simpler device than a conventional FTIR spectrometer, with the above disadvantages of the prior art can be partially or even completely avoided.
[0007] Die vorliegende Erfindung stellt daher eine Vorrichtung zur Identifizierung von Zellen in einer Probe durch Messung des Infrarot-Absorptionsvermögens der Probe bei zumindest zwei Wellenlängen bereit, wobei die Vorrichtung Folgendes umfasst: [0008] eine Lichtquelle, die Infrarotstrahlung bei den zumindest zwei Wellenlängen emittiert und zumindest eine Leuchtdiode (LED) umfasst, [0009] eine im Strahlengang der Lichtquelle angeordnete Probenhalterung, [0010] eine Photodiode als Detektor, 1/12 österreichisches Patentamt AT 11 772 U1 2011-04-15 [0011] eine Optik zur Parallelrichtung des von der Lichtquelle emittierten Lichtstrahls, zur Fokussierung desselben auf die Probe sowie des aus der Probe austretenden Lichtstrahls auf den Detektor und [0012] eine mit dem Detektor verbundene Recheneinheit zur Aufnahme, Speicherung, Umrechnung und Ausgabe der gemessenen bzw. umgerechneten Daten.The present invention therefore provides an apparatus for identifying cells in a sample by measuring the infrared absorbance of the sample at at least two wavelengths, the apparatus comprising: a light source, the infrared radiation at the at least two wavelengths and at least one light-emitting diode (LED) comprises a sample holder arranged in the beam path of the light source, a photodiode as detector, an optic for the parallel direction of the light beam emitted by the light source, for focusing the same on the sample and the light beam emerging from the sample onto the detector, and [0012] a computing unit connected to the detector for recording, storage, conversion and output of the measured or converted data.
[0013] Mittels einer solchen Vorrichtung können bei den zumindest zwei vorgegebenen Wellenlängen Messwerte für die Absorbanz der Probe erhalten und in Beziehung zueinander gesetzt werden, um für den jeweiligen Zelltyp charakteristische Absorbanzverhältnisse bei diesen Wellenlängen zu erhalten. Aufgrund der Verwendung einer oder mehrerer Infrarot-Leuchtdioden als Lichtquelle und deren äußerst geringer Wärmeentwicklung in Betrieb ist eine externe Kühlung der Messvorrichtung nicht zwingend erforderlich, so dass die Messungen bei Raumtemperatur erfolgen können. Darüber hinaus können die Dimensionen einer solchen erfindungsgemäßen Vorrichtung klein gehalten oder miniaturisiert werden, so dass bei Einbau der Letzteren in ein entsprechendes Gehäuse ein leicht transportables Messgerät zur Verfügung steht, das beispielsweise Abmessungen in der Größenordnung nur weniger Dezimeter oder sogar Zentimeter aufweisen kann.By means of such a device, measured values for the absorbance of the sample can be obtained and set in relation to each other in the at least two predetermined wavelengths in order to obtain characteristic absorbance ratios at these wavelengths for the respective cell type. Due to the use of one or more infrared light-emitting diodes as the light source and their extremely low heat development during operation, external cooling of the measuring device is not absolutely necessary, so that the measurements can take place at room temperature. In addition, the dimensions of such a device according to the invention can be kept small or miniaturized, so that when installing the latter in a corresponding housing a readily portable meter is available, which may have dimensions of the order of only a few decimeters or even centimeters, for example.
[0014] Die Definition der zumindest zwei Messwellenlängen kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Zum einen kann die Lichtquelle mehrere LEDs umfassen, deren Emissionsmaxima bei den gewünschten Messwellenlängen liegen. Andererseits, d.h. zusätzlich oder alternativ dazu, kann die Emissionswellenlänge einer oder mehrerer LEDs durch geeignete, im Strahlengang derselben liegende optische Bauteile, wie z.B. Filter, Gitter, Prismen oder dergleichen, zu einer gewünschten Messwellenlänge hin verschoben werden. Diese optischen Bauteile sind vorzugsweise austauschbar im Strahlengang der jeweiligen LED angeordnet und sind besonders bevorzugt Schmalband-Passfilter (NBPs), deren Transmissionsmaxima bei den gewünschten Messwellenlängen liegen.The definition of the at least two measuring wavelengths can be done in different ways. On the one hand, the light source can comprise a plurality of LEDs whose emission maxima are at the desired measurement wavelengths. On the other hand, i.e. additionally or alternatively, the emission wavelength of one or more LEDs may be controlled by suitable optical components located in the optical path thereof, e.g. Filter, grid, prisms or the like, are shifted to a desired measurement wavelength. These optical components are preferably arranged interchangeably in the beam path of the respective LED and are particularly preferably narrow-band pass filters (NBPs) whose transmission maxima are at the desired measurement wavelengths.
[0015] Solche Schmalband-Passfilter sind vorzugsweise nur für Licht in einem möglichst engen Wellenlängenbereich, noch bevorzugter für Licht nur einer bestimmten Wellenlänge, durchlässig, was die Genauigkeit der Messungen weiter erhöht. Die übrige Optik kann ganz herkömmlich ausgeführt sein und kann daher beispielsweise einen Satz plankonvexer Linsen umfassen, ohne jedoch speziell darauf beschränkt zu sein. Vielmehr sind jegliche der Messgenauigkeit zuträgliche optische Bauteile wie Linsen, Spiegel, Blenden, Prismen, Planplatten, Filter, Gitter usw. einsetzbar, wobei wiederum besonderes Augenmerk auf den Raumbedarf der Komponenten zu legen ist.Such narrow-band pass filters are preferably only for light in the narrowest possible wavelength range, more preferably for light only a certain wavelength, permeable, which further increases the accuracy of the measurements. The remainder of the optics may be of conventional design and therefore may include, but are not limited to, a set of plano-convex lenses, for example. Rather, any of the accuracy of measurement-beneficial optical components such as lenses, mirrors, diaphragms, prisms, plane plates, filters, grids, etc. can be used, again paying particular attention to the space requirements of the components.
[0016] Wenn mehr als eine LED als Lichtquelle vorgesehen ist, umfasst die Optik vorzugsweise weiters einen oder mehrere Strahlteiler zur Fokussierung der von den weiteren LEDs emittierten Lichtstrahlen auf denselben Punkt der Probe wie den aus der ersten LED emittierten Lichtstrahl.When more than one LED is provided as the light source, the optic preferably further comprises one or more beam splitters for focusing the light beams emitted from the further LEDs to the same point of the sample as the light beam emitted from the first LED.
[0017] Die Art der mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung messbaren Probe ist nicht speziell eingeschränkt, solange eine ausreichende Anzahl und Dichte der zu untersuchenden Zellen gewährleistet ist. So können beispielsweise sowohl flüssige Zellsuspensionen als auch feste Proben, wie z.B. Gewebeschnitte oder eigens gezüchtete Zell(mono)schichten, gemessen werden. Diese können etwa mittels entsprechender, bei der Messung inerter Küvetten oder Objektträger (z.B. aus Quarzglas, CaF2, KBr oder dergleichen) in die Probenhalterung eingeführt werden.The nature of the measurable with the device according to the invention sample is not particularly limited, as long as a sufficient number and density of the cells to be examined is ensured. For example, both liquid cell suspensions and solid samples, e.g. Tissue sections or specially grown cell (monolayer) layers are measured. These may be introduced into the sample holder by means of appropriate cuvettes or slides (e.g., fused quartz, CaF2, KBr, or the like) which are inert upon measurement.
[0018] Die Messungen erfolgen vorzugsweise an mehreren Stellen der Probe unter anschließender Mittelwertbildung durch die Recheneinheit, um so die Messgenauigkeit zu erhöhen. Dazu kann die Position der Probe in oder mitsamt der Probenhalterung verändert oder der Fokus des Strahlengangs auf unterschiedliche Stellen der Probe gerichtet werden, oder auch beides. Weiters werden vorzugsweise die LEDs pulsierend betrieben, was nachstehend ausführlicher beschrieben wird, und die von der Photodiode empfangenen Messwerte werden während eines Pulses gemittelt, was die Messgenauigkeit und die Reproduzierbarkeit der Daten weiter erhöht. 2/12 österreichisches Patentamt AT 11 772 U1 2011-04-15 [0019] In bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Vorrichtung in der Lage, Messungen bei zumindest zwei weiteren Wellenlängen vorzunehmen, wobei aus diesen Messwerten entweder zusätzliche, für den Zelltyp charakteristische Verhältnisse ermittelt werden können oder die Messwerte zur Kalibrierung der Vorrichtung herangezogen werden können, z.B. zur Normalisierung und/oder Grundlinienkorrektur der sonstigen Messwerte. So kann beispielsweise bei insgesamt vier Wellenlängen gemessen werden, indem in der Vorrichtung der Erfindung entweder vier LEDs mit entsprechenden Emissionsmaxima oder nur eine einzige LED mit vier - vorzugsweise austauschbar - im Strahlengang vorgesehenen optischen Bauteilen, wobei NBPs erneut bevorzugt sind, oder eine Kombination davon vorgesehen sind, z.B.zwei LEDs mit passenden Emissionsmaxima und eine LED mit zwei zugehörigen NBPs.The measurements are preferably carried out at several points of the sample with subsequent averaging by the arithmetic unit, so as to increase the accuracy of measurement. For this purpose, the position of the sample in or together with the sample holder can be changed or the focus of the beam path can be directed to different locations of the sample, or both. Further preferably, the LEDs are pulsed, as described in more detail below, and the measurements received by the photodiode are averaged during a pulse, further increasing the measurement accuracy and reproducibility of the data. [0019] In preferred embodiments, the device according to the invention is capable of taking measurements at at least two further wavelengths, wherein either additional conditions characteristic of the cell type are determined from these measured values or the measured values can be used to calibrate the device, eg for normalization and / or baseline correction of other measured values. Thus, for example, a total of four wavelengths can be measured by providing in the device of the invention either four LEDs with corresponding emission maxima or only a single LED with four - preferably interchangeable - provided in the beam path optical components, with NBPs are again preferred, or a combination thereof For example, there are two LEDs with matching emission maxima and one LED with two associated NBPs.
[0020] Zwar kann in einer einfachen Ausführungsform der Erfindung lediglich ein austauschbar montierter NBP im Strahlengang der zumindest einen LED vorgesehen sein, der nach Durchführung der Messung bei der ersten Wellenlänge entfernt und gegen den zweiten Filter ausgetauscht wird, oder es können zwei (oder mehrere) NBPs auf einem linear verschiebbaren Träger angeordnet sein. Aufgrund des geringeren Platzbedarfs sind jedoch zumindest zwei NBPs vorzugsweise auf jeweils einem Filterrad vorgesehen, was deren Position leicht veränderbar macht, um zwischen den beiden Messwellenlängen hin- und herschalten zu können. Das Filterrad kann dabei zum Austausch der NBPs im Strahlengang der zugehörigen LED manuell oder auch mittels eines Elektromotors rotierbar sein.Although in a simple embodiment of the invention only an interchangeable mounted NBP be provided in the beam path of the at least one LED, which is removed after performing the measurement at the first wavelength and replaced with the second filter, or there may be two (or more ) NBPs be arranged on a linearly displaceable carrier. Due to the smaller space requirement, however, at least two NBPs are preferably provided on a respective filter wheel, which makes their position easily changeable in order to be able to switch between the two measuring wavelengths. The filter wheel can be rotated manually to replace the NBPs in the beam path of the associated LED or by means of an electric motor.
[0021] Die zumindest eine LED der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in bevorzugten Ausführungsformen pulsierend betreibbar, was ermöglicht, die Absorbanzen bei mehreren Wellenlängen in kontinuierlicher Weise abwechselnd mit nur einer Photodiode zu messen, wodurch die Auswirkungen etwaiger Änderungen der Umgebungsbedingungen während der Messungen sich in den berechneten Verhältnissen nicht niederschlagen. Dazu liegt die die Pulsdauer besonders bevorzugt im Bereich von wenigen Mikrosekunden. Der Pulsbetrieb verringert zudem die Wärmeentwicklung der LEDs signifikant.The at least one LED of the device according to the invention is pulsatingly operable in preferred embodiments, which makes it possible to measure the absorbances at several wavelengths in a continuous manner alternately with only one photodiode, whereby the effects of any changes in the environmental conditions during the measurements are calculated in the Conditions do not knock down. For this purpose, the pulse duration is particularly preferably in the range of a few microseconds. The pulsed operation also significantly reduces the heat development of the LEDs.
[0022] Zur weiteren Abschirmung der LEDs und/oder der Photodiode vor äußeren Einflüssen sind diese vorzugsweise in einem eigenen Gehäuse untergebracht, was ebenfalls die Messgenauigkeit erhöht. Aus demselben Grund ist in manchen bevorzugten Ausführungsformen zwischen dem Detektor und der Recheneinheit zusätzlich ein Verstärker des Detektorsignals vorgesehen.For further shielding of the LEDs and / or the photodiode from external influences, these are preferably housed in a separate housing, which also increases the accuracy of measurement. For the same reason, in some preferred embodiments, an amplifier of the detector signal is additionally provided between the detector and the arithmetic unit.
[0023] Obwohl die Vorrichtung der Erfindung keine äußere Kühlung zwingend erfordert, kann in bestimmten Ausführungsformen dennoch zumindest ein Kühlelement zum Kühlen von Bauteilen der Vorrichtung, vor allem natürlich der LEDs und der Photodiode, vorgesehen sein. Auf diese Weise können die Auswirkungen sowohl äußerer Wärmeeinflüsse als auch der inneren Wärmeentwicklung minimiert oder gänzlich vermieden und folglich die Temperatur in der Vorrichtung konstant gehalten werden. Dazu ist jeweils ein Kühlelement besonders bevorzugt am oder im Gehäuse der LEDs und der Photodiode untergebracht. Jegliche Kühlelemente können aus thermoelektrischen Kühlern, Wärmerohren (Heatpipes) und Ventilatoren ausgewählt sein, wobei aus Gründen des Raumbedarfs thermoelektrische Kühler, d.h. eine so genannte Stromkühlung, besonders bevorzugt werden.Although the device of the invention does not require external cooling, in certain embodiments, at least one cooling element for cooling components of the device, especially, of course, the LEDs and the photodiode can be provided. In this way, the effects of both external heat and internal heat generation can be minimized or avoided altogether, and consequently the temperature in the device can be kept constant. For this purpose, a cooling element is particularly preferably housed on or in the housing of the LEDs and the photodiode. Any cooling elements may be selected from thermoelectric coolers, heatpipes, and fans, where thermoelectric coolers, i. E. a so-called power cooling, are particularly preferred.
[0024] An die Recheneinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann ein Anzeigeelement angeschlossen sein, um die Messwerte und die daraus ermittelten Verhältnisse direkt am Messgerät ablesen zu können. Dabei kann es sich beispielsweise um ein herkömmliches LCD-Display handeln, das erneut sehr klein ausgeführt werden kann.A display element can be connected to the arithmetic unit of the device according to the invention in order to be able to read the measured values and the conditions determined therefrom directly at the measuring device. This can be, for example, a conventional LCD display, which can again be made very small.
[0025] Weiters kann an die Recheneinheit ein beliebiges Speicherelement angeschlossen sein. Dieses ist nicht speziell eingeschränkt, so dass jegliche herkömmliche Speicher, wie z.B. magnetische, optische oder magnetooptische Speichermedien, z.B. Festplatten, CD- bzw. DVD-Writer und dergleichen, in Frage kommen. Vorzugsweise wird aber ein Halbleiterspeicher eingesetzt, der etwa ein Speicherchip oder eine Solid State Disk (SSD) sein kann, da so erneut der Platzbedarf, aber auch der Strombedarf minimiert wird. Letzterer ist besonders in Ausführungsformen zu berücksichtigen, in denen die Vorrichtung nicht mittels Netzstrom, sondern mittels 3/12 österreichisches Patentamt AT 11 772 U1 2011-04-15Furthermore, an arbitrary memory element can be connected to the arithmetic unit. This is not particularly limited so that any conventional memory, such as memory. magnetic, optical or magneto-optical storage media, e.g. Hard disks, CD or DVD writers and the like come into question. Preferably, however, a semiconductor memory is used, which may be a memory chip or a solid state disk (SSD), for example, since this again minimizes the space requirement, but also the power requirement. The latter is particularly to be considered in embodiments in which the device is not by means of mains power, but by means of the Austrian patent office AT 11 772 U1 2011-04-15
Akkus betrieben wird.Batteries is operated.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGENBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
[0026] Fig. 1 zeigt, wie bereits erwähnt, beispielhaft das IR-Spektrum gesunder im Vergleich zu jenem von kanzerösen Ösophaguszellen.As already mentioned, FIG. 1 shows, by way of example, the IR spectrum of healthy compared to that of cancerous oesophageal cells.
[0027] Fig. 2 zeigt schematisch das optische Konzept einer bevorzugten Ausführungsform derFig. 2 shows schematically the optical concept of a preferred embodiment of
Erfindung mit zwei LEDs in einer in den Ausführungsbeispielen verwendeten Messanordnung, d.h. Vorrichtung.Invention with two LEDs in a measuring arrangement used in the embodiments, i. Contraption.
[0028] Fig. 3 zeigt die Lage der Messwellenlängen in einem Ausschnitt des IR-Spektrums von in den Ausführungsbeispielen untersuchten Zellen.FIG. 3 shows the position of the measurement wavelengths in a section of the IR spectrum of cells investigated in the exemplary embodiments.
[0029] Fig. 4 zeigt denselben Bereich des IR-Spektrums wie Fig. 3, jedoch nach Normalisierung und Grundlinienkorrektur für zwei untersuchte Zelllinien.Fig. 4 shows the same region of the IR spectrum as Fig. 3, but after normalization and baseline correction for two cell lines examined.
[0030] Die Erfindung wird nachstehend anhand von nichteinschränkenden Beispielen näher beschrieben.The invention is described below with reference to non-limiting examples.
BEISPIELEEXAMPLES
[0031] Die Bau- und Wirkungsweise einer erfindungsgemäßen Vorrichtung wird anhand von Messungen des Verhältnisses zwischen dem Ausmaß der symmetrischen und der antisymmetrischen Streckschwingungen von CH2-Gruppen im Lipid-Anteil von Zellmembranen demonstriert, wenngleich auch eine Reihe anderer charakteristischer Verhältniszahlen zur Identifizierung der Zellen herangezogen werden kann, die beispielsweise aus dem in Fig. 1 dargestellten IR-Spektrum oder aus IR-Datenbanken ableitbar sind.The construction and operation of a device according to the invention is demonstrated by measurements of the ratio between the extent of symmetric and antisymmetric stretching vibrations of CH2 groups in the lipid portion of cell membranes, although a number of other characteristic ratios used to identify the cells can be derived, for example, from the IR spectrum shown in FIG. 1 or from IR databases.
[0032] Die in Fig. 2 schematisch dargestellte Vorrichtung bestand durchwegs aus im Handel erhältlichen Bauteilen, nämlich aus zwei LEDs c und i mit Emissionsmaxima bei 3,4 pm bzw. 3,65 pm (d.h. Wellenzahlen von 2940 bzw. 2740 cm"1) und einer Photodiode j mit einer Peakwellenlänge von 3,35 pm und einem Cutoff von 3,7 pm, die alle drei jeweils in ein selbst als Kühlkörper dienendes Gehäuse ("heat sink housing") eingebaut waren; vier Schmalband-Passfiltern e mit Durchlässigkeiten bei 3,33, 3,42, 3,51 und 3,57 pm (d.h. bei Wellenzahlen von 3000, 2920, 2850 und 2800 cm"1); sowie einer aus fünf plankonvexen Linsen d und f und einem Strahlteiler g bestehenden Optik.The device shown schematically in Fig. 2 consisted entirely of commercially available components, namely two LEDs c and i with emission maxima at 3.4 pm and 3.65 pm (ie wavenumbers of 2940 and 2740 cm " 1, respectively ) and a photodiode j having a peak wavelength of 3.35 pm and a cutoff of 3.7 pm, all three of which were incorporated respectively in a heat sink housing ("heat sink housing"); four narrow band pass filters e with transmittances at 3.33, 3.42, 3.51 and 3.57 pm (i.e., at wavenumbers of 3000, 2920, 2850 and 2800 cm "1); and one consisting of five plano-convex lenses d and f and a beam splitter g optics.
[0033] Die LEDs c und i wurden abwechselnd pulsend betrieben, wobei Pulse einer Dauer von 8 ps bei einer Trägerfrequenz von 2 kHz abgegeben wurden und die Pulsemissionen der LEDs jeweils an der oberen bzw. unteren Flanke des Trägersignals erfolgten. Dazu waren die Trägersignale beider LED-Treiber - wie auch das verstärkte Photodioden-Signal - an eine mittels Matlab-Script programmierbare Messwerterfassungskarte eines herkömmlichen PCs als Recheneinheit gekoppelt.The LEDs c and i were operated alternately pulsating, with pulses of duration 8 ps were emitted at a carrier frequency of 2 kHz and the pulse emissions of the LEDs were made respectively at the upper and lower edge of the carrier signal. For this purpose, the carrier signals of both LED drivers - as well as the amplified photodiode signal - were coupled to a Matlab script programmable data acquisition board of a conventional PC as a processing unit.
[0034] Die Strahlen aus den beiden LEDs c und i wurden mittels jeweils einer plankonvexen Linse d der Optik gebündelt und durch je einen von jeweils zwei auf einem Filterrad montierten NBPs e geleitet. Auf dem ersten Filterrad waren die NBPs e mit Durchlässigkeiten um eine zentrale Wellenlänge von 3,33 und 3,42 pm (3000 und 2920 cm"1) montiert, auf dem anderen jene um 3,51 und 3,57 pm (2850 und 2800 cm1).The beams from the two LEDs c and i were bundled by means of a plano-convex lens d of the optics and passed through one of two each mounted on a filter wheel NBPs e. On the first filter wheel, the NBPs e were mounted with transmittances around a central wavelength of 3.33 and 3.42 pm (3,000 and 2,920 cm " 1), on the other, those at 3.51 and 3.57 pm (2850 and 2800 cm-1).
[0035] Die Strahlen aus den NBPs e wurden mittels des Strahlteilers g und einer weiteren plankonvexen Linse f auf eine 1,5 mm große Apertur in der Ebene der Probenhalterung h fokussiert, wobei für jede Probe auf vier unterschiedliche 1,5-mm-Aperturen fokussiert wurde und die jeweiligen Mittelwerte dieser Messungen gebildet wurden. In die im Wesentlichen aus zwei vertikalen Schienen aufgebaute Probenhalterung h wurden herkömmliche Objektträger aus CaF2 eingeschoben, auf denen zuvor Zellmonoschichten der zu messenden Zelllinien aufkultiviert worden waren, wie nachstehend näher beschrieben wird.The beams from the NBPs e were focused by means of the beam splitter g and another plano-convex lens f onto a 1.5 mm aperture in the plane of the sample holder h, with four different 1.5 mm apertures for each sample was focused and the respective averages of these measurements were formed. Conventional slides of CaF2, on which cell monolayers of the cell lines to be measured had been cultivated in advance, were inserted into the sample holder h consisting essentially of two vertical rails, as will be described in more detail below.
[0036] Die aus den Proben austretenden Strahlen wurden mittels zweier weiterer plankonvexer 4/12 österreichisches Patentamt AT 11 772 U1 2011-04-15The rays emerging from the samples were analyzed by means of two further planoconvex AT 11 772 U1 2011-04-15
Linsen f gebündelt und auf den Detektor, d.h. die Photodiode, j fokussiert. Das Messsignal aus der Photodiode j wurde mittels eines Spannungsverstärkers verstärkt und wie oben beschrieben an die Messwerterfassungskarte der Recheneinheit weitergeleitet, dort gespeichert, umgerechnet und an eine Ausgabe weitergegeben.Lens f bundled and onto the detector, i. the photodiode, j focused. The measurement signal from the photodiode j was amplified by means of a voltage amplifier and forwarded as described above to the measured value acquisition card of the arithmetic unit, stored there, converted and passed on to an output.
In den Beispielen wurden die folgenden Zellinien auf die CaF2-Objektträger aufkultiviert und getestet. BEISPIEL 1: [0037] gesunde Madin-Darby-Hundenieren-Zellen (MDCK; ATCC CCL-34) BEISPIEL 2: [0038] Zellen von humanem epithelialem Nierenzellkarzinom A498 (ATCC HTB-44) BEISPIEL 3: [0039] Zellen von humanem Nierenkarzinom Caki-1 (ATCC HTB-46) [0040] Die Kultivierung erfolgte jeweils bei 37 °C und 5 % C02 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und Antibiotika (100 U/ml Penicillin, 100 pg/ml Streptomycin und 0,25 pg/ml Amphotericin B), die allesamt von Lonza erhalten wurden. Die Objektträger wurden vor den Messungen zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, um jegliche abgelöste Zellen und Komponenten des Mediums zu entfernen, und anschließend 3 h lang in einem sterilen Laminarströmungsbox getrocknet, um den Wasseranteil zu entfernen.In the examples, the following cell lines were cultured on the CaF2 slides and tested. EXAMPLE 1: Healthy Madin-Darby canine kidney cells (MDCK; ATCC CCL-34) EXAMPLE 2: Human epithelial renal cell carcinoma cell A498 (ATCC HTB-44) cells EXAMPLE 3: Cells of human renal carcinoma Caki-1 (ATCC HTB-46) Cultivation was carried out at 37 ° C. and 5% CO 2 respectively in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, 10% fetal calf serum (FBS) and antibiotics (100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin and 0.25 pg / ml amphotericin B), all obtained from Lonza. The slides were washed twice with phosphate buffered saline (PBS) before measurements to remove any detached cells and components of the medium and then dried in a sterile laminar flow box for 3 hours to remove the water portion.
[0041] Auf diese Weise wurden mittels der alternierenden Pulse der LEDs zunächst gleichzeitige Messungen der Absorbanz bei der höchsten und der niedrigsten Wellenlänge durchgeführt, anhand derer die Grundlinie für die Messung der charakteristischen CH2-Streckschwingungen definiert wurde, wie dies in Fig. 3 dargestellt ist. Dabei wurden die Werte nichtfunktioneller Absorbanz unterhalb der Grundlinie berechnet, die von den späteren Probenmessungen subtrahiert wurden.In this way, by means of the alternating pulses of the LEDs first simultaneous measurements of the absorbance at the highest and the lowest wavelength were carried out, on the basis of which the baseline for the measurement of the characteristic CH2 stretching vibrations was defined, as shown in FIG , The values of non-functional absorbance below the baseline were calculated, which were subtracted from the later sample measurements.
[0042] Zusätzlich wurde eine Blindprobe, d.h. ein leerer Objektträger ohne Zellen, gemessen und das Ergebnis von allen weiteren Messungen subtrahiert. Darüber hinaus stellen sämtliche Messungen aller Beispiele Mittelwerte von vier Einzelwerten - genauer gesagt vom zweithöchsten bis zum fünfthöchsten gemessenen Spannungswert - von 10 Messwerten pro Puls dar, und insgesamt wurden 500 Pulse pro Wellenlänge aufgezeichnet. Da, wie zuvor erwähnt, an vier Messpunkten pro Probe gemessen wurde, wurden somit insgesamt 8000 Pulse für jede Wellenlänge zur Berechnung herangezogen, was eine ausgezeichnete Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Messungen gewährleistete.In addition, a blank, i. an empty slide without cells, measured and the result subtracted from all further measurements. In addition, all measurements of all examples represent averages of four individual values - more precisely, the second highest to the fifth highest measured voltage value - of 10 measurements per pulse, and a total of 500 pulses per wavelength were recorded. Since, as mentioned above, four measurement points per sample were measured, a total of 8000 pulses for each wavelength were used for the calculation, which ensured excellent reliability and reproducibility of the measurements.
[0043] Nach der Definition der Grundlinie wurden die beiden Filterräder weitergedreht, so dass die beiden NBPs mit Durchlässigkeiten um 3,42 bzw. 3,51 pm im Strahlengang lagen. Danach wurde gleichzeitig die Absorbanz bei diesen Wellenlängen gemessen, von denen die obigen Grundlinienwerte subtrahiert wurde, um so die charakteristischen Werte für die antisymmetrischen (3,42 pm) und die symmetrischen (3,51 pm) CH2-Streckschwingungen des Lipidanteils der Zellmembranen zu erhalten.After defining the baseline, the two filter wheels were further rotated, so that the two NBPs with transmittances were around 3.42 and 3.51 pm in the beam path. Thereafter, the absorbance was simultaneously measured at these wavelengths, from which the above baseline values were subtracted, to obtain the characteristic values for the antisymmetric (3.42 pm) and the symmetrical (3.51 pm) CH2 stretching vibrations of the lipid portion of the cell membranes ,
[0044] Diese Werte wurden von der Recheneinheit auf den Absorbanzwert der antisymmetrischen Schwingungen bei 3,42 pm normalisiert, d.h. dieser wurde in jedem Beispiel als 1 angenommen, wie in Fig. 4 dargestellt, um für die jeweiligen symmetrischen Schwingungen bei 3,51 pm, die durchwegs numerisch kleinere Absorbanzwerte aufweisen, eine Verhältniszahl < 1 zu erhalten.These values were normalized by the arithmetic unit to the absorbance value of the antisymmetric vibrations at 3.42 pm, i. this was taken as 1 in each example, as shown in Fig. 4, for the respective symmetrical vibrations at 3.51 pm, which have numerically smaller absorbance values, a ratio < 1 to get.
[0045] Zur Überprüfung, ob die Messwerte sich im Lauf der Zeit verändern würden, so dass nur frisch gewonnene Zellproben für die Beurteilung herangezogen werden könnten, wurden die Messungen sechs Tage später wiederholt. Während dieser Zeit wurden die Objektträger in einem verschlossenen Polystyrol-Behälter bei Raumtemperatur aufbewahrt. 5/12 österreichisches Patentamt AT 11 772 U1 2011-04-15 [0046] Auf diese Weise wurden die folgenden Werte für die Verhältniszahlen (CH2 symm. / CH2 antisym.) erhalten.In order to check whether the measured values would change over time, so that only freshly obtained cell samples could be used for the assessment, the measurements were repeated six days later. During this time, the slides were stored in a sealed polystyrene container at room temperature. In this way the following values for the ratios (CH2 symm. / CH2 antisym.) Were obtained.
Zelllinie Verhältniszahl Verhältniszahl nach 6 d Beispiel 1 MDCK 0,47 0,49 Beispiel 2 A-498 0,62 0,59 Beispiel 3 Caki-1 0,73 0,71 [0047] Aus diesen Werten geht nicht nur klar hervor, dass die beiden kanzerösen Zellinien ein deutlich (nämlich um rund 32 % bzw. 55 %) höheres Verhältnis zwischen den symmetrischen und den antisymmetrischen Streckschwingungen aufweisen als gesunde Nierenzellen, sondern auch, dass sich die beiden Zellinien in diesem Verhältnis signifikant (nämlich um rund 18 %) voneinander unterscheiden. Darüber hinaus veränderten sich die Werte innerhalb von sechs Tagen bei Raumtemperatur nur geringfügig (nämlich um maximal 5 %), was zeigt, dass die Messungen nicht nur an frisch gewonnenen oder tiefgefrorenen Zellproben durchgeführt werden können.Cell line ratio Number of ratios after 6 d Example 1 MDCK 0.47 0.49 Example 2 A-498 0.62 0.59 Example 3 Caki-1 0.73 0.71 From these values it is not only clear that the two cancerous cell lines have a significantly higher ratio (ie by about 32% or 55%) between the symmetrical and the antisymmetric stretching vibrations than healthy kidney cells, but also that the two cell lines in this ratio significantly (namely by about 18%) differ from each other. In addition, the values changed only marginally within six days at room temperature (namely by a maximum of 5%), which shows that the measurements can not be carried out only on freshly obtained or frozen cell samples.
[0048] Somit ist es beispielsweise möglich, unter Verwendung einer relativ einfach aufgebauten IR-Spektroskopie-Vorrichtung gemäß vorliegender Erfindung eine Datenbank derartiger charakteristischer Schwingungsdaten und Verhältniszahlen derselben anzulegen, um anhand dieser Datenbank nach Durchführung rascher und einfacher Messungen, z.B. an Gewebeschnitten als Proben, fundierte Aussagen bezüglich der Herkunft einer (mitunter unbekannten) Zell- oder Gewebeprobe und/oder bezüglich des Zustands einer solchen Probe treffen zu können. Unter anderem kann eine Feststellung getroffen werden, ob die getesteten Zellen/Gewebe mit hoher Wahrscheinlichkeit pathologisch verändert sind oder nicht.Thus, for example, using a relatively simply constructed IR spectroscopy apparatus of the present invention, it is possible to create a database of such characteristic vibration data and ratios thereof to obtain from that database after performing rapid and simple measurements, e.g. on tissue sections as samples to be able to make informed statements regarding the origin of a (sometimes unknown) cell or tissue sample and / or with regard to the condition of such a sample. Among other things, a determination can be made as to whether the cells / tissues tested are likely to be pathologically altered or not.
[0049] Die vorliegende Erfindung stellt daher eine relativ kostengünstige Vorrichtung bereit, die beispielsweise als mobiles Schnelltestgerät für Gewebeuntersuchungen und Erstdiagnosen einsetzbar ist. LEGENDE ZU DEN ZEICHNUNGEN:The present invention therefore provides a relatively inexpensive device which can be used, for example, as a mobile rapid test device for tissue examinations and initial diagnoses. LEGEND TO THE DRAWINGS:
Figur 1 a: normale Zellen b: maligne ZellenFIG. 1 a: normal cells b: malignant cells
Figur 2 c: Leuchtdiode d: plankonvexe Linsen e: Schmalband-Passfilter f: plankonvexe Linsen g: Strahlteiler h: Probenhalterung i: Leuchtdiode j: PhotodiodeFigure 2 c: light emitting diode d: plano-convex lenses e: narrow band pass filter f: plano-convex lenses g: beam splitter h: sample holder i: light emitting diode j: photodiode
Figur 3 k: antisymmetrische CH2-Streckschwingungen I: symmetrische CH2-Streckschwingungen m: GrundlinieFIG. 3 k: antisymmetric CH 2 stretching vibrations I: symmetric CH 2 stretching vibrations m: baseline
Figur 4 n: antisymmetrische CH2-Streckschwingungen o: Caki-1FIG. 4 n: anti-symmetrical CH 2 stretching vibrations o: Caki-1
p: MDCK q: symmetrische CH2-Streckschwingungen 6/12p: MDCK q: symmetric CH2 stretching vibrations 6/12
Claims (18)
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Family Applications (1)
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| AT0030209U AT11772U1 (en) | 2009-05-11 | 2009-05-11 | DEVICE FOR IDENTIFYING CELLS |
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