WO2009074274A1 - Functionalised solid polymer nanoparticles containing epothilones - Google Patents

Functionalised solid polymer nanoparticles containing epothilones Download PDF

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WO2009074274A1
WO2009074274A1 PCT/EP2008/010371 EP2008010371W WO2009074274A1 WO 2009074274 A1 WO2009074274 A1 WO 2009074274A1 EP 2008010371 W EP2008010371 W EP 2008010371W WO 2009074274 A1 WO2009074274 A1 WO 2009074274A1
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Katrin Claudia Fischer
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Definitions

  • the present invention describes cationic surface potential polymer nanoparticles in which neutral, hydrophobic and hydrophilic pharmaceutically active substances can be included.
  • the hydrophilic and thus water-soluble substances are entrapped by ionic complexation with a charged polymer in the core of the particle by co-precipitation.
  • pharmaceutically active substances include both therapeutics, in particular epothilones, as well as diagnostics.
  • the cationic particle surface provides stable, electrostatic surface modification with partially oppositely charged compounds that may contain target-specific ligands to enhance passive and active targeting.
  • Distribution in the organism can, for. B. for the diagnosis as well as for the therapy of various tumor diseases can be used advantageously.
  • Nanoparticular systems which are used both for detection and for
  • the associated therapeutic monitoring will enable a faster detection of therapy resistance in the future and significantly improve the healing success of the patient through the timely use of alternative therapies
  • a substance class used very successfully in tumor therapy is the group of cytostatic drugs. All rapidly dividing cells of the body, including tumor cells, are damaged by these substances. However, this not only leads to a death of the tumor cells, but often other vital organs and tissues such as the bone marrow, mucous membranes or heart vessels are affected. The associated undesirable toxicity is often the dose limiting factor of therapy [Silacci D., Neri M., Modern Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, Volume 3, Part V, Wiley-VCH, Weinheim, 2005; 1271-1299].
  • the cardiotoxicity of the substance can be significantly reduced. By reducing the dose-limiting cardiotoxicity, in turn, a higher therapeutic efficiency can be achieved. Due to the demonstrable clinical benefit, the liposome-encapsulated doxorubicin was successfully approved under the name Doxil ® or Cealyx for tumor therapy.
  • Epothilones are a new class of antitumor compounds that cause apoptosis.
  • Various publications and reports of study results eg IDrugs, 2002, 5 (10): 949-954) have proven their effectiveness against cancer.
  • the dose for their administration is also known from study reports or from other publications, eg for epothilones A and B from WO 99/43320.
  • the therapeutic effect or the side-effect profile of this new substance class can be positively influenced by using special distribution mechanisms. First and foremost, the enhanced permeation and retention effect (EPR effect for short) is held responsible.
  • tumor tissue is characterized by its fast growth and various messenger substances usually by a fenestr Understand "holey" tissue structure as well as a lack of lymphatic drainage
  • holey tissue structure As well as a lack of lymphatic drainage
  • this area is also referred to as nanosize window [Hobbs SK, Monsky WL et al., Proc Natl Acad., USA, 1998; 95: 4607-4612] [Brigger I., Dubemet C. et al., Adv. Drug DeNv.
  • the nanoparticles must circulate in the blood stream for a sufficient period of time.
  • This requires particle sizes between about 10 nm and 380 nm and suitable particle surfaces.
  • pegylated particle surfaces can prevent the body's own proteins from identifying the particles as foreign and rapid elimination via the organs of the reticulo-endothelial system (short RES) [Otsuka H. et al., Adv. Drug DeNv. Rev., 2003; 55 (3): 403-419].
  • active ligands on the particle surface eg -A-
  • tissue-specific enrichment can be optimized again [Nobs L. et al., Pharm. Sei., 2004; 93: 1980-1992] [Yokoyama M., J. Artif. Organs, 2005; 8: 77-84].
  • the cell membrane For a recording of the active ingredients in the cell, another physiological barrier, the cell membrane, must be overcome.
  • the active substance is introduced into the cell via endocytosis with the aid of nanoparticles, it is possible to circumvent ejecting transporters and to prevent multi-drug resistance (MDR) [Bharadwaj V., J. Biomed. Nanotechnol., 2005; 1: 235-258] [Huwyler J. et al., J. Drug Target., 2002; 10 (1): 73-79].
  • MDR multi-drug resistance
  • the release properties of the active substance from the nanoparticle can additionally be controlled by targeted selection of the polymer.
  • a nanoparticulate formulation can thus minimize the frequency of application and lead to a reduction of the therapeutically necessary dose. Furthermore, unwanted plasma peak levels can be avoided by encapsulation in nanoparticles and a delayed release can be achieved.
  • tissue or cell specific ligands e.g. B. antibodies
  • controllable drug release by targeted polymer selection
  • a nanoparticulate system which already fulfills all the described advantages, has not yet been developed according to the current state of knowledge.
  • the variety of nanoparticulate carrier systems described in the literature also makes it clear that there is currently no optimal nano-formulation for all problems.
  • the overall structure of the particles, matrix-forming substances, and especially their surface are of crucial importance for in vivo behavior [Choi S.W., Kim W.S., Kim J.H., Journal of Dispersion Science and Technology, 2003; 24 (3 & 4): 475-487].
  • the physicochemical properties of various drugs, especially classes of drugs differ greatly. Accordingly, there remains a need in the development of colloidal drug carrier systems with improved properties.
  • Optical imaging techniques such as sonography, X-ray diagnostics, cross-sectional imaging (CT, MRI) and nuclear medicine (PET, SPECT) are available for in vivo detection.
  • CT cross-sectional imaging
  • PET nuclear medicine
  • SPECT nuclear medicine
  • Another and relatively new method is Optical Imaging, whose detection principle is based on usage is based on near-infrared fluorescence. It is a non-invasive procedure that works without ionizing radiation and is very inexpensive and inexpensive compared to methods such as MRI.
  • the NIR dyes such as indocyanine green developed for such an application are very soluble in water, which makes it difficult to efficiently encapsulate them in a hydrophobic polymer matrix.
  • the reason for this is the rapid change of the hydrophilic substance into the aqueous phase, for example during production by means of nanoprecipitation.
  • hydrophilic substances in nanoparticles only a few technologies are available that have different disadvantages.
  • the amphiphilic nature of liposomes or polymerosomes, for example allows the inclusion of hydrophilic substances in the aqueous interior of the particles, whereas hydrophobic compounds can be incorporated in the membrane. Due to the localization in the core or in the shell of the particles, the loading is very limited and thus usually insufficient.
  • a further disadvantage is that, above all, hydrophilic substances in an aqueous environment are rapidly washed out of such systems.
  • An alternative encapsulation of water-soluble substances in Polyelektrolytkomplexe is limited, since dyes such as indocyanine green (ICG) are small molecules with only a few charged groups, which are insufficient charges for electrostatic complexation available.
  • ICG indocyanine green
  • polyelectrolyte complexes in aqueous solution are very dynamic systems, as a result of which they usually have inadequate colloidal stability in plasma [Thünemann AF et al., Adv. Polym. Sei., 2004; 166: 113-171].
  • both water-soluble dyes for diagnosis and therapeutic substances which are usually poorly water-soluble due to their hydrophobic properties, should be able to be encapsulated effectively and with sufficient stability to wash out.
  • a technological challenge remains to ensure adequate particle stability on the one hand and specific enrichment in the target tissue on the other hand through the use of suitable surfaces.
  • the whereabouts at the place of enrichment (target tissue) is again u. a. depending on how well the particles are absorbed into the tissue and the cell.
  • polymers or substances carrying amino groups are known to possess endo-osmotic activity, ie they promote intracellular activity Release of the particles from the endolysosomes by damage to the endolysosome membrane [DeDuve C. et al., Biochem. Pharmacol., 1974; 23: 2495-2531]. If the particles remain within the cell in the endolysosomes, a degradation of the particle matrix and the substances contained therein takes place via cell-specific enzymes. The endolysosomal release of the encapsulated drugs is therefore essential for the therapeutic effect.
  • nanoparticulate systems with cationic surface properties should be prepared without the potential toxicologically harmful properties hindering an in vivo application.
  • the particle surface must be inconspicuous to the body's own defense mechanisms (Opsonine, RES), allowing only a sufficiently long circulation time, which is a prerequisite for a corresponding accumulation of particles from the blood stream in the target tissue.
  • the nanoparticulate systems should continue to support uptake into the target cell and endolysosomal release.
  • Another difficulty in making nanoparticulate systems is to apply suitable substances or target-recognizing structures to the particle surface.
  • the surface of the particles is modified by means of covalent coupling reactions.
  • Prerequisite for this are functional groups on the polymer backbone or on the particle surface, which can be irreversibly linked by appropriate chemical coupling reactions with the target-recognizing molecule [Nobs L. et al., J.Pharm. Sei., 2004; 93: 1980-1992].
  • the stability of colloidal dispersions is often greatly reduced by the reagents or under the reaction conditions, the chemical implementation is usually complicated and problematic [Koo OM et al., Nanomedicine, 2005; 1 (3): 193-212] [Choi SW et al., J. Dispersion Sei.
  • An object of the invention was therefore to provide an improved pharmaceutical formulation in which both hydrophilic and hydrophobic drugs can be encapsulated.
  • a flexible and sufficiently stable surface modification should allow optimal accumulation in the diseased tissue.
  • such a colloidal system must also be efficiently incorporated into the target tissue as well as into the individual cells where endolysosomal release can occur.
  • they should be practicable manufacturing methods to enable production in a timely and cost-effective manner.
  • the invention relates to polymer nanoparticles having a cationic surface potential containing a cationic polymer and a sparingly water-soluble polymer, characterized in that said polymer nanoparticles encapsulate diagnostic and therapeutic agents, in particular epothilones, together or separately, or contain only epothilones.
  • the cationically functionalized particle surface can be electrostatically stably and flexibly surface-modified with a partially oppositely charged compound.
  • An object of the described invention is therefore the use of nanoparticles according to the invention for the detection of diseases (diagnosis), for the treatment of diseases (therapy) as well as for the monitoring of a therapy.
  • Another aspect of the invention is a kit consisting of separately prepared nanoparticulate systems (a) and (b) thereof
  • a composition comprising (a) a diagnostic agent encapsulated in a particle and (b) a diagnostic agent encapsulated in a particle
  • a further aspect of the invention is a kit as described above, wherein the constituents (a) and (b) are in the solid state, for example as lyophilisate, and if appropriate additionally an agent (c) which is suitable for use in the nanoparticulate systems ( a) and (b) optionally optionally separately or together to disperse.
  • the invention includes the use of the nanoparticulate systems for the preparation of a suitable drug form using pharmaceutically acceptable excipients, which are necessary for the respective dosage form.
  • the drug form developed in the context of the invention can be applied to humans or animals via various routes of administration. Preferably, it is administered iv. Necessary application systems known to the person skilled in the art are likewise part of the invention described here.
  • the composition of the nanoparticles includes a poorly water-soluble polymer, which is preferably a biodegradable polymer or else a mixture of various biodegradable polymers.
  • a biodegradable polymer can be described via individual monomer units which form said polymer by means of polymerization or other processes.
  • the polymer can be defined by its name.
  • the poorly water-soluble polymer is derived from the group of natural and / or synthetic polymers or homo- and / or
  • Methacrylates the lactides, for example, the L-lactides or DL-lactides, the glycolides, the caprolactones such as ⁇ -caprolactones and others from.
  • said polymer or part of the polymer is selected from the group of polycyanoacrylates and polyalkylcyanoacrylates (PACA), such as, for example, polybutylcyanoacrylate (PBCA), polyesters, for example poly (DL-lactides), poly (L-lactides), polyglycolides, polydioxanones, Polyoxazolines, poly (glycolide-co-trimethylene carbonates), polylactide-co-glycolides (PLGA) such as poly (L-lactide-co-glycolide) or poly (DL-lactide-co-glycolide), poly (L-lactide -co-DL-lactides), poly (glycolide-co-trimethylene), poly (carbonates-co-dioxanones), alginic acid, hyaluronic acid, polysialic acid, acidic cellulose derivatives, acidic starch derivatives,
  • PDA polybutylcyanoacrylate
  • polyesters for example
  • Polysaccharides such as dextrans, alginates, cyclodextrins, hyaluronic acid, chitosans, acidic polyamino acids, polymeric proteins such as collagen, gelatin or albumin,
  • Polyamides such as poly (aspartic acid), poly (glutamic acid), poly (lminocarbonate) (poly (carbonate) derived from tyrosine, poly ( ⁇ -hydroxybutyrate),
  • Polyanhydrides such as, for example, polysebacidic acid (poly (SA)), poly (adipic acid), poly (CPP-SA), poly (CPH), poly (CPM) aromatic polyanhydrides, polyorthoesters, polycaprolactones such as poly- ⁇ - or ⁇ -caprolactones,
  • Polyphosphoric acid such as polyphosphates, polyphosphonates, polyphosphazenes, poly (amide-enamines), azopolymers, polyurethanes, dendrimers, Pseudopolymaminoklaren as well as all mixtures and co-polymers of the same compounds.
  • the sparingly water-soluble polymer is selected from the group of the following polymers:
  • Polyacrylates, polylactides and Polygylcolide, or their co-polymers are examples of polyacrylates, polylactides and Polygylcolide, or their co-polymers.
  • the sparingly water-soluble polymer is selected from the group of polyalkyl cyanoacrylates (PACA).
  • PDA polyalkyl cyanoacrylates
  • polyalkylcyanoacrylates shows the structure indicated (formula I), wherein the stated radical R is preferably linear and branched alkyl groups having 1 to 16 carbon atoms, a cyclohexyl, benzyl or a phenyl group.
  • the sparingly water-soluble polymer is a polybutyl cyanoacrylate (PBCA) (formula II).
  • the poorly water-soluble polymer forms the larger proportion of the polymer matrix of the particles.
  • nanoparticles with a cationically charged surface potential are produced by the incorporation of compounds with amino groups, in particular a cationic polymer, into a poorly water-soluble, solid polymer matrix.
  • the cationic polymer is derived from the group of natural and / or synthetic polymers or from homopolymers and copolymers of corresponding monomers.
  • Suitable cationic polymers in the context of this invention are polymers having free primary, secondary or tertiary amino groups which can form salts with any low molecular weight acid, the salts being soluble in aqueous-organic solvents. Also suitable are polymers or their salts which carry quaternary ammonium groups and are soluble in organic solvents.
  • the following groups of cationic polymers, polycations and polyamine compounds or polymers of homo- and co-polymers of corresponding monomers are particularly suitable: modified natural cationic polymers, cationic proteins, synthetic cationic polymers, aminoalkanes of different chain length, modified cationic dextrans, cationic polysaccharides , cationic starch or Cellulose derivatives, chitosans, guar derivatives, cationic cyanoacrylates, methacrylates and methacrylamides, and such monomers and comonomers which can be used to form corresponding suitable compounds and the corresponding salts which can form with suitable inorganic or low molecular weight organic acids.
  • Hydroxyethylcellulose trimethylamine, polyallylamines, protamine chloride, polyallylamine hydrosalts, polyamines, polyvinylbenzyltrimethylammonium salts, polydiallyldimethylammonium salts, polyimidazoline, polyvinylamine and polyvinylpyridine, polyethyleneimine (PEI), putrescine (butane-1, 4-diamine), spermidine (N- (3-aminopropyl) butane-1, 4 -diamine), spermine (N, N'-bis (3-aminopropyl) butan-1, 4-diamine) dimethylaminoethyl acrylate, poly-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate P (DMEAMA), dimethylaminopropylacrylamide, dimethylaminopropylmethacrylamide, dimethylaminostyrene, vinylpyridine and Methyldiallylamine, poly-DADMAC, poly
  • polymers are a particular aspect of the invention: polyamines, in particular diethylaminoethyl-modified dextrans, polylysine, protamine sulfate, protamine chloride, polyallylamines and polyallylamine hydrosalts,
  • Polydiallyldimethylammonium salts polyvinylbenzyltrimethylammonium salts, polyimidazoline, polyvinylamine and polyvinylpyridine, polyethyleneimine (PEI), poly-DADMAC, guar, or deacetylated chitin and the corresponding salts which may form with suitable inorganic or low molecular weight organic acids.
  • the following monomers are suitable: hydroxymethylcellulosetrimethylamine, hydroxyethylcellulosetrimethylamine, putrescine (butane-1, 4-diamine), spermidine (N- (3-aminopropyl) butane-1,4-diamine), spermine (N, N'-bis (3 - aminopropyl) butane-1, 4-diamine), dimethylaminoethyl acrylate,
  • Suitable acids for salt formation are, for. B.: Hydrochloric acid, sulfuric acid, but especially acetic acid, glycolic acid or lactic acid.
  • the amino group-bearing compound in particular a cationic polymer, in an organic solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), or in a mixture of these solvents with water be solved.
  • an organic solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), or in a mixture of these solvents with water
  • the polymer nanoparticles contain, as the amino group bearing compound, a cationically modified polyacrylate (poly-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, P (DMAEMA)) (Formula 3).
  • a cationically modified polyacrylate poly-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, P (DMAEMA)
  • the biodegradable, cationically modified polyacrylate eg P (DMAEMA), P (DMAPMAM) is encapsulated in the polymer matrix, in particular the PBCA polymer matrix, by nanoprecipitation.
  • the surface of the resulting nanoparticles has a positive (cationic) surface potential (zeta potential) due to the amino groups of the cationic polymer.
  • the cationic particle surface ensures good cell uptake and enables flexible electrostatic surface modification with partially anionically charged compounds.
  • the polymer nanoparticles contain as cationic polymer a modified polyacrylate poly (dimethylaminopropylmethacrylamide (P (DMAPMAM)).
  • DMAPMAM dimethylaminopropylmethacrylamide
  • the polymer nanoparticles contain as cationic polymer polyethyleneimine (PEI) of various molecular weights, in particular 1, 8 kDa, 10 kDa, 70 kDa and 750 kDa, (formula 4).
  • PEI polyethyleneimine
  • PEI is a polycation commonly used in the field of non-viral gene therapy for DNA polyplexes (PEK) and accordingly much studied [Remy J.-S. et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 1998; 30 (1-3): 85-95].
  • the particle shell consists of PEI polymer chains, which produce a cationic surface potential.
  • diagnostic as well as therapeutic substances can be included in the polymer matrix by means of nanoprecipitation.
  • the following substance classes for different molecular imaging methods can be used as diagnostic substances for encapsulation, in particular contrast agents or tracers for the following method for molecular imaging (molecular imaging): optical imaging, e.g. DOT (diffuse optical imaging), US (ultrasound imaging), OPT (optical projection tomography), near infrared fluorescence imaging, fluorescence protein imaging and BLI (bioluminescence imaging) and magnetic resonance imaging (MRI, MRI) and X-ray imaging (X-ray).
  • optical imaging e.g. DOT (diffuse optical imaging), US (ultrasound imaging), OPT (optical projection tomography), near infrared fluorescence imaging, fluorescence protein imaging and BLI (bioluminescence imaging) and magnetic resonance imaging (MRI, MRI) and X-ray imaging (X-ray).
  • DOT direct optical imaging
  • US ultrasound imaging
  • OPT optical projection tomography
  • near infrared fluorescence imaging fluorescence protein imaging
  • BLI bioluminescence
  • nanoparticulate systems according to the invention which contain exclusively a diagnostic active substance are not covered by the patent claims.
  • the diagnostic agent is a dye, in particular selected from the following group: fluorescein, fluorescein isothiocyanate, carboxyfluorescein or calcein, tetrabromfluoresceins or eosines, tertaiodefluorescein or erythrosines, difluorofluorescein, such as Oregon GreenTM 488, Oregon GreenTM 500 or Oregon GreenTM 514, Carboxyrhodol (Rhodol Green TM) dyes (U.S. 5,227,487, U.S. 5,442,045), carboxyrodamine dyes (Rhodamine Green TM Dyes) (U.S.
  • the diagnostic substance is a fluorescent dye.
  • the diagnostic agent is a fluorescent near-infrared (NIR) dye.
  • NIR dyes preferably used for optical imaging, absorb and emit light in the NIR range between 650 nm and 1000 nm.
  • the preferred dyes belong to the class of polymethine dyes and are selected from the following groups: carbocyanines such as diethyloxacarbocyanine (DOC), diethyloxadicarbocyanine (DODC ), Diethyloxatricarbocyanine (DOTC), indodi or indotricarbocyanines, tricarbocyanines, merocyanines, oxonol dyes (WO 96/17628), rhodamine dyes, phenoxazine or phenothiazine dyes,
  • carbocyanines such as diethyloxacarbocyanine (DOC), diethyloxadicarbocyanine (DODC ), Diethyloxatricarbocyanine (DOTC), in
  • Tetrapyrrole dyes especially benzoporphyrins, chorine and phthalocyanines.
  • Suitable inorganic cations or counterions for these dyes are, for example, the lithium ion, the potassium ion, the hydrogen ion and in particular the sodium ion.
  • Suitable cations of organic bases include those of primary, secondary or tertiary amines, such as ethanolamine, diethanolamine, morpholine, glucamine, N, N-dimethylglucamine, and especially N-methylglucamine and polyethyleneimine.
  • Suitable cations of amino acids are, for example, those of lysine, arginine and ornithine and the amides of otherwise acidic or neutral amino acids.
  • the dyes can be used as bases or as salts of these.
  • the diagnostic substance is a carbocyanine dye.
  • the general structure of the carbocyanines is described as follows: (Formula VI)
  • R 30 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, a carboxy group, an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms or a chlorine atom
  • R 31 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • R 20 to R 29 , R 32 and R 33 independently of one another represent a hydrogen atom, a hydroxy group, a carboxy, a sulfonic acid radical or a carboxyalkyl, alkoxycarbonyl or alkoxyoxoalkyl radical having up to 10 C atoms or a sulfoalkyl radical up to 4 carbon atoms, or for a non-specifically binding macromolecule, or for a radical of the general formula (VII)
  • R 20 to R 29 is a non-specifically binding macromolecule or the general formula VII wherein o and s are 0 or independently of one another are an integer from 1 to 6, q and v independently of one another are 0 or 1, R 34 represents a hydrogen atom or a methyl radical,
  • R 35 is an alkyl radical having 3 to 6 C atoms which has 2 to n-1 hydroxyl groups, where n is the number of C atoms, or an alkyl radical having 1 to 6 C atoms which is substituted by 1 to 3 carboxy groups,
  • carbocyanines In the case of carbocyanines, further reference is made to the applications DE 4445065 and DE 69911034, the content of which should also be the subject of this application.
  • the use of the carbocyanines mentioned there for the nanoparticles of the present invention is a particular aspect in the context of the present invention.
  • anionic, readily water-soluble substances such as certain carbocyanines can be stably entrapped in the hydrophobic polymer matrix of the described nanoparticles.
  • an anionic water-soluble substance is encapsulated by ion complexation and co-precipitation with a cationic polymer in a sparingly water-soluble polymer matrix by nanoprecipitation, resulting in particles of defined size.
  • NIR-active fluorescent dye By incorporating an NIR-active fluorescent dye into the polymer matrix of the particles, they are non-invasively detectable by fluorescence in the tissue by means of optical imaging. There is thus the possibility in vivo of detecting the distribution or accumulation of fluorescently labeled nanoparticles.
  • the carbocyanine dye is the readily water-soluble anionic tetrasulfocyanine (TSC) (Formula IX).
  • the carbocyanine dye is IDCC (indodicarbocyanine) (Formula IX).
  • the carbocyanine dye is ICG (indocyanine green) (Formula XI).
  • the encapsulated pharmaceutically active substance is an epothilone.
  • the epothilone is defined by the general formula (XII)
  • R 1a , R 1b are each independently of one another hydrogen, C 1 -C 10 -alkyl, aryl, aralkyl, or together a group - (CH 2 ) m - wherein m is 2 to 5;
  • R 2a R 2b independently of one another are hydrogen, C 1 -C 10 -alkyl, C 2 -C 10 -alkenyl, C 2 -C 10 -alkynyl, aryl, aralkyl, or together form a group - (CH 2 ) n - where n is 2 to 5 .
  • R J is hydrogen, C 1 -C 0 alkyl, aryl, aralkyl
  • R, 4 ⁇ a, R 4b independently of one another are hydrogen, C 1 -C 10 -alkyl, aryl, aralkyl, or together form a group - (CH 2 ) P - where p is 2 to 5;
  • R b is hydrogen, C 1 -C 10 -alkyl, aryl, aralkyl, CO 2 H, CO 2 alkyl, CH 2 OH, CH 2 O-C 1 -C 5 -alkyl, CH 2 OAcyl, CN, CH 2 NH 2 , CH 2 N ((C r C 5 alkyl), acyl) i, 2, or CH 2 Hal, Chai 3;
  • R 6 , R 7 are independently hydrogen, or together one
  • DE can not be CH 2 -O;
  • R 8 is hydrogen, C 1 -C 10 alkyl, aryl, aralkyl, halogen, CN;
  • R 9 , R 10 independently of one another are hydrogen, C 1 -C 20 -alkyl, aryl,
  • Aralkyl or together with the methylene carbon atom, a 5- to 7-membered carbocyclic ring;
  • R 11 is hydrogen or a protective group PG Z ;
  • R 12 is hydrogen, or C 1 -C 10 alkyl
  • PG Z CrC 2O alkyl a C 4 -C 7 cycloalkyl group which may contain one or more oxygen atoms in the ring, aryl, aralkyl, C 1 -C 20 acyl, aroyl, C 1 -C 20 alkylsulfonyl, arylsulfonyl, tri (C 1 -C 20 alkyl) silyl, di ( C 1 -C 20 alkyl) arylsilyl, (C 1 -C 20 alkyl) diarylsilyl, or tri (aralkyl) silyl;
  • the epothilone is defined by the formula (XII) wherein R 1a , R 1b independently of one another are hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl, or together form the group - ⁇ CH 2 ) m - where m is 2 to 5;
  • R 2a , R 2b independently of one another are hydrogen, C 1 -C 8 -alkyl, or together form the group - ⁇ CH 2 ) m - where m is 2 to 5, or C 2 -C 6 -alkenyl, or C 2 -C 6 -alkynyl ;
  • R 3 is hydrogen
  • R 48 , R 4b independently of one another are hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl,
  • R 5 is hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl.
  • R 6 , R 7 are both hydrogen, or together another bond, or together an epoxide function
  • DE is the group H 2 C-CH 2 , or
  • X is the group CR 9 R 10 ;
  • R 8 is hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl, halogen,
  • R 9, R 10 are both independently hydrogen, C r C 4 alkyl,
  • R 12 is hydrogen, or C 1 -C 4 -alkyl; encapsulated as a single stereoisomer or as a mixture of different stereoisomers and / or as pharmaceutically acceptable salts.
  • R 1a , R 1b are both independently of one another hydrogen, C 1 -C 2 -alkyl, or together form a group - (CH 2 ) m - where m is 2 to 5,
  • R 2a , R 2b are each independently of one another hydrogen, C 1 -C 5 alkyl, or together the group a - (CH 2 ) n - wherein n is 2 to 5, or C 2 -C 6 alkenyl, or C 2 -C 6 alkynyl; R 3 is hydrogen,
  • R 48 , R 4b are each, independently of one another, hydrogen, C 1 -C 2 -alkyl, R 5 is hydrogen or methyl or trifluoromethyl,
  • R 6 , R 7 together form another bond, or together an epoxide function
  • DE is the group H 2 C-CH 2 .
  • X is the group CR 9 R 10 ;
  • R 8 is hydrogen, methyl, chlorine, fluorine,
  • R 9 , R 10 are both independently of one another hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl,
  • R 12 is hydrogen or C 1 -C 4 -alkyl; encapsulated as a single stereoisomer or as a mixture of different stereoisomers and / or as a pharmaceutically acceptable salt.
  • epothilones of general formula (XII) are encapsulated, which are listed in the following list: (4S, 7R, 8S, 9S, 13E / Z, 16S) -4,8-dihydroxy-16- (2-methyl -benzoxazol-5-yl) -1-oxo-5,5,9,1-tetramethyl-phi-en-i-ylJ-cyclohexadec-IS-ene-1-dione;
  • the use of the nanoparticles of the invention containing an epothilone for the treatment of tumors diseases associated with inflammatory reactions is an aspect of the invention.
  • Another aspect of the invention is a method of treating tumors or diseases associated with inflammatory reactions in which an effective amount of the active ingredient contained in a nanoparticulate system according to the invention is administered to humans or animals.
  • the diagnostic agent and the epothilone are incorporated together in the particle. Accordingly, the use of these nanoparticles for the treatment of tumor diseases or diseases associated with inflammatory reactions as well as for the simultaneous diagnosis and / or monitoring of the course of therapy is an aspect of the invention. In particular, therapy and monitoring is an aspect of the present invention.
  • a further aspect of the invention is therefore a method for the treatment, diagnosis and / or monitoring of tumor diseases or diseases associated with inflammatory reactions in which an effective amount of the active substance contained in a nanoparticulate system according to the invention is administered to humans or animals.
  • a method of treatment and monitoring of therapy is one aspect of the invention.
  • the diagnostic agent and the epothilone are present in separate identical nanoparticulate systems, which in particular have the same structure.
  • the invention thus also relates to a kit consisting of the particles according to the invention which together contain a diagnostic agent and an epothilone and a kit which contains (a) the particles according to the invention comprising a diagnostic agent and (b) the particles according to the invention comprising an epothilone separately, and Use of the kit for therapy and diagnosis / monitoring.
  • the polymer nanoparticles according to the claims are precipitation aggregates which are produced by nanoprecipitation.
  • the following production methods are available for this purpose: Direct precipitation (precipitation) in a test tube by introducing the dissolved polymer-substance mixture into a surfactant-containing aqueous solution which is mixed by means of a magnetic stirrer.
  • the organic solvent is abruptly withdrawn from the matrix polymer and the substances dissolved with it, when the polymer-containing organic solution is added to a significantly larger volume of an aqueous solution.
  • compounds dissolved in the polymer phase with amino groups are co-encapsulated in the sparingly soluble polymer during the precipitation.
  • the condition for this is the unlimited miscibility of the organic solvent (particularly suitable, for example, acetone, ethanol) with water and the insolubility of the matrix polymer in the aqueous phase.
  • the diagnostic agent is negatively charged and trapped in the particle as an ion pair with the cationic polymer.
  • the surface of the polymer nanoparticles is electrostatically modified.
  • the electrostatic modification of the cationic nanoparticle surface is an outstanding advantage of the present invention.
  • the particle surface can be modified with a suitable substance without a chemical coupling reaction.
  • the prerequisite for this is that the modifying agent has partial charges which are opposite to the particle surface charge.
  • electrostatic surface modification by charge titration allows a simple, flexible and versatile modification of the particle surface.
  • the enrichment (active and passive targeting) of nanoparticles from the bloodstream into the target tissue requires that the particles circulate in the blood stream for a sufficient period of time.
  • the circulation time in the body can be adjusted individually, in particular by using polyethylene oxides or polyethylene glycols (see Example 5).
  • electrostatic surface modification described here can be carried out quickly and without problems directly before use. This is done by simply mixing appropriate amounts of the nanoparticle dispersion with the modifying agent. Thus, it is additionally possible to prepare and store the core particles separately from the surface-modifying agent. This is for a particularly advantageous for the colloidal long-term stability. On the other hand, extremely labile surface-modifying substances such as peptides or antibodies can be stored under suitable conditions until use.
  • the separation of core particles and modifying agent further allows a surface modification according to the individual requirements of the patient.
  • the surface modification on a modular principle offers maximum flexibility for diagnosis, therapy and monitoring, whereby the uncomplicated implementation of the modification is carried out directly by the user.
  • a preferred construction of the surface-modifying agent for cationically functionalized polymer nanoparticles, in particular the described PBCA nanoparticles, is shown in formula 5.
  • the partially anionically charged moiety fulfills the function of an anchor on the positively charged particle surface through electrostatic interactions.
  • the neutral, aligned to the surrounding aqueous medium moiety consists of polyethylene glycol and / or polyethylene oxide units (PEG units) of different lengths.
  • PEG chains having a molecular weight of from 100 to 30,000 daltons and more preferably from 3,000 to 5,000 daltons. This moiety may alternatively be made of other suitable structures, such as.
  • HES hydroxyethyl starch
  • the radical R is preferably hydrogen or a methyl unit.
  • the anionic anchor may be, for example, a polymer of 5 to 50 units of glutamic acid (Glu) or aspartic acid (Asp) or the salts of the acids. It may also be a mixed polymer of the named subunits. Furthermore, uncharged subunits such. B. neutral amino acids in the anionic block regularly or irregularly incorporated. Generally suitable as a negatively charged moiety (anchor) compounds or polymeric structures with groups such as acetate, carbonate, citrate, succinate, nitrate, carboxylate, phosphate, sulfonate or sulfate groups, as well as salts and free acids of these Groups.
  • the anionic anchor may preferably be a polyamino acid.
  • the anionic anchor consists of a polymer of up to 20 units of glutamic acid (Glu) or aspartic acid (Asp) or its salts, or their copolymers, which may optionally also contain neutral amino acids.
  • the surface is modified with Glu (10) -b-PEG (110), Glu (10) -b-PEG (114) or Asp (15) -b-PEG (114).
  • the surface is modified with Glu (10) -b-PEG (110) or Asp (15) -b-PEG (114).
  • the surface of the polymer nanoparticle is modified with Glu (10) -b-PEG (110) (Formula XIV).
  • the negative moiety (anchor) is the carboxylate groups of the glutamic acid subunits of the block copolymer.
  • Formula XIV Structural Formula of GIu (10) -b-PEG (110);
  • a target recognizing structure is present.
  • This target recognizing structure has at least one negatively charged moiety which is applied to the cationic particle surface by electrostatic interactions.
  • Another particularly preferred structure of the surface-modifying agent for cationically functionalized polymethylene particles, in particular the described PBCA nanoparticles, is shown in formula XV.
  • the anionic anchor may be constructed according to the previously described description of formula XIII.
  • the partially anionically charged moiety fulfills the function of an anchor on the positively charged particle surface through electrostatic interactions.
  • the middle, neutral part of the molecule consists of polyethylene glycol units and / or polyethylene oxide units (PEG units) of different lengths. Preference is given here to PEG chains having a molecular weight of from 100 to 30,000 daltons and more preferably from 3,000 to 5,000 daltons. This moiety may alternatively be made of other suitable structures, such as. As hydroxyethyl starch (HES) and all possible polymeric compounds exist.
  • HES hydroxyethyl starch
  • the ligand X of the surface-modifying agent also called the target-recognizing structure in the following, serves to improve passive and active accumulation mechanisms of the polymanneroparticles.
  • Suitable ligands X as targeting structures may be antibodies, peptides, receptor ligands of ligand mimetics or an aptamer. Structures include amino acids, peptides, CDR (compementary determining regions), antigens, haptens, enzyme substances, enzyme cofactors, biotin, carotenoids, hormones, vitamins, growth factors, lymphokines, carbohydrates, oligosaccharides, lecithins, dextrans, lipids, nucleosides such as DNA or an RNA molecule containing native, modified or artificial nucleosides, Nucleic acids, oligo nucleotides, polysaccharides, B, A, Z HeNx or hairpin structure (hairpin), modified polysaccharides as well as receptor binding substances or fragments thereof. Target-recognizing structures may also be transferrin or folic acid or parts thereof, or all possible combinations of the foregoing.
  • the targeting structure is selected from a list containing an antibody, a protein, a polypeptide, a polysaccharide, a DNA molecule, an RNA molecule, a chemical moiety, a nucleic acid, a lipid, a carbohydrate or combinations of the foregoing.
  • ligands are bound to the nanoparticles via electrostatic interactions, but it is also possible to bind the ligands via covalent bonds to the particle surface. Furthermore, it is possible to incorporate a linker between ligand and nanoparticles.
  • the electrostatic attachment of the target-recognizing structures takes place via charge interactions with at least one negatively charged moiety on the cationic particle surface.
  • a negatively charged moiety are compounds or polymeric structures having groups such as acetate, carbonate, citrate, succinate, nitrate, carboxylate, phosphate, sulfonate or sulfate groups, as well as salts and free acids of these groups ,
  • the size of the nanoparticles is between 1 nm and 800 nm.
  • the size of the nanoparticles is between 5 nm and 800 nm.
  • the size of the nanoparticles is between 1 nm and 500 nm. In a preferred embodiment, the size of the nanoparticles is between 1 nm and 300 nm.
  • the size of the nanoparticles is between 5 nm and 500 nm.
  • the size of the nanoparticles is between 5 nm and 300 nm.
  • the size of the nanoparticles is between 10 nm and 300 nm.
  • the size of the resulting polymer nanoparticles is determined by photon correlation spectroscopy (PCS).
  • the preparation of the polymer nanoparticles is characterized by carrying out the following process steps:
  • the water-insoluble polymer is dissolved in a suitable organic solvent
  • Solvent which is infinitely miscible with water preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, isopropanol dimethyl sulfoxide (DMSO), or dissolved in a mixture of these solvents with water.
  • the cationic polymer is dissolved in a suitable solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethylsulfoxide (DMSO), or dissolved in a mixture of these solvents with water.
  • the active ingredient (diagnostic agent and / or epothilone) is dissolved in an organic solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethylsulfoxide (DMSO), isopropanol or in a mixture of these solvents with water.
  • an organic solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethylsulfoxide (DMSO), isopropanol or in a mixture of these solvents with water.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the organic solvent is then removed either under atmospheric pressure or negative pressure, via lyophilization or heat completely or other suitable methods.
  • the aqueous stable nanoparticle dispersion prepared above is mixed in a suitable proportion with the modifying agent dissolved in water.
  • the determination of the appropriate quantitative ratio is carried out by stepwise titration of the particle dispersion with the modifying agent.
  • the degree of electrostatic surface modification (charge titration) is controlled by determining the zeta potential.
  • the target value of the zeta potential depends on the planned application path. For i.v. Applications would be preferred, for example, a neutral to negative zeta potential, in oral and buccal administration, a neutral or cationic zeta potential is preferred, etc.
  • a purification step is carried out, for example by washing the particles with a suitable solution.
  • Suitable solutions for the washing process are, for example, aqueous surfactant solutions 0.1-2%, but also pure water.
  • lyophilized nanoparticles after removal of the organic solvent and optionally purification or after Surface modification are lyophilized.
  • the lyophilized nanoparticles may then be marketed as a kit and reconstituted and administered for use.
  • kits which encapsulates the particles containing a diagnostic agent and an epothilone or only one epothilone together or separately, optionally as a lyophilisate or as a solution or dispersion.
  • This kit may additionally comprise a suitable means for reconstitution of the lyophilisate, e.g. physiological saline or water for injection / infusion purposes.
  • Another object of the invention is a kit that the non-surface-modified particles, means for the preparation of a solution of the surface-modifying agent.
  • the described nanoparticles can be further processed using suitable pharmaceutical additives to form various dosage forms which are suitable for application to humans or animals.
  • suitable pharmaceutical additives include in particular aqueous dispersions, lyophilisates, solid oral dosage forms such as fast-dissolving tablets, capsules and others.
  • suitable pharmaceutical additives may be: sugar alcohols for lyophilization (eg sorbitol, mannitol), tableting excipients, polyethylene glycols, etc.
  • aqueous nanoparticle dispersion or a further developed pharmaceutical form can be administered orally, parenterally (eg intravenously), subcutaneously, intramuscularly, intraocularly, intrapulmonary, nasally, intraperitoneally, dermally as well as on all other administration routes possible for humans or animals.
  • parenterally eg intravenously
  • subcutaneously intramuscularly, intraocularly, intrapulmonary, nasally, intraperitoneally, dermally as well as on all other administration routes possible for humans or animals.
  • the invention relates to a process for the preparation of a polymer nanoparticle, characterized in that the following process steps are carried out:
  • active agent includes therapeutically and diagnostically-effective compounds, as well as compounds that are active in animals other than humans and plants.
  • Epothilone or epothilone encompasses all naturally occurring epothilones and their derivatives Epothilone derivatives are known, for example, from WO 93/10102, WO 93/10121 and DE 41 38 042 A2, WO 97/19086 and WO 98/25929, WO 99 / 43320, WO 2000/066589, WO 00/49021, WO 00/71521, WO 2001027308, WO 99/02514, WO 2002080846.
  • epothilones suitable for use in the present invention and their preparation are disclosed in DE 19907588, WO 98/25929, WO 99/58534, WO 99/2514, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 99/7692, EP 99/4915, WO 00/1333, WO 00/66589, WO 00/49019, WO 00/49020, WO 00/49021, WO 00/71521, WO 00/37473, WO 00/57874, WO 01/92255, WO 01/81342, WO 01/73103, WO 01/64650, WO 01/70716, US 6204388, US 6387927, US 6380394, US 02/52028, US 02/58286, US 02/62030, WO 02/32844, WO 02/30356, WO 02/32844, WO 02/14323, and WO 02/8440. Particularly suitable are the compounds disclosed in WO 00/665
  • epothilones as encompassed by formula II.
  • the term epothilone also includes the possibility of encapsulating in a preparation various epothilone derivatives selected from the disclosed list of claim 21.
  • matrix polymer as used herein describes the polymer which quantitatively constitutes the major proportion of the particle mass, wherein further encapsulated substances (both arbitrary additives and pharmaceutically active substances) may be uniformly and / or non-uniformly embedded.
  • (nano) precipitation describes the formation of a colloidal precipitate by precipitating a sparingly water-soluble polymer when placed in an aqueous phase, with mixing of the solvents taking place Community precipitation of several substances which may be both water-soluble and poorly water-soluble in the context of the invention.
  • this precipitating aggregate consists of a matrix polymer in which further polymeric substances as well as pharmaceutically active substances can be partially or completely embedded in. A uniform or uneven distribution of the coagulum may be present. encapsulated substances in the matrix polymer.
  • anchor describes an ionic moiety of the modifying agent that allows immobilization and thus localization of the modifying agent on the charged particle surface by ionic interactions between oppositely charged compounds.
  • Charge titration describes the process of electrostatic coupling of the armature on the particle surface that can be traced by zeta potential measurement.
  • the charged anchor changes the zeta potential of the particle towards the charge of the anchor.
  • neutral amino acid in the sense of the invention encompasses all amino acids whose molecular charge is balanced in the sum of the individual charges, ie zero, including all natural amino acids R-CH (COOH) (NH 2), whose radical R carries no charge eg alanine, valine, leucine, isoleucine, etc. but also synthetic amino acids that fulfill this condition, such as cyclohexylalanine.
  • surfactants according to the invention are, on the one hand, surface-active substances which lower the interfacial tension between two immiscible phases, which makes it possible to stabilize colloidal dispersions.
  • surfactants can be any type of substances which are capable of sterically and / or electrostatically stabilizing colloidal dispersions.
  • tumors includes the diseases or conditions associated with cell growth, cell division and / or proliferation, such as malignant tumors More specific diseases which fall into this term include, for example, osteoporosis, osteoarthritis, cervical and cervical cancer, and abdominal cancer including all carcinomas in the upper abdomen, colon cancer, glandular cancer eg adenosarcoma, breast, lung (eg SCLC and NSCLC), head and neck carcinoma, malignant melanoma, acute lymphocytic or myelocytic leukemia, prostate carcinoma, bone metastases, brain tumors and brain metastases Solid tumors are a sub-aspect. Preferred among “tumor diseases” are neonatal and cervical cancer, breast, lung, prostate carcinoma, malignant melanoma, bone metastases, brain tumors and brain metastases to understand.
  • targeting is meant a targeting structure: in the case of “passive targeting”, the targeting structure may indirectly assist in enrichment at the target site, for example, by extending the circulation time of the particles in the bloodstream increases the likelihood of enrichment about the fenestrations in the tumor endothelium.
  • active targeting is used when tissue- or cell-specific ligands are used for targeted enrichment Active ligands can be administered directly to active substances (ligand-drug Conjugates) as well as to the surface of colloidal carrier systems.
  • passive targeting is used when the distribution of the active ingredient is due to (nonspecific) physical, biochemical or immunological processes, primarily due to the enhanced permeation and retention effect (EPR effect) this is a passive enrichment mechanism which exploits the structural peculiarities of tumorous or inflamed tissue [Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug DeNv. Rev., 2004; 56 (7): 1023-
  • surface potential also referred to as surface charge
  • zeta potential is synonymous with the term “zeta potential”. This zeta potential is determined by the method of laser Doppler anemometry (LDA).
  • the surface potential also referred to as zeta potential, indicates the potential of a migrating particle at the shear plane, i. H. if the majority of the diffuse layer has been sheared off by movement of the particle.
  • the surface potential was determined by the method of laser Doppler anemometry using a "Zetasizer 3000" (Malvern Instruments).
  • the migration speed of the particles in the electric field is determined. Particles with a charged surface migrate in an electric field to the oppositely charged electrode, wherein the
  • Migration rate of the particles depends on the amount of surface charges and the applied field strength.
  • particles traveling in the electric field are irradiated with a laser and the scattered laser light is detected.
  • a frequency shift in the reflected light is measured in comparison to the incident light.
  • Doppler frequency Doppler effect
  • the electrophoretic mobility results from the quotient of the migration speed and the electric field strength.
  • the product of electrophoretic mobility and factor 13 corresponds to the zeta potential, the unit of which is [mV].
  • the software used was PCS V1.41 / PCS V1.51 Rev.
  • the control measurements of the zeta potential were carried out with standard latex particles from Malvern Instruments Ltd. (-50 mV ⁇ 5 mV). The measurements were made under the standard settings of Malvern Instruments Ltd. carried out.
  • the size of the nanoparticles was determined by Dynamic Light Scattering (DLS) using a "Zetasizer 3000" (Malvern Instruments). In addition, images were taken in the scanning electron microscope (SEM), as shown by way of example in FIG. Figure 12 ( Figure 12) also confirms the spherical shape of the nanoparticles.
  • the determination of the particle size by DLS is based on the principle of Photon Correlation Spectroscopy (PCS).
  • PCS Photon Correlation Spectroscopy
  • the particle size is calculated from the slope of the correlation function.
  • the particles should have a spherical shape, which can be checked by SEM images (see above), do not sediment or float.
  • the measurements were carried out with samples in appropriate dilution, at a constant temperature of 25 ° C and a defined viscosity of the solution.
  • the measuring device was calibrated with standard latex particles of different sizes from Malvern Instruments Ltd.
  • the scanning electron micrographs (SEM images) for determining the particle size were prepared using a field emission scanning electron microscope of the type XL-30-SFEG from FEI (Kassel, Germany). In advance, the samples were sputtered in a high vacuum sputter 208 HR from Cressington (Watford, England) with a 5 nm gold-palladium layer.
  • the solubility of a substance indicates whether and to what extent a pure substance can be dissolved in a solvent. It thus describes the property of a substance to mix with the solvent under homogeneous distribution (as atoms, molecules or ions).
  • the solubility of a compound is determined to be the concentration of a saturated solution that is in equilibrium with the undissolved sediment, depending on the temperature (room temperature).
  • a sparingly soluble compound has a solubility ⁇ 0.1 mol / l, a moderately soluble between 0.1-1 mol / l and a slightly soluble compound> 1 mol / l.
  • Sicomet 6000 is used for PBCA production by anionic polymerization of butyl cyanoacrylate (BCA).
  • BCA butyl cyanoacrylate
  • the polymerization process is carried out by slow, permanent dropwise addition of a total of 2.5% [m / v] BCA in a 1% [m / v] Triton X-100 solution in an acidic solution (pH 1, 5 - pH 2.5 , ideal pH 2.2).
  • the pH is previously adjusted by means of a 0.1 N HCl solution.
  • the resulting dispersion is stirred while cooling in an ice bath (about 4 ° C) for 4 hours constantly at 450 U / min. Subsequently, larger agglomerates are separated by filtration through a paper pleated filter.
  • the BCA polymerized to PBCA is precipitated and the resulting filter cake is washed several times with purified water (MilliQ system). After the drying of the PBCA filter residue in a drying oven at 40 0 C for 24 h by GPC a number average molecular weight determined (Mn ⁇ 2000 Da). Polystyrene standards are used.
  • Example 2 Production of Epothilone-loaded PBCA-P (DMAEMA) Nanoparticles by Nanoprecipitation
  • the PBCA used is prepared by Example 1. 10 ml of a 1% Synperonic T707 solution (m / v) are placed in a 20 ml screw-capped magnetic stirrer tube.
  • the PBCA used is prepared by Example 1.
  • Crystalline, unencapsulated epothilone is separated by means of a 1 ⁇ m glass fiber filter (PALL, 25 mm, 1 ⁇ m P / N 4523T).
  • the filtrate is purified using an Amicon ultrafiltration cell 8050 using a 100 kDa polyethersulfone filter membrane.
  • the filtrate is concentrated to about 1/3 of the volume and then the concentrate is brought back to the starting volume by adding a 1% Synperonic T707 solution. It follows a renewed narrowing. This process is repeated twice and the target concentration of the epothilone particle dispersion is adjusted via the final volume of the solution (epothilone content 0.1-2 mg / ml).
  • PBCA-P DMAEMA nanoparticles (with ICG, DODC, IDCC or Coumarin 6)
  • Dye solution a 3 mg of indocyanine green are pre-dissolved in 300 ⁇ l of purified water in an ultrasonic bath and then treated with 700 ⁇ l of acetone.
  • Dye Solution b, c, d The dyes DODC, IDCC and coumarin 6 are used in a 0.02% acetone solution [m / v].
  • the mixed dye-polymer mixture is taken up in a 2.5 ml Eppendorf pipette and in 10 ml of an intensely stirred 1% [m / v] Synperonic T707 solution pipetted.
  • the nanoparticle dispersion is stirred for 2 h at 600 rpm (standard magnetic stirrer) and for a further 16 h at 100 rpm for complete evaporation of the solvent.
  • the workup is carried out by centrifugation in Eppendorf Caps.
  • the mixed dye-polymer mixture is taken up with a 2.5 ml Eppendorf pipette and pipetted into 10 ml of an intensely stirred 1% Triton X-100 solution.
  • the nanoparticle dispersion is stirred for 2 h at 600 rpm (standard magnetic stirrer) and for a further 16 h at 100 rpm for complete evaporation of the solvent.
  • the workup is carried out by centrifugation in Eppendorf Caps.
  • Example 6 Influence of Nanoprecipitation by Changing the Polymer Content in the Surfactant Phase
  • FIG. 4 shows that the particle size of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles can be controlled during production by varying the polymer concentration.
  • the stabilization of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles prepared according to Example 2 (but without epothilone) is carried out with the Synperonic T707 surfactant.
  • the volume of the organic polymer solution injected into the surfactant phase is kept constant and only the polymer concentration is changed accordingly. All further
  • Example 7 Electrostatic surface modification of epothilone-loaded PBCA-PDMAEMA nanoparticles with Glu (10) -b-PEG (110)
  • the epothilone-PBCA-PDMAEMA nanoparticles used here are prepared according to Example 2.
  • the aqueous, stable nanoparticle dispersion is mixed in a suitable quantitative ratio with the modifying agent (Glu (10) -b-PEG (110) / Glu (10) -b-PEG (114) dissolved in water).
  • the determination of the appropriate quantitative ratio is carried out by stepwise titration of the particle dispersion with the modifying agent.
  • the degree of electrostatic surface modification (charge titration) is controlled by determining the zeta potential.
  • Fig. 3a Shown in Fig. 3a) is the change of the zeta potential from (+) 25 mV to about (-) 30 mV, or Fig. 3b) from +35 mV to -10 mV, by stepwise addition of the modifying agent (Glu (10) -b-PEG (110)) or Glu (10) -b-PEG (114) for particle dispersion (charge titration).
  • the modifying agent Glu (10) -b-PEG (110)
  • Example 8 SEM images of epothilone-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles
  • the epothilone-loaded PBCA-P (DMAEMA) are prepared according to Example 2.
  • FIG. 5 shows an SEM micrograph of epothilone-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles.
  • FCS fetal calf medium
  • Additives penicillin / streptamycin
  • the cells are passaged regularly and sowed for experimental purposes 24 hours before the start of the investigations.
  • the cells are in 96-well plates of the company
  • FCS-containing medium is aspirated and replaced with 50 .mu.l of serum-free medium.
  • CMXRos dye previously diluted in medium, from Molecular Probes Europe BV, Leiden (NL) (0.25 ⁇ l / ml) is used. Incubation with 50 ⁇ l of the dye solution takes place in the incubator for 15 min (37 ° C., 5% CO 2 ). Then the dye solution is aspirated and the cells with 2-3 times
  • PBS washed.
  • the fixation of the cells is carried out with 100 ul of 1, 37% formaldehyde for 10 min at room temperature. After aspirating the fixing solution, the cells are washed 2-3 times with PBS. Nuclear staining takes place on the already fixed cells with a maximum of 33342.
  • 100 ⁇ l of the dye solution diluted in PBS (2 ⁇ g / ml) are incubated for 10 min at room temperature. After removing the dye solution, the cells are washed with 100 ⁇ l PBS 2-3 times.
  • the fixed plates are stored in the refrigerator until the fluorescence microscopic examination with 200 .mu.l PBS / Well protected from light in the refrigerator at 8 ° C.
  • Example 9 The nanoparticles used in Example 9 are prepared according to Example 5. Unmodified or after electrostatic surface modification with folic acid or Glu (10) -b-PEG (110), the particles have the properties listed in Table 1.
  • Example 11 Cell uptake behavior Glu (10) -b-PEG (110) modified PBCA P (DMAEMA) nanoparticle loaded with coumarin 6 (fluorescent dye for in vitro detection)
  • the brightly fluorescent dots which are endosomes or endolysosomes, are evidence of efficient uptake of the nanoparticles into the cell by endocytosis ( Figure 7).
  • the scale of the magnification proves that in this photograph individual particles can not be visible due to their size of less than 200 nm.
  • a large number of particles within these vesicles cause strong, punctate fluorescence contrast in the cytoplasm.
  • Cell uptake of PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles surface-modified with Glu (10) -b-PEG (110) is shown schematically in FIG.
  • Example 12 Enrichment of the GIu (10) -b-PEG (110) Modified PBCA P (DMAEMA) Nanoparticles in the Nucleus
  • GIu (10) -b-PEG (110) Modified PBCA P (DMAEMA) Nanoparticles in the Nucleus On the basis of the recording of the central cell plane with the aid of the confocal laser scanning microscope (FIG. 9), it can be shown that partial accumulation of the particles takes place in the cell nucleus.
  • Charge titration is used to modify the cationic surface of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles with the block copolymer Glu (10) -b-PEG (110) (see FIG. 14).
  • the surface charge measured as zeta potential will correspondingly increase from approx. +3 ohms above the neutral point until it reaches its neutral point of the dissociation equilibrium at about -30 mV.
  • the surface-modified PBCA [P (DMAEMA) -ICG] particles show no change in the zeta potential over the investigated period of 7 days after titration. In connection with the unchanged particle size and the constant low PI, a good particle stability can be proven.
  • FIG. 15 shows the UV-Vis absorption spectra of an aqueous ICG solution as well as the ICG nanoparticle dispersion (washed and unwashed).
  • Indocyanine green is a near-infrared fluorescent dye whose absorption and emission spectrum is in the wavelength range between 650-900 nm.
  • DMAEMA cationic polyacrylate P
  • the animals used are supplied by Taconic M & B. These are female albino nude mice of the type NMRI nude. The adult animals have a weight of 22-24 g after about 8 weeks.
  • Five female nude mice are inoculated with 2x10 6 cells of a F9 teratoma in the right posterior flank. The cells are obtained from the company ATCC / LGC Promochem GmbH. It is mouse-derived embryonic cells of a testinal teratocarcinoma, which is used as a tumor model for cancer research purposes in mice. After 18 days, four of the five mice had tumors with an average size of about 0.5-1 cm in diameter.
  • the animals are permanently anesthetized with a rompun-ketavet injection in a dose of 100 ⁇ l / 10 g of animal for the first hour of the experiment.
  • the solution for injection consists of a 1: 1 mixture of a 1:10 dilution Rompun or 1: 5 dilution Ketavet with physiological saline.
  • 200 ⁇ l of the nanoparticle dispersion are injected iv into the tail vein.
  • the subsequent anesthesia is carried out with Rompun- Ketavet via the lungs as an inhalation anesthetic to the circulation of the animals only minimal weight.
  • the animals are examined by fluorescence optics.
  • GIu (10) -b-PEG (110) -modified PBCA [P (DMAEMA) -ICG] nanoparticles after intravenous administration (tail vein) are capable of passive enrichment mechanisms (EPR effect) in tumor tissue.
  • Examination of the tumors ex vivo shows a clear enhancement of the fluorescence contrast in treated compared to untreated tumor tissue (compare Fig. 18 b with a and c with a).
  • Multiple, time-shifted detection of fluorescence in one and the same animal is possible after 24 h and 48 h (FIG. 17). Consequently, the particles can circulate in vivo for a sufficiently long time and accumulate accordingly in the tumor.
  • the electrostatically pegylated surface is thus stably connected to the particle surface.
  • the device used for the animal experiment was set up by the company LMTB (Berlin, Germany). As individual components were used:
  • Excitation filter 1xLCLS-750 nm-F; 1x740 nm interference filter (bandpass)
  • Emission filter 1 x bk-802.5-22-C1; 1 xbk-801 -15-C1
  • Fig. 1 Short-term stability of PBCA-PDMAEMA nanoparticles with epothilone (not surface-modified).
  • Fig. 2 Short-term stability PBCA-PDMAEMA nanoparticles with epothilone surface-modified with Glu (10) -b-PEG (110) a) Hydrodynamic particle diameter d hyd and polydispersity index PI / # EpoPDI 9Ak2konz PEG-Glu b) Hydrodynamic particle diameter d h y d and Zeta potential
  • Fig. 3 Titration curve (zeta potential) in the surface modification of epothilone-loaded PBCA-PDMAEMA nanoparticles. Shown in this figure is the change of the
  • Fig. 4 control of the particle diameter by changing the
  • Fig. 1 it is shown that the particle size of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles can be controlled during production by varying the polymer concentration.
  • FIG. 5 The figure shows an SEM image of epothilone-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles.
  • Cell uptake a) Comparison of cell uptake behavior after surface modification; Row 1: unmodified particles; Row 2: Nanoparticles with folic acid; Row 3: Nanoparticles with Glu (10) -b-
  • Fig. 7 Nanoparticle uptake in HeLa cells; Fluorescence of
  • the figure shows the cell uptake behavior of GIu (10) -b-PEG (HO) modified PBCA P (DMAEMA) nanoparticles in HeLa.
  • PEG-NP pegylated coumarin-containing PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles
  • NP coumarin-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles
  • CP clathrin-coated pits
  • ES endosomes
  • LS lysosomes
  • ELS endolysosomes
  • ZK cell nucleus
  • H + H + ATPase
  • PEG-Glu free Glu (10) -b-PEG (110)
  • the plot shows the accumulation of the GIu (10) -b-PEG (110) modified PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles in the nucleus. This is possible by loading with the fluorescence-active dye coumarin 6.
  • Fig. 10 Lower particle uptake with incubation of lower particle concentration: 0.21 mg / ml; Fluorescence of the NP as grayscale image; The figure shows fluorescent HeLa cells after a particle concentration of 0.21 mg / ml was incubated.
  • GIu (10) -b-PEG (110) surface-modified PBCA-P (DMAEMA) particles were used for this.
  • Fig. 11 Increased particle uptake with incubation of higher particle concentration: 0.85 mg / ml; Fluorescence of the NP as grayscale image;
  • the figure shows more strongly fluorescent HeLa cells after a higher particle concentration of 0.85 mg / ml was incubated.
  • GIu (10) -b-PEG (110) surface-modified PBCA-P (DMAEMA) particles were used for this purpose.
  • Fig. 12 SEM image of PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles
  • FIG. 13 particle diameter d hyd of the PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles, surface-modified with Glu (10) -b-PEG (110); The particle size of the surface-modified PBCA [P (DMAEMA) -ICG] nanoparticles used for the animal experiment is shown over a period of 7 days
  • Figure 14 Zeta potential of the untitrated (washed / unwashed) and titrated PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles; The figure shows the zeta potential measured
  • PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles modified with the block copolymer Glu (10) -b-PEG (110). This was correspondingly titrated from about + 3OmV beyond the neutral point until reaching the dissociation equilibrium at about -3OmV.
  • Fig. 15 UV-Vis absorption spectra: a) aqueous ICG solution, b) PBCA [P (DMAEMA) -ICG] -NP unwashed; c) PBCA- [P (DMAEMA) -ICG] nanoparticles washed;
  • Fig. 16 Emission spectrum of the PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles and an aqueous ICG solution; The figure represents the corresponding emission spectra of the aqueous ICG solution compared to the nanoparticle dispersion.
  • Fig. 17 Detection of NIR fluorescence in vivo; The images show the NIR fluorescence in a time frame of 24 and 48 h after substance injection (a) ventrally 24 h, b) 24 h laterally, c) 48 h laterally, d) ventrally empty).
  • Fig. 18 NIR fluorescence contrast of the tumor tissue ex vivo 48 h after treatment
  • the figure shows NIR fluorescence contrasts a) an untreated tumor without NIR fluorescence contrast, b) a large, treated tumor and c) a median, treated tumor ex vivo 48 h after treatment.

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Abstract

The invention relates to polymer nanoparticles having a cationic surface potential, in which both hydrophobic and hydrophilic pharmaceutically active substances can be contained. The hydrophilic, and therefore water-soluble, substances are contained in the core of the particles by means of co-precipitation by ionic complexing with a loaded polymer. Both therapeutic agents and diagnostic agents can be used as pharmaceutically active substances for encapsulation. The cationic particle surface enables a stable, electrostatic surface modification with compounds partially having opposite charges and optionally containing target-specific ligands for improving passive and active targeting.

Description

Funktionalisierte, feste Polymernanopartikel enthaltend Epothilone Functionalized solid polymer nanoparticles containing epothilones
Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
Die vorliegende Erfindung beschreibt Polymernanopartikel mit kationischem Oberflächenpotential, in welche neutrale, hydrophobe und hydrophile pharmazeutisch aktive Substanzen eingeschlossen werden können. Die hydrophilen und somit wasserlöslichen Substanzen werden durch ionische Komplexierung mit einem geladenen Polymer in den Kern des Partikels mittels Co-Präzipitation eingeschlossen. Zur Verkapselung sind als pharmazeutisch aktive Substanzen sowohl Therapeutika, insbesondere Epothilone als auch Diagnostika verwendbar. Die kationische Partikeloberfläche ermöglicht eine stabile, elektrostatische Oberflächenmodifikation mit partiell entgegengesetzt geladenen Verbindungen, die zur Verbesserung des passiven und aktiven Targetings zielspezifische Liganden enthalten können.The present invention describes cationic surface potential polymer nanoparticles in which neutral, hydrophobic and hydrophilic pharmaceutically active substances can be included. The hydrophilic and thus water-soluble substances are entrapped by ionic complexation with a charged polymer in the core of the particle by co-precipitation. For encapsulation, pharmaceutically active substances include both therapeutics, in particular epothilones, as well as diagnostics. The cationic particle surface provides stable, electrostatic surface modification with partially oppositely charged compounds that may contain target-specific ligands to enhance passive and active targeting.
Hintergrund der ErfindungBackground of the invention
Die besonderen Eigenschaften nanopartikulärer Drug Delivery Systeme beruhen vor allem auf ihrer geringen Größe, wodurch eine Überwindung unterschiedlicher physiologischer Barrieren möglich ist [Fahmy T.M., Fong P.M. et al., Mater. Today, 2005; 8(8): 18-26]. Die damit verbundene veränderteThe particular properties of nanoparticulate drug delivery systems are mainly due to their small size, thereby overcoming different physiological barriers is possible [Fahmy T.M., Fong P.M. et al., Mater. Today, 2005; 8 (8): 18-26]. The associated changed
Verteilung im Organismus kann z. B. für die Diagnose als auch zur Therapie verschiedener Tumorerkrankungen vorteilhaft genutzt werden. Nanopartikuläre Systeme, welche sowohl zur Erkennung als auch zurDistribution in the organism can, for. B. for the diagnosis as well as for the therapy of various tumor diseases can be used advantageously. Nanoparticular systems, which are used both for detection and for
Behandlung von Erkrankungen eingesetzt werden können, werden als sogenannte Theranostika (= Therapeutika + Diagnostika) bezeichnet. Das damit verbundene therapeutische Monitoring wird zukünftig ein schnelleres Erkennen von Therapieresistenzen ermöglichen und durch rechtzeitigen Einsatz alternativer Therapien den Heilungserfolg des Patienten deutlich verbessernTreatment of diseases are referred to as so-called Theranostika (= therapeutics + diagnostics). The associated therapeutic monitoring will enable a faster detection of therapy resistance in the future and significantly improve the healing success of the patient through the timely use of alternative therapies
[Emerich D.F., Thanos CG., Curr. Nanosci., 2005; 1 : 177-188]. Eine in der Tumortherapie sehr erfolgreich eingesetzte Substanzklasse ist die Gruppe der Zytostatika. Alle sich schnell teilenden Zellen des Körpers, so auch Tumorzellen, werden durch diese Substanzen geschädigt. Dies führt allerdings nicht nur zu einem Absterben der Tumorzellen, sondern häufig sind auch andere vitale Organe und Gewebe wie das Knochenmark, Schleimhäute oder Herzgefäße davon betroffen. Die damit verbundene unerwünschte Toxizität ist häufig der Dosis limitierende Faktor der Therapie [Silacci D., Neri M., Modern Biopharmaceuticals: Design, development and optimization, Volume 3, Part V, Wiley-VCH, Weinheim, 2005; 1271-1299].[Emerich DF, Thanos CG., Curr. Nanosci., 2005; 1: 177-188]. A substance class used very successfully in tumor therapy is the group of cytostatic drugs. All rapidly dividing cells of the body, including tumor cells, are damaged by these substances. However, this not only leads to a death of the tumor cells, but often other vital organs and tissues such as the bone marrow, mucous membranes or heart vessels are affected. The associated undesirable toxicity is often the dose limiting factor of therapy [Silacci D., Neri M., Modern Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, Volume 3, Part V, Wiley-VCH, Weinheim, 2005; 1271-1299].
Es konnte gezeigt werden, dass beispielsweise durch das Verkapseln zytotoxischer Substanzen wie Doxorubicin in nanopartikuläre Systeme gesunde Gewebe weniger stark geschädigt werden und eine lokal höhere Wirkstoffkonzentration im Tumorgewebe erzielt wird [Silacci D., Neri M., Modern Biopharmaceuticals: Design, development and optimization, Volume 3, Part V, Wiley-VCH, Weinheim, 2005; 1271-1299].It has been shown that, for example, by encapsulating cytotoxic substances such as doxorubicin in nanoparticulate systems, healthy tissue is damaged to a lesser extent and a locally higher concentration of active substance in the tumor tissue is achieved [Silacci D., Neri M., Modern Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, Volume 3, Part V, Wiley-VCH, Weinheim, 2005; 1271-1299].
Im Falle der liposomalen Formulierung von Doxorubicin kann die Kardiotoxizität der Substanz deutlich gemindert werden. Durch die Verringerung der dosislimitierenden Kardiotoxizität kann wiederum eine höhere therapeutische Effizienz erzielt werden. Aufgrund des belegbaren klinischen Vorteils wurde das in Liposomen verkapselte Doxorubicin erfolgreich unter dem Namen Doxil® bzw. Cealyx für die Tumortherapie zugelassen.In the case of the liposomal formulation of doxorubicin, the cardiotoxicity of the substance can be significantly reduced. By reducing the dose-limiting cardiotoxicity, in turn, a higher therapeutic efficiency can be achieved. Due to the demonstrable clinical benefit, the liposome-encapsulated doxorubicin was successfully approved under the name Doxil ® or Cealyx for tumor therapy.
Epothilone stellen eine neue Klasse von Antitumorverbindungen dar, die Apoptose bewirken. Verschiedene Publikationen und Berichte von Studienergebnissen (e.g. IDrugs, 2002, 5(10):949-954) haben ihre Wirkung gegen Krebs bewiesen. Die Dosis für ihre Gabe ist von Studienberichten oder aus anderen Publikationen, z.B. für die Epothilone A und B aus WO 99/43320 ebenfalls bekannt. Mittels einer nanopartikulären Formulierung kann durch Ausnutzung spezieller Verteilungsmechanismen der therapeutische Effekt bzw. das Nebenwirkungsprofil dieser neuen Substanzklasse positiv beeinflusst werden. In erster Linie wird der Enhanced Permeation and Retention-Effekt (kurz EPR- Effekt) dafür verantwortlich gemacht. Dieser EPR-Effekt wurde bereits 1986 von Matsumura und Maeda als eine Strategie zur gezielten Arzneistoffkumulation in soliden Tumoren beschrieben [Matsumura Y., Maeda H., Cancer Res., 1986; 46: 6387-6392][Maeda H., Adv. Enzyme Regul., 2001 ; 41 : 189-207]. Es handelt sich hierbei um einen passiven Anreicherungsmechanismus, welcher die strukturellen Besonderheiten von tumorösem oder auch entzündetem Gewebe ausnutzt [Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug DeNv. Rev., 2004; 56(7): 1023-1050]. Insbesondere Tumorgewebe ist aufgrund seines schnellen Wachstums und verschiedener Botenstoffe meist durch eine fenestrierte „löchrige" Gewebsstruktur sowie eine fehlende lymphatische Drainage gekennzeichnet. Je nach Tumorart wird die Größe der Fenestrierungen zwischen 380 nm und 780 nm angegeben, weshalb dieser Bereich auch als nanosize window bezeichnet wird [Hobbs S. K., Monsky W.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998; 95: 4607- 4612][Brigger I., Dubemet C. et al., Adv. Drug DeNv. Rev., 2002; 54(5): 631-651]. Im Gegensatz dazu besitzen normale Gewebe wie Herz, Gehirn oder Lunge so genannte tight junetions, welche mit weniger als 10 nm (meist 2 nm bis 4 nm) Durchmesser undurchlässig für kolloidale Arzneistoffträger sind [Hughes G.A., Nanomedicine, 2005; 1(1 ): 22-30]. Im Blutstrom zirkulierende Nanopartikel sind somit in der Lage, sich passiv durch Diffusion aus dem Blutstrom im Tumorgewebe anzureichern. Eine fehlende lymphatische Drainage begünstigt die dauerhafte Anreicherung im Tumor bzw. verhindert einen schnelles Auswaschen der Nanopartikel (EPR- Effekt).Epothilones are a new class of antitumor compounds that cause apoptosis. Various publications and reports of study results (eg IDrugs, 2002, 5 (10): 949-954) have proven their effectiveness against cancer. The dose for their administration is also known from study reports or from other publications, eg for epothilones A and B from WO 99/43320. Using a nanoparticulate formulation, the therapeutic effect or the side-effect profile of this new substance class can be positively influenced by using special distribution mechanisms. First and foremost, the enhanced permeation and retention effect (EPR effect for short) is held responsible. This EPR effect was already described by Matsumura and Maeda in 1986 as a strategy for targeted drug accumulation in solid tumors [Matsumura Y, Maeda H., Cancer Res., 1986; 46: 6387-6392] [Maeda H., Adv. Enzyme Regul., 2001; 41: 189-207]. This is a passive enrichment mechanism which exploits the structural features of tumorous or inflamed tissue [Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug DeNv. Rev., 2004; 56 (7): 1023-1050]. In particular tumor tissue is characterized by its fast growth and various messenger substances usually by a fenestrierte "holey" tissue structure as well as a lack of lymphatic drainage Depending on the type of tumor, the size of the fenestrations between 380 nm and 780 nm indicated, which is why this area is also referred to as nanosize window [Hobbs SK, Monsky WL et al., Proc Natl Acad., USA, 1998; 95: 4607-4612] [Brigger I., Dubemet C. et al., Adv. Drug DeNv. Rev., 2002; 54 (5): 631-651] In contrast, normal tissues such as the heart, brain, or lung possess tight junctions which are less than 10 nm (usually 2 nm to 4 nm) in diameter impermeable to colloidal drug carriers [Hughes GA , Nanomedicine, 2005; 1 (1): 22-30]. Nanoparticles circulating in the bloodstream are thus able to passively accumulate by diffusion from the bloodstream in the tumor tissue and a lack of lymphatic drainage favors the permanent enrichment g in the tumor or prevents rapid washing out of the nanoparticles (EPR effect).
Damit dieser Anreicherungsmechanismus möglich ist, müssen die Nanopartikel ausreichend lange im Blutstrom zirkulieren. Voraussetzung dafür sind Partikelgrößen zwischen ca. 10 nm und 380 nm sowie geeignete Partikeloberflächen. Beispielsweise können pegylierte Partikeloberflächen verhindern, dass körpereigene Proteine die Partikel als fremd identifizieren und eine schnelle Eliminierung über die Organe des retikulo-endothelialen Systems (kurz RES) erfolgt [Otsuka H. et al., Adv. Drug DeNv. Rev., 2003; 55(3): 403- 419]. Durch die Nutzung aktiver Liganden auf der Partikeloberfläche (z.B. -A-For this enrichment mechanism to be possible, the nanoparticles must circulate in the blood stream for a sufficient period of time. This requires particle sizes between about 10 nm and 380 nm and suitable particle surfaces. For example, pegylated particle surfaces can prevent the body's own proteins from identifying the particles as foreign and rapid elimination via the organs of the reticulo-endothelial system (short RES) [Otsuka H. et al., Adv. Drug DeNv. Rev., 2003; 55 (3): 403-419]. By using active ligands on the particle surface (eg -A-
Antikörper) kann die gewebsspezifische Anreicherung nochmals optimiert werden [Nobs L. et al., Pharm. Sei., 2004; 93: 1980-1992] [Yokoyama M., J. Artif. Organs, 2005; 8: 77-84].Antibodies), the tissue-specific enrichment can be optimized again [Nobs L. et al., Pharm. Sei., 2004; 93: 1980-1992] [Yokoyama M., J. Artif. Organs, 2005; 8: 77-84].
Für eine Aufnahme der Wirkstoffe in die Zelle muss eine weitere physiologische Barriere, die Zellmembran, überwunden werden. Die Schwierigkeit besteht für viele Arzneistoffe u. a. darin, dass die Zelle sehr effektive Transportmechanismen (z. B. P-Glycoprotein) zum Ausschleusen fremder oder toxischer Substanzen besitzt. Wird jedoch der Wirkstoff mit Hilfe von Nanopartikeln in die Zelle über Endozytose eingeschleust, so können ausschleusende Transporter umgangen und die so genannte Multi Drug Resistance (MDR) verhindert werden [Bharadwaj V., J. Biomed. Nanotechnol., 2005; 1 : 235-258] [Huwyler J. et al., J. Drug Target., 2002; 10(1): 73-79].For a recording of the active ingredients in the cell, another physiological barrier, the cell membrane, must be overcome. The difficulty exists for many drugs u. a. in that the cell has very effective transport mechanisms (eg P-glycoprotein) for the removal of foreign or toxic substances. If, however, the active substance is introduced into the cell via endocytosis with the aid of nanoparticles, it is possible to circumvent ejecting transporters and to prevent multi-drug resistance (MDR) [Bharadwaj V., J. Biomed. Nanotechnol., 2005; 1: 235-258] [Huwyler J. et al., J. Drug Target., 2002; 10 (1): 73-79].
Die Internalisierung in die Zelle erfolgt bei Nanopartikeln meist mittels Endozytose. Aus diesem Grund liegen die Partikel nach dem Aufnahmeprozess in Endosomen bzw. Endolysosomen vor [Koo O. M. et al., Nanomedicine, 2005; 1(3):193-212]. Sofern keine Freisetzung der Partikel aus den Endolysosomen stattfindet, kommt es innerhalb der Vesikel zu einem enzymatischen Abbau von Wirkstoff und kolloidalem Trägersystem. Eine endolysosomale Freisetzung der Partikel und damit des Wirkstoffes ist deshalb für den intrazellulären therapeutischen Effekt essentiell.The internalization into the cell takes place with nanoparticles usually by means of endocytosis. For this reason, the particles are present in endosomes or endolysosomes after the uptake process [Koo O.M. et al., Nanomedicine, 2005; 1 (3): 193-212]. If there is no release of the particles from the endolysosomes, an enzymatic degradation of active ingredient and colloidal carrier system occurs within the vesicles. An endolysosomal release of the particles and therefore of the active substance is therefore essential for the intracellular therapeutic effect.
Die Freisetzungseigenschaften des Wirkstoffes aus dem Nanopartikel können zusätzlich durch gezielte Auswahl des Polymers gesteuert werden. Eine nanopartikuläre Formulierung kann somit die Applikationshäufigkeit minimieren sowie zu einer Reduktion der therapeutisch notwendigen Dosis führen. Weiterhin können unerwünschte Plasmaspiegelspitzen durch Verkapselung in Nanopartikel vermieden und eine verzögerte Freisetzung erzielt werden.The release properties of the active substance from the nanoparticle can additionally be controlled by targeted selection of the polymer. A nanoparticulate formulation can thus minimize the frequency of application and lead to a reduction of the therapeutically necessary dose. Furthermore, unwanted plasma peak levels can be avoided by encapsulation in nanoparticles and a delayed release can be achieved.
Zusammengefasst sind folgende Vorteile für die Entwicklung von Polymernanopartikeln ausschlaggebend: (i) gezielte Anreicherung der Wirkstoffe (a) passiv mittels EPR-Effekt,In summary, the following advantages for the development of polymer nanoparticles are crucial: (i) targeted enrichment of the active ingredients (a) passively by EPR effect,
(b) aktiv mittels gewebs- oder zellspezifischer Liganden, z. B. Antikörper, (ii) steuerbare Wirkstoff-Freisetzung durch gezielte Polymerauswahl,(b) actively by means of tissue or cell specific ligands, e.g. B. antibodies, (ii) controllable drug release by targeted polymer selection,
(iii) Vermeidung starker Schwankungen der Plasmaspiegel, (iv) Senkung der Dosis bzw. Steigerung der Effektivität bei gleicher Dosis, (v) geringere Nebenwirkungen bei erhöhtem Sicherheitsprofil, (vi) verringerte Applikationshäufigkeit mit verbesserter Compliance und (vii) Umgehung von Resistenzmechanismen (P-Gycoprotein) [Rosen H., Abribat T., Nature Reviews Drug Discovery, 2005 May; 4(5): 381- 5][McLennan D.N., Porter CJ. H. et al., Drug Discovery Today: Technologies, 2005 Spring; 2(1 ): 89-96].(iii) avoidance of large fluctuations in plasma levels, (iv) dose reduction or increase in efficacy at the same dose, (v) lower side effects with increased safety profile, (vi) reduced frequency of application with improved compliance and (vii) avoidance of resistance mechanisms (P Gycoprotein) [Rosen H., Abribat T., Nature Reviews Drug Discovery, 2005 May; 4 (5): 381-5] [McLennan D.N., Porter CJ. H. et al., Drug Discovery Today: Technologies, 2005 Spring; 2 (1): 89-96].
Ein nanopartikuläres System, welches die Gesamtheit der beschriebenen Vorteile bereits erfüllt, ist nach dem aktuellen Wissensstand noch nicht entwickelt worden. Auch die Vielfalt der in der Literatur beschriebenen nanopartikulären Trägersysteme macht deutlich, dass es zum jetzigen Zeitpunkt nicht eine optimale Nanoformulierung für alle Problemstellungen gibt. Neben der Größe sind der gesamte Aufbau der Partikel, die matrixbildenden Substanzen und vor allem ihre Oberfläche für das Verhalten in vivo von entscheidender Bedeutung [Choi S.W., Kim W. S., Kim J. H., Journal of Dispersion Science and Technology, 2003; 24(3&4): 475-487]. Hinzu kommt, dass die physikochemischen Eigenschaften verschiedener Wirkstoffe, insbesondere Wirkstoffklassen, sich stark unterscheiden. Es besteht demzufolge nach wie vor ein Bedarf in der Entwicklung kolloidaler Arzneistoffträgersysteme mit verbesserten Eigenschaften.A nanoparticulate system, which already fulfills all the described advantages, has not yet been developed according to the current state of knowledge. The variety of nanoparticulate carrier systems described in the literature also makes it clear that there is currently no optimal nano-formulation for all problems. In addition to size, the overall structure of the particles, matrix-forming substances, and especially their surface, are of crucial importance for in vivo behavior [Choi S.W., Kim W.S., Kim J.H., Journal of Dispersion Science and Technology, 2003; 24 (3 & 4): 475-487]. In addition, the physicochemical properties of various drugs, especially classes of drugs, differ greatly. Accordingly, there remains a need in the development of colloidal drug carrier systems with improved properties.
Für zukünftige therapeutische Ansätze wird es beispielsweise notwendig sein, durch einen diagnostischen Nachweis der Verteilung der Partikel im Organismus zu belegen, dass eine Anreicherung vor allem im erkrankten Gewebe (z. B. im Tumor) stattfindet. Für eine Detektion in vivo stehen unter anderem optische Bildgebungsverfahren wie die Sonographie, die Röntgendiagnostik, Schnittbildverfahren (CT, MRT) und die Nuklearmedizin (PET, SPECT) zur Verfügung. Eine weitere und relativ neue Methode ist Optical Imaging, dessen Detektionsprinzip auf der Nutzung von Nahinfrarot-Fluoreszenz beruht. Es handelt sich um ein nicht-invasives Verfahren, welches ohne ionisierende Strahlung arbeitet und im Vergleich zu Verfahren wie dem MRT sehr kostengünstig und wenig aufwendig ist. Die für eine solche Anwendung entwickelten NIR-Farbstoffe wie Indocyaningrün sind sehr gut wasserlöslich, weshalb es schwierig ist, diese effizient in eine hydrophobe Polymermatrix zu verkapseln. Grund ist der schnelle Wechsel der hydrophilen Substanz in die wässrige Phase beispielsweise bei der Herstellung mittels Nanopräzipitation. Für die Verkapselung hydrophiler Substanzen in Nanopartikel stehen nur wenige Technologien zur Verfügung, die unterschiedliche Nachteile aufweisen. Der amphiphile Charakter von Liposomen oder Polymerosomen ermöglicht beispielsweise den Einschluss hydrophiler Substanzen in den wässrigen Innenraum der Partikel, wohingegen hydrophobe Verbindungen in der Membran eingelagert werden können. Aufgrund der Lokalisierung im Kern oder in der Hülle der Partikel ist die Beladung sehr limitiert und damit meist unzureichend. Nachteilig ist weiterhin, dass vor allem hydrophile Substanzen in wässriger Umgebung schnell aus solchen Systemen ausgewaschen werden. Eine alternative Verkapselung wasserlöslicher Substanzen in Polyelektrolytkomplexe ist nur begrenzt möglich, da Farbstoffe wie beispielsweise Indocyaningrün (ICG) kleine Moleküle mit nur wenigen geladenen Gruppen sind, womit nur unzureichend Ladungen für eine elektrostatische Komplexierung zur Verfügung stehen. Hinzu kommt, dass Polyelektrolytkomplexe in wässriger Lösung sehr dynamische Systeme sind, wodurch diese meist eine unzureichende kolloidale Stabilität in Plasma aufweisen [Thünemann A. F. et al., Adv. Polym. Sei., 2004; 166: 113-171].For future therapeutic approaches, for example, it will be necessary to demonstrate by means of diagnostic proof of the distribution of the particles in the organism that accumulation takes place above all in the diseased tissue (eg in the tumor). Optical imaging techniques such as sonography, X-ray diagnostics, cross-sectional imaging (CT, MRI) and nuclear medicine (PET, SPECT) are available for in vivo detection. Another and relatively new method is Optical Imaging, whose detection principle is based on usage is based on near-infrared fluorescence. It is a non-invasive procedure that works without ionizing radiation and is very inexpensive and inexpensive compared to methods such as MRI. The NIR dyes such as indocyanine green developed for such an application are very soluble in water, which makes it difficult to efficiently encapsulate them in a hydrophobic polymer matrix. The reason for this is the rapid change of the hydrophilic substance into the aqueous phase, for example during production by means of nanoprecipitation. For the encapsulation of hydrophilic substances in nanoparticles, only a few technologies are available that have different disadvantages. The amphiphilic nature of liposomes or polymerosomes, for example, allows the inclusion of hydrophilic substances in the aqueous interior of the particles, whereas hydrophobic compounds can be incorporated in the membrane. Due to the localization in the core or in the shell of the particles, the loading is very limited and thus usually insufficient. A further disadvantage is that, above all, hydrophilic substances in an aqueous environment are rapidly washed out of such systems. An alternative encapsulation of water-soluble substances in Polyelektrolytkomplexe is limited, since dyes such as indocyanine green (ICG) are small molecules with only a few charged groups, which are insufficient charges for electrostatic complexation available. In addition, polyelectrolyte complexes in aqueous solution are very dynamic systems, as a result of which they usually have inadequate colloidal stability in plasma [Thünemann AF et al., Adv. Polym. Sei., 2004; 166: 113-171].
Wie zuvor beschrieben wird es zukünftig erforderlich sein, mittels diagnostischer Nanopartikel zu belegen, dass die Anreicherung der Partikel vor allem am Zielort, beispielsweise dem Tumor, stattfindet. Wird dieser Nachweis erbracht, so kann eine therapeutisch aktive Substanz in ein- und dasselbe System verkapselt werden und einen maximalen therapeutischen Effekt am Wirkort erzielen, da ja die erwünschte Verteilung der Nanopartikel bereits mittels des diagnostischen Systems nachgewiesen wurde. Um die Verteilungseigenschaften der Partikel nicht zu verändern ist es deshalb wichtig, für den diagnostischen Nachweis und die anschließende Behandlung ein und dasselbe nanopartikuläre System nutzen zu können. Wie zuvor beschrieben, gibt es eine Reihe unterschiedlicher nanopartikulärer Systeme, welche allerdings entweder nur für die Verkapselung hydrophiler oder hydrophober Substanzen geeignet sind. Aus der Literatur ist bekannt, dass nur geringe Veränderungen der Nanopartikeleigenschaften wie Partikelgröße, Oberflächenmaterial, Art des Matrixpolymers oder auch die Verwendung eines anderen Tensids einen enormen Einfluss auf die Verteilung der Partikel im Organismus haben. Deshalb ist es wichtig, sowohl Diagnose, Therapie als auch ein mögliches Monitoring der Behandlung mit ein- und demselben System durchführen zu können.As described above, it will be necessary in the future to prove by means of diagnostic nanoparticles that the accumulation of the particles takes place above all at the target site, for example the tumor. If this proof is provided, then a therapeutically active substance can be encapsulated in one and the same system and achieve a maximum therapeutic effect at the site of action, since the desired distribution of the nanoparticles has already been detected by means of the diagnostic system. To the It is therefore important to be able to use one and the same nanoparticulate system for the diagnostic detection and the subsequent treatment. As described above, there are a number of different nanoparticulate systems, which, however, are suitable either only for the encapsulation of hydrophilic or hydrophobic substances. It is known from the literature that only small changes in the nanoparticle properties such as particle size, surface material, type of matrix polymer or the use of another surfactant have a tremendous influence on the distribution of the particles in the organism. Therefore, it is important to be able to perform both diagnosis, therapy and possible monitoring of treatment with one and the same system.
Idealerweise sollten deshalb in ein- und demselben nanopartikulären System sowohl wasserlösliche Farbstoffe zur Diagnose als auch therapeutische Substanzen, welche meist aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften schwer wasserlöslich sind, effektiv und mit einer ausreichenden Stabilität gegen Auswaschen verkapselt werden können.Ideally, therefore, in the same nanoparticulate system, both water-soluble dyes for diagnosis and therapeutic substances, which are usually poorly water-soluble due to their hydrophobic properties, should be able to be encapsulated effectively and with sufficient stability to wash out.
Eine technologische Herausforderung besteht weiterhin darin, durch die Verwendung geeigneter Oberflächen einerseits eine ausreichende Partikelstabilität und andererseits eine spezifische Anreicherung im Zielgewebe zu gewährleisten. Der Verbleib am Ort der Anreicherung (Zielgewebe) wiederum ist u. a. davon abhängig, wie gut die Partikel in das Gewebe und die Zelle aufgenommen werden.A technological challenge remains to ensure adequate particle stability on the one hand and specific enrichment in the target tissue on the other hand through the use of suitable surfaces. The whereabouts at the place of enrichment (target tissue) is again u. a. depending on how well the particles are absorbed into the tissue and the cell.
Aus der Literatur ist bekannt, dass kationische Partikeloberflächen eine Aufnahme in die Zelle begünstigen [Mounkes L. C. et al., J. Biol. Chem., 1998; 273(40): 26164-26170] [Mislick K.A., Baldeschwieler J.D., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996; 93: 12349-12354]. Grund sind elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der negativ geladenen Zellmembran (sulfatierte Proteoglykane) und der kationischen Partikeloberfläche (meist protonierte Aminfunktionen). Hinzu kommt, dass Aminogruppen tragende Polymere oder Substanzen dafür bekannt sind, endoosmoyltische Aktivität zu besitzen, d.h. sie fördern eine intrazelluläre Freisetzung der Partikel aus den Endolysosomen durch Schädigung der Endolysosomenmembran [DeDuve C. et al., Biochem. Pharmacol., 1974; 23:2495-2531]. Verbleiben die Partikel innerhalb der Zelle in den Endolysosomen, findet ein Abbau der Partikelmatrix sowie der darin eingeschlossenen Substanzen über zelleigene Enzyme statt. Die endolysosomale Freisetzung der verkapselten Wirkstoffe ist deshalb essentiell für den therapeutischen Effekt.It is known from the literature that cationic particle surfaces favor uptake into the cell [Mounkes LC et al., J. Biol. Chem., 1998; 273 (40): 26164-26170] [Mislick KA, Baldeschwieler JD, Proc. Natl. Acad. Be. USA, 1996; 93: 12349-12354]. The reason is electrostatic interactions between the negatively charged cell membrane (sulfated proteoglycans) and the cationic particle surface (usually protonated amine functions). In addition, polymers or substances carrying amino groups are known to possess endo-osmotic activity, ie they promote intracellular activity Release of the particles from the endolysosomes by damage to the endolysosome membrane [DeDuve C. et al., Biochem. Pharmacol., 1974; 23: 2495-2531]. If the particles remain within the cell in the endolysosomes, a degradation of the particle matrix and the substances contained therein takes place via cell-specific enzymes. The endolysosomal release of the encapsulated drugs is therefore essential for the therapeutic effect.
Problematisch ist jedoch, dass teilweise schwerwiegende toxikologische Effekte bei in vivo Untersuchungen von Polyplexen und Lipiden mit stark kationischen geladenen Oberflächen beschrieben worden sind [Kircheis S. et al., J. Gene Med., 1999; 1 : 111-120][Ogris M. et al., Gene Ther., 1999; 6: 595-605]. Die Ursache liegt darin, dass kationische Partikel mit negativ geladenen Erythrozyten aggregieren und es dadurch zu einer Blockade der Blutgefäße kommt. Zusätzlich führt dies meist zu einer starken Akkumulation in der Lunge, welche die Partikel als erstes Kapillarbett nach i.v. Applikation passieren [Kircheis R. et al., Drug Deliv. Rev., 2001 ; 53(3): 341-58]. Hier besteht die Gefahr einer Lungenembolie, begünstigt durch Agglomerate aus Partikeln und Erythrozyten oder anderen Blutkomponenten [Kircheis S. et al., J. Gene Med., 1999; 1 : 111-120] [Og ris M. et al., Gene Ther., 1999; 6: 595-605].The problem, however, is that partially serious toxicological effects have been described in in vivo studies of polyplexes and lipids with highly cationic charged surfaces [Kircheis S. et al., J. Gene Med., 1999; 1: 111-120] [Ogris M. et al., Gene Ther., 1999; 6: 595-605]. The reason is that cationic particles aggregate with negatively charged erythrocytes resulting in blockage of the blood vessels. In addition, this usually leads to a strong accumulation in the lungs, which the particles as the first capillary bed after i.v. Application [Kircheis R. et al., Drug Deliv. Rev., 2001; 53 (3): 341-58]. Here there is a risk of pulmonary embolism, favored by agglomerates of particles and erythrocytes or other blood components [Kircheis S. et al., J. Gene Med., 1999; 1: 111-120] [Ogris M. et al., Gene Ther., 1999; 6: 595-605].
Idealerweise sollten deshalb nanopartikuläre Systeme mit kationischen Oberflächeneigenschaften hergestellt werden, ohne dass mögliche toxikologisch bedenkliche Eigenschaften eine in-vivo Anwendung behindern. Zusätzlich muss die Partikeloberfläche gegenüber körpereigenen Abwehrmechanismen (Opsonine, RES) unauffällig sein, wodurch erst eine ausreichend lange Zirkulationszeit ermöglicht wird, welche Voraussetzung für eine entsprechende Anreicherung der Partikel aus dem Blutstrom im Zielgewebe ist. Dabei sollten die nanopartikulären Systeme weiterhin die Aufnahme in die Zielzelle und die endolysosomale Freisetzung unterstützen.Ideally, therefore, nanoparticulate systems with cationic surface properties should be prepared without the potential toxicologically harmful properties hindering an in vivo application. In addition, the particle surface must be inconspicuous to the body's own defense mechanisms (Opsonine, RES), allowing only a sufficiently long circulation time, which is a prerequisite for a corresponding accumulation of particles from the blood stream in the target tissue. The nanoparticulate systems should continue to support uptake into the target cell and endolysosomal release.
Eine weitere Schwierigkeit bei der Herstellung nanopartikulärer Systeme besteht darin, geeignete Substanzen oder Ziel erkennende Strukturen auf der Partikeloberfläche aufzubringen. Häufig wird die Oberfläche der Partikel mit Hilfe von kovalenten Kopplungsreaktionen modifiziert. Voraussetzung dafür sind funktionelle Gruppen am Polymerrückgrat bzw. an der Partikeloberfläche, welche durch entsprechende chemische Kopplungsreaktionen mit dem Ziel erkennenden Molekül irreversibel verknüpft werden können [Nobs L. et al., J. Pharm. Sei., 2004; 93: 1980-1992]. Da die Stabilität kolloidaler Dispersionen durch die Reagenzien bzw. unter den Reaktionsbedingungen häufig stark verringert wird, ist die chemische Durchführung meist aufwendig und problematisch [Koo O. M. et al., Nanomedicine, 2005; 1(3):193-212][Choi S.W. et al., J. Dispersion Sei. Technol., 2003; 24(3&4): 475-487]. Die kovalente Verknüpfung von Molekülen und Partikeloberflächen muss zusätzlich für jedes neue, auf die Oberfläche aufzubringende, Molekül speziell geeignet sein, um mögliche nicht gewollte chemische Reaktionen zu vermeiden. Auch eine Vermeidung von organischen Lösemitteln, häufig genutzt für kovalente Verknüpfungen, ist wegen der verringerten Belastung der Umwelt und der Vereinfachung der Durchführung der Reaktion anzustreben.Another difficulty in making nanoparticulate systems is to apply suitable substances or target-recognizing structures to the particle surface. Frequently, the surface of the particles is modified by means of covalent coupling reactions. Prerequisite for this are functional groups on the polymer backbone or on the particle surface, which can be irreversibly linked by appropriate chemical coupling reactions with the target-recognizing molecule [Nobs L. et al., J.Pharm. Sei., 2004; 93: 1980-1992]. Since the stability of colloidal dispersions is often greatly reduced by the reagents or under the reaction conditions, the chemical implementation is usually complicated and problematic [Koo OM et al., Nanomedicine, 2005; 1 (3): 193-212] [Choi SW et al., J. Dispersion Sei. Technol., 2003; 24 (3 & 4): 475-487]. In addition, the covalent attachment of molecules and particle surfaces must be particularly suitable for any new molecule to be applied to the surface in order to avoid possible unwanted chemical reactions. Avoiding organic solvents, often used for covalent linkages, is also desirable because of the reduced burden on the environment and the simplification of the implementation of the reaction.
Idealerweise sollte deshalb eine nicht-kovalente, einfach durchzuführende und somit flexible und dennoch stabile Oberflächenmodifikation möglich sein.Ideally, therefore, a non-covalent, easy-to-perform, and thus flexible, yet stable surface modification should be possible.
Die aus der Literatur bekannten kolloidalen Systeme eignen sich meist nur zur Verkapselung hydrophober Substanzen oder aber hydrophiler Substanzen. Im Falle der häufig angewendeten kovalenten Oberflächenmodifikation der Partikel besteht wenig Flexibilität bezüglich der Nutzung unterschiedlichster Oberflächenstrukturen auf ein- und demselben Kernpartikel. Hinzu kommt, dass sich die Liganden zur spezifischen Anreicherung oft nachteilig auf die Aufnahme im eigentlichen Tumorgewebe und insbesondere auf die Zellaufnahme auswirken. Sofern die Partikel eine ausreichende Zirkulation gewährleisten und sich passiv oder aktiv gut im Zielgewebe anreichern, so ist meist die Internalisierung und die endolysosomale Freisetzung nicht optimal [van Osdol W., Cancer Res., 1991 ; 51 : 4776-4784] [Weinstein J. N. et al., Cancer Res., 1992; 52(9): 2747-2751].The known from the literature colloidal systems are usually only suitable for encapsulation of hydrophobic substances or hydrophilic substances. In the case of the frequently used covalent surface modification of the particles, there is little flexibility with regard to the use of a wide variety of surface structures on one and the same core particle. In addition, the ligands for specific enrichment often adversely affect the uptake in the actual tumor tissue and in particular on the cell uptake. Insofar as the particles ensure adequate circulation and passively or actively accumulate well in the target tissue, internalization and endolysosomal release are usually not optimal [van Osdol W., Cancer Res., 1991; 51: 4776-4784] [Weinstein J.N. et al., Cancer Res., 1992; 52 (9): 2747-2751].
Folglich besteht auch weiterhin ein Bedarf an pharmazeutischen, nanopartikulären Formulierungen, welche: (i) sowohl wasserlösliche als auch schwer wasserlösliche pharmazeutisch aktive Substanzen, effektiv und mit einer ausreichenden Stabilität gegen Auswaschen verkapseln (ii) eine nicht- kovalente, einfach durchzuführende (flexible) und dennoch stabile Oberflächenmodifikation ermöglichen, (iii) eine ausreichende Zirkulationszeit ermöglichen (iv), effektiv in das Zielgewebe aufgenommen werden sowie (v) dort intrazellulär aus den Endolysosomen freigesetzt werden.Thus, there continues to be a need for pharmaceutical, nanoparticulate formulations which: (i) both water-soluble and encapsulate poorly water-soluble pharmaceutically active substances, effectively and with sufficient stability to wash out (ii) enable non-covalent, easy-to-perform (flexible) yet stable surface modification; (iii) allow sufficient circulation time (iv) to be effectively absorbed into the target tissue and (v) there are released intracellularly from the endolysosomes.
Eine Aufgabe der Erfindung war es deshalb, eine verbesserte pharmazeutische Formulierung zur Verfügung zu stellen, in welche sowohl hydrophile als auch hydrophobe Wirkstoffe verkapselt werden können. Andererseits sollte eine flexible und ausreichend stabile Oberflächenmodifikation eine optimale Anreicherung im erkrankten Gewebe ermöglichen. Um einen maximalen diagnostischen oder therapeutischen Effekt erzielen zu können, muss ein solches kolloidales System auch effizient in das Zielgewebe sowie in die einzelnen Zellen aufgenommen werden, wo eine endolysosomale Freisetzung erfolgen kann. Ebenso sollte es sich um praktikable Herstellungsmethoden handeln, um die Herstellung in einem zeit- und kostengerechten Rahmen zu ermöglichen.An object of the invention was therefore to provide an improved pharmaceutical formulation in which both hydrophilic and hydrophobic drugs can be encapsulated. On the other hand, a flexible and sufficiently stable surface modification should allow optimal accumulation in the diseased tissue. To achieve maximum diagnostic or therapeutic effect, such a colloidal system must also be efficiently incorporated into the target tissue as well as into the individual cells where endolysosomal release can occur. Likewise, they should be practicable manufacturing methods to enable production in a timely and cost-effective manner.
Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
Die Erfindung betrifft Polymernanopartikel mit einem kationischen Oberflächenpotential, enthaltend ein kationisches Polymer und ein in Wasser schwer lösliches Polymer, dadurch gekennzeichnet, dass diese Polymernanopartikel diagnostische und therapeutische Agenzien, insbesondere Epothilone, gemeinsam oder getrennt verkapselt, oder nur Epothilone enthalten.The invention relates to polymer nanoparticles having a cationic surface potential containing a cationic polymer and a sparingly water-soluble polymer, characterized in that said polymer nanoparticles encapsulate diagnostic and therapeutic agents, in particular epothilones, together or separately, or contain only epothilones.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass durch Co-Präzipitation eines wasserlöslichen kationischen Polymers mit einem schwer wasserlöslichen Polymer stabile Polymernanopartikel hergestellt werden können, welche eine kationisch funktionalisierte Oberfläche aufweisen. Weiterhin war im Sinne der Erfindung überraschend, dass sowohl hydrophile, gut wasserlösliche als auch hydrophobe, schwer wasserlösliche Substanzen in die Polymermatrix der zuvor beschriebenen Nanopartikel verkapselt werden konnten. Unerwarteterweise führte die ionische Komplexierung von wasserlöslichen Substanzen geringen Molekulargewichtes mit dem geladenen kationischen Polymer zu einer erfolgreichen Verkapselung in die Polymermatrix der Partikel mittels Nanopräzipitation. Im Sinne der Erfindung können Substanzen in die Polymerpartikel verkapselt werden, welche sich zur Diagnose und/ oder zur Therapie von verschiedenen Erkrankungen eignen.Surprisingly, it has been found that by co-precipitation of a water-soluble cationic polymer with a sparingly water-soluble polymer stable polymer nanoparticles can be prepared, which have a cationically functionalized surface. Furthermore, it was surprising in the context of the invention that both hydrophilic, readily water-soluble and hydrophobic, poorly water-soluble substances in the polymer matrix of the previously described nanoparticles could be encapsulated. Unexpectedly, ionic complexation of low molecular weight water-soluble substances with the charged cationic polymer resulted in successful encapsulation in the polymer matrix of the particles by nanoprecipitation. For the purposes of the invention, substances can be encapsulated in the polymer particles which are suitable for the diagnosis and / or the therapy of various diseases.
Weiterhin wurde gefunden, dass die kationisch funktionalisierte Partikeloberfläche elektrostatisch mit einer partiell entgegengesetzt geladenen Verbindung stabil und flexibel oberfächenmodifiziert werden kann.Furthermore, it has been found that the cationically functionalized particle surface can be electrostatically stably and flexibly surface-modified with a partially oppositely charged compound.
Ein Gegenstand der beschriebenen Erfindung ist daher die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel zum Erkennen von Krankheiten (Diagnose), zur Behandlung von Krankheiten (Therapie) wie auch zum Monitoring einer Therapie.An object of the described invention is therefore the use of nanoparticles according to the invention for the detection of diseases (diagnosis), for the treatment of diseases (therapy) as well as for the monitoring of a therapy.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Kit bestehend aus getrennt hergestellten nanopartikulären Systemen (a) und (b) derselbenAnother aspect of the invention is a kit consisting of separately prepared nanoparticulate systems (a) and (b) thereof
Zusammensetzung, enthaltend (a) ein in einen Partikel verkapseltes Diagnostikum und (b) ein in einenA composition comprising (a) a diagnostic agent encapsulated in a particle and (b) a diagnostic agent encapsulated in a particle
Partikel verkapseltes Epothilon, wobei die Partikel gemeinsam oder getrennt, gegebenenfalls verdünnt, verabreicht werden können. oder aus einem nanopartikulären System, das Wirkstoff und Diagnostikum gemeinsam verkapselt enthält.Particles encapsulated epothilone, wherein the particles can be administered together or separately, optionally diluted. or from a nanoparticulate system that encapsulates drug and diagnostic agent together.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Kit wie oben beschrieben, wobei die Bestandteile (a) und (b) im festen Zustand, beispielsweise als Lyophilisat, vorliegen und zusätzlich gegebenenfalls ein Mittel (c) enthalten ist, das geeignet ist, die nanopartikulären Systeme (a) und (b) gegebenenfalls wahlweise getrennt oder zusammen zu dispergieren.A further aspect of the invention is a kit as described above, wherein the constituents (a) and (b) are in the solid state, for example as lyophilisate, and if appropriate additionally an agent (c) which is suitable for use in the nanoparticulate systems ( a) and (b) optionally optionally separately or together to disperse.
Weiterhin beinhaltet die Erfindung die Verwendung der nanopartikulären Systeme zur Herstellung einer geeigneten Arzneiform unter Verwendung von pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoffen, die für die jeweilige Arzneiform notwendig sind. Die im Sinne der Erfindung entwickelte Arzneiform kann an Mensch oder Tier über verschiedene Applikationswege angewendet werden. Bevorzugt wird sie i.v. verabreicht. Dazu notwendige, dem Fachmann bekannte Applikationssysteme sind ebenso Teil der hier beschriebenen Erfindung.Furthermore, the invention includes the use of the nanoparticulate systems for the preparation of a suitable drug form using pharmaceutically acceptable excipients, which are necessary for the respective dosage form. The drug form developed in the context of the invention can be applied to humans or animals via various routes of administration. Preferably, it is administered iv. Necessary application systems known to the person skilled in the art are likewise part of the invention described here.
Die Zusammensetzung der Nanopartikel beinhaltet ein schwer wasserlösliches Polymer, wobei es sich bevorzugt um ein bioabbaubares Polymer oder auch eine Mischung verschiedener bioabbaubarer Polymere handelt. Das bioabbaubare Polymer kann über einzelne Monomereinheiten beschrieben werden, welche mittels einer Polymerisation oder anderer Prozesse besagtes Polymer formen. Weiterhin kann das Polymer über seinen Namen definiert sein.The composition of the nanoparticles includes a poorly water-soluble polymer, which is preferably a biodegradable polymer or else a mixture of various biodegradable polymers. The biodegradable polymer can be described via individual monomer units which form said polymer by means of polymerization or other processes. Furthermore, the polymer can be defined by its name.
In einer Ausführungsform leitet sich das schwer wasserlösliche Polymer aus der Gruppe der natürlichen und/oder synthetischen Polymere bzw. aus Homo- undIn one embodiment, the poorly water-soluble polymer is derived from the group of natural and / or synthetic polymers or homo- and / or
Co-Polymeren entsprechender Monomere ab. Insbesondere leitet sich dasCo-polymers of corresponding monomers. In particular, that derives
Polymer aus der Gruppe Alkylcyanoacrylate wie beispielsweise derPolymer from the group alkyl cyanoacrylates such as
Butylcyanoacrylate und der Isobutylcyanoacrylate, der Acrylate, wie derButyl cyanoacrylates and isobutyl cyanoacrylates, acrylates such as
Methacrylate, der Lactide, beispielsweise der L-Lactide oder DL-Lactide, der Glycolide, der Caprolactone wie der ε-Caprolactone und anderer ab.Methacrylates, the lactides, for example, the L-lactides or DL-lactides, the glycolides, the caprolactones such as ε-caprolactones and others from.
In einer weiteren Ausführungsform ist besagtes Polymer oder Teil des Polymers ausgewählt aus der Gruppe Polycyanoacrylate und Polyalkylcyanoacrylate (PACA), wie beispielsweise Polybutylcyanoacrylat (PBCA), Polyester wie beispielsweise Poly(DL-Lactide), Poly(L-Lactide), Polyglycolide, Polydioxanone, Polyoxazoline, Poly(Glycolide-co-Trimethylene-Carbonate), Polylactid-co-Glycolide (PLGA) wie beispielsweise Poly(L-Lactide-co-Glycolide) oder Poly(DL-Lactide-co-Glycolide), Poly(L-lactide-co-DL-Lactide), Poly(Glycolide-co-Trimethylen), Poly(Carbonate-co-Dioxanone), Alginsäure, Hyaluronsäure, Polysialinsäure, saure Cellulose-Derivate, saure Stärke-Derivate,In a further embodiment, said polymer or part of the polymer is selected from the group of polycyanoacrylates and polyalkylcyanoacrylates (PACA), such as, for example, polybutylcyanoacrylate (PBCA), polyesters, for example poly (DL-lactides), poly (L-lactides), polyglycolides, polydioxanones, Polyoxazolines, poly (glycolide-co-trimethylene carbonates), polylactide-co-glycolides (PLGA) such as poly (L-lactide-co-glycolide) or poly (DL-lactide-co-glycolide), poly (L-lactide -co-DL-lactides), poly (glycolide-co-trimethylene), poly (carbonates-co-dioxanones), alginic acid, hyaluronic acid, polysialic acid, acidic cellulose derivatives, acidic starch derivatives,
Polysaccharide wie beispielsweise Dextrane, Alginate, Cyclodextrine, Hyaluronsäure, Chitosane, saure Polyaminosäuren, polymere Proteine wie beispielsweise Collagen, Gelatine oder Albumin,Polysaccharides such as dextrans, alginates, cyclodextrins, hyaluronic acid, chitosans, acidic polyamino acids, polymeric proteins such as collagen, gelatin or albumin,
Polyamide wie beispielsweise Poly(Asparaginsäure), Poly(Glutaminsäure), Poly(lminocarbonate) (Poly(carbonate) abgeleitet von Tyrosin, Poly(ß- Hydroxybutyrat),Polyamides such as poly (aspartic acid), poly (glutamic acid), poly (lminocarbonate) (poly (carbonate) derived from tyrosine, poly (β-hydroxybutyrate),
Polyanhydride wie beispielsweise Polysebacidsäure (PoIy(SA)), Poly(adipinsäure), PoIy(CPP-SA), PoIy(CPH), PoIyCPM) aromatische Polyanhydride, Polyorthoester, Polycaprolactone wie beispielsweise Poly-ε- oder γ-Caprolactone,Polyanhydrides such as, for example, polysebacidic acid (poly (SA)), poly (adipic acid), poly (CPP-SA), poly (CPH), poly (CPM) aromatic polyanhydrides, polyorthoesters, polycaprolactones such as poly-ε- or γ-caprolactones,
Polyphosphorsäure wie Polyphosphate, Polyphosphonate, Polyphosphazene, Poly(amide-enamines), Azopolymers, Polyurethane, Dendrimere, Pseudopolymaminosäuren wie auch sämtliche Mischungen und Co-Polymere derselben Verbindungen.Polyphosphoric acid such as polyphosphates, polyphosphonates, polyphosphazenes, poly (amide-enamines), azopolymers, polyurethanes, dendrimers, Pseudopolymaminosäuren as well as all mixtures and co-polymers of the same compounds.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das schwer wasserlösliche Polymer ausgewählt aus der Gruppe der folgenden Polymere:In a preferred embodiment, the sparingly water-soluble polymer is selected from the group of the following polymers:
Polyacrylate, Polylactide und Polygylcolide, bzw. deren Co-Polymere.Polyacrylates, polylactides and Polygylcolide, or their co-polymers.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das schwer wasserlösliche Polymer aus der Gruppe der Polyalkylcyanoacrylate (PACA).In a particularly preferred embodiment, the sparingly water-soluble polymer is selected from the group of polyalkyl cyanoacrylates (PACA).
Den Aufbau dieser Polyalkylcyanoacrylate zeigt die angegebene Struktur (Formel I), wobei es sich bei dem angegebenen Rest R bevorzugt um lineare und verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen, eine Cyclohexyl-, Benzyl- oder eine Phenylgruppe handelt.The structure of these polyalkylcyanoacrylates shows the structure indicated (formula I), wherein the stated radical R is preferably linear and branched alkyl groups having 1 to 16 carbon atoms, a cyclohexyl, benzyl or a phenyl group.
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Formel (I): Strukturformel PACA, n= 5 - 20000, bevorzugt n=5-6000, bzw. n=5- 100 In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist das schwer wasserlösliche Polymer ein Polybutylcyanoacrylat (PBCA) (Formel II).Formula (I): Structural formula PACA, n = 5-20,000, preferably n = 5-6000, or n = 5-100 In a further particularly preferred embodiment, the sparingly water-soluble polymer is a polybutyl cyanoacrylate (PBCA) (formula II).
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Formel II: Strukturformel PBCA; n= 5 - 20000 bevorzugt n=5-6000, bzw. n=5- 100
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Formula II: Structural Formula PBCA; n = 5-20000, preferably n = 5-6000, or n = 5-100
Das schwer wasserlösliche Polymer bildet im Sinne der Erfindung den größeren Anteil der Polymermatrix der Partikel.For the purposes of the invention, the poorly water-soluble polymer forms the larger proportion of the polymer matrix of the particles.
Überraschenderweise konnte gefunden werden, dass durch den Einbau von Verbindungen mit Aminogruppen, insbesondere einem kationischen Polymer, in eine schwer wasserlösliche, feste Polymermatrix Nanopartikel mit einem kationisch geladenen Oberflächenpotential (Zetapotential) erzeugt werden.Surprisingly, it has been found that nanoparticles with a cationically charged surface potential (zeta potential) are produced by the incorporation of compounds with amino groups, in particular a cationic polymer, into a poorly water-soluble, solid polymer matrix.
In einer Ausführungsform leitet sich das kationische Polymer aus der Gruppe der natürlichen und/oder synthetischen Polymere bzw. aus Homo- und Co- Polymeren entsprechender Monomere ab.In one embodiment, the cationic polymer is derived from the group of natural and / or synthetic polymers or from homopolymers and copolymers of corresponding monomers.
Als kationische Polymere eignen sich im Sinne dieser Erfindung Polymere mit freien primären, sekundären oder tertiären Aminogruppen, die mit beliebigen niedermolekularen Säuren Salze bilden können, wobei die Salze in wässrig- organischen Lösungsmitteln löslich sind. Auch eignen sich Polymere oder deren Salze, die quartäre Ammoniumgruppen tragen und in organischen Lösungsmitteln löslich sind.Suitable cationic polymers in the context of this invention are polymers having free primary, secondary or tertiary amino groups which can form salts with any low molecular weight acid, the salts being soluble in aqueous-organic solvents. Also suitable are polymers or their salts which carry quaternary ammonium groups and are soluble in organic solvents.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind folgende Gruppen kationischer Polymere, Polykationen und Polyaminverbindungen bzw. Polymere aus Homo- und Co-Polymeren entsprechender Monomere besonders geeignet: Modifizierte natürliche kationische Polymere, kationische Proteine, synthetische kationische Polymere, Aminoalkane unterschiedlicher Kettenlänge, modifizierte kationische Dextrane, kationische Polysaccharide, kationische Stärke- oder Cellulosederivate, Chitosane, Guarderivate, kationische Cyanoacrylate, Methacrylate und Methacrylamide und solche Monomere und Comonomere die zur Bildung entsprechender geeigneter Verbindungen genutzt werden können und die entsprechenden Salze, welche sich mit geeigneten anorganischen oder niedermolekularen organischen Säuen bilden können.In a preferred embodiment, the following groups of cationic polymers, polycations and polyamine compounds or polymers of homo- and co-polymers of corresponding monomers are particularly suitable: modified natural cationic polymers, cationic proteins, synthetic cationic polymers, aminoalkanes of different chain length, modified cationic dextrans, cationic polysaccharides , cationic starch or Cellulose derivatives, chitosans, guar derivatives, cationic cyanoacrylates, methacrylates and methacrylamides, and such monomers and comonomers which can be used to form corresponding suitable compounds and the corresponding salts which can form with suitable inorganic or low molecular weight organic acids.
Dazu zählen insbesondere: „Diethylaminoethyl"-modifizierte Dextrane, Hydroxymethylcellulosetrimethylamin, Polylysin, Protaminsulfat,These include in particular: "diethylaminoethyl" -modified dextrans, hydroxymethylcellulosetrimethylamine, polylysine, protamine sulfate,
Hydroxyethylcellulosetrimethylamin, Polyallylaminen, Protaminchlorid, Polyallylaminhydrosalze, Polyamine, Polyvinylbenzyltrimethylammoniumsalze, Polydiallyldimethylammoniumsalze, Polyimidazolin, Polyvinylamin und Polyvinylpyridin, Polyethylenimin (PEI), Putrescin (Butan-1 ,4-diamin), Spermidin (N-(3-Aminopropyl)butan-1 ,4-diamin), Spermin (N,N'-bis(3-aminopropyl)butan- 1 ,4-diamin) Dimethylaminoethylacrylat, PoIy-N, N-dimethylaminoethylmethacrylat =P(DMEAMA), Dimethylaminopropylacrylamid, Dimethylaminopropyl- methacrylamid, Dimethylaminostyrol, Vinylpyridin und Methyldiallylamin, PoIy- DADMAC, Guar, deacetyliertes Chitin und die entsprechenden Salze, welche sich mit geeigneten anorganischen oder niedermolekularen organischen Säuen bilden können . Folgende Polymere sind ein besonderer Aspekt der Erfindung: Polyamine, insbesondere Diethylaminoethylmodifizierte Dextrane, Polylysin, Protaminsulfat, Protaminchlorid, Polyallylaminen und Polyallylaminhydrosalze,Hydroxyethylcellulose trimethylamine, polyallylamines, protamine chloride, polyallylamine hydrosalts, polyamines, polyvinylbenzyltrimethylammonium salts, polydiallyldimethylammonium salts, polyimidazoline, polyvinylamine and polyvinylpyridine, polyethyleneimine (PEI), putrescine (butane-1, 4-diamine), spermidine (N- (3-aminopropyl) butane-1, 4 -diamine), spermine (N, N'-bis (3-aminopropyl) butan-1, 4-diamine) dimethylaminoethyl acrylate, poly-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate = P (DMEAMA), dimethylaminopropylacrylamide, dimethylaminopropylmethacrylamide, dimethylaminostyrene, vinylpyridine and Methyldiallylamine, poly-DADMAC, guar, deacetylated chitin and the corresponding salts which may form with suitable inorganic or low molecular weight organic acids. The following polymers are a particular aspect of the invention: polyamines, in particular diethylaminoethyl-modified dextrans, polylysine, protamine sulfate, protamine chloride, polyallylamines and polyallylamine hydrosalts,
Polydiallyldimethylammoniumsalze, Polyvinylbenzyltrimethylammoniumsalze, Polyimidazolin, Polyvinylamin und Polyvinylpyridin, Polyethylenimin (PEI), PoIy- DADMAC, Guar, oder deacetyliertes Chitin sowie die entsprechenden Salze, welche sich mit geeigneten anorganischen oder niedermolekularen organischen Säuen bilden können.Polydiallyldimethylammonium salts, polyvinylbenzyltrimethylammonium salts, polyimidazoline, polyvinylamine and polyvinylpyridine, polyethyleneimine (PEI), poly-DADMAC, guar, or deacetylated chitin and the corresponding salts which may form with suitable inorganic or low molecular weight organic acids.
Folgende Monomere sind beonsers geeignet: Hydroxymethylcellulosetrimethyl amin, Hydroxyethylcellulosetrimethylamin, Putrescin (Butan-1 ,4-diamin), Spermidin (N-(3-Aminopropyl)butan-1 ,4-diamin), Spermin (N,N'-bis(3- aminopropyl)butan-1 ,4-diamin), Dimethylaminoethylacrylat,The following monomers are suitable: hydroxymethylcellulosetrimethylamine, hydroxyethylcellulosetrimethylamine, putrescine (butane-1, 4-diamine), spermidine (N- (3-aminopropyl) butane-1,4-diamine), spermine (N, N'-bis (3 - aminopropyl) butane-1, 4-diamine), dimethylaminoethyl acrylate,
Dimethylaminopropylacrylamid, Dimethylaminopropylmethacrylamid, Dimethylaminostyrol, Vinylpyridin und Methyldiallylamin, sowie die entsprechenden Salze, welche sich mit geeigneten anorganischen oder niedermolekularen organischen Säuen bilden können.Dimethylaminopropylacrylamide, dimethylaminopropylmethacrylamide, dimethylaminostyrene, vinylpyridine and methyldiallylamine, and the corresponding salts which can be formed with suitable inorganic or low molecular weight organic Säu.
Geeignete Säuren zur Salzbildung sind z. B.: Salzsäure, Schwefelsäure, insbesondere aber auch Essigsäure, Glycolsäure oder Milchsäure.Suitable acids for salt formation are, for. B.: Hydrochloric acid, sulfuric acid, but especially acetic acid, glycolic acid or lactic acid.
In einer Ausführungsform kann die Aminogruppen-tragende Verbindung, insbesondere ein kationisches Polymer, in einem organischen Lösungsmittel, welches unbegrenzt mit Wasser mischbar ist, vorzugsweise Aceton, Methanol, Ethanol, Propanol, Dimetylsulfoxid (DMSO), oder in einem Gemisch aus diesen Lösungsmitteln mit Wasser gelöst werden.In one embodiment, the amino group-bearing compound, in particular a cationic polymer, in an organic solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), or in a mixture of these solvents with water be solved.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Polymernanopartikel als Aminogruppen tragende Verbindung ein kationisch modifiziertes Polyacrylat (PoIy-N, N-dimethylaminoethylmethacrylat, P(DMAEMA)) (Formel 3).In a preferred embodiment, the polymer nanoparticles contain, as the amino group bearing compound, a cationically modified polyacrylate (poly-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, P (DMAEMA)) (Formula 3).
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Formel (IM): Strukturformel P(DMAEMA), n= 5 - 20000, bevorzugt n=5-6000, bzw. n=5-100 oder Formel (IV): P(DMAPMAM) = PoIy(N, N-Dimethylaminopropylmethacrylamid)Formula (IM): structural formula P (DMAEMA), n = 5-20,000, preferably n = 5-6000, or n = 5-100 or formula (IV): P (DMAPMAM) = poly (N, N-dimethylaminopropylmethacrylamide)
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(IV) Das biologisch abbaubare, kationisch modifizierte Polyacrylat, z.B. P(DMAEMA), P(DMAPMAM) wird in die Polymermatrix, insbesondere die PBCA-Polymermatrix, mittels Nanopräzipitation verkapselt. Die Oberfläche der resultierenden Nanopartikel weist aufgrund der Aminogruppen des kationischen Polymers ein positives (kationisches) Oberflächenpotential (Zetapotential) auf. Die kationische Partikeloberfläche gewährleistet eine gute Zellaufnahme und ermöglicht eine flexible elektrostatische Oberflächenmodifikation mit partiell anionisch geladenen Verbindungen.(IV) The biodegradable, cationically modified polyacrylate, eg P (DMAEMA), P (DMAPMAM) is encapsulated in the polymer matrix, in particular the PBCA polymer matrix, by nanoprecipitation. The surface of the resulting nanoparticles has a positive (cationic) surface potential (zeta potential) due to the amino groups of the cationic polymer. The cationic particle surface ensures good cell uptake and enables flexible electrostatic surface modification with partially anionically charged compounds.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthalten die Polymernanopartikel als kationisches Polymer ein modifiziertes Polyacrylat Poly(Dimethylaminopropylmethacrylamid (P(DMAPMAM)).In another preferred embodiment, the polymer nanoparticles contain as cationic polymer a modified polyacrylate poly (dimethylaminopropylmethacrylamide (P (DMAPMAM)).
In einer weiteren Ausführungsform enthalten die Polymernanopartikel als kationisches Polymer Polyethylenimin (PEI) verschiedener Molekulargewichte, insbesondere 1 ,8 kDa, 10 kDa, 70 kDa sowie 750 kDa, (Formel 4).In a further embodiment, the polymer nanoparticles contain as cationic polymer polyethyleneimine (PEI) of various molecular weights, in particular 1, 8 kDa, 10 kDa, 70 kDa and 750 kDa, (formula 4).
PEI ist ein im Bereich der nicht-viralen Gentherapie für DNA-Polyplexe (PEK) häufig verwendetes und dementsprechend viel untersuchtes Polykation [Remy J.-S. et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 1998; 30(1-3): 85-95].PEI is a polycation commonly used in the field of non-viral gene therapy for DNA polyplexes (PEK) and accordingly much studied [Remy J.-S. et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 1998; 30 (1-3): 85-95].
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Formel (V): Allgemeine Strukturformel für verzweigtes Polyethylenimin, wobei x, y und z = 10-50 %, bevorzugt x, y und z = 20-40% sind und in die Gesamtheit der Anteile 100% ergibtFormula (V): General structural formula for branched polyethylenimine, wherein x, y and z = 10-50%, preferably x, y and z = 20-40%, and gives 100% in the entirety of the proportions
Aufgrund der Verkapselung des kationischen Polyelektrolyten PEI in die PBCA- Polymermatrix besteht die Partikelhülle aus PEI-Polymerketten, welche ein kationisches Oberflächenpotential erzeugen. Zusätzlich können erfindungsgemäß neben den zuvor genannten kationischen Polymeren bzw. Verbindungen mit Aminogruppen diagnostische aber auch therapeutische Substanzen in die Polymermatrix mittels Nanopräzipitation eingeschlossen werden.Due to the encapsulation of the cationic polyelectrolyte PEI in the PBCA polymer matrix, the particle shell consists of PEI polymer chains, which produce a cationic surface potential. In addition, according to the invention, in addition to the abovementioned cationic polymers or compounds containing amino groups, diagnostic as well as therapeutic substances can be included in the polymer matrix by means of nanoprecipitation.
Als diagnostische Substanzen zur Verkapselung können folgende Substanzklassen für unterschiedliche Molecular-Imaging-Methoden herangezogen werden, insbesondere sind hier Kontrastmittel oder Tracer für folgende Methode für molekulare Bildgebung (Molecular Imaging) zu nennen: die optische Bildgebung (Optical Imaging), wie z.B. DOT (diffuse optical imaging), US (ultrasound imaging), OPT (optical projection tomography), Nah- Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung, Fluoreszenz-Protein-Bildgebung und BLI (bioluminescence imaging) und die Magnetresonanztomographie (MRT, MRI) bzw. Röngenbildgebung (X-ray). Es sind aber auch noch andere Methoden denkbar. Die Verkapselung einer geeigneten diagnostischen Substanz aus gennanten Substanzgruppen ermöglicht eine Detektion der Partikel in vitro und/ oder in vivo.The following substance classes for different molecular imaging methods can be used as diagnostic substances for encapsulation, in particular contrast agents or tracers for the following method for molecular imaging (molecular imaging): optical imaging, e.g. DOT (diffuse optical imaging), US (ultrasound imaging), OPT (optical projection tomography), near infrared fluorescence imaging, fluorescence protein imaging and BLI (bioluminescence imaging) and magnetic resonance imaging (MRI, MRI) and X-ray imaging (X-ray). But there are also other methods conceivable. The encapsulation of a suitable diagnostic substance from named substance groups makes it possible to detect the particles in vitro and / or in vivo.
Erfindungsgemäße nanopartikuläre Systeme, die ausschließlich einen diagnostischen Wirkstoff enthalten, sind jedoch von den Patentansprüchen nicht umfasst.However, nanoparticulate systems according to the invention which contain exclusively a diagnostic active substance are not covered by the patent claims.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem diagnostischen Agens um Farbstoffe, insbesondere ausgewählt aus folgender Gruppe: Fluorescein, Fluorescein-isothiocyanat, Carboxyfluorescein oder Calcein, Tetrabromfluoresceine oder Eosine, Tertaiodfluorescein oder Erythrosine, Difluorofluorescein, wie Oregon GreenTM 488, Oregon GreenTM 500 oder Oregon GreenTM 514, Carboxyrhodol (Rhodol GreenTM)- Farbstoffe (US 5,227,487; US 5,442,045), Carboxyrodamin-Farbstoffe (Rhodamine GreenTM Dyes) (US 5,366,860), 4,4-Difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-indacene, wie z.B. Dodipy FL, Bodipy 493/503 oder Bodipy 530/550 und Derivate davon (US 4,774,339; US 5,187,288; US 5,248,782; US 5,433,896; US 5,451 ,663), Polymethin-Farbstoffe, Coumarinfarbstoffe wie z.B. Cumarin 6, 7-Amino-4- methylcoumarin, Metallkomplexe von DTPA oder Tetraazamacrozyclen (Cyclen, Pyvlen) mit Terbium oder Europium oder Tetrapyrrolfarbstoffe, insbesondere Porphyrine.In a preferred embodiment, the diagnostic agent is a dye, in particular selected from the following group: fluorescein, fluorescein isothiocyanate, carboxyfluorescein or calcein, tetrabromfluoresceins or eosines, tertaiodefluorescein or erythrosines, difluorofluorescein, such as Oregon GreenTM 488, Oregon GreenTM 500 or Oregon GreenTM 514, Carboxyrhodol (Rhodol Green ™) dyes (U.S. 5,227,487, U.S. 5,442,045), carboxyrodamine dyes (Rhodamine Green ™ Dyes) (U.S. 5,366,860), 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-indacenes, as disclosed in U.S. Pat eg Dodipy FL, Bodipy 493/503 or Bodipy 530/550 and derivatives thereof (US 4,774,339; US 5,187,288; US 5,248,782; US 5,433,896; US 5,451,663), polymethine dyes, coumarin dyes such as coumarin 6,7-amino-4 - methylcoumarin, metal complexes of DTPA or tetraazamacrocycles (Cyclen, Pyvlen) with terbium or europium or tetrapyrrole dyes, especially porphyrins.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei der diagnostischen Substanz um einen fluoreszenzaktiven Farbstoff.In one embodiment, the diagnostic substance is a fluorescent dye.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem diagnostischen Agens um einen fluoreszierenden Nah-lnfrarot(NIR)-Farbstoff. Diese bevorzugt für Optical Imaging verwendeten NIR-Farbstoffe absorbieren und emittieren Licht im NIR-Bereich zwischen 650 nm und 1000 nm. Die bevorzugten Farbstoffe gehören zur Klasse der Polymethinfarbstoffe und sind aus folgenden Gruppen ausgewählt: Carbocyanine wie beispielsweise Diethyloxacarbocyanin (DOC), Diethyloxadicarbocyanin (DODC), Diethyloxatricarbocyanin (DOTC), Indodi- oder Indotricarbocyanine, Tricarbocyanine, Merocyanine, Oxonolfarbstoffe (WO 96/17628), Rhodaminfarbstoffe, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffe,In another embodiment, the diagnostic agent is a fluorescent near-infrared (NIR) dye. These NIR dyes, preferably used for optical imaging, absorb and emit light in the NIR range between 650 nm and 1000 nm. The preferred dyes belong to the class of polymethine dyes and are selected from the following groups: carbocyanines such as diethyloxacarbocyanine (DOC), diethyloxadicarbocyanine (DODC ), Diethyloxatricarbocyanine (DOTC), indodi or indotricarbocyanines, tricarbocyanines, merocyanines, oxonol dyes (WO 96/17628), rhodamine dyes, phenoxazine or phenothiazine dyes,
Tetrapyrrolfarbstoffe, insbesondere Benzoporphyrine, Chorine und Phthalocyanine.Tetrapyrrole dyes, especially benzoporphyrins, chorine and phthalocyanines.
Die oben genannten Farbstoffe können entweder als Säuren oder als Salze eingesetzt werden. Geeignete anorganische Kationen bzw. Gegenionen für diese Farbstoffe sind beispielsweise das Lithiumion, das Kaliumion, das Wasserstoffion und insbesondere das Natriumion. Geeignete Kationen organischer Basen sind unter anderem solche von primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie zum Beispiel Ethanolamin, Diethanolamin, Morpholin, Glucamin, N,N-Dimethylglucamin und insbesondere N-Methylglucamin und Polyethylenimin. Geeignete Kationen von Aminosäuren sind beispielsweise die des Lysins, des Arginins und des Ornithins sowie die Amide ansonsten saurer oder neutraler Aminosäuren.The above-mentioned dyes can be used either as acids or as salts. Suitable inorganic cations or counterions for these dyes are, for example, the lithium ion, the potassium ion, the hydrogen ion and in particular the sodium ion. Suitable cations of organic bases include those of primary, secondary or tertiary amines, such as ethanolamine, diethanolamine, morpholine, glucamine, N, N-dimethylglucamine, and especially N-methylglucamine and polyethyleneimine. Suitable cations of amino acids are, for example, those of lysine, arginine and ornithine and the amides of otherwise acidic or neutral amino acids.
Ebenso können die Farbstoffe können als Basen oder als Salze von diesen eingesetzt werden. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der diagnostischen Substanz um einen Carbocyanin-Farbstoff. Die allgemeine Struktur der Carbocyanine wird wie folgt beschrieben: (Formel VI)Likewise, the dyes can be used as bases or as salts of these. In a most preferred embodiment, the diagnostic substance is a carbocyanine dye. The general structure of the carbocyanines is described as follows: (Formula VI)
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wobei Q ein Fragment
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where Q is a fragment
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wobei R30 für ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, eine Carboxygruppe, einen Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder ein Chloratom steht, R31 für ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht, X und Y unabhängig voneinander für ein Fragment -O-, -S-, -CH=CH- oder - C(CH2R32) (CH2R33)- stehen,
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wherein R 30 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, a carboxy group, an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms or a chlorine atom, R 31 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, X and Y independently represent a fragment -O -, -S-, -CH = CH- or - C (CH 2 R 32 ) (CH 2 R 33 ) - stand,
R20 bis R29, R32 und R33 unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, einen Carboxy-, einen Sulfonsäure-Rest oder einen Carboxyalkyl -, Alkoxycarbonyl- oder Alkoxyoxoalkyl- Rest mit bis zu 10 C- Atomen oder ein Sulfoalkylrest mit bis zu 4 C-Atomen, oder für ein nicht spezifisch bindendes Makromolekül, oder für einen Rest der allgemeinen Formel (VII)R 20 to R 29 , R 32 and R 33 independently of one another represent a hydrogen atom, a hydroxy group, a carboxy, a sulfonic acid radical or a carboxyalkyl, alkoxycarbonyl or alkoxyoxoalkyl radical having up to 10 C atoms or a sulfoalkyl radical up to 4 carbon atoms, or for a non-specifically binding macromolecule, or for a radical of the general formula (VII)
-(O)v-(CH2)o-CO-NR34-(CH2)s-(NH-CO)q-R35 (VII) steht, mit der Maßgabe, dass bei der Bedeutung von X und Y gleich O, S, -CH=CH- oder -C(CH3)2- mindestens einer der Reste R20 bis R29 einem nicht spezifisch bindenden Makromolekül oder der allgemeinen Formel VII entspricht, wobei o und s gleich 0 sind oder unabhängig voneinander für eine ganze Zahl von 1 bis 6 stehen, q und v unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, R34 ein Wasserstoffatom oder einen Methylrest darstellt,- (O) v - (CH 2 ) o -CO-NR 34 - (CH 2 ) s - (NH-CO) q -R 35 (VII), with the proviso that when X and Y are identical, O, S, -CH = CH- or -C (CH 3 ) 2 - at least one of R 20 to R 29 is a non-specifically binding macromolecule or the general formula VII wherein o and s are 0 or independently of one another are an integer from 1 to 6, q and v independently of one another are 0 or 1, R 34 represents a hydrogen atom or a methyl radical,
R35 ein Alkylrest mit 3 bis 6 C-Atomen, welcher 2 bis n-1 Hydroxygruppen aufweist, wobei n die Anzahl der C-Atome ist, oder ein mit 1 bis 3 Carboxygruppen substituierter Alkylrest mit 1 bis 6 C-Atomen,R 35 is an alkyl radical having 3 to 6 C atoms which has 2 to n-1 hydroxyl groups, where n is the number of C atoms, or an alkyl radical having 1 to 6 C atoms which is substituted by 1 to 3 carboxy groups,
Arylrest mit 6 bis 9 C-Atomen oder Arylalkylrest mit 7 bis 15 C-Atomen, oder ein Rest der allgemeinen Formel (Villa) oder (VIIIb)Aryl radical having 6 to 9 C atoms or arylalkyl radical having 7 to 15 C atoms, or a radical of the general formula (Villa) or (VIIIb)
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(Villa) (VIIIb)(Villa) (VIIIb)
ist, unter der Massgabe, dass q für 1 steht, oder ein nicht spezifisch bindendes Makromolekül bedeutet, R20 und R21, R21 und R22, R22 und R23, R24 und R25, R25 und R26, R26 und R27 zusammen mit den zwischen ihnen liegenden Kohlenstoffatomen einen 5- oder 6- gliedrigen aromatischen oder gesättigten annelierten Ring bilden, sowie deren physiologisch verträgliche Salze.is, with the proviso that q is 1, or a non-specifically binding macromolecule, R 20 and R 21 , R 21 and R 22 , R 22 and R 23 , R 24 and R 25 , R 25 and R 26 , R 26 and R 27 together with the carbon atoms between them form a 5- or 6-membered aromatic or saturated fused ring, and their physiologically acceptable salts.
Im Falle der Carbocyanine wird weiterhin Bezug auf die Anmeldungen DE 4445065 und DE 69911034 genommen, deren Inhalt hiermit auch Gegenstand dieser Anmeldung sein soll. Die Verwendung der dort erwähnten Carbocyanine für die Nanopartikel der vorliegenden Erfindung ist im Sinne der vorliegenden Erfindung ein besonderer Aspekt.In the case of carbocyanines, further reference is made to the applications DE 4445065 and DE 69911034, the content of which should also be the subject of this application. The use of the carbocyanines mentioned there for the nanoparticles of the present invention is a particular aspect in the context of the present invention.
Unerwarteterweise können anionische, gut wasserlösliche Substanzen wie bestimmte Carbocyanine in die hydrophobe Polymermatrix der beschriebenen Nanopartikel stabil eingeschlossen werden.Unexpectedly, anionic, readily water-soluble substances such as certain carbocyanines can be stably entrapped in the hydrophobic polymer matrix of the described nanoparticles.
Im Sinne der Erfindung wird eine anionische wasserlösliche Substanz mittels lonenkomplexbildung und Co-Präzipitation mit einem kationischem Polymer in einer schwer wasserlöslichen Polymermatrix durch Nanopräzipitation verkapselt, wobei Partikel definierter Größe entstehen.For the purposes of the invention, an anionic water-soluble substance is encapsulated by ion complexation and co-precipitation with a cationic polymer in a sparingly water-soluble polymer matrix by nanoprecipitation, resulting in particles of defined size.
Durch den Einbau eines NIR-aktiven Fluoreszenzfarbstoffes in die Polymermatrix der Partikel sind diese mittels Optical Imaging nicht-invasiv im Gewebe über Fluoreszenz detektierbar. Es besteht damit in vivo die Möglichkeit, die Verteilung bzw. Anreicherung fluoreszensmarkierter Nanopartikel zu detektieren.By incorporating an NIR-active fluorescent dye into the polymer matrix of the particles, they are non-invasively detectable by fluorescence in the tissue by means of optical imaging. There is thus the possibility in vivo of detecting the distribution or accumulation of fluorescently labeled nanoparticles.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Carbocyanin-Farbstoff um das gut wasserlösliche anionischeTetrasulfocyanin (TSC) (Formel IX).In a particularly preferred embodiment, the carbocyanine dye is the readily water-soluble anionic tetrasulfocyanine (TSC) (Formula IX).
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Formel (X): Tetrasulfocyanin / TSCFormula (X): Tetrasulfocyanine / TSC
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Carbocyanin-Farbstoff um IDCC (Indodicarbocyanin) (Formel IX) .
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In another preferred embodiment, the carbocyanine dye is IDCC (indodicarbocyanine) (Formula IX).
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Formel (X): lndodicarbocyanin / IDCCFormula (X): Indodicarbocyanine / IDCC
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Carbocyanin-Farbstoff um ICG (Indocyaningrün) (Formel Xl).In another preferred embodiment, the carbocyanine dye is ICG (indocyanine green) (Formula XI).
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Formel (Xl): Indocyaningrün (ICG)Formula (XI): Indocyanine Green (ICG)
In der erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei der verkapselten pharmazeutisch aktiven Substanz um ein Epothilon .In the embodiment of the invention, the encapsulated pharmaceutically active substance is an epothilone.
In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das Epothilon definiert durch die allgemeinen Formel (XII),
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In further embodiments of the present invention, the epothilone is defined by the general formula (XII)
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worinwherein
R1a, R 1b unabhängig voneinander Wasserstoff, CrCio-Alkyl, Aryl, Aralkyl, oder zusammen eine Gruppe -(CH2)m- wobei m 2 bis 5 bedeutet;R 1a , R 1b are each independently of one another hydrogen, C 1 -C 10 -alkyl, aryl, aralkyl, or together a group - (CH 2 ) m - wherein m is 2 to 5;
R2a R2b unabhängig voneinander Wasserstoff, C-i-C-io-Alkyl, C2-Cio-Alkenyl, C2-Ci o-Alkinyl, Aryl, Aralkyl, oder zusammen eine Gruppe -(CH2)n- wobei n 2 bis 5 bedeutet, R 2a R 2b independently of one another are hydrogen, C 1 -C 10 -alkyl, C 2 -C 10 -alkenyl, C 2 -C 10 -alkynyl, aryl, aralkyl, or together form a group - (CH 2 ) n - where n is 2 to 5 .
RJ Wasserstoff, C1-Ci0 Alkyl, Aryl, Aralkyl;R J is hydrogen, C 1 -C 0 alkyl, aryl, aralkyl;
R ,4^a, R 4b unabhängig voneinander Wasserstoff, CrCio-Alkyl, Aryl, Aralkyl, oder zusammen eine Gruppe -(CH2)P- wobei p 2 to 5 bedeutet;R, 4 ^ a, R 4b independently of one another are hydrogen, C 1 -C 10 -alkyl, aryl, aralkyl, or together form a group - (CH 2 ) P - where p is 2 to 5;
Rb Wasserstoff, d-Cio-Alkyl, Aryl, Aralkyl, CO2H, CO2Alkyl, CH2OH, CH2O-Ci-C5-Alkyl, CH2OAcyl, CN, CH2NH2, CH2N((CrC5-Alkyl), Acyl)i,2, or CH2HaI, CHaI3;R b is hydrogen, C 1 -C 10 -alkyl, aryl, aralkyl, CO 2 H, CO 2 alkyl, CH 2 OH, CH 2 O-C 1 -C 5 -alkyl, CH 2 OAcyl, CN, CH 2 NH 2 , CH 2 N ((C r C 5 alkyl), acyl) i, 2, or CH 2 Hal, Chai 3;
R6, R7 unabhängig voneinander Wasserstoff, oder zusammen eineR 6 , R 7 are independently hydrogen, or together one
weitere Bindung oder eine Epoxid Funktion;further bond or an epoxide function;
O oder CH2;O or CH 2 ;
D-E zusammen die Gruppe -H2C-CH2-, -HC=CH-, -C≡C-, -CH(OH)-CH(OH)-, -CH(OH)-CH2-, -CH2-CH(OH)-, -CH2-O-, ADE together form the group -H 2 C-CH 2 -, -HC = CH-, -C≡C-, -CH (OH) -CH (OH) -, -CH (OH) -CH 2 -, -CH 2 -CH (OH) -, -CH 2 -O-, A
-O-CH2- or CH CH wobei wenn G Sauerstoff bedeutet,-O-CH 2 - or CH CH where G is oxygen,
D-E nicht CH2-O sein kann; oderDE can not be CH 2 -O; or
D-E-G zusammen die Gruppe H2C-CH=CHDEG together the group H 2 C-CH = CH
W die Gruppe C(=X)R8, oder ein bi- or trizyklischer aromatischer oder heteroaromatischer Rest;W is the group C (= X) R 8 , or a bi- or tricyclic aromatic or heteroaromatic radical;
X O oder die Gruppe CR9R10;XO or the group CR 9 R 10 ;
R8 Wasserstoff, CrC10 Alkyl, Aryl, Aralkyl, Halogen, CN;R 8 is hydrogen, C 1 -C 10 alkyl, aryl, aralkyl, halogen, CN;
R9, R10 unabhängig voneinander Wasserstoff, Ci-C20-Alkyl, Aryl,R 9 , R 10 independently of one another are hydrogen, C 1 -C 20 -alkyl, aryl,
Aralkyl, oder zusammen mit dem Methylenkohlenstoffatom einen 5- bis 7-gliedrigen carbozyklischen Ring;Aralkyl, or together with the methylene carbon atom, a 5- to 7-membered carbocyclic ring;
Z O oder Wasserstoff und die Gruppe OR11;ZO or hydrogen and the group OR 11 ;
R11 Wasserstoff oder eine Schutzgruppe PGZ;R 11 is hydrogen or a protective group PG Z ;
A-Y eine Gruppe O-C(=O), O-CH2, CH2-C(=O), NR12-C(=O),AY is a group OC (= O), O-CH 2 , CH 2 -C (= O), NR 12 -C (= O),
NR12-SO2;NR 12 -SO 2 ;
R12 Wasserstoff, oder C1-C10 Alkyl;R 12 is hydrogen, or C 1 -C 10 alkyl;
PGZ CrC2O Alkyl, eine C4-C7 Cycloalkylgruppe, die ein oder mehrere Sauerstoffatome im Ring enthalten kann, Aryl, Aralkyl, CrC20 Acyl, Aroyl, CrC20 Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Tri(CrC20alkyl)silyl, Di(CrC20 alkyl) Arylsilyl, (CrC20 Alkyl)diarylsilyl, or Tri(aralkyl)silyl;PG Z CrC 2O alkyl, a C 4 -C 7 cycloalkyl group which may contain one or more oxygen atoms in the ring, aryl, aralkyl, C 1 -C 20 acyl, aroyl, C 1 -C 20 alkylsulfonyl, arylsulfonyl, tri (C 1 -C 20 alkyl) silyl, di ( C 1 -C 20 alkyl) arylsilyl, (C 1 -C 20 alkyl) diarylsilyl, or tri (aralkyl) silyl;
als einzelnes Stereoisomer oder als Mischung aus verschiedenen Stereoisomeren und/oder als pharmazeutisch akzeptables Salz verkapselt ist.is encapsulated as a single stereoisomer or as a mixture of different stereoisomers and / or as a pharmaceutically acceptable salt.
Für eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Epothilon definiert durch die Formel (XII), worin R1a, R1b unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC4-Alkyl, oder zusammen die Gruppe -{CH2)m- wobei m 2 to 5 bedeutet;For a further embodiment of the present invention, the epothilone is defined by the formula (XII) wherein R 1a , R 1b independently of one another are hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl, or together form the group - {CH 2 ) m - where m is 2 to 5;
R2a, R2b unabhängig voneinander Wasserstoff, d-Cs-Alkyl, oder zusammen die Gruppe -{CH2)m- wobei m 2 to 5 bedeutet, oder C2-C6-Alkenyl, oder C2-C6-Alkinyl;R 2a , R 2b independently of one another are hydrogen, C 1 -C 8 -alkyl, or together form the group - {CH 2 ) m - where m is 2 to 5, or C 2 -C 6 -alkenyl, or C 2 -C 6 -alkynyl ;
R3 Wasserstoff,R 3 is hydrogen,
R48, R4b unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC4-Alkyl,R 48 , R 4b independently of one another are hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl,
R5 Wasserstoff, Ci-C4-Alkyl. C(HaI)3 R 5 is hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl. C (HaI) 3
R6, R7 beide Wasserstoff, oder zusammen eine weitere Bindung, oder zusammen eine Epoxid Funktion,R 6 , R 7 are both hydrogen, or together another bond, or together an epoxide function,
G CH2;G CH 2 ;
D-E die Gruppe H2C-CH2, oderDE is the group H 2 C-CH 2 , or
D-E-G zusammen die Gruppe H2C-CH=CHDEG together the group H 2 C-CH = CH
W die Gruppe C(=X)R8, oder ein bi- or tricyclischer aromatischer oder heteroaromatischer Rest;W is the group C (= X) R 8 , or a bi- or tricyclic aromatic or heteroaromatic radical;
X die Gruppe CR9R10;X is the group CR 9 R 10 ;
R8 Wasserstoff, CrC4-Alkyl, Halogen,R 8 is hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl, halogen,
R9, R10 beide unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC4-Alkyl,R 9, R 10 are both independently hydrogen, C r C 4 alkyl,
Aryl, Aralkyl, Z SauerstoffAryl, aralkyl, Z oxygen
A-Y die Gruppe O-C(=O) oder die Gruppe NR12-C(=O)AY is the group OC (= O) or the group NR 12 -C (= O)
R12 Wasserstoff, oder Ci-C4-Alkyl; als einzelnes Stereoisomer oder als Mischung aus verschiedenen Stereoisomeren und/oder als pharmazeutisch akzeptable Salze, verkapselt. r weiteren Ausführungsform werden Epothilone der allgemeinen Formel (XII), worinR 12 is hydrogen, or C 1 -C 4 -alkyl; encapsulated as a single stereoisomer or as a mixture of different stereoisomers and / or as pharmaceutically acceptable salts. In another embodiment, epothilones of the general formula (XII) in which
R1a, R1b beide unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC2 Alkyl, oder zusammen eine Gruppe -(CH2)m- wobei m 2 to 5 bedeutet,R 1a , R 1b are both independently of one another hydrogen, C 1 -C 2 -alkyl, or together form a group - (CH 2 ) m - where m is 2 to 5,
R2a, R2b beide unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC5 Alkyl, oder zusammen die Gruppe a -(CH2)n- wobei n 2 to 5 bedeutet, oder C2-C6 Alkenyl, or C2-C6 Alkinyl; R3 Wasserstoff,R 2a , R 2b are each independently of one another hydrogen, C 1 -C 5 alkyl, or together the group a - (CH 2 ) n - wherein n is 2 to 5, or C 2 -C 6 alkenyl, or C 2 -C 6 alkynyl; R 3 is hydrogen,
R48, R4b beide unabhängig voneinander Wasserstoff, C-1-C2 Alkyl, R5 Wasserstoff oder Methyl oder Trifluormethyl,R 48 , R 4b are each, independently of one another, hydrogen, C 1 -C 2 -alkyl, R 5 is hydrogen or methyl or trifluoromethyl,
R6, R7 zusammen eine weitere Bindung, oder zusammen eine Epoxid Funktion;R 6 , R 7 together form another bond, or together an epoxide function;
G CH2;G CH 2 ;
D-E die Gruppe H2C-CH2,DE is the group H 2 C-CH 2 ,
D-E-G zusammen die Gruppe H2C-CH=CHDEG together the group H 2 C-CH = CH
W Die Gruppe C(=X)R8, oder Thiazolyl, Oxazolyl, Pyridyl, N- oxo-Pyridyl; Benzothiazolyl, Benzoxazolyl, Benzimidazolyl, die gegebenenfalls substituiert sein können durch CrC3- Alkyl, Ci-C3-Hydroxyalkyl, CrC3-Aminoalkyl, CrC3- AlkylsulfonylW The group C (= X) R 8 , or thiazolyl, oxazolyl, pyridyl, N-oxo-pyridyl; Benzothiazolyl, benzoxazolyl, benzimidazolyl, which may be optionally substituted by -C 3 - alkyl, Ci-C 3 hydroxyalkyl, C r C 3 aminoalkyl, C r C 3 - alkylsulfonyl
X die Gruppe CR9R10; R8 Wasserstoff, Methyl, Chlor, Fluor,X is the group CR 9 R 10 ; R 8 is hydrogen, methyl, chlorine, fluorine,
R9, R10 beide unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC4-Alkyl,R 9 , R 10 are both independently of one another hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl,
Thiazolyl, Oxazolyl, Pyridyl, N-oxo-Pyridyl, die gegebenenfalls substituiert sein können durch Ci-C3-Alkyl, CrC3-Hydroxyalkyl, Aralkyl, Z SauerstoffThiazolyl, oxazolyl, pyridyl, N-oxo-pyridyl, which may optionally be substituted by Ci-C 3 alkyl, C r C 3 -hydroxyalkyl, aralkyl, Z oxygen
A-Y die Gruppe O-C(=O), oder die Gruppe NR12-C(=O)AY is the group OC (= O), or the group NR 12 -C (= O)
R12 Wasserstoff oder CrC4-Aalkyl; als einzelnes Stereoisomer oder als Mischung von verschiedenen Stereoisomeren und/oder als pharamzeutisch akzeptables Salz, verkapselt.R 12 is hydrogen or C 1 -C 4 -alkyl; encapsulated as a single stereoisomer or as a mixture of different stereoisomers and / or as a pharmaceutically acceptable salt.
In einer weiteren Ausführungsform werden Epothilone der allgemeinen Formel (Xl), worin A-Y: O-C(=O); D-E: H2C-CH2; G: CH2; Z: O; R1a, R1b: CrC10-Alkyl oder zusammen eine -(CH2)P- Gruppe, wobei p 2 bis 3 ist; R2a, R2b unabhängig voneinander Wasserstoff, Ci-Cio-Alkyl, C2-C-ιo-Alkenyl, oder C2-Ci o-Alkynyl; R3 Wasserstoff; R4a, R4b unabhängig voneinander Wasserstoff oder Ci-C,o-Alkyl und R5 CrC-io-Alkyl bedeuten, verkapselt. In einer weiteren Ausführungsform werden Epothilone der allgemeinen Formel (Xl), worin R2a, R2b unabhängig voneinander Wasserstoff, C2-Cio-Alkenyl oder C2-Cio-Alkynyl; R6, R7 zusammen eine Epoxid Funktion und W eine 2- Methylbenzothiazol-5-yl Gruppe oder eine 2-Methylbenzoxazol-5-yl Gruppe oder eine Quinoline-7-yl Gruppe bedeutet.In another embodiment, epothilones of general formula (XI) wherein AY: OC (= O); DE: H 2 C-CH 2 ; G: CH 2 ; Z: O; R 1a , R 1 b : C r C 10 -alkyl or together a - (CH 2 ) P - group, wherein p is 2 to 3; R 2a , R 2b independently of one another are hydrogen, C 1 -C 10 -alkyl, C 2 -C -alkenyl, or C 2 -C 10 -alkynyl; R 3 is hydrogen; R 4a , R 4b are independently hydrogen or Ci-C, o-alkyl and R 5 is CrC-io-alkyl encapsulated. In a further embodiment, epothilones of the general formula (XI) in which R 2a , R 2b are each independently hydrogen, C 2 -C 10 alkenyl or C 2 -C 10 alkynyl; R 6 , R 7 together represents an epoxide function and W represents a 2-methylbenzothiazol-5-yl group or a 2-methylbenzoxazol-5-yl group or a quinoline-7-yl group.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Epothilone der allgemeinen Formel (XII) verkapselt, die in der folgenden Liste aufgeführt sind : (4S,7R,8S,9S,13E/Z,16S)-4,8-Dihydroxy-16-(2-methyl-benzoxazol-5-yl)-1-oxa- 5,5,9,1 S-tetramethyl^-φrop^-en-i-ylJ-cyclohexadec-IS-en^.ö-dion;In a preferred embodiment epothilones of general formula (XII) are encapsulated, which are listed in the following list: (4S, 7R, 8S, 9S, 13E / Z, 16S) -4,8-dihydroxy-16- (2-methyl -benzoxazol-5-yl) -1-oxo-5,5,9,1-tetramethyl-phi-en-i-ylJ-cyclohexadec-IS-ene-1-dione;
(1S/R>3S,7S,10R,11 R,12SI16R/S)-7>11-Dihydroxy-10-(prop-2-en-1-yl)-3-(2- methyl-benzoxazol-5-yl)-8,8,12,16-tetramethyl-4,17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion;(1S / R> 3S, 7S, 10R, 11R, 12S I 16R / S) -7> 11-dihydroxy-10- (prop-2-en-1-yl) -3- (2-methyl-benzoxazole 5-yl) -8,8,12,16-tetramethyl-4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione;
(4S,7R,8S,9S,13E/Z,16S)-4,8-Dihydroxy-16-(2-methyl-benzothiazol-5-yl)-1-oxa- 5,5,9,13-tetramethyl-7-(prop-2-en-1-yl)-cyclohexadec-13-en-2,6-dion;(4S, 7R, 8S, 9S, 13E / Z, 16S) -4,8-dihydroxy-16- (2-methylbenzothiazol-5-yl) -1-oxa-5,5,9,13-tetramethyl- 7- (prop-2-en-1-yl) -cyclohexadec-13-ene-2,6-dione;
(1S/R,3S,7S,10R,11S,12S,16R/S)-7,11-Dihydroxy-10-(prop-2-en-1-yl)-3-(2- methyl-benzothiazol-5-yl)-8,8, 12, 16-tetramethyl-4, 17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion; (1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)- 7,11 -Dihydroxy-10-(prop-2-en-1 -yl)-3-(2-methyl-benzothiazol-5-yl)- δ.δ.^.iθ-tetramethyM.^-dioxabicycloI^.I .Olheptadecan-δ.θ-dion;(1S / R, 3S, 7S, 10R, 11S, 12S, 16R / S) -7,11-dihydroxy-10- (prop-2-en-1-yl) -3- (2-methylbenzothiazole-5 -yl) -8,8,12,16-tetramethyl-4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione; (1S, 3S, 7S, 10R, 11S, 12S, 16R) - 7,11 -dihydroxy-10- (prop-2-en-1-yl) -3- (2-methyl-benzothiazol-5-yl) - δ.δ. ^. iθ-tetramethylm. ^ - dioxabicycloI ^ .I.Olheptadecan-δ.θ-dione;
(1S/R,3S,7S,10R,11 R,12S,16R/S)-7,11-Dihydroxy-10-(prop-2-en-1-yl)-3-(1S / R, 3S, 7S, 10R, 11R, 12S, 16R / S) -7,11-dihydroxy-10- (prop-2-en-1-yl) -3-
(2-methyl-benzothiazol-5-yl)-8,8,12,16-tetramethyl-4,17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecane-5,9-dion;(2-methylbenzothiazol-5-yl) -8,8,12,16-tetramethyl-4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione;
(4S,7R,8S,9S,13E/Z,16S)-4,8-Dihydroxy-16-(2-methyl-benzothiazol-5-yl)-1-oxa- 9,13-dimethyl-5,5-(1 ,3-trimethylen)-7-(prop-2-en-1-yl)-cyclohexadec-13- en-2,6-dion;(4S, 7R, 8S, 9S, 13E / Z, 16S) -4,8-dihydroxy-16- (2-methylbenzothiazol-5-yl) -1-oxa-9,13-dimethyl-5,5- (1, 3-trimethylene) -7- (prop-2-en-1-yl) -cyclohexadec-13-ene-2,6-dione;
(1S/R,3S,7S,10R,11 R,12S,16R/S)-7,11-Dihydroxy-10-(prop-2-en-1-yl)-3-(2- methyl-benzothiazol-5-yl)-12,16-dimethyl-8,8-(1 ,3-trimethylen)-4,17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion; (4S,7R,8S,9S,13E/Z,16S)-4,8-Dihydroxy-16-(2-methyl-benzothiazol-5-yl)-1-oxa- 5,5,9, IS-tetramethyl^^prop^-in-i-yO-cyclohexadec-IS-en^.θ-dion; (IS/R.SSJS.IOR.H R.^S.ieR/SJ-y.H-Dihydroxy-IO^prop^-in-i-yO-a^- methyl-benzothiazol-5-yl)-8,8,12,16-tetramethyl-4,17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion;(1S / R, 3S, 7S, 10R, 11R, 12S, 16R / S) -7,11-dihydroxy-10- (prop-2-en-1-yl) -3- (2-methylbenzothiazole) 5-yl) -12,16-dimethyl-8,8- (1,3-trimethylene) -4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione; (4S, 7R, 8S, 9S, 13E / Z, 16S) -4,8-Dihydroxy-16- (2-methyl-benzothiazol-5-yl) -1-oxo-5,5,9, is-tetramethyl ^ prop ^ -in-i-yO-cyclohexadec-IS-en ^ .θ-dione; (IS / R.SSJS.IOR.H.R. ^ S.ieR / SJ-yH-dihydroxy-IO ^ prop-1-i-y-a-methyl-benzothiazol-5-yl) -8.8, 12,16-tetramethyl-4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione;
(4S,7R,8S,9S,13E/Z.16S)-4,8-Dihydroxy-16-(quinolin-7-yl)-1 -oxa-5,5,9,13- tetramethyl-7-(prop-2-en-1 -yl)-cyclohexadec-13-en-2,6-dion;(4S, 7R, 8S, 9S, 13E / Z.16S) -4,8-dihydroxy-16- (quinolin-7-yl) -1-oxa-5,5,9,13-tetramethyl-7- (prop -2-en-1-yl) -cyclohexadec-13-ene-2,6-dione;
(IS/R.SS.yS.IOR.H R.^S.ieR/SH.H-Dihydroxy-IO^prop^-en-i-yO-S- (quinolin-7-yl)-8,8, 12, 16-tetramethyl-4, 17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion;(IS / R.SS.yS.IOR.H R. ^ S.ieR / SH.H-dihydroxy-IO ^ prop-1-y-yO-S- (quinolin-7-yl) -8.8, 12,16-tetramethyl-4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione;
(4S,7R,8SI9S,13E/Z,16S)-4,8-Dihydroxy-16-(1 )2-dimethyl-1 H-benzoimidazol-5- yl)-1 -oxa-5,5,9, 13-tetramethyl-7-(prop-2-en-1 -yl)-cyclohexadec-13-ene-(4S, 7R, 8S I 9S, 13E / Z, 16S) -4,8-Dihydroxy-16- (1 ) 2-dimethyl-1H-benzoimidazol-5-yl) -1-oxa-5,5,9 , 13-tetramethyl-7- (prop-2-en-1-yl) -cyclohexadec-13-ene
2,6-dion;2,6-dione;
(18/R1SS1ZS1IOR111 R,12S,16R/S)-7l11-ihydroxy-10-(piOp-2-en-1-yl)-3-(1 ,2- dimethyl-I H-benzoimidazol-δ-yO-δ.δ.^.iθ-tetramethyl^.i Z- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion; (4S,7R,8S,9S, 13E/Z, 16S)-4,8-dihydroxy-16-(2-methyl-benzothiazol-5-yl)-1 -aza- 5,5,9, IS-tetramethyl^prop^-en-i-ylJ-cyclohexadec-IS-ene^.β-dione;(18 / R 1 SS 1 ZS 1 IOR 1 11 R, 12S, 16R / S) -7 l 11-ihydroxy-10- (piOp-2-en-1-yl) -3- (1, 2-dimethyl) I H-benzoimidazole-δ-y-O-δ-δ, ω-tetramethyl-ω-z-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione; (4S, 7R, 8S, 9S, 13 E / Z, 16S) -4,8-dihydroxy-16- (2-methyl-benzothiazol-5-yl) -1-aza-5,5,9-is-tetramethyl-prop-1-ylJ-cyclohexadec-IS- ene ^ .β-diones;
(18/R1SS1ZS1IOR111S,12S,16R/S)-7f11-DihyclrOxy-10-(prop-2-en-1-yl)-3-(2- methyl-benzothiazol-5-yl)-8,8,12,16-tetramethyl-4-aza-1 Z- oxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion, (1S/R,3S,7S,10R,11 R,12S,16R/S)-7,11-Dihydroxy-10-(prop-2-en-1-yl)-3-(2- methyl-benzothiazol-5-yl)-8,8, 12,16-tetramethyl-4-aza-1 Z- oxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion,(18 / R 1 SS 1 ZS 1 IOR 1 11S, 12S, 16R / S) -7-f 11 DihyclrOxy-10- (prop-2-en-1-yl) -3- (2- methyl-benzothiazol-5 -yl) -8,8,12,16-tetramethyl-4-aza-1 Z-oxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione, (1S / R, 3S, 7S, 10R, 11R, 12S , 16R / S) -7,11-dihydroxy-10- (prop-2-en-1-yl) -3- (2-methylbenzothiazol-5-yl) -8,8,12,16-tetramethyl- 4-aza-1 Z-oxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione,
(1S,3S(E))7S,10R,11S,12S>16R)-7,11-Dihydroxy-8,8,10,12,16-pentamethyl-3-(1S, 3S (E) ) 7S, 10R, 11S, 12S > 16R) -7,11-dihydroxy-8,8,10,12,16-pentamethyl-3-
[1 -(2-methyl-1 ,3-thiazol-4-yl)prop-1 -en-2-yl]-4, 1 Z- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion ,[1- (2-methyl-1,3-thiazol-4-yl) -prop-1 -en-2-yl] -4,1-Z-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione,
(1S,3S(E),7S)10R,11S)12S,16R)-7)11-Dihydroxy-8,8,10,12,16-pentamethyl-3- [1 -(2-methyl-1 ,3-thiazol-4-yl)prop-1 -en-2-yl]-17-oxa-4- azabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dione ,(1S, 3S (E), 7S ) 10R, 11S ) 12S, 16R) -7 ) 11-Dihydroxy-8,8,10,12,16-pentamethyl-3- [1- (2-methyl-1,3-dicarboxylate) -thiazol-4-yl) prop-1 -en-2-yl] -17-oxa-4-azabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione,
(4S,7R,8S,9S,13Z,16S(E))-4,8-Dihydroxy-5,5,7)9I13-pentamethyl-16-[1-(2- methyl-1 ,3-thiazol-4-yl)prop-1 -en^-ylj-oxacyclohexadec-i 3-en-2,6-dion , (4S,7R,8S,9S,10E,13Z,16S(E))-4,8-Dihydroxy-5,5,7,9,13-pentamethyl-16-[1-(2- methyl-1 ,3-thiazol-4-yl)prop-1 -en-2-yl]-oxacyclohexadec-10,13-dien-2,6- dion ,(4S, 7R, 8S, 9S, 13Z, 16S (E)) - 4,8-dihydroxy-5,5,7) 9 I 13-pentamethyl-16- [1- (2-methyl-1, 3-thiazol 4-yl) prop-1-ene -ylj-oxacyclohexadec-i 3-ene-2,6-dione, (4S, 7R, 8S, 9S, 10E, 13Z, 16S (E)) - 4,8-Dihydroxy-5,5,7,9,13-pentamethyl-16- [1- (2-methyl-1,3 -thiazol-4-yl) prop-1 -en-2-yl] -oxacyclohexadec-10,13-diene-2,6-dione,
(4S,7R,8S,9S,10E,13Z,16S(E))-4,8-Dihydroxy-5,5,7,9-tetramethyl-13- trifluormethyl-16-[1 -(2-methyl-1 ,3-thiazol-4-yl)prop-1 -en-2-yl]- oxacyclohexadec-10,13-diene-2,6-dion ,(4S, 7R, 8S, 9S, 10E, 13Z, 16S (E)) - 4,8-Dihydroxy-5,5,7,9-tetramethyl-13-trifluoromethyl-16- [1 - (2-methyl-1 , 3-thiazol-4-yl) prop-1 -en-2-yl] oxacyclohexadec-10,13-dienes-2,6-dione,
(IS.SSCEJJS.IOR.HS.^S.IΘRH.H-Dihydroxy-δ.δ.iO.^.ie-pentamethyl-S- [1-(2-methylsulfanyl-1 ,3-thiazol-4-yl)prop-1-en-2-yl]-4,17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion als einzelnes Stereoisomer oder als Mischung verschiedener Stereoisomeren und/oder pharmazeutisch akzeptables Salz(IS.SSCEJJS.IOR.HS. ^ S.IΘRH.H-dihydroxy-δ.δ.iO. ^, ie-pentamethyl-S- [1- (2-methylsulfanyl-1,3-thiazol-4-yl) prop-1-en-2-yl] -4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione as a single stereoisomer or as a mixture of different stereoisomers and / or pharmaceutically acceptable salt
Besonders bevorzugt sind die EpothiloneParticularly preferred are the epothilones
(4S,7R,δS,9S,13E/Z,16S)-4,δ-dihydroxy-16-(2-methyl-benzothiazol-5-yl)-1-oxa- 5,5,9,13-tetramethyl-7-(prop-2-en-1-yl)-cyclohexadec-13-ene-2,6-dion;und (1S/R,3S,7S,10R,11S,12S,16R/S)-7,11-dihydroxy-10-(prop-2-en-1-yl)-3-(2- methyl-benzothiazol-5-yl)-δ,δ,12,16-tetramethyl-4,17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecane-5,9-dion als einzelnes Stereoisomer oder als Mischung verschiedener Stereoisomeren und/oder als pharmazeutisch akzeptables Salz. . Ganz besonders bevorzugt ist (1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)-7,11-dihydroxy-10- (prop-2-en-1-yl)-3-(2-methyl-benzothiazol-5-yl)-8,8,12,16-tetramethyl-4,17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecane-5,9-dion. als einzelnes Stereoisomer oder als Mischung verschiedener Stereoisomeren und/oder als pharmazeutisch akzeptables Salz. .(4S, 7R, δS, 9S, 13E / Z, 16S) -4, δ-dihydroxy-16- (2-methyl-benzothiazol-5-yl) -1-oxo-5,5,9,13-tetramethyl- 7- (prop-2-en-1-yl) -cyclohexadec-13-ene-2,6-dione; and (1S / R, 3S, 7S, 10R, 11S, 12S, 16R / S) -7,11 -dihydroxy-10- (prop-2-en-1-yl) -3- (2-methylbenzothiazol-5-yl) -δ, δ, 12,16-tetramethyl-4,17-dioxabicyclo [14.1.0 ] heptadecane-5,9-dione as a single stereoisomer or as a mixture of different stereoisomers and / or as a pharmaceutically acceptable salt. , Very particular preference is given to (1S, 3S, 7S, 10R, 11S, 12S, 16R) -7,11-dihydroxy-10- (prop-2-en-1-yl) -3- (2-methylbenzothiazole-5 -yl) -8,8,12,16-tetramethyl-4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione. as a single stereoisomer or as a mixture of different stereoisomers and / or as a pharmaceutically acceptable salt. ,
Aufgrund der Eigenschaften der Epothilone, die sich eignen als Therapeutikum bei Tumorerkrankungen oder Erkrankungen, die mit Entzündungsreaktionen einhergehen, ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel enthaltend ein Epothilon zur Behandlung von Tumorerkrankungen Erkrankungen, die mit Entzündungsreaktionen einhergehen ein Aspekt der Erfindung. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Methode zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder Erkrankungen, die mit Entzündungsreaktionen einhergehen, bei der eine effektive Menge des Wirkstoffes, enthalten in einem erfindungsgemäßen nanopartikulären System, an Mensch oder Tier verabreicht wird.Due to the properties of the epothilones, which are useful as a therapeutic agent for tumors or diseases associated with inflammatory reactions, the use of the nanoparticles of the invention containing an epothilone for the treatment of tumors diseases associated with inflammatory reactions is an aspect of the invention. Another aspect of the invention is a method of treating tumors or diseases associated with inflammatory reactions in which an effective amount of the active ingredient contained in a nanoparticulate system according to the invention is administered to humans or animals.
In einer weiteren Ausfϋhrungsform werden das Diagnostikum und das Epothilon gemeinsam in den Partikel eingeschlossen. Dementsprechend ist die Verwendung dieser Nanopartikel zur Therapie von Tumorerkrankungen oder Erkrankungen, die mit Entzündungsreaktionen einhergehen sowie zur gleichzeitigen Diagnose und/oder Überwachung des Therapieverlaufs ein Aspekt der Erfindung. Insbesondere ist Therapie und Überwachung ein Aspekt der vorliegenden Erfindung.In another embodiment, the diagnostic agent and the epothilone are incorporated together in the particle. Accordingly, the use of these nanoparticles for the treatment of tumor diseases or diseases associated with inflammatory reactions as well as for the simultaneous diagnosis and / or monitoring of the course of therapy is an aspect of the invention. In particular, therapy and monitoring is an aspect of the present invention.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist daher eine Methode zur Behandlung, Diagnose und/oder Monitoring von Tumorerkrankungen oder Erkrankungen, die mit Entzündungsreaktionen einhergehen, bei der eine effektive Menge des Wirkstoffes enthalten in einem erfindungsgemäßen nanopartikulären System an Mensch oder Tier verabreicht wird. Insbesondere ist eine Methode zur Behandlung und Überwachung der Therapie ein Aspekt der Erfindung.A further aspect of the invention is therefore a method for the treatment, diagnosis and / or monitoring of tumor diseases or diseases associated with inflammatory reactions in which an effective amount of the active substance contained in a nanoparticulate system according to the invention is administered to humans or animals. In particular, a method of treatment and monitoring of therapy is one aspect of the invention.
In einer weiteren Ausführungsform liegen das Diagnostikum und das Epothilon in getrennten gleichen nanopartikulären Systemen vor, die insbesondere denselben Aufbau haben.In a further embodiment, the diagnostic agent and the epothilone are present in separate identical nanoparticulate systems, which in particular have the same structure.
Die Erfindung betrifft somit auch ein Kit bestehend aus den erfindungsgemäßen Partikeln, die ein Diagnostikum und ein Epothilon gemeinsam enthalten sowie ein Kit, das (a) die erfindungsgemäßen Partikel enthaltend ein Diagnostikum und (b) die erfindungsgemäßen Partikel enthaltend ein Epothilon getrennt enthält, sowie die Verwendung des Kits zur Therapie und Diagnose/Monitoring.The invention thus also relates to a kit consisting of the particles according to the invention which together contain a diagnostic agent and an epothilone and a kit which contains (a) the particles according to the invention comprising a diagnostic agent and (b) the particles according to the invention comprising an epothilone separately, and Use of the kit for therapy and diagnosis / monitoring.
In einer bevorzugten Ausführung handelt es sich bei den Polymernanopartikeln gemäß der Patentansprüche um Fällungsaggregate, welche durch Nanopräzipitation hergestellt werden. Hierfür stehen insbesondere folgende Herstellungsmethoden zur Verfügung: • Direkte Fällung (Präzipitation) in einem Reagenzglas durch Einbringen des gelösten Polymer-Substanz-Gemisches in eine tensidhaltige wässrige Lösung, welche mittels Magnetrührer durchmischt wird.In a preferred embodiment, the polymer nanoparticles according to the claims are precipitation aggregates which are produced by nanoprecipitation. In particular, the following production methods are available for this purpose: Direct precipitation (precipitation) in a test tube by introducing the dissolved polymer-substance mixture into a surfactant-containing aqueous solution which is mixed by means of a magnetic stirrer.
• Fällung des Polymer-Substanz-Gemisches in der tensidhaltigen wässrigen Lösung durch Zusammenführung der beiden Lösungen mittels eines Micro-Mischer-Systems.• Precipitation of the polymer-substance mixture in the surfactant-containing aqueous solution by combining the two solutions by means of a micro-mixer system.
• Verwendung von Ultraschall zur gleichmäßigen Verteilung des Polymer- Substanz-Gemisches in der tensidhaltigen wässrigen Lösung.Use of ultrasound for uniform distribution of the polymer-substance mixture in the surfactant-containing aqueous solution.
Bei der Herstellung von Nanopartikeln mittels Nanopräzipitation wird das organische Lösungsmittel schlagartig dem Matrixpolymer und den mit ihm gelösten Substanzen entzogen, wenn die polymerhaltige organische Lösung in ein deutlich größeres Volumen einer wässrigen Lösung gegeben wird. Überraschenderweise werden in der Polymerphase gelöste Verbindungen mit Aminogruppen (wasserlösliche als auch wasserunlösliche) in dem schwer löslichen Polymer während der Fällung co-verkapselt. Bedingung dafür ist die unbegrenzte Mischbarkeit des organischen Lösungsmittels (besonders geeignet sind z. B. Aceton, Ethanol) mit Wasser sowie die Unlöslichkeit des Matrixpolymers in der wässrigen Phase.In the production of nanoparticles by nanoprecipitation, the organic solvent is abruptly withdrawn from the matrix polymer and the substances dissolved with it, when the polymer-containing organic solution is added to a significantly larger volume of an aqueous solution. Surprisingly, compounds dissolved in the polymer phase with amino groups (water-soluble as well as water-insoluble) are co-encapsulated in the sparingly soluble polymer during the precipitation. The condition for this is the unlimited miscibility of the organic solvent (particularly suitable, for example, acetone, ethanol) with water and the insolubility of the matrix polymer in the aqueous phase.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Partikel ist das diagnostische Agens negativ geladen und als lonenpaar mit dem kationischen Polymer in den Partikel eingeschlossen.In one embodiment of the particles of the invention, the diagnostic agent is negatively charged and trapped in the particle as an ion pair with the cationic polymer.
In einer bevorzugten Ausführung für alle vorhergehenden Polymernanopartikel ist die Oberfläche der Polymernanopartikel elektrostatisch modifiziert.In a preferred embodiment for all preceding polymer nanoparticles, the surface of the polymer nanoparticles is electrostatically modified.
Die elektrostatische Modifikation der kationischen Nanopartikeloberfläche ist ein herausragender Vorteil der vorliegenden Erfindung. Auf der Basis ionischer Wechselwirkungen kann ohne eine chemische Kopplungsreaktion die Partikeloberfläche mit einer geeigneten Substanz modifiziert werden. Voraussetzung dafür ist, dass das modifizierende Agens partiell über Ladungen verfügt, welche entgegengesetzt der Partikeloberflächenladung sind. Damit erlaubt diese Methode (elektrostatische Oberflächenmodifikation mittels Ladungstitration) eine einfache, flexible und vielseitige Modifikation der Partikeloberfläche.The electrostatic modification of the cationic nanoparticle surface is an outstanding advantage of the present invention. On the basis of ionic interactions, the particle surface can be modified with a suitable substance without a chemical coupling reaction. The prerequisite for this is that the modifying agent has partial charges which are opposite to the particle surface charge. In order to This method (electrostatic surface modification by charge titration) allows a simple, flexible and versatile modification of the particle surface.
Zusätzlich ist es möglich, instabile Wirkstoffe auf der Partikeloberfläche zu adsorbieren, welche dadurch vor dem Abbau durch Enzyme geschützt sind und dementsprechend einen höheren therapeutischen Effekt erzielen können.In addition, it is possible to adsorb unstable drugs on the particle surface, which are thereby protected from degradation by enzymes and accordingly can achieve a higher therapeutic effect.
Die Anreicherung (aktives und passives Targeting) von Nanopartikeln aus dem Blutstrom in das Zielgewebe setzt voraus, dass die Partikel ausreichend lange im Blutstrom zirkulieren. Erfindungsgemäß kann mittels der zuvor beschrieben Oberflächenmodifikation die Zirkulationszeit im Körper individuell angepasst werden, insbesondere durch Verwendung von Polyethylenoxiden oder Polyethylenglycolen (siehe Beispiel 5).The enrichment (active and passive targeting) of nanoparticles from the bloodstream into the target tissue requires that the particles circulate in the blood stream for a sufficient period of time. According to the invention, by means of the above-described surface modification, the circulation time in the body can be adjusted individually, in particular by using polyethylene oxides or polyethylene glycols (see Example 5).
Ein weiterer herausragender Vorteil besteht darin, dass die hier beschriebene elektrostatische Oberflächenmodifikation direkt vor der Anwendung schnell und unproblematisch durchgeführt werden kann. Dies geschieht durch ein einfaches Mischen geeigneter Mengen der Nanopartikeldispersion mit dem modifizierenden Agens. Damit besteht zusätzlich die Möglichkeit, den Kernpartikel separat vom oberflächenmodifizierenden Agens herzustellen und zu lagern. Dies ist zum einen besonders vorteilhaft für die kolloidale Langzeitstabilität. Zum anderen können extrem labile oberflächenmodifizierende Substanzen wie Peptide oder Antikörper unter geeigneten Bedingungen bis zur Verwendung aufbewahrt werden.Another outstanding advantage is that the electrostatic surface modification described here can be carried out quickly and without problems directly before use. This is done by simply mixing appropriate amounts of the nanoparticle dispersion with the modifying agent. Thus, it is additionally possible to prepare and store the core particles separately from the surface-modifying agent. This is for a particularly advantageous for the colloidal long-term stability. On the other hand, extremely labile surface-modifying substances such as peptides or antibodies can be stored under suitable conditions until use.
Die Trennung von Kernpartikel und modifizierendem Agens ermöglicht weiterhin eine Oberflächenmodifikation entsprechend den individuellen Anforderungen beim Patienten. Die Oberflächenmodifikation nach einem Baukastenprinzip bietet dabei maximale Flexibilität für Diagnose, Therapie und Monitoring, wobei die unkomplizierte Durchführung der Modifikation direkt durch den Anwender erfolgt. Ein bevorzugter Aufbau des oberflächenmodifizierenden Agens für kationisch funktionalisierte Polymernanopartikel, insbesondere die beschriebenen PBCA- Nanopartikel, ist in Formel 5 dargestellt. Der partiell anionisch geladene Molekülteil erfüllt die Funktion eines Ankers auf der positiv geladenen Partikeloberfläche durch elektrostatische Wechselwirkungen. Der neutrale, zum umgebenden wässrigen Medium ausgerichtete Molekülteil besteht aus Polyethylenglycol und/oder Polyethylenoxid-Einheiten (PEG-Einheiten) unterschiedlicher Länge. Bevorzugt sind hier PEG-Ketten mit einem Molekulargewicht von 100 bis 30000 Dalton und besonders bevorzugt mit 3000 bis 5000 Dalton. Dieser Molekülteil kann alternativ auch aus anderen geeigneten Strukturen, wie z. B. Hydroxyethylstärke (HES) und allen daraus möglichen polymeren Verbindungen, bestehen. Bei dem Rest R handelt es sich bevorzugt um Wasserstoff oder eine Methyl-Einheit.The separation of core particles and modifying agent further allows a surface modification according to the individual requirements of the patient. The surface modification on a modular principle offers maximum flexibility for diagnosis, therapy and monitoring, whereby the uncomplicated implementation of the modification is carried out directly by the user. A preferred construction of the surface-modifying agent for cationically functionalized polymer nanoparticles, in particular the described PBCA nanoparticles, is shown in formula 5. The partially anionically charged moiety fulfills the function of an anchor on the positively charged particle surface through electrostatic interactions. The neutral, aligned to the surrounding aqueous medium moiety consists of polyethylene glycol and / or polyethylene oxide units (PEG units) of different lengths. Preference is given here to PEG chains having a molecular weight of from 100 to 30,000 daltons and more preferably from 3,000 to 5,000 daltons. This moiety may alternatively be made of other suitable structures, such as. As hydroxyethyl starch (HES) and all possible polymeric compounds exist. The radical R is preferably hydrogen or a methyl unit.
Formel XIII: Allgemeine Strukturformel eines oberflächenmodifizierenden Agens (R = Wasserstoff, CrCß-Alkyl oder eine ungeladene, neutrale Aminosäure, bevorzugt H, CH3, wobei auch Mischungen der Reste R in einem Polymer mit umfasst sind), n=5-700, bevorzugt n=5-200Formula XIII: General structural formula of a surface modifying agent (R = hydrogen, alkyl or CrC ß an uncharged, neutral amino acid, preferably H, CH 3, wherein mixtures of R are included in a polymer), n = 5-700, preferably n = 5-200
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Der anionische Anker kann beispielsweise ein Polymer aus 5 bis 50 Einheiten Glutaminsäure (GIu) oder Asparaginsäure (Asp) oder den Salzen der Säuren sein. Es kann sich auch um ein Mischpolymer aus den gennanten Untereinheiten handeln. Weiterhin können auch ungeladene Untereinheiten wie z. B. neutrale Aminosäuren in den anionischen Block regelmäßig oder unregelmäßig eingebaut sein. Allgemein eignen sich als negativ geladener Molekülteil (Anker) Verbindungen oder polymere Strukturen mit Gruppen wie Acetat-, Carbonat-, Citrat, Succinat-, Nitrat-, Carboxylat-, Phosphat-, Sulfonat- oder Sulfat-Gruppen, sowie Salze und freie Säuren dieser Gruppen.The anionic anchor may be, for example, a polymer of 5 to 50 units of glutamic acid (Glu) or aspartic acid (Asp) or the salts of the acids. It may also be a mixed polymer of the named subunits. Furthermore, uncharged subunits such. B. neutral amino acids in the anionic block regularly or irregularly incorporated. Generally suitable as a negatively charged moiety (anchor) compounds or polymeric structures with groups such as acetate, carbonate, citrate, succinate, nitrate, carboxylate, phosphate, sulfonate or sulfate groups, as well as salts and free acids of these Groups.
In einer Ausführungsform kann der anionische Anker vorzugsweise eine Polyaminosäure sein. In einer Ausführungsform besteht der "anionische Anker aus einem Polymer aus bis zu 20 Einheiten Glutaminsäure (GIu) oder Asparaginsäure (Asp) oder deren Salzen, oder deren Mischpolymere, die gegebenenfalls auch neutrale Aminosäuren enthalten können.In one embodiment, the anionic anchor may preferably be a polyamino acid. In one embodiment, the anionic anchor consists of a polymer of up to 20 units of glutamic acid (Glu) or aspartic acid (Asp) or its salts, or their copolymers, which may optionally also contain neutral amino acids.
In einer Ausführungsform ist die Oberfläche mit GIu(10)-b-PEG(110), GIu(10)-b- PEG(114) oder Asp(15)-b-PEG(114) modifiziert.In one embodiment, the surface is modified with Glu (10) -b-PEG (110), Glu (10) -b-PEG (114) or Asp (15) -b-PEG (114).
In einer Ausführungsform ist die Oberfläche mit GIu(10)-b-PEG(110) oder Asp(15)-b-PEG(114) modifiziert.In one embodiment, the surface is modified with Glu (10) -b-PEG (110) or Asp (15) -b-PEG (114).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche des Polymernanopartikels mit GIu(10)-b-PEG(110) modifiziert (Formel XIV). Als negativer Molekülteil (Anker) dienen die Carboxylat-Gruppen der Glutaminsäure-Untereinheiten des Blockcopolymers.In a particularly preferred embodiment, the surface of the polymer nanoparticle is modified with Glu (10) -b-PEG (110) (Formula XIV). The negative moiety (anchor) is the carboxylate groups of the glutamic acid subunits of the block copolymer.
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Formel XIV: Strukturformel von GIu(10)-b-PEG(110);Formula XIV: Structural Formula of GIu (10) -b-PEG (110);
In einer weiteren Ausführungsform ist eine Ziel erkennende Struktur vorhanden.In another embodiment, a target recognizing structure is present.
Diese Ziel erkennende Struktur besitzt mindestens einen negativ geladenen Molekülteil, welcher durch elektrostatische Wechselwirkungen auf die kationische Partikeloberfläche aufgebracht wird. Ein weiterer besonders bevorzugter Aufbau des oberflächenmodifizierenden Agens für kationisch funktionalisierte Polymemanopartikel, insbesondere die beschriebenen PBCA-Nanopartikel, ist in Formel XV dargestellt.This target recognizing structure has at least one negatively charged moiety which is applied to the cationic particle surface by electrostatic interactions. Another particularly preferred structure of the surface-modifying agent for cationically functionalized polymethylene particles, in particular the described PBCA nanoparticles, is shown in formula XV.
Anker
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(Formel XV)anchor
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(Formula XV)
Formel XV: Allgemeine Strukturformel eines oberflächenmodifizierenden Agens, n=5-700, bevorzugt n=5-200, wobei X eine mögliche Ziel erkennende Struktur und der anionische Anker ein Polymerblock sein kann. Der anionische Anker kann entsprechend der zuvor benannten Beschreibung von Formel XIII aufgebaut sein.Formula XV: General structural formula of a surface-modifying agent, n = 5-700, preferably n = 5-200, where X may be a possible target-recognizing structure and the anionic anchor may be a polymer block. The anionic anchor may be constructed according to the previously described description of formula XIII.
Der partiell anionisch geladene Molekülteil erfüllt die Funktion eines Ankers auf der positiv geladenen Partikeloberfläche durch elektrostatische Wechselwirkungen. Der mittlere, neutrale Molekülteil besteht aus Polyethylenglycol-Einheiten und/oder Polyethylenoxid-Einheiten (PEG- Einheiten) unterschiedlicher Länge. Bevorzugt sind hier PEG-Ketten mit einem Molekulargewicht von 100 bis 30000 Dalton und besonders bevorzugt mit 3000 bis 5000 Dalton. Dieser Molekülteil kann alternativ auch aus anderen geeigneten Strukturen, wie z. B. Hydroxyethylstärke (HES) und allen daraus möglichen polymeren Verbindungen, bestehen.The partially anionically charged moiety fulfills the function of an anchor on the positively charged particle surface through electrostatic interactions. The middle, neutral part of the molecule consists of polyethylene glycol units and / or polyethylene oxide units (PEG units) of different lengths. Preference is given here to PEG chains having a molecular weight of from 100 to 30,000 daltons and more preferably from 3,000 to 5,000 daltons. This moiety may alternatively be made of other suitable structures, such as. As hydroxyethyl starch (HES) and all possible polymeric compounds exist.
Der Ligand X des oberflächenmodifizierenden Agens, im weiteren auch Ziel erkennende Struktur genannt, dient zur Verbesserung von passiven und aktiven Anreicherungsmechanismen der Polymemanopartikel.The ligand X of the surface-modifying agent, also called the target-recognizing structure in the following, serves to improve passive and active accumulation mechanisms of the polymanneroparticles.
Geeignete Liganden X als Ziel erkennende Strukturen können sowohl Antikörper, Peptide, Rezeptor-Liganden von Liganden-Mimetika oder ein Aptamer sein. Als Strukturen kommen Aminosäuren, Peptide, CDR (compementary determining regions), Antigene, Haptene, Enzymsubstanzen, Enzym-Cofaktoren, Biotin, Carotinoide, Hormone, Vitamine, Wachstumsfaktoren, Lymphokine, Carbohydrate, Oligosaccharide, Lecitine, Dextrane, Lipide, Nucleoside wie beispielsweise ein DNA- oder ein RNA- Molekül enthaltend native, modifizierte oder artifizielle Nucleoside, Nucleinsäuren, Oligocucleotide, Polysaccharide, B-, A-, Z-HeNx oder Haarnadelstruktur (Hairpin), modifizierte Polysaccharide als auch rezeptorbindende Substanzen oder Fragmente davon in Betracht. Ziel erkennende Strukturen können auch Transferrin oder Folsäure oder Teile davon sein oder alle möglichen Kombinationen aus den vorgenannten.Suitable ligands X as targeting structures may be antibodies, peptides, receptor ligands of ligand mimetics or an aptamer. Structures include amino acids, peptides, CDR (compementary determining regions), antigens, haptens, enzyme substances, enzyme cofactors, biotin, carotenoids, hormones, vitamins, growth factors, lymphokines, carbohydrates, oligosaccharides, lecithins, dextrans, lipids, nucleosides such as DNA or an RNA molecule containing native, modified or artificial nucleosides, Nucleic acids, oligo nucleotides, polysaccharides, B, A, Z HeNx or hairpin structure (hairpin), modified polysaccharides as well as receptor binding substances or fragments thereof. Target-recognizing structures may also be transferrin or folic acid or parts thereof, or all possible combinations of the foregoing.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, wenn die Ziel erkennende Struktur ausgewählt ist aus einer Liste enthaltend einen Antikörper, ein Protein, ein Polypeptid, ein Polysaccharid, ein DNA Molekül, ein RNA Molekül, eine chemische Einheit, eine Nukleinsäure, ein Lipid, ein Carbohydrat oder Kombinationen aus den vorgenannten.One aspect of the present invention is where the targeting structure is selected from a list containing an antibody, a protein, a polypeptide, a polysaccharide, a DNA molecule, an RNA molecule, a chemical moiety, a nucleic acid, a lipid, a carbohydrate or combinations of the foregoing.
Diese Liganden werden erfindungsgemäß über elektrostatische Wechselwirkungen an die Nanopartikel gebunden, es ist aber auch möglich, die Liganden über kovalente Bindungen an die Partikeloberfläche zu binden. Weiterhin ist es möglich, einen Linker zwischen Ligand und Nanopartikel einzubauen.These ligands are bound to the nanoparticles via electrostatic interactions, but it is also possible to bind the ligands via covalent bonds to the particle surface. Furthermore, it is possible to incorporate a linker between ligand and nanoparticles.
Die elektrostatische Anlagerung der Ziel erkennenden Strukturen erfolgt über Ladungswechselwirkungen mit mindestens einem negativ geladenen Molekülteil an die kationische Partikeloberfläche. Als negativ geladener Molekülteil (Anker) eignen sich Verbindungen oder polymere Strukturen mit Gruppen wie Acetat-, Carbonat-, Citrat, Succinat-, Nitrat-, Carboxylat-, Phosphat-, Sulfonat- oder Sulfat-Gruppen, sowie Salze und freie Säuren dieser Gruppen.The electrostatic attachment of the target-recognizing structures takes place via charge interactions with at least one negatively charged moiety on the cationic particle surface. As a negatively charged moiety (anchor) are compounds or polymeric structures having groups such as acetate, carbonate, citrate, succinate, nitrate, carboxylate, phosphate, sulfonate or sulfate groups, as well as salts and free acids of these groups ,
In einer Ausführungsform beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 1 nm - 800 nm.In one embodiment, the size of the nanoparticles is between 1 nm and 800 nm.
In einer weiteren Ausführungsform beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 5 nm - 800 nm.In a further embodiment, the size of the nanoparticles is between 5 nm and 800 nm.
In einer Ausführungsform beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 1 nm - 500 nm. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 1 nm - 300 nm.In one embodiment, the size of the nanoparticles is between 1 nm and 500 nm. In a preferred embodiment, the size of the nanoparticles is between 1 nm and 300 nm.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 5 nm - 500 nm.In a particularly preferred embodiment, the size of the nanoparticles is between 5 nm and 500 nm.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 5 nm - 300 nm.In a further particularly preferred embodiment, the size of the nanoparticles is between 5 nm and 300 nm.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 10 nm - 300 nm.In a further particularly preferred embodiment, the size of the nanoparticles is between 10 nm and 300 nm.
Die Größe der entstandenen Polymernanopartikel wird mittels der Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) ermittelt.The size of the resulting polymer nanoparticles is determined by photon correlation spectroscopy (PCS).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Herstellung der Polymernanopartikel durch die Durchführung folgender Verfahrensschritte gekennzeichnet: • Das wasserunlösliche Polymer wird in einem geeigneten organischenIn a particularly preferred embodiment, the preparation of the polymer nanoparticles is characterized by carrying out the following process steps: The water-insoluble polymer is dissolved in a suitable organic solvent
Lösungsmittel, welches unbegrenzt mit Wasser mischbar ist, vorzugsweise Aceton, Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol Dimetylsulfoxid (DMSO), oder in einem Gemisch aus diesen Lösungsmitteln mit Wasser gelöst. • Das kationische Polymer wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, welches unbegrenzt mit Wasser mischbar ist, vorzugsweise Aceton, Methanol, Ethanol, Propanol, Dimetylsulfoxid (DMSO), oder in einem Gemisch aus diesen Lösungsmitteln mit Wasser gelöst. • Der Wirkstoff (Diagnostikum und/oder Epothilon) wird in einem organischen Lösungsmittel, welches unbegrenzt mit Wasser mischbar ist, vorzugsweise Aceton, Methanol, Ethanol, Propanol, Dimetylsulfoxid (DMSO), Isopropanol oder in einem Gemisch aus diesen Lösungsmitteln mit Wasser gelöst. • Es wird eine vollständig homogene Lösung aus kationischem Polymer, wasserunlöslichem Polymer und Wirkstoff hergestellt durch Zusammengeben der vorher getrennt hergestellten Lösungen.Solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, isopropanol dimethyl sulfoxide (DMSO), or dissolved in a mixture of these solvents with water. The cationic polymer is dissolved in a suitable solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethylsulfoxide (DMSO), or dissolved in a mixture of these solvents with water. The active ingredient (diagnostic agent and / or epothilone) is dissolved in an organic solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethylsulfoxide (DMSO), isopropanol or in a mixture of these solvents with water. A completely homogeneous solution of cationic polymer, water-insoluble polymer and active ingredient is prepared by combining the previously separately prepared solutions.
• Durch ein Einbringen des gelösten Polymer-Substanz-Gemisches in eine tensidhaltige Lösung, als Tensid insbesondere Pluronic F68, Triton X-100 und Synperonic T707, wird die spontane Bildung eines kolloidalen Fällungsaggregats herbeigeführt.• By introducing the dissolved polymer-substance mixture in a surfactant-containing solution, as a surfactant in particular Pluronic F68, Triton X-100 and Synperonic T707, the spontaneous formation of a colloidal precipitation unit is brought about.
• Das organische Lösungsmittel wird anschließend entweder unter Atmosphärendruck oder Unterdruck, über Lyophilisation oder Hitze vollständig oder andere geeignete Methoden entfernt.The organic solvent is then removed either under atmospheric pressure or negative pressure, via lyophilization or heat completely or other suitable methods.
• Gegebenenfalls wird zur Modifikation der Partikeloberfläche die oben hergestellte wässrige, stabile Nanopartikeldispersion in einem geeigneten Mengenverhältnis mit dem in Wasser gelösten modifizierenden Agens vermischt. Die Bestimmung des geeigneten Mengenverhältnisses erfolgt durch schrittweise Titration der Partikeldispersion mit dem modifizierenden Agens. Das Ausmaß der elektrostatischen Oberflächenmodifikation (Ladungstitration) wird durch Bestimmung des Zetapotentials kontrolliert. Der Zielwert des Zeta Potentials hängt von dem geplanten Applikationsweg ab. Für i.v. Anwendungen wäre beispielsweise ein neutrales bis negatives Zetapotential bevorzugt , bei oraler und buccaler Applikation wird eher ein neutrales oder kationisches Zetapotential bevorzugt, usw.Optionally, to modify the particle surface, the aqueous stable nanoparticle dispersion prepared above is mixed in a suitable proportion with the modifying agent dissolved in water. The determination of the appropriate quantitative ratio is carried out by stepwise titration of the particle dispersion with the modifying agent. The degree of electrostatic surface modification (charge titration) is controlled by determining the zeta potential. The target value of the zeta potential depends on the planned application path. For i.v. Applications would be preferred, for example, a neutral to negative zeta potential, in oral and buccal administration, a neutral or cationic zeta potential is preferred, etc.
• Gegebenenfalls erneut Entfernen des Dispergens.• If necessary, remove the dispersant again.
In einer weiteren Ausführungsform wird nach dem Entfernen des organischen Lösungsmittels ein Reinigungsschritt, beispielsweise durch Waschen der Partikel mit einer geeigneten Lösung, durchgeführt.In a further embodiment, after the removal of the organic solvent, a purification step is carried out, for example by washing the particles with a suitable solution.
Geeignete Lösungen für den Waschvorgang sind beispielsweise wässrige Tensidlösungen 0,1-2 %, aber auch reines Wasser.Suitable solutions for the washing process are, for example, aqueous surfactant solutions 0.1-2%, but also pure water.
In einer weiteren Ausführungsform kann nach Entfernen des organischen Lösungsmittels und gegebenenfalls Aufreinigung oder nach erfolgter Oberflächenmodifikation lyophilisiert werden. Die lyophilisierten Nanopartikel können dann als Kit vertrieben und zur Verwendung rekonstituiert und verabreicht werden.In a further embodiment, after removal of the organic solvent and optionally purification or after Surface modification are lyophilized. The lyophilized nanoparticles may then be marketed as a kit and reconstituted and administered for use.
Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Kit, das die Partikel enthaltend ein Diagnostikum und ein Epothilon oder nur ein Epothilon gemeinsam oder getrennt verkapselt, gegebenenfalls als Lyophilisat oder als Lösung oder Dispersion enthält. Dieses Kit kann zusätzlich ein geeignetes Mittel zur Rekonstitution des Lyophilisates z.B. physiologische Kochsalzlösung oder Wasser für Injektions/Infusionszwecke enthalten.Therefore, another object of the invention is a kit which encapsulates the particles containing a diagnostic agent and an epothilone or only one epothilone together or separately, optionally as a lyophilisate or as a solution or dispersion. This kit may additionally comprise a suitable means for reconstitution of the lyophilisate, e.g. physiological saline or water for injection / infusion purposes.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit, dass die nicht oberflächenmodifizierten Partikel, Mittel für die Herstellung einer Lösung des oberflächenmodifizierenden Agens enthält.Another object of the invention is a kit that the non-surface-modified particles, means for the preparation of a solution of the surface-modifying agent.
In einer weiteren Ausführungsform können die beschriebenen Nanopartikel unter Verwendung geeigneter pharmazeutischer Zusatzstoffe zu verschiedenen Arzneiformen weiterverarbeitet werden, welche sich zur Applikation an Mensch oder Tier eignen. Dazu zählen insbesondere wässrige Dispersionen, Lyophilisate, feste orale Arzneiformen wie schnell auflösende Tabletten, Kapseln und andere. Geeignete pharmazeutische Zusatzstoffe können sein: Zuckeralkohole zur Lyophilisation (z. B. Sorbitol, Mannitol), Hilfstoffe zur Tablettierung, Polyethylenglycole etc.In a further embodiment, the described nanoparticles can be further processed using suitable pharmaceutical additives to form various dosage forms which are suitable for application to humans or animals. These include in particular aqueous dispersions, lyophilisates, solid oral dosage forms such as fast-dissolving tablets, capsules and others. Suitable pharmaceutical additives may be: sugar alcohols for lyophilization (eg sorbitol, mannitol), tableting excipients, polyethylene glycols, etc.
Die Applikation der wässrigen Nanopartikeldispersion oder einer weiter entwickelten Arzneiform kann oral, parenteral (z.B. intravenös), subkutan, intramuskulär, intraokular, intrapulmonal, nasal, intraperitoneal, dermal sowie auf allen anderen für Mensch oder Tier möglichen Applikationswegen angewendet werden. Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polymernanopartikels, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Verfahrensschritte durchgeführt werden:The application of the aqueous nanoparticle dispersion or a further developed pharmaceutical form can be administered orally, parenterally (eg intravenously), subcutaneously, intramuscularly, intraocularly, intrapulmonary, nasally, intraperitoneally, dermally as well as on all other administration routes possible for humans or animals. The invention relates to a process for the preparation of a polymer nanoparticle, characterized in that the following process steps are carried out:
• Lösen des kationischen Polymers in einem organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch mit WasserDissolving the cationic polymer in an organic solvent or a solvent mixture with water
• Lösen des wasserunlöslichen Polymers in einem organischen LösungsmittelDissolving the water-insoluble polymer in an organic solvent
• Getrenntes oder geminsames Lösen des Wirkstoffes (Diagnostikum und Therapeutikum oder nur Therapeutikum) in einem organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch mit Wasser,Separate or geminsames release of the drug (diagnostic and therapeutic or therapeutic only) in an organic solvent or a solvent mixture with water,
• Herstellen eines vollständig gelösten Gemisches aus kationischem Polymer, wasserunlöslichem Polymer und Wirkstoff durch Zusammengeben der hergestellten Einzellösungen• Make a completely dissolved mixture of cationic polymer, water-insoluble polymer and active ingredient by combining the prepared individual solutions
• Einbringen des Gemisches in eine tensidhaltige Lösung, wobei es zur spontanen Bildung von Fällungsaggregaten kommt,Introducing the mixture into a surfactant-containing solution, which leads to the spontaneous formation of precipitation aggregates,
• Entfernen des Lösungsmittels.• Remove the solvent.
• Gegebenenfalls Aufreinigung der Partikeldispersion• If necessary, clean up the particle dispersion
• Gegebenenfalls Lyophilisieren• Lyophilize if necessary
• Gegebenenfalls elektrostatische Oberflächenmodifikation der Partikel durch Zusammenfügen von Nanopartikeldispersion und modifizierendem• Optionally electrostatic surface modification of the particles by combining nanoparticle dispersion and modifying
Agens in geeigneten Mengen (Fakultativ)Agent in appropriate quantities (Optional)
• Gegebenenfalls entfernen des Lsöungsmittels und/oder Dispergens, gegebenenfalls durch Lyophilisieren. Optionally, remove the solvent and / or dispersant, if necessary by lyophilization.
Definitionendefinitions
Der Begriff "Wirkstoff, wie hier verwendet, umfasst therapeutisch und diagnostisch wirksame Verbindungen. Ebenso umfasst sind Verbindungen, die bei anderen Tieren als dem Menschen und bei Pflanzen wirksam sind.As used herein, the term "active agent" includes therapeutically and diagnostically-effective compounds, as well as compounds that are active in animals other than humans and plants.
Der Begriff „Epothilon oder Epothilone" umfasst alle natürlich vorkommenden Epothilone und deren Derivate. Epothilon Derivate sind bekannt beispielsweise aus WO 93/10102, WO 93/10121 und DE 41 38 042 A2, WO 97/19086 und WO 98/25929 , WO 99/43320, WO 2000/066589, WO 00/49021 WO 00/71521 , WO 2001027308 , WO 99/02514 , WO 2002080846.The term "epothilone or epothilone" encompasses all naturally occurring epothilones and their derivatives Epothilone derivatives are known, for example, from WO 93/10102, WO 93/10121 and DE 41 38 042 A2, WO 97/19086 and WO 98/25929, WO 99 / 43320, WO 2000/066589, WO 00/49021, WO 00/71521, WO 2001027308, WO 99/02514, WO 2002080846.
Die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung beispielsweise geeigneten Epothilone und deren Herstellung sind offenbart in DE 19907588, WO 98/25929, WO 99/58534, WO 99/2514, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 99/7692, EP 99/4915, WO 00/1333, WO 00/66589, WO 00/49019, WO 00/49020, WO 00/49021 , WO 00/71521 , WO 00/37473, WO 00/57874, WO 01/92255, WO 01/81342, WO 01/73103, WO 01/64650, WO 01/70716, US 6204388, US 6387927, US 6380394, US 02/52028, US 02/58286, US 02/62030, WO 02/32844, WO 02/30356, WO 02/32844, WO 02/14323, and WO 02/8440. Insbesondere geeignet sind die Verbindungen, die in WO 00/66589 offenbart sind.The epothilones suitable for use in the present invention and their preparation are disclosed in DE 19907588, WO 98/25929, WO 99/58534, WO 99/2514, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 99/7692, EP 99/4915, WO 00/1333, WO 00/66589, WO 00/49019, WO 00/49020, WO 00/49021, WO 00/71521, WO 00/37473, WO 00/57874, WO 01/92255, WO 01/81342, WO 01/73103, WO 01/64650, WO 01/70716, US 6204388, US 6387927, US 6380394, US 02/52028, US 02/58286, US 02/62030, WO 02/32844, WO 02/30356, WO 02/32844, WO 02/14323, and WO 02/8440. Particularly suitable are the compounds disclosed in WO 00/66589.
Bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Epothilone, wie sie von Formel Il umfasst sind. Der Begriff Epothilone schließt auch die Möglichkeit mit ein, dass in einer Zubereitung verschiedene Epothilonderivate ausgewählt aus der offenbarten Liste aus Anspruch 21 verkapselt werden.Preferred within the meaning of the present invention are epothilones, as encompassed by formula II. The term epothilone also includes the possibility of encapsulating in a preparation various epothilone derivatives selected from the disclosed list of claim 21.
Der Begriff "Matrixpolymer", wie hier verwendet, beschreibt das Polymer, welches mengenmäßig den größeren Anteil der Partikelmasse bildet, wobei weitere verkapselte Substanzen (sowohl beliebige Zusatzstoffe als auch pharmazeutisch aktive Substanzen) gleichmäßig und/oder ungleichmäßig eingebettet sein können. Der Begriff „(Nano)-Präzipitation", wie hier verwendet, beschreibt die Bildung eines kolloidalen Niederschlags durch Ausfällen eines schwer wasserlöslichen Polymers beim Einbringen in eine wässrige Phase, wobei eine Durchmischung der Lösungsmittel stattfindet. Im Falle einer Co-Präzipitation kommt es zu einer gemeinschaftlichen Ausfällung mehrerer Substanzen, welche im Sinne der Erfindung sowohl wasserlöslich als auch schwer wasserlöslich sein können.The term "matrix polymer" as used herein describes the polymer which quantitatively constitutes the major proportion of the particle mass, wherein further encapsulated substances (both arbitrary additives and pharmaceutically active substances) may be uniformly and / or non-uniformly embedded. As used herein, the term "(nano) precipitation" describes the formation of a colloidal precipitate by precipitating a sparingly water-soluble polymer when placed in an aqueous phase, with mixing of the solvents taking place Community precipitation of several substances which may be both water-soluble and poorly water-soluble in the context of the invention.
Ein „Fällungsaggregat", wie hier verwendet, entsteht im Zuge der Nanopräzipitation. Dieses Fällungsaggregat besteht erfindungsgemäß aus einem Matrixpolymer, worin weitere polymere Substanzen wie auch pharmazeutisch aktive Substanzen teilweise oder vollständig eingebettet sein können. Es kann hierbei eine gleichmäßige oder ungleichmäßige Verteilung der co-verkapselten Substanzen im Matrixpolymer vorliegen.According to the invention, this precipitating aggregate consists of a matrix polymer in which further polymeric substances as well as pharmaceutically active substances can be partially or completely embedded in. A uniform or uneven distribution of the coagulum may be present. encapsulated substances in the matrix polymer.
Ein "Anker", wie hier verwendet, beschreibt eine ionische Teilstruktur des modifizierenden Agens, welche die Immobilisierung und somit Lokalisation des modifizierenden Agens auf der geladenen Partikeloberfläche durch ionische Wechselwirkungen zwischen entgegengesetzt geladenen Verbindungen ermöglicht.An "anchor", as used herein, describes an ionic moiety of the modifying agent that allows immobilization and thus localization of the modifying agent on the charged particle surface by ionic interactions between oppositely charged compounds.
Ladungstitration beschreibt den über Zetapotentialmessung nachvollziehbaren Prozess der elektrostatischen Kopplung des Ankers auf der Partikeloberfläche. Der geladene Anker verändert dabei das Zetapotential des Partikels hin zur Ladung des Ankers.Charge titration describes the process of electrostatic coupling of the armature on the particle surface that can be traced by zeta potential measurement. The charged anchor changes the zeta potential of the particle towards the charge of the anchor.
Der Begriff „neutrale Aminosäure" im Sinne der Erfindung umfasst alle Aminosäuren, deren molekulare Ladung in der Summe der Einzelladungen ausgeglichen ist, also null ist. Darunter fallen alle natürlichen Aminosäuren R- CH(COOH)(NH2), deren Rest R keine Ladung trägt, z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin usw. aber auch synthetische Aminosäuren, die diese Bedingung erfüllen wie beispielsweise Cyclohexylalanin. Tenside im Sinne der Erfindung sind zum einen oberflächenaktive Substanzen, welche die Grenzflächenspannung zwischen zwei nicht mischbaren Phasen erniedrigen, wodurch eine Stabilisierung kolloidaler Dispersionen möglich ist. Weiterhin kann es sich bei Tensiden erfindungsgemäß um jede Art von Substanzen handeln, welche in der Lage sind, kolloidale Dispersionen sterisch und / oder elektrostatisch zu stabilisieren.The term "neutral amino acid" in the sense of the invention encompasses all amino acids whose molecular charge is balanced in the sum of the individual charges, ie zero, including all natural amino acids R-CH (COOH) (NH 2), whose radical R carries no charge eg alanine, valine, leucine, isoleucine, etc. but also synthetic amino acids that fulfill this condition, such as cyclohexylalanine. Surfactants according to the invention are, on the one hand, surface-active substances which lower the interfacial tension between two immiscible phases, which makes it possible to stabilize colloidal dispersions. Furthermore, according to the invention, surfactants can be any type of substances which are capable of sterically and / or electrostatically stabilizing colloidal dispersions.
Der Begriff „Tumorerkrankungen" umfasst die Krankheiten oder Krankheitsbedingungen die assoziiert sind mit Zellwachstum, Zellteilung und/oder Proliferation, wie beispielsweise maligne Tumoren. Als noch speziellere Erkrankungen, die unter diesen Begriff fallen, seien beispielsweise Osteoporose, Osteoarthritis, Gebährmutter- und Gebährmutterhalskrebs, Bauchkrebs umfassend alle Carcinome im oberen Bauchraum, Darmkrebs, Drüsenkrebs z.B. Adenosarcom, Brust-, Lungen- (z.B. SCLC und NSCLC) , Kopf- und Nackenkarcinom, malignes Melanom, akute lymphocytische oder myelocytische Leukämie, Prostatakarcinom, Knochenmetastasen, Gehirntumoren und Gehirnmetastasen geannt, wobei in dieser Aufzählung die Begriffe „-krebs" und ,,-karcinom" synonym verwendet wurden. Feste Tumoren stellen einen Unteraspekt dar. Bevorzugt sind unter „Tumorerkrankungen" Gebährmutter- und Gebährmutterhalskrebs, Brust-, Lungen-, Prostatakarcinom, malignes Melanom, Knochenmetastasen, Gehirntumoren und Gehirnmetastasen zu verstehen.The term "neoplastic diseases" includes the diseases or conditions associated with cell growth, cell division and / or proliferation, such as malignant tumors More specific diseases which fall into this term include, for example, osteoporosis, osteoarthritis, cervical and cervical cancer, and abdominal cancer including all carcinomas in the upper abdomen, colon cancer, glandular cancer eg adenosarcoma, breast, lung (eg SCLC and NSCLC), head and neck carcinoma, malignant melanoma, acute lymphocytic or myelocytic leukemia, prostate carcinoma, bone metastases, brain tumors and brain metastases Solid tumors are a sub-aspect. Preferred among "tumor diseases" are neonatal and cervical cancer, breast, lung, prostate carcinoma, malignant melanoma, bone metastases, brain tumors and brain metastases to understand.
Mit dem Begriff „Zielstruktur" ist eine das Ziel (Target) erkennende Struktur gemeint. Im Falle von „passiven Targeting" kann die Zielstruktur indirekt eine Anreicherung am Zielort unterstützen, beispielsweise durch eine Verlängerung der Zirkulationszeit der Partikel im Blutstrom erhöht sich die Wahrscheinlichkeit einer Anreicherung über die Fenestrierungen im Tumorendothel.By "targeting" is meant a targeting structure: in the case of "passive targeting", the targeting structure may indirectly assist in enrichment at the target site, for example, by extending the circulation time of the particles in the bloodstream increases the likelihood of enrichment about the fenestrations in the tumor endothelium.
Der Begriff „aktives Targeting" wird verwendet, wenn gewebs- oder zellspezifische Liganden für eine gezielte Anreicherung zum Einsatz kommen. Aktive Liganden können sowohl an Wirkstoffen direkt (Ligand-Wirkstoff- Konjugate) als auch auf die Oberfläche kolloidaler Trägersysteme gekoppelt werden.The term "active targeting" is used when tissue- or cell-specific ligands are used for targeted enrichment Active ligands can be administered directly to active substances (ligand-drug Conjugates) as well as to the surface of colloidal carrier systems.
Der Begriff „passives Targeting" wird verwendet, wenn sich die Verteilung des Wirkstoffs aufgrund (unspezifischer) physikalischer, biochemischer oder immunologischer Vorgänge ergibt. In erster Linie wird der Enhanced Permeation and Retention-Effekt (kurz EPR- Effekt) dafür verantwortlich gemacht. Es handelt sich hierbei um einen passiven Anreicherungsmechanismus, welcher die strukturellen Besonderheiten von tumorösem oder auch entzündetem Gewebe ausnutzt [Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug DeNv. Rev., 2004; 56(7): 1023-The term "passive targeting" is used when the distribution of the active ingredient is due to (nonspecific) physical, biochemical or immunological processes, primarily due to the enhanced permeation and retention effect (EPR effect) this is a passive enrichment mechanism which exploits the structural peculiarities of tumorous or inflamed tissue [Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug DeNv. Rev., 2004; 56 (7): 1023-
1050].1050].
Der Begriff "Oberflächenpotential", auch als Oberflächenladung bezeichnet, ist gleichbedeutend mit dem Begriff "Zetapotential". Dieses Zetapotential wird mittels der Methode der Laser-Doppler-Anemometrie (LDA) bestimmt.The term "surface potential", also referred to as surface charge, is synonymous with the term "zeta potential". This zeta potential is determined by the method of laser Doppler anemometry (LDA).
Das Oberflächenpotential, auch als Zetapotential bezeichnet, gibt das Potential eines wandernden Teilchens an der Scherebene an, d. h. wenn durch Bewegung des Teilchens der größte Teil der diffusen Schicht abgeschert worden ist. Das Oberflächenpotential wurde mit dem Verfahren der Laser- Doppler-Anemometrie unter Verwendung eines "Zetasizer 3000" (Malvern Instruments) bestimmt.The surface potential, also referred to as zeta potential, indicates the potential of a migrating particle at the shear plane, i. H. if the majority of the diffuse layer has been sheared off by movement of the particle. The surface potential was determined by the method of laser Doppler anemometry using a "Zetasizer 3000" (Malvern Instruments).
Mittels der Methode der Laser-Doppler-Anemometrie wird die Wanderungsgeschwindigkeit der Partikel im elektrischen Feld bestimmt. Teilchen mit einer geladenen Oberfläche wandern in einem elektrischen Feld zur entgegengesetzt geladenen Elektrode, wobei dieBy means of the method of laser Doppler anemometry, the migration speed of the particles in the electric field is determined. Particles with a charged surface migrate in an electric field to the oppositely charged electrode, wherein the
Wanderungsgeschwindigkeit der Partikel von der Menge der Oberflächenladungen und der angelegten Feldstärke abhängig ist. Zur Bestimmung der Wanderungsgeschwindigkeit werden im elektrischen Feld wandernde Teilchen mit einem Laser bestrahlt und das gestreute Laserlicht detektiert. Durch die Bewegung der Teilchen wird eine Frequenzverschiebung beim reflektierten Licht im Vergleich zum eingestrahlten Licht gemessen. Der Betrag dieser Frequenzverschiebung ist abhängig von der Wanderungsgeschwindigkeit und wird als so genannte Doppler-Frequenz bezeichnet (Doppler-Effekt). Aus der Doppler-Frequenz, dem Streuwinkel und der Wellenlänge kann die Wanderungsgeschwindigkeit eines Teilchens abgeleitet werden. Die elektrophoretische Mobilität ergibt sich aus dem Quotienten der Wanderungsgeschwindigkeit und der elektrischen Feldstärke. Das Produkt aus elektrophoretischer Mobilität und dem Faktor 13 entspricht dem Zetapotential, dessen Einheit [mV] ist.Migration rate of the particles depends on the amount of surface charges and the applied field strength. To determine the migration speed, particles traveling in the electric field are irradiated with a laser and the scattered laser light is detected. As a result of the movement of the particles, a frequency shift in the reflected light is measured in comparison to the incident light. Of the The amount of this frequency shift is dependent on the rate of migration and is referred to as the so-called Doppler frequency (Doppler effect). From the Doppler frequency, the scattering angle and the wavelength, the migration speed of a particle can be derived. The electrophoretic mobility results from the quotient of the migration speed and the electric field strength. The product of electrophoretic mobility and factor 13 corresponds to the zeta potential, the unit of which is [mV].
Die Messungen (n=5) wurden mit einem Zetasizer Advanced 3000 und einem Zetamaster der Firma Malvern Instruments Ltd. (Worcestershire, England) nach Verdünnen in elektrolytarmen Dispersionsmedium (MiIIiQ Wasser: Widerstandswert 18,2 MΩ.cm, 25 0C und TOC-Gehalt (gesamter organischer Kohlenstoff) <10 ppb) und unter definiertem pH Wert (pH 6,8-7,0) durchgeführt. Als Software wurden PCS V1.41/ PCS V1.51 Rev. verwendet. Die Kontrollmessungen des Zetapotentials erfolgten mit Latex-Standardpartikeln der Firma Malvern Instruments Ltd. (-50 mV ± 5 mV). Die Messungen wurden unter den Standardeinstellungen der Firma Malvern Instruments Ltd. durchgeführt.The measurements (n = 5) were carried out with a Zetasizer Advanced 3000 and a Zetamaster from Malvern Instruments Ltd. (Worcestershire, England) after dilution in low-electrolyte dispersion medium (MiIIiQ water: resistance 18.2 MΩ.cm, 25 0 C and TOC content (total organic carbon) <10 ppb) and at a defined pH (pH 6.8-7 , 0). The software used was PCS V1.41 / PCS V1.51 Rev. The control measurements of the zeta potential were carried out with standard latex particles from Malvern Instruments Ltd. (-50 mV ± 5 mV). The measurements were made under the standard settings of Malvern Instruments Ltd. carried out.
Die Größe der Nanopartikel wurde mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung (Dynamic Light Scattering, DLS) unter Verwendung eines "Zetasizer 3000" (Malvern Instruments) bestimmt. Zusätzlich wurden Aufnahmen im Raster- Elektronen-Mikroskop (REM) gemacht, wie in Fig. 12 beispielhaft gezeigt wird. Die Figur 12 (Fig. 12) bestätigt auch die kugelförmige Gestalt der Nanopartikel.The size of the nanoparticles was determined by Dynamic Light Scattering (DLS) using a "Zetasizer 3000" (Malvern Instruments). In addition, images were taken in the scanning electron microscope (SEM), as shown by way of example in FIG. Figure 12 (Figure 12) also confirms the spherical shape of the nanoparticles.
Die Bestimmung der Partikelgröße durch DLS beruht auf dem Prinzip der Photonenkorrelationsspektroskopie (Photon Correlation Spectroscopy, PCS). Dieses Verfahren eignet sich zur Vermessung von Partikeln mit einer Größe im Bereich von 3 nm bis 3 μm. Die Partikel unterliegen in Lösung einer ungerichteten Bewegung, ausgelöst durch die Kollision mit Flüssigkeitsmolekülen des Dispersionsmittels, deren treibende Kraft die Brown'sche Molekularbewegung ist. Die resultierende Bewegung der Partikel ist umso schneller, je kleiner ihr Partikeldurchmesser ist. Wird eine Probe in einer Küvette mit Laserlicht bestrahlt, so kommt es an den sich ungerichtet bewegenden Partikeln zur Streuung des Lichts. Durch diese Bewegung der Partikel ist die Streuung nicht konstant, sondern schwankt über die Zeit. Die im 90°-Winkel detektierten Schwankungen der Intensität des gestreuten Laserlichts sind umso stärker, je schneller sich die Partikel bewegen, d.h. je kleiner sie sind. Auf der Grundlage dieser Intensitätsschwankungen kann man mit Hilfe einer Autokorrelationsfunktion auf die Partikelgröße schließen. Der mittlere Teilchendurchmesser wird aus dem Abfall der Korrelationsfunktion berechnet. Zur korrekten Berechnung des mittleren Teilchendurchmessers sollten die Partikel eine kugelförmige Gestalt haben, was sich durch REM-Aufnahmen überprüfen lässt (siehe oben), nicht sedimentieren oder flotieren. Die Messungen wurden durchgeführt mit Proben in geeigneter Verdünnung, unter einer konstanten Temperatur von 25°C sowie einer definierten Viskosität der Lösung. Es erfolgte eine Kalibrierung des Messgerätes mit Standardlatexpartikeln unterschiedlicher Größe der Firma Malvern Instruments Ltd.The determination of the particle size by DLS is based on the principle of Photon Correlation Spectroscopy (PCS). This method is suitable for measuring particles with a size in the range of 3 nm to 3 μm. The particles, in solution, undergo an undirected motion caused by the collision with liquid molecules of the dispersant whose driving force is Brownian motion. The resulting particle motion is faster, the smaller their particle diameter. Is a sample in one Cuvette irradiated with laser light, so it comes to the undirected moving particles to scatter the light. Due to this movement of the particles, the scattering is not constant, but fluctuates over time. The fluctuations in the intensity of the scattered laser light detected at 90 ° are the stronger the faster the particles move, ie the smaller they are. Based on these intensity variations, one can conclude the particle size using an autocorrelation function. The mean particle diameter is calculated from the slope of the correlation function. For the correct calculation of the average particle diameter, the particles should have a spherical shape, which can be checked by SEM images (see above), do not sediment or float. The measurements were carried out with samples in appropriate dilution, at a constant temperature of 25 ° C and a defined viscosity of the solution. The measuring device was calibrated with standard latex particles of different sizes from Malvern Instruments Ltd.
Die rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen (REM-Aufnahmen) zur Bestimmung der Teilchengröße wurde mit einem Feldemissions- Rasterelektronenmikroskop vom Typ XL-30-SFEG der Firma FEI (Kassel, Deutschland) angefertigt. Vorab wurden die Proben in einem Hochvakuum- Sputter 208 HR der Firma Cressington (Watford, England) mit einer 5 nm Gold- Palladium Schicht gesputtert.The scanning electron micrographs (SEM images) for determining the particle size were prepared using a field emission scanning electron microscope of the type XL-30-SFEG from FEI (Kassel, Germany). In advance, the samples were sputtered in a high vacuum sputter 208 HR from Cressington (Watford, England) with a 5 nm gold-palladium layer.
Die Löslichkeit eines Stoffes gibt an, ob und in welchem Umfang ein Reinstoff in einem Lösungsmittel gelöst werden kann. Sie bezeichnet also die Eigenschaft eines Stoffes, sich unter homogener Verteilung (als Atome, Moleküle oder Ionen) mit dem Lösungsmittel zu vermischen. Die Löslichkeit einer Verbindung wird als die Konzentration einer gesättigten Lösung bestimmt, die sich mit dem ungelösten Bodensatz im Gleichgewicht befindet in Abhängigkeit der Temperatur (Raumtemperatur). Eine schwer lösliche Verbindung weist eine Löslichkeit < 0,1 mol/l auf, eine mäßig lösliche zwischen 0,1-1 mol/l und eine leicht lösliche Verbindung > 1 mol/l. Die Erfindung soll nun im Folgenden in den Beispielen weiter beschrieben werden, ohne darauf beschränkt zu sein.The solubility of a substance indicates whether and to what extent a pure substance can be dissolved in a solvent. It thus describes the property of a substance to mix with the solvent under homogeneous distribution (as atoms, molecules or ions). The solubility of a compound is determined to be the concentration of a saturated solution that is in equilibrium with the undissolved sediment, depending on the temperature (room temperature). A sparingly soluble compound has a solubility <0.1 mol / l, a moderately soluble between 0.1-1 mol / l and a slightly soluble compound> 1 mol / l. The invention will now be further described below in the examples, without being limited thereto.
BeispieleExamples
Beispiel 1 : Herstellung von PBCA mittels anionischer PolymerisationExample 1: Preparation of PBCA by means of anionic polymerization
Für die PBCA-Herstellung mittels anionischer Polymerisation von Butylcyanoacrylat (BCA) wird Sicomet 6000 verwendet. Der Polymerisationsprozess erfolgt durch langsames, permanentes Zutropfen von insgesamt 2,5% [m/v] BCA in eine 1%-ige [m/v] Triton X-100 Lösung in eine saure Lösung (pH 1 ,5 - pH 2,5, ideal pH 2,2). Der pH-Wert wird mit Hilfe einer 0,1 N-HCI-Lösung zuvor eingestellt. Die entstehende Dispersion wird unter Kühlung im Eisbad (ca. 4°C) über 4 Stunden konstant bei 450 U/min gerührt. Anschließend werden größere Agglomerate durch Filtration über einen Papier- Faltenfilter abgetrennt. Durch Zusatz von Methanol (oder anderer geeigneter Alkohole wie Ethanol) wird das zu PBCA polymerisierte BCA ausgefällt und der davon gewonnene Filterrückstand mehrere Male mit gereinigtem Wasser (MilliQ-System) gewaschen. Nach der Trocknung des PBCA-Filterrückstandes im Trockenschrank bei 400C über 24 h wird mittels GPC ein durchschnittliches Molekulargewicht bestimmt (Mn ~ 2000 Da). Es werden Polysterolstandards verwendet.Sicomet 6000 is used for PBCA production by anionic polymerization of butyl cyanoacrylate (BCA). The polymerization process is carried out by slow, permanent dropwise addition of a total of 2.5% [m / v] BCA in a 1% [m / v] Triton X-100 solution in an acidic solution (pH 1, 5 - pH 2.5 , ideal pH 2.2). The pH is previously adjusted by means of a 0.1 N HCl solution. The resulting dispersion is stirred while cooling in an ice bath (about 4 ° C) for 4 hours constantly at 450 U / min. Subsequently, larger agglomerates are separated by filtration through a paper pleated filter. By addition of methanol (or other suitable alcohols, such as ethanol), the BCA polymerized to PBCA is precipitated and the resulting filter cake is washed several times with purified water (MilliQ system). After the drying of the PBCA filter residue in a drying oven at 40 0 C for 24 h by GPC a number average molecular weight determined (Mn ~ 2000 Da). Polystyrene standards are used.
Zur besonderen Aufreinigung des in Methanol ausgefällten PBCAs kann dieses nochmals in Tetrahydrofuran gelöst und anschließend mit Heptan wiederum ausgefällt werden. Der durch Filtration (Faltenfilter, Nutsche o.a.) gewonnene Rückstand wird mit Heptan 2-n mal nachgespült. Der Rückstand wird bis zur Gewichtskonstanz im Trockenschrank bei 40-50 0C getrocknet (ca. 4 Tage).For the particular purification of the precipitated in methanol PBCA this can be redissolved in tetrahydrofuran and then precipitated again with heptane. The residue obtained by filtration (pleated filter, suction filter or the like) is rinsed with heptane 2-n times. The residue is dried to constant weight in a drying oven at 40-50 0 C (about 4 days).
Beispiel 2: Herstellung von Epothilon beladenen PBCA-P(DMAEMA) Nanopartikel durch Nanopräzipitation a) Herstellung des Polymer-Substanz-Gemisches (= Misch ungl) und der Tensidlösung In ein Schraubvial (50 ml) werden 30 ml einer 4%igen acetonischen PBCA- Lösung (m/v), 3 ml einer 4%igen acetonischen PDMAEMA-Lösung (m/v) sowie 3 ml einer acetonischen Epothilon-Lösung (Konzentration ca. 60 mg/ml) einpipettiert und nach Verschluss mit einem Schraubdeckel unter Schütteln gut durchmischt (=Mischung 1). Das verwendete PBCA wird mittels Beispiel 1 hergestellt. Je 10 ml einer 1%igen Synperonic T707-Lösung (m/v) werden in ein 20 ml Schraubglas mit Magnetrührkern vorgelegt. b) Herstellung der Partikeldispersion durch NanopräzipitationExample 2 Production of Epothilone-loaded PBCA-P (DMAEMA) Nanoparticles by Nanoprecipitation a) Preparation of the Polymer-Substance Mixture (= Misch ungl) and the Tensidlösung Into a screw vial (50 ml) are added 30 ml of a 4% acetone PBCA solution (m / v), 3 ml of a 4% solution of PDMAEMA acetone (m / v) and 3 ml of an acetone epothilone solution (concentration approx 60 mg / ml) and mix well with a screw cap after shaking with a shaker (= mixture 1). The PBCA used is prepared by Example 1. 10 ml of a 1% Synperonic T707 solution (m / v) are placed in a 20 ml screw-capped magnetic stirrer tube. b) Preparation of the particle dispersion by nanoprecipitation
Bei hoher Rührgeschwindigkeit (600 U/min) werden 1 ,2 ml der Mischung 1 zu 10 ml Tensidlösung zügig einpipettiert. Nach 2-3 h wird bei niedrigerer Rührstufe (100 U/min) für weitere ca.18-24 h das restliche Aceton unter dem Abzug abgedampft. c) Aufarbeitung der PartikelansätzeAt a high stirring speed (600 rpm), 1, 2 ml of the mixture 1 are rapidly pipetted into 10 ml of surfactant solution. After 2-3 h, the residual acetone is evaporated off under reduced pressure at a lower stirring stage (100 rpm) for a further approx. 18-24 h. c) workup of the particle approaches
20 Ansätze nach Herstellungsanweisung a,b werden zu einem Ansatz vereinigt und aufgearbeitet. Kristallines, nicht verkapseltes Epothilon wird mittels eines 1 μm Glasfaserfilters (PALL, 25 mm, 1 μm P/N 4523T) abgetrennt. Die Aufreinigung des Filtrates erfolgt unter Nutzung einer Amicon-Ultrafiltrationszelle 8050 unter Verwendung einer Polyethersulfon-Filtermembran (100 kDa). Zur Aufreinigung wird das Filtrat auf ca. 1/3 des Volumens eingeengt und anschließend das Konzentrat durch Zugabe einer 1%igen Synperonic T707- Lösung wieder auf das Ausgangsvolumen gebracht. Es folgt ein erneutes Einengen. Dieser Prozess wird zweimal wiederholt und die Zielkonzentration der Epothilon-Partikeldispersion wird über das Endvolumen der Lösung eingestellt (Epothilongehalt 0,1- 2mg/ml).20 batches according to manufacturing instructions a, b are combined into one approach and worked up. Crystalline, unencapsulated epothilone is separated by means of a 1 μm glass fiber filter (PALL, 25 mm, 1 μm P / N 4523T). The filtrate is purified using an Amicon ultrafiltration cell 8050 using a 100 kDa polyethersulfone filter membrane. For purification, the filtrate is concentrated to about 1/3 of the volume and then the concentrate is brought back to the starting volume by adding a 1% Synperonic T707 solution. It follows a renewed narrowing. This process is repeated twice and the target concentration of the epothilone particle dispersion is adjusted via the final volume of the solution (epothilone content 0.1-2 mg / ml).
Beispiel 3: Herstellung von Epothilon beladenen PBCA-P(DMAPMAM) Nanopartikel durch Nanopräzipitation a) Herstellung des Polymer-Substanz-Gemisches (= Mischungl) und der Tensidlösung In ein Schraubvial (50 ml) werden 30 ml einer 4%igen acetonischen PBCA- Lösung (m/v), 3 ml einer 4%igen acetonischen PDMAPMAM-Lösung (m/v) sowie 3 ml einer acetonischen Epothilon-Lösung (Konzentration ca. 60 mg/ml) einpipettiert und nach Verschluss mit einem Schraubdeckel unter Schütteln gut durchmischt (=Mischung 1 ). Das verwendete PBCA wird mittels Beispiel 1 hergestellt. Je 10 ml einer 1%igen Synperonic T707-Lösung (m/v) werden in ein 20 ml Schraubglas mit Magnetrührkern vorgelegt. b) Herstellung der Partikeldispersion durch Nanopräzipitation Bei hoher Rührgeschwindigkeit (600 U/min) werden 1 ,2 ml der Mischung 1 zu 10 ml Tensidlösung zügig einpipettiert. Nach 2-3 h wird bei niedrigerer Rührstufe (100 U/min) für weitere ca.18-24 h das restliche Aceton unter dem Abzug abgedampft. c) Aufarbeitung der Partikelansätze 20 Ansätze nach Herstellungsanweisung a,b werden zu einem Ansatz vereinigt und aufgearbeitet. Kristallines, nicht verkapseltes Epothilon wird mittels eines 1 μm Glasfaserfilters (PALL, 25 mm, 1 μm P/N 4523T) abgetrennt. Die Aufreinigung des Filtrates erfolgt unter Nutzung einer Amicon-Ultrafiltrationszelle 8050 unter Verwendung einer Polyethersulfon-Filtermembran (100 kDa). Zur Aufreinigung wird das Filtrat auf ca. 1/3 des Volumens eingeengt und anschließend das Konzentrat durch Zugabe einer 1 %igen Synperonic T707- Lösung wieder auf das Ausgangsvolumen gebracht. Es folgt ein erneutes Einengen. Dieser Prozess wird zweimal wiederholt und die Zielkonzentration der Epothilon-Partikeldispersion wird über das Endvolumen der Lösung eingestellt (Epothilongehalt 0,1- 2mg/ml).Example 3: Preparation of Epothilone-loaded PBCA-P (DMAPMAM) Nanoparticles by Nanoprecipitation a) Preparation of the Polymer-Substance Mixture (= Mixture) and the Surfactant Solution In a screw vial (50 ml) are added 30 ml of a 4% acetone PBCA solution (m / v), 3 ml of a 4% acetone PDMAPMAM solution (m / v) and 3 ml of an acetone epothilone solution (concentration about 60 mg / ml) pipetted in and after closure with a screw cap with shaking well mixed (= mixture 1). The PBCA used is prepared by Example 1. 10 ml of a 1% Synperonic T707 solution (m / v) are placed in a 20 ml screw-capped magnetic stirrer tube. b) Production of the Particle Dispersion by Nanoprecipitation At a high stirring speed (600 rpm), 1, 2 ml of the mixture 1 are rapidly pipetted into 10 ml of surfactant solution. After 2-3 h, the residual acetone is evaporated off under reduced pressure at a lower stirring stage (100 rpm) for a further approx. 18-24 h. c) Processing of the Particle Batches 20 Batches according to preparation instructions a, b are combined into one batch and worked up. Crystalline, unencapsulated epothilone is separated by means of a 1 μm glass fiber filter (PALL, 25 mm, 1 μm P / N 4523T). The filtrate is purified using an Amicon ultrafiltration cell 8050 using a 100 kDa polyethersulfone filter membrane. For purification, the filtrate is concentrated to about 1/3 of the volume and then the concentrate is brought back to the starting volume by adding a 1% Synperonic T707 solution. It follows a renewed narrowing. This process is repeated twice and the target concentration of the epothilone particle dispersion is adjusted via the final volume of the solution (epothilone content 0.1-2 mg / ml).
Beispiel 4: Herstellung von Epothilon beladenen PLGA-P(DMAEMA)Example 4: Preparation of epothilone-loaded PLGA-P (DMAEMA)
Nanopartikeln durch Nanopräzipitation a) Herstellung des Polymer-Substanz-Gemisches (= Mischung 1) In ein Schraubvial (50 ml) werden 30 ml einer 4%igen acetonischen PLGA-Nanoparticles by Nanoprecipitation a) Preparation of the Polymer-Substance Mixture (= Mixture 1) Into a screw vial (50 ml) are added 30 ml of a 4% acetone-PLGA reagent.
Lösung (m/v) (PLGA RG 752S), 3 ml einer 4%igen acetonischen PDMAEMA-Solution (m / v) (PLGA RG 752S), 3 ml of a 4% acetone PDMAEMA-
Lösung (m/v) sowie 3 ml einer acetonischen Epothilon-Lösung (Konzentration ca. 60 mg/ml) einpipettiert und nach Verschluss mit einem Schraubdeckel unterSolution (m / v) and 3 ml of an acetone epothilone solution (concentration about 60 mg / ml) pipetted and after closure with a screw under
Schütteln gut durchmischt. b) Herstellung der TensidlösungShaking well mixed. b) Preparation of the surfactant solution
Je 10 ml einer 1%igen Synperonic T707-Lösung (m/v) werden in ein 20 ml10 ml of a 1% Synperonic T707 solution (m / v) are added to a 20 ml
Schraubglas mit Magnetrührkern vorgelegt. c) Herstellung der Partikeldispersion durch Nanopräzipitation Unter hoher Rührgeschwindigkeit (600 U/min) werden 1 ,2 ml der Mischung 1 zu 10 ml Tensidlösung zügig ein pipettiert. Nach 2-3 h wird bei niedrigerer Rührstufe (100 U/min) für weitere ca.18-24 h das restliche Aceton unter dem Abzug abgedampft. d) Aufarbeitung der PartikelansätzeScrewed glass with magnetic stirrer presented. c) Preparation of the particle dispersion by nanoprecipitation At a high stirring speed (600 rpm), 1, 2 ml of the mixture 1 are rapidly pipetted into 10 ml of surfactant solution. After 2-3 h, the residual acetone is evaporated off under reduced pressure at a lower stirring stage (100 rpm) for a further approx. 18-24 h. d) workup of the particle mixtures
20 Ansätze nach Herstellungsanweisung a-c werden zu einem Ansatz vereinigt und aufgearbeitet. Kristallines, nicht verkapseltes Epothilon wird mittels eines 1 μm Glasfaserfilters (PALL, 25 mm, 1 μm P/N 4523T) abgetrennt. Die Aufreinigung des Filtrates erfolgt unter Nutzung einer Amicon-Ultrafiltrationszelle 8050 unter Verwendung einer Polyethersulfon-Filtermembran (100 kDa). Zur Aufreinigung wird das Filtrat auf ca. 1/3 des Volumens eingeengt und anschließend das Konzentrat durch Zugabe einer 1%igen Synperonic T707- Lösung wieder auf das Ausgangsvolumen gebracht. Es folgt ein erneutes Einengen. Dieser Prozess wird zweimal wiederholt und die Zielkonzentration der Epothilon-Partikeldispersion wird über das Endvolumen der Lösung eingestellt.20 batches according to manufacturing instructions a-c are combined into a single approach and worked up. Crystalline, unencapsulated epothilone is separated by means of a 1 μm glass fiber filter (PALL, 25 mm, 1 μm P / N 4523T). The filtrate is purified using an Amicon ultrafiltration cell 8050 using a 100 kDa polyethersulfone filter membrane. For purification, the filtrate is concentrated to about 1/3 of the volume and then the concentrate is brought back to the starting volume by adding a 1% Synperonic T707 solution. It follows a renewed narrowing. This process is repeated twice and the target concentration of the epothilone particle dispersion is adjusted over the final volume of the solution.
Beispiel 5: Herstellung von farbstoffbeladenen PBCA-Nanopartikeln durch NanopräzipitationExample 5: Preparation of Dye-loaded PBCA Nanoparticles by Nanoprecipitation
i) PBCA-P(DMAEMA) Nanopartikel (mit ICG, DODC, IDCC oder Cumarin 6)i) PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles (with ICG, DODC, IDCC or Coumarin 6)
Es werden 500 μl einer 2%-igen acetonischen PBCA-Lösung [m/v] mit 100 μl einer 2%-igen acetonischen P(DMAEMA)-Lösung [m/v] unter Verschluss (um ein Abdampfen des Acetons zu verhindern) mittels eines Standard- Laborschüttlers gut durchmischt. Das dafür verwendete PBCA wird gemäß Beispiel 1 hergestellt. Zu diesem Polymergemisch werden je 100 μl der im folgenden beschriebenen Farbstofflösungen zugesetzt.500 μl of a 2% acetone PBCA solution [m / v] are added with 100 μl of a 2% acetone P (DMAEMA) solution [m / v] under occlusion (to prevent evaporation of the acetone) of a standard laboratory shaker. The PBCA used for this is prepared according to Example 1. 100 μl each of the dye solutions described below are added to this polymer mixture.
Farbstofflösung a: 3 mg des Indocyaningrün werden in 300 μl gereinigtem Wasser im Ultraschallbad vorgelöst und dann mit 700 μl Aceton versetzt. Farbstofflösung b, c, d: Die Farbstoffe DODC, IDCC und Cumarin 6 werden in einer 0,02%-igen acetonischen Lösung [m/v] eingesetzt.Dye solution a: 3 mg of indocyanine green are pre-dissolved in 300 μl of purified water in an ultrasonic bath and then treated with 700 μl of acetone. Dye Solution b, c, d: The dyes DODC, IDCC and coumarin 6 are used in a 0.02% acetone solution [m / v].
Das durchmischte Farbstoff-Polymergemisch wird mit einer 2,5 ml Eppendorfpipette aufgenommen und in 10 ml einer intensiv gerührten 1 %-igen [m/v] Synperonic T707 Lösung einpipettiert. Die Nanopartikeldispersion wird für 2 h bei 600 U/min (Standard Magnetrührer) und für weitere 16 h bei 100 U/min zum vollständigen Abdampfen des Lösungsmittels gerührt. Die Aufarbeitung erfolgt durch Zentrifugation in Eppendorf-Caps. Jeweils 1 ml der Partikeldispersion und 0,5 ml einer 1 %-igen [m/v] CETAC-Lösung (Cetyltrimethylammoniumchlorid-Lösung) werden nach Durchmischung für 10 min bei 14000 UpM (auf einer Sigma 2 K 15 Laborzentrifuge) zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, die Partikel in der 1%-igen CETAC-Lösung redispergiert und erneut zentrifugiert. Dieser Waschprozess wird drei mal wiederholt, wobei zum Schluss die Partikel in einer 1 %-igen Lösung Synperonic T707 aufgenommen werden.The mixed dye-polymer mixture is taken up in a 2.5 ml Eppendorf pipette and in 10 ml of an intensely stirred 1% [m / v] Synperonic T707 solution pipetted. The nanoparticle dispersion is stirred for 2 h at 600 rpm (standard magnetic stirrer) and for a further 16 h at 100 rpm for complete evaporation of the solvent. The workup is carried out by centrifugation in Eppendorf Caps. In each case 1 ml of the particle dispersion and 0.5 ml of a 1% [m / v] CETAC solution (cetyltrimethylammonium chloride solution) are centrifuged after mixing for 10 min at 14000 rpm (on a Sigma 2 K 15 laboratory centrifuge). The supernatant is removed, the particles are redispersed in the 1% CETAC solution and recentrifuged. This washing process is repeated three times, and finally the particles are taken up in a 1% solution of Synperonic T707.
H) PBCA-tPEMDCq-NanopartikelH) PBCA-tPEMDCq nanoparticles
Es werden 500 μl einer 2%-igen acetonischen PBCA-Lösung [m/v] mit PEI 1 ,8 kDa in Isopropanol (2% [m/v]) verwendet. Es werden je 100 μl der unter i) genannten Farbstofflösungen a-d verwendet.500 μl of a 2% acetone PBCA solution [m / v] with PEI 1.8 kDa in isopropanol (2% [m / v]) are used. In each case, 100 μl of the dye solutions a-d mentioned under i) are used.
Das durchmischte Farbstoff-Polymergemisch wird mit einer 2,5 ml Eppendorfpipette aufgenommen und in 10 ml einer intensiv gerührten 1 %-igen Triton X-100 Lösung einpipettiert. Die Nanopartikeldispersion wird für 2 h bei 600 U/min (Standard Magnetrührer) und für weitere 16 h bei 100 U/min zum vollständigen Abdampfen des Lösungsmittels gerührt. Die Aufarbeitung erfolgt durch Zentrifugation in Eppendorf-Caps. Jeweils 1 ml der Partikeldispersion und 0,5 ml einer 1%-igen [m/v] CETAC-Lösung (Cetyltrimethylammoniumchlorid- Lösung) werden nach Durchmischung für 10 min bei 14000 UpM (auf einer Sigma 2 K 15 Laborzentrifuge) zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, die Partikel in der 1 %-igen CETAC-Lösung redispergiert und erneut zentrifugiert. Dieser Waschprozess wird drei mal wiederholt, wobei zum Schluss die Partikel in einer 1%-igen Lösung Triton X-100 aufgenommen werden.The mixed dye-polymer mixture is taken up with a 2.5 ml Eppendorf pipette and pipetted into 10 ml of an intensely stirred 1% Triton X-100 solution. The nanoparticle dispersion is stirred for 2 h at 600 rpm (standard magnetic stirrer) and for a further 16 h at 100 rpm for complete evaporation of the solvent. The workup is carried out by centrifugation in Eppendorf Caps. In each case 1 ml of the particle dispersion and 0.5 ml of a 1% [m / v] CETAC solution (cetyltrimethylammonium chloride solution) are centrifuged after mixing for 10 min at 14000 rpm (on a Sigma 2 K 15 laboratory centrifuge). The supernatant is removed, the particles are redispersed in the 1% CETAC solution and recentrifuged. This washing process is repeated three times, and finally the particles are taken up in a 1% Triton X-100 solution.
Beispiel 6: Beeinflussung der Nanopräzipitation durch Veränderung des Polymergehaltes in der Tensidphase In Fig. 4 ist dargestellt, dass die Partikelgröße der PBCA-P(DMAEMA)- Nanopartikel während der Herstellung durch Variation der Polymerkonzentration gesteuert werden kann. Die Stabilisierung der PBCA-P(DMAEMA) Nanopartikel, welche gemäß Beispiel 2 (jedoch ohne Epothilon) hergestellt werden, erfolgt mit dem Tensid Synperonic T707. Während der Partikelherstellung (Nanopräzipitation) wird das in die Tensidphase injizierte Volumen der organischen Polymerlösung konstant gehalten und nur die Polymerkonzentration entsprechend verändert. Alle weiterenExample 6: Influence of Nanoprecipitation by Changing the Polymer Content in the Surfactant Phase FIG. 4 shows that the particle size of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles can be controlled during production by varying the polymer concentration. The stabilization of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles prepared according to Example 2 (but without epothilone) is carried out with the Synperonic T707 surfactant. During particle production (nanoprecipitation), the volume of the organic polymer solution injected into the surfactant phase is kept constant and only the polymer concentration is changed accordingly. All further
Herstellungsbedingungen (Tensidkonzentration, Polymerverhältnis PBCA:P(DMAEMA)=10:1 , Temperatur, Rührgeschwindigkeit / Rührfisch, Gefäß, Art der Injektion) bleiben konstant.Production conditions (surfactant concentration, polymer ratio PBCA: P (DMAEMA) = 10: 1, temperature, stirring speed / stirring fish, vessel, type of injection) remain constant.
Die Verwendung einer geringeren Polymerkonzentration in der Tensidphase während der Fällung führt zu kleineren Partikeldurchmessern. Über den untersuchten Zeitraum wurde keine Veränderung der Partikelgröße bei gleichem Polymergehalt festgestellt.The use of a lower polymer concentration in the surfactant phase during the precipitation results in smaller particle diameters. Over the period studied, no change in particle size was observed for the same polymer content.
Beispiel 7: Elektrostatische Oberflächenmodifikation von Epothilon beladenen PBCA-PDMAEMA-Nanopartikeln mit GIu(10)-b-PEG(110)Example 7: Electrostatic surface modification of epothilone-loaded PBCA-PDMAEMA nanoparticles with Glu (10) -b-PEG (110)
Die hier verwendeten Epothilon-PBCA-PDMAEMA-Nanopartikel werden gemäß Beispiel 2 hergestellt.The epothilone-PBCA-PDMAEMA nanoparticles used here are prepared according to Example 2.
Zur Modifikation der Partikeloberfläche wird die wässrige, stabile Nanopartikeldispersion in einem geeigneten Mengenverhältnis mit dem in Wasser gelösten modifizierenden Agens (GIu(10)-b-PEG(110)/Glu(10)-b- PEG(114)) vermischt. Die Bestimmung des geeigneten Mengenverhältnisses erfolgt durch schrittweise Titration der Partikeldispersion mit dem modifizierenden Agens. Das Ausmaß der elektrostatischen Oberflächenmodifikation (Ladungstitration) wird durch Bestimmung des Zetapotentials kontrolliert.In order to modify the particle surface, the aqueous, stable nanoparticle dispersion is mixed in a suitable quantitative ratio with the modifying agent (Glu (10) -b-PEG (110) / Glu (10) -b-PEG (114) dissolved in water). The determination of the appropriate quantitative ratio is carried out by stepwise titration of the particle dispersion with the modifying agent. The degree of electrostatic surface modification (charge titration) is controlled by determining the zeta potential.
Dargestellt ist in Fig. 3a) die Veränderung des Zetaptentials von (+) 25 mV auf ca. (-) 30 mV, bzw. Fig. 3b) von +35 mV auf -10 mV, durch schrittweise Zugabe des modifizierenden Agens (GIu(10)-b-PEG(110)) bzw. GIu(10)-b-PEG(114) zur Partikeldispersion (Ladungstitration).Shown in Fig. 3a) is the change of the zeta potential from (+) 25 mV to about (-) 30 mV, or Fig. 3b) from +35 mV to -10 mV, by stepwise addition of the modifying agent (Glu (10) -b-PEG (110)) or Glu (10) -b-PEG (114) for particle dispersion (charge titration).
Beispiel 8: REM-Aufnahmen von Epothilon beladenen PBCA-P(DMAEMA)- NanopartikelnExample 8: SEM images of epothilone-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles
Die Epothilon beladenen PBCA-P(DMAEMA) werden gemäß Beispiel 2 hergestellt.The epothilone-loaded PBCA-P (DMAEMA) are prepared according to Example 2.
In Fig. 5 ist eine REM-Aufnahme von Epothilon-beladenen PBCA-P(DMAEMA)- Nanopartikeln dargestellt.FIG. 5 shows an SEM micrograph of epothilone-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles.
Beispiel 9: ZellkulturversucheExample 9: Cell culture experiments
Die Kultivierung der HeLa-Zelllinie erfolgt in 225 cm2 Kulturflaschen bei 37 0C und 5% CO2 in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) unter Zusatz vonCultivation of the HeLa cell line is carried out in 225 cm 2 culture flasks at 37 ° C. and 5% CO 2 in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) with the addition of
10% fötalem Kälbermedium (FCS) und 2 mM L-Glutamin. Auf antibiotische10% fetal calf medium (FCS) and 2 mM L-glutamine. On antibiotic
Zusätze (Penicillin / Streptamycin) wird verzichtet, um die Zellprozesse möglichst wenig zu beeinflussen. Die Zellen werden regelmäßig passagiert und eine Aussaat zu Versuchszwecken erfolgt 24 h vor Beginn der Untersuchungen. Für die Untersuchungen werden die Zellen in 96-Wellplatten der FirmaAdditives (penicillin / streptamycin) are dispensed with in order to influence the cell processes as little as possible. The cells are passaged regularly and sowed for experimental purposes 24 hours before the start of the investigations. For the investigations, the cells are in 96-well plates of the company
Falcon/Becton Dickinson ausgesät.Seeded Falcon / Becton Dickinson.
Vor Versuchsbeginn erfolgt eine optische Kontrolle bezüglich der Vitalität bzw. typischen Morphologie der Zellen. Anschließend wird das FCS-haltige Medium abgesaugt und durch 50 μl serumfreies Medium ersetzt.Before the start of the test, a visual check is carried out regarding the vitality or typical morphology of the cells. Subsequently, the FCS-containing medium is aspirated and replaced with 50 .mu.l of serum-free medium.
Nach einer maximal 60-minütigen Inkubationszeit einer Nanopartikeldispersion, welche gemäß Beispiel 5i (Cumarin 6 beladene Nanopartikel) hergestellt wird, wird die überstehende Partikeldispersion abgesaugt und die Zellen mit PBS 2-3 mal gewaschen. Zum Anfärben der Mitochondrien wird der zuvor in Medium verdünnte Farbstoff MitoTracker Red CMXRos der Firma Molecular Probes Europe BV, Leiden (NL) (0,25μl/ml) verwendet. Die Inkubation mit 50 μl der Farbstofflösung erfolgt für 15 min im Brutschrank (37°C, 5% CO2). Anschließend wird die Farbstofflösung abgesaugt und die Zellen 2-3 mal mitAfter a maximum of 60 minutes incubation time of a nanoparticle dispersion, which is prepared according to Example 5i (Coumarin 6 loaded nanoparticles), the supernatant particle dispersion is aspirated and the cells washed 2-3 times with PBS. For staining the mitochondria, the MitoTracker Red CMXRos dye, previously diluted in medium, from Molecular Probes Europe BV, Leiden (NL) (0.25 μl / ml) is used. Incubation with 50 μl of the dye solution takes place in the incubator for 15 min (37 ° C., 5% CO 2 ). Then the dye solution is aspirated and the cells with 2-3 times
PBS gewaschen. Die Fixierung der Zellen erfolgt mit 100 μl 1 ,37% Formaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur. Nach Absaugen der Fixierlösung werden die Zellen 2-3 mal mit PBS gewaschen. Die Zellkernfärbung erfolgt bei den bereits fixierten Zellen mit Höchst 33342. Dafür werden 100 μl der in PBS verdünnten Farbstofflösung (2 μg/ml) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Farbstofflösung werden die Zellen mit 100 μl PBS 2-3 mal gewaschen. Die fixierten Platten werden bis zur fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung mit 200 μl PBS/Well lichtgeschützt im Kühlschrank bei 8°C aufbewahrt.PBS washed. The fixation of the cells is carried out with 100 ul of 1, 37% formaldehyde for 10 min at room temperature. After aspirating the fixing solution, the cells are washed 2-3 times with PBS. Nuclear staining takes place on the already fixed cells with a maximum of 33342. For this purpose, 100 μl of the dye solution diluted in PBS (2 μg / ml) are incubated for 10 min at room temperature. After removing the dye solution, the cells are washed with 100 μl PBS 2-3 times. The fixed plates are stored in the refrigerator until the fluorescence microscopic examination with 200 .mu.l PBS / Well protected from light in the refrigerator at 8 ° C.
Beispiel 10: Einfluss funktionalisierter Partikeloberflächen auf die ZellaufnahmeExample 10: Influence of functionalized particle surfaces on cell uptake
Tab. 1 : Partikeldurchmesser dhyd, Polydispersitätsindex und ZetapotentialTab. 1: particle diameter dhyd, polydispersity index and zeta potential
(nicht)-funktionalisierter Cumarin 6 beladener PBCA-P(DMAEMA)- Nanopartikel (NP)(non) functionalized coumarin 6-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles (NP)
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Figure imgf000056_0001
Die in Beispiel 9 verwendeten Nanopartikel werden gemäß Beispiel 5 hergestellt. Unmodifiziert bzw. nach elektrostatischer Oberflächenmodifikation mit Folsäure oder GIu(10)-b-PEG(110) weisen die Partikel die in der Tabelle 1 gelisteteten Eigenschaften auf.The nanoparticles used in Example 9 are prepared according to Example 5. Unmodified or after electrostatic surface modification with folic acid or Glu (10) -b-PEG (110), the particles have the properties listed in Table 1.
In der für den Versuch verwendeten 96-Wellplatte haben alle Wells die gleiche Zelldichte (Aussaat 24 h vor Versuch: 1x104 Zellen). Inkubiert wird eine konstante Partikelkonzentration der in der Tabelle (Tab. 1) aufgeführten Partikel über einen Zeitraum von 60 Minuten im Brutschrank. Anschließend werden die Zellen gewaschen, fixiert und am Folgetag vermessen. Die Aufnahme der fluoreszierenden Zellen erfolgt mit einem automatischen Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung und konstanter Belichtungszeit (siehe Fig. 6). Anhand von Fig. 6 wird gezeigt, wie durch unterschiedliche Oberflächeneigenschaften von ein- und derselben Nanopartikelcharge das Zellaufnahmeverhalten beeinflusst wird. Unmodifizierte Partikel in Reihe 1.) mit einem kationischem Oberflächenpotential zeigen eine höhere Affinität zur Zelloberfläche, erkennbar am stärkeren Fluoreszenzkontrast auf bzw. in den Zellen. Die ebenso effektive Internalisierung von Partikeln mit negativem Oberflächenpotential nach Titration mit GIu(10)-b-PEG(110) kann anhand des vergrößerten Ausschnittes der Zellen aus Reihe 3.) gezeigt werden.In the 96-well plate used for the experiment all wells have the same cell density (sowing 24 h before experiment: 1x10 4 cells). A constant particle concentration of the particles listed in the table (Table 1) is incubated in the incubator over a period of 60 minutes. Subsequently, the cells are washed, fixed and measured on the following day. The recording of fluorescent cells is carried out with an automatic fluorescence microscope at 20x magnification and constant exposure time (see Fig. 6). Based on FIG. 6 it is shown how the cell uptake behavior is influenced by different surface properties of one and the same nanoparticle charge. Unmodified particles in series 1.) with a cationic surface potential show a higher affinity for the cell surface, recognizable by the stronger fluorescence contrast on or in the cells. The equally effective internalization of particles with negative surface potential after titration with Glu (10) -b-PEG (110) can be shown by the enlarged section of the cells from row 3.).
Beispiel 11 : Zellaufnahmeverhalten Glu(10)-b-PEG(110) modifizierter PBCA P(DMAEMA)-Nanopartikel, beladen mit Cumarin 6 (Fluoreszenzfarbstoff zur in vitro Detektion)Example 11: Cell uptake behavior Glu (10) -b-PEG (110) modified PBCA P (DMAEMA) nanoparticle loaded with coumarin 6 (fluorescent dye for in vitro detection)
Die in Beispiel 9 verwendeten Nanopartikel werden gemäß Beispiel 5 hergestellt. Nach elektrostatischer Oberflächenmodifikation mit GIu(10)-b- PEG(HO) wird das Zellaufnahmeverhalten der Partikel (dhyd = 171 nm; ZP = -33 mV) untersucht.The nanoparticles used in Example 9 are prepared according to Example 5. After electrostatic surface modification with Glu (10) -b-PEG (HO), the cell uptake behavior of the particles (d h y d = 171 nm, ZP = -33 mV) is investigated.
Die hell fluoreszierenden Punkte, bei welchen es sich um Endosomen oder Endolysosomen handelt, sind Beleg für eine effiziente Aufnahme der Nanopartikel in die Zelle mittels Endozytose (Fig. 7). Der Maßstab der Vergrößerung belegt, dass in dieser Aufnahme einzelne Partikel aufgrund ihrer Größe von weniger als 200 nm nicht sichtbar sein können. Eine Vielzahl von Partikeln innerhalb dieser Vesikel (Endosomen/Endolysosomen) verursachen den starken, punktförmigen Fluoreszenzkontrast im Cytoplasma. Die Zellaufnahme von PBCA-P(DMAEMA)-Nanopartikeln oberflächenmodifiziert mit GIu(10)-b-PEG(110) wird in Fig. 8 schematisch dargestellt.The brightly fluorescent dots, which are endosomes or endolysosomes, are evidence of efficient uptake of the nanoparticles into the cell by endocytosis (Figure 7). The scale of the magnification proves that in this photograph individual particles can not be visible due to their size of less than 200 nm. A large number of particles within these vesicles (endosomes / endolysosomes) cause strong, punctate fluorescence contrast in the cytoplasm. Cell uptake of PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles surface-modified with Glu (10) -b-PEG (110) is shown schematically in FIG.
Beispiel 12: Anreicherung der GIu(10)-b-PEG(110) modifizierten PBCA P(DMAEMA)-Nanopartikel im Zellkern Anhand der Aufnahme der mittleren Zellebene mit Hilfe des konfokalen Laser- Raster-Mikroskops (Fig. 9) kann gezeigt werden, dass eine partielle Anreicherung der Partikel im Zellkern stattfindet.Example 12: Enrichment of the GIu (10) -b-PEG (110) Modified PBCA P (DMAEMA) Nanoparticles in the Nucleus On the basis of the recording of the central cell plane with the aid of the confocal laser scanning microscope (FIG. 9), it can be shown that partial accumulation of the particles takes place in the cell nucleus.
Beispiel 13: Gesteigerte Partikelaufnahme bei Inkubation höherer PatikelkonzentrationExample 13: Increased particle uptake with incubation of higher particle concentrations
Cumarin 6 beladene, GIu(10)-b-PEG(110) oberflächenmodifizierte PBCA- P(DMAEMA)-Partikel werden gemäß Beispiel 5 hergestellt. Es wird eine niedrige Partikelkonzentration 0,21 mg/ml (Fig. 10) und eine höhere Partikelkonzentration von 0,85 mg/ml (Fig. 11 ) für den gleichen Zeitraum inkubiert auf den Zellen gemäß Beispiel 9 inkubiert. Fig. 11 zeigt im Verhältnis zu Fig. 10 eine gesteigerte Partikelaufnahme bei Inkubation einer höheren Patikelkonzentration.Coumarin 6 loaded, Glu (10) -b-PEG (110) surface-modified PBCA-P (DMAEMA) particles are prepared according to Example 5. A low particle concentration of 0.21 mg / ml (FIG. 10) and a higher particle concentration of 0.85 mg / ml (FIG. 11) are incubated for the same period incubated on the cells according to example 9. Fig. 11 shows in relation to Fig. 10 an increased particle uptake with incubation of a higher particle concentration.
Beispiel 14: Charakterisierung der PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]-NanopartikelExample 14: Characterization of the PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles
Dargestellt ist die Partikelgröße (Fig. 13) der für den Tierversuch verwendeten oberflächenmodifizierten PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]-Nanopartikel über einen Zeitraum von 7 Tagen nach Herstellung für den Tierversuch. Die konstante Partikelgröße sowie der gleich bleibend niedrige Polydispersitätsindex (PI<0,1 ) als Merkmal für eine sehr enge Partikelgrößenverteilung sind Beweis für eine gute Stabilität der oberflächenmodifizierten Partikel.Shown is the particle size (Figure 13) of the surface-modified PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles used for the animal experiment over a period of 7 days after preparation for the animal experiment. The constant particle size and the consistently low polydispersity index (PI <0.1) as a feature of a very narrow particle size distribution are evidence of a good stability of the surface-modified particles.
Anhand der REM-Aufnahme (Fig. 12) kann zusätzlich belegt werden, dass es sich um sphärische Nanopartikel mit einer Größe um 200 nm handelt.On the basis of the SEM image (FIG. 12), it can additionally be demonstrated that they are spherical nanoparticles with a size around 200 nm.
Mittels Ladungstitration wird die kationische Oberfläche der PBCA-P(DMAEMA)- Nanopartikel mit dem Blockcopolymer GIu(10)-b-PEG(110) modifiziert (siehe Fig. 14). Die als Zetapotential gemessene Oberflächenladung wird entsprechend von ca. +3OmV über den Neutralpunkt hinaus bis zum Erreichen des Dissoziations-Gleichgewichtes bei etwa -30 mV titriert. Die oberflächenmodifizierten PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]-Partikel zeigen über den untersuchten Zeitraum von 7 Tagen nach Titration keine Veränderung des Zetapotentials. Im Zusammenhang mit der unveränderten Partikelgröße sowie dem konstant niedrigen PI kann somit eine gute Partikelstabilität belegt werden.Charge titration is used to modify the cationic surface of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles with the block copolymer Glu (10) -b-PEG (110) (see FIG. 14). The surface charge measured as zeta potential will correspondingly increase from approx. +3 ohms above the neutral point until it reaches its neutral point of the dissociation equilibrium at about -30 mV. The surface-modified PBCA [P (DMAEMA) -ICG] particles show no change in the zeta potential over the investigated period of 7 days after titration. In connection with the unchanged particle size and the constant low PI, a good particle stability can be proven.
In Fig. 15 sind die UV-Vis-Absorptionsspektren einer wässrigen ICG-Lösung als auch der ICG-Nanopartikeldispersion (gewaschen und ungewaschen) dargestellt. Indocyaningrün ist ein Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff, dessen Absorptions- und Emissionsspektrum im Wellenlängenbereich zwischen 650- 900 nm liegt. Die Komplexierung und Einkapselung von ICG mit Hilfe des kationischen Polyacrylates P(DMAEMA) führt zu einer minimalen bathochromen Verschiebung der beiden Wellenlängenmaxima.FIG. 15 shows the UV-Vis absorption spectra of an aqueous ICG solution as well as the ICG nanoparticle dispersion (washed and unwashed). Indocyanine green is a near-infrared fluorescent dye whose absorption and emission spectrum is in the wavelength range between 650-900 nm. The complexation and encapsulation of ICG using the cationic polyacrylate P (DMAEMA) leads to a minimal bathochromic shift of the two wavelength maxima.
Beispiel 15: TierversuchExample 15: Animal experiment
Die eingesetzten Tiere werden von der Firma Taconic M&B geliefert. Es handelt sich um weibliche Albino-Nacktmäuse vom Typ NMRI nude. Die ausgewachsenen Tiere besitzen nach ca. 8 Wochen ein Gewicht von 22-24 g. Fünf weiblichen Nacktmäusen werden 2x106 Zellen eines F9-Teratoms in die rechte hintere Flanke inokuliert. Die Zellen werden von der Firma ATCC / LGC Promochem GmbH bezogen. Es handelt sich um von der Maus stammende embryonale Zellen eines testinalen Teratokarzinoms, welches als Tumormodell für Krebsforschungszwecke in Mäusen verwendet wird. Nach 18 Tagen sind bei vier der fünf Mäuse Tumore mit einer durchschnittlichen Größe von ca. 0,5-1 cm Durchmesser gewachsen. Die Tiere werden für die erste Stunde des Versuches dauerhaft mit einer Rompun-Ketavet-Injektion in einer Dosis 100 μl / 10 g Tier anästhesiert. Die Injektionslösung besteht aus einem 1 :1 Gemisch einer 1 :10 Verdünnung Rompun bzw. 1 :5 Verdünnung Ketavet mit physiologischer Kochsalzlösung. Anschließend werden 200 μl der Nanopartikeldispersion in die Schwanzvene i.v. injiziert. Die nachfolgenden Narkosen erfolgen mit Rompun- Ketavet über die Lunge als Inhalationsnarkotikum, um den Kreislauf der Tiere nur minimal zu belasten. In einem Zeitraster von 24 und 48 h nach Substanzinjektion werden die Tiere fluoreszenzoptisch untersucht.The animals used are supplied by Taconic M & B. These are female albino nude mice of the type NMRI nude. The adult animals have a weight of 22-24 g after about 8 weeks. Five female nude mice are inoculated with 2x10 6 cells of a F9 teratoma in the right posterior flank. The cells are obtained from the company ATCC / LGC Promochem GmbH. It is mouse-derived embryonic cells of a testinal teratocarcinoma, which is used as a tumor model for cancer research purposes in mice. After 18 days, four of the five mice had tumors with an average size of about 0.5-1 cm in diameter. The animals are permanently anesthetized with a rompun-ketavet injection in a dose of 100 μl / 10 g of animal for the first hour of the experiment. The solution for injection consists of a 1: 1 mixture of a 1:10 dilution Rompun or 1: 5 dilution Ketavet with physiological saline. Subsequently, 200 μl of the nanoparticle dispersion are injected iv into the tail vein. The subsequent anesthesia is carried out with Rompun- Ketavet via the lungs as an inhalation anesthetic to the circulation of the animals only minimal weight. In a time frame of 24 and 48 h after substance injection, the animals are examined by fluorescence optics.
Mit Hilfe von Fig. 17 wird gezeigt, dass GIu(10)-b-PEG(110)-modifizierte PBCA- [P(DMAEMA)-ICG]-Nanopartikel nach intravenöser Applikation (Schwanzvene) in der Lage sind, sich über passive Anreicherungsmechanismen (EPR-Effekt) im Tumorgewebe anzureichern. Die Untersuchung der Tumoren ex vivo belegt eine deutliche Verstärkung des Fluoreszenzkontrastes bei behandelten im Vergleich zu unbehandeltem Tumorgewebe (Vergleich Fig. 18 b mit a bzw. c mit a). Eine mehrfache, zeitversetzte Detektion der Fluoreszenz bei ein und demselben Tier ist nach 24 h und 48 h möglich (Fig. 17). Die Partikel können demzufolge in vivo ausreichend lange zirkulieren und sich entsprechend im Tumor anreichern. Die elektrostatisch pegylierte Oberfläche ist somit stabil mit der Partikeloberfläche verbunden. Es findet eine schnelle biliäre Eliminierung nicht-tumorassoziierter Partikel aus der Leber statt. Indiz dafür ist ein fehlender NIR-Fluoreszenzkontrast in der Leber nach 24 bzw. 48 h. Eine schnelle Eliminierung nicht im Tumor angereicherter Partikel aus dem Organismus (z.B. Leber) ermöglicht einen guten Tumorkontrast bei minimaler Belastung anderer Organe, Voraussetzung für ein nebenwirkungsarmes Kontrastmittelsystem.Referring to Figure 17, it is shown that GIu (10) -b-PEG (110) -modified PBCA [P (DMAEMA) -ICG] nanoparticles after intravenous administration (tail vein) are capable of passive enrichment mechanisms (EPR effect) in tumor tissue. Examination of the tumors ex vivo shows a clear enhancement of the fluorescence contrast in treated compared to untreated tumor tissue (compare Fig. 18 b with a and c with a). Multiple, time-shifted detection of fluorescence in one and the same animal is possible after 24 h and 48 h (FIG. 17). Consequently, the particles can circulate in vivo for a sufficiently long time and accumulate accordingly in the tumor. The electrostatically pegylated surface is thus stably connected to the particle surface. There is a rapid biliary elimination of non-tumor associated particles from the liver. Indication for this is a lack of NIR fluorescence contrast in the liver after 24 or 48 h. Rapid elimination of non-tumor-enriched particles from the organism (e.g., liver) allows good tumor contrast with minimal stress on other organs, a prerequisite for a low-contrast contrast agent system.
Das für den Tierversuch verwendete Gerät wurde von der Firma LMTB (Berlin, Deutschland) aufgebaut. Als Einzelkomponenten wurden verwendet:The device used for the animal experiment was set up by the company LMTB (Berlin, Germany). As individual components were used:
Laser: Diodenlaser (742 nm), Modell Ceralas PDT 742/1 ,5W; Fa. CeramOptec (Bonn, Deutschland)Laser: diode laser (742 nm), model Ceralas PDT 742/1, 5W; CeramOptec (Bonn, Germany)
Anregungsfilter: 1xLCLS-750 nm-F; 1x740 nm Interferenzfilter (Bandpass)Excitation filter: 1xLCLS-750 nm-F; 1x740 nm interference filter (bandpass)
Emissionsfilter: 1 x bk-802,5-22-C1 ; 1 xbk-801 -15-C1Emission filter: 1 x bk-802.5-22-C1; 1 xbk-801 -15-C1
Kamera: Peltier gegen Luft gekühlte CCD Kamera, Modell C4742-95Camera: Peltier air-cooled CCD camera, model C4742-95
12ER, Fa. Hamamatsu (Herrsching, Deutschland) Software: Simple PCI 5.0, Fa. Compix / Hamamatsu Figuren12ER, Hamamatsu (Herrsching, Germany) Software: Simple PCI 5.0, Compix / Hamamatsu characters
Fig. 1 : Kurzzeitstabilität PBCA-PDMAEMA-Nanopartikel mit Epothilon (nicht oberflächenmodifiziert).Fig. 1: Short-term stability of PBCA-PDMAEMA nanoparticles with epothilone (not surface-modified).
Fig. 2: Kurzzeitstabilität PBCA-PDMAEMA-Nanopartikel mit Epothilon oberflächenmodifiziert mit GIu(10)-b-PEG(110) a) Hydrodynamischer Partikeldurchmesser dhyd und Polydispersitätsindex PI / # EpoPDI 9Ak2konz PEG-GIu b) Hydrodynamischer Partikeldurchmesser dhyd und ZetapotentialFig. 2: Short-term stability PBCA-PDMAEMA nanoparticles with epothilone surface-modified with Glu (10) -b-PEG (110) a) Hydrodynamic particle diameter d hyd and polydispersity index PI / # EpoPDI 9Ak2konz PEG-Glu b) Hydrodynamic particle diameter d h y d and Zeta potential
Fig. 3: Titrationsverlauf (Zetapotential) bei der Oberflächenmodifikation von Epothilon beladenen PBCA-PDMAEMA Nanopartikeln Dargestellt ist in dieser Abbildung die Veränderung desFig. 3: Titration curve (zeta potential) in the surface modification of epothilone-loaded PBCA-PDMAEMA nanoparticles. Shown in this figure is the change of the
Zetaptentials von Fig. 3a) +25 mV auf ca. -30 mV bzw. von Fig. 3b) +35 mV auf -10 mV durch schrittweise Zugabe des modifizierenden Agens (GIu(10)-b-PEG(110)) bzw. (GIu(10)-b- PEG(114)) zur Partikeldispersion (Ladungstitration).Zetaptentials of Fig. 3a) +25 mV to about -30 mV and of Fig. 3b) +35 mV to -10 mV by stepwise addition of the modifying agent (Glu (10) -b-PEG (110)) or (GIu (10) -b- PEG (114)) for particle dispersion (charge titration).
Fig. 4: Steuerung des Partikeldurchmessers durch Änderung derFig. 4: control of the particle diameter by changing the
Polymerkonzentration;Polymer concentration;
In Fig. 1 ist dargestellt, dass die Partikelgröße der PBCA- P(DMAEMA)-Nanopartikel während der Herstellung durch Variation der Polymerkonzentration gesteuert werden kann.In Fig. 1 it is shown that the particle size of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles can be controlled during production by varying the polymer concentration.
Fig. 5: In der Abbildung ist dargestellt eine REM-Aufnahme Epothilon beladener PBCA-P(DMAEMA)-Nanopartikel.FIG. 5: The figure shows an SEM image of epothilone-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles.
Fig. 6: Einfluss funktionalisierter Partikeloberflächen auf dieFig. 6: Influence of functionalized particle surfaces on the
Zellaufnahme: a) Vergleich des Zellaufnahmeverhaltens nach Oberflächenmodifikation; Reihe 1 : unmodifizierte Partikel; Reihe 2: Nanopartikel mit Folsäure; Reihe 3: Nanopartikel mit GIu(10)-b-Cell uptake: a) Comparison of cell uptake behavior after surface modification; Row 1: unmodified particles; Row 2: Nanoparticles with folic acid; Row 3: Nanoparticles with Glu (10) -b-
PEG(HO); b) Ausschnitt: Reihe 3/ Well 1/ Site 15; Pfeile markieren deutlichePEG (HO); b) Section: Row 3 / Well 1 / Site 15; Arrows mark clearly
Fluoreszenzverstärkung im Zellkern. (Bsp. 10)Fluorescence enhancement in the nucleus. (Ex. 10)
Fig. 7: Nanopartikelaufnahme in HeLa-Zellen; Fluoreszenz derFig. 7: Nanoparticle uptake in HeLa cells; Fluorescence of
Nanopartikel als Graustufenabbildung;Nanoparticles as grayscale imaging;
Die Abbildung zeigt das Zellaufnahmeverhalten GIu(10)-b- PEG(HO) modifizierter PBCA P(DMAEMA)-Nanopartikel in HeLa-The figure shows the cell uptake behavior of GIu (10) -b-PEG (HO) modified PBCA P (DMAEMA) nanoparticles in HeLa.
Zellen.Cells.
Fig. 8: Schematische Darstellung der Zellaufnahme von PBCA-8: Schematic representation of the cell uptake of PBCA
P(DMAEMA)-Nanopartikeln oberflächenmodifiziert mit GIu(10)-b- PEG(HO);P (DMAEMA) nanoparticles surface-modified with Glu (10) -b-PEG (HO);
Verwendete Abkürzungen = PEG-NP: pegylierte cumarinhaltige PBCA-P(DMAEMA)-Nanopartikel; NP: cumarinbeladene PBCA- P(DMAEMA)-Nanopartikel; CP: Clathrin-coated pits; ES: Endosomen; LS: Lysosomen; ELS: Endolysosomen; ZK: Zellkern; H+: H+ATPase; PEG-GIu: freies GIu(10)-b-PEG(110)Abbreviations used = PEG-NP: pegylated coumarin-containing PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles; NP: coumarin-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles; CP: clathrin-coated pits; ES: endosomes; LS: lysosomes; ELS: endolysosomes; ZK: cell nucleus; H +: H + ATPase; PEG-Glu: free Glu (10) -b-PEG (110)
Blockcopolymer; Größenrelationen entsprechen nicht der Realität.block copolymer; Size relations do not correspond to reality.
Fig. 9: a) Darstellung der Fluoreszenz in der mittleren Zellebene (CLSM, konfokales Laser-Raster-Mikroskop), b) computerbasierte 3D- Darstellung der Fluoreszenz;9: a) representation of the fluorescence in the middle cell level (CLSM, confocal laser scanning microscope), b) computer-based 3D representation of the fluorescence;
Die Darstellung zeigt die Anreicherung der GIu(10)-b-PEG(110) modifizierten PBCA-P(DMAEMA)-Nanopartikel im Zellkern. Dies ist möglich durch die Beladung mit dem fluoreszenzaktiven Farbstoff Cumarin 6.The plot shows the accumulation of the GIu (10) -b-PEG (110) modified PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles in the nucleus. This is possible by loading with the fluorescence-active dye coumarin 6.
Fig. 10: Geringere Partikelaufnahme bei Inkubation niedrigerer Patikelkonzentration: 0,21 mg/ml; Fluoreszenz der NP als Graustufenabbildung; Die Abbildung zeigt fluoreszierende HeLa-Zellen nachdem eine Partikelkonzentration von 0,21 mg/ml inkubiert wurde. Es wurden dafür GIu(10)-b-PEG(110) oberflächenmodifizierte PBCA- P(DMAEMA)-Partikel verwendet.Fig. 10: Lower particle uptake with incubation of lower particle concentration: 0.21 mg / ml; Fluorescence of the NP as grayscale image; The figure shows fluorescent HeLa cells after a particle concentration of 0.21 mg / ml was incubated. GIu (10) -b-PEG (110) surface-modified PBCA-P (DMAEMA) particles were used for this.
Fig. 11 : Gesteigerte Partikelaufnahme bei Inkubation höherer Patikelkonzentration: 0,85 mg/ml; Fluoreszenz der NP als Graustufenabbildung;Fig. 11: Increased particle uptake with incubation of higher particle concentration: 0.85 mg / ml; Fluorescence of the NP as grayscale image;
Die Abbildung zeigt deulich stärker fluoreszierende HeLa-Zellen nachdem eine höhere Partikelkonzentration von 0,85 mg/ml inkubiert wurde. Es wurden dafür GIu(10)-b-PEG(110) oberflächenmodifizierte PBCA-P(DMAEMA)-Partikel verwendet.The figure shows more strongly fluorescent HeLa cells after a higher particle concentration of 0.85 mg / ml was incubated. GIu (10) -b-PEG (110) surface-modified PBCA-P (DMAEMA) particles were used for this purpose.
Fig. 12: REM-Aufnahme von PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]-NanopartikelnFig. 12: SEM image of PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles
Fig. 13: Partikeldurchmesser dhyd der PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]- Nanopartikel, oberflächenmodifiziert mit GIu(10)-b-PEG(110); Dargestellt ist die Partikelgröße der für den Tierversuch verwendeten oberflächenmodifizierten PBCA-[P(DMAEMA)- ICG]-Nanopartikel über einen Zeitraum von 7 Tagen nachFIG. 13: particle diameter d hyd of the PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles, surface-modified with Glu (10) -b-PEG (110); The particle size of the surface-modified PBCA [P (DMAEMA) -ICG] nanoparticles used for the animal experiment is shown over a period of 7 days
Herstellung für den Tierversuch.Production for the animal experiment.
Fig. 14: Zetapotential der untitrierten (gewaschenen / ungewaschenen) und der titrierten PBCA [P(DMAEMA) ICG] Nanopartikel; Die Abbildung zeigt die als Zetapotential gemesseneFigure 14: Zeta potential of the untitrated (washed / unwashed) and titrated PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles; The figure shows the zeta potential measured
Oberflächenladung der PBCA-P(DMAEMA)-Nanopartikel modifiziert mit dem Blockcopolymer GIu(10)-b-PEG(110). Dieses wurde entsprechend von ca. +3OmV über den Neutralpunkt hinaus bis zum Erreichen des Dissoziations-Gleichgewichtes bei etwa -3OmV titriert. Fig. 15: UV-Vis-Absorptionsspektren: a) wässrige ICG-Lösung, b) PBCA- [P(DMAEMA)-ICG]-NP ungewaschen; c) PBCA-[P(DMAEMA)-ICG] Nanopartikel gewaschen;Surface charge of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles modified with the block copolymer Glu (10) -b-PEG (110). This was correspondingly titrated from about + 3OmV beyond the neutral point until reaching the dissociation equilibrium at about -3OmV. Fig. 15: UV-Vis absorption spectra: a) aqueous ICG solution, b) PBCA [P (DMAEMA) -ICG] -NP unwashed; c) PBCA- [P (DMAEMA) -ICG] nanoparticles washed;
In dieser Abbildung sind die UV-Vis-Absorptionsspektren einer wässrigen ICG-Lösung als auch der ICG-NanopartikeldispersionIn this figure, the UV-Vis absorption spectra of an aqueous ICG solution as well as the ICG nanoparticle dispersion are
(gewaschen und ungewaschen) dargestellt.(washed and unwashed).
Fig. 16: Emissionsspektrum der PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]-Nanopartikel und einer wässrigen ICG-Lösung; Die Abbildung stellt die entsprechenden Emissionsspektren der wässrigen ICG-Lösung im Vergleich zur Nanopartikeldispersion dar.Fig. 16: Emission spectrum of the PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles and an aqueous ICG solution; The figure represents the corresponding emission spectra of the aqueous ICG solution compared to the nanoparticle dispersion.
Fig. 17: Detektion der NIR-Fluoreszenz in vivo; Die Darstellungen zeigen die NIR-Fluoreszenz in einem Zeitraster von 24 und 48 h nach Substanzinjektion (a) 24 h ventral, b) 24 h lateral, c) 48 h lateral, d) Leerwert ventral).Fig. 17: Detection of NIR fluorescence in vivo; The images show the NIR fluorescence in a time frame of 24 and 48 h after substance injection (a) ventrally 24 h, b) 24 h laterally, c) 48 h laterally, d) ventrally empty).
Fig. 18: NIR-Fluoreszenzkontrast des Tumorgewebes ex vivo 48 h nach Behandlung;Fig. 18: NIR fluorescence contrast of the tumor tissue ex vivo 48 h after treatment;
Die Abbildung zeigt NIR-Fluoreszenzkontraste a) eines unbehandelten Tumors ohne NIR-Fluoreszenzkontrast, b) eines großen, behandelten Tumors und c) eines mittleren, behandelten Tumors ex vivo 48 h nach Behandlung. The figure shows NIR fluorescence contrasts a) an untreated tumor without NIR fluorescence contrast, b) a large, treated tumor and c) a median, treated tumor ex vivo 48 h after treatment.

Claims

Patentansprüche claims
1. Polymernanopartikel mit einem kationischen Oberflächenpotential, enthaltend ein kationisches Polymer und ein in Wasser schwer lösliches Polymer, dadurch gekennzeichnet, dass diese Polymernanopartikel diagnostische Agenzien und Epothilone oder nur Epothilone enthalten.A polymer nanoparticle having a cationic surface potential containing a cationic polymer and a sparingly water-soluble polymer, characterized in that said polymer nanoparticles contain diagnostic agents and epothilones or only epothilones.
2. Polymernanopartikel gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das in Wasser schwer lösliche Polymer ein Polycyanoacrylate, Polyalkylcyanoacrylate (PACA), Polyester Alginsäure, Hyaluronsäure, Polysialinsäure, saure Cellulose-Derivate, saure Stärke-Derivate,2. polymer nanoparticles according to claim 1, characterized in that the polymer sparingly soluble in water, a polycyanoacrylates, polyalkylcyanoacrylates (PACA), polyester alginic acid, hyaluronic acid, polysialic acid, acidic cellulose derivatives, acidic starch derivatives,
Polysaccharide, polymere Proteine, Polyamide, Polyanhydride, Polyorthoester, Polycaprolactone, Polyphosphorsäure, Poly(amide- enamines), Azopolymers, Polyurethane, Polyorthoester, Dendrimere, Pseudopolymaminosäuren oder sämtliche Mischungen und Co-Polymere derselben Verbindungen ist.Polysaccharides, polymeric proteins, polyamides, polyanhydrides, polyorthoesters, polycaprolactones, polyphosphoric acid, poly (amide-enamines), azopolymers, polyurethanes, polyorthoesters, dendrimers, pseudopolymamic acids or all mixtures and co-polymers of the same compounds.
3. Polymernanopartikel, gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend: ein kationisch modifiziertes Polyacrylat P(DMAEMA=PoIy(N1N- dimethylaminoethylmethacrylat), P(DMAPMAM= PoIy(N, N- Dimethylaminopropylmethacrylamid)3. Polymer nanoparticles according to claim 1, characterized in that the cationic polymer is selected from the group comprising: a cationically modified polyacrylate P (DMAEMA = poly (N 1 N-dimethylaminoethyl methacrylate), P (DMAPMAM = poly (N, N-dimethylaminopropyl methacrylamide )
4. Polymernanopartikel gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche elektrostatisch modifiziert ist.4. polymer nanoparticles according to claim 1, characterized in that the surface is electrostatically modified.
5. Polymernanopartikel gemäß Anspruch 4, wobei das oberflächenmodifizierende Agens eine Verbindung der Formel (XIII) istThe polymer nanoparticle according to claim 4, wherein the surface-modifying agent is a compound of the formula (XIII)
Figure imgf000065_0001
worin n 5 bis 700
Figure imgf000065_0001
wherein n is 5 to 700
R Wasserstoff, CrC3-Alkyl, eine neutrale Aminosäure und "anionischer Anker (anionic anchor)" ein Polymer aus bis zu 20 Einheiten Glutaminsäure (GIu) oder Asparaginsäure (Asp) oder deren Salzen, oder deren Mischpolymere, die gegebenenfalls auch neutrale Aminosäuren enthalten können, bedeutet,,.R is hydrogen, C 1 -C 3 alkyl, a neutral amino acid and "anionic anchor" means a polymer of up to 20 units glutamic acid (GIu) or aspartic acid (Asp) or salts thereof, or their copolymers, which may optionally also contain neutral amino acids, means.
6. Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1-5 dadurch gekennzeichnet, dass das diagnostische Agens negativ geladen ist und als lonenpaar mit dem kationischen Polymer in den Partikel eingeschlossen wird.6. polymer nanoparticles according to any one of claims 1-5, characterized in that the diagnostic agent is negatively charged and is included as an ion pair with the cationic polymer in the particle.
7. Polymernanopartikel gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Epothilon eine Verbindung der allgemeinen Formel (XII)7. Polymer nanoparticle according to claim 1 or 2, wherein the epothilone is a compound of the general formula (XII)
Figure imgf000066_0001
worin
Figure imgf000066_0001
wherein
R1a, R1b unabhängig voneinander Wasserstoff, Ci-CiO-Alkyl, Aryl,R 1a, R 1b are independently hydrogen, Ci-Ci o alkyl, aryl,
Aralkyl, oder zusammen eine Gruppe -(CH2)m- wobei m 2 bis 5 bedeutet; R2a, R2b unabhängig voneinander Wasserstoff, C-ι-CiO-Alkyl,Aralkyl, or together a group - (CH 2 ) m - wherein m is 2 to 5; R 2a, R 2b are independently hydrogen, C-ι-C O alkyl,
C2-Ci0-Alkenyl C2-Cio-Alkinyl, Aryl, Aralkyl, oder zusammen eine Gruppe -(CH2)n- wobei n 2 bis 5 bedeutet,C 2 -C 0 alkenyl C 2 -Cio-alkynyl, aryl, aralkyl, or together a group - wherein n is 2 to 5, - (CH 2) n
R3 Wasserstoff, C1-Ci0 Alkyl, Aryl, Aralkyl;R 3 is hydrogen, C 1 -C 0 alkyl, aryl, aralkyl;
R48, R4b unabhängig voneinander Wasserstoff, CrCiO-Alkyl, Aryl, Aralkyl, oder zusammen eine Gruppe -(CH2)P- wobei p 2 to 5 bedeutet; R5 Wasserstoff, CrC10-Alkyl, Aryl, Aralkyl. CO2H, CO2Alkyl,R 48, R 4b are independently hydrogen, CRCI O alkyl, aryl, aralkyl, or together a group - wherein p is 2 to 5 represents - (CH 2) P; R 5 is hydrogen, C 1 -C 10 -alkyl, aryl, aralkyl. CO 2 H, CO 2 alkyl,
CH2OH, CH2O-CrC5-Alkyl, CH2OAcyl, CN, CH2NH2, CH2N(CC1-C5-AIkVl), Acyl)1i2, or CH2HaI, CHaI3;CH 2 OH, CH 2 OC r C 5 alkyl, CH 2 O acyl, CN, CH 2 NH 2 , CH 2 N (CC 1 -C 5 alkyl), acyl) 1i 2 , or CH 2 Hal, CHal 3 ;
R6, R7 unabhängig voneinander Wasserstoff, oder zusammen eine weitere Bindung oder eine Epoxid Funktion;R 6 , R 7 are independently hydrogen, or together another bond or an epoxide function;
G O oder CH2;GO or CH 2 ;
D-E zusammen die Gruppe -H2C-CH2-, -HC=CH-, -C≡C-,DE together form the group -H 2 C-CH 2 -, -HC = CH-, -C≡C-,
-CH(OH)-CH(OH)-, -CH(OH)-CH2-, -CH2-CH(OH)-, -CH2-O-,-CH (OH) -CH (OH) -, -CH (OH) -CH 2 -, -CH 2 -CH (OH) -, -CH 2 -O-,
A -0-CH2- or CH CH wobei wenn G Sauerstoff bedeutet, D-E nicht CH2-O sein kann; oderA is -O-CH 2 - or CH CH where G is oxygen, DE can not be CH 2 -O; or
D-E-G zusammen die Gruppe H2C-CH=CHDEG together the group H 2 C-CH = CH
W die Gruppe C(=X)R8, oder ein bi- or trizyklischer aromatischer oder heteroaromatischer Rest; X O oder die Gruppe CR9R10; R8 Wasserstoff, C1-C10 Alkyl, Aryl, Aralkyl, Halogen, CN;W is the group C (= X) R 8 , or a bi- or tricyclic aromatic or heteroaromatic radical; XO or the group CR 9 R 10 ; R 8 is hydrogen, C 1 -C 10 alkyl, aryl, aralkyl, halogen, CN;
R9, R10 unabhängig voneinander Wasserstoff, CrC20-Alkyl, Aryl,R 9 , R 10 independently of one another hydrogen, C 1 -C 20 -alkyl, aryl,
Aralkyl, oder zusammen mit dem Methylenkohlenstoffatom einen 5- bis 7-gliedrigen carbozyklischen Ring; Z O oder Wasserstoff und die Gruppe OR11; R11 Wasserstoff der eine Schutzgruppe PGZ;Aralkyl, or together with the methylene carbon atom, a 5- to 7-membered carbocyclic ring; ZO or hydrogen and the group OR 11 ; R 11 is hydrogen of a protective group PG Z ;
A-Y eine Gruppe O-C(=O), 0-CH2, CH2-C(=O), NR12-C(=O),AY is a group OC (= O), O-CH 2 , CH 2 -C (= O), NR 12 -C (= O),
NR12-SO2;NR 12 -SO 2 ;
R12 Wasserstoff, oder C1-C10 Alkyl;R 12 is hydrogen, or C 1 -C 10 alkyl;
PGZ C1-C20 Alkyl, eine C4-C7 Cycloalkylgruppe, die ein oder mehrere Sauerstoffatome im Ring enthalten kann, Aryl,PG Z C 1 -C 20 alkyl, a C 4 -C 7 cycloalkyl group which may contain one or more oxygen atoms in the ring, aryl,
Aralkyl, C1-C20 Acyl, Aroyl, C1-C20 Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Tri(CrC20alkyl)silyl, Di(C1-C20 alkyl) Arylsilyl, (C1-C20 Alkyl)diarylsilyl, or Tri(aralkyl)silyl; als einzelnes Stereoisomer oder als Mischung aus verschiedenen Stereoisomeren und/oder als pharmazeutisch akzeptables Salz verkapselt ist. Aralkyl, C 1 -C 20 acyl, aroyl, C 1 -C 20 alkylsulfonyl, arylsulfonyl, tri (C r C 20 alkyl) silyl, di (C 1 -C 20 alkyl) arylsilyl, (C 1 -C 20 alkyl) diarylsilyl , or tri (aralkyl) silyl; is encapsulated as a single stereoisomer or as a mixture of different stereoisomers and / or as a pharmaceutically acceptable salt.
8. Polymernanopartikel gemäß Anspruch 7, wobei des Epothilon ausgewählt ist aus der Liste enthaltend (4S,7R,8S,9S,13E/Z,16S)-4J8-Dihydroxy-16-(2-methyl-benzoxazol-5-yl)-1-oxa-8. The polymer nanoparticles according to claim 7, wherein the epothilone is selected from the list comprising (4S, 7R, 8S, 9S, 13E / Z, 16S) -4 J 8-dihydroxy-16- (2-methyl-benzoxazol-5-yl ) -1-oxa-
5,5,9,1 S-tetramethyl^-φrop^-en-i-yO-cyclohexadec-IS-en^.θ-dion; (IS/R.aSJS.IOR.H R.^S.IΘR/Sp.H-Dihydroxy-IO^prop^-en-i-yO-S-Ca- methyl-benzoxazol-5-yl)-8,8,12,16-tetramethyl-4,17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion;5, 5, 9, 1-tetramethyl-2-propen-1-y-cyclohexadec-IS-ene-1-dione; (IS / R.aSJS.IOR.H.R. ^ S.IΘR / Sp.H-dihydroxy-IO ^ prop-1-i-yO-S-carboxymbenzoxazol-5-yl) -8.8 , 12,16-tetramethyl-4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione;
(4S,7R,8S,9S,13E/Z,16S)-4,8-Dihydroxy-16-(2-methyl-benzothiazol-5-yl)-1-oxa- 5,5,9, 13-tetramethyl-7-(prop-2-en-1-yl)-cyclohexadec-13-en-2,6-dion; (1S/R,3S,7S,10Rf11Sl12S,16R/S)-7l11-Dihydroxy-10-(prOp-2-en-1-yl)-3-(2- methyl-benzothiazol-δ-yO-δ.δ.^.iθ-tetramethyl^,^- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion;(4S, 7R, 8S, 9S, 13E / Z, 16S) -4,8-dihydroxy-16- (2-methyl-benzothiazol-5-yl) -1-oxo-5,5,9,13-tetramethyl- 7- (prop-2-en-1-yl) -cyclohexadec-13-ene-2,6-dione; (1S / R, 3S, 7S, 10R f 11S l 12S, 16R / S) -7 l 11-dihydroxy-10- (prOp-2-en-1-yl) -3- (2-methyl-benzothiazole-δ -yO-δ, δ, γ, ω-tetramethyl, ω-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione;
(1Sl3S,7S,10Rl11SI12Sl16R)-7f11-Dihydroxy-10-(prop-2-en-1-yl)-3-(2-methyl- benzothiazol-5-yl)-8,8, 12,16-tetramethyl-4, 17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion;(1S l 3S, 7S, 10R, 11S I l l 12S 16R) -7 f 11-dihydroxy-10- (prop-2-en-1-yl) -3- (2-methyl-benzothiazol-5-yl) - 8,8,12,16-tetramethyl-4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione;
(IS/R.SSJS.IOR.I I R.^S.IΘR/SK.H-Dihydroxy-IO^prop^-en-i-yO-S^- methyl-benzothiazol-5-yl)-8,8, 12, 16-tetramethyl-4, 17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion;(IS / R.SSJS.IOR.II R. ^ S.IΘR / SK.H-dihydroxy-IO ^ prop-1-y-y-O-S-methyl-benzothiazol-5-yl) -8.8, 12,16-tetramethyl-4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione;
(4S,7R,8S,9S,13E/ZI16S)-4,8-Dihydroxy-16-(2-methyl-benzothiazol-5-yl)-1-oxa- Θ.IS-dimethyl-δ.S^I .S-trimethylen^^prop^-en-i-yO-cyclohexadec-IS- en-2,6-dion;(4S, 7R, 8S, 9S, 13E / Z I 16S) -4,8-dihydroxy-16- (2-methyl-benzothiazol-5-yl) -1-oxo-Θ.is-dimethyl-δ.S ^ I .S-trimethylene ^^ prop ^ -en-i-yO-cyclohexadec-IS-en-2,6-dione;
(1S/R,3S,7S,10R,11 R,12SI16R/S)-7>11-Dihydroxy-10-(piOp-2-en-1-yl)-3-(2- methyl-benzothiazol-5-yl)-12,16-dimethyl-8,8-(1 ,3-trimethylen)-4,17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion; (4S,7R,8S,9S)13E/Z)16S)-4,8-Dihydroxy-16-(2-methyl-benzothiazol-5-yl)-1-oxa- 5,5,9,13-tetramethyl-7-(prop-2-in-1-yl)-cyclohexadec-13-en-2,6-dion;(1S / R, 3S, 7S, 10R, 11R, 12S I 16R / S) -7> 11-dihydroxy-10- (piOp-2-en-1-yl) -3- (2- methyl-benzothiazol 5-yl) -12,16-dimethyl-8,8- (1,3-trimethylene) -4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione; (4S, 7R, 8S, 9S ) 13E / Z ) 16S) -4,8-Dihydroxy-16- (2-methyl-benzothiazol-5-yl) -1-oxo-5,5,9,13-tetramethyl- 7- (prop-2-in-1-yl) -cyclohexadec-13-ene-2,6-dione;
(1S/R,3S,7S>10R,11 R>12S,16R/S)-7,11-DihydiOxy-10-(prop-2-in-1-yl)-3-(2- methyl-benzothiazol-5-yl)-8,8,12,16-tetramethyl-4,17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion; (4S,7R,8S,9S,13E/Z,16S)-4,8-Dihydroxy-16-(quinolin-7-yl)-1-oxa-5>5,9,13- tetramethyl-7-(prop-2-en-1 -yl)-cyclohexadec-13-en-2,6-dion;(1S / R, 3S, 7S > 10R, 11R > 12S, 16R / S) -7,11-dihydroxy-10- (prop-2-yn-1-yl) -3- (2-methylbenzothiazole) 5-yl) -8,8,12,16-tetramethyl-4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione; (4S, 7R, 8S, 9S, 13E / Z, 16S) -4,8-dihydroxy-16- (quinolin-7-yl) -1-oxa-5 > 5,9,13-tetramethyl-7- (prop -2-en-1-yl) -cyclohexadec-13-ene-2,6-dione;
(IS/R.SSJS.IOR.H R.^S.IΘR/SK.n-Dihydroxy-IO^prop^-en-i-yO-S-(IS / R.SSJS.IOR.H R. ^ S.IΘR / SK.n-dihydroxy-IO ^ prop ^ -en-i-yO-S-
(quinolin^-yO-δ.δ.^.iβ-tetramethyK^- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion;(quinoline) -yO-δ, δ, δ, δ-tetramethyl K, -dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione;
(4S,7Rl8SI9Sl13E/Z>16S)-4.8-Dihydroxy-16-(1 ,2-dimethyl-1 H-benzoimidazol-5- yl)-1-oxa-5, 5,9,13-tetramethyl-7-(prop-2-en-1-yl)-cyclohexadec-13-ene- 2,6-dion;(4S, 7R 8S I l l 9S 13E / Z> 16S) -4.8-dihydroxy-16- (1, 2-dimethyl-1 H-benzoimidazol-5-yl) -1-oxa-5, 5,9,13 tetramethyl-7- (prop-2-en-1-yl) -cyclohexadec-13-ene-2,6-dione;
(1S/R,3S,7S,10R,11 R,12S,16R/S)-7>11-ihydroxy-10-(prop-2-en-1-yl)-3-(1 <2- dimethyl-I H-benzoimidazol-S-yO-δ.δ.^.iθ-tetramethyM,^- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion;(1S / R, 3S, 7S, 10R, 11R, 12S, 16R / S) -7 > 11-ihydroxy-10- (prop-2-en-1-yl) -3- (1 < -2-dimethyl) I H-benzoimidazole-S-yO-δ, δ, γ, ω-tetramethyl, ω-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione;
(4S,7R,8S,9S,13E/Z,16S)-4>δ-dihydroxy-16-(2-methyl-benzothiazol-5-yl)-1-aza- 5,5,9,13-tetramethyl-7-(prop-2-en-1-yl)-cyclohexadec-13-ene-2,6-dion;(4S, 7R, 8S, 9S, 13E / Z, 16S) -4 > δ-dihydroxy-16- (2-methylbenzothiazol-5-yl) -1-aza-5,5,9,13-tetramethyl- 7- (prop-2-en-1-yl) -cyclohexadec-13-ene-2,6-dione;
(1S/R,3S,7S,10R,11S,12S,16R/S)-7,11-Dihydroxy-10-(prop-2-en-1-yl)-3-(2- methyl-benzothiazol-5-yl)-8,8, 12,16-tetramethyl-4-aza-17- oxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion,(1S / R, 3S, 7S, 10R, 11S, 12S, 16R / S) -7,11-dihydroxy-10- (prop-2-en-1-yl) -3- (2-methylbenzothiazole-5 -yl) -8,8,12,16-tetramethyl-4-aza-17-oxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione,
(18/R1SSJS1IOR111 R,12S,16R/S)-7l11-DihydrOxy-10-(prop-2-en-1-yl)-3-(2- methyl-benzothiazol-5-yl)-8,8, 12,16-tetramethyl-4-aza-17- oxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion, (IS.SSCEJJS.IOR.H S.^S.ieR^.H-Dihydroxy-δ.δ.iO.^.ie-pentamethyl-S- [1 -(2-methyl-1 ,3-thiazol-4-yl)prop-1 -en-2-yl]-4, 17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion ,(18 / R 1 SSJS 1 IOR 1 11 R, 12 S, 16 R / S) -7 L 11-Dihydroxy-10- (prop-2-en-1-yl) -3- (2-methylbenzothiazole-5- yl) -8,8,12,16-tetramethyl-4-aza-17-oxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione, (IS.SSCEJJS.IOR.H S. ^ S.ieR ^ .H Dihydroxy-δ, δ, ω, ω, ω-pentamethyl-S- [1- (2-methyl-1,3-thiazol-4-yl) -prop-1 -ene-2-yl] -4, 17- dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione,
(^^(EJJS.IOR.I IS.^S.IβR^.I I-Dihydroxy-δ.δ.iO.^.ie-pentamethyl-S-(^) (EJJS.IOR.I IS.
[1 -(2-methyl-1 ,3-thiazol-4-yl)prop-1 -en-2-yl]-17-oxa-4- azabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dione ,[1 - (2-methyl-1, 3-thiazol-4-yl) -prop-1 -en-2-yl] -17-oxa-4-azabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione,
(4S,7R,δS,9SI13Z,16S(E))-4,δ-Dihydroxy-5,5,7)9,13-pentamethyl-16-[1-(2- methyl-1 ,3-thiazol-4-yl)prop-1 -en-2-yl]-oxacyclohexadec-13-en-2,6-dion ,(4S, 7R, δS, 9S I 13Z, 16S (E)) - 4, δ-Dihydroxy-5,5,7 ) 9,13-pentamethyl-16- [1- (2-methyl-1,3-thiazole 4-yl) prop-1 -en-2-yl] oxacyclohexadec-13-ene-2,6-dione,
(4S)7R,δS,9S,10E,13Z,16S(E))-4,δ-Dihydroxy-5l5,7,9,13-pentamethyl-16-[1-(2- methyl-I .S-thiazol^-yOprop-i-en^-ylJ-oxacyclohexadec-IO.IS-dien^.e- dion , (4S,7R,8S>9S,10E,13Z,16S(E))-4,8-Dihydroxy-5,5,7,9-tetramethyl-13- trifluormethyl-16-[1 -(2-methyl-1 ,3-thiazol-4-yl)prop-1 -en-2-yl]- oxacyclohexadec-10,13-diene-2,6-dion ,(4S ) 7R, δS, 9S, 10E, 13Z, 16S (E)) - 4, δ-Dihydroxy-5 L 5,7,9,13-pentamethyl-16- [1- (2-methyl-1-S -thiazole-y-propyl-1-yl-yl-oxacyclohexadec-IO.is-diene-dione, (4S, 7R, 8S > 9S, 10E, 13Z, 16S (E)) - 4,8-Dihydroxy-5,5,7,9-tetramethyl-13-trifluoromethyl-16- [1 - (2-methyl-1 , 3-thiazol-4-yl) prop-1 -en-2-yl] oxacyclohexadec-10,13-dienes-2,6-dione,
(18,3S(E)JS1IOR1I IS.^S.IβRH.H-Dihydroxy-β.β.iO.^.iβ-pentamethyl-a- [1-(2-methylsulfanyl-1 ,3-thiazol-4-yl)prop-1-en-2-yl]-4,17- dioxabicyclo[14.1.0]heptadecan-5,9-dion als einzelnes Stereoisomer oder als Mischung verschiedener Stereoisomeren und/oder pharmazeutisch akzeptables Salz(18,3S (E) JS 1 IOR 1 I IS. ^ SI RH.H β-dihydroxy-β. Β .io. ^. I β pentamethyl-a- [1- (2-methylsulfanyl-1, 3- thiazol-4-yl) prop-1-en-2-yl] -4,17-dioxabicyclo [14.1.0] heptadecane-5,9-dione as a single stereoisomer or as a mixture of different stereoisomers and / or pharmaceutically acceptable salt
9. Polymemanopartikel gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das oberflächenmodifizierende Agens eine Ziel erkennende Struktur enthält.9. Polymemanopartikel according to claim 8, characterized in that the surface-modifying agent contains a target-recognizing structure.
10. Polymemanopartikel gemäß Anspruch 9, wobei die Ziel erkennende Struktur ein negativ geladenes Molekülteil besitzt und durch elektrostatische Wechselwirkungen auf die kationische Partikeloberfläche aufgebracht wird.10. The polymembrane article according to claim 9, wherein the target recognizing structure has a negatively charged moiety and is applied to the cationic particle surface by electrostatic interactions.
11. Polymemanopartikel gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Ziel erkennende Struktur ausgewählt ist aus einer Liste enthaltend einen Antikörper, ein Protein, ein Polypeptid, ein Polysaccharid, ein DNA Molekül, ein RNA Molekül, eine Nukleinsäure, ein Lipid, ein Carbohydrat oder Kombinationen aus den vorgenannten .11. Polymemanopartikel according to claim 9, characterized in that the target-detecting structure is selected from a list containing an antibody, a protein, a polypeptide, a polysaccharide, a DNA molecule, an RNA molecule, a nucleic acid, a lipid, a carbohydrate or Combinations of the aforementioned.
12. Polymemanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1-11 dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der Teilchen zwischen 1-800 nm beträgt.12. Polymemanopartikel according to any one of claims 1-11, characterized in that the size of the particles is between 1-800 nm.
13. Verwendung eines Polymernanopartikels gemäß einem der Ansprüche 1- 12 für die Therapie von Tumorerkrankungen oder Erkrankungen die mit13. Use of a Polymernanopartikels according to any one of claims 1- 12 for the treatment of tumor diseases or diseases with
Entzündungsreaktionen einhergehen und/oder für die Diagnose oder das Monitoring einer Therapie. Associated with inflammatory reactions and / or for the diagnosis or monitoring of a therapy.
14. Verfahren zur Herstellung eines Polymernanopartikels gemäß einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Verfahrensschritte durchgeführt werden: a) Lösen des kationischen Polymers in einem organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch mit Wasser b) Lösen des wasserunlöslichen Polymers in einem organischen Lösungsmittel c) Getrenntes oder gemeinsames Lösen eines oder mehrerer Wirkstoffe in einem organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch mit Wasser, d) Herstellen eines vollständig gelösten Gemisches aus kationischem Polymer, wasserunlöslichem Polymer und Wirkstoff durch Zusammengeben der hergestellten Einzellösungen e) Einbringen des Gemisches in eine tensidhaltige Lösung, f) Entfernen des Lösungsmittels und gegebenenfalls Reinigen der14. A process for producing a polymer nanoparticle according to any one of claims 1-12, characterized in that the following process steps are carried out: a) dissolving the cationic polymer in an organic solvent or a solvent mixture with water b) dissolving the water-insoluble polymer in an organic solvent c Separately or jointly dissolving one or more active substances in an organic solvent or a solvent mixture with water, d) preparing a completely dissolved mixture of cationic polymer, water-insoluble polymer and active ingredient by combining the prepared individual solutions. E) introducing the mixture into a surfactant-containing solution, f Removing the solvent and, if necessary, cleaning the
Partikeldispersion, g) gegebenenfalls Lyophilisieren h) Gegebenenfalls elektrostatische Oberflächenmodifikation der Partikel durch Zusammenfügen von Nanopartikeldispersion und modifizierendem Agens in geeignetem Mengenverhältnis i) Gegebenenfalls erneut Entfernen des Lösungsmittels und/oderIf appropriate, electrostatic surface modification of the particles by combining nanoparticle dispersion and modifying agent in a suitable ratio i) optionally again removing the solvent and / or
Dispergens, gegebenenfalls LyophilisierenDispergens, optionally lyophilize
15. Verwendung eines Nanopartikels gemäß einem der Ansprüche 1-14 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung /Arzneiform unter Verwendung pharmazeutisch akzeptabler Hilfsstoffe.15. Use of a nanoparticle according to any one of claims 1-14 for the preparation of a pharmaceutical preparation / dosage form using pharmaceutically acceptable excipients.
16) Kit bestehend aus den Partikeln gemäß Anspruch 1-12, die ein Diagnostikum und ein Epothilon gemeinsam oder getrennt verkapselt enthalten.16) Kit consisting of the particles according to claim 1-12, containing a diagnostic agent and an epothilone encapsulated together or separately.
17) Kit gemäß Anspruch 16 bestehend aus getrennt hergestellten nanopartikulären Systemen (a) und (b) derselben Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1-12, enthaltend (a) ein in einen Partikel verkapseltes Diagnostikum und (b) ein in einen Partikel verkapseltes Epothilon, wobei die Partikel gemeinsam oder getrennt, gegebenenfalls verdünnt, verabreicht werden können.17) Kit according to claim 16 consisting of separately prepared nanoparticulate systems (a) and (b) of the same composition according to any one of claims 1-12, containing (a) a diagnostic encapsulated in a particle; and (b) an epothilone encapsulated in a particle, which particles may be administered together or separately, optionally diluted.
18) Kit gemäß Anspruch 17, wobei die Bestandteile (a) und (b) in festem i Zustand vorliegen und zusätzlich gegebenenfalls ein Mittel (c) enthalten ist, das geeignet ist, die nanopartikulären Systeme (a) und (b) gegebenenfalls wahlweise getrennt oder zusammen zu lösen oder zu dispergieren. 18) Kit according to claim 17, wherein the components (a) and (b) are in a solid state and additionally optionally an agent (c) is present, which is suitable, the nanoparticulate systems (a) and (b) optionally optionally separated or dissolve or disperse together.
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