WO2001077362A1 - Immunoassay of anti-hm1.24 antibody - Google Patents

Immunoassay of anti-hm1.24 antibody Download PDF

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WO2001077362A1
WO2001077362A1 PCT/JP2001/002964 JP0102964W WO0177362A1 WO 2001077362 A1 WO2001077362 A1 WO 2001077362A1 JP 0102964 W JP0102964 W JP 0102964W WO 0177362 A1 WO0177362 A1 WO 0177362A1
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antibody
soluble
antigen
protein
antigen protein
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PCT/JP2001/002964
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Inventor
Yasuko Kinoshita
Yuji Ishikawa
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention also provides (A3) the above method, wherein the soluble HM1.24 antigen has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 17.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a sandwich ELISA system using an HA-tagged soluble antigen.
  • FIG. 2 is a diagram comparing the amount of soluble antigen produced by the HA-tagged soluble HM1.24 antigen-producing cell line in the culture supernatant. The higher the dilution ratio, the higher the production.
  • Figure 4 shows the standard curve of humanized anti-HM1.24 antibody in a Sandwich ELISA system using purified antigens diluted 5 'from 750-fold to 3-fold. This is a graph.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of the cDNA encoding the HM1.24 antigen protein and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 7 shows the nucleotide sequence of the cDNA encoding the HM1.24 antigen protein and the corresponding amino acid sequence.
  • Figure 10 is a drawing substitute showing the results of immunoprecipitation using anti-HM1.24 antibody and detection of HM1.24 antigen in various cell lines and HM1.24 expressing CH0 cells by Western blotting. It is a photograph. After immunoprecipitation using Sepharose 4B (lanes 1 to 6) or unbound Sepharose 4B (lanes 7 and 8) bound to the anti-HM1.24 antibody, Western blotting was performed using the anti-HM1.24 antibody. HM1.24 antigen was detected (displayed on the right). (*; Anti-HM1.24 antibody heavy chain)
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 has an amino acid in which 1 or more, preferably 1 or 42 or less, more preferably 1 or 17 or less amino acid residues have been deleted. You may. Alternatively, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, one or more, preferably 1 or 50 or less, more preferably 1 or 14 or less amino acids are added to the amino acid sequence. You may.
  • the soluble HM1.24 antigen protein used in the present invention may be simultaneously modified by the above amino acid substitution, deletion and / or addition.
  • Soluble bandage 1. 24 antigen protein can exhibit its biological activity if it has an amino acid sequence from amino acid Asn at position 1 to amino acid Arg at position 90 in SEQ ID NO: 5. It's clear. Therefore, the soluble HM1.24 antigen protein of the present invention comprises an amino acid sequence from amino acid Asn at position 1 to amino acid Arg at position 90 in SEQ ID NO: 5. Sequence, or substitution, deletion and / or replacement of one or more amino acid residues with respect to the amino acid sequence from amino acid Asn at position 1 to Arg at position 90. It may be a soluble HM1.24 antigen protein having an amino acid sequence modified by addition.
  • Soluble HM1.24 antigen protein has the amino acid sequence from amino acid Arg at position 90 to amino acid Gin at position 132 in SEQ ID NO: 5 as long as it has the biological activity, or this amino acid It may be a soluble band 1.24 antigen protein having an amino acid sequence modified by substitution, deletion and / or addition of one or more amino acid residues to the sequence.
  • a soluble HM1.24 antigen protein having an amino acid sequence modified by substitution, deletion and / or addition of one or more amino acid residues to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5; And a soluble HM1.24 antigen protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 17, 10 or 18, or 11 or 19.
  • the soluble marauder 1.24 antigen protein of the present invention may have an amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence or absence of glycosylation, location of glycosylation, sugar, depending on the species of origin, the host producing them and / or the purification method.
  • the chain structure, phosphorylation state, and the presence or absence of Z or disulfide bonds are different.
  • the protein may have any structure as long as it can be suitably used in the present invention. Human is preferred as the species from which the protein is derived.
  • Examples of the DNA encoding the soluble HM1.24 antigen protein of the present invention include a base sequence consisting of base adenine at position 1 to base guanine at position 396 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the DNA encoding the soluble HM1.24 antigen protein of the present invention may be any DNA as long as it has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • Examples of such DNA include dienomic DNA, cDNA, and synthetic DNA. These may be cDNA libraries obtained from various cells, tissues or organs, or species other than human, DNA obtained from a dienomic library, or may be a commercially available DNA library. Good.
  • the vector used for these libraries may be any vector such as plasmid, bacterio phage, YAC vector and the like.
  • the DNA encoding the soluble HM1.24 antigen protein of the present invention also includes a polypeptide that hybridizes to the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and has the biological activity of the soluble HM1.24 antigen protein. May be DNA to be loaded.
  • Examples of the conditions under which DNA encoding the soluble HM1.24 antigen protein hybridizes include DNA that hybridizes under appropriate stringency conditions. Examples of such hybridization conditions include low DNA.
  • stringency conditions include, for example, cleaning conditions provided by 42 ° C., 5 ⁇ SSC, 0.1% sodium dodecyl sulfate, and 50% formamide. More preferably, high stringency conditions can be mentioned.
  • Conditions of high stringency include, for example, 60 ° (: 0.1 SSC, 0.1% sodium dodecyl sulfate).
  • the cleaning conditions provided by the camera It is already known that a protein encoded by a DNA that hybridizes under appropriate conditions to a nucleotide sequence encoding a protein has the same biological activity as the protein.
  • the soluble HM1.24 antigen protein of the present invention is encoded by the above-mentioned “hybridizing DNA”, and also includes a protein having the biological activity of the soluble HM1.24 antigen protein.
  • peptides include FLAG (Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6 XHis consisting of 6 His (histidine) residues, lOXHis, and influenza agglutinin. (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, pl8HIV fragment, T7_tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen fragment, lck tag, a-tubulin fragment, B-tag A known peptide such as a fragment of Protein in C or the like is used.
  • polypeptides include GST (daltathione-S-transferase), HA, immunoglobulin constant region, b-galactosidase, MBP (maltose binding protein) and the like. These can be used commercially available ones.
  • the DNA encoding the protein of the present invention can be constructed from the above-described DNA by a commercially available kit known in the art. For example, it can be constructed by digestion with a restriction enzyme, addition of a linker, insertion of an initiation codon (ATG) and a no or termination codon (ATT, TGA or TAG), and the like.
  • the protein expression vector of the present invention may be any expression vector that is suitably used in the present invention.
  • expression vectors include mammalian-derived expression vectors, such as pEF, pCDM8, insect cell-derived expression vectors, such as pBacPAK8, plant-derived expression vectors, such as ⁇ 1, pMH2, and animal virus-derived expression vectors.
  • P HSV mammalian-derived expression vectors
  • pMV insect cell-derived expression vectors
  • pBacPAK8 insect cell-derived expression vectors
  • plant-derived expression vectors such as ⁇ 1, pMH2, and animal virus-derived expression vectors.
  • P HSV pMV
  • expression vectors derived from yeast e.g. PNVl l
  • expression vectors derived from Bacillus subtilis e.g. pPL608, Rokappatauitaderutaomikuron
  • expression vectors derived from Escherichia coli for example pGEX, pGEMEX, include
  • the expression vector of the protein of the present invention may be produced, for example, by ligating DNA coding for the soluble HM1.24 antigen protein downstream of the promoter and introducing it into the expression vector.
  • a Z motor a mammalian promoter
  • Enhancers such as EF1-a promoter / enhancer, gamma actin promoter / enhancer, promoters derived from insect vinoles, such as polynuclear (polyhedrin) virus mouth motors, and plant-derived motorhead enhancers.
  • Tano Komozyk Winores promoter Jenhanser Promoters / enhancers derived from animal vinoles, e.g., SV40 motor / enhancer, human CMV promoter Z enhancer, promoters / enhancers derived from yeast, e.g., alcohol dehydrogenase promoter no enhancer, E. coli-derived promoter Z enhancer, e.g., Lac promoter Z Enhancer, Trp Promoter / Enhancer, Tac Promoter / Enhancer.
  • the protein used in the present invention can be obtained as a recombinant protein produced using a gene recombination technique as described above.
  • a recombinant protein is produced by cloning the nucleotide sequence of the gene described herein from a cell, tissue, or organ that expresses them, incorporating the nucleotide sequence into an appropriate vector, and introducing the vector into a host. This recombinant protein can be used in the present invention.
  • mRNA encoding the gene is isolated from cells, tissues, or organs expressing the protein used in the present invention.
  • mRNA Can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. and Sacchi, N. et al. , Anal. Biochem., 1987) lb2, 156-159).
  • mRNA Purification Kit Pharmacia
  • mRNA can be directly prepared by using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • CDNA of the gene is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA can also be synthesized using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Corporation) or the like.
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Corporation) or the like.
  • PCR polymerase chain reaction
  • promoters / enhancers that can be used for protein expression include virus promoters / enhancers such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, and simian virus 40 (SV40).
  • Nfa click ter 1 a may be used promoter Z Enhansa from mammalian cells (HEF1 a).
  • HEF1 a mammalian cells
  • expression can be achieved by operably linking a useful promoter commonly used, a signal sequence for protein secretion, and a gene to be expressed.
  • the promoter include a lacZ promoter and an araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), and when the araB promoter is used, the method of Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043).
  • any production system can be used for protein production.
  • Production systems for protein production include in vitro and in vivo production systems.
  • Examples of in vitro production systems include production systems using eukaryotic cells and production systems using prokaryotic cells.
  • CH0 cells include dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) and CHO Kl (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) can be suitably used.
  • yeast such as the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces' Saccharomyces cerevisiae
  • filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspernogillus niger
  • prokaryotic cells there are production systems using bacterial cells.
  • Bacteria As cells Escherichia coli (E. coli) and Bacillus subtilis are known.
  • Proteins can be obtained by transforming these cells with the desired DNA and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture solution. At that time, a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) may be used in combination, or serum-free culture may be performed. The pH during culturing is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 200 hours, and if necessary, the medium is replaced, aerated, and agitated.
  • FCS fetal calf serum
  • examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants.
  • the desired DNA is introduced into these animals or plants, and the protein is produced and recovered in the animals or plants.
  • mice When using animals, there are production systems using mammals and insects. Goats, pigs, sheep, mice, and mice can be used as mammals (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). When a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • a silkworm When a silkworm is used, a paculovirus into which a target DNA has been inserted is used to infect a chick, and a desired protein is obtained from the body fluid of the silkworm (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).
  • tobacco When using a plant, for example, tobacco can be used.
  • a plant expression vector for example, pMON530, and this vector is introduced into a nocteria such as Agrobacterium tumefaciens.
  • tobacco for example, Nicotiana tabacum
  • the desired protein is obtained from the leaves of the tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. 1 994) 24, 131-138).
  • Known methods for introducing an expression vector into a host include, for example, the calcium phosphate method (Virology (1973) 52, 456-467) and the electroporation method (EMBO J. (1982) 1 , 841-845).
  • sequences with higher expression efficiency can be designed in consideration of the codon usage of the host used for expression (Grantham, R. et al., Nucleic Acids Research (1981) 9, r43-r74). .
  • the gene is introduced into these animals or plants as described above, and proteins are produced and recovered in the animals or plants.
  • the protein expressed and produced as described above can be separated from the host inside and outside the cell and from the host and purified to homogeneity.
  • the separation and purification of the protein used in the present invention may be carried out by using the separation and purification methods used for ordinary proteins, and is not limited at all.
  • the concentration of the protein can be measured using a known method. For example, measurement of absorbance or Bradford method may be used.
  • the present invention includes a step of reacting a soluble HM1.24 antigen protein with an anti-HM1.24 antibody contained in a test sample to detect or measure an anti-HM1.24 antibody bound to the soluble HM1.24 antigen protein.
  • the present invention relates to a method for immunochemical measurement of a soluble HM1.24 antigen protein.
  • the immunochemical measurement method provided in the present invention is performed as an in vitro assay system.
  • One example of this method is schematically shown in FIG.
  • In vitro Atsushi systems are performed in non-cellular systems. Specifically, the soluble HM1.24 antigen protein was bound to the support, a test sample containing the anti-band 1.24 antibody was added to this protein, and the mixture was incubated, washed, and then washed to remove the soluble HM1.24 antigen bound to the support. What is necessary is just to detect or measure the binding of the anti-HM1.24 antibody to the protein. Or, specifically, The anti-HM1.24 antibody was bound to the support, and a test sample containing the soluble HM1.24 antigen protein was added to this protein. The sample was incubated, washed, and washed to dissolve the anti-HM1.24 antibody bound to the support. The binding of the HM1.24 antigen protein may be detected or measured.
  • Soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody is a protein produced from cells that express them uniquely, cells transfected with the DNA encoding them, and animals or plants transfected with the DNA encoding them. Can be used in a purified state or in a partially purified state.
  • Either purified or partially purified soluble HM1,24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody protein is bound to the support.
  • the protein can be immobilized on the support by standard methods.
  • the support to which the protein is bound include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, cellulose, and synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon.
  • beads and plates manufactured using them as raw materials are used.
  • a column filled with these may be used.
  • a multiwell plate eg, a 96-well multiwell plate
  • a biosensor chip can be used.
  • the binding between the protein and the support may be performed by a commonly used method such as chemical bonding or physical adsorption.
  • an antibody that specifically recognizes a protein can be bound to a support in advance by the above-described method, and the antibody can be bound to the protein to bind.
  • the binding between soluble HM1.24 antigen protein and anti-HM1.24 antibody, which can be bound via avidin / biotin is usually buffered. Performed in liquid.
  • the buffer for example, a phosphate buffer, a Tris buffer, or the like is used. Incubation is performed under conditions that are already commonly used, such as incubation at 4 ° C to room temperature for 1 hour to 24 hours.
  • the post-incubation washing may be any as long as it does not hinder the binding between the soluble HM1.24 antigen protein and the anti-HM1.24 antibody.
  • a buffer containing a surfactant is used.
  • the surfactant for example, 0.05% Tween 20 is used.
  • test sample containing the soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody measured in the present invention includes human body fluids (blood, serum, urine, joint fluid, etc.), cell culture supernatant, Animal secretions (milk, etc.), pharmaceutical preparations, and the like.
  • a control group may be provided together with a group in which a test sample is brought into contact with a protein.
  • a negative control group containing no test sample and / or a positive control group containing a purified soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody standard were used. Can be kept.
  • the bound protein can be detected by the immunochemical measurement method of the present invention. Alternatively, the bound protein can be quantitatively measured. In these cases, the results obtained in the negative control group without the test sample, the results obtained in the group with the test sample and / or the purified soluble HM1.24 antigen protein or anti-band 1.24 antibody Including goods By comparing the results obtained with the positive control group, the binding between the soluble HM1.24 antigen protein and the anti-HM1.24 antibody can be detected.
  • the results of their detection are obtained as numerical values, and by comparing those numerical values, the soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody contained in the test sample can be quantitatively measured. Can also. When measuring quantitatively, compare the values obtained in the negative control group without the test sample with the values obtained in the group to which the test sample containing the soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody was applied. As a result, the amount of binding between the soluble HM1.24 antigen protein and the anti-bandwidth antibodies 124 can be quantified. If soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody is contained in the test sample, soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody is detected or measured by the presence of the bound protein. be able to.
  • a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon can be used as a means for detecting or measuring a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody in a test sample.
  • a biosensor that utilizes the surface plasmon resonance phenomenon allows real-time observation of the interaction between protein and protein as a surface plasmon resonance signal without labeling using a small amount of protein. It is possible (for example, BIAcore; manufactured by Pharmacia). Therefore, it is possible to detect or measure the binding between the soluble HM1.24 antigen protein and the anti-HM1.24 antibody by using a biosensor such as BIAcore.
  • a test sample containing an anti-HM1.24 antibody or a soluble HM1.24 antigen protein is brought into contact with a sensor chip on which a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody is immobilized, and the soluble HM1.
  • Anti-HM1.24 antibody or soluble HM1.24 antigen protein that binds to .24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody can be detected or measured as a change in resonance signal.
  • the sensor chip CM5 (Biosensor) is activated to immobilize the soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody on the sensor chip. That is, the sensor chip is activated by an aqueous solution of ED CI NHS (200 mM EDC (N-ethyl_ ⁇ '-(3-dimethylaminopropyl pill) carbonate hydrochloride), 50 mM NHS (N-hydroxysuccinimide)). After that, the sensor chip is washed with HBS buffer (10 mM HEPES pH7, 150 mM NaCl, 3.4 mM MEDTA, 0.05% Tween20).
  • HBS buffer 10 mM HEPES pH7, 150 mM NaCl, 3.4 mM MEDTA, 0.05% Tween20.
  • a test sample containing an appropriate amount of an anti-HM1.24 antibody or a soluble HM1.24 antigen protein dissolved in an HBS buffer is brought into contact with a sensor chip to be immobilized.
  • the remaining active groups on the sensor chip are blocked with an ethanolamine solution (1M ethanolamine hydrochloride, pH 8.5). Wash the sensor chip again with HBS buffer and use it for binding evaluation.
  • a test sample containing an appropriate amount of an anti-HM1.24 antibody or soluble HM1.24 antigen protein dissolved in an HBS buffer is injected.
  • the amount of the anti-HM1.24 antibody or soluble HM1.24 antigen protein in the test sample bound to the soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody immobilized on one sensor chip was determined by the resonance signal value. Is observed as an increase in
  • a control group may be set up together with the group containing the test sample.
  • a negative control containing no test sample was used.
  • the bound protein can be quantitatively measured as a change in the resonance signal value.
  • the results obtained in the negative control group containing no test sample, the results obtained in the group containing the test sample, and / or a known amount of soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody were used. By comparing the results obtained with the positive control group containing the target protein, the target protein in the test sample can be detected or measured.
  • a primary antibody that specifically recognizes a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody is used as a means for detecting or measuring the protein in the bound test sample. Can be used.
  • a test sample is brought into contact with a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-1.224 antibody, washed, and the bound protein is detected or measured with a primary antibody that specifically recognizes the protein. That is, preferably, one protein bound to the support is brought into contact with a test sample containing the other protein. After incubating and washing, the bound protein may be detected or measured with a primary antibody that specifically recognizes the protein.
  • the primary antibody is preferably labeled with a labeling substance.
  • the soluble HM1.24 antigen protein may be fused to another peptide or polypeptide. Therefore, anti-band 1.25 antibody can be used to detect soluble HM1.24 antigen protein contained in the test sample, and other peptides or polypeptides fused with soluble HM1.24 antigen protein can be used. Antibodies to the peptides can be used. Further, in order to detect the anti-HM1.24 antibody contained in the test sample, an antibody that specifically recognizes the anti-HM1.24 antibody can be used. Anti-HM1.24 antibody In the case of a mouse antibody, an anti-mouse immunoglobulin antibody can be used as an antibody that specifically recognizes the anti-HM1.24 antibody. When the anti-HM1.24 antibody is a chimeric antibody or a humanized antibody, an anti-immunoglobulin antibody can be used as an antibody that specifically recognizes the anti-HM1.24 antibody.
  • the protein can be labeled by a commonly known method.
  • the labeling substance include a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, biotin / avidin and the like.
  • labeling substances commercially available labeling substances can be used. Is to radioisotopes, for example 3 2?, 3 3 P, 1 3 1 I, 1 2 5 I, 3 H, 1 C, 3 5 S and the like.
  • the enzyme include alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -darcosidase and the like.
  • the fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate (FITC) and rhodamine. These can be obtained commercially and labeled by a known method.
  • a solution containing the soluble bandage 1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody is added to the plate, and left overnight to fix it on the plate.
  • the antibody for each is immobilized on a plate in advance, and the immobilized antibody is treated with soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody. They may be combined. After washing the plate, block it with, for example, BSA to prevent nonspecific binding of the protein. Wash again and add a test sample containing anti-HM1.24 antibody or soluble HM1.24 antigen protein to the plate.
  • a group containing no test sample (negative control) and / or a group to which a known concentration of anti-HM1.24 antibody or soluble ⁇ 1.24 antigen protein was added were placed and incubated. I do. After incubation, wash and add antibodies to the test sample. After a suitable incubation, the plate is washed and the protein is detected or measured with a primary antibody that specifically recognizes the protein. For detection or measurement, in the case of a radioisotope, detection or measurement is performed by liquid scintillation. In the case of an enzyme, the substrate is added, and the enzymatic change of the substrate, for example, color development is detected or measured by an absorptiometer. For fluorescent substances, detect or measure with a fluorometer. By comparing these results with the values obtained for the control group, the test sample containing the inhibitor can be determined.
  • the soluble HM1.24 antigen protein or the anti-HM1.24 antibody in the test sample is detected or measured by using a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody.
  • a primary antibody that specifically recognizes and a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody can be used.
  • a test sample is brought into contact with a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody, incubated, and then washed to bind the bound protein to the protein.
  • Detection or measurement is performed with a primary antibody that recognizes the primary antibody and a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody. That is, specifically, a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody is immobilized on a support, and a test sample is contacted. After the incubation, washing is performed, and the bound protein may be detected or measured with a primary antibody that specifically recognizes the protein and a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody.
  • the secondary antibody is preferably labeled with a labeling substance.
  • the antibody can be labeled by the above-mentioned method generally known.
  • the test sample containing the inhibitor can be determined.
  • the soluble HM1.24 antigen protein may be fused to another peptide or polypeptide. Therefore, an anti-HM1.24 antibody can be used as a temporary antibody for detecting the soluble HM1.24 antigen protein contained in the test sample, and other antibodies fused with the soluble HM1.24 antigen protein can be used. Antibodies to the peptide or polypeptide can also be used. In addition, in order to detect the anti-HM1.24 antibody contained in the test sample, the anti-HM1.24 antibody was specifically identified. Differentially recognizing antibodies can be used.
  • an anti-mouse immunoglobulin antibody can be used as a primary antibody that specifically recognizes the anti-HM1.24 antibody.
  • an anti-band 1.24 antibody is a chimera antibody or a humanized antibody
  • an anti-immunoglobulin antibody can be used as a primary antibody that specifically recognizes the anti-HM1.24 antibody.
  • an antibody that specifically recognizes the primary antibody can be appropriately selected as the secondary antibody. For example, if the primary antibody is a hidge antibody, an anti-hidgymno glopurin antibody can be used. In addition, when the primary antibody is a rabbit antibody, an anti-rabbit antibody can be used.
  • the present invention is particularly preferably carried out using ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) as follows. That is, soluble HM1. 24 antigen protein and fused HA antibody immobilized buffer against (Flu Enza agglutinin) (0. 1 M NaHC0 3, 0. 02% NaN 3, pH9. 6) Ri is diluted by the . An appropriate amount of the diluted aqueous solution is added to each well of a 96-well imnoplate (manufactured by Nunc), and the mixture is immobilized at 4 ° C to solidify.
  • ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
  • soluble HM1.24 antigen protein fused with HA diluted in dilution buffer 1% ⁇ SA, 0.5% Tween20, PBS
  • dilution buffer 1% ⁇ SA, 0.5% Tween20, PBS
  • a certain amount of a test sample containing a chimeric anti-HM1.24 antibody having a human IgG antibody constant region (C region) is added, and incubated at room temperature for 1 hour.
  • C region human IgG antibody constant region
  • Each well is washed three times with wash buffer, 5000-fold alkaline phosphatase diluted labeled catcher formic anti human I g G antibody (manufactured by IB I) 100 mu 1 was added to each well at a dilution buffer, for 1 hour at room temperature Incubate.
  • Each well is washed five times with wash puffer developing solution; the (substrate puffer. 50 mM NaHC0 3, 10mM MgCl 2, pH9 8 to Sigma 104 dissolved in a concentration of 1 mg / ml) 100 ⁇ 1 to each well
  • the absorbance at 405 ⁇ m is measured using a microplate reader (Model 3550, manufactured by BIO-RAD).
  • the chimeric anti-HM1.24 antibody can be detected or measured by comparing these results with the values obtained in the negative control group and the no control group or the positive control group.
  • a soluble HM1.24 antigen protein can be detected or measured by the same method.
  • the screening method of the present invention can also be used for High Throughput Screening (HTS). Specifically, carried out until Bro Kkingu manually, subsequent reaction is O over Bok Meshiyo Ni spoon by made by a mouth pots, it can be force s to achieve a High Throughput screening.
  • HTS High Throughput Screening
  • the antibody-immobilized buffer against HA (0. 1M NaHC0 3, 0. 02% NaN 3, pH9. 6) Ri is diluted by the.
  • An appropriate amount of the diluted aqueous solution is added to each well of a 96-well immunoplate (manufactured by Nunc), and the mixture is incubated at 4 ° C for solid phase immobilization.
  • washing buffer prepared with 0.05% Tween20 in PBS
  • BSA manufactured by SI GMA
  • soluble HMl.24 antigen protein fused with HA diluted with dilution buffer (1% BSi, 0.5% Tween20, PBS). Incubate overnight at 4 ° C to bind the anti-HA antibody and soluble HM1.24 antigen protein fused with HA.
  • iiB iomek2000 HTS system manufactured by Beckman
  • ⁇ Set the immunoplate here, and test sample containing chimeric anti-HM1.24 antibody, primary antibody against chimeric anti-HM1.24 antibody
  • the dispenser as the Bi omek 2000 dispensing machine there have the Mul t ipi P et t e96 Penetration dispenser of the solution Imuno plates to each well by using the (Sagian Ltd.) Dispensing and solution removal can be performed.
  • EL404 microplate washers BioTek
  • a SPECTRAmax250 plate reader (Molecular Devices) can be used to measure the absorbance.
  • the program is set to perform the following operations. That is, wash each well three times with a washing buffer, and add a fixed amount of the test sample and the test sample containing the chimeric anti-HM1.24 antibody diluted with dilution buffer (1% BSA, 0.5% Tween20, PBS). At the same time, place a group containing no test sample (negative control) and a group to which a known concentration of chimera anti-HM1.24 antibody was added (positive control), and incubate them at room temperature for 1 hour.
  • dilution buffer 1% BSA, 0.5% Tween20, PBS
  • wash each well three times with wash buffer add 100 ⁇ l of egret anti-human IgG antiserum (New England Biolabs) diluted 5000 times with dilution buffer to each well and incubate at room temperature for 1 hour .
  • wash each well three times with the washing buffer add 100 ⁇ l of an alga phosphatase-labeled goat anti-money IgG antibody (manufactured by TAG0) diluted 5,000-fold with a dilution buffer to each well, and incubate for 1 hour at room temperature.
  • an alga phosphatase-labeled goat anti-money IgG antibody manufactured by TAG0
  • each well is washed five times with washing buffer, color development solution (substrate buffer;. 50 mM NaHC0 3, 10 mM MgCl 2, pH9 of 8 to lmg / ml concentration this ⁇ Army P-Nitrophenyl phosphate (manufactured by Sigma)) was added to each well, and allowed to react at room temperature. Then, the absorbance at 405 nm was measured using a microplate plate, Biomek plate. ) Measurement is carried out using a probe (manufactured by Beckman / Molecular Devices). By comparing these results with the values obtained for the control group, the chimeric anti-HM1.24 antibody contained in the test sample can be detected or measured. In addition, a soluble HM1.24 antigen protein can be detected or measured by the same method.
  • the immunochemical assay method provided by the present invention can measure soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody up to a concentration of 500 pg / ml.
  • the antibody used in the present invention may be a commercially available antibody or an antibody contained in a commercially available kit, or may be obtained as a monoclonal antibody or a polyclonal antibody using known means. .
  • the monoclonal antibody is immunized with a desired sensitizing antigen using a conventional immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. Thus, it can be produced by screening the monoclonal antibody-producing cells.
  • a monoclonal or polyclonal antibody may be prepared as follows.
  • the sensitizing antigen from which the antibody is obtained is not limited to the animal species from which it is derived, but the mammal, eg, human, mouse or rat, from which the peptide or polypeptide used in the present invention actually originates. Origins are preferred. Of these, human-derived sensitizing antigens are particularly preferred.
  • a human soluble HM1.24 antigen protein when used as a sensitizing antigen, its nucleotide sequence and amino acid sequence are as disclosed in this specification. It can be obtained using gene sequences.
  • those peptides or polypeptides to be fused with the soluble protein 1.24 antigen protein are used as the sensitizing antigen, those peptides or polypeptides may be chemically synthesized, It can be obtained by genetic engineering techniques.
  • the protein, peptide or polypeptide used as a sensitizing antigen its full length may be used, or a fragment thereof may also be used. Examples of the fragment include a C-terminal fragment and an N-terminal fragment.
  • cells expressing a protein, peptide or polypeptide used as a sensitizing antigen can be used as the sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Teeth, magpies, and primates are used.
  • mice for example, mice, rats, hamsters and the like are used.
  • Egrets are used as egrets.
  • monkeys are used as primates.
  • monkeys of the lower nose for example, cynomolgus monkeys, macaques, baboons, and chimpanzees are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphat e-Buffe red Saline), physiological saline, or the like, and the suspension is mixed with an ordinary adjuvant, for example, an appropriate amount of Freund's complete adjuvant, if desired.
  • PBS Phosphat e-Buffe red Saline
  • physiological saline or the like
  • an ordinary adjuvant for example, an appropriate amount of Freund's complete adjuvant, if desired.
  • a suitable carrier can be used during immunization of the sensitizing antigen. Immunize in this way and have the desired An increase in the antibody level is confirmed by a conventional method.
  • the blood of the mammal sensitized with the antigen is taken out.
  • the serum is separated from the blood by a known method.
  • a serum containing the polyclonal antibody may be used as the polyclonal antibody, and if necessary, a fraction containing the polyclonal antibody may be further isolated from the serum.
  • immune cells may be removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • preferred immune cells used for cell fusion include splenocytes, in particular.
  • Mammalian myeloma cells as the other parent cells to be fused with the immune cells have already been described.
  • Various known cell lines for example, P3 (P3x63Ag8.653) (Kearney, JF et al., J. Immunol. (1979) 123, 154 8-1550), P3x63Ag8.
  • the cell fusion of the immune cells and myeoma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Milstein et al. (Galfre, G. and Milstein, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46. ) Etc. You.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture in the presence of a cell fusion promoter.
  • a fusion promoter for example,
  • Polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like can be used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added to increase the fusion efficiency.
  • the ratio of the use of the immune cells to the myeloma cells is preferably, for example, 1 to 10 times the number of the immune cells to the myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, an RPMI 1640 culture medium, a MEM culture medium suitable for the culture of the myeloma cell line, and other ordinary culture mediums used for cell culture of this type are used. It is possible, and serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • a predetermined amount of the immune cell and the myeloma cell are mixed well in the culture medium, and a PEG solution previously heated to about 37 ° C., for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is prepared.
  • a PEG solution previously heated to about 37 ° C.
  • a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is prepared.
  • the desired fused cells are formed by adding and mixing at a concentration of 30 to & 0% (w / v). Subsequently, by repeatedly adding an appropriate culture solution and centrifuging to remove the supernatant, a cell fusion agent or the like unfavorable for the growth of the hybridoma can be removed.
  • the hybridoma is selected by culturing it in a normal selective culture medium, for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • a HAT culture medium a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • the culture in the HAT culture solution is continued for a time sufficient for the death of cells other than the target hybridoma (non-fused cells), usually several days to several weeks.
  • screening and cloning of hybridomas producing the desired antibody are performed by the usual limiting dilution method.
  • human lymphocytes such as those infected with Epstein-Barr virus, are sensitized in vitro with peptides or polypeptides, their expressing cells or their lysates, and sensitized. It is also possible to fuse a lymphocyte with a myeloma cell having permanent division ability derived from human, for example, U266, to obtain a hybridoma producing a desired human antibody having a peptide or polypeptide binding activity ( JP-A-63-17688).
  • a transgenic animal having a human antibody gene repertoire is immunized with a peptide or polypeptide serving as an antigen, an expression cell thereof, or a lysate thereof to obtain antibody-producing cells.
  • a human antibody to the peptide or polypeptide used in the present invention may be obtained using a hybridoma fused to a single cell (see International Patent Application Publication Nos. 2-03918, W093-2227, and simplified version 4). -02602, W094-25585, Figures 6-33735 and 6-34096;).
  • the hybridomas producing monoclonal antibodies produced in this way can be subcultured in ordinary culture medium and can be stored for a long time in liquid nitrogen. .
  • a method of culturing the hybridoma according to a usual method and obtaining a culture supernatant thereof, or transferring the hybridoma to a mammal compatible therewith A method of transplanting, growing, and obtaining ascites is used.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • cells in which immune cells such as sensitized lymphocytes that produce antibodies are immortalized with oncogenes may be used.
  • the thus obtained monoclonal antibody can also be obtained as a recombinant antibody produced using a gene recombination technique.
  • a recombinant antibody is produced by cloning an antibody gene from an immune cell such as a hybridoma or a sensitized lymphocyte producing the antibody, incorporating the clone into an appropriate solid, introducing the clone into a host, and producing the recombinant antibody.
  • the recombinant antibody can be used (see, for example, Borrebaeck, CA K. and Larrick, JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). .
  • the antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified antibody as long as it has a desired binding activity.
  • the antibody fragment include Fab, F (ab ') 2, Fv, or a single chain Fv (scFv) in which an Fv of an H chain and an L chain are linked by an appropriate linker.
  • an antibody is treated with an enzyme, for example, papine or pepsin, to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed, and the gene is introduced into an expression vector.
  • a suitable host cell eg, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M.
  • the antibodies detected or measured by the immunochemical measurement method of the present invention include the above-mentioned antibodies, for example, antibodies produced by hybridomas, recombinant antibodies, chimeric antibodies, and humanized antibodies. Either may be used.
  • the antibody expressed and produced as described above can be separated from the host inside and outside the cell and from the host and purified to homogeneity.
  • the amount of the antibody used in the present invention Separation and purification may be performed by using the separation and purification methods used in ordinary proteins, and are not limited at all.
  • Columns used for affinity chromatography include a protein tin A column and a protein G column.
  • columns using Protein A column include Hyper D, POROS, Separose FF (Pharmacia), and the like.
  • Chromatography other than affinity chromatography includes, for example, ion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reversed-phase chromatography, and adsorption chromatography. Power S (Strategies for Protein Purification and Character Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatographies can be performed using liquid chromatography such as HPLC and FPLC.
  • ELISA Enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent antibody method for example, ELISA, EIA (enzyme immunoassay), RIA (radioimmunoassay) or fluorescent antibody method.
  • Hypri-Doma HM1.24 which produces anti-HM1.24 antibody, was submitted to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (FERM) on September 14, 1995. Deposited internationally as BP-5233 under the Pastoral Treaty.
  • Another embodiment of the present invention is a method of measuring the antigen-binding activity of an anti-HM1.24 antibody contained in a test sample and controlling the quality of the anti-HM1.24 antibody using the same. In a drug containing an antibody as an active ingredient, it is important that not only the amount of the antibody but also the biological activity of the antibody be appropriately maintained.
  • the biological activity of an antibody is the antigen-binding activity
  • confirming the level of an antibody that retains the antigen-binding activity in a pharmaceutical composition is a matter of determining the height of the active ingredient. It is indispensable for quality control of pharmaceuticals contained as a product.
  • the method of the present invention relates to a method for appropriately controlling the quality of a drug containing an anti-bandit 1.24 antibody as an active ingredient, and an anti-HM1.24 antibody and an anti-HM1.24 antibody whose quality is appropriately controlled.
  • a pharmaceutical composition containing an antibody as an active ingredient is provided.
  • the method of the present invention provides a method for producing an anti-HM1.24 antibody and a method for producing a pharmaceutical composition containing an anti-HM1.24 antibody as an active ingredient by providing an appropriate quality control method. Things.
  • HEF expression vector International Patent Application Publication No.W092-19759 containing the EF1a promoter prepared by digestion with EcoR I (Takara Shuzo) and Notl (Takara Shuzo), and an Ig leader sequence. Coat the HA tag dos genetic Napea the (Ame r sham Pharmac ia Co.), 50 mmo l / L Tr is -.
  • the Escherichia coli transformant was cultured overnight at 37 ° C in LB medium containing 50 / xg / mL ampicillin. From this culture, the alkaline method (Molecular loning: A Laboratory Manual, Sambrook et al.) Plasmid DNA was prepared according to the Old Ipring Harbor Laboratory Press, (1989)).
  • the gene in the extracellular region of the HM1.24 antigen was amplified by PCR using a Thermal Cycler (Perk in Elmer Cetus).
  • a Thermal Cycler Perk in Elmer Cetus
  • 100 pmol of the primers shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 10 mmol / L Tris-HC1, pH 8.3, 50 mmol / L KC1,
  • a mixture containing 0.1 mmol / L dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5 mmol / LM gCl 2 and 5-unit DNA polymerase Ampli Taq (Perkin Elmer Cetus) was first mixed at 94 ° C. After the first denaturation at The cycle was performed 30 times at 94 ° C for 1 minute, at 55 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1 minute, and finally, incubation was performed at 72 ° C for 10 minutes.
  • This PCR product was used as the gene for the extracellular region of HM1.24 antigen (SEQ ID NO: 5), and the plasmid DNA digested with Kpnl and BamHI was combined with 50 mmol / L Tris_HCl, pH 7.6, 10 mmol / L MgCl 2 , Incubate for 3 hours at 16 ° C in a reaction mixture containing 10 mM dithiothreitol, 1 mmol / L ATP, 50 mg / mL polyethylene glycol and 1 unit T4 DNA ligase (T0Y0B0). Connected. In the same manner as described above, the ligation reaction mixture was added to E. coli DH5o! Competent cells to obtain an E. coli transformant, from which plasmid DNA was prepared. This plasmid DNA was designated as HA-tagged soluble antigen expression plasmid, psHM.
  • the base sequence determination of psHM and psHM164 was performed using an automatic DNA sequencer (Applied Biosystem Inc.) and an aq Dye terminator / ycle Sequencing kit (.Applied Biosystem Inc.). Was performed according to The primers shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 (manufactured by Certainly Technology) were used. As a result, it was confirmed that the fusion protein (SEQ ID NO: 10 and 11) in which the HA tag peptide was linked to the soluble antigen was expressed.
  • Example 2 Establishment of cells expressing high levels of soluble human HM1.24 antigen
  • the linearized expression vectors (psHM and psHM164) obtained by digestion with Pvul (GIBC0-BRL) were prepared by the electroporation method. CH0 cell M The gene was introduced into the Bll strain (provided by the Medical Research Council collaboration Center).
  • the electroporated cells were transferred to 100 mL of 10% FCS (GIBC0-BRL), 1% penicillin-streptomycin (GIBC0-BRL). ) Suspended in -MEM (without nucleotides) selection medium (GIBC0-BRL), 96-well flat bottom plate (FALCON) at 100 ⁇ L / well (1 ⁇ 10 4 cells / well) The seeds were sown. After incubation overnight at 37 ° C, 5% C0 2 incubator one further 100 ⁇ ⁇ 7 Ueru added selection culture areas, was carried out selector tion.
  • FCS GIBC0-BRL
  • GIBC0-BRL penicillin-streptomycin
  • an assay was performed by a sandwich ELISA (see the section on cell line selection), and 24 clones that highly expressed HA-sHM or HA-sHM164 were selected and expanded on a 24-well plate. (LmL / well). After confirming stable growth of the clones selected in the nucleic acid-free medium, the clones were further subjected to atssay and squeezed to 10 clones each.
  • the ELISA for soluble human HM1.24 described below was performed as follows. In order to select high-producing strains, the production of soluble antigen was determined using anti-HA antibody (Boehringer Mannheim) and humanized anti-HM1.24 antibody (Koichiro Ono et al. The 20th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, etc. The cell lines were selected by comparison using sandwich ELISA with abstract 3-501-P-478). Since the purified antigen was not obtained, the antigen concentration was not known, so the concentration was compared taking into account the number of cells when ELISA was performed.
  • E. coli having a plasmid containing light chain purge ion a was designated as Escherichia coli DH5a ( P UC19-VLa-AHM-gK) by the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and on August 29, 1997 as FERM BP-5645. ⁇ Deposited internationally under the EST.
  • Escherichia coli having a plasmid containing the heavy chain purgion s of a humanized anti-HM1.24 antibody is referred to as Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gy1).
  • Anti-HA antibody (Boehringer Mannheim) prepared at 1 ⁇ g / mL in Coating Buffer (CB: 0.1 mol / L sodium bicarbonate buffer, pH 9.6, 0.02% sodium azide) was added to a flat-bottomed 96-well plate (manufactured by Nunc) at 100 L / well, and coated at 4 ° C.
  • CB Coating Buffer
  • dilute buffer (50 mmol / well) to the anti-HA antibody-coated plate washed three times with PBS (-) containing 300 ⁇ L / well 0.05% Tween 20 using a plate washer.
  • CGM / sHM As a positive control, CGM / sHM (Kyoko Oyoro et al., Japanese Society of Hematology 60 times, General title 690) was used. Next, a humanized anti-HM1.24 antibody (Koichiro Ono et al. 20th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan 3-501-P-478) was diluted to 1 ⁇ g / mL in the same washed plate. 100 ⁇ L / mL of the solution prepared with the buffer was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • alkaline phosphatase-labeled hidge anti-human IgG antibody (manufactured by BI0S0URCE) diluted 5,000-fold with a dilution buffer was added in 100 ⁇ l / 7 ⁇ l portions, and the mixture was added For 1 hour.
  • SIGMA104 p-nitrophenyl phosphate sodium salt hexahydrate: manufactured by SIGMA
  • SB 0.05 mol / L sodium bicarbonate
  • Buffer solution pH 9.8, 10 mmol / L MgCl 2
  • absorbance of 405 nm-655 nm with MICR0PLATE READER (BIO-RAD) was measured.
  • DXB11 cells transfected with soluble HM1.24 antigen (sHM) lacking the transmembrane region of HM1.24 antigen and sHM164 expression vector lacking the C-terminus of sHM with HA tag added 10 strains each ( sHM producing strain::!-1, 8-2, 9-3, 11-4, 14-5,-16, -17, -22, -23, -24, sHM164 producing strain: 164-1, -2 , 13, 15, -6, 17, 18, 1, 10, 1, 13, -16) (Continued, 10 nmol / L Methotrexate in a 25 cm 2 flask) M TX) containing medium (a-MEM (GIBC0-BRL), 10% FCS (GIBC0-BRL, 1% penicillin-streptomycin (GIBC0-BRL), 100 nmol / L) MTX (manufactured by SIGMA)).
  • a-MEM GIBC0-BRL
  • FCS GIBC0-BRL
  • the amount of antigen produced in the culture supernatant (3 day culture) was measured by ELISA.
  • Gene amplification was performed with 100 nmol / L MTX for 11-4, a sHM-producing strain, and sHM164-producing strains, 164-2 and 164-1-13, which had high expression levels and had sufficiently increased cells (post-group B). .).
  • the remaining strains were not well adapted to 10 nmol / L MTX, so we continued to culture in 10 nmol / L MTX medium.
  • the amount of antigen produced in the culture supernatant was measured by ELISA, and the sHM-producing strains 8-2, 9-3, 14-16 and 14-24 and the SHM164-producing strain 164 with high expression levels were measured.
  • — 1, 164—5 and 164—8 Gene amplification was performed using 100 nmol / L MTX (see Subsection B.). At this point, 164-13, which had the highest production, was converted to CGM / sHM (Kyoko Oyoro et al. The antigen production was about 10 times that of the general abstract 690).
  • ⁇ -MEM GIBC0-BRL
  • FCS GIBC0-BRL
  • SIGMA penicillin-strain Tomycin
  • sHM-producing strains 11-4 and sHM164-producing strains 164-2 and 164-13 were sHM-producing strains 8-2, 9-3, 14-16 and 14-24 and sHM164-producing strains 164-1 and 164.
  • the amount of antigen production in the culture supernatant (2 day culture) was measured by ELISA.
  • sHM-producing strains 8-2 and sHM164-producing strains 164-2 and 164-13 which have higher or possibly higher yields.
  • the amount of antigen produced in the supernatant was measured again by ELISA.
  • the 164-2 strain which produced the highest amount, produced more than 5 times more antigen than CGM / sHM (Kyoko Oyoro et al., General Presentation 690 of the 60th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematology).
  • the 164-2 strain which produced the highest amount, showed slightly lower antigen production than CGM / sHM, and the production tended to decrease. For this reason, we decided to carry out syndial cloning by the limiting dilution method.
  • the cells were passaged from the wells producing the highest yield (8-2: 6 wells, 164-2: 15 wells, 164-13: 9 wells) to 24-well plates. Prepare two plates for subculture and assay.When the assay plate becomes confluent, change the medium, culture for 3 days, and measure the amount of antigen production in the culture supernatant by ELISA. .
  • TBS Tris buffer
  • FBS FBS
  • TBS-T Tris buffer
  • Teen 20 50 ⁇ g / mL mouse anti-HM1.24 antibody (Blood (1994) 84, 1922-1930) and shake at 25 ° C. For 1 hour. TBS-T was added and the buffer was changed 6 times at 10 minute intervals while shaking at room temperature to wash the membrane.
  • the alkaline phosphatase-labeled goat anti-mouse IgG antibody (manufactured by Zymed)), which was diluted 2000-fold with TBS-T, was used as a secondary antibody while shaking at 25 ° C in the same manner. The reaction was performed for 30 minutes.
  • the membrane was washed by adding TBS-T and shaking at 25 ° C for 10 minutes six times.
  • This membrane was prepared using BCIP / NBT chromogenic substrate (manufactured by Promega) with 33 ⁇ L of Nitrobrute Trazolium ( ⁇ ⁇ ) and 16.5 ⁇ L of 5-Mouth-4 -Immerse the membrane in a western detection buffer (0.1 mol / L NaCl, 0.1 mmol / L Tris-HCl buffer containing 5 mmol / L MgCl 2 ; pH 9.5) containing indolinole phosphate (BCIP) to develop color I let it.
  • BCIP indolinole phosphate
  • the plate was washed with distilled water and HM1.24 antigen was detected.
  • the four clones (164-2-1, 164-2-13, 164-2-17, and 164-2-31) obtained were both in a reduced state, and were heterologous by glycosylation. Soluble antigen was detected as a broad band of 23-28 kDa, which is considered genetic. However, 18 kDa
  • Soluble human HM1.24 antigen was purified from the culture supernatant of CH0 cells expressing soluble human HM1.24 antigen. Culture solution of soluble human HM1.24 antigen-expressing CH0 cells
  • the buffer was replaced with PBS using a Fast Desalting HR10 / 10 column after diluting 5-fold with PBS. From the absorption at 280 nm, the concentration of the soluble human HM1.24 antigen obtained was estimated to be about 0.382 mg / mL, and a total of 42 mL of purified product was obtained. Purity was 95% or more based on the peak area ratio of reversed phase chromatography.
  • Example 4 Construction of an ELISA system using purified soluble human HM1.24 antigen
  • An anti-HA antibody (Boehringer Mannheim) was coated with a coating buffer (CB: 0.1 mol / L sodium bicarbonate buffer, pH 9.6). , 0.02% sodium azide) at a concentration of 1 ⁇ g / mL was added to a flat-bottom 96-well plate (manufactured by Nunc) at 100 ⁇ ! 7-well and coated at 4 ° C.
  • CB 0.1 mol / L sodium bicarbonate buffer, pH 9.6
  • 0.02% sodium azide at a concentration of 1 ⁇ g / mL was added to a flat-bottom 96-well plate (manufactured by Nunc) at 100 ⁇ ! 7-well and coated at 4 ° C.
  • the purified HM1.24 antigen diluted 750-fold, 2250-fold, 6750-fold, 20250-fold, or 60750-fold with the dilution buffer is 100 ⁇ l /
  • the reaction mixture was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • human-type anti-HM1.24 antibody (Koichiro Ono et al. 20th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan 3-501-P-478) was diluted to 1 g / mL in the washed plate.
  • the solution prepared with the buffer solution was added at 100 / well, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • an alkaline phosphatase-labeled sheep anti-human IgG antibody (manufactured by BI0S0URCE) diluted 5,000-fold with a dilution buffer was added at 100 / xL / well, and reacted at room temperature for 1 hour. .
  • the plate is washed 5 times, and the substrate buffer (SB: 0.05 mol / L sodium bicarbonate buffer, pH 9.8, 10 mmol / L MgCl 2 ) is used with SIGMA104 (manufactured by SIGMA) as the substrate.
  • SIGMA104 manufactured by SIGMA
  • 100 mg / well of 1 mg / mU was added to each well to develop color, and the absorbance at 405 nm-655 nm was measured with a microplate reader (manufactured by BI0-RAD).
  • a standard curve of the anti-HM1.24 antibody was obtained, and it was judged that use at a 5000-fold dilution was appropriate.
  • Fig. 5 shows the standard curve of the humanized anti-HM1.24 antibody in the ELISA system when the purified antigen was used at 5000-fold dilution. The measurement limit was about 500 pg / mL. .
  • a mouse anti-HM1.24 monoclonal antibody-producing hybridoma was prepared according to the method described in Goto, T. et al., Blood (1994) 84, 1992-1930.
  • KPC-32 Screening of the antibodies in the hybridoma culture supernatant was performed by Cell ELISA using KPC-32 (Posner, MR et al., J. Immunol. Methods (1982) 48, 23). 5Xl0 4 pieces of KPC-32 were suspended in 50 ml of PBS, 96-well plates (U-bottomed, Corning, Iwaki, Ltd.) was dried dispensed 37 ° C De ⁇ to. After blocking with PBS containing 1% serum albumin (BSA), the hybridoma culture supernatant was added and incubated at 4 ° C for 2 hours.
  • BSA serum albumin
  • the reaction was stopped with 1 mol / L sulfuric acid, and the absorbance at 492 nm was measured using an ELISA reader (manufactured by Bio-Rad).
  • the culture supernatant of the positive hybridoma was adsorbed to human serum in advance, and the reactivity to other cell lines was screened by ELISA. Positive hybridomas were selected and their reactivity to various cells was determined by flow cytometry.
  • the selected hybridoma clone was cloned twice and injected into the abdominal cavity of a pristane-treated BALB / C mouse to obtain ascites.
  • Monoclonal antibodies were purified from mouse ascites by precipitation with ammonium sulfate and protein A affinity chromatography kit (Ampure PA, manufactured by Amersham). Purified antibodies were obtained using a Quick Tag FITC binding kit (Boehringer Mannheim). F ITC labeled.
  • HM1.24 a hybridoma clone most useful for flow cytometry analysis and having CDC activity against RPMI 8226 was selected and named HM1.24.
  • the subclass of the monoclonal antibody produced by this hybridoma was determined by ELISA using a subclass-specific anti-mouse porcupine antibody (Zymed).
  • Anti HM1. 24 antibody had a subclass of I g G2a kappa.
  • Hypri-Doma HM1.24 which produces anti-HM1.24 antibody, was submitted to the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (1-3 1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) on September 14, 1995, as FERM BP 5233. Was deposited internationally under the Budapest Treaty.
  • a humanized anti-HM1.24 antibody was obtained by the following method.
  • Total RNA was prepared from the hybridoma HM1.24 prepared in Reference Example 1 by a conventional method. From this, cDNA encoding the mouse antibody V region was synthesized and amplified by the polymerase chain reaction (PCR) method and the 5'-RACE method. A DNA fragment containing the gene encoding the mouse V region was obtained, and each of these DNA fragments was ligated to a plasmid pUC-based cloning vector and introduced into E. coli competent cells to obtain an E. coli transformant.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the above plasmid was obtained from this transformant, the nucleotide sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined according to a conventional method, and the complementarity determining region (CDR) of each V region was further determined.
  • CDR complementarity determining region
  • the human antibody REI chain is used as the human antibody L chain, and the framework region (FR) 1-3 is used as the human antibody H chain using FR1-3 of human antibody HG3 and FR4 is used as the human antibody H chain.
  • FR4 of human antibody JH6 Used FR4 of human antibody JH6. The amino acid of FR in the V region of the H chain was substituted so that the CDR-grafted antibody formed an appropriate antigen-binding site.
  • each of the genes was separately introduced into a HEF vector, and the humanized anti-HM1.24 antibody was humanized.
  • a vector for expressing the L chain or H chain of the HM1.24 antibody was prepared.
  • a cell line producing a humanized anti-HM1.24 antibody was established.
  • the antigen-binding activity and the binding inhibitory activity of the humanized anti-HM1.24 antibody obtained by culturing this cell line on the human amniotic membrane-derived cell line WISH were examined by Cell ELISA.
  • the humanized anti-l.24 antibody has the same antigen-binding activity as the chimeric antibody, and furthermore, the binding inhibition activity using the biotinylated mouse anti-HM1.24 antibody was confirmed by the chimeric antibody or the mouse antibody. It had the same activity as.
  • Escherichia coli having a plasmid containing DNA encoding the L chain V region and H chain V region of the chimeric anti-HM1.24 antibody was Escherichia coli DH5a (pUC19-l.24L-g ⁇ ) and Escherichia coli, respectively.
  • E. coli DH5a (pUC19-1.24H-gy1) was submitted to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) on August 29, 1996. Each FERM BP-5646 * 5 jt / FERM BP-5644 based on Budapest International deposit.
  • E. coli having a plasmid containing DNA encoding the L chain V region a purge ion (SEQ ID NO: 12) and the H chain V region version (SEQ ID NO: 13) of a humanized anti-HM1.24 antibody each Escherichia co li DH5a (pUC19- RVLa- AHM- g k) and Escherichia coli DH5 a (PUC19- RVHr- a ⁇ - gyl) as, Agency of industrial Science technology Research Institute (Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 1 On October 29, 1996, FERM BP-5645 and FERM BP-5643 were deposited internationally under the Budapest Treaty.
  • Escherichia coli having a plasmid containing DNA encoding the H chain V region s purge ion (SEQ ID NO: 14) of a humanized anti-HM1.24 antibody is cherichis coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM- g ⁇ 1) was reported to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology (I 1-3, Higashi 1-3-1, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) as FERM BP-6127 on September 29, 1997. And deposited internationally under the Budapest Treaty.
  • the human myeloma cell lines RPMI8226 and U266 were cultured in RPMI1640 medium (GIBC0-BRL) supplemented with 10% fetal calf serum (FBS), and the human myeloma cell line KPMM2 (JP-A-7-236475) was Culture was performed in RPMI1640 medium supplemented with 20% fetal bovine serum.
  • RPMI1640 medium GIBC0-BRL
  • FBS fetal calf serum
  • KPMM2 JP-A-7-236475
  • the pCOSl expression vector was constructed by deleting the genes contained by digestion with EcoRI and Yale from HEF-PMh-gyl (see W092-19759) and ligating EcoRI-Notl-BamHI Adapter (Takara Shuzo). did.
  • the cells are washed with a phosphate buffer (PBS), and the cells are washed with PBS containing 5 mM EDTA, and the cells are washed with 1% S, 5% FBS, 0.02% NaN 3 with 1-2% caro PBS.
  • PBS phosphate buffer
  • the cell suspension was prepared at X10 6 cells / ml, and the cells were incubated on a panning plate (described later) coated with anti-HM1.24 antibody for 2 hours, and the plate was washed with 5% FBS and 0.02%. The plate was washed gently three times with 3 ml of PBS containing 3% NaN 3. After washing, a Hirt solution (Hitt J., Mol. Biol.
  • the panning plate was prepared as follows. Add 3 ml 3 ⁇ 4HMl. 24 antibody solution (lOii g / ml in 50 mM Tris-HCl, pH 9.5) to a 60 mm dish (Falcon), clean for 2 hours at room temperature, and wash three times with 0.15 M NaCl After that, 3 ml of 5% FBS, 1 mM EDTA, and 0.02% NaN 3 were added, and the cells were settled at room temperature for 2 hours to perform blocking. After removing the blocking solution, the panning plate was stored at -20 ° C until use.
  • plasmid DNA having a cDNA of about 0.9 kb P as an insert was enriched.
  • the nucleotide sequence was determined using the Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) using the 373A or 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems).
  • clone P3.19 was composed of 1,012 bp cDNA, It was found to have an open reading frame (23-549) encoding an amino acid (FIGS. 6 and 7) (SEQ ID NO: 15).
  • the amino acid sequence predicted from this cDNA showed a structure characteristic of the type II membrane protein, and had two N-type sugar chain binding sites.
  • Library B was subjected to immunoscreening using anti-HM1.24 antibody. That is, a phage library containing 1.5 ⁇ 10 5 independent clones was overlaid on agar together with E. coli NM522 (Pharmacia Biotech), and cultured at 42 for 3.5 hours. After the cultivation, a nitrosenorrelose finole letter (Schleicher & Schue 11) pretreated with 10 mM IPTG was overlaid on the plate, and further cultured at 37 ° C for 3 hours.
  • anti-HM1.24 antibody solution (10 ⁇ g / ml blocking buffer), incubate at room temperature for 1 hour, wash and dilute 5,000-fold diluted alkaline phosphatase-conjugated anti-mouse Ig antibody Serum (picoBlue Immunoscreening kit; Stratagene) was used!]; ⁇ , And incubated at room temperature for 1 hour.
  • the spot that reacted with antibody 0 3 m g / ml- preparative Robusurete Torazori ⁇ beam, 0.15mg / ml 5 -.
  • Bromo-4 Ichiku B row 3 Lee emission chromogenic solution containing indolyl phosphate (lOOmM Tris-HCl , PH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ).
  • Escherichia coli DH5 is a plasmid containing the plasmid pRS38-pUC19 in which DNA encoding a human protein having the same sequence as the human HM1.24 antigen protein was inserted between the Xbal cleavage sites of pUC beta.
  • a P RS38-pUC19
  • FERM BP-4434 It has been deposited internationally under the Budapest Treaty.
  • a CH0 transformed cell line transfected with P3.19 was established.
  • P3.19 clone After being introduced into CHO cells by the ratioon method, the cells were cultured in the presence of 500 g / ml G418 (GIBC0-BRL) to obtain a HM1.24 antigen-expressing CH0 cell line.
  • FACS buffer PBS ( ⁇ ) / 2% FCS / 0.1% NaN 3
  • HM1.24 antibody was added, and the mixture was reacted on ice for 30 minutes.
  • FACS buffer PBS ( ⁇ ) / 2% FCS / 0.1% NaN 3
  • HM1.24 antibody was added, and the mixture was reacted on ice for 30 minutes.
  • GAM-FITC solution 25 / zg / ml in FACS buffer; Becton Dickinson
  • the cells were resuspended in 600 ⁇ l of FACS buffer and measured by FACScan (Becton Dickinson).
  • UPC10 was used as a negative control antibody.
  • the cell lysis buffer method 50 mM sodium folate, 150 mM NaCl, 0.5% sodium deoxycholate, 1% Nonidet P_40, 0.1 mg / ml phenylenomethine
  • Ultrasonic crushing was performed in lesnorefoninolefnoreolide and protease inhibitor IJ Cactenyl [Boehringer Mannheim]) to obtain a solubilized fraction.
  • the solubilized fraction was added to Sepharose 4B beads conjugated with anti-HM1.24 antibody. After centrifugation, the precipitate was separated by SDS-PAGE (12% gel) and transferred to a PVDF membrane.
  • the PVDF membrane was reacted with an anti-HM 1.24 antibody, followed by POD-anti-mouse IgG, and then detected using an ECL kit (Amersham).
  • P3.19 encodes a protein consisting of 180 amino acids with an estimated molecular weight of 19.8 kDa, and has two N-type sugar chain binding motifs (Fig. 6). Therefore, it was considered that the presence of those having different molecular weights observed by immunoprecipitation was due to differences in N-glycan modification. In fact, immunoprecipitates have been found to bind to several lectins. Industrial applicability

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Abstract

A process whereby a highly purified soluble HM1.24 antigen protein can be produced at a high efficiency. Namely, a process for producing a soluble HM1.24 antigen extracellular domain characterized by comprising culturing animal cells transformed by an expression vector which contains an (A1)EF1a promoter and a gene encoding soluble HM1.24 antigen lacking the intracellular domain ligated downstream of the promoter, and isolating and purifying the soluble HM1.24 antigen from the culture.

Description

明 細 書 抗 HM 1. 2 4抗体の免疫学的測定 発明の分野  Description Immunoassay of anti-HM1.24 antibody Field of the invention
本発明は、 抗 HM1.24抗体の免疫化学的測定方法に関する。 また本 発明は可溶性 HM1.24抗原タンパク質の免疫化学的測定方法に関する 。 さらに本発明は、 可溶性 HM1.24抗原タンパク質及びそれをコード する DNA に関する。 背景技術  The present invention relates to a method for immunochemical measurement of an anti-HM1.24 antibody. The present invention also relates to a method for immunochemically measuring soluble HM1.24 antigen protein. Furthermore, the present invention relates to a soluble HM1.24 antigen protein and a DNA encoding the same. Background art
Goto, T らはヒ ト形質細胞を免役して得られた、 B 細胞系列に特 異的に発現する分子量が 22〜39 kDaの抗原を認識するマウスモノク ローナル抗体 1.24抗体を報告している （Blood(1994)84， 1922-1930 ) 。 このマウス抗 HM1.24抗体はヒ ト形質細胞を移植したマウスにお いて in vivo 抗腫瘍効果ならびに、 ヒ ト形質細胞に対する ADCC (an t lbody— dependent cellular cytotoxicity) Ϊ舌个生【こよる in vitro 腫瘍効果を佘す （0zaki， S et al.， Blood, (1997)90, 3179-3186) また、 このマウス抗 HMl.24抗体のキメラ抗体および再構成ヒ ト抗 体が作製されている （小野浩一郎ら第 2 0回日本分子生物学会年会 (1997) 抄録集一般演題 3- 501-P- 478； W0 98/14580) 。  Goto, T. et al. Reported a mouse monoclonal antibody 1.24, which was obtained by immunizing human plasma cells and recognizes an antigen with a molecular weight of 22 to 39 kDa, which is specifically expressed in the B cell lineage (Blood (1994) 84, 1922-1930). This mouse anti-HM1.24 antibody has anti-tumor effects in vivo in mice transplanted with human plasma cells and ADCC (antlbody—dependent cellular cytotoxicity) against human plasma cells. Tumor effect (0zaki, S et al., Blood, (1997) 90, 3179-3186) In addition, chimeric antibodies and reshaped human antibodies of this mouse anti-HMl.24 antibody have been produced (Ono Koichiro et al. The 20th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan (1997) Abstracts General Abstracts 3-501-P-478; W098 / 14580).
一方、 これらマウス HM1.24抗体、 キメラ抗体、 再構成ヒ ト抗体の 活性測定はヒ ト形質細胞株 RPMI8226を用いた cell- ELISA (Goto, T ら、 Blood(1994)84， 1922-1930) によって行われており、 よ り精度 の高い測定方法が求められていた。 発明の開示 On the other hand, the activities of these mouse HM1.24 antibody, chimeric antibody and reshaped human antibody were measured by cell-ELISA using human plasma cell line RPMI8226 (Goto, T et al., Blood (1994) 84, 1922-1930). Therefore, a more accurate measurement method was required. Disclosure of the invention
抗 HMl . 24抗体とその抗原である細胞膜上に発現している HMl . 24抗 原タンパク質については上述のようにすでに報告されている。 しか しながら、 高度に精製された可溶性 HM1. 24抗原の製造方法は知られ ておらず、 従って高度に精製された可溶性 HM1. 24抗原タンパク質を 用いて、 低濃度の可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体を 検出又は測定する方法は知られていなかった。  The anti-HMl24 antibody and its antigen, the HMl24 antigen protein expressed on the cell membrane, have already been reported as described above. However, a method for producing highly purified soluble HM1.24 antigen is not known, and therefore, using highly purified soluble HM1.24 antigen protein, a low concentration of soluble HM1.24 antigen protein or A method for detecting or measuring an anti-HM1.24 antibody was not known.
従って本発明はまず、 高度に精製された可溶性 HM1. 24抗原タンパ ク質を高い効率で製造することができる方法を提供する。  Therefore, the present invention first provides a method capable of producing highly purified soluble HM1.24 antigen protein with high efficiency.
すなわち、 本発明は、 （A l ) EF1 ひプロモーターと、 その下流 に連結された、 細胞内 ドメイ ンを欠く可溶性 HM1. 24抗原をコ一ドす る遺伝子とを含んで成る発現ベクターにより形質転換された動物細 胞を培養し、 そして培養物から可溶性匪 1. 24抗原単離 · 精製するこ とを特徴とする可溶性 HM1. 24抗原細胞外ドメインの製造方法を提供 する。  That is, the present invention provides a method for transforming an expression vector comprising the (Al) EF1 promoter and a gene linked downstream thereof, which encodes a soluble HM1.24 antigen lacking an intracellular domain. The present invention provides a method for producing a soluble HM1.24 antigen extracellular domain, comprising culturing isolated animal cells and isolating and purifying a soluble band 1024 antigen from the culture.
本発明はまた、 （A 2 ) 前記可溶性 HM1. 24抗原が配列番号 ： 5又 は 16に示すアミ ノ酸配列を有する、 前記の方法を提供する。  The present invention also provides (A2) the above method, wherein the soluble HM1.24 antigen has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 16.
本発明はまた、 （A 3 ) 前記可溶性 HM1. 24抗原が配列番号 ： 7又 は 17に示すァミ ノ酸配列を有する、 前記の方法を提供する。  The present invention also provides (A3) the above method, wherein the soluble HM1.24 antigen has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 17.
本発明はまた、 （A 4 ) 前記可溶性 HM1. 24抗原がイ ンフルエンザ 凝集素 （HA) との融合蛋白質の形である前記の方法を提供する。 本発明はまた、 （A 5 ) 前記融合蛋白質が配列番号 ： 10又は 18に 記載のアミノ酸配列を有する、 前記の方法を提供する。  The present invention also provides (A4) the above method, wherein the soluble HM1.24 antigen is in the form of a fusion protein with influenza agglutinin (HA). The present invention also provides (A5) the above method, wherein the fusion protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 18.
本発明はさ らに、 （A 6 ) 前記融合蛋白質が配列番号 ： 11又は 19 に記載のアミ ノ酸配列を有する、 前記の方法を提供する。  The present invention further provides (A6) the above method, wherein the fusion protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or 19.
本発明はさらに、 （A 7 ) 前記動物細胞が CH0 細胞である、 前記 の方法を提供する。 本発明はさ らに、 （A 8 ) 形質転換された動物細胞が 100 nmo l/L の濃度のメ ト トレキセ一ト （MTX ) の存在下に遺伝子増幅を行った ものである、 前記の方法を提供する。 The present invention further provides (A7) the method as described above, wherein the animal cell is a CH0 cell. The present invention further provides (A8) a method wherein the transformed animal cell is subjected to gene amplification in the presence of methotrexate (MTX) at a concentration of 100 nmol / L. I will provide a.
本発明はさ らに、 高度に精製された可溶性 HM1. 24抗原タンパク質 を用いて抗 HM1. 24抗体を検出又は測定する簡便な方法を提供する。 すなわち、 本発明は、 （B 1 ) 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質と被 験-試料中に含まれる抗 HM1. 24抗体とを反応させて、 可溶性 HM1. 24抗 原タンパク質に結合した抗 HM1. 24抗体を検出又は測定する工程を含 む、 抗 HM1. 24抗体の免疫化学的測定方法を提供する。 可溶性 HM1. 24 抗原タンパク質は、 好ましく は他のペプチド又はポリペプチドと融 合している。 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質は、 好ましく は支持体と 結合している。  The present invention further provides a simple method for detecting or measuring an anti-HM1.24 antibody using a highly purified soluble HM1.24 antigen protein. That is, the present invention provides (B 1) a method of reacting a soluble HM1.24 antigen protein with an anti-HM1.24 antibody contained in a test sample to obtain an anti-HM1.24 antibody bound to a soluble HM1.24 antigen protein. Provided is a method for immunochemical measurement of an anti-HM1.24 antibody, comprising a step of detecting or measuring an antibody. The soluble HM1.24 antigen protein is preferably fused to another peptide or polypeptide. The soluble HM1.24 antigen protein is preferably bound to a support.
支持体は、 好ましく はビーズ又はプレー トである。 可溶性 HM1. 24 抗原タンパク質は、 好ましくは可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は可 溶性 HM1. 24抗原タンパク質と融合した他のぺプチド又はポリぺプチ ドに対する抗体により支持体と結合している。  The support is preferably a bead or a plate. The soluble HM1.24 antigen protein is bound to the support, preferably by an antibody to another peptide or polypeptide fused to the soluble HM1.24 antigen protein or soluble HM1.24 antigen protein.
本発明はまた、 （B 2 ) 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質に結合した 抗 HM1. 24抗体を、 抗 HM1. 24抗体に対する一次抗体によ り検出又は測 定することを特徴とする前記 （B 1 ) に記載の免疫化学的測定方法 を提供する。  The present invention also provides (B2) detecting or measuring an anti-HM1.24 antibody bound to a soluble HM1.24 antigen protein using a primary antibody against the anti-HM1.24 antibody. )).
本発明はまた、 （B 3 ) 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質に結合した 抗 HM1. 24抗体を、 抗 HM1. 24抗体に対する一次抗体及び一次抗体に対 する二次抗体によ り検出又は測定することを特徴とする前記 （B 1 ) 又は （B 2 ) に記載の免疫化学的測定方法を提供する。 前記 （B 1 ) 又は （B 2 ) において、 一次抗体又は二次抗体は、 好ましく は 放射性同位元素、 酵素、 ピオチン/アビジン又は蛍光物質によ り標 識されている。 本発明はまた、 （B 4) 抗 HM1.24抗体に結合した可溶性 HM1.24抗 原タンパク質を、 可溶性 HM1.24抗原タンパク質に対する一次抗体又 は可溶性 HM1.24抗原タンパク質と融合した他のぺプチド又はポリぺ プチドに対する一次抗体により検出又は測定することを特徴とする 前記 （ 1 ) 〜 （ 3 ) に記載の免疫化学的測定方法を提供する。 The present invention also relates to (B3) detecting or measuring an anti-HM1.24 antibody bound to a soluble HM1.24 antigen protein using a primary antibody against the anti-HM1.24 antibody and a secondary antibody against the primary antibody. The immunochemical measurement method according to the above (B 1) or (B 2), characterized in that: In the above (B1) or (B2), the primary antibody or the secondary antibody is preferably labeled with a radioisotope, an enzyme, biotin / avidin or a fluorescent substance. The present invention also relates to (B4) another peptide obtained by fusing a soluble HM1.24 antigen protein bound to an anti-HM1.24 antibody with a primary antibody against the soluble HM1.24 antigen protein or a soluble HM1.24 antigen protein. Alternatively, the present invention provides the immunochemical measurement method according to any one of (1) to (3), wherein the detection or measurement is performed using a primary antibody against the polypeptide.
本発明はまた、 （B 5 ) 抗 HM1.24抗体に結合した可溶性 HM1.24抗 原タンパク質を、 可溶性 HM1.24抗原タンパク質に対する一次抗体又 は可溶性 HM1.24抗原タンパク質と融合した他のペプチ ド又はポリべ プチドに対する一次抗体及び一次抗体に対する二次抗体によ り検出 又は測定するこ とを特徴とする前記 （B 1 ) 〜 （B 4 ) に記載の免 疫化学的測定方法を提供する。 前記 （B 1 ) 〜 （B 4 ) において、 一次抗体又は二次抗体は、 好ましく は放射性同位元素、 酵素、 ビォ チン/アビジン又は蛍光物質により標識されている。 図面の簡単な説明  The present invention also relates to (B5) another peptide obtained by fusing a soluble HM1.24 antigen protein bound to an anti-HM1.24 antibody with a primary antibody against the soluble HM1.24 antigen protein or a soluble HM1.24 antigen protein. Alternatively, the present invention provides the immunochemical measurement method according to any one of (B1) to (B4), wherein the method is detected or measured by a primary antibody against the polypeptide and a secondary antibody against the primary antibody. In the above (B1) to (B4), the primary antibody or the secondary antibody is preferably labeled with a radioisotope, an enzyme, biotin / avidin or a fluorescent substance. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1 は、 HAタグ付加可溶性抗原を用いた sandwich ELISA系を示す 模式図である。  FIG. 1 is a schematic diagram showing a sandwich ELISA system using an HA-tagged soluble antigen.
図 2は作製した HAタグ付加可溶性 HM1.24抗原産生細胞株が培養上 清中に産生している可溶性抗原の量を比較した図である。 希釈倍率 が高い方が高産生である。  FIG. 2 is a diagram comparing the amount of soluble antigen produced by the HA-tagged soluble HM1.24 antigen-producing cell line in the culture supernatant. The higher the dilution ratio, the higher the production.
図 3は HAタグ付加可溶性 HM1.24抗原産生細胞 4株 （164-2-1， 16 4-2-13, 164-2-17 、 及び 164-2- 31) の培養上清中を還元状態にて S DS-ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動を行った後、 マウス抗 HM1.24 抗体による western blotを行い、 HM1.24抗原を検出した結果を示す 図面代用写真である。  Figure 3 shows the reduced state of the culture supernatant of four HA-tagged soluble HM1.24 antigen-producing cells (164-2-1, 164-2-13, 164-2-17, and 164-2-31) 3 is a photograph as a substitute for a drawing, showing the results of detection of HM1.24 antigen by western blotting with a mouse anti-HM1.24 antibody after performing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis at.
図 4は 750 倍から 3倍希釈で 5'段階希釈した精製抗原を用いたサ ンドィ ツチ ELISA 系におけるヒ ト型化抗 HM1.24抗体の標準曲線を示 すグラフである。 Figure 4 shows the standard curve of humanized anti-HM1.24 antibody in a Sandwich ELISA system using purified antigens diluted 5 'from 750-fold to 3-fold. This is a graph.
図 5は精製抗原を 5000倍希釈 （約 76. 4 ng/mL) で用いたサン ドィ ツチ ELISA 系におけるヒ ト型化抗 HM1. 24抗体の標準曲線を示すグラ フである。  FIG. 5 is a graph showing a standard curve of a humanized anti-HM1.24 antibody in a Sandwich ELISA system using purified antigen at a 1: 5000 dilution (about 76.4 ng / mL).
図 6は、 HM1. 24抗原タンパク質をコ一ドする cDNAの塩基配列及び 対応するアミ ノ酸配列を示す図である。  FIG. 6 shows the nucleotide sequence of the cDNA encoding the HM1.24 antigen protein and the corresponding amino acid sequence.
図 7は、 HM1. 24抗原タンパク質をコー ドする cDNAの塩基配列及び 対応するアミ ノ酸配列を示す図である。  FIG. 7 shows the nucleotide sequence of the cDNA encoding the HM1.24 antigen protein and the corresponding amino acid sequence.
図 8は、 Panning 法を用いて単離したクローン P3. 19 及び免疫ス ク リーニング法により単離された 5つのクローン （I S1 〜I S5 ) の 模式図である。  FIG. 8 is a schematic diagram of clone P3.19 isolated using the Panning method and five clones (I S1 to I S5) isolated by the immunoscreening method.
図 9は、 抗 HM1. 24抗体 （A ； CH0/NE0 , B ； CH0/HM ') を用いたフ ローサイ トメ ト リ一解析の結果を示す図である。 抗 HM1. 24抗体のヒ ス トグラムは実線で、 アイソタイプの一致したコントロール抗体 （ UPC10 ) のヒス トグラムは波線で示す。 なお、 横軸は蛍光強度を、 縦軸は細胞数を示す。  FIG. 9 is a diagram showing the results of flow cytometry analysis using an anti-HM1.24 antibody (A; CH0 / NE0, B; CH0 / HM '). The histogram of the anti-HM1.24 antibody is shown by a solid line, and the histogram of the isotype-matched control antibody (UPC10) is shown by a wavy line. The horizontal axis indicates the fluorescence intensity, and the vertical axis indicates the number of cells.
図 1 0は、 各種細胞株および HM1. 24発現 CH0 細胞における HM1. 24 抗原の発現を抗 HM1. 24抗体を用いた免疫沈降 . ウェスタンブロ ッテ イング法によ り検出した結果を示す図面代用写真である。 抗 HM1. 24 抗体結合セファ ロース 4B (レーン 1〜6 ) または非結合セファ ロー ス 4B (レーン 7及び 8 ) を用いて免疫沈降を行った後、 抗 HM1. 24抗 体を用いてウェスタン · ブロ ッティ ングを行い、 HM1. 24抗原の検出 を行った （右側に表示） 。 （* ； 抗 HM1. 24抗体 H鎖） 発明の実施の形態  Figure 10 is a drawing substitute showing the results of immunoprecipitation using anti-HM1.24 antibody and detection of HM1.24 antigen in various cell lines and HM1.24 expressing CH0 cells by Western blotting. It is a photograph. After immunoprecipitation using Sepharose 4B (lanes 1 to 6) or unbound Sepharose 4B (lanes 7 and 8) bound to the anti-HM1.24 antibody, Western blotting was performed using the anti-HM1.24 antibody. HM1.24 antigen was detected (displayed on the right). (*; Anti-HM1.24 antibody heavy chain)
本発明の可溶性 HM1. 24抗原タンパク質と しては、 配列番号 ： 5示 すァミ ノ酸配列においてァミノ酸位置 1 位の Asn からアミノ酸位置 132 位の Gin からなるアミ ノ酸配列を有し、 且つ可溶性 HM1. 24抗原 タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質であれば、 いかなる ものであってよい。 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質の生物学的活性と は、 抗 HM1. 24抗体に特異的に結合され、 細胞膜には結合しておらず 細胞膜から遊離して可溶性であり、 且つ二量体である。 The soluble HM1.24 antigen protein of the present invention includes the amino acid position from Asn at position 1 in the amino acid position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. Any protein may be used as long as it has an amino acid sequence consisting of Gin at position 132 and has the biological activity of a soluble HM1.24 antigen protein. The biological activity of the soluble HM1.24 antigen protein means that it is specifically bound to the anti-HM1.24 antibody, is not bound to the cell membrane, is free from the cell membrane, is soluble, and is a dimer.
また、 本発明の可溶性 HM1. 24抗原タンパク質は、 可溶性 HM1. 24抗 原タンパク質の生物学的活性を有し、 且つ配列番号 ： 5に示すアミ ノ酸配列に対する 1又は複数個のァミ ノ酸残基の置換、 欠失及び/ 又は付加によ り修飾されたァミ ノ酸配列を有する可溶性 HM1. 24抗原 タンパク質であってよい。 本発明の可溶性 HM1. 24抗原タンパク質は 、 よ り具体的には可溶性 HM1. 24抗原タンパク質の生物学的活性を有 する限り、 配列番号 ： 5に示すアミ ノ酸配列において、 1又は 2個 以上、 好ましくは 1又は 24個以下、 よ り好ましく は 1又は 12個以下 のァミ ノ酸残基が置換したァミ ノ酸を有していてよい。  Further, the soluble HM1.24 antigen protein of the present invention has the biological activity of the soluble HM1.24 antigen protein, and has one or more amino acids corresponding to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. It may be a soluble HM1.24 antigen protein having an amino acid sequence modified by substitution, deletion and / or addition of residues. More specifically, as long as the soluble HM1.24 antigen protein of the present invention has the biological activity of the soluble HM1.24 antigen protein, one or two or more of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 5 It may have an amino acid substituted with preferably 1 or 24 or less, more preferably 1 or 12 amino acid residues.
又は、 配列番号 ： 5に示すアミノ酸配列において、 1又は 2個以 上、 好ましく は 1又は 42個以下、 より好ましくは 1又は 17個以下の アミ ノ酸残基が欠失したアミ ノ酸を有していてよい。 又は、 配列番 号 ： 5に示すアミ ノ酸配列において、 1又は 2個以上、 好ましくは 1又は 50個以下、 より好ましく は 1又は 14個以下のァミノ酸残基が 付加したアミ ノ酸を有していてよい。 本発明に使用される可溶性 HM 1. 24抗原タンパク質はまた、 上記アミノ酸の置換、 欠失及び/ 又は 付加による修飾が同時になされていてもよい。  Alternatively, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, the amino acid sequence has an amino acid in which 1 or more, preferably 1 or 42 or less, more preferably 1 or 17 or less amino acid residues have been deleted. You may. Alternatively, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, one or more, preferably 1 or 50 or less, more preferably 1 or 14 or less amino acids are added to the amino acid sequence. You may. The soluble HM1.24 antigen protein used in the present invention may be simultaneously modified by the above amino acid substitution, deletion and / or addition.
可溶性匪 1. 24抗原タンパク質は、 配列番号 ： 5において 1 位のァ ミ ノ酸 Asn から 90位のァミノ酸 Arg までのアミ ノ酸配列を有してい ればその生物学的活性を示すことが明らかになつている。 したがつ て、 本発明の可溶性 HM1. 24抗原タンパク質は、 配列番号 ： 5におい て 1 位のアミ ノ酸 Asn から 9 0位のアミ ノ酸 Arg までのアミノ酸配 列を有する力 、 あるいは 1 位のアミ ノ酸 Asn から 9 0位のアミ ノ酸 Arg までのァミ ノ酸配列に対する 1又は複数個のァミ ノ酸残基の置 換、 欠失及び/又は付加によ り修飾されたァミ ノ酸配列を有する可 溶性 HM1.24抗原タンパク質であってよい。 Soluble bandage 1. 24 antigen protein can exhibit its biological activity if it has an amino acid sequence from amino acid Asn at position 1 to amino acid Arg at position 90 in SEQ ID NO: 5. It's clear. Therefore, the soluble HM1.24 antigen protein of the present invention comprises an amino acid sequence from amino acid Asn at position 1 to amino acid Arg at position 90 in SEQ ID NO: 5. Sequence, or substitution, deletion and / or replacement of one or more amino acid residues with respect to the amino acid sequence from amino acid Asn at position 1 to Arg at position 90. It may be a soluble HM1.24 antigen protein having an amino acid sequence modified by addition.
可溶性 HM1.24抗原タンパク質は、 その生物学的活性有する限り、 配列番号 ： 5において 9 0位のアミ ノ酸 Arg から 132 位のアミ ノ酸 Gin までのアミ ノ酸配列を有する力 、 あるいはこのアミノ酸配列に 対して 1又は複数個のァミ ノ酸残基の置換、 欠失及び 又は付加に よ り修飾されたアミノ酸配列を有する可溶性匪 1.24抗原タンパク質 であってよい。  Soluble HM1.24 antigen protein has the amino acid sequence from amino acid Arg at position 90 to amino acid Gin at position 132 in SEQ ID NO: 5 as long as it has the biological activity, or this amino acid It may be a soluble band 1.24 antigen protein having an amino acid sequence modified by substitution, deletion and / or addition of one or more amino acid residues to the sequence.
配列番号 ： 5に示すァミ ノ酸配列に対する 1又は複数個のァミ ノ 酸残基の置換、 欠失及び/又は付加によ り修飾されたァミノ酸配列 を有する可溶性 HM1.24抗原タンパク質と して、 配列番号 ： 7又は 17 、 10又は 18、 あるいは 11又は 19に示されるアミノ酸配列を有する可 溶性 HM1.24抗原タンパク質が挙げられる。  A soluble HM1.24 antigen protein having an amino acid sequence modified by substitution, deletion and / or addition of one or more amino acid residues to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5; And a soluble HM1.24 antigen protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 17, 10 or 18, or 11 or 19.
あるアミ ノ酸配列に対する 1又は複数個のァミノ酸残基の置換、 欠失及び/又は付加により修飾されたァミ ノ酸配列を有するタンパ ク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている （Ma rk, D. F. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 566 2-5666 、 Zoller , M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1 982) 10， 6487-6500 、 Wang, A. et al.， Science 224, 1431-1433 、 Dalbadie-McFarland, G. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. US A (1982) 79, 6409-6413 ) 。  It is already known that a protein having an amino acid sequence modified by substitution, deletion and / or addition of one or more amino acid residues to a certain amino acid sequence maintains its biological activity. Known (Mark, DF et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 566 2-5666, Zoller, MJ & Smith, M. Nucleic Acids Research (1 982) 10, 6487. -6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A (1982) 79, 6409-6413).
本発明の可溶性匪 1.24抗原タンパク質は、 由来する種、 それらを 産生する宿主及び/又は精製方法によ り、 アミノ酸配列、 分子量、 等電点、 糖鎖付加の有無や糖鎖付加の位置、 糖鎖の構造、 リ ン酸化 状態及び Z又はジスルフィ ド結合の有無が異なる。 しかしながら、 本発明に好適に使用し得る限り、 いかなる構造を有するタンパク質 であってよい。 タンパク質が由来する種としてはヒ トが好ましい。 本発明の可溶性 HM1. 24抗原タンパク質をコー ドする DNA としては 、 配列番号 ： 5に示す塩基配列の塩基位置 1 位の塩基アデニンから 396 位の塩基グァニンからなる塩基配列が挙げられる。 また、 本発 明の可溶性 HM1. 24抗原タンパク質をコー ドする DNA と しては配列番 号 ： 5に示す塩基配列を有する DNA であれば、 いかなる由来の DNA であってよい。 このような DNA と して、 例えばジエノ ミ ック DNA 、 cDNA、 合成 DNA が挙げられる。 これらは、 種々の細胞、 組織又は臓 器あるいはヒ ト以外の種から得られた cDNAライブラリ ー、 ジエノ ミ ックライブラリーから得られた DNA であってよいし、 それらは市販 の DNA ライブラ リーであってもよい。 これらライブラリーに用いら れるベクターと しては、 プラスミ ド、 パクテリオファージ、 YAC ベ クタ一等いかなるものであってよい。 The soluble marauder 1.24 antigen protein of the present invention may have an amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence or absence of glycosylation, location of glycosylation, sugar, depending on the species of origin, the host producing them and / or the purification method. The chain structure, phosphorylation state, and the presence or absence of Z or disulfide bonds are different. However, The protein may have any structure as long as it can be suitably used in the present invention. Human is preferred as the species from which the protein is derived. Examples of the DNA encoding the soluble HM1.24 antigen protein of the present invention include a base sequence consisting of base adenine at position 1 to base guanine at position 396 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5. The DNA encoding the soluble HM1.24 antigen protein of the present invention may be any DNA as long as it has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5. Examples of such DNA include dienomic DNA, cDNA, and synthetic DNA. These may be cDNA libraries obtained from various cells, tissues or organs, or species other than human, DNA obtained from a dienomic library, or may be a commercially available DNA library. Good. The vector used for these libraries may be any vector such as plasmid, bacterio phage, YAC vector and the like.
本発明の可溶性 HM1. 24抗原タンパク質をコー ドする DNA としては また、 配列番号 ： 5に示す塩基配列に対しハイブリ ダィズし、 且つ 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質の生物学的活性を有するポリペプチド をコー ドする DNA であってもよい。 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質を コ一ドする DNA がハイブリ ダイズする条件としては、 適度なス ト リ ンジエ ンシー条件下においてハイブリ ダイズする DNA が挙げられる このようなハイブリ ダイズ条件と しては、 例えば低ス ト リ ンジェ ンシ一な条件が挙げられる。 低ス ト リ ンジヱンシ一な条件としては 、 例えば 4 2 °C、 5 X SSC 、 0. 1 %ドデシル硫酸ナト リ ウム、 50% ホ ルムアミ ドによ り与えられる洗浄条件である。 よ り好ましく は、 高 ス ト リ ンジエ ンシーな条件が挙げられる。 高ス ト リ ンジエンシーな 条件と しては、 例えば 60° (：、 0. 1 SS C 、 0. 1 %ドデシル硫酸ナト リ ゥムにより与えられる洗浄条件である。 あるタンパク質をコードす る塩基配列に対し、 適度な条件でハイブリ ダィズする DNA がコー ド するタンパク質がそのタンパク質と同じ生物学的活性を有すること はすでに知られている。 The DNA encoding the soluble HM1.24 antigen protein of the present invention also includes a polypeptide that hybridizes to the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and has the biological activity of the soluble HM1.24 antigen protein. May be DNA to be loaded. Examples of the conditions under which DNA encoding the soluble HM1.24 antigen protein hybridizes include DNA that hybridizes under appropriate stringency conditions. Examples of such hybridization conditions include low DNA. One example is stringency conditions. Low stringency conditions include, for example, cleaning conditions provided by 42 ° C., 5 × SSC, 0.1% sodium dodecyl sulfate, and 50% formamide. More preferably, high stringency conditions can be mentioned. Conditions of high stringency include, for example, 60 ° (: 0.1 SSC, 0.1% sodium dodecyl sulfate). The cleaning conditions provided by the camera. It is already known that a protein encoded by a DNA that hybridizes under appropriate conditions to a nucleotide sequence encoding a protein has the same biological activity as the protein.
従って、 本発明の可溶性 HM1.24抗原タンパク質は、 上記の 「ハイ ブリ ダィズする DNA 」 によ り コードされており、 可溶性 HM1.24抗原 タンパク質の生物活性を有するタンパク質も包含する。  Therefore, the soluble HM1.24 antigen protein of the present invention is encoded by the above-mentioned “hybridizing DNA”, and also includes a protein having the biological activity of the soluble HM1.24 antigen protein.
なお、 細胞膜上に発現するヒ ト HM1.24抗原タンパク質のアミ ノ酸 配列を配列番号 ： 15又は 23に示す。 配列番号 ： 15又は 23のァミノ酸 配列を有するヒ トタンパク質をコー ドする DNA を pUC べクターの Xb al切断部位間に保持するプラスミ ド pRS38-pUC19 を含有する大腸菌 は Escherichia coli DH5ひ （pRS38— pUC19 ) と命名され、 平成 5 ( 1993) 年 1 0月 5 日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨 城県つくば市東 1 丁目 1 番 3 号） に寄託番号 FERM BP-4434と して、 ブダぺス ト条約に基づき国際寄託されている。  The amino acid sequence of the human HM1.24 antigen protein expressed on the cell membrane is shown in SEQ ID NO: 15 or 23. Escherichia coli containing the plasmid pRS38-pUC19, which retains a DNA encoding a human protein having an amino acid sequence of 15 or 23 between the Xbal cleavage sites of pUC vector, is Escherichia coli DH5 (pRS38- pUC19) and the deposit number FERM BP-4434 on October 5, 1993 at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) on October 5, 1993. It has been deposited internationally under the Budapest Treaty.
本発明の可溶性 HM1.24抗原タンパク質はまた、 可溶性 HM1.24抗原 タンパク質の生物学的活性を有する限り他のペプチド又はポリぺプ チドと融合した上記タンパク質であってよい。 これら融合タンパク 質を作製する方法は、 すでに公知の手法を用いることができる。 タ ンパク質との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとして は、 本発明に有効に使用される限りいかなるペプチ ド又はポリぺプ チドであってよい。  The soluble HM1.24 antigen protein of the present invention may also be the above protein fused to another peptide or polypeptide as long as it has the biological activity of the soluble HM1.24 antigen protein. As a method for producing these fusion proteins, known methods can be used. The other peptide or polypeptide to be fused with the protein may be any peptide or polypeptide as long as it is effectively used in the present invention.
例えば、 ペプチ ドと しては、 FLAG (Hopp, T. P. et al.， BioTec hnology (1988) 6, 1204-1210 ) 、 6 個の His (ヒスチジン) 残基 からなる 6 XHis 、 lOXHis 、 イ ンフルエンザ凝集素 （HA) 、 ヒ ト c-myc の断片、 VSV- GPの断片、 pl8HIVの断片、 T7_tag、 HSV-tag 、 E - tag 、 SV40T 抗原の断片、 lck tag 、 a- tubulin の断片、 B- tag 、 Pr o t e in C の断片等、 すでに公知であるペプチ ドが使用される。 また例えば、 ポリペプチ ドと しては、 GST (ダルタチオン · S · トランスフエラーゼ） 、 HA、 ィムノグロブリ ン定常領域、 b-ガラク トシダーゼ、 MBP (マルトース結合蛋白質） 等が挙げられる。 これ らは市販されているものを用いるこ とができる。 For example, peptides include FLAG (Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6 XHis consisting of 6 His (histidine) residues, lOXHis, and influenza agglutinin. (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, pl8HIV fragment, T7_tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen fragment, lck tag, a-tubulin fragment, B-tag A known peptide such as a fragment of Protein in C or the like is used. Further, for example, polypeptides include GST (daltathione-S-transferase), HA, immunoglobulin constant region, b-galactosidase, MBP (maltose binding protein) and the like. These can be used commercially available ones.
本発明のタンパク質をコー ドする DNA は、 以上に述べた DNA を市 販のキッ トゃ公知の方法によつて構築するこ とができる。 例えば、 制限酵素による消化、 リ ンカ一の付加、 開始コ ドン （ATG ) 及びノ 又は終始コ ドン （ATT 、 TGA 又は TAG ) の挿入等によ り構築するこ とができる。  The DNA encoding the protein of the present invention can be constructed from the above-described DNA by a commercially available kit known in the art. For example, it can be constructed by digestion with a restriction enzyme, addition of a linker, insertion of an initiation codon (ATG) and a no or termination codon (ATT, TGA or TAG), and the like.
本発明のタ ンパク質の発現ベクターは、 本発明に好適に使用され る発現ベクターであればいかなる発現ベクターであってよい。 発現 ベクターと しては、 哺乳動物由来の発現ベクター、 例えば pEF 、 pC DM8 、 昆虫細胞由来の発現ベクター、 例えば pBacPAK8、 植物由来の 発現ベクター、 例えば ρΜΗ1、 pMH2、 動物ウィルス由来の発現べクタ 一、 例えば PHSV、 pMV 、 酵母由来の発現ベクター、 例えば pNVl l 、 枯草菌由来の発現ベクター、 例えば pPL608、 ρΚΤΗδΟ , 大腸菌由来の 発現ベクター、 例えば pGEX、 pGEMEX、 pMALP2が挙げられる。 The protein expression vector of the present invention may be any expression vector that is suitably used in the present invention. Examples of expression vectors include mammalian-derived expression vectors, such as pEF, pCDM8, insect cell-derived expression vectors, such as pBacPAK8, plant-derived expression vectors, such as ρΜΗ1, pMH2, and animal virus-derived expression vectors. for example P HSV, pMV, expression vectors derived from yeast, e.g. PNVl l, expression vectors derived from Bacillus subtilis, e.g. pPL608, Rokappatauitaderutaomikuron, expression vectors derived from Escherichia coli, for example pGEX, pGEMEX, include pMAL P 2.
本発明のタンパク質の発現べクターには、 例えば可溶性 HM1. 24抗 原タンパク質をコー ドする DNA をプロモーターの下流に連結し、 こ れを発現べクターに導入するこ とによ り製造するこ とができる。 プ 口モーター Zェンハンサ一と しては、 哺乳動物由来のプロモーター  The expression vector of the protein of the present invention may be produced, for example, by ligating DNA coding for the soluble HM1.24 antigen protein downstream of the promoter and introducing it into the expression vector. Can be. As a Z motor, a mammalian promoter
/ェンハンサー、 例えば EF1 - aプロモーター/ェンハンサー、 γ 一 ァクチンプロモーター/ェンハンサー、 昆虫ウイノレス由来のプロモ 一ター Ζェンハンサー、 例えば多核体 （ポリヘドリ ン） ウィルスプ 口モーター ζェンハンサー、 植物由来のプ口モーターノエンハンサ 一、 例えばタノ コモザィク ウイノレスプロモーター ζェンハンサー、 動物ウイノレス由来のプロモーター/ェンハンサー、 例えば SV40プ口 モーター /ェンハンサー、 ヒ ト CMV プロモーター Zェンハンサー、 酵母由来のプロモーター/ェンハンサー、 例えばアルコール脱水素 酵素プロモーターノエンハンサー、 大腸菌由来のプロモーター Zェ ンハンサー、 例えば Lac プロモーター Zェンハンサー、 Trp プロモ 一ター/ェンハンサー、 Tac プロモーター/ェンハンサ一が挙げら れる。 / Enhancers, such as EF1-a promoter / enhancer, gamma actin promoter / enhancer, promoters derived from insect vinoles, such as polynuclear (polyhedrin) virus mouth motors, and plant-derived motorhead enhancers. First, for example, Tano Komozyk Winores promoter Jenhanser, Promoters / enhancers derived from animal vinoles, e.g., SV40 motor / enhancer, human CMV promoter Z enhancer, promoters / enhancers derived from yeast, e.g., alcohol dehydrogenase promoter no enhancer, E. coli-derived promoter Z enhancer, e.g., Lac promoter Z Enhancer, Trp Promoter / Enhancer, Tac Promoter / Enhancer.
本発明のタンパク質の発現には、 発現に用いられる宿主に適した シグナル配列を付加して使用してもよい。 シグナル配列と しては、 例えば分泌蛋白質のシグナル配列が挙げられる。 分泌蛋白質のシグ ナル配列と しては、 例えば哺乳動物由来分泌蛋白質のシグナル配列 、 例えばィムノグロブリ ンのシグナル配列が挙げられる。 また分泌 蛋白質のシグナル配列としては、 大腸菌由来分泌蛋白質のシグナル 配列、 例えば OmpA等のペリ ブラズム分泌シグナル配列が挙げられる このよ うに作製した発現ベクターは、 公知の方法によ り宿主に導 入することができる。 宿主への導入の方法と しては、 例えばエレク ト ロポレーシヨ ン、 リ ン酸カルシウム法、 リ ボソーム法が挙げられ る。  For expression of the protein of the present invention, a signal sequence suitable for a host used for expression may be added and used. Examples of the signal sequence include a signal sequence of a secretory protein. Examples of the secretory protein signal sequence include, for example, a signal sequence of a mammalian-derived secretory protein, for example, a signal sequence of immunoglobulin. Examples of the signal sequence of the secretory protein include a signal sequence of a secretory protein derived from Escherichia coli, for example, a periplasmic secretory signal sequence such as OmpA. The expression vector thus prepared may be introduced into a host by a known method. Can be. Examples of the method of introduction into a host include the electroporation, calcium phosphate method, and ribosome method.
本発明に使用されるタンパク質は、 上述のように遺伝子組換え技 術を用いて産生させた組換えタンパク質として得ることができる。 例えば、 組換えタンパク質は、 本明細書に記載された遺伝子の塩基 配列をそれらを発現する細胞、 組織、 又は臓器からク ローニングし 、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し産生させる。 本発明には、 この組換えタンパク質を用いることができる。  The protein used in the present invention can be obtained as a recombinant protein produced using a gene recombination technique as described above. For example, a recombinant protein is produced by cloning the nucleotide sequence of the gene described herein from a cell, tissue, or organ that expresses them, incorporating the nucleotide sequence into an appropriate vector, and introducing the vector into a host. This recombinant protein can be used in the present invention.
具体的には、 本発明に使用されるタンパク質を発現する細胞、 組 織、 又は臓器から、 その遺伝子をコードする mRNAを単離する。 mRNA の単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法（Chirgwin, J . M. et al.， Biochemistry (1979) 18， 5294-5299) 、 AGPC法 （Ch omczynski , P. and Sacchi , N.， Anal. Biochem. 、1987) lb2 , 15 6-159) 等によ り全 RNA を調製し、 mRNA Purification Kit (Pharma cia) 等を使用して全 RNA から mRNAを精製する。 また、 QuickPrep m RNA Purification Kit (Pharmacia) を用いることによ り mRNAを直 接調製するこ ともできる。 Specifically, mRNA encoding the gene is isolated from cells, tissues, or organs expressing the protein used in the present invention. mRNA Can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. and Sacchi, N. et al. , Anal. Biochem., 1987) lb2, 156-159). Prepare total RNA and purify mRNA from total RNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Alternatively, mRNA can be directly prepared by using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて遺伝子の cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA S ynthesis Kit (生化学工業） 等を用いて行う こともできる。 また、 cDNAの合成及び増幅を行うには Marathon cDNA Amplification kit( CLONTECH製） 及びポリ メ ラーゼ連鎖反応 （polymerase chain react ion ； PCR ) を用いた 5' -RACE 法（Frohman, M. A. et al. , Proc . Natl. Acad. Sci. U. S.A. (1988) 85， 8998-9002 ； Belyavsky, A. et al.， Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) を使用す るこ とができる。  CDNA of the gene is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase. cDNA can also be synthesized using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Corporation) or the like. In order to synthesize and amplify cDNA, a 5'-RACE method using Marathon cDNA Amplification kit (manufactured by CLONTECH) and polymerase chain reaction (PCR) (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) can be used.
得られた PCR 産物から目的とする DNA 断片を調製し、 ベクター DN A と連結する。 さ らに、 これよ り組換えベクターを作製し、 大腸菌 等に導入してコロニーを選択して所望の耝換えべクターを調製する 。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、 例えば、 ジデォキシヌ クレオチ ドチェインターミネーショ ン法によ り確認する。 目的とす る DNA が得られれば、 これを発現ベクターへ組み込む。 よ り具体 的には、 前記のよ うに構築した DNA は、 下記のよ うに発現させ、 タ ンパク質を取得することができる。  Prepare the target DNA fragment from the obtained PCR product and ligate it with the vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and a colony is selected to prepare a desired recombinant vector. The nucleotide sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the dideoxynucleotide chain termination method. Once the desired DNA is obtained, incorporate it into the expression vector. More specifically, the DNA constructed as described above can be expressed as described below to obtain protein.
哺乳類細胞を使用する場合、 常用される有用なプロモーター Zェ ンハンサー、 発現される遺伝子、 その 3'側下流にポリ A シグナルを 機能的に結合させた DNA あるいはそれを含むベクターにより発現さ せることができる。 例えばプロモーター zェンハンサ一としては、 ヒ トサイ トメガロウイルス前期プロモーター エンハンサー （huma n cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer ) を拳け ることができる。 When a mammalian cell is used, it is expressed by a commonly used and useful promoter Z enhancer, a gene to be expressed, a DNA having a polyA signal operably linked to its 3 ′ downstream, or a vector containing the same. Can be made. For example, as a promoter, a human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer can be used.
また、 その他にタンパク質発現に使用できるプロモーター/ェン ハンサ一と して、 レ ト ロ ウイルス、 ポリォ一マウィルス、 アデノウ ィルス、 シミ アンウィルス 40 (SV 40 ) 等のウ ィルスプロモーター /ェンハンサーゃヒ トェロンゲーシ ヨ ンファ ク ター 1 a (HEF1 a ) の哺乳類細胞由来のプロモーター Zェンハンサーを用いればよい。 例えば、 SV 40 プロモーター/ェンハンサーを使用する場合、 Mu lliganらの方法 (Nature (1979) 277, 108) 、 また、 HEF1ひプロモ 一ター Zェンハンサーを使用する場合、 Mizushima らの方法 （Nucl eic Acids Res. (1990) 18， 5322) に従えば容易に実施することが できる。 Other promoters / enhancers that can be used for protein expression include virus promoters / enhancers such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, and simian virus 40 (SV40). Nfa click ter 1 a may be used promoter Z Enhansa from mammalian cells (HEF1 a). For example, when using the SV40 promoter / enhancer, the method of Mulligan et al. (Nature (1979) 277, 108), and when using the HEF1 promoter Zenhancer, the method of Mizushima et al. (1990) 18, 5322).
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 タンパク質分泌 のためのシグナル配列、 発現させる遺伝子を機能的に結合させて発 現させることができる。 例えばプロモーターとしては、 lacZプロモ 一ター、 araBプロモーターを挙げることができる。 lacZプロモータ 一を使用する場合、 Wardらの方法 （Nature (1098) 341, 544-546 ； FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) 、 araBプロモーターを使用する場 合、 Betterらの方法 （Science (1988) 240, 1041-1043 ) に従えば よい。  In the case of Escherichia coli, expression can be achieved by operably linking a useful promoter commonly used, a signal sequence for protein secretion, and a gene to be expressed. For example, examples of the promoter include a lacZ promoter and an araB promoter. When the lacZ promoter is used, the method of Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), and when the araB promoter is used, the method of Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043).
タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のぺリ プ ラズムに産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei， S. P. et al J . Bacteriol. (1987) 169, 4379 ) を使用すればよい。  As a signal sequence for protein secretion, the pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used for production in E. coli periplasm.
複製起源と しては、 SV 40 、 ポリオ一マウィルス、 アデノウィル ス、 ゥシパピローマウィルス （BPV ) 等の由来のものを用いること ができる。 さ らに、 宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現 ベクターは選択マーカーと して、 アミノグリ コシドホスホ トランス フェラーゼ （APH ) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸 菌キサンチングァニンホスホリ ボシルトランスフェラーゼ （Ecogpt ) 遺伝子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことがで さる。 Use replication origins such as those derived from SV40, poliovirus, adenovirus, sipapipillomavirus (BPV), etc. Can be. In addition, the expression vector is used as a selectable marker for aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phosphorolibosyltransferase for gene copy number amplification in the host cell system. (Ecogpt) gene and dihydrofolate reductase (dhfr) gene.
本発明において、 タンパク質の製造のために、 任意の産生系を使 用することができる。 タンパク質製造のための産生系は、 in vitro 及び in vivo の産生系がある。 in vitroの産生系と しては、 真核細 胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。  In the present invention, any production system can be used for protein production. Production systems for protein production include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems using eukaryotic cells and production systems using prokaryotic cells.
真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を用い る産生系がある。 動物細胞と しては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば CH0 When eukaryotic cells are used, there are production systems using animal cells, plant cells, and fungal cells. Examples of animal cells include (1) mammalian cells, such as CH0
(J. Exp. Med. (1995) 108， 945) 、 COS 、 ミエローマ、 BHK (ba by hamster kidney ) 、 HeLa、 Vero、 (2) 両生類細胞、 例えばァフ リ カツメガエル卵母細胞 （Valle， et al. , Nature (1981) 291, 35 8-340 ) 、 あるいは（3) 昆虫細胞、 例えば sf9 、 sf21、 Tn5 が知ら れている。 CH0 細胞と しては、 特に DHFR遺伝子を欠損した CH0 細胞 である dhfr- CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77， 4216-4 220 ) や CHO K-l (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275 ) を好適に使用することができる。 (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, myeloma, BHK (ba by hamster kidney), HeLa, Vero, (2) Amphibian cells, such as the oocytes of the Xenopus laevis (Valle, et. al., Nature (1981) 291, 358-340), or (3) insect cells such as sf9, sf21, and Tn5. Examples of CH0 cells include dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) and CHO Kl (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) can be suitably used.
植物細胞と しては、 ニコチアナ ' タパクム （Nicotiana tabacum ) 由来の細胞が知られており、 これをカルス培養すればよい。 真菌 細胞と しては、 酵母、 例えばサッカロ ミセス （Saccharomyces ) 属 、 例えはサッカロ ミセス ' セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae ) 、 糸状菌、 例えばァスペルギウス属 （Aspergillus ) 属、 例えば ァスぺノレギウス · 二ガー (Aspergillus niger ) 力 S知られている。 原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞と しては、 大腸菌 （E. coli ) 、 枯草菌が知られている。 As plant cells, cells derived from Nicotiana tabacum are known, and callus culture may be used. Fungal cells include yeast, such as the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces' Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi, such as the genus Aspergillus, such as Aspernogillus niger ) Force S Known. When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells. Bacteria As cells, Escherichia coli (E. coli) and Bacillus subtilis are known.
これらの細胞を目的とする DNAによ り形質転換し、 形質転換さ れた細胞を in vitroで培養することによ り タンパク質が得られる。 培養は、 公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液として、 DMEM、 ME M 、 RPMI1640、 IMDMを使用することができる。 その際、 牛胎児血清 (FCS ) 等の血清補液を併用することもできるし、 無血清培養して もよい。 培養時の pHは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 1 5〜 2 0 0時間行い、 必要に応じて培地の交換 、 通気、 撹拌を加える。  Proteins can be obtained by transforming these cells with the desired DNA and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture solution. At that time, a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) may be used in combination, or serum-free culture may be performed. The pH during culturing is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 200 hours, and if necessary, the medium is replaced, aerated, and agitated.
一方、 in vivo の産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物又は植物に目的とす る DN Aを導入し、 動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、 回収する。  On the other hand, examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants. The desired DNA is introduced into these animals or plants, and the protein is produced and recovered in the animals or plants.
動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物としては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥシを用い るこ と力 Sできる (Vicki Glaser , SPECTRUM Biotechnology Applica tions, 1993 ) 。 また、 哺乳類動物を用いる場合、 トランスジェニ ック動物を用いることができる。  When using animals, there are production systems using mammals and insects. Goats, pigs, sheep, mice, and mice can be used as mammals (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). When a mammal is used, a transgenic animal can be used.
例えば、 目的とする DNA をャギ ]3カゼイ ンのよ うな乳汁中に固有 に産生される蛋白質をコー ドする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝 子と して調製する。 この DNA が挿入された融合遺伝子を含む DNA 断 片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ導入する。 胚を受容し たャギから生まれる トランスジエニックャギ又はその子孫が産生す る乳汁からタンパク質を得る。 トランスジエニックャギから産生さ れるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、 適宜ホルモンを トランスジエニックャギに使用してもよレヽ。 (Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology (1994) 12， 699-702 ) 。 また、 昆虫と しては、 例えばカイコを用いることができる。 カイ コを用いる場合、 目的とする DNA を挿入したパキュロウィルスを力 ィコに感染させ、 このカイコの体液よ り所望のタンパク質を得る （ Susumu, M. et al.， Nature (1985) 315， 592-594 ) 。 For example, the target DNA is inserted into a gene encoding a protein that is uniquely produced in milk, such as goat] 3 casein, to prepare a fusion gene. A DNA fragment containing the fusion gene into which the DNA has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat. A protein is obtained from milk produced by a transgenic goat born from a goat that has received an embryo or a progeny thereof. Hormones may be used in transgeneic goats as appropriate to increase the amount of milk containing proteins produced from transgeneic goats. (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702). In addition, silkworms can be used as insects, for example. When a silkworm is used, a paculovirus into which a target DNA has been inserted is used to infect a chick, and a desired protein is obtained from the body fluid of the silkworm (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).
さ らに植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる 。 タパコを用いる場合、 目的とする DNA を植物発現用ベクター、 例 えば pMON 530に挿入し、 このベクターをァグロパクテリ ゥム · ッメ ファシエンス (Agrobacterium tumefaciens ) のよ うなノ クテリ ア に導入する。 このパクテリアをタバコ、 例えばニコチアナ · タパク ム （Nicotiana tabacum ) に感染させ、 本タバコの葉より所望のタ ンパク質を得る （Julian, K. -C. Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1 994) 24, 131-138) 。  When using a plant, for example, tobacco can be used. When tapaco is used, the DNA of interest is inserted into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a nocteria such as Agrobacterium tumefaciens. By infecting the bacterium with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, the desired protein is obtained from the leaves of the tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. 1 994) 24, 131-138).
なお、 宿主への発現ベクターの導入方法と しては、 公知の方法、 例えばリ ン酸カルシウム法 （Virology (1973) 52, 456-467 ) ゃェ レク トロポレーショ ン法 （EMBO J. (1982) 1， 841-845 ) 等が用い られる。 また、 発現に使用する宿主のコ ドン使用頻度を考慮して、 より発現効率の高い配列を設計することができる （Grantham, R. e t al.， Nucleic Acids Research (1981) 9， r43- r74 ) 。  Known methods for introducing an expression vector into a host include, for example, the calcium phosphate method (Virology (1973) 52, 456-467) and the electroporation method (EMBO J. (1982) 1 , 841-845). In addition, sequences with higher expression efficiency can be designed in consideration of the codon usage of the host used for expression (Grantham, R. et al., Nucleic Acids Research (1981) 9, r43-r74). .
これらの動物又は植物に上記のよ うに遺伝子を導入し、 動物又は 植物の体内でタンパク質を産生させ、 回収する。 前記のように発現 、 産生されたタンパク質は、 細胞内外、 宿主から分離し均一にまで 精製することができる。 本発明で使用されるタンパク質の分離、 精 製は通常のタンパク質で使用されている分離、 精製方法を使用すれ ばよく、 何ら限定されるものではない。  The gene is introduced into these animals or plants as described above, and proteins are produced and recovered in the animals or plants. The protein expressed and produced as described above can be separated from the host inside and outside the cell and from the host and purified to homogeneity. The separation and purification of the protein used in the present invention may be carried out by using the separation and purification methods used for ordinary proteins, and is not limited at all.
例えば、 ァフィ二ティーク ロマ トグラフィー等のクロマ トグラフ ィーカラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDS ポリ アタ リ ルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動等を適宜選択、 組み合わせ れば、 タンパク質を分離、 精製することができる （新生化学実験講 座 1 (1990) 東京化学同人） 。 For example, chromatographic columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyatomic amide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. are appropriately selected and combined. If this is the case, proteins can be separated and purified (Shinsei Kagaku Experimental Course 1 (1990) Tokyo Chemical Doujin).
クロマ トグラフィ一と しては、 例えばァフィ二ティークロマ トグ ラフィー、 イオン交換クロマ トグラフィー、 疎水性クロマ トグラフ ィー、 ゲル濾過、 逆相クロマ トグラフィー、 吸着クロマ トグラフィ 一等力 牵けられる (Strategies for Protein Purification and し ha racterization ： A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Mar shak et al.， Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1996) 。 こ れらのクロマ トグラフィーは HPLC、 FPLC等の液相クロマ トグラフィ 一を用いて行う ことができる。  Chromatography includes, for example, affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for chromatography). Protein Purification and shi racterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Mar shak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatographies can be performed using liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
タンパク質は、 公知の方法を用いて濃度を測定することができる 。 例えば、 吸光度の測定又は Bradford法を用いればよい。  The concentration of the protein can be measured using a known method. For example, measurement of absorbance or Bradford method may be used.
本発明は、 可溶性 HM1.24抗原タンパク質と被験試料中に含まれる 抗 HM1.24抗体とを反応させて、 可溶性 HM1.24抗原タンパク質に結合 した抗 HM1.24抗体を検出又は測定する工程を含む、 抗 HM1.24抗体の 免疫化学的測定方法 ； 及び  The present invention includes a step of reacting a soluble HM1.24 antigen protein with an anti-HM1.24 antibody contained in a test sample to detect or measure an anti-HM1.24 antibody bound to the soluble HM1.24 antigen protein. A method for immunochemical measurement of anti-HM1.24 antibody;
抗 HM1.24抗体と被験試料中に含まれる可溶性 HM1.24抗原タンパク 質とを反応させて、 抗 HM1.24抗体に結合した可溶性 HM1.24抗原タン パク質を検出又は測定する工程を含む、 可溶性 HM1.24抗原タンパク 質の免疫化学的測定方法に関する。  Reacting the anti-HM1.24 antibody with the soluble HM1.24 antigen protein contained in the test sample to detect or measure the soluble HM1.24 antigen protein bound to the anti-HM1.24 antibody. The present invention relates to a method for immunochemical measurement of a soluble HM1.24 antigen protein.
本発明において提供される免疫化学的測定方法は、 in vitroのァ ッセィ系として行われる。 この方法の 1例を図 1 に模式的に示す。 in vitro のアツセィ系は、 非細胞系において行われる。 具体的 には可溶性 HM1.24抗原タンパク質を支持体に結合させ、 このタンパ ク質に抗匪 1.24抗体を含む被験試料を加え、 インキュベートをした 後洗浄して支持体に結合した可溶性 HM1.24抗原タンパク質に対する 抗 HM1.24抗体の結合を検出又は測定すればよい。 又は、 具体的には 抗 HM1. 24抗体を支持体に結合させ、 このタンパク質に可溶性 HM1. 24 抗原タンパク質を含む被験試料を加え、 イ ンキュベー トをした後洗 浄して支持体に結合した抗 HM1. 24抗体に対する可溶性 HM1. 24抗原タ ンパク質の結合を検出又は測定すればよい。 The immunochemical measurement method provided in the present invention is performed as an in vitro assay system. One example of this method is schematically shown in FIG. In vitro Atsushi systems are performed in non-cellular systems. Specifically, the soluble HM1.24 antigen protein was bound to the support, a test sample containing the anti-band 1.24 antibody was added to this protein, and the mixture was incubated, washed, and then washed to remove the soluble HM1.24 antigen bound to the support. What is necessary is just to detect or measure the binding of the anti-HM1.24 antibody to the protein. Or, specifically, The anti-HM1.24 antibody was bound to the support, and a test sample containing the soluble HM1.24 antigen protein was added to this protein. The sample was incubated, washed, and washed to dissolve the anti-HM1.24 antibody bound to the support. The binding of the HM1.24 antigen protein may be detected or measured.
可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体は、 それらを固有 に発現する細胞、 それらをコー ドする DNA を導入した細胞、 それら をコードする DNA を導入した動物又は植物から産生されるタンパク 質を、 精製した状態であるいは粗精製の状態で使用することができ る。  Soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody is a protein produced from cells that express them uniquely, cells transfected with the DNA encoding them, and animals or plants transfected with the DNA encoding them. Can be used in a purified state or in a partially purified state.
精製された又は粗精製された可溶性 HM1， 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体のいずれか一方のタンパク質を支持体に結合させる。 タ ンパク質を支持体に結合させる際に標準的な方法でタンパク質を支 持体に固相化することができる。 タンパク質を結合させる支持体と しては、 例えば不溶性の多糖類、 例えばァガロース、 デキス ト ラ ン 、 セルロース、 合成樹脂、 例えばポ リ スチレン、 ポリ アク リ ルアミ ド、 シリ コ ン等が挙げられる。  Either purified or partially purified soluble HM1,24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody protein is bound to the support. When binding the protein to the support, the protein can be immobilized on the support by standard methods. Examples of the support to which the protein is bound include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, cellulose, and synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon.
よ り具体的にはそれらを原料と して製造される市販のビーズ、 プ レー トが用いられる。 ビーズの場合、 これらが充填されたカラム等 を用いてもよレ、。 プレー トの場合、 マルチウエルプレート （96穴マ ルチウエルプレー ト等） やバイオセンサーチップが挙げられる。  More specifically, commercially available beads and plates manufactured using them as raw materials are used. In the case of beads, a column filled with these may be used. In the case of a plate, a multiwell plate (eg, a 96-well multiwell plate) or a biosensor chip can be used.
タンパク質と支持体との結合は、 化学結合、 物理的な吸着等、 通 常用いられる方法によ り結合すればよい。 また、 タンパク質を特異 的に認識する抗体を上述の方法によ り予め支持体に結合せしめ、 こ の抗体とタンパク質とを結合させることによ り結合することもでき る。 さ らに、 アビジン/ピオチンを介して結合させることができる 可溶性 HM1. 24抗原タ ンパク質と抗 HM1. 24抗体の結合は、 通常緩衝 液中で行われる。 緩衝液と しては、 例えばリ ン酸緩衝液、 Tr i s緩衝 液等が使用される。 また、 イ ンキュベー トの条件と しては、 すでに よく用いられている条件、 例えば 4 °C〜室温にて 1 時間〜 2 4時間 のイ ンキュベーショ ンが行われる。 イ ンキュベー ト後の洗浄は、 可 溶性 HM1. 24抗原タンパク質と抗 HM1. 24抗体との結合を妨げないもの であれば何でもよく、 例えば界面活性剤を含む緩衝液が使用される 。 界面活性剤と しては、 例えば 0. 05%Tween 20 が使用される。 The binding between the protein and the support may be performed by a commonly used method such as chemical bonding or physical adsorption. Alternatively, an antibody that specifically recognizes a protein can be bound to a support in advance by the above-described method, and the antibody can be bound to the protein to bind. In addition, the binding between soluble HM1.24 antigen protein and anti-HM1.24 antibody, which can be bound via avidin / biotin, is usually buffered. Performed in liquid. As the buffer, for example, a phosphate buffer, a Tris buffer, or the like is used. Incubation is performed under conditions that are already commonly used, such as incubation at 4 ° C to room temperature for 1 hour to 24 hours. The post-incubation washing may be any as long as it does not hinder the binding between the soluble HM1.24 antigen protein and the anti-HM1.24 antibody. For example, a buffer containing a surfactant is used. As the surfactant, for example, 0.05% Tween 20 is used.
本発明において測定される可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM 1. 24抗体を含む被験試料と しては、 ヒ ト体液 （血液、 血清、 尿、 関 節液等） 、 細胞の培養上清、 動物の分泌物 （乳等） 、 医薬製剤等を あげることができる。  The test sample containing the soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody measured in the present invention includes human body fluids (blood, serum, urine, joint fluid, etc.), cell culture supernatant, Animal secretions (milk, etc.), pharmaceutical preparations, and the like.
これらの被験試料に含まれる可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体に対する抗 HM1. 24抗体又は可溶性 HM1. 24抗原タンパク質 の結合を検出又は測定する際、 適切な条件下でィンキュペー ト及び 洗浄するこ とによ り、 特異的な結合と非特異的な結合を分離するこ とができる。 そして、 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質と抗 HM1. 24抗体 との結合状態を評価すればよい。  When detecting or measuring the binding of the anti-HM1.24 antibody or soluble HM1.24 antigen protein to the soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody contained in these test samples, incubate and wash under appropriate conditions. By doing so, specific binding and non-specific binding can be separated. Then, the binding state between the soluble HM1.24 antigen protein and the anti-HM1.24 antibody may be evaluated.
本発明の免疫化学的測定方法において、 被験試料をタンパク質に 接触させる群と共にコントロール群を設置してもよい。 コントロー ル群と しては、 被験試料を含まない陰性コントロール群又は精製さ れた可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体の標品を含む陽 性コント口ール群あるいはその両群をおく ことができる。  In the immunochemical measurement method of the present invention, a control group may be provided together with a group in which a test sample is brought into contact with a protein. As the control group, a negative control group containing no test sample and / or a positive control group containing a purified soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody standard were used. Can be kept.
本発明の免疫化学的測定方法によ り、 結合したタンパク質を検出 するこ とができる。 又は結合したタンパク質を定量的に測定するこ ともできる。 これらの場合、 被験試料を含まない陰性コント ロール 群で得られた結果、 被験試料を含む群で得られた結果及び 又は精 製された可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗匪 1. 24抗体の標品を含 む陽性コント ロール群で得られた結果を比較することにより、 可溶 性 HM1. 24抗原タンパク質と抗 HM1. 24抗体との結合を検出するこ とが できる。 The bound protein can be detected by the immunochemical measurement method of the present invention. Alternatively, the bound protein can be quantitatively measured. In these cases, the results obtained in the negative control group without the test sample, the results obtained in the group with the test sample and / or the purified soluble HM1.24 antigen protein or anti-band 1.24 antibody Including goods By comparing the results obtained with the positive control group, the binding between the soluble HM1.24 antigen protein and the anti-HM1.24 antibody can be detected.
また、 それらの検出の結果を数値と して得、 それらの数値を比較 するこ とによ り、 被験試料に含まれる可溶性 HM1. 24抗原タンパク質 又は抗 HM1. 24抗体を定量的に測定することもできる。 定量的に測定 する場合、 被験試料を含まない陰性コントロール群で得られた数値 と可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体を含む被験試料を 適用した群で得られた数値を比較することによ り、 可溶性 HM1. 24抗 原タンパク質と抗匪 1· 24抗体との結合量を定量することができる。 被験試料中に可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体が含ま れていれば、 結合したタンパク質が存在することによ り可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体を検出又は測定するこ とができ る。  In addition, the results of their detection are obtained as numerical values, and by comparing those numerical values, the soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody contained in the test sample can be quantitatively measured. Can also. When measuring quantitatively, compare the values obtained in the negative control group without the test sample with the values obtained in the group to which the test sample containing the soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody was applied. As a result, the amount of binding between the soluble HM1.24 antigen protein and the anti-bandwidth antibodies 124 can be quantified. If soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody is contained in the test sample, soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody is detected or measured by the presence of the bound protein. be able to.
また、 定量的に測定する場合、 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は 抗 HM1. 24抗体を既知量含む陽性コントロール群で得られた数値によ り作成された標準曲線を元に定量することができる。  In the case of quantitative measurement, it can be quantified based on a standard curve prepared from numerical values obtained in a positive control group containing a known amount of soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody.
本発明の免疫化学的測定方法において、 被験試料中の可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体を検出又は測定する手段と して 表面ブラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用すること ができる。 表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタ ンパク質一タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてか つ標識するこ となく、 表面プラズモン共鳴シグナルと してリ アルタ ィムに観察することが可能である （例えば B IAcore ； Pharmac ia 製 ) 。 したがって、 B IAcore 等のバイオセンサーを用いることによ り 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質と抗 HM1. 24抗体との結合を検出又は測 定することが可能である。 具体的には、 可溶性 HMl.24抗原タンパク質又は抗 HMl.24抗体を固 定化したセンサーチップに、 抗 HM1.24抗体又は可溶性 HM1.24抗原タ ンパク質を含む被験試料を接触させ、 可溶性 HM1.24抗原タンパク質 又は抗 HM1.24抗体に結合する抗 HM1.24抗体又は可溶性 HM1.24抗原タ ンパク質を共鳴シグナルの変化として検出又は測定することができ る。 In the immunochemical measurement method of the present invention, a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon can be used as a means for detecting or measuring a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody in a test sample. . A biosensor that utilizes the surface plasmon resonance phenomenon allows real-time observation of the interaction between protein and protein as a surface plasmon resonance signal without labeling using a small amount of protein. It is possible (for example, BIAcore; manufactured by Pharmacia). Therefore, it is possible to detect or measure the binding between the soluble HM1.24 antigen protein and the anti-HM1.24 antibody by using a biosensor such as BIAcore. Specifically, a test sample containing an anti-HM1.24 antibody or a soluble HM1.24 antigen protein is brought into contact with a sensor chip on which a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody is immobilized, and the soluble HM1. Anti-HM1.24 antibody or soluble HM1.24 antigen protein that binds to .24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody can be detected or measured as a change in resonance signal.
よ り具体的には、 以下のように行えばよい。 初めにセンサーチッ プ CM5 (Biosensor 社） を活性化して可溶性 HM1.24抗原タンパク質 又は抗 HM1.24抗体をセンサーチップ上に固定化する。 すなわち、 ED C I NHS 水溶液 （200mM EDC (N-ェチル _Ν' - (3- ジメチルアミ ノプ 口ピル） カーボネー ト塩酸塩） , 50mM NHS (N -ヒ ドロキシサクシン イ ミ ド） ） によ りセンサーチップを活性化した後、 HBS パッファー (10mM HEPES pH7. , 150mM NaCl, 3.4m MEDTA, 0.05%Tween20) に よりセンサーチップを洗浄する。  More specifically, it may be performed as follows. First, the sensor chip CM5 (Biosensor) is activated to immobilize the soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody on the sensor chip. That is, the sensor chip is activated by an aqueous solution of ED CI NHS (200 mM EDC (N-ethyl_Ν '-(3-dimethylaminopropyl pill) carbonate hydrochloride), 50 mM NHS (N-hydroxysuccinimide)). After that, the sensor chip is washed with HBS buffer (10 mM HEPES pH7, 150 mM NaCl, 3.4 mM MEDTA, 0.05% Tween20).
次に HBSパッファ一に溶解した適量の抗 HM1.24抗体又は可溶性 HM 1.24抗原タンパク質を含む被験試料をセンサーチップに接触させ、 固定化する。 HBSバッファ一によ りセンサーチップを洗浄後、 エタ ノールァミ ン溶液 （1M ェタノールァミ ン塩酸塩， pH8.5 ) によ り センサーチップ上の残存活性基をブロ ックする。 再び HBSバッファ 一によ りセンサーチップを洗浄し結合評価に用いる。  Next, a test sample containing an appropriate amount of an anti-HM1.24 antibody or a soluble HM1.24 antigen protein dissolved in an HBS buffer is brought into contact with a sensor chip to be immobilized. After washing the sensor chip with an HBS buffer, the remaining active groups on the sensor chip are blocked with an ethanolamine solution (1M ethanolamine hydrochloride, pH 8.5). Wash the sensor chip again with HBS buffer and use it for binding evaluation.
次に HBS パッファ一に溶解した適量の抗 HM1.24抗体又は可溶性 HM 1.24抗原タンパク質を含む被験試料を注入する。 このときにセンサ 一チップに固定化された可溶性 HM1.24抗原タンパク質又は抗 HM1.24 抗体に結合した被験試料中の抗 HM1.24抗体又は可溶性 HM1.24抗原タ ンパク質の量は共鳴シグナル値の増加と して観察される。  Next, a test sample containing an appropriate amount of an anti-HM1.24 antibody or soluble HM1.24 antigen protein dissolved in an HBS buffer is injected. At this time, the amount of the anti-HM1.24 antibody or soluble HM1.24 antigen protein in the test sample bound to the soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody immobilized on one sensor chip was determined by the resonance signal value. Is observed as an increase in
さ らに、 また被験試料を含む群と共に、 コントロール群を設置し てもよい。 コントロール群としては、 被験試料を含まない陰性コン ト口ール群、 既知量の可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗 体を含む陽性コント口ール群あるいはその両群をおく ことができる 。 結合したタンパク質は共鳴シグナル値の変化量と して定量的に測 定することができる。 この場合、 被験試料を含まない陰性コント口 ール群で得られた結果、 被験試料を含む群で得られた結果及び/又 は既知量の可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体を含む陽 性コン ト ロール群で得られた結果を比較することによ り、 被験試料 中の目的とするタンパク質を検出又は測定することができる。 In addition, a control group may be set up together with the group containing the test sample. As a control group, a negative control containing no test sample was used. There may be a control group, a control group containing a known amount of soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody, or both groups. The bound protein can be quantitatively measured as a change in the resonance signal value. In this case, the results obtained in the negative control group containing no test sample, the results obtained in the group containing the test sample, and / or a known amount of soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody were used. By comparing the results obtained with the positive control group containing the target protein, the target protein in the test sample can be detected or measured.
本発明の免疫化学的測定方法において、 結合した被験試料中のタ ンパク質を検出又は測定する手段として、 可溶性 HM1. 24抗原タンパ ク質又は抗 HM1. 24抗体を特異的に認識する一次抗体を用いることが できる。  In the immunochemical measurement method of the present invention, a primary antibody that specifically recognizes a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody is used as a means for detecting or measuring the protein in the bound test sample. Can be used.
例えば、 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗丽 1. 24抗体に被験試 料を接触させ、 洗浄して結合しているタンパク質をそのタンパク質 を特異的に認識する一次抗体によ り検出又は測定する。 すなわち、 好ましくは支持体に結合させた一方のタンパク質にも う一方のタン パク質を含む被験試料とを接触させる。 インキュベー ト した後、 洗 浄して、 結合しているタンパク質をそのタンパク質を特異的に認識 する一次抗体によ り検出又は測定すればよい。 一次抗体は、 好まし くは標識物質によ り標識されている。  For example, a test sample is brought into contact with a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-1.224 antibody, washed, and the bound protein is detected or measured with a primary antibody that specifically recognizes the protein. That is, preferably, one protein bound to the support is brought into contact with a test sample containing the other protein. After incubating and washing, the bound protein may be detected or measured with a primary antibody that specifically recognizes the protein. The primary antibody is preferably labeled with a labeling substance.
可溶性 HM1. 24抗原タンパク質は、 他のぺプチド又はポリぺプチ ド と融合していてもよい。 したがって、 被験試料中に含まれる可溶性 HM1. 24抗原タンパク質を検出するために抗匪 1. 24抗体を使用するこ とができるし、 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質と融合した他のぺプチ ド又はポリべプチドに対する抗体を使用することができる。 また、 被験試料中に含まれる抗 HM1. 24抗体を検出するために抗 HM1. 24抗体 を特異的に認識する抗体を使用することができる。 抗 HM1. 24抗体が マウス抗体である場合、 抗 HM1. 24抗体を特異的に認識する抗体と し て抗マウスィ ムノグロブリ ン抗体を使用することができる。 また、 抗 HM1. 24抗体がキメラ抗体又はヒ ト型化抗体である場合、 抗 HM1. 24 抗体を特異的に認識する抗体と して抗ヒ トイムノグロプリ ン抗体を 使用することができる。 The soluble HM1.24 antigen protein may be fused to another peptide or polypeptide. Therefore, anti-band 1.25 antibody can be used to detect soluble HM1.24 antigen protein contained in the test sample, and other peptides or polypeptides fused with soluble HM1.24 antigen protein can be used. Antibodies to the peptides can be used. Further, in order to detect the anti-HM1.24 antibody contained in the test sample, an antibody that specifically recognizes the anti-HM1.24 antibody can be used. Anti-HM1.24 antibody In the case of a mouse antibody, an anti-mouse immunoglobulin antibody can be used as an antibody that specifically recognizes the anti-HM1.24 antibody. When the anti-HM1.24 antibody is a chimeric antibody or a humanized antibody, an anti-immunoglobulin antibody can be used as an antibody that specifically recognizes the anti-HM1.24 antibody.
タンパク質は、 通常知られる方法によ り標識されることができる 。 標識物質としては、 例えば放射性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 ビ ォチン/アビジン等が挙げられる。 これらの標識物質は市販の標識 物質を使用することができる。 放射性同位元素しては、 例えば3 2 ? 、 3 3 P 、 1 3 1 I 、 1 2 5 I 、 3 H 、 1 C 、 3 5 S が挙げられる。 酵素と しては、 例えばアルカ リ フォスファターゼ、 ホースラディッシュパ ーォキシダーゼ、 β - ガラク ト シダーゼ、 β - ダルコシダーゼ等が 挙げられる。 蛍光物質と しては、 例えばフロォロセインイソチオシ ァネート （FITC) 、 ローダミ ンが挙げられる。 これらは市販のもの を入手することができ、 公知の方法によって標識される。 The protein can be labeled by a commonly known method. Examples of the labeling substance include a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, biotin / avidin and the like. As these labeling substances, commercially available labeling substances can be used. Is to radioisotopes, for example 3 2?, 3 3 P, 1 3 1 I, 1 2 5 I, 3 H, 1 C, 3 5 S and the like. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, β-galactosidase, β-darcosidase and the like. Examples of the fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate (FITC) and rhodamine. These can be obtained commercially and labeled by a known method.
具体的には、 次のようにして行う ことができる。 すなわち、 可溶 性匪 1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体を含む溶液をプレー トに 加え、 一夜放置してプレートに固定する。 可溶性 HM1. 24抗原タ ンパ ク質又は抗 HM1. 24抗体を固定する際、 各々に対する抗体をあらかじ めプレー ト に固定し、 固定した抗体に可溶性 HM1. 24抗原タンパク質 又は抗 HM1. 24抗体を結合させてもよい。 プレートを洗浄の後、 タ ン パク質の非特異的な結合を防ぐため例えば BSA でプロ ッキングする 。 再び洗浄し、 抗 HM1. 24抗体又は可溶性 HM1. 24抗原タンパク質を含 む被験試料をプレー トに加える。 同時に被験試料を含まない群 （陰 性コント口ール） 及び 又は既知濃度の抗 HM1. 24抗体又は可溶性 ΗΜ 1. 24抗原タンパク質を加えた群 （陽性コントロール） を置き、 これ らをイ ンキュベー トする。 イ ンキュベー トの後、 洗浄し被験試料に対する抗体を加える。 適 度なィ ンキュベーショ ンの後、 プレー トを洗浄しそのタンパク質を 特異的に認識する一次抗体によ りタンパク質を検出又は測定する。 検出又は測定には、 放射性同位元素の場合液体シンチレ一シヨ ンに より検出又は測定する。 酵素の場合その基質を加え、 基質の酵素的 変化、 例えば発色を吸光度計により検出又は測定する。 蛍光物質の 場合蛍光光度計よ り検出又は測定する。 これらの結果を、 コン ト口 ール群で得られた数値を比較すれば阻害物質を含む被験試料を決定 することができる。 Specifically, it can be performed as follows. That is, a solution containing the soluble bandage 1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody is added to the plate, and left overnight to fix it on the plate. When immobilizing the soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody, the antibody for each is immobilized on a plate in advance, and the immobilized antibody is treated with soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody. They may be combined. After washing the plate, block it with, for example, BSA to prevent nonspecific binding of the protein. Wash again and add a test sample containing anti-HM1.24 antibody or soluble HM1.24 antigen protein to the plate. At the same time, a group containing no test sample (negative control) and / or a group to which a known concentration of anti-HM1.24 antibody or soluble ΗΜ1.24 antigen protein was added (positive control) were placed and incubated. I do. After incubation, wash and add antibodies to the test sample. After a suitable incubation, the plate is washed and the protein is detected or measured with a primary antibody that specifically recognizes the protein. For detection or measurement, in the case of a radioisotope, detection or measurement is performed by liquid scintillation. In the case of an enzyme, the substrate is added, and the enzymatic change of the substrate, for example, color development is detected or measured by an absorptiometer. For fluorescent substances, detect or measure with a fluorometer. By comparing these results with the values obtained for the control group, the test sample containing the inhibitor can be determined.
本発明の免疫化学的測定方法において、 被験試料中の可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体を検出又は測定する手段と して 、 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体を特異的に認識す る一次抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体を用いること ができる。  In the immunochemical measurement method of the present invention, the soluble HM1.24 antigen protein or the anti-HM1.24 antibody in the test sample is detected or measured by using a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody. A primary antibody that specifically recognizes and a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody can be used.
例えば、 前述の免疫化学的測定方法において、 可溶性 HM1. 24抗原 タンパク質又は抗 HM1. 24抗体に被験試料を接触させ、 インキュベー ト した後、 洗浄して結合しているタンパク質をそのタンパク質を特 異的に認識する一次抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体 によ り検出又は測定する。 すなわち、 具体的には可溶性 HM1. 24抗原 タンパク質又は抗 HM1. 24抗体を支持体に固定し、 被験試料を接触さ せる。 イ ンキュベート した後、 洗浄して、 結合しているタンパク質 をそのタンパク質を特異的に認識する一次抗体及び一次抗体を特異 的に認識する二次抗体により検出又は測定すればよい。 二次抗体は 、 好ましくは標識物質により標識されている。 抗体は、 通常知られ る上述の方法によ り標識されることができる。  For example, in the above-described immunochemical measurement method, a test sample is brought into contact with a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody, incubated, and then washed to bind the bound protein to the protein. Detection or measurement is performed with a primary antibody that recognizes the primary antibody and a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody. That is, specifically, a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody is immobilized on a support, and a test sample is contacted. After the incubation, washing is performed, and the bound protein may be detected or measured with a primary antibody that specifically recognizes the protein and a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody. The secondary antibody is preferably labeled with a labeling substance. The antibody can be labeled by the above-mentioned method generally known.
具体的には、 次のようにして行う ことができる。 すなわち、 可溶 性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体を含む溶液をプレー トに 加え、 一夜放置してプレー トに固定する。 プレートに固定する際、 あらかじめ可溶性 HM1. 24抗原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体に対する 抗体をプレートに固定し、 固定された抗体に可溶性 HM1. 24抗原タン パク質又は抗 HM1. 24抗体を結合させてもよい。 プレー トを洗浄の後 、 タンパク質の非特異的な結合を防ぐため例えば BSA でブロ ッキン グする。 再び洗浄し、 被験試料をプレートに加える。 同時に被験試 料を含まない群 （陰性コン ト ロール） 及び及び Z又は既知濃度の抗 HM1. 24抗体又は可溶性 HM1. 24抗原タンパク質を加えた群 （陽性コン トロール） を置き、 これらをインキュベートする。 Specifically, it can be performed as follows. That is, a solution containing a soluble HM1.24 antigen protein or an anti-HM1.24 antibody was plated. In addition, leave overnight to fix to the plate. When immobilizing on a plate, an antibody against soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody is immobilized on the plate in advance, and the immobilized antibody is allowed to bind to soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody. Is also good. After washing the plate, it is blocked with, for example, BSA to prevent non-specific binding of the protein. Wash again and add the test sample to the plate. At the same time, place a group containing no test sample (negative control) and a group to which Z or a known concentration of anti-HM1.24 antibody or soluble HM1.24 antigen protein has been added (positive control), and incubate them.
イ ンキュベー トの後、 洗浄し被験試料に含まれる抗 HM1. 24抗体又 は可溶性 HM1. 24抗原タンパク質に対する一次抗体を加える。 適度な イ ンキュベーショ ンの後、 プレートを洗浄し、 次いで一次抗体を特 異的に認識する二次抗体を加える。 適度なイ ンキュベーショ ンの後 、 洗浄して、 その被験試料中に含まれるタンパク質を特異的に認識 する一次抗体を特異的に認識する二次抗体によ りタンパク質を検出 又は測定する。 検出又は測定には、 放射性同位元素の場合液体シン チレーシヨ ンによ り検出又は測定する。 酵素の場合その基質を加え 、 基質の酵素的変化、 例えば発色を吸光度計により検出又は測定す る。 蛍光物質の場合蛍光光度計によ り検出又は測定する。  After the incubation, wash and add the primary antibody against the anti-HM1.24 antibody or soluble HM1.24 antigen protein contained in the test sample. After moderate incubation, wash the plate and then add a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody. After an appropriate incubation, washing is performed, and the protein is detected or measured by a secondary antibody that specifically recognizes a primary antibody that specifically recognizes a protein contained in the test sample. For detection or measurement, in the case of a radioisotope, use a liquid scintillation to detect or measure. In the case of an enzyme, its substrate is added, and the enzymatic change of the substrate, for example, color development is detected or measured by an absorptiometer. In the case of a fluorescent substance, it is detected or measured by a fluorometer.
これらの結果を、 コント ロール群で得られた数値を比較すれば阻 害物質を含む被験試料を決定することができる。 可溶性 HM1. 24抗原 タンパク質は、 他のペプチド又はポリペプチドと融合していてもよ い。 したがって、 被験試料中に含まれる可溶性 HM1. 24抗原タンパク 質を検出するための一時抗体と して抗 HM1. 24抗体を使用することが できる し、 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質と融合した他のぺプチド又 はポリペプチドに対する抗体を使用することもできる。 また、 被験 試料中に含まれる抗 HM1. 24抗体を検出するために抗 HM1. 24抗体を特 異的に認識する抗体を使用することができる。 By comparing these results with the values obtained in the control group, the test sample containing the inhibitor can be determined. The soluble HM1.24 antigen protein may be fused to another peptide or polypeptide. Therefore, an anti-HM1.24 antibody can be used as a temporary antibody for detecting the soluble HM1.24 antigen protein contained in the test sample, and other antibodies fused with the soluble HM1.24 antigen protein can be used. Antibodies to the peptide or polypeptide can also be used. In addition, in order to detect the anti-HM1.24 antibody contained in the test sample, the anti-HM1.24 antibody was specifically identified. Differentially recognizing antibodies can be used.
抗 HM1. 24抗体がマウス抗体である場合、 抗 HM1. 24抗体を特異的に 認識する一次抗体として抗マウスィムノグロプリ ン抗体を使用する ことができる。 また、 抗匪 1. 24抗体がキメ ラ抗体又はヒ ト型化抗体 である場合、 抗 HM1. 24抗体を特異的に認識する一次抗体として抗ヒ トイムノグロプリ ン抗体を使用することができる。 また、 二次抗体 と して、 一次抗体を特異的に認識する抗体を適宜選択することがで きる。 例えば、 一次抗体がヒッジ抗体である場合、 抗ヒッジィムノ グロプリ ン抗体を使用することができる。 また、 一次抗体がゥサギ 抗体である場合、 抗ゥサギィムノグロプリ ン抗体を使用することが できる。  When the anti-HM1.24 antibody is a mouse antibody, an anti-mouse immunoglobulin antibody can be used as a primary antibody that specifically recognizes the anti-HM1.24 antibody. When the anti-band 1.24 antibody is a chimera antibody or a humanized antibody, an anti-immunoglobulin antibody can be used as a primary antibody that specifically recognizes the anti-HM1.24 antibody. In addition, an antibody that specifically recognizes the primary antibody can be appropriately selected as the secondary antibody. For example, if the primary antibody is a hidge antibody, an anti-hidgymno glopurin antibody can be used. In addition, when the primary antibody is a rabbit antibody, an anti-rabbit antibody can be used.
よ り詳しく は、 本発明は特に好ましくは ELI SA (Enzyme-l inked Immunosorbent Assay ) によ り次のよ うにして行う こと力 Sできる。 すなわち、 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質と融合された HA (インフル ェンザ凝集素） に対する抗体を固相化バッファー （0. 1 M NaHC03 、 0. 02% NaN3 、 pH9. 6 ) によ り希釈する。 96穴のィムノプレー ト ( Nunc製） の各穴に希釈したこの水溶液を適量加え、 4 °Cでー晚ィ ンキュペー ト して固相化する。 More specifically, the present invention is particularly preferably carried out using ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) as follows. That is, soluble HM1. 24 antigen protein and fused HA antibody immobilized buffer against (Flu Enza agglutinin) (0. 1 M NaHC0 3, 0. 02% NaN 3, pH9. 6) Ri is diluted by the . An appropriate amount of the diluted aqueous solution is added to each well of a 96-well imnoplate (manufactured by Nunc), and the mixture is immobilized at 4 ° C to solidify.
洗浄バッファー （PBS に 0, 05% Tween20 となるよう調製したもの ) で 3 回各穴を洗浄後、 PBSに溶解した 5% BSA ( S IGMA 製） 溶液 20 0 β 1 を加え、 室温で 2 時間ブロ ッキングする。 After washing 3 times each well with wash buffer (PBS to 0, 05% Tween20 become as those prepared), (manufactured by S IgM a) 5% BSA in PBS solution 20 0 beta 1 was added, at room temperature for 2 hours Blocking.
次に洗浄バッファーで 3 回各穴を洗浄し、 希釈バッファー （1% Β SA、 0. 5% Tween20、 PBS ) で希釈した HAと融合した可溶性 HM1. 24抗 原タンパク質を加え 4 °Cで一晩インキュベー トして抗 HA抗体と HAと 融合した可溶性 HM1. 24抗原タンパク質を結合させる。 洗浄パッファ 一で 3回洗浄した後、 ヒ ト I gG 抗体定常領域 （C 領域） を有するキ メラ抗 HM1. 24抗体を含む被験試料を一定量加え、 室温で 1時間ィン キュベー 卜する。 Next, wash each well three times with washing buffer, add soluble HM1.24 antigen protein fused with HA diluted in dilution buffer (1% ΒSA, 0.5% Tween20, PBS) and add at 4 ° C. Incubate overnight to bind anti-HA antibody and soluble HM1.24 antigen protein fused with HA. After washing three times with a washing buffer, a certain amount of a test sample containing a chimeric anti-HM1.24 antibody having a human IgG antibody constant region (C region) is added, and incubated at room temperature for 1 hour. Cuvette.
洗浄バッファーで各穴を 3 回洗浄し、 希釈バッファーで 5000倍に 希釈したアルカ リ フォスファターゼ標識ャギ抗ヒ ト I gG 抗体 （IB I 製） を 100 μ 1各穴に加え、 室温で 1時間インキュベートする。 洗 浄パッファーで 5 回各穴を洗浄し、 発色溶液 （基質パッファー ； 50 mM NaHC03 、 10mM MgCl2 、 pH9. 8 に 1 mg/mlの濃度に溶解した Sigma 104 ) を 100 μ 1各穴に加え、 室温で反応させた後に 405 η m での吸光度をマイク ロプレー ト リーダー （Model3550 、 B I O- RAD 製） を用いて測定する。 これらの結果を陰性コン ト ロール群及びノ 又は陽性コントロール群で得られた数値を比較することにより、 キ メラ抗 HM1. 24抗体を検出又は測定することができる。 また、 同様の 方法によ り、 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質を検出又は測定すること も可能である。 Each well is washed three times with wash buffer, 5000-fold alkaline phosphatase diluted labeled catcher formic anti human I g G antibody (manufactured by IB I) 100 mu 1 was added to each well at a dilution buffer, for 1 hour at room temperature Incubate. Each well is washed five times with wash puffer developing solution; the (substrate puffer. 50 mM NaHC0 3, 10mM MgCl 2, pH9 8 to Sigma 104 dissolved in a concentration of 1 mg / ml) 100 μ 1 to each well In addition, after reacting at room temperature, the absorbance at 405 ηm is measured using a microplate reader (Model 3550, manufactured by BIO-RAD). The chimeric anti-HM1.24 antibody can be detected or measured by comparing these results with the values obtained in the negative control group and the no control group or the positive control group. In addition, a soluble HM1.24 antigen protein can be detected or measured by the same method.
本発明のスク ジ一二ング方法は、 High Throughput Screening ( HTS ) にも使用することができる。 具体的には、 ブロ ッキングまで を手作業で行い、 その後の反応は口ポッ トによつて行う ことでォー 卜メーシヨ ンィ匕し、 High Throughput screening を実現すること力 s できる。 The screening method of the present invention can also be used for High Throughput Screening (HTS). Specifically, carried out until Bro Kkingu manually, subsequent reaction is O over Bok Meshiyo Ni spoon by made by a mouth pots, it can be force s to achieve a High Throughput screening.
すなわち、 HAに対する抗体を固相化バッファー （0. 1M NaHC03 、 0. 02 % NaN3 、 pH9. 6 ) によ り希釈する。 96穴のィムノプレー ト （ Nunc製） の各穴に希釈したこの水溶液を適量加え 4 °Cで一晚イ ンキ ュベート して固相化する。 That is, the antibody-immobilized buffer against HA (0. 1M NaHC0 3, 0. 02% NaN 3, pH9. 6) Ri is diluted by the. An appropriate amount of the diluted aqueous solution is added to each well of a 96-well immunoplate (manufactured by Nunc), and the mixture is incubated at 4 ° C for solid phase immobilization.
洗浄バッファー （PBS に 0. 05% Twe en20 となるよう調製したもの ) で 3 回各穴を洗浄後、 PBSに溶解した 5% BSA ( S I GMA 製） 溶液 20 0 μ 1 を加え、 室温で 2 時間ブロ ッキングする。 次に洗浄バッファ 一で 3 回各穴を洗浄し、 希釈バッファー （1% BSi、 0. 5% Tween20、 PBS ) で希釈した HAと融合した可溶性 HMl. 24抗原タンパク質を加え 4 °Cで一晩イ ンキュベー トして抗 HA抗体と HAと融合した可溶性 HM1. 24抗原タンパク質を結合させる。 After washing each well three times with a washing buffer (prepared with 0.05% Tween20 in PBS), add 200 μl of 5% BSA (manufactured by SI GMA) in PBS and add 2 μl at room temperature. Time blocking. Next, wash each well three times with washing buffer, and add soluble HMl.24 antigen protein fused with HA diluted with dilution buffer (1% BSi, 0.5% Tween20, PBS). Incubate overnight at 4 ° C to bind the anti-HA antibody and soluble HM1.24 antigen protein fused with HA.
次レヽで、 ィ列え iiB iomek2000 HTS syst em (Beckman 製） ίここのィム ノプレートをセッ ト して、 キメラ抗 HM1. 24抗体を含む被験試料、 キ メラ抗 HM1. 24抗体に対する一次抗体及び一次抗体に対する二次抗体 を添加するよ うにシステムのコント ロールプログラムを実行する。  In the next step, iiB iomek2000 HTS system (manufactured by Beckman) ί Set the immunoplate here, and test sample containing chimeric anti-HM1.24 antibody, primary antibody against chimeric anti-HM1.24 antibody And run the system control program to add a secondary antibody to the primary antibody.
この際、 分注機としては Bi omek 2000 分注機（Beckman製） あるい は Mul t ipiPet t e96穴同時分注器（Sagian 製） を用いることでィムノ プレー ト各穴への溶液の分注や溶液の除去を行う ことができる。 ま た、 ィムノプレー トの各穴の洗浄には EL404 マイクロプレートゥォ ッシヤー（Bi o Tek社） を用いることができる。 また、 吸光度の測定 には SPECTRAmax250 プレート リーダー（Mo l ecular Devi ces製） を用 いることができる。 In this case, the dispenser as the Bi omek 2000 dispensing machine (manufactured by Beckman) there have the Mul t ipi P et t e96 Penetration dispenser of the solution Imuno plates to each well by using the (Sagian Ltd.) Dispensing and solution removal can be performed. In addition, EL404 microplate washers (BioTek) can be used to clean each hole in the im- noplate. A SPECTRAmax250 plate reader (Molecular Devices) can be used to measure the absorbance.
プログラムは以下の操作を行うよう設定する。 すなわち洗浄パッ ファーで 3 回各穴を洗浄し、 被験試料と希釈バッファー （1% BSA、 0. 5% Tween20, PBS ) で希釈したキメラ抗 HM1. 24抗体を含む被験試 料を一定量加える。 同時に被験試料を含まない群 （陰性コン トロー ル） 及び既知濃度のキメ ラ抗 HM1. 24抗体を加えた群 （陽性コン ト口 ール） を置き、 これらを室温で 1時間インキュベー トする。 洗浄パ ッファーで各穴を 3 回洗浄し、 希釈バッファーで 5000倍に希釈した ゥサギ抗ヒ ト I gG 抗血清 （New England Bio labs 製） を 100 μ 1各 穴に加え、 室温で 1時間インキュベートする。 洗浄バッファーで各 穴を 3 回洗浄し、 希釈パッファーで 5000 倍に希釈したアル力 リ フ ォスファターゼ標識ャギ抗ゥサギ I gG 抗体 （TAG0製） を 100 μ 1各 穴に加え、 室温で 1時間インキュベー トする。  The program is set to perform the following operations. That is, wash each well three times with a washing buffer, and add a fixed amount of the test sample and the test sample containing the chimeric anti-HM1.24 antibody diluted with dilution buffer (1% BSA, 0.5% Tween20, PBS). At the same time, place a group containing no test sample (negative control) and a group to which a known concentration of chimera anti-HM1.24 antibody was added (positive control), and incubate them at room temperature for 1 hour. Wash each well three times with wash buffer, add 100 µl of egret anti-human IgG antiserum (New England Biolabs) diluted 5000 times with dilution buffer to each well and incubate at room temperature for 1 hour . Wash each well three times with the washing buffer, add 100 μl of an alga phosphatase-labeled goat anti-money IgG antibody (manufactured by TAG0) diluted 5,000-fold with a dilution buffer to each well, and incubate for 1 hour at room temperature. To
洗浄バッファーで 5 回各穴を洗浄し、 発色溶液 （基質バッファー ； 50 mM NaHC03 、 10 mM MgCl2 、 pH9. 8 に lmg/ml の濃度 こ溶角军 した p-ニト ロフエニルフォスフェー ト （S i gma 製） ） を ΙΟΟ μ Ι各 穴に加え、 室温で反応させた後に 405 nm での吸光度をマイクロプ レー 卜 ジ一グー、 B i omekプレー 卜 ])一ター ( Be ckman / Mo l e cular D evi c e s製） を用いて測定する。 これらの結果をコン ト ロール群で得 られた数値と比較することによ り、 被験試料に含まれているキメ ラ 抗 HM1. 24抗体を検出又は測定することができる。 また、 同様の方法 によ り、 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質を検出又は測定することも可 能である。 Each well is washed five times with washing buffer, color development solution (substrate buffer;. 50 mM NaHC0 3, 10 mM MgCl 2, pH9 of 8 to lmg / ml concentration this溶角Army P-Nitrophenyl phosphate (manufactured by Sigma)) was added to each well, and allowed to react at room temperature. Then, the absorbance at 405 nm was measured using a microplate plate, Biomek plate. ) Measurement is carried out using a probe (manufactured by Beckman / Molecular Devices). By comparing these results with the values obtained for the control group, the chimeric anti-HM1.24 antibody contained in the test sample can be detected or measured. In addition, a soluble HM1.24 antigen protein can be detected or measured by the same method.
• 本発明によ り提供される免疫化学的測定方法は、 可溶性 HM1. 24抗 原タンパク質又は抗 HM1. 24抗体を 500pg/mlの濃度まで測定すること が可能である。  • The immunochemical assay method provided by the present invention can measure soluble HM1.24 antigen protein or anti-HM1.24 antibody up to a concentration of 500 pg / ml.
本発明に使用される抗体は、 市販の抗体や市販のキッ トに含まれ る抗体を用いることもできるし、 公知の手段を用いてモノクローナ ル抗体又はポリ クローナル抗体と して得ることができる。  The antibody used in the present invention may be a commercially available antibody or an antibody contained in a commercially available kit, or may be obtained as a monoclonal antibody or a polyclonal antibody using known means. .
モノ クローナル抗体は、 所望の感作抗原を使用して、 これを通常 の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融 合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスク リーニング法に よ り、 モノ ク ローナル抗体産生細胞をスク リーニングすることによ つて作製できる。  The monoclonal antibody is immunized with a desired sensitizing antigen using a conventional immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. Thus, it can be produced by screening the monoclonal antibody-producing cells.
具体的には、 モノク ローナル抗体又はポリ ク ローナル抗体を作製 するには次のようにすればよい。  Specifically, a monoclonal or polyclonal antibody may be prepared as follows.
例えば、 抗体取得の感作抗原は、 その由来となる動物種に制限さ れないが、 実際に本発明で使用するペプチド又はポリペプチドの由 来となる哺乳動物、 例えばヒ ト、 マウス又はラッ ト由来のものが好 ましい。 これらのうち、 特にヒ ト由来の感作抗原が好ましい。 例え ば、 ヒ ト可溶性 HM1. 24抗原タンパク質を感作抗原と して使用する場 合、 それらの塩基配列及びァミノ酸配列は本明細書に開示される遺 伝子配列を用いて得ることができる。 また、 可溶性讓 1. 24抗原タン パク質との融合に付される他のペプチドやポリべプチ ドを感作抗原 として用いる場合、 それらのペプチ ドやポリペプチドを化学的に合 成するか、 遺伝子工学的手法により得ることができる。 For example, the sensitizing antigen from which the antibody is obtained is not limited to the animal species from which it is derived, but the mammal, eg, human, mouse or rat, from which the peptide or polypeptide used in the present invention actually originates. Origins are preferred. Of these, human-derived sensitizing antigens are particularly preferred. For example, when a human soluble HM1.24 antigen protein is used as a sensitizing antigen, its nucleotide sequence and amino acid sequence are as disclosed in this specification. It can be obtained using gene sequences. When other peptides or polypeptides to be fused with the soluble protein 1.24 antigen protein are used as the sensitizing antigen, those peptides or polypeptides may be chemically synthesized, It can be obtained by genetic engineering techniques.
感作抗原として使用されるタンパク質、 ペプチド又はポリべプチ ドは、 その全長を使用してもよいし、 またその断片も用いることが できる。 断片と しては、 例えば C 末端断片や N 末端断片が挙げられ る。 あるいは、 感作抗原として使用されるタンパク質、 ペプチド又 はポリべプチドを発現する細胞を感作抗原として使用することもで きる。  As the protein, peptide or polypeptide used as a sensitizing antigen, its full length may be used, or a fragment thereof may also be used. Examples of the fragment include a C-terminal fragment and an N-terminal fragment. Alternatively, cells expressing a protein, peptide or polypeptide used as a sensitizing antigen can be used as the sensitizing antigen.
感作抗原で免疫される哺乳動物と しては、 特に限定されるもので はないが、 細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択す るのが好ましく、 一般的にはげつ歯目、 ゥサギ目、 霊長目の動物が 使用される。  The mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Teeth, magpies, and primates are used.
げっ歯目の動物と しては、 例えば、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター 等が使用される。 ゥサギ目の動物と しては、 例えば、 ゥサギが使用 される。 霊長目の動物と しては、 例えばサルが使用される。 サルと しては、 狭鼻下目のサル （旧世界ザル） 、 例えば、 力二クイザル、 ァカゲザル、 マントヒヒ、 チンパンジー等が使用される。  As rodent animals, for example, mice, rats, hamsters and the like are used.動物 Egrets are used as egrets. For example, monkeys are used as primates. As monkeys, monkeys of the lower nose (old world monkeys), for example, cynomolgus monkeys, macaques, baboons, and chimpanzees are used.
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われ る。 例えば、 一般的方法と して、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は 、 皮下に注射することによ り行われる。 具体的には、 感作抗原を P B S ( Phosphat e- Buffe red Sal ine ) や生理食塩水等で適当量に希釈 、 懸濁したものを所望により通常のアジュバント、 例えば、 フロイ ント完全アジュパントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4〜 2 1 日毎に数回投与するのが好ましい。 また、 感作抗原免疫時に適当な 担体を使用することができる。 このように免疫し、 血清中に所望の 抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。 Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method. For example, as a general method, the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal. Specifically, the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphat e-Buffe red Saline), physiological saline, or the like, and the suspension is mixed with an ordinary adjuvant, for example, an appropriate amount of Freund's complete adjuvant, if desired. After emulsification, it is preferably administered to a mammal several times every 4 to 21 days. In addition, a suitable carrier can be used during immunization of the sensitizing antigen. Immunize in this way and have the desired An increase in the antibody level is confirmed by a conventional method.
ここで、 ポリ クローナル抗体を得るには、 血清中の所望の抗体レ ベルが上昇したことを確認した後、 抗原を感作した哺乳動物の血液 を取り出す。 この血液から公知の方法によ り血清を分離する。 ポリ クローナル抗体と してポリ クローナル抗体を含む血清を使用しても よいし、 必要に応じこの血清からポリ クローナル抗体を含む画分を さらに単離してもよい。  Here, in order to obtain a polyclonal antibody, after confirming that the desired antibody level in the serum has increased, the blood of the mammal sensitized with the antigen is taken out. The serum is separated from the blood by a known method. A serum containing the polyclonal antibody may be used as the polyclonal antibody, and if necessary, a fraction containing the polyclonal antibody may be further isolated from the serum.
モノクローナル抗体を得るには、 上記抗原を感作した哺乳動物の 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物 から免疫細胞を取り出し、 細胞融合に付せばよい。 この際、 細胞融 合に使用される好ましい免疫細胞と して、 特に脾細胞が挙げられる 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と しての哺乳動物のミエ ローマ細胞と しては、 既に公知の種々の細胞株、 例えば、 P3 (P3x6 3Ag8.653) (Kearney, J. F. et al. , J. Immunol. (1979) 123, 154 8-1550) 、 P3x63Ag8. Ul (Yelton, D. E. et al.， Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81， 1-7)、 NS - 1 (Kohler ， G. and Milstein, C. , Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC - 11 (Margulies, D. H. et al. , Cell (1976) 8, 405 - 415)、 SP 2/0 (Shulman, M. et al.， Nature (1978) 276, 269-270)、 F0 (de St. Groth, S. F. and Scheidegger , D. , J. Immunol. Methods ( 1980) 35， 1-21) 、 S194 (Trowbridge, I. S. , J. Exp. Med. (197 8) 148， 313-323)、 R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277 ， 131-133)等が好適に使用される。  To obtain a monoclonal antibody, after confirming that the level of the desired antibody is increased in the serum of a mammal sensitized with the antigen, immune cells may be removed from the mammal and subjected to cell fusion. In this case, preferred immune cells used for cell fusion include splenocytes, in particular. Mammalian myeloma cells as the other parent cells to be fused with the immune cells have already been described. Various known cell lines, for example, P3 (P3x63Ag8.653) (Kearney, JF et al., J. Immunol. (1979) 123, 154 8-1550), P3x63Ag8. Ul (Yelton, DE et al., Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 ( Margulies, DH et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP 2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), F0 (de St. Groth, SF) and Scheidegger, D., J. Immunol.Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, IS, J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) and the like are preferably used.
前記免疫細胞と ミエ口一マ細胞の細胞融合は基本的には公知の方 法、 例えば、 ミルスティ ンらの方法（Galfre, G. and Milstein, に ， Methods Enzymol. (1981) 73， 3-46) 等に準じて行うことができ る。 The cell fusion of the immune cells and myeoma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Milstein et al. (Galfre, G. and Milstein, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46. ) Etc. You.
よ り具体的には、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在 下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤としては例えば More specifically, the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture in the presence of a cell fusion promoter. As a fusion promoter, for example,
、 ポリエチレングリ コール （PEG ) 、 センダイ ウィルス （HVJ ) 等 が使用され、 更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスル ホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。 Polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like can be used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added to increase the fusion efficiency.
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミエローマ 細胞に対して免疫細胞を 1 〜 1 0倍とするのが好ましい。 前記細胞 融合に用いる培養液と しては、 例えば、 前記ミエローマ細胞株の增 殖に好適な RPMI 1640培養液、 MEM 培養液、 その他、 この種の細胞培 養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さらに、 牛胎児血 清 （FCS ) 等の血清補液を併用することもできる。  The ratio of the use of the immune cells to the myeloma cells is preferably, for example, 1 to 10 times the number of the immune cells to the myeloma cells. As the culture medium used for the cell fusion, for example, an RPMI 1640 culture medium, a MEM culture medium suitable for the culture of the myeloma cell line, and other ordinary culture mediums used for cell culture of this type are used. It is possible, and serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
細胞融合は、 前記免疫細胞と ミエローマ細胞との所定量を前記培 養液中でよく混合し、 予め、 37°C程度に加温した PEG 溶液、 例えば 、 平均分子量 1000〜6000程度の PEG 溶液を通常、 30〜& 0% ( w/v ) の濃度で添加し、 混合するこ とによって目的とする融合細胞 （ハイ プリ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによ りハイプリ ドーマ の生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。  In the cell fusion, a predetermined amount of the immune cell and the myeloma cell are mixed well in the culture medium, and a PEG solution previously heated to about 37 ° C., for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is prepared. Usually, the desired fused cells (hybridoma) are formed by adding and mixing at a concentration of 30 to & 0% (w / v). Subsequently, by repeatedly adding an appropriate culture solution and centrifuging to remove the supernatant, a cell fusion agent or the like unfavorable for the growth of the hybridoma can be removed.
当該ハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば HAT 培養液 （ ヒポキサンチン、 アミノプテリ ン及びチミジンを含む培養液） で培 養することによ り選択される。 当該 HAT 培養液での培養は、 目的と するハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分 な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界希釈法を 実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスク リーニン グ及びクローニングが行われる。  The hybridoma is selected by culturing it in a normal selective culture medium, for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). The culture in the HAT culture solution is continued for a time sufficient for the death of cells other than the target hybridoma (non-fused cells), usually several days to several weeks. Next, screening and cloning of hybridomas producing the desired antibody are performed by the usual limiting dilution method.
また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得 る他に、 ヒ ト リ ンパ球、 例えば EBウィルスに感染したヒ ト リ ンパ球 を in vi t roでぺプチド又はポリぺプチドやそれらの発現細胞又はそ の溶解物で感作し、 感作リ ンパ球をヒ ト由来の永久分裂能を有する ミエローマ細胞、 例えば U266と融合させ、 ペプチド又はポリべプチ ドへの結合活性を有する所望のヒ ト抗体を産生するハイプリ ドーマ を得ることもできる （特開昭 63-17688) 。 In addition, animals other than humans are immunized with the antigen to obtain the above hybridomas. In addition, human lymphocytes, such as those infected with Epstein-Barr virus, are sensitized in vitro with peptides or polypeptides, their expressing cells or their lysates, and sensitized. It is also possible to fuse a lymphocyte with a myeloma cell having permanent division ability derived from human, for example, U266, to obtain a hybridoma producing a desired human antibody having a peptide or polypeptide binding activity ( JP-A-63-17688).
さらに、 ヒ ト抗体遺伝子のレパート リ一を有する トランスジェニ ック動物に抗原となるペプチド又はポリペプチド、 それらの発現細 胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、 これをミエ口 一マ細胞と融合させたハイプリ ドーマを用いて本発明に使用される ペプチド又はポリペプチドに対するヒ ト抗体を取得してもよい （国 際特許出願公開番号應2 - 03918、 W093-2227 、 簡 4 - 02602、 W094-2 5585、 画 6 - 33735及び画 6 - 34096参照;） 。  Furthermore, a transgenic animal having a human antibody gene repertoire is immunized with a peptide or polypeptide serving as an antigen, an expression cell thereof, or a lysate thereof to obtain antibody-producing cells. A human antibody to the peptide or polypeptide used in the present invention may be obtained using a hybridoma fused to a single cell (see International Patent Application Publication Nos. 2-03918, W093-2227, and simplified version 4). -02602, W094-25585, Figures 6-33735 and 6-34096;).
このようにして作製されるモノ ク ローナル抗体を産生するハイプ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養することが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存することが可能である。  The hybridomas producing monoclonal antibodies produced in this way can be subcultured in ordinary culture medium and can be stored for a long time in liquid nitrogen. .
当該ハイブリ ドーマからモノ ク ローナル抗体を取得するには、 当 該ハイプリ ドーマを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に移植して増殖させ、 その腹水として得る方法などが採用され る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。  To obtain a monoclonal antibody from the hybridoma, a method of culturing the hybridoma according to a usual method and obtaining a culture supernatant thereof, or transferring the hybridoma to a mammal compatible therewith A method of transplanting, growing, and obtaining ascites is used. The former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
ハイプリ ドーマを用いて抗体を産生する以外に、 抗体を産生する 感作リ ンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子 （onc ogene ) により不死化さ せた細胞を用いてもよい。  In addition to producing antibodies using hybridomas, cells in which immune cells such as sensitized lymphocytes that produce antibodies are immortalized with oncogenes may be used.
このように得られたモノクローナル抗体はまた、 遺伝子組換え技 術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる。 例え ば、 組換え型抗体は、 抗体遺伝子をハイプリ ドーマ又は抗体を産生 する感作リ ンパ球等の免疫細胞からクローニングし、 適当なベタタ 一に組み込んで、 これを宿主に導入し産生させる。 本発明には、 こ の組換え型抗体を用いるこ とができる （例えば、 Borrebaeck, C. A . K. and Larrick, J. W.， THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照） 。 The thus obtained monoclonal antibody can also be obtained as a recombinant antibody produced using a gene recombination technique. example For example, a recombinant antibody is produced by cloning an antibody gene from an immune cell such as a hybridoma or a sensitized lymphocyte producing the antibody, incorporating the clone into an appropriate solid, introducing the clone into a host, and producing the recombinant antibody. In the present invention, the recombinant antibody can be used (see, for example, Borrebaeck, CA K. and Larrick, JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). .
本発明で使用される抗体は、 所望の結合活性を有するかぎり、 そ の抗体断片や抗体修飾物であってよい。 例えば、 抗体断片としては 、 Fab 、 F(ab' )2、 Fv又は H鎖と L鎖の Fvを適当なリ ンカ一で連結 させたシングルチヱイ ン Fv (scFv) が挙げられる。 具体的には、 抗 体を酵素、 例えば、 パパイ ン、 ペプシンで処理し抗体断片を生成さ せるか、 又は、 これら抗体断片をコー ドする遺伝子を構築し、 これ を発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例え ば、 Co, M. S. et al. , J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ； Be tter , M. and Horwitz, A. H.， Methods Enzymol. (1989) 178， 47 6-496 ； Pluckthun, A. and Skerra, A.， Methods Enzymol. (1989 ) 178, 497-515 ； Lamoyi, E.， Methods Enzymol. (1986) 121, 65 2-663 ； Rousseau , J. et al. , Methods Enzymol. ( 1986) 121 , 6 63-669 ； Bird, R. E. and Walker, B. W. , Trends Biotechnol. ( 1991) 9， 132- 137参照） 。 本発明には、 公知の技術によ り作製され るキメラ抗体又はヒ ト型化抗体を使用することができる。  The antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified antibody as long as it has a desired binding activity. For example, examples of the antibody fragment include Fab, F (ab ') 2, Fv, or a single chain Fv (scFv) in which an Fv of an H chain and an L chain are linked by an appropriate linker. Specifically, an antibody is treated with an enzyme, for example, papine or pepsin, to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed, and the gene is introduced into an expression vector. Expression in a suitable host cell (eg, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, AH, Methods Enzymol. (1989) 178, 47 6-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 65 2-663; Rousseau, J. et al. , Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, RE and Walker, BW, Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137). In the present invention, a chimeric antibody or a humanized antibody produced by a known technique can be used.
また、 本発明の免疫化学的測定方法によ り検出又は測定される抗 体は、 上述の抗体、 例えばハイプリ ドーマに産生される抗体、 組換 え型抗体、 キメ ラ抗体及びヒ ト型化抗体のいずれでもよい。  The antibodies detected or measured by the immunochemical measurement method of the present invention include the above-mentioned antibodies, for example, antibodies produced by hybridomas, recombinant antibodies, chimeric antibodies, and humanized antibodies. Either may be used.
前記のよ うに発現、 産生された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離 し均一にまで精製することができる。 本発明で使用される抗体の分 離、 精製は通常のタンパク質で使用されている分離、 精製方法を使 用すればよく 、 何ら限定されるものではない。 The antibody expressed and produced as described above can be separated from the host inside and outside the cell and from the host and purified to homogeneity. The amount of the antibody used in the present invention Separation and purification may be performed by using the separation and purification methods used in ordinary proteins, and are not limited at all.
例えば、 ァフィ二ティーク ロマ トグラフィ一等のク ロマ トグラフ ィーカラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDS ポリ アク リ ルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動等を適宜選択、 組み合わせ れば、 抗体を分離、 精製するこ とができる（Antibodies ： A Labora tory Manual. Ed Harlow and David Lane , Cold spring Harbor La boratory, 1988) 。  For example, if appropriate selection and combination of chromatographic columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. Can be separated and purified (Antibodies: A Labora tory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold spring Harbor La boratory, 1988).
ァフィ二ティーク ロマ トグラフィーに用いるカラムと しては、 プ 口ティ ン Aカラム、 プロテイ ン Gカラムが挙げられる。 例えば、 プ ロティ ン Aカラムを用いたカラムと して、 Hyper D, POROS, Sephar ose F. F. (Pharmacia) 等が挙げられる。  Columns used for affinity chromatography include a protein tin A column and a protein G column. For example, columns using Protein A column include Hyper D, POROS, Separose FF (Pharmacia), and the like.
ァフィ二ティーク ロマ トグラフィー以外のク ロマ トグラフィ一と しては、 例えば、 イオン交換ク ロマ トグラフィー、 疎水性ク ロマ ト グラフィー、 ゲル濾過、 逆相ク ロマ トグラフィー、 吸着ク ロマ トグ ラフィ一等力 S挙げられる（Strategies for Protein Purification a nd Character izat ion ： A Laboratory Course Manual. Ed Daniel . Mar shak et al.， Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1996 ) 。 これらのク ロマ トグラフィーは HPLC、 FPLC等の液相ク ロマ トグ ラフィーを用いて行う こ とができる。  Chromatography other than affinity chromatography includes, for example, ion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reversed-phase chromatography, and adsorption chromatography. Power S (Strategies for Protein Purification and Character Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatographies can be performed using liquid chromatography such as HPLC and FPLC.
上記で得られた抗体の濃度測定又は活性確認は、 公知の方法、 例 えば ELISA 、 EIA (酵素免疫測定法） 、 RIA (放射免疫測定法） あ るいは蛍光抗体法を用いるこ とができる。  For the concentration measurement or activity confirmation of the antibody obtained above, known methods, for example, ELISA, EIA (enzyme immunoassay), RIA (radioimmunoassay) or fluorescent antibody method can be used.
抗 HM1.24抗体を産生するハイプリ ドーマ HM1.24は、 工業技術院生 命工学工業研究所 （茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 7 (1995)年 9 月 14日に FERM BP-5233と してプタぺス ト条約に基づき国 際寄託された。 本発明の別の態様は、 被験試料中に含まれる抗 HM1. 24抗体の抗原 結合活性を測定し、 これをもつて抗 HM1. 24抗体の品質を管理する方 法である。 抗体を有効成分として含有する医薬品においては、 単に 、 抗体の量のみならず、 抗体の生物活性が適切に保持されているこ とが重要である。 抗体の生物活性は多くの場合、 抗原との結合活性 であり、 抗原との結合活性を保持する抗体が、 医薬組成物中におい てどの程度であるかを確認することは、 高体を有効成分として含有 する医薬品の品質管理と して必須である。 本発明の方法は、 抗匪 1. 24抗体を有効成分と して含有する医薬品の品質を適切に管理する方 法、 及び品質を適切に管理された抗 HM1. 24抗体、 ならびに抗 HM1. 24 抗体を有効成分と して含有する医薬組成物を提供する。 Hypri-Doma HM1.24, which produces anti-HM1.24 antibody, was submitted to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (FERM) on September 14, 1995. Deposited internationally as BP-5233 under the Pastoral Treaty. Another embodiment of the present invention is a method of measuring the antigen-binding activity of an anti-HM1.24 antibody contained in a test sample and controlling the quality of the anti-HM1.24 antibody using the same. In a drug containing an antibody as an active ingredient, it is important that not only the amount of the antibody but also the biological activity of the antibody be appropriately maintained. In many cases, the biological activity of an antibody is the antigen-binding activity, and confirming the level of an antibody that retains the antigen-binding activity in a pharmaceutical composition is a matter of determining the height of the active ingredient. It is indispensable for quality control of pharmaceuticals contained as a product. The method of the present invention relates to a method for appropriately controlling the quality of a drug containing an anti-bandit 1.24 antibody as an active ingredient, and an anti-HM1.24 antibody and an anti-HM1.24 antibody whose quality is appropriately controlled. Provided is a pharmaceutical composition containing an antibody as an active ingredient.
医薬品の製造工程においては、 医薬品または医薬組成物の品質を 管理することが必要である。 従って、 適節な品質管理方法は医薬品 または医薬組成物の製造工程の一部である。 本発明の方法は、 適切 な品質管理方法を提供することによって、 抗 HM1. 24抗体の製造方法 ならびに、 抗 HM1. 24抗体を有効成分と して含有する医薬組成物の製 造方法を提供するものである。  In the manufacturing process of pharmaceuticals, it is necessary to control the quality of pharmaceuticals or pharmaceutical compositions. Thus, a good quality control method is part of the manufacturing process for a pharmaceutical or pharmaceutical composition. The method of the present invention provides a method for producing an anti-HM1.24 antibody and a method for producing a pharmaceutical composition containing an anti-HM1.24 antibody as an active ingredient by providing an appropriate quality control method. Things.
実施例 Example
以下に実施例を示して本発明をよ り詳細に説明するが、 本発明の 範囲を限定するものではない。  Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the Examples do not limit the scope of the present invention.
実施例 1 . 可溶性ヒ ト HM1. 24抗原用発現プラスミ ドの構築  Example 1. Construction of expression plasmid for soluble human HM1.24 antigen
Ec oR I (宝酒造社製） および No t l (宝酒造社製） で消化すること によ り調製した EF1 aプロモーターを含む HEF 発現ベクター （国際 特許出願公開番号 W092 - 19759) と、 I gリーダー配列と HAタグをコー ドす 遺伝ナぺァ ( Ame r sham Pharmac i a社製) を、 50 mmo l /L Tr i s - HC 1、 pH7. 6 、 10 mM MgC l2 、 10 mmo l /L ジチオスレィ トール、 1 mmo l /L ATP、 50 mg/mLのポリ エチレングリ コールおよび 10ュ二ッ ト T4 DNAリガーゼ （T0Y0B0社製） を含有する反応混合物中で、 16°C にて 3時間反応させ連結した。 HEF expression vector (International Patent Application Publication No.W092-19759) containing the EF1a promoter prepared by digestion with EcoR I (Takara Shuzo) and Notl (Takara Shuzo), and an Ig leader sequence. Coat the HA tag dos genetic Napea the (Ame r sham Pharmac ia Co.), 50 mmo l / L Tr is -. HC 1, pH7 6, 10 mM MgC l 2, 10 mmo l / L Jichiosurei torr, 1 mmol / L ATP, 50 mg / mL polyethylene glycol and 10 units In a reaction mixture containing T4 DNA ligase (manufactured by T0Y0B0), the reaction was carried out at 16 ° C. for 3 hours for ligation.
挿入した Igリーダー配列と HAタグをコ一ドする遺伝子として、 Ec oRI 、 Kpnl (宝酒造社製） および Notl制限酵素認識部位をリ ンカ一 と して接続した配列番号 1及び 2に示す合成遺伝子ペアを用いた。 次に連結反応混合物を大腸菌 DH5aのコンビテント細胞 （GIBC0-BR L 社製） に加え、 これを氷上で 30分間、 42°Cにて 1分間、 そして再 び氷上で 1分間静置した。 Synthetic gene pairs shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 in which EcoRI, Kpnl (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and Notl restriction enzyme recognition site are connected as linkers as genes encoding the inserted Ig leader sequence and HA tag. Was used. Then ligation mixture was added to E. coli DH5 a combi competent cells (manufactured by GIBC0-BR L Inc.) on ice for 30 minutes this 1 minute at 42 ° C, and allowed to stand again on ice for 1 minute.
次いで、 00 μ L の S0C 培地 (Molecular Cloning ： A Laborato ry kanua丄， Sambrook ら、 し old Spring Harbor Laboratory Press , (1989) ) を加え、 37°Cにて 1時間インキュベーショ ンした後、 5 0 μ g/mLのアンピシリ ンを含有する LB寒天培地 （Molecular Clonin g A Laboratory Manual , Sambrook b、 Cold Spring harbor Lab oratory Press, (1989) ) 上にこの大腸菌を播き 、 37°Cにて一夜ィ ンキュベー ト して大腸菌形質転換体を得た。  Then, add 00 μL of S0C medium (Molecular Cloning: A Laboratory kanua 丄, Sambrook et al., Old Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), incubate at 37 ° C for 1 hour, and then add 50 μL The E. coli was seeded on LB agar medium (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Sambrook b, Cold Spring harbor Laboratory Press, (1989)) containing g / mL ampicillin, and incubated at 37 ° C overnight. Thus, an E. coli transformant was obtained.
この大腸菌形質転換体を 50 /xg/mLのアンピシリ ンを含有する LB 培地中で 37°Cにて一夜培養し、 この培養物から、 アルカリ法 （Mole cular し loning ： A Laboratory Manual , Sambrook ら、 し old ipr in g Harbor Laboratory Press, (1989) ) に従ってプラスミ ド DNA を 調製した。  The Escherichia coli transformant was cultured overnight at 37 ° C in LB medium containing 50 / xg / mL ampicillin. From this culture, the alkaline method (Molecular loning: A Laboratory Manual, Sambrook et al.) Plasmid DNA was prepared according to the Old Ipring Harbor Laboratory Press, (1989)).
一方、 HM1.24抗原の細胞外領域の遺伝子は Thermal Cycler (Perk in Elmer Cetus社製） を用いた PCR 法により増幅した。 HM1.24抗原 の cDNA (配列番号 15) を铸型と して、 100 pmolの配列番号 3及び 4 に示したプライマー、 10 mmol/L Tris- HC1、 pH8.3 、 50 mmol/L KC 1 、 0.1 mmol/L dNTPs (dATP, dGTP， dCTP, dTTP) 、 1.5 mmol/L M gCl2および 5ュニッ トの DNA ポリ メ ラーゼ Ampli Taq (Perkin Elm er Cetus社製） を含有する混合物を最初に 94°Cにて最初の変性の後 、 94 °Cにて 1分間、 55°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間のサイクルを 30回行い、 最後に 72°Cにて 10分間ィンキュベーショ ンした。 On the other hand, the gene in the extracellular region of the HM1.24 antigen was amplified by PCR using a Thermal Cycler (Perk in Elmer Cetus). Using the cDNA of HM1.24 antigen (SEQ ID NO: 15) as type I, 100 pmol of the primers shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, 10 mmol / L Tris-HC1, pH 8.3, 50 mmol / L KC1, A mixture containing 0.1 mmol / L dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5 mmol / LM gCl 2 and 5-unit DNA polymerase Ampli Taq (Perkin Elmer Cetus) was first mixed at 94 ° C. After the first denaturation at The cycle was performed 30 times at 94 ° C for 1 minute, at 55 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1 minute, and finally, incubation was performed at 72 ° C for 10 minutes.
この PCR 産物を HM1.24抗原の細胞外領域 （配列番号 5 ) の遺伝子 と して、 Kpnlおよび BamHI 消化した上記プラスミ ド DNA と 50 mmol/ L Tris_HCl、 pH7.6 、 10 mmol/L MgCl2 、 10 mM ジチオスレィ トー ル、 1 mmol/L ATP、 50 mg/mLのポリエチレングリ コールおよび 1ュ ニッ ト T4 DNAリガーゼ （T0Y0B0社製） を含有する反応混合物中で、 16°Cにて 3時間反応させ連結した。 上記同様に、 連結反応混合物を 大腸菌 DH5o!のコンビテン ト細胞に加え、 大腸菌形質転換体を得、 これよりプラスミ ド DNA を調製した。 このプラスミ ド DNA を HAタグ 付加可溶性抗原発現プラスミ ド、 psHMと した。 This PCR product was used as the gene for the extracellular region of HM1.24 antigen (SEQ ID NO: 5), and the plasmid DNA digested with Kpnl and BamHI was combined with 50 mmol / L Tris_HCl, pH 7.6, 10 mmol / L MgCl 2 , Incubate for 3 hours at 16 ° C in a reaction mixture containing 10 mM dithiothreitol, 1 mmol / L ATP, 50 mg / mL polyethylene glycol and 1 unit T4 DNA ligase (T0Y0B0). Connected. In the same manner as described above, the ligation reaction mixture was added to E. coli DH5o! Competent cells to obtain an E. coli transformant, from which plasmid DNA was prepared. This plasmid DNA was designated as HA-tagged soluble antigen expression plasmid, psHM.
また、 配列番号 3及び 6に示したプライマーを用い、 同様にして C端も削除した HM1.24抗原の細胞外領域 （配列番号 7 ) を発-現する プラスミ ド、 psHM164 を作製した。  In addition, using the primers shown in SEQ ID NOs: 3 and 6, a plasmid psHM164 expressing the extracellular region of the HM1.24 antigen (SEQ ID NO: 7) from which the C-terminal was also deleted was prepared in the same manner.
塩基配列決定  Nucleotide sequencing
psHM及び psHM164 の塩基配列決定は自動 DNA シークェンサ一 （Ap plied Biosystem Inc.社製) およひ aq Dye terminator し ycle Seq uenc ing kit (.Applied Biosystem Inc.社 ) 用レヽて、 メーカー 指定のプロ トコールに従って行った。 配列番号 8及び 9に示したプ ライマー （サヮディーテクノ ロジ一社製） を用いた。 その結果、 可 溶性抗原に HAタグぺプチドをつないだ融合タンパク （配列番号 10及 び 11) が発現する構造になっていることを確認した。  The base sequence determination of psHM and psHM164 was performed using an automatic DNA sequencer (Applied Biosystem Inc.) and an aq Dye terminator / ycle Sequencing kit (.Applied Biosystem Inc.). Was performed according to The primers shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 (manufactured by Sadly Technology) were used. As a result, it was confirmed that the fusion protein (SEQ ID NO: 10 and 11) in which the HA tag peptide was linked to the soluble antigen was expressed.
実施例 2. 可溶性ヒ ト HM1.24抗原高発現細胞の樹立  Example 2. Establishment of cells expressing high levels of soluble human HM1.24 antigen
( 1 ) CH0 細胞への トランスフ クシヨ ン  (1) Transfusion to CH0 cells
HAタグ付加可溶性 HM1.24抗原安定産生系を樹立するために、 Pvul (GIBC0-BRL 社製） で消化して得た直鎖状にした前記発現ベクター (psHM及び psHM164)をェレク ト ロポレーシヨ ン法によ り CH0 細胞 M Bll 株 (Medical Research Council collaboration Center よ り供 与） に遺伝子導入した。 ベクター 1 を PBS (-) 中 1.1 X107 細 胞 /mL の 0.8 mL ァ リ コー トに加え、 Gene Pulser 装置 （Bio- Rad 社製） を用いて 1.5 kV、 25 MF の容量にてパルスを与えた。 In order to establish an HA-tagged soluble HM1.24 antigen stable production system, the linearized expression vectors (psHM and psHM164) obtained by digestion with Pvul (GIBC0-BRL) were prepared by the electroporation method. CH0 cell M The gene was introduced into the Bll strain (provided by the Medical Research Council collaboration Center). Vector 1 PBS (-) in addition to 0.8 mL § Li Coat of 1.1 X10 7 cells / mL, the pulse at the capacity of 1.5 kV, 25 M F using Gene Pulser apparatus (Bio- manufactured Rad) Gave.
室温にて 10分間の回復期間の後、 エレク トロポレーションされた 細胞を、 100 mLの 10% FCS (GIBC0- BRL社製） 、 1 % ペニシリ ン—ス ト レプ トマイ シン （GIBC0- BRL 社製） 含有ひ -MEM (ヌ ク レオシ ド不 含有） 選択培地 （GIBC0-BRL 社製） に懸濁し、 100 μ L/ゥエル （ 1 X104 細胞/ ゥエル） で平底 96穴プレー ト （FALCON社製） に播種し た。 37°C、 5 % C02 インキュベータ一にて一晩培養した後、 選択培 地を更に 100 μ ΐ7ゥエル加え、 セレク シ ョ ンを行った。 14日 目にサ ンドイ ッチ ELISA (細胞株の選択の項参照） によるアツセィを行い 、 HA-sHM又は HA- sHM164 を高発現する 24ク ローンを選択し、 24ゥェ ルプレートにて拡大培養 （ l mL/ ゥエル） した。 これら核酸不含培 地で選択したクローンは安定増殖を確認した後、 更にアツセィを行 い、 それぞれ 10クローンずつに絞った。 After a 10-minute recovery period at room temperature, the electroporated cells were transferred to 100 mL of 10% FCS (GIBC0-BRL), 1% penicillin-streptomycin (GIBC0-BRL). ) Suspended in -MEM (without nucleotides) selection medium (GIBC0-BRL), 96-well flat bottom plate (FALCON) at 100 μL / well (1 × 10 4 cells / well) The seeds were sown. After incubation overnight at 37 ° C, 5% C0 2 incubator one further 100 μ ΐ7 Ueru added selection culture areas, was carried out selector tion. On the 14th day, an assay was performed by a sandwich ELISA (see the section on cell line selection), and 24 clones that highly expressed HA-sHM or HA-sHM164 were selected and expanded on a 24-well plate. (LmL / well). After confirming stable growth of the clones selected in the nucleic acid-free medium, the clones were further subjected to atssay and squeezed to 10 clones each.
( 2 ) 細胞株の選択  (2) Selection of cell line
後記の可溶性ヒ ト HM1.24の ELISA は次のよ うにして行った。 高産 生の株を選択するために可溶性抗原の産生量を抗 HA抗体 （Boehring er Mannheim 社製） と ヒ ト型化抗 HM1.24抗体 (小野浩一郎ら 第 20 回日本分子生物学会年会 一般演題 3-501- P- 478) によるサンドィ ツチ ELISA で比較し、 細胞株の選択を行った。 精製抗原を得ていな いため抗原濃度は分からないので、 濃度の比較は ELISA を行った際 の細胞数を考慮した。  The ELISA for soluble human HM1.24 described below was performed as follows. In order to select high-producing strains, the production of soluble antigen was determined using anti-HA antibody (Boehringer Mannheim) and humanized anti-HM1.24 antibody (Koichiro Ono et al. The 20th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, etc. The cell lines were selected by comparison using sandwich ELISA with abstract 3-501-P-478). Since the purified antigen was not obtained, the antigen concentration was not known, so the concentration was compared taking into account the number of cells when ELISA was performed.
尚、 本実施例では、 再構成ヒ ト抗 HM1.24抗体 （ヒ ト型化抗 HM1.24 抗体） と して W098/14580に記載の軽鎖パージヨ ン a と重鎖パージョ ン s を用いた。 軽鎖パージヨ ン a を含むプラスミ ドを有する大腸菌 は、 Escherichia coli DH5 a (PUC19- VLa-AHM-gK) と して、 工業 技術院生命工学工業技術研究所に、 平成 8年 （1997年） 8月 29日に 、 FERM BP- 5645としてブダぺス ト条約に基づき国際寄託されている 。 また、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体の重鎖パージヨン s を含むプラスミ ドを有する大腸菌は、 Escherichia coli DH5 a (pUC19- RVHs - AHM- gy 1 ) として、 工業技術院生命工学工業技術研究所に、 平成 9年In this example, light chain purge ion a and heavy chain version s described in W098 / 14580 were used as reshaped human anti-HM1.24 antibody (humanized anti-HM1.24 antibody). . E. coli having a plasmid containing light chain purge ion a Was designated as Escherichia coli DH5a ( P UC19-VLa-AHM-gK) by the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and on August 29, 1997 as FERM BP-5645.国際 Deposited internationally under the EST. Escherichia coli having a plasmid containing the heavy chain purgion s of a humanized anti-HM1.24 antibody is referred to as Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gy1). In 1997
(1997年） 9月 29日に、 FERM BP-6127と してブダペス ト条約に基づ き国際寄託されている。 (1997) On September 29, it was deposited internationally under FERM BP-6127 under the Budapest Treaty.
抗 HA抗体 (Boehringer Mannheim 社製） を Coating Buffer (C. B. ： 0.1 mol/L 重炭酸ナト リ ゥム緩衝液、 pH 9.6、 0.02% ナト リ ウム アジ ド） にて 1 μ g/mLに調製したものを、 100 L/wellで平底 96穴 プレート （Nunc社製） に添加し、 4 °Cでー晚コーティ ングした。  Anti-HA antibody (Boehringer Mannheim) prepared at 1 μg / mL in Coating Buffer (CB: 0.1 mol / L sodium bicarbonate buffer, pH 9.6, 0.02% sodium azide) Was added to a flat-bottomed 96-well plate (manufactured by Nunc) at 100 L / well, and coated at 4 ° C.
プレー ト洗浄器を用いて、 300 μ L/ゥエルの 0.05% Tween 20を含 む PBS (-) にて 3回洗浄した抗 HA抗体コーティングプレートに 200 / L/ゥエルで希釈緩衝液 （50 mmol/L Tris- HC1、 pH 8.1、 1 mmol/L Using a plate washer, dilute buffer (50 mmol / well) to the anti-HA antibody-coated plate washed three times with PBS (-) containing 300 μL / well 0.05% Tween 20 using a plate washer. L Tris-HC1, pH 8.1, 1 mmol / L
MgCl2、 0.15 mol/L NaCl 、 0.05% Tween 20、 0.02% ナト リ ウムァ ジド、 1 % BSA) を加え、 室温で 2時間ブロ ッキングを行った。 希 釈緩衝液を捨てた後、 CH0 細胞による培養上清をそのまま又は適宜 希釈緩衝液で希釈したものを 100 μ!7ゥエル加え、 室温で 2時間反 応させた。 MgCl 2 , 0.15 mol / L NaCl, 0.05% Tween 20, 0.02% sodium azide, 1% BSA) were added, and blocking was performed at room temperature for 2 hours. After the dilution buffer was discarded, the culture supernatant of the CH0 cells, as it was or appropriately diluted with a dilution buffer, was added in an amount of 100 μ !, and reacted at room temperature for 2 hours.
陽性対照と して CGM/sHM (尾寄恭子ら 60回日本血液学会 一般 演題 690) を用いた。 次に、 同様に洗浄したプレートにヒ ト型化抗 HM1.24抗体 (小野浩一郎ら 第 20回日本分子生物学会年会 一般演 題 3-501-P-478) を 1 μ g/mLに希釈緩衝液で調製したものを 100 μ L/ゥ ル加えて室温で 1時間反応させた。 同様に洗浄後、 アルカリ フォスファターゼ標識ヒッジ抗ヒ ト IgG 抗体 （BI0S0URCE 社製） を 希釈緩衝液で 5000倍希釈したものを 100 μΐ7ゥ工ルずつ加え、 室温 で 1時間反応させた。 As a positive control, CGM / sHM (Kyoko Oyoro et al., Japanese Society of Hematology 60 times, General title 690) was used. Next, a humanized anti-HM1.24 antibody (Koichiro Ono et al. 20th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan 3-501-P-478) was diluted to 1 μg / mL in the same washed plate. 100 μL / mL of the solution prepared with the buffer was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing in the same manner, alkaline phosphatase-labeled hidge anti-human IgG antibody (manufactured by BI0S0URCE) diluted 5,000-fold with a dilution buffer was added in 100 μl / 7 μl portions, and the mixture was added For 1 hour.
最後に、 5回洗浄し、 SIGMA104 (p-ニトロフヱニルホスフェー ト ニナト リ ゥム塩六水和物 ： SIGMA 社製） を基質緩衝液 （S.B. ： 0.05 mol/L重炭酸ナト リ ゥム緩衝液、 pH 9.8、 10 mmol/L MgCl2 )で 1 mg /mL にしたものを 100 μ L/ゥェルずつ加えて発色させ、 MICR0PLATE READER (BIO - RAD社製） で 405 nm-655 nm の吸光度を測定した。 Finally, the plate was washed 5 times, and SIGMA104 (p-nitrophenyl phosphate sodium salt hexahydrate: manufactured by SIGMA) was added to a substrate buffer (SB: 0.05 mol / L sodium bicarbonate). Buffer solution, pH 9.8, 10 mmol / L MgCl 2 ) made 1 mg / mL, add 100 μL / well to develop color, absorbance of 405 nm-655 nm with MICR0PLATE READER (BIO-RAD) Was measured.
A . 10nmol/L MTXによる遺伝子増幅  A. Gene amplification by 10nmol / L MTX
それぞれ HAタグを付加した、 HM1.24抗原の膜貫通領域を欠損した 可溶性 HM1.24抗原 （sHM)及び sHM の C末端を欠損した sHM164の発現 ベクターを導入した DXB11 細胞で、 各 10株ずつ （sHM 産生株 ： ：！ - 1， 8-2, 9-3, 11-4, 14-5, - 16， -17, -22, -23, -24, sHM164産生株 ： 164-1, -2, 一 3， 一 5， -6, 一 7， 一 8， 一 10， 一 13， -16) (こつレヽて、 25 cm2フラスコにて 10 nmol/L メ 卜 卜 レキセ一卜 （Methotrexate) (M TX) 含有培地 ( a -MEM (GIBC0-BRL 社製） 、 10% FCS (GIBC0 - BRL社 製、 1 % ぺニシリ ン―ス ト レプトマイ シン （GIBC0- BRL 社製） 、 10 0 nmol/L MTX (SIGMA 社製） ） で培養した。 DXB11 cells transfected with soluble HM1.24 antigen (sHM) lacking the transmembrane region of HM1.24 antigen and sHM164 expression vector lacking the C-terminus of sHM with HA tag added, 10 strains each ( sHM producing strain::!-1, 8-2, 9-3, 11-4, 14-5,-16, -17, -22, -23, -24, sHM164 producing strain: 164-1, -2 , 13, 15, -6, 17, 18, 1, 10, 1, 13, -16) (Continued, 10 nmol / L Methotrexate in a 25 cm 2 flask) M TX) containing medium (a-MEM (GIBC0-BRL), 10% FCS (GIBC0-BRL, 1% penicillin-streptomycin (GIBC0-BRL), 100 nmol / L) MTX (manufactured by SIGMA)).
8 日後、 培養上清 （ 3 日培養） 中の抗原産生量を ELISA で測定し た。 発現量が高く、 かつ細胞が十分に増えていた sHM 産生株である 11 - 4並びに sHM164産生株である 164- 2 及び 164- 13について 100 nmol /L MTXによる遺伝子増幅を行った （後基 B . 項参照） 。 残りの株は 十分に 10 nmol/L MTX に適応していなかつたため、 さ らに 10 nmol/ L MTX 培地で培養を続けた。  Eight days later, the amount of antigen produced in the culture supernatant (3 day culture) was measured by ELISA. Gene amplification was performed with 100 nmol / L MTX for 11-4, a sHM-producing strain, and sHM164-producing strains, 164-2 and 164-1-13, which had high expression levels and had sufficiently increased cells (post-group B). .). The remaining strains were not well adapted to 10 nmol / L MTX, so we continued to culture in 10 nmol / L MTX medium.
11日後、 培養上清 （ 3 日培養） 中の抗原産生量を ELISA で測定し 、 発現量の高かった sHM 産生株 8- 2， 9-3, 14-16 及び 14- 24 並びに SHM164産生株 164— 1， 164— 5及び 164— 8 ίこつレヽても 100 nmol/L MTXこ よる遺伝子増幅を行った （後基 B . 項参照） 。 この時点で最も産生 量の高かった 164- 13は CGM/sHM (尾寄恭子ら 第 60回日本血液学会 一般演題 690) の約 10倍の抗原産生量を示した。 After 11 days, the amount of antigen produced in the culture supernatant (cultured for 3 days) was measured by ELISA, and the sHM-producing strains 8-2, 9-3, 14-16 and 14-24 and the SHM164-producing strain 164 with high expression levels were measured. — 1, 164—5 and 164—8 Gene amplification was performed using 100 nmol / L MTX (see Subsection B.). At this point, 164-13, which had the highest production, was converted to CGM / sHM (Kyoko Oyoro et al. The antigen production was about 10 times that of the general abstract 690).
B . 100 nmol/L MTXによる遺伝子増幅  B. Gene amplification by 100 nmol / L MTX
sHM 産生株及び sHM164産生株について、 10 nmol/L MTX 培地で抗 原産生量の高かった各 5株ずつ （sHM 産生株 8- 2， 9-3, 11-4, 14 - 1 6 及び 14- 24 並びに sHM164産生株 164- 1, 164-2, 164-5， 164- 8及び 164-13) について、 100 nmol/L MTXによる遺伝子増幅を行った。  For sHM-producing strains and sHM164-producing strains, 5 strains each of which had higher antigen production on 10 nmol / L MTX medium (sHM-producing strains 8- 2, 9-3, 11-4, 14- 16 and 14- 24 and sHM164-producing strains 164-1, 164-2, 164-5, 164-8 and 164-13) were subjected to gene amplification with 100 nmol / L MTX.
10 nmol/L MTX 培地に適応したものから順に細胞数に応じて 1/15 ， 1/10又は 1 /4量を 25 cm2フラスコに継代した。 10 nmol/L MTX 培 地で 1 日培養後、 100 nmol/L MTX培地 （ α - MEM (GIBC0-BRL 社製） 、 10% FCS (GIBC0- BRL社製） 、 1 % ペニシリ ン—ス ト レブ トマイ シ ン （GIBC0- BRL 社製） 、 100 nmol/L MTX (SIGMA 社製） ） に交換し 、 以降 100 nmol/L MTX培地で培養を行った。 sHM 産生株 11- 4、 並び に sHM164産生株 164- 2 及び 164-13は 19日後、 sHM 産生株 8- 2， 9-3， 14-16 及び 14 - 24 並びに sHM164産生株 164-1， 164- 5及び 164-8 は 8 日後、 培養上清 （ 2 日培養） 中の抗原産生量を ELISA で測定した。 さらに産生量の高い、 あるいは高くなる可能性のある sHM 産生株 8-2 、 並びに sHM164産生株 164— 2 及び 164— 13につレヽて 100 nmol/L M TX培地で培養を続け、 15日後、 培養上清 （ 3 日培養） 中の抗原産生 量を再度 ELISA で測定した。 当初、 最も産生量の高かった 164-2 株 は CGM/sHM (尾寄恭子ら 第 60回日本血液学会 一般演題 690) の 5倍以上の抗原産生量を示した。 しかし、 継代を重ねると最も産生 量の高かった 164- 2 株は CGM/sHM よ り若干劣る抗原産生量を示し、 産生量が下がる傾向が見られた。 これよ り、 限界希釈法によ りシン ダルクローン化を行う こと と した。 10 nmol / L MTX medium in accordance with the number of cells in order from an adaptation to 1/15, were passaged 1/10 or 1/4 amount 25 cm 2 flasks. After culturing for 1 day in 10 nmol / L MTX medium, 100 nmol / L MTX medium (α-MEM (GIBC0-BRL), 10% FCS (GIBC0-BRL), 1% penicillin-strain Tomycin (GIBC0-BRL) and 100 nmol / L MTX (SIGMA) were exchanged, and the cells were cultured in 100 nmol / L MTX medium. After 19 days, sHM-producing strains 11-4 and sHM164-producing strains 164-2 and 164-13 were sHM-producing strains 8-2, 9-3, 14-16 and 14-24 and sHM164-producing strains 164-1 and 164. After 8 days for -5 and 164-8, the amount of antigen production in the culture supernatant (2 day culture) was measured by ELISA. Continue culturing in 100 nmol / LM TX medium for sHM-producing strains 8-2 and sHM164-producing strains 164-2 and 164-13, which have higher or possibly higher yields. The amount of antigen produced in the supernatant (cultured for 3 days) was measured again by ELISA. Initially, the 164-2 strain, which produced the highest amount, produced more than 5 times more antigen than CGM / sHM (Kyoko Oyoro et al., General Presentation 690 of the 60th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematology). However, with successive passages, the 164-2 strain, which produced the highest amount, showed slightly lower antigen production than CGM / sHM, and the production tended to decrease. For this reason, we decided to carry out syndial cloning by the limiting dilution method.
C . 限界希釈法によるシンダルク口一ン化  C. Unification of Sindalk by limiting dilution method
sHM 産生株 8- 2 並びに sHM164産生株 164-2 及び 164- 13について、 限界希釈法によるシングルクローン化を行った。 8-2, 164- 2及び 164- 13をそれぞれ 100 nmol/L MTX培地で 1.7 細胞 /DIL に調製し、 96ゥヱルプレート各 3枚に 150 μ!7ゥエル （0.25細 胞 / ゥエル） 分注した。 13日培養後、 コロニーの形成が見られたゥ エル （8-2 ： 13ゥエル、 164-2 ： 36ゥェル、 164-13 ： 23 ゥエル） の培養上清 （ 4 日培養） 中の抗原産生量を ELISA で測定した。 Single cloning by the limiting dilution method was performed on the sHM-producing strain 8-2 and the sHM164-producing strains 164-2 and 164-13. 8-2, 164-2 and 164-13 were prepared at 1.7 cells / DIL in 100 nmol / L MTX medium, respectively, and dispensed at 150 μ! 7 μl (0.25 cells / μl) into each of three 96 μl plates. After 13 days of culture, the amount of antigen produced in the culture supernatant (4 day culture) of ゥ -well (8-2: 13-well, 164-2: 36-well, 164-13: 23-well) in which colony formation was observed Was measured by ELISA.
産生量の高かったゥエル （8-2 ： 6 ゥエル、 164-2 ： 15ゥエル、 164-13 : 9 ゥヱル） から細胞を 24ゥヱルプレートへ継代した。 継代 用と測定用の 2枚のプレートを用意し、 測定用のプレートはコンフ ルェントになった時点で培地交換し、 3 日培養し、 培養上清中の抗 原産生量を ELISA で測定した。  The cells were passaged from the wells producing the highest yield (8-2: 6 wells, 164-2: 15 wells, 164-13: 9 wells) to 24-well plates. Prepare two plates for subculture and assay.When the assay plate becomes confluent, change the medium, culture for 3 days, and measure the amount of antigen production in the culture supernatant by ELISA. .
96ゥヱル由来 164- 2 から、 最終的に CGM/sHM (尾寄恭子ら 第 60 回日本血液学会 一般演題 690) で作製したものの約 100 倍程度の 産生量を示す 4株 （164-2-1， 164-2-13, 164-2-17 及び 164-2- 31) が得られた （図. 2 ) 。  Four strains (164-2-1) showing about 100 times the production from CGM / sHM (164-2-1), which were finally produced by CGM / sHM (Kyoko Oyoro et al. , 164-2-13, 164-2-17 and 164-2-31) were obtained (Fig. 2).
D . ウェスタンブロ ッ ト  D. Western blot
164-2-1, 164-2-13, 164-2-1 及び 164 - 2 - 31の細胞株を 25 cm2フ ラスコ / 5mL培地で 1 日、 3 日、 及び 5 日培養した培養上清につい てウェスタンブロ ッ トを行った。 164-2-1, 164-2-13, 164-2-1 and 164 - 2 - 31 1 day cell lines in 25 cm 2 flasks / 5 mL of medium, 3 days, and 5 days of culture and the culture supernatant Western blots were performed on the samples.
培養上清 5 μ ΐ を PBS (-) で総量 10 L に調製し、 それぞれに SDS-サンプル緩衝液 （還元 TEFC0 社製） ) を等量加えた。 これらを 100 でで 5分加熱した後、 SDS- PAGE (18 mA 、 1.5 時間） を行った 。 伹し、 ゲルは分離ゲル 12.5% とスタックゲル 4.5%のミニスラブを Laemi の万法 ( Current Protocols in Molecular Biology 10.2.6 - 10.2.6) に従って作製した。 泳動後、 ゲルを PVDFメ ンブレン （ミ リ ポア社製） ） に ト ラ ンスプロ ッ ト （10 V、 30分） した。 そのメンブ レンを 5 % FBS を含む Tris緩衝液 （TBS (宝酒造社製） ） 中で 25°C にて 1時間振と う して、 ブロ ッキングを行った。 ' 0.05% T een 20を含む TBS (TBS- T) でゆすいだ後、 50 μ g/mLマ ウス抗 HM1.24抗体 （Blood (1994) 84, 1922-1930) を加え、 25°Cで 振と う しながら 1時間反応させた。 TBS-T を加えて室温で振と う し ながら 10分間隔で 6回緩衝液を交換して、 メ ンブレンを洗浄した。 続いて、 アルカ リ フォスファターゼ標識ャギ抗マウス IgG 抗体 （Zy med 社製） ） を TBS-T にて 2000倍希釈したものを二次抗体と して同 様に 25°Cで振と う しながら 30分間反応させた。 Five μl of the culture supernatant was prepared with PBS (-) to make a total volume of 10 L, and an equal amount of SDS-sample buffer (reduced TEFC0) was added to each. After heating these at 100 for 5 minutes, SDS-PAGE (18 mA, 1.5 hours) was performed. The gel was prepared according to Laemi's Manner method (Current Protocols in Molecular Biology 10.2.6-10.2.6) using minislabs of 12.5% separation gel and 4.5% stack gel. After electrophoresis, the gel was transplotted (10 V, 30 minutes) on a PVDF membrane (Millipore). The membrane was shaken in a Tris buffer (TBS (Takara Shuzo)) containing 5% FBS at 25 ° C for 1 hour to perform blocking. ' After rinsing with TBS containing 0.05% Teen 20 (TBS-T), add 50 μg / mL mouse anti-HM1.24 antibody (Blood (1994) 84, 1922-1930) and shake at 25 ° C. For 1 hour. TBS-T was added and the buffer was changed 6 times at 10 minute intervals while shaking at room temperature to wash the membrane. Subsequently, the alkaline phosphatase-labeled goat anti-mouse IgG antibody (manufactured by Zymed)), which was diluted 2000-fold with TBS-T, was used as a secondary antibody while shaking at 25 ° C in the same manner. The reaction was performed for 30 minutes.
反応後、 TBS- T を加えて 25°Cで 10分間の振と うを 6回繰り返して メ ンブレンを洗浄した。 このメ ンブレンを BCIP/NBT発色基質 （Prom ega 社製） ) を用いて 33 μ L のニ トロブルーテ トラゾリ ゥム （ΝΒ Τ)と 16.5 μ L の 5-ブ口モ- 4- ク ロ 口— 3- イ ン ドリノレー ホスフエ一 ト （BCIP) を含むウェスタン検出緩衝液 （0.1 mol/L NaCl、 5 mmol /L MgCl2を含む 0.1 mol/L Tris-HCl緩衝液、 pH 9.5) に膜を浸して 発色させた。 After the reaction, the membrane was washed by adding TBS-T and shaking at 25 ° C for 10 minutes six times. This membrane was prepared using BCIP / NBT chromogenic substrate (manufactured by Promega) with 33 μL of Nitrobrute Trazolium (ΝΒ と) and 16.5 μL of 5-Mouth-4 -Immerse the membrane in a western detection buffer (0.1 mol / L NaCl, 0.1 mmol / L Tris-HCl buffer containing 5 mmol / L MgCl 2 ; pH 9.5) containing indolinole phosphate (BCIP) to develop color I let it.
パックグラウンドが上がらない程度に develop させた後、 蒸留水 で洗浄し HM1.24抗原を検出した。 図 3に示したように得られた 4ク ローン （164-2-1， 164-2-13, 164-2-17 及び 164- 2- 31) とも還元状 態で、 糖鎖修飾によるへテロジェネティーと考えられる 23-28 kDa のブロー ドなパンドと して可溶性抗原が検出された。 但し、 18 kDa After developing to the extent that the background did not rise, the plate was washed with distilled water and HM1.24 antigen was detected. As shown in Fig. 3, the four clones (164-2-1, 164-2-13, 164-2-17, and 164-2-31) obtained were both in a reduced state, and were heterologous by glycosylation. Soluble antigen was detected as a broad band of 23-28 kDa, which is considered genetic. However, 18 kDa
、 14 kDa付近に HM抗原タンパク質由来のへテ口パンドを認めたため 、 ク ロマ トを行って、 これを除いたものを可溶性抗原とすること と した。 However, since a mouth band derived from the HM antigen protein was observed at around 14 kDa, chromatography was carried out, and the resulting product was determined to be a soluble antigen.
実施例 3. 可溶性ヒ ト HM1.24抗原の精製  Example 3. Purification of soluble human HM1.24 antigen
可溶性ヒ ト HM1.24抗原発現 CH0 細胞培養上清よ り、 可溶性ヒ ト HM 1.24抗原を精製した。 可溶性ヒ ト HM1.24抗原発現 CH0 細胞を培養液  Soluble human HM1.24 antigen was purified from the culture supernatant of CH0 cells expressing soluble human HM1.24 antigen. Culture solution of soluble human HM1.24 antigen-expressing CH0 cells
[10% FBS (M0REGATE 社製） 、 1 % ペニシリ ン一ス トレブトマイシ ン （GIBC0- BRL 社製） 、 500 nmol/L MTX (Sigma 社製） を含む α ME M 培地 （GIBCO- BRL 社製） ] 中で、 37°C、 5 % C02 存在下で培養し た。 培養上清約 2 Lを遠心により、 回収した。 [Α ME containing 10% FBS (M0REGATE), 1% penicillin-streptomycin (GIBC0-BRL), 500 nmol / L MTX (Sigma) Among M medium (GIBCO-BRL, Inc.)], were cultured in C0 2 the presence 37 ° C, 5%. About 2 L of the culture supernatant was collected by centrifugation.
AHM コンジユゲートァフィニティーカラム （約 300 mgの AHM をコ ンジュゲー トした CNBr- 活性化セファロース 4FF) に、 培養上清を アプライ し、 PBS (10XPBS)を 10倍希釈したもの ： ナカライ） で洗つ た後、 0.2 mol/L Glycine バッファー （pH 2.48)で溶出した。 この 画分を、 VyDAC C4力ラムを用いた逆相ク 口マ トグラフィ一にて、 ァ セ トニ ト リルの濃度勾配で溶出し、 祖精製品を得た。  Apply the culture supernatant to an AHM Conjugate Affinity column (CNBr-activated Sepharose 4FF conjugated with about 300 mg of AHM) and wash with PBS (10XPBS) diluted 10-fold: Nacalai. After that, elution was performed with 0.2 mol / L Glycine buffer (pH 2.48). This fraction was eluted with a concentration gradient of acetonitrile by reversed-phase chromatography using VyDAC C4 column to obtain a purified product.
さらに、 祖精製品を、 同様の逆相クロマ トグラフィーで、 2回の リ クロマ トグラフィーを行う ことによって精製した。 この精製品を In addition, the purified product was purified by performing two re-chromatographies on the same reversed-phase chromatograph. This refined product
、 PBS で 5倍希釈し、 Fast Desalting HR10/10カラムを用いて、 PB S にバッファー置換を行った。 280 nmの吸収から、 得られた可溶性 ヒ ト HM1.24抗原の濃度は約 0.382 mg/mL と試算され、 合計 42 mL の 精製品が得られた。 精製度は、 逆相ク ロマ トグラフィーのピーク面 積比から、 95% 以上の純度であった。 Then, the buffer was replaced with PBS using a Fast Desalting HR10 / 10 column after diluting 5-fold with PBS. From the absorption at 280 nm, the concentration of the soluble human HM1.24 antigen obtained was estimated to be about 0.382 mg / mL, and a total of 42 mL of purified product was obtained. Purity was 95% or more based on the peak area ratio of reversed phase chromatography.
実施例 4. 精製可溶性ヒ ト HM1.24抗原を用いた ELISA 系の構築 抗 HA抗体 （Boehringer Mannheim 社製） をコート緩衝液 （C.B. : 0.1 mol/L 重炭酸ナト リ ゥム緩衝液、 pH 9.6、 0.02% ナト リ ウムァ ジド） にて 1 μ g/mLに調製したものを、 100 μ!7ゥエルで平底 96穴 プレート （Nunc社製） に添加し、 4 °Cでー晚コーティングした。 0. 05% Tween 20を含む PBS (-) にて洗浄した抗 HA抗体コーティ ングプ レー トに 200 μ!7ゥヱルで希釈緩衝液 （50 mmol/L Tris- HC1、 pH 8 .1、 1 mmol/L MgCl2、 0.15 mol/L NaCl 、 0.05% Tween 20、 0.02% ナト リ ゥムアジ ド、 1 % BSA)を加え、 室温で 2時間ブロ ッキングを 行った。 Example 4. Construction of an ELISA system using purified soluble human HM1.24 antigen An anti-HA antibody (Boehringer Mannheim) was coated with a coating buffer (CB: 0.1 mol / L sodium bicarbonate buffer, pH 9.6). , 0.02% sodium azide) at a concentration of 1 μg / mL was added to a flat-bottom 96-well plate (manufactured by Nunc) at 100 μ! 7-well and coated at 4 ° C. 200 μl of anti-HA antibody coating plate washed with PBS (-) containing 0.05% Tween 20 diluted with 200 μl of dilution buffer (50 mmol / L Tris-HC1, pH 8.1, 1 mmol / l L MgCl 2 , 0.15 mol / L NaCl, 0.05% Tween 20, 0.02% sodium azide, 1% BSA) were added, and blocking was performed at room temperature for 2 hours.
希釈緩衝液を捨てた後、 精製 HM1.24抗原を希釈緩衝液で 750 倍、 2250倍、 6750倍、 20250 倍、 又は 60750 倍希釈したものを 100 μ 1/ ゥエル加え、 室温で 1時間反応させた。 次に、 同様に洗浄したプレ ー トにヒ ト型化抗 HM1.24抗体 (小野浩一郎ら 第 20回日本分子生物 学会年会 一般演題 3- 501-P-478) を 1 g/mLに希釈緩衝液で調製 したものを 100 し/ゥエル加えて室温で 1時間反応させた。 同様に 洗浄後、 アルカ リ フォスファターゼ標識ヒ ッジ抗—ヒ ト IgG 抗体 （ BI0S0URCE 社製） を希釈緩衝液で 5000倍希釈したものを 100 /xL/ゥ エルずつ加え、 室温で 1時間反応させた。 After discarding the dilution buffer, the purified HM1.24 antigen diluted 750-fold, 2250-fold, 6750-fold, 20250-fold, or 60750-fold with the dilution buffer is 100 μl / The reaction mixture was added and reacted at room temperature for 1 hour. Next, human-type anti-HM1.24 antibody (Koichiro Ono et al. 20th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan 3-501-P-478) was diluted to 1 g / mL in the washed plate. The solution prepared with the buffer solution was added at 100 / well, and reacted at room temperature for 1 hour. Similarly, after washing, an alkaline phosphatase-labeled sheep anti-human IgG antibody (manufactured by BI0S0URCE) diluted 5,000-fold with a dilution buffer was added at 100 / xL / well, and reacted at room temperature for 1 hour. .
最後に、 5回洗浄し、 SIGMA104 (SIGMA 社製） を基質と して基質 緩衝液 （S.B.： 0.05 mol/L重炭酸ナ ト リ ウム緩衝液、 pH 9.8、 10 m mol/L MgCl2 )で 1 mg/mUこしたものを 100 μ ΐ7ゥエルずつ加えて発 色させ、 マイクロプレート リーダー （BI0-RAD 社製） で 405 nm- 655 nm の吸光度を測定した、 図 4に示したとお り のヒ ト型化抗 HM1.24 抗体の標準曲線が得られ、 これよ り 5000倍希釈での使用が妥当であ る と判断した。 また、 図 5に 5000倍希釈で精製抗原を使用した際の ELISA 系におけるヒ ト型化抗 HM1.24抗体の標'準曲線を示したが、 測 定限界は約 500 pg/mL であった。 Finally, the plate is washed 5 times, and the substrate buffer (SB: 0.05 mol / L sodium bicarbonate buffer, pH 9.8, 10 mmol / L MgCl 2 ) is used with SIGMA104 (manufactured by SIGMA) as the substrate. 100 mg / well of 1 mg / mU was added to each well to develop color, and the absorbance at 405 nm-655 nm was measured with a microplate reader (manufactured by BI0-RAD). A standard curve of the anti-HM1.24 antibody was obtained, and it was judged that use at a 5000-fold dilution was appropriate. Fig. 5 shows the standard curve of the humanized anti-HM1.24 antibody in the ELISA system when the purified antigen was used at 5000-fold dilution.The measurement limit was about 500 pg / mL. .
参考例 1. マウス抗 HM1.24モノ ク ローナル抗体産生ハイブリ ドー マの調製  Reference Example 1. Preparation of mouse anti-HM1.24 monoclonal antibody-producing hybridoma
Goto, T. et al.， Blood (1994) 84, 1992-1930 に記載の方法に て、 マウス抗 HM1.24モノ ク ローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製 した。  A mouse anti-HM1.24 monoclonal antibody-producing hybridoma was prepared according to the method described in Goto, T. et al., Blood (1994) 84, 1992-1930.
ヒ ト多発性骨髄腫患者骨髄由来の形質細胞株 KPC-32 (lxlO7 個） (Goto, T. et al. , Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400 ) を BALB/Cマウス （チヤ一ルスリパー製） の腹腔内に 6 週間おきに 2 回注射した。 Human multiple myeloma patient bone marrow-derived plasma cell line KPC-32 ( 7 lxlO) (Goto, T. et al., Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400) Injected twice (every 6 weeks) into the peritoneal cavity (manufactured by Chillslipper).
このマウスを屠殺する 3 日前にマウスの抗体産生価をさ らに上昇 させるために、 1.5xl06 個の KPC- 32をマウスの脾臓内に注射した （ Goto, T. et al. , Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89 ) 。 マ ウスを屠殺した後に脾臓を摘出し、 Groth, de St. & Schreidegger の方法 （Cancer Research (1981) 41, 3465 ) に従い摘出した脾臓 細胞と ミエローマ細胞 SP2/0 を細胞融合に付した。 Three days before sacrifice of the mouse, 1.5xl0 6 KPC-32 were injected into the spleen of the mouse to further increase the antibody production titer of the mouse ( Goto, T. et al., Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89). After the mouse was killed, the spleen was excised and the spleen cell and myeloma cell SP2 / 0 were subjected to cell fusion according to the method of Groth, de St. & Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465).
KPC - 32を用いた Cell ELISA (Posner, M. R. et al. , J. Immunol . Methods (1982) 48, 23 ) によりハイプリ ドーマ培養上清中の抗 体のスク リーニングを行った。 5xl04 個の KPC-32を 50 ml の PBS に 懸濁し、 96穴プレー ト （U 底型、 Corning, Iwaki製） に分注し 37°C でー晚風乾した。 1%ゥシ血清アルブミ ン （BSA ) を含む PBS でプロ ックした後、 ハイプリ ドーマ培養上清を加え 4 °Cにて 2 時間インキ ュペートした。 次いで、 4 °Cにて 1 時間ペルォキシダーゼ標識抗マ ウス IgG ャギ抗体 （Zymed 製） を反応させ、 洗浄後室温にて 30分間 0 -フエ二レンジアミ ン基質溶液 （Sumitomo Bakelite 製） を反応さ せた。 Screening of the antibodies in the hybridoma culture supernatant was performed by Cell ELISA using KPC-32 (Posner, MR et al., J. Immunol. Methods (1982) 48, 23). 5Xl0 4 pieces of KPC-32 were suspended in 50 ml of PBS, 96-well plates (U-bottomed, Corning, Iwaki, Ltd.) was dried dispensed 37 ° C De晚風to. After blocking with PBS containing 1% serum albumin (BSA), the hybridoma culture supernatant was added and incubated at 4 ° C for 2 hours. Next, a peroxidase-labeled anti-mouse IgG goat antibody (Zymed) was reacted at 4 ° C for 1 hour. After washing, a 0-phenylenediamine substrate solution (Sumitomo Bakelite) was reacted at room temperature for 30 minutes. Was.
1 mol/L 硫酸で反応を停止させ、 ELISA reader (Bio-Rad 製） で 492nm における吸光度を測定した。 ヒ ト免疫グロプリ ンに対する抗 体を産生するハイプリ ドーマを除去するために、 陽性ハイプリ ドー マ培養上清をヒ ト血清にあらかじめ吸着させ、 他の細胞株に対する 反応性を ELISA にてスク リーニングした。 陽性のハイプリ ドーマを 選択し、 種々の細胞に対する反応性をフローサイ トメ ト リ一で調べ た。 最後に選択されたハイプリ ドーマクローンを二度クローン化し 、 これをプリスタン処理した BALB/Cマウスの腹腔に注射して、 腹水 を取得した。  The reaction was stopped with 1 mol / L sulfuric acid, and the absorbance at 492 nm was measured using an ELISA reader (manufactured by Bio-Rad). In order to remove the hybridoma producing an antibody against human immunoglobulin, the culture supernatant of the positive hybridoma was adsorbed to human serum in advance, and the reactivity to other cell lines was screened by ELISA. Positive hybridomas were selected and their reactivity to various cells was determined by flow cytometry. Finally, the selected hybridoma clone was cloned twice and injected into the abdominal cavity of a pristane-treated BALB / C mouse to obtain ascites.
モノクローナル抗体は、 硫酸アンモニゥムによる沈澱とプロティ ン A ァフィ二ティクロマ トグラフィーキッ ト （Ampure PA 、 Amersh am製） によ りマウス腹水よ り精製した。 精製抗体は、 Quick Tag FI TC結合キッ ト （ベーリ ンガーマンハイ ム製） を使用することによ り F ITC標識した。 Monoclonal antibodies were purified from mouse ascites by precipitation with ammonium sulfate and protein A affinity chromatography kit (Ampure PA, manufactured by Amersham). Purified antibodies were obtained using a Quick Tag FITC binding kit (Boehringer Mannheim). F ITC labeled.
その結果、 30のハイブリ ドーマク ローンが産生するモノク ローナ ノレ抗体力 S KPC- 32および RPMI 8226 と反応した。 クローユングの後、 これらのハイブリ ドーマの培養上清と他の細胞株あるいは末梢血単 核球との反応性を調べた。  As a result, 30 hybridoma clones reacted with monoclonal antibody SKPC-32 and RPMI 8226 produced by monoclonal antibodies. After closing, the reactivity of the culture supernatants of these hybridomas with other cell lines or peripheral blood mononuclear cells was examined.
このう ち、 3 つのクローンが形質細胞に特異的に反応するモノク ローナル抗体であった。 これらの 3 つのク ローンのう ち、 最もフロ 一サイ トメ ト リー分析に有用であり、 かつ RPM I 8226 に対する CDC 活性を有するハイプリ ドーマクローンを選択し、 HM1. 24と名付けた 。 このハイブリ ドーマが産生するモノ ク ローナル抗体のサブクラス を、 サブクラス特異的抗マウスゥサギ抗体 （Zymed 製） を用いた EL I SA にて決定した。 抗 HM1. 24抗体は、 I gG2a κのサブクラスを有し ていた。 抗 HM1. 24抗体を産生するハイプリ ドーマ HM1. 24は、 工業技 術院生命工学工業研究所 （茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 7 年 9 月 14日に FERM BP 5233と してブタぺス ト条約に基づき国 際寄託された。 Of these, three clones were monoclonal antibodies that specifically reacted with plasma cells. Among these three clones, a hybridoma clone most useful for flow cytometry analysis and having CDC activity against RPMI 8226 was selected and named HM1.24. The subclass of the monoclonal antibody produced by this hybridoma was determined by ELISA using a subclass-specific anti-mouse porcupine antibody (Zymed). Anti HM1. 24 antibody had a subclass of I g G2a kappa. Hypri-Doma HM1.24, which produces anti-HM1.24 antibody, was submitted to the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (1-3 1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) on September 14, 1995, as FERM BP 5233. Was deposited internationally under the Budapest Treaty.
参考例 2 . ヒ ト型化抗 HM1. 24抗体の作製  Reference Example 2. Preparation of humanized anti-HM1.24 antibody
ヒ ト型化抗 HM1. 24抗体を下記の方法によ り得た。  A humanized anti-HM1.24 antibody was obtained by the following method.
参考例 1 で作製されたハイプリ ドーマ HM1. 24から、 常法によ り全 RNA を調製した。 これよ りマウス抗体 V 領域をコ一ドする cDNAをポ リ メラーゼ連鎖反応 （PCR ) 法および 5 ' - RACE 法によ り、 合成、 増 幅した。 マウス V 領域をコー ドする遺伝子を含む DNA 断片を得、 こ れらの DNA 断片を各々プラスミ ド pUC 系ク ローニングベクタ一に連 結し、 大腸菌コンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た 。 この形質転換体から上記プラスミ ドを得、 プラスミ ド中の cDNAコ 一ド領域の塩基配列を常法に従い決定し、 さ らに各々の V 領域の相 補性決定領域 （CDR ) を決定した。 キメラ抗 ΗΜ1· 24抗体を発現するべクターを作製するため、 それぞ れマウス抗 HM1.24抗体 L 鎖および Η 鎖の V 領域をコ一ドする cDNAを HEF ベクターに揷.入した。 また、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体を作製する ために、 CDR 移植法によりマウス抗 HM1.24抗体の V 領域 CDR をヒ ト 抗体へ移植した。 ヒ ト抗体の L 鎖と してヒ ト抗体 REI のし 鎖を用い 、 ヒ ト抗体 H 鎖と してフレームワーク領域 （FR) 1-3 についてはヒ ト抗体 HG3 の FR1-3 を用い FR4 についてはヒ ト抗体 JH6 の FR4 を用 いた。 CDR を移植した抗体が適切な抗原結合部位を形成するように H 鎖 V 領域の FRのァミ ノ酸を置換した。 Total RNA was prepared from the hybridoma HM1.24 prepared in Reference Example 1 by a conventional method. From this, cDNA encoding the mouse antibody V region was synthesized and amplified by the polymerase chain reaction (PCR) method and the 5'-RACE method. A DNA fragment containing the gene encoding the mouse V region was obtained, and each of these DNA fragments was ligated to a plasmid pUC-based cloning vector and introduced into E. coli competent cells to obtain an E. coli transformant. Was The above plasmid was obtained from this transformant, the nucleotide sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined according to a conventional method, and the complementarity determining region (CDR) of each V region was further determined. In order to prepare vectors expressing the chimeric anti-Δ124 antibody, cDNAs encoding the V regions of the mouse anti-HM1.24 antibody L chain and 鎖 chain, respectively, were inserted into the HEF vector. In addition, in order to prepare a humanized anti-HM1.24 antibody, the V region CDR of the mouse anti-HM1.24 antibody was transplanted into the human antibody by CDR transplantation. The human antibody REI chain is used as the human antibody L chain, and the framework region (FR) 1-3 is used as the human antibody H chain using FR1-3 of human antibody HG3 and FR4 is used as the human antibody H chain. Used FR4 of human antibody JH6. The amino acid of FR in the V region of the H chain was substituted so that the CDR-grafted antibody formed an appropriate antigen-binding site.
このようにして作製したヒ ト型化抗 HM1.24抗体の L 鎖および H 鎖 の遺伝子を哺乳類細胞で発現させるために、 HEF ベクターに、 各々 の遺伝子を別々に導入し、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体の L 鎖または H 鎖 を発現するベクターを作製した。  In order to express the L chain and H chain genes of the humanized anti-HM1.24 antibody thus produced in mammalian cells, each of the genes was separately introduced into a HEF vector, and the humanized anti-HM1.24 antibody was humanized. A vector for expressing the L chain or H chain of the HM1.24 antibody was prepared.
これら二つの発現べクターを CH0 細胞に同時に導入することによ り、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体を産生する細胞株を樹立した。 この細胞 株を培養して得られたヒ ト型化抗 HM1.24抗体のヒ ト羊膜由来細胞株 WISHへの抗原結合活性および結合阻害活性を、 Cell ELISAにて調べ た。 その結果、 ヒ ト型化抗 l.24抗体は、 キメラ抗体と同等の抗原 結合活性を有し、 さらにピオチン化マウス抗 HM1.24抗体を用いた結 合阻害活性についても、 キメラ抗体あるいはマウス抗体と同等の活 性を有した。  By simultaneously introducing these two expression vectors into CH0 cells, a cell line producing a humanized anti-HM1.24 antibody was established. The antigen-binding activity and the binding inhibitory activity of the humanized anti-HM1.24 antibody obtained by culturing this cell line on the human amniotic membrane-derived cell line WISH were examined by Cell ELISA. As a result, the humanized anti-l.24 antibody has the same antigen-binding activity as the chimeric antibody, and furthermore, the binding inhibition activity using the biotinylated mouse anti-HM1.24 antibody was confirmed by the chimeric antibody or the mouse antibody. It had the same activity as.
なお、 キメ ラ抗 HM1.24抗体の L 鎖 V 領域および H 鎖 V 領域をコー ドする DNA を含むプラスミ ドを有する大腸菌は、 各々 Escherichia coli DH5 a (pUC19-l.24L- g κ ) および Escherichia coli DH5 a ( pUC19-1.24H- g y 1 ) と して、 工業技術院生命工学工業技術研究所 (茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 8 年 8 月 29日に、 各 々FERM BP-5646*5 j t/FERM BP— 5644と してブダぺス 卜条糸勺に基づき 国際寄託された。 Escherichia coli having a plasmid containing DNA encoding the L chain V region and H chain V region of the chimeric anti-HM1.24 antibody was Escherichia coli DH5a (pUC19-l.24L-gκ) and Escherichia coli, respectively. E. coli DH5a (pUC19-1.24H-gy1) was submitted to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) on August 29, 1996. Each FERM BP-5646 * 5 jt / FERM BP-5644 based on Budapest International deposit.
また、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体の L 鎖 V 領域 a パージヨ ン （配列番 号 ： 12) および H 鎖 V 領域 パージョ ン （配列番号 ： 13) をコード する DNA を含むプラスミ ドを有する大腸菌は、 各々 Escherichia co li DH5a (pUC19- RVLa-AHM- gk ) および Escherichia coli DH5 a ( PUC19- RVHr- A丽- g y l ) として、 工業技術院生命工学工業技術研 究所 （茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 8 年 8 月 29日に 、 各々 FERM BP— 5645および FERM BP— 5643と してブダぺス ト条約に基 づき国際寄託された。 In addition, E. coli having a plasmid containing DNA encoding the L chain V region a purge ion (SEQ ID NO: 12) and the H chain V region version (SEQ ID NO: 13) of a humanized anti-HM1.24 antibody each Escherichia co li DH5a (pUC19- RVLa- AHM- g k) and Escherichia coli DH5 a (PUC19- RVHr- a丽- gyl) as, Agency of industrial Science technology Research Institute (Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 1 On October 29, 1996, FERM BP-5645 and FERM BP-5643 were deposited internationally under the Budapest Treaty.
また、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体の H 鎖 V 領域 s パージヨ ン （配列番 号 ： 14) をコードする DNA を含むプラスミ ドを有する大腸菌は、 cherichis coli DH5 a (pUC19- RVHs - AHM - g γ 1 ) と して、 工業技 術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 9 年 （1997年） 9 月 29日に FERM BP - 6127と してブダペス ト 条約に基づき国際寄託された。  Escherichia coli having a plasmid containing DNA encoding the H chain V region s purge ion (SEQ ID NO: 14) of a humanized anti-HM1.24 antibody is cherichis coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM- g γ 1) was reported to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology (I 1-3, Higashi 1-3-1, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) as FERM BP-6127 on September 29, 1997. And deposited internationally under the Budapest Treaty.
参考例 3. HM1.24抗原をコ一 ドする cDNAのクローニング  Reference Example 3. Cloning of cDNA encoding HM1.24 antigen
1 ) 細胞株 1) Cell line
ヒ ト骨髄腫細胞株 RPMI8226, U266は 10% ゥシ胎児血清 （FBS ) を 添加した RPMI1640培地 （GIBC0- BRL ) にて培養を行い、 ヒ ト骨髄腫 細胞株 KPMM2 (特開平 7- 236475) は 20% ゥシ胎児血清を添加した RP MI1640培地にて培養を行った。  The human myeloma cell lines RPMI8226 and U266 were cultured in RPMI1640 medium (GIBC0-BRL) supplemented with 10% fetal calf serum (FBS), and the human myeloma cell line KPMM2 (JP-A-7-236475) was Culture was performed in RPMI1640 medium supplemented with 20% fetal bovine serum.
2 ) cDNAライブラ リ一の構築 2) Construction of cDNA library
1X108 個の KPMM2 細胞よ りチオシァン酸グァニン 塩化セシゥ ム法により全 RNA を単離し、 Fast Track mRNA Isolation Kit(Invi trogen) を用レヽて mRNAの精製を行った。 10 g の mRNAより Not I , oligo_dT18 (Time Saver cDNA synthesis Kit ； Pharmacia Biot ech ) を用いて cDNAを合成した後、 EcoR I adapterを連結した。 0.7kbp以上の cDNAを 1.0%低融点ァガロースゲル （Sigma ) を用い て分画し、 Notlにて消化し pCOSl 発現ベクター又は； L ExCellベクタ 一 (Pharmacia Biotech ) の EcoR l ZNot I site に挿入し、 直接 発現クローニング （panning によるスク リーニング） に用いるライ ブラリー （ライブラリー A) 及び免疫スク リーニング用のライブラ リー （ライブラ リー B ) をそれぞれ構築した。 Total RNA was isolated from 1 × 10 8 KPMM2 cells by guanosine thiosinate cesium chloride method, and mRNA was purified using a Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen). 10 g mRNA from Not I of, oligo_dT 18; After cDNA was synthesized using (Time Saver cDNA synthesis Kit Pharmacia Biot ech), was ligated with EcoR I adapter. The cDNA of 0.7kbp or more is fractionated using 1.0% low melting point agarose gel (Sigma), digested with Notl, and inserted into pCOSl expression vector or EcoRl ZNot I site of L ExCell vector (Pharmacia Biotech). A library (library A) used for expression cloning (screening by panning) and a library (library B) for immunoscreening were respectively constructed.
なお、 pCOSl 発現ベクターは、 HEF- PMh- g y l ( W092-19759参照 ) から、 EcoRI および Sinai消化によ り含有される遺伝子を削除し、 EcoRI-Notl-BamHI Adaptor (宝酒造） を連結することにより構築し た。  The pCOSl expression vector was constructed by deleting the genes contained by digestion with EcoRI and Sinai from HEF-PMh-gyl (see W092-19759) and ligating EcoRI-Notl-BamHI Adapter (Takara Shuzo). did.
3 ) Panning  3) Panning
ライブラ リー Aをエレク トロポレーシヨ ン法によ り COS- 7 細胞に 導入した。 すなわち、 20 μ § のプラスミ ド DNA (5X105 個の独立ク ローンを含む） を 0.8 mlの細胞 （ 1 X107 細胞/ ml in PBS ) と混 合し、 Gene Pulser (Bio— Rad) を用レヽて 1.5 kV、 25 μ Έ の条件 ίこて エレク トロポレーシヨ ンを行った。 室温にて 1 0分間清置した後、 細胞を 10°/。 FBS 添加 DMEM (GIBC0- BRL)に懸濁し 4枚の 100 mm培養デ ィ ッシュに分け 3 7 °Cにて 7 2時間培養した。 Library A was introduced into COS-7 cells by the electroporation method. That, 20 mu (including 5X10 5 independent clones) § of plasmid DNA were combined 0.8 ml of cells (1 X10 7 cells / ml in PBS) and mixed, Rere use a Gene Pulser (Bio- Rad) A 1.5 kV, 25 μΈ condition was used to perform an electroporation. After 10 minutes of incubation at room temperature, the cells are turned 10 ° /. The cells were suspended in DMEM (GIBC0-BRL) supplemented with FBS, divided into four 100 mm culture dishes, and cultured at 37 ° C for 72 hours.
培養後細胞をリ ン酸緩衝液 （PBS ) で洗浄し、 5 mM EDTA を含む PBS をカロえ細胞を录 (1力 Sし、 5 % FBS 、 0.02% NaN3添カロ PBS にて 1—2 X106 cells/ml の細胞懸濁液を調整した。 続いて細胞は抗 HM1.24抗 体をコーティ ングした panning プレー ト （後述） 上で 2時間清置し 、 プレー トを 5 % FBS 、 0.02% NaN3を含む 3 mlの PBS で穏やかに 3 回洗浄した。 洗浄後、 プレー ト上に結合した細胞から、 Hirtの溶液 (Hitt J.， Mol. Biol. 26 ： 365-369, 1983 ) (0.6% SDS 、 10mM E DTA ) を用いてプラスミ ド DNA を回収した。 回収したプラスミ ド DN A は大腸菌内で増幅し、 次の panning に使用した。 Panning プレー トの調製は次のよ うにして行った。 3 ml ¾HMl. 24抗体溶液 （lOii g/ml in 50mM Tris-HCl 、 pH 9.5) を 6 0 mmディ ッシュ （Falcon) に加え、 室温にて 2時間清置し、 0.15M NaClにて 3回洗浄した後、 3 mlの 5 % FBS 、 1 mM EDTA 、 0.02% NaN3添力 ΠΡΒ S を加え、 室温にて 2時間清置しブロ ッキングを行った。 ブロ ッキ ング溶液を除去した後 panning プレートは使用するまで- 20 °Cで保 存した。 After culturing, the cells are washed with a phosphate buffer (PBS), and the cells are washed with PBS containing 5 mM EDTA, and the cells are washed with 1% S, 5% FBS, 0.02% NaN 3 with 1-2% caro PBS. The cell suspension was prepared at X10 6 cells / ml, and the cells were incubated on a panning plate (described later) coated with anti-HM1.24 antibody for 2 hours, and the plate was washed with 5% FBS and 0.02%. The plate was washed gently three times with 3 ml of PBS containing 3% NaN 3. After washing, a Hirt solution (Hitt J., Mol. Biol. 26: 365-369, 1983) was collected from the cells bound on the plate. Plasmid DNA was recovered using 0.6% SDS, 10 mM EDTA. The recovered plasmid DNA was amplified in E. coli and used for the next panning. The panning plate was prepared as follows. Add 3 ml ¾HMl. 24 antibody solution (lOii g / ml in 50 mM Tris-HCl, pH 9.5) to a 60 mm dish (Falcon), clean for 2 hours at room temperature, and wash three times with 0.15 M NaCl After that, 3 ml of 5% FBS, 1 mM EDTA, and 0.02% NaN 3 were added, and the cells were settled at room temperature for 2 hours to perform blocking. After removing the blocking solution, the panning plate was stored at -20 ° C until use.
5 X105 個のクローンを含むプラスミ ドライブラリー （ライブラ リー A) を出発材料と して panning を 3回繰り返すこ とにより、 約 0.9kbPの cDNAをィンサート として持つプラスミ ド DNA が濃縮された 。 Dye Terminator Cycle sequencing Kit (Applied Biosystems ) を用 ヽて 373Aもしく ίま 377DNA Sequencer (Applied Biosystems) に より塩基配列の決定を行った結果、 クローン P3.19 は l，012bp の cD NAから成り、 180 アミ ノ酸をコードするオープンリーデングフ レー ム （23-549) を持つことが明らかとなった （図 6及び図 7 ) (配列 番号 ： 15) 。 この cDNAよ り予想されるアミ ノ酸配列はタイプ IIの膜 タンパクに特徴的な構造を示し、 2箇所の N型糖鎖結合部位を有し ていた。 By repeating panning three times using a plasmid library (library A) containing 5 × 10 5 clones as a starting material, plasmid DNA having a cDNA of about 0.9 kb P as an insert was enriched. The nucleotide sequence was determined using the Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) using the 373A or 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). As a result, clone P3.19 was composed of 1,012 bp cDNA, It was found to have an open reading frame (23-549) encoding an amino acid (FIGS. 6 and 7) (SEQ ID NO: 15). The amino acid sequence predicted from this cDNA showed a structure characteristic of the type II membrane protein, and had two N-type sugar chain binding sites.
4) 免疫ス ク リーニング  4) Immune screening
ライプラリー Bは抗 HM1.24抗体を用いた免疫スク リーニングに供 した。 すなわち、 1.5X105 個の独立クローンを含むファージライ ブラリーを大腸菌 NM522 (Pharmacia Biotech ) と共に寒天上に重 層し、 42でにて3.5 時間培養した。 培養後、 プレート上に 10mM IPT G で前処置したニ トロセノレロ ースフイノレター （Schleicher & Schue 11) を重ね、 さ らに 37°Cにて 3時間培養した。 Filterは 0.05% (v/v ) Tween-20添加 TBS (20mM Tris- HC1、 pH 7.4、 150 mM NaCl ) で洗 浄した後、 1 % (w/v) BSA 添加 TBS を加え、 室温にて 1時間イ ンキ ュベー ト してブロ ッキングを行った。 Library B was subjected to immunoscreening using anti-HM1.24 antibody. That is, a phage library containing 1.5 × 10 5 independent clones was overlaid on agar together with E. coli NM522 (Pharmacia Biotech), and cultured at 42 for 3.5 hours. After the cultivation, a nitrosenorrelose finole letter (Schleicher & Schue 11) pretreated with 10 mM IPTG was overlaid on the plate, and further cultured at 37 ° C for 3 hours. Filter was washed with TBS containing 0.05% (v / v) Tween-20 (20 mM Tris-HC1, pH 7.4, 150 mM NaCl), and then added 1% (w / v) TBS containing BSA and added at room temperature. Time ink And blocked.
ブロ ッキング後、 抗 HM1.24抗体溶液 （10 μ g/mlブロ ッキング緩衝 液） を加え、 室温にて 1時間イ ンキュベー ト し、 洗浄後 5,000 倍希 釈したアルカ リホスファターゼ結合抗マウス I g抗血清 （picoBlue Immunoscreening kit ； Stratagene) を力!]；^、 りに室温にて 1時 間インキュベート した。 抗体と反応したスポッ トは 0 . 3 mg/ml- ト ロブスレーテ トラゾリ ゥム、 0.15mg/ml 5 —ブロモー 4 一ク ロ ロー 3—イ ン ドリルホスフェー トを含む発色溶液 （lOOmM Tris-HCl、 pH 9.5 、 lOOmM NaCl、 5 mM MgCl2 ) にて発色させた。 After blocking, add anti-HM1.24 antibody solution (10 μg / ml blocking buffer), incubate at room temperature for 1 hour, wash and dilute 5,000-fold diluted alkaline phosphatase-conjugated anti-mouse Ig antibody Serum (picoBlue Immunoscreening kit; Stratagene) was used!]; ^, And incubated at room temperature for 1 hour. The spot that reacted with antibody 0 3 m g / ml- preparative Robusurete Torazori © beam, 0.15mg / ml 5 -. Bromo-4 Ichiku B row 3 Lee emission chromogenic solution containing indolyl phosphate (lOOmM Tris-HCl , PH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ).
免疫スク リ ーニングにより 5個の陽性クローンが単離され、 それ ら全てが P3.19 の部分配列と一致した （図 8 ) 。 ホモロジ一検索の 結果、 P3.19 は骨髄または滑膜ス ト ローマ細胞に発現する BST-2 ( Ishikawa J. ら、 Genomics, 26 ; 527 - 534， 1995 ) の塩基酉己列と同 一のものであることが明らかとなった。 二通りのスク リーニング法 によ り同一の分子が得られ、 P3.19 がコー ドする膜タンパクは HM1. 24抗原分子であることを強く示唆している。  Five positive clones were isolated by immunoscreening, all of which matched the partial sequence of P3.19 (Figure 8). As a result of homology search, P3.19 was identical to the base sequence of BST-2 (Ishikawa J. et al., Genomics, 26; 527-534, 1995) expressed in bone marrow or synovial stromal cells. It became clear that it was. The same molecule was obtained by the two screening methods, strongly suggesting that the membrane protein encoded by P3.19 is an HM1.24 antigen molecule.
なお、 前記ヒ ト HM1.24抗原タンパク質と同一の配列を有するヒ ト タンパク質をコー ドする DNA を pUC ベタターの Xbal切断部位間に挿 入したプラスミ ド pRS38- pUC19 を含有する大腸菌は Escherichia co li DH5 a (PRS38-pUC19 ) と命名され、 平成 5 (1993)年 10月 5 日 に工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つくば市東 1丁目 1 番 3号） に寄託番号 FERM BP- 4434と して、 ブダペス ト条約に基づき 国際寄託されている。 Escherichia coli DH5 is a plasmid containing the plasmid pRS38-pUC19 in which DNA encoding a human protein having the same sequence as the human HM1.24 antigen protein was inserted between the Xbal cleavage sites of pUC beta. a ( P RS38-pUC19), deposited with the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology (1-1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) on October 5, 1993, FERM BP-4434 It has been deposited internationally under the Budapest Treaty.
5 ) FACS解析 5) FACS analysis
さ らに、 P3.19 によってコー ドされるタンパクが確かに抗 HM1.24 抗体と結合するのかを確認するために、 P3.19 を導入した CH0 形質 転換細胞株を樹立した。 すなわち、 P3.19 ク ローンをエレク トロポ レーシ ヨ ン法によ り CHO 細胞に導入した後、 500 g/mlの G418 (GI BC0-BRL)の存在下で培養し、 HM1.24抗原発現 CH0 細胞株を得た。 Furthermore, in order to confirm whether the protein encoded by P3.19 binds to the anti-HM1.24 antibody, a CH0 transformed cell line transfected with P3.19 was established. In other words, P3.19 clone After being introduced into CHO cells by the ratioon method, the cells were cultured in the presence of 500 g / ml G418 (GIBC0-BRL) to obtain a HM1.24 antigen-expressing CH0 cell line.
1 X106 個の培養細胞を FACS緩衝液 （PBS (- )/2% FCS/0.1% NaN3 ) に懸濁し、 HM1.24抗体を添加し、 氷中で 3 0分間反応した。 FACS 緩衝液で洗浄後、 GAM- FITC溶液 （25/z g/ml in FACS緩衝液 ； Becton Dickinson) で再懸濁し、 さらに氷中で 3 0分間反応した。 FACS緩 衝液で 2回洗浄した後、 600 μ 1 の FACS緩衝液に再懸濁し FACScan (Becton Dickinson) にて測定した。 1 × 10 6 cultured cells were suspended in FACS buffer (PBS (−) / 2% FCS / 0.1% NaN 3 ), HM1.24 antibody was added, and the mixture was reacted on ice for 30 minutes. After washing with a FACS buffer, the cells were resuspended in a GAM-FITC solution (25 / zg / ml in FACS buffer; Becton Dickinson) and reacted on ice for 30 minutes. After washing twice with a FACS buffer, the cells were resuspended in 600 μl of FACS buffer and measured by FACScan (Becton Dickinson).
なお、 陰性対照抗体として UPC10 を用いた。  UPC10 was used as a negative control antibody.
FACS解析の結果、 P3.19 を導入した CH0 細胞は抗 HM1.24抗体と強 く反応したのに対し、 コ ン ト ロールの発現ベクターのみを導入した CH0 細胞 （CH0/NE0 ) では有意な結合は認められなかった （図 9 ) 。 したがって、 P3.19 によってコー ドされるタンパク質は抗 HM1.24 抗体と結合することが確認された。  As a result of FACS analysis, CH0 cells transfected with P3.19 strongly reacted with the anti-HM1.24 antibody, whereas CH0 cells transfected only with the control expression vector (CH0 / NE0) showed significant binding. Was not recognized (Fig. 9). Therefore, it was confirmed that the protein encoded by P3.19 binds to the anti-HM1.24 antibody.
6 ) 免疫沈降 6) Immunoprecipitation
細胞は PBS (-) で 2回洗浄した後、 細胞溶解緩衝法 （50mM萌酸ナ ト リ ウム、 150mM NaCl、 0.5%デォキシコール酸ナト リ ウム、 1 % No nidet P_40、 0. lmg/mlフエニノレメ チノレスノレホニノレフノレオリ ド、 プロ テアーゼ阻害斉 IJカクテニル 〔Boehringer Mannheim 〕 ) 内で超音波 破砕を行い、 可溶化画分を得た。 可溶化画分は抗 HM1.24抗体をコン ジュゲー トした Sepharose 4Bビーズに加えた。 遠心後、 沈殿物は SD S-PAGE (12% gel)によ り分離し、 PVDF膜に転写した。 PVDF膜は抗 HM 1.24抗体、 続レヽて POD-anti- mouse IgGと反応させた後、 ECL キッ ト (Amersham) を用いて検出を行った。  After washing the cells twice with PBS (-), the cell lysis buffer method (50 mM sodium folate, 150 mM NaCl, 0.5% sodium deoxycholate, 1% Nonidet P_40, 0.1 mg / ml phenylenomethine) Ultrasonic crushing was performed in lesnorefoninolefnoreolide and protease inhibitor IJ Cactenyl [Boehringer Mannheim]) to obtain a solubilized fraction. The solubilized fraction was added to Sepharose 4B beads conjugated with anti-HM1.24 antibody. After centrifugation, the precipitate was separated by SDS-PAGE (12% gel) and transferred to a PVDF membrane. The PVDF membrane was reacted with an anti-HM 1.24 antibody, followed by POD-anti-mouse IgG, and then detected using an ECL kit (Amersham).
KPMM2, RPMI8226 及び U266の各種ミエローマ細胞株は HM1.24抗原 を強く発現し、 これらの細胞溶解物を抗 HM1.24抗体で免疫沈降を行 う と、 分子量が約 29〜33kDa のタンパクが特異的に検出された （図 10) 。 P3. 19 を導入した CHO 細胞株 （CHO/HM) においても同様の実 験を行った結果、 CH0/HM細胞においてもミェローマ細胞株と同様に 免疫沈降物が確認され （図 10、 レーン 4 ) 、 発現ベクター pCOSl の みを導入したコントロール細胞 （CH0/NE0 ) ではそのような免疫沈 降物は確認されなかった （図 10、 レーン 5 ) 。 KPMM2, RPMI8226, and U266 various myeloma cell lines strongly express HM1.24 antigen, and immunoprecipitation of these cell lysates with anti-HM1.24 antibody shows that proteins with a molecular weight of approximately 29 to 33 kDa are specific. (Figure Ten) . Similar experiments were performed on the CHO cell line (CHO / HM) transfected with P3.19. As a result, immunoprecipitates were confirmed on the CH0 / HM cells as well as on the myeloma cell line (Fig. 10, lane 4). On the other hand, no such immunoprecipitates were found in control cells (CH0 / NE0) into which only the expression vector pCOSl was introduced (FIG. 10, lane 5).
P3. 19 は 180 アミ ノ酸からなる推定分子量 19. 8kDa のタンパクを コー ドしており、 2力所の N型糖鎖結合モチーフが存在している （ 図 6 ) 。 従って、 免疫沈降により認められた分子量の異なったもの の存在は、 N型糖鎖の修飾の違いによることが考えられた。 事実、 免疫沈降物が数種のレクチンと結合することが確認されている。 産業上の利用可能性  P3.19 encodes a protein consisting of 180 amino acids with an estimated molecular weight of 19.8 kDa, and has two N-type sugar chain binding motifs (Fig. 6). Therefore, it was considered that the presence of those having different molecular weights observed by immunoprecipitation was due to differences in N-glycan modification. In fact, immunoprecipitates have been found to bind to several lectins. Industrial applicability
丽 1. 24抗原高産生株を樹立し得たため、 2 L という培養上清から 16 mg の精製抗原を得ることが出来た。 精製抗原を用いた ELI SA 系 を確立したため、 培養上清を用いた ELI SA 系と比較して 4 °Cでー晚 インキュベートする必要はなくなり、 室温で 1時間反応させればよ く、 反応時間の短縮が行えた。 また、 培養上清に含まれる成分によ る ELI SA 系への関与もなくなり、 血清中の投与した抗 HM1. 24抗体の 濃度測定系としても安定して利用できる。  丽 1. Since a high-producing strain of 24 antigen was established, 16 mg of purified antigen could be obtained from 2 L of the culture supernatant. Since the ELI SA system using the purified antigen was established, there was no need to incubate at 4 ° C compared to the ELI SA system using the culture supernatant. Was shortened. In addition, the components contained in the culture supernatant are not involved in the ELISA system, and can be used stably as a system for measuring the concentration of anti-HM1.24 antibody administered in serum.
P C T規則第 1 3規則の 2に規定する寄託された微生物への言及 及び国際寄託当局  References to the deposited microorganisms as provided for in Rule 13-2 of the PCT Regulations and the International Depositary Authority
国際寄託当局  International Depositary Authority
名 称 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター あて名 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6  Name National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Center Address 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan 1 Central No. 6
( 1 ) 名 称 Es cher i chia co l i DH5 a ( pRS38- PUC19 ) (1) Name Escher i chia co li DH5a (pRS38- P UC19)
寄託番号 FERM BP-4434  Deposit number FERM BP-4434
寄 託 日 1993年 10月 5 日 ( 2 ) 名 称 Mouse-mouse hybridoma HMl.24 Date of deposit: October 5, 1993 (2) Name Mouse-mouse hybridoma HMl.24
寄託番号 FERM BP - 5233  Deposit number FERM BP-5233
寄 託 日 1995年 9月 14日  Deposit date September 14, 1995
( 3 ) 名 称 Escherichia coli DH5 a (pUC19-RVHr-AHM-g 71) 寄託番号 FERM BP-5643 (3) Name Escherichia coli DH5 a (pUC19-RVHr -AHM-g 7 1) accession number FERM BP-5643
寄 託 日 1996年 8月 29曰  Deposit date August 29, 1996
( 4 ) 名 称 Escherichia coli DH5ひ (pU19-l.24H-g γ 1)  (4) Name Escherichia coli DH5 (pU19-l.24H-gγ1)
寄託番号 FERM BP - 5644  Deposit number FERM BP-5644
寄 託 日 1996年 8月 29日  Deposit date Aug 29, 1996
( 5 ) 名 称 Escherichia coli DH5 a (pUC19-RVLa-AHM-gk) 寄託番号 FERM BP - 5645  (5) Name Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLa-AHM-gk) Deposit number FERM BP-5645
寄 託 日 1996年 8月 29日  Deposit date Aug 29, 1996
( 6 ) 名 称 Escherichia coli DH5ひ (pUC19-l.24L-gk)  (6) Name Escherichia coli DH5 (pUC19-l.24L-gk)
寄託番号 FERM BP - 5646  Deposit number FERM BP-5646
寄 託 日 1996年 8月 29日  Deposit date Aug 29, 1996
( 7 ) 名 称 Escherichia coli DH5 a (pUC19- RVHs- AHM-g γ 1 ) 寄託番号 FERM BP - 6127  (7) Name Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gγ1) accession number FERM BP-6127
寄 託 日 1997年 9月 29日  Deposit date September 29, 1997

Claims

請 求 の 範 囲 The scope of the claims
1 . EF1 αプロモーターと、 その下流に連結された、 細胞内 ドメ インを欠く可溶性 HM1. 24抗原をコー ドする遺伝子とを含んで成る発 現べクターにより形質転換された動物細胞を培養し、 そして培養物 から可溶性 HM1. 24抗原単離 · 精製することを特徴とする可溶性 HM1. 24抗原細胞外ドメインの製造方法。 1. culturing animal cells transformed by an expression vector comprising the EF1α promoter and a gene linked downstream thereof, which encodes a soluble HM1.24 antigen lacking an intracellular domain, A method for producing a soluble HM1.24 antigen extracellular domain, comprising isolating and purifying a soluble HM1.24 antigen from a culture.
2 . 前記可溶性 HM1. 24抗原が配列番号 ： 5又は 16に示すアミ ノ酸 配列を有する、 請求項 1 に記載の方法。  2. The method according to claim 1, wherein the soluble HM1.24 antigen has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 16.
3 . 前記可溶性 HM1. 24抗原が配列番号 ： 7又は 17に示すアミ ノ酸 配列を有する、 請求項 1 に記載の方法。  3. The method according to claim 1, wherein the soluble HM1.24 antigen has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 17.
4 . 前記可溶性 HM1. 24抗原がイ ンフルエンザ凝集素 （ΗΑ) との融 合蛋白質の形である請求項 1 に記載の方法。  4. The method according to claim 1, wherein the soluble HM1.24 antigen is in the form of a fusion protein with influenza agglutinin (II).
5 . 前記融合蛋白質が配列番号 ： 10又は 18に記載のァミノ酸配列 を有する、 請求項 4に記載の方法。  5. The method according to claim 4, wherein the fusion protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 18.
6 . 前記融合蛋白質が配列番号 ： 11又は 19に記載のァミノ酸配列 を有する、 請求項 4に記載の方法。  6. The method according to claim 4, wherein the fusion protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or 19.
7 . 前記動物細胞が CH0 細胞である、 請求項 1〜 6のいずれか 1 項に記載の方法。  7. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the animal cell is a CH0 cell.
8 . 形質転換された動物細胞が 100 nmo l/Lの濃度のメ ト ト レキセ ート （MTX ) の存在下に遺伝子増幅を行ったものである、 請求項 1 〜 7のいずれか 1項に記載の方法。  8. The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the transformed animal cells have been subjected to gene amplification in the presence of methotrexate (MTX) at a concentration of 100 nmol / L. The described method.
9 . 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の方法によ り製造された 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質と被験試料中に含まれる抗 HM1. 24抗体 とを反応させて、 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質に結合した抗 HM1. 24 抗体を検出又は測定する工程を含む、 抗 HM1. 24抗体の免疫化学的測 定方法。 9. The soluble HM1.24 antigen protein produced by the method according to any one of claims 1 to 8 is reacted with an anti-HM1.24 antibody contained in a test sample to obtain a soluble HM1.24 antibody. A method for immunochemically measuring an anti-HM1.24 antibody, comprising a step of detecting or measuring an anti-HM1.24 antibody bound to an antigen protein.
10. 前記可溶性 HM1. 24抗原タンパク質が、 支持体と結合している ことを特徴とする、 請求項 1に記載の免疫化学的測定方法。 10. The immunochemical measurement method according to claim 1, wherein the soluble HM1.24 antigen protein is bound to a support.
11. 前記可溶性 HM1. 24抗原タンパク質が、 他のペプチド又はポリ ぺプチドと融合していることを特徴とする、 請求項 9又は 10に記载 の免疫化学的測定方法。  11. The immunochemical measurement method according to claim 9, wherein the soluble HM1.24 antigen protein is fused with another peptide or polypeptide.
12. 支持体がビーズ又はプレートであるこ とを特徴とする、 請求 項 10に記載の免疫化学的測定方法。  12. The immunochemical measurement method according to claim 10, wherein the support is a bead or a plate.
13. 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質に結合した抗 HM1. 24抗体又は抗 HM1. 24抗体に結合した可溶性 HM1. 24抗原タンパク質を、 抗 HM1. 24抗 体に対する一次抗体又は可溶性 HM1. 24抗原タンパク質に対する一次 抗体によ り検出又は測定することを特徴とする請求項 9〜12のいず れか 1項に記載の免疫化学的測定方法。  13. Anti-HM1.24 antibody bound to soluble HM1.24 antigen protein or soluble HM1.24 antigen protein bound to anti-HM1.24 antibody is converted to primary antibody or soluble HM1.24 antigen protein against anti-HM1.24 antibody. The immunochemical measurement method according to any one of claims 9 to 12, wherein detection or measurement is performed using a primary antibody.
14. 可溶性 HM1. 24抗原タンパク質に結合した抗 HM1. 24抗体又は抗 HM1. 24抗体に結合した可溶性 HM1. 24抗原タンパク質を、 抗 HM1. 24抗 体に対する一次抗体又は可溶性 HM1. 24抗原タンパク質に対する一次 抗体及び該一次抗体に対する二次抗体によ り検出又は測定すること を特徴とする請求項 9〜 12のいずれか 1項に記載の免疫化学的測定 方法。  14. Anti-HM1.24 antibody bound to soluble HM1.24 antigen protein or soluble HM1.24 antigen protein bound to anti-HM1.24 antibody is converted to primary antibody or soluble HM1.24 antigen protein against anti-HM1.24 antibody. The immunochemical measurement method according to any one of claims 9 to 12, wherein detection or measurement is performed using a primary antibody and a secondary antibody against the primary antibody.
15. 一次抗体又は二次抗体が放射性同位元素、 酵素、 ピオチン/ アビジン又は蛍光物質によ り標識されていることを特徴とする請求 項 9〜14のいずれか 1項に記載の免疫化学的測定方法。  15. The immunochemical assay according to any one of claims 9 to 14, wherein the primary antibody or the secondary antibody is labeled with a radioisotope, an enzyme, biotin / avidin, or a fluorescent substance. Method.
16. 請求項 9〜15に記載の方法を用いる品質管理方法。  16. A quality control method using the method according to claims 9 to 15.
17. 請求項 16に記載の品質管理方法によって品質を管理された抗 HM1. 24抗体。  17. An anti-HM1.24 antibody whose quality is controlled by the quality control method according to claim 16.
18. 請求項 17に記載の抗 HM1. 24抗体を有効成分と して含有する医 薬組成物。 - 18. A pharmaceutical composition comprising the anti-HM1.24 antibody according to claim 17 as an active ingredient. -
19. 請求項 16に記載の品質管理方法を含む、 抗 HM1. 24抗体の製造 方法。 19. Production of an anti-HM1.24 antibody, including the quality control method according to claim 16. Method.
20. 請求項 16に記載の品質管理方法を含む、 抗 HM1. 24抗体を有効 成分として含有する医薬組成物の製造方法。  20. A method for producing a pharmaceutical composition comprising the anti-HM1.24 antibody as an active ingredient, comprising the quality control method according to claim 16.
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