TWI429897B - 複數三倍頻顯微鏡系統及方法 - Google Patents
複數三倍頻顯微鏡系統及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI429897B TWI429897B TW99139177A TW99139177A TWI429897B TW I429897 B TWI429897 B TW I429897B TW 99139177 A TW99139177 A TW 99139177A TW 99139177 A TW99139177 A TW 99139177A TW I429897 B TWI429897 B TW I429897B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- triple frequency
- triple
- laser
- frequency
- complex
- Prior art date
Links
Description
本發明係關於一種複數三倍頻顯微鏡系統與方法，尤指一種應用在活體生物分子及醫學工程三倍頻顯微鏡系統與方法者。
三倍頻(third harmonic generation)由於具有無光傷害性、無光漂白、高穿透深度以及次微米的解析度等優點，因此自1996年以來已經被廣泛的應用在生物影像的研究上，台灣發明專利公告第581863號中的倍頻顯微術是利用三倍頻結合二倍頻且無螢光的顯微系統，強調生物醫學的應用。在D.S.Stoker,J.W.Keto,J.Baek,M.F.Becker,and J.Ma,“Resonant frequency-domain interferometry via third-harmonic generation,”Optics Letters 32,1265-1267(2007)的論文中，三倍頻也被應用在光譜學上來瞭解材料或生物分子的解構和特性。但是對於生物分子影像來說，這些研究多少都有一些不足的地方，因為目前三倍頻的顯微系統只提供單一波長之倍頻影像，也就是量測三倍頻的強度，並將此強度匯集(mapping)成影像，因此只知道生物細胞與組織狀況。而目前將三倍頻應用在光譜學的研究是直接調變一個雷射光源的波長來得到三倍頻的頻譜，但此方法卻無法提供空間分布相關資訊，也無多數同時三倍頻影像功能。
本發明的主要目的是提供一種複數三倍頻顯微鏡系統，利用多個不同波長的雷射光源或一寬頻光源，同時分析不同波長之三倍頻反應，同時得到材料或生物組織的多數三倍頻影像和光譜，以取得分子功能影像，適用於提供臨床醫學三倍頻顯微
術之分子影像能力。
本發明的另一目的是提供一種複數三倍頻顯微系統，包含有：一雷射裝置，用於發射複數不同波長的雷射光束；一顯微鏡裝置，用於接收該雷射光束，並將該複數不同波長的雷射光束投射至一觀察樣本上，而產生複數不同波長的三倍頻觀察光束；一分光裝置，用於將該觀察光束分光成一第一三倍頻部份及一第二三倍頻部份；以及光偵測裝置，用於分別偵測該第一三倍頻部份及該第二三倍頻部份而轉換成一第一三倍頻影像訊號或第一三倍頻光譜訊號及一第二三倍頻影像訊號或第二三倍頻光譜訊號。
根據本發明之複數三倍頻影像顯微系統，該光偵測裝置用於分別偵測該第一三倍頻部份及該第二三倍頻部份而同時轉換成一第一三倍頻影像訊號或第一三倍頻光譜訊號及一第二三倍頻影像訊號或第二三倍頻光譜訊號。
根據本發明之複數三倍頻影像顯微系統，該光偵測裝置用於另進一步偵測該第三三倍頻部份或更多三倍頻部份而同時轉換成一第三三倍頻影像訊號或第三三倍頻光譜訊號或更多種三倍頻影像訊號或更多種三倍頻光譜訊號。
根據本發明之複數三倍頻影像顯微系統，其另包含有一電腦系統及影像處理軟體，用於接收該第一三倍頻影像訊號或第一三倍頻光譜訊號及該第二三倍頻影像訊號或第二三倍頻光譜訊號，以同時處理該觀察樣本的一第一三倍頻影像或第一三倍頻光譜及一第二三倍頻影像或第二三倍頻光譜。
根據本發明之複數三倍頻顯微系統，較佳的該雷射裝置是單一台雷射，用於產生一個寬頻的短脈衝雷射光源。
根據本發明之複數三倍頻顯微系統，較佳的該雷射裝置是一台短脈衝雷射，打入光纖或非線性材料，以產生寬頻或複數不同波長的雷射光束。
根據本發明之複數三倍頻顯微系統，較佳的該雷射裝置包
含有複數台不同中心波長之短脈衝雷射。
根據本發明之複數三倍頻顯微系統，較佳的光偵測裝置包含有複數光偵測器。
根據本發明之複數三倍頻顯微系統，較佳的該光偵測裝置包含一頻譜儀(spectrometer)。
根據本發明之複數三倍頻顯微系統，較佳的該顯微鏡裝置包含有：一用於將該雷射光束掃描之掃描系統(scanning system)；一接收該掃描過的雷射光束及反射之反射鏡(mirror)；及一用於將已反射過的雷射光束聚焦之物鏡(objective)，以將雷射光束打在樣本上。
根據本發明之複數三倍頻顯微系統，較佳的該分光裝置是二色分光鏡(dichroic beamsplitter)。
本發明的又一目的是提供一種複數三倍頻顯微方法，包含有列步驟：提供一雷射裝置，以發射出複數不同波長的雷射光束；利用一顯微鏡裝置將該雷射光束投射至一觀察樣本上，以產生一複數不同波長的三倍頻觀察光束，該觀察光束包含有一第一波長的三倍頻光及一第二波長的三倍頻光；將該第一波長的三倍頻光及該第二波長的三倍頻光分離開；將該第一波長的三倍頻光及該第二波長的三倍頻光分別轉換成對應的第一電氣訊號及第二電氣訊號；處理該第一電氣訊號及第二電氣訊號，以同時形成觀察樣本的複數三倍頻影像和三倍頻光譜。
根據本發明之複數三倍頻顯微方法，其中，該三倍頻光束另包含有一第三波長或更多種波長的三倍頻光，以分別轉換成對應的第三電氣訊號或更多種的電氣訊號。
根據本發明之複數三倍頻顯微方法，較佳的該雷射裝置是單一台雷射，用於產生一個寬頻的短脈衝雷射光源。
根據本發明之複數三倍頻顯微方法，較佳的該雷射裝置是
一台短脈衝雷射，打入光纖或非線性材料，以產生寬頻或複數不同波長的雷射光束。
根據本發明之複數三倍頻顯微方法，較佳的該雷射裝置包含有複數台不同中心波長之短脈衝雷射。
下文將配合圖式，針對本發明之複數三倍頻顯微系統具體實例加以說明。
請參閱第1圖，第1圖顯示出本發明之第一具體實例的複數三倍頻顯微系統，此系統10包含有一掃描裝置112，其可自一雷射裝置或雷射光源114接收一束雷射光束116。掃描裝置112內為能產生二維掃描雷射光束的功能，例如為設置有旋轉的二維鏡組(未顯示)，而將該束雷射光束導引至一反射鏡113後，將雷射光束反射導引至二色分光鏡126，再往下射入顯微鏡裝置(未顯示)，此顯微鏡裝置含有一物鏡122，之後，將該束雷射光束被物鏡122聚焦而照射在觀察樣本120上產生三倍頻信號。由此反向射入物鏡122的三倍頻光束116’，射向二色分光鏡126被分光後射入透鏡128，三倍頻光束116’被頻譜儀132處理而利用例如光偵測器將三倍頻光的訊號轉換成類比電氣訊號後再用電氣放大器放大，再利用類比數位轉換器Analog/Digital converter將類比訊號轉換成數位影像訊號或光譜訊號，傳輸至電腦系統140產生複數個不同波長的三倍頻影像訊號或三倍頻光譜，並顯示該複數個不同波長的三倍頻影像或三倍頻光譜。此第1圖為背向(backward)收集的收集方式。
請參閱第2圖，第2圖顯示出本發明之第二具體實例的複數三倍頻顯微系統20，此系統20包含有一掃描裝置212，其可自一雷射裝置或雷射光源214接收一束雷射光束216。掃描裝置212內為能產生二維掃描雷射光束的功能，例如為設置有旋轉的二維鏡組(未顯示)，而將該束雷射光束導引至一反射鏡2131後，將雷射光束216導引至顯微鏡裝置(未顯示)，此顯微
鏡裝置含有一物鏡222，之後，將該束雷射光束被物鏡222聚焦而照射在觀察樣本220上產生三倍頻信號。而後所收集的三倍頻光束216’經過反射鏡2132反射，通過濾光片229，經過透鏡228，再導入至頻譜儀232，利用例如光偵測器將三倍頻光的訊號轉換成類比電氣訊號，經過放大器放大後，再利用類比數位轉換器Analog/Digital converter將類比電氣訊號轉換成數位影像訊號或光譜訊號，傳輸至電腦系統240顯示該複數個不同波長的三倍頻影像或三倍頻光譜。此第2圖為正向(forward)收集的收集方式。
請參閱第3圖，第3圖顯示出本發明之第三具體實例的複數三倍頻顯微系統，此系統30包含有一掃描裝置312，其可自一三倍頻雷射裝置或三倍頻雷射光源314接收一束雷射光束316。掃描裝置312內為能產生二維掃描雷射光束的功能，例如為設置有旋轉的二維鏡組(未顯示)，而將該束雷射光束導引至一反射鏡3131後，將雷射光束反射導引至二色分光鏡3261，再往下射入顯微鏡裝置(未顯示)，此顯微鏡裝置含有一物鏡322，之後，將該束雷射光束被物鏡322聚焦而照射在觀察樣本320上產生三倍頻信號。由此反向射入物鏡322的三倍頻光束316’，射向二色分光鏡3261被分光後射入透鏡328，接著，射向二色分光鏡3262被分光後，向下的三倍頻光束經過干涉濾光片3311，再照射在光偵測器3301，將三倍頻光的訊號轉換成類比電氣訊號，經過放大器放大後，再利用類比數位轉換器Analog/Digital converter將類比訊號轉換成數位影像訊號或數位光譜訊號，傳輸至電腦系統340顯示該第一波長的三倍頻影像或三倍頻光譜，向左的三倍頻光束經過干涉濾光片3312，再照射在光偵測器3302，將三倍頻光的訊號轉換成類比電氣訊號，經過放大器放大後，再利用類比數位轉換器Analog/Digital converter將類比訊號轉換成數位影像訊號或三倍頻光譜訊號，傳輸至電腦系統340顯示該第二波長的三倍頻影像或三倍頻光譜。此第3圖為背向(backward)收集的收集方
式。
請參閱第4圖，第4圖顯示出本發明之第四具體實例的複數三倍頻顯微系統，此系統40包含有一掃描裝置412，其可自一雷射裝置或雷射光源414接收一束雷射光束416。掃描裝置412內為能產生二維掃描雷射光束的功能，例如為設置有旋轉的二維鏡組(未顯示)，而將該束雷射光束導引至一反射鏡4131後，再往下射入顯微鏡裝置(未顯示)，此顯微鏡裝置含有一物鏡422，之後，將該束雷射光束被物鏡422聚焦而照射在觀察樣本420上產生三倍頻信號。由此向下的三倍頻光束經過光束收集裝置424收集至反射鏡4132反射，經過濾光片429，再射經透鏡428，接著，射向二色分光鏡4261被分光後，向上射入干涉濾光片4311，再照射在光偵測器4301，將三倍頻光的訊號轉換成類比電氣訊號，經過放大器放大後，再利用類比數位轉換器Analog/Digital converter將類比訊號轉換成數位影像訊號或光譜訊號，傳輸至電腦系統440顯示該第一波長的三倍頻影像或三倍頻光譜，向左的三倍頻光束經過干涉濾光片4312，再照射在光偵測器4302，將三倍頻光的訊號轉換成類比訊號，經過放大器放大後再利用類比數位轉換器Analog/Digital converter將類比訊號轉換成數位影像訊號或光譜訊號，傳輸至電腦系統440顯示該第二波長的三倍頻影像或三倍頻光譜。此第4圖為正向(forward)收集的收集方式。
本發明的雷射裝置或雷射光源114,214,314,414可為一台雷射輸出裝置，例如，由單一台雷射產生一個寬頻的短脈衝雷射光源即可得到多波長的光束，此光束如第5圖中較大頻寬者，或者利用一台短脈衝雷射打入光纖或其他非線性材料，以利用非線性效應產生兩個或兩個以上具有不同中心波長之短脈衝雷射光源，如第5圖中兩個中心波長的短脈衝光源；雷射光源114,214,314,414可為多台雷射輸出裝置，利用多台不同中心波長之短脈衝雷射作為多波長雷射光源。雷射光源可為揭露於1.2-to 2.2-μm Tunable Raman Soliton Source Based on a
Cr：Forsterite Laser and a Photonic-Crystal Fiber,IEEE PHOTONICS TECHNOLOGY LETTERS,VOL.20,NO.11,JUNE 1,2008。
本發明的光偵測器可為任何種類感測雷射光的光偵測器，例如，光電倍增管(photomultiplier tube)光偵測器(photodetector)。
本發明的光偵測器的數目不限於兩個，亦可設置三個或三個以上的光偵測器，用於偵測三種或三種以上的不同波長的三倍頻光。
在顯微鏡裝置內可檢視分子影像，此優勢也更便利了在非侵入式臨床醫學生物分子影像的活體應用，例如，人體組織內微血管內紅血球流動的情況，可以觀察紅色含氧血紅素(oxyhemoglobin)與暗色缺氧血紅素(deoxyhemoglobin)的分佈顯微影像情況。
本發明的電腦系統140,240,340,440係為任何型式的個人電腦，筆記型電腦，小筆電等。本發明影像處理軟體是可以為任何三倍頻影像處理軟體，例如，Olympus的Fluoview 300。
本發明的複數三倍頻顯微方法亦可包含有掃描的步驟，可以針對樣本的某一深度用三倍頻光束進行二維平面式的掃描及造影，以非侵入式地取得複數個不同波長三倍頻影像及三倍頻光譜。
本發明的優點在於本發明所提供的非侵入式多波長三倍頻顯微系統，搭配同時產生的不同波長三倍頻的頻譜分析，可以藉此得到生物分子的分佈顯微影像與特性。
112,212,312,412‧‧‧掃描系統
113,2131,2132,3131,4131,4132‧‧‧反射鏡
114,214,314,414‧‧‧雷射裝置
120,220,320,420‧‧‧觀察樣本
122,222,322,422‧‧‧物鏡
126,3261,3262,4261‧‧‧二色分光鏡
128,228,328,428‧‧‧透鏡
229,429‧‧‧濾光片
132,232‧‧‧頻譜儀
3301,3311,4311,4312‧‧‧干涉濾光片
3301,3302,4301,4302‧‧‧光偵測器
140,240,340,440‧‧‧電腦系統
第1圖顯示出本發明之第一具體實例的複數三倍頻顯微系統。
第2圖顯示出本發明之第二具體實例的複數三倍頻顯微系統。
第3圖顯示出本發明之第三具體實例的複數三倍頻顯微系統。
第4圖顯示出本發明之第四具體實例的複數三倍頻顯微系統。
第5圖顯示出本發明之雷射光源的波長強度函數圖。
412‧‧‧掃描系統
4131,4132‧‧‧反射鏡
414‧‧‧雷射裝置
416‧‧‧雷射光束
420‧‧‧觀察樣本
422‧‧‧物鏡
4261‧‧‧二色分光鏡
4311,4312‧‧‧干涉濾光片
4301,4302‧‧‧光偵測器
440‧‧‧電腦系統
Claims (16)
- 一種複數三倍頻顯微系統，包含有：一雷射裝置，用於發射複數不同波長的雷射光束；一顯微鏡裝置，用於接收該雷射光束，並將該複數不同波長的雷射光束投射至一觀察樣本上，而產生複數不同波長的三倍頻觀察光束；一分光裝置，用於將該複數不同波長的三倍頻觀察光束分光成一第一三倍頻部份及一第二三倍頻部份；以及光偵測裝置，用於分別偵測該第一三倍頻部份及該第二三倍頻部份而轉換成一第一三倍頻影像訊號或第一三倍頻光譜訊號及一第二三倍頻影像訊號或第二三倍頻光譜訊號。
- 如申請專利範圍第1項所述之複數三倍頻顯微系統，其中，該光偵測裝置用於分別偵測該第一三倍頻部份及該第二三倍頻部份而同時轉換成一第一三倍頻影像訊號或第一三倍頻光譜訊號及一第二三倍頻影像訊號或第二三倍頻光譜訊號。
- 如申請專利範圍第1項所述之複數三倍頻顯微系統，其中，該光偵測裝置用於另進一步偵測一第三三倍頻部份或更多種三倍頻部份而同時轉換成一第三三倍頻影像訊號或第三三倍頻光譜訊號或更多種三倍頻影像訊號或更多種三倍頻光譜訊號。
- 如申請專利範圍第1項所述之複數三倍頻顯微系統，其另包含有一電腦系統及影像處理軟體，用於接收該第一三倍頻影像訊號或第一三倍頻光譜訊號及該第二三倍頻影像訊號或第二三倍頻光譜訊號，以同時處理該觀察樣本的一第一三倍頻影像或第一三倍頻光譜及一第二三倍頻影像或第二三倍頻光譜。
- 如申請專利範圍第1項所述之複數三倍頻顯微系統，其中，該雷射裝置是單一台雷射，用於產生一個寬頻的短脈衝雷射光源。
- 如申請專利範圍第1項所述之複數三倍頻顯微系統，其中，該雷射裝置是一台短脈衝雷射，打入光纖或非線性材料，以產生寬頻或複數不同波長的雷射光束。
- 如申請專利範圍第1項所述之複數三倍頻顯微系統，其中，該雷 射裝置包含有複數台不同中心波長之短脈衝雷射。
- 如申請專利範圍第1項所述之複數三倍頻顯微系統，其中，該光偵測裝置包含有複數光電倍增管光偵測器。
- 如申請專利範圍第1項所述之複數三倍頻顯微系統，其中，該光偵測裝置包含一頻譜儀(spectrometer)。
- 如申請專利範圍第1項所述之複數三倍頻顯微系統，其中，該顯微鏡裝置包含有：一用於將該雷射光束掃描之掃描系統(scanning system)；一接收該掃描過的雷射光束及反射之反射鏡(mirror)；及一用於將已反射過的雷射光束聚焦之物鏡(objective)，以將雷射光束打在樣本上。
- 如申請專利範圍第1項所述之複數三倍頻顯微系統，其中，該分光裝置是一二色分光鏡(dichroic beamsplitter)。
- 一種複數三倍頻顯微方法，包含有下列步驟：提供一雷射裝置，以發射出複數不同波長的雷射光束；利用一顯微鏡裝置將該雷射光束投射至一觀察樣本上，以產生複數不同波長的三倍頻光束，該三倍頻光束包含有一第一波長的三倍頻光及一第二波長的三倍頻光；將該第一波長的三倍頻光及該第二波長的三倍頻光分離開；將該第一波長的三倍頻光及該第二波長的三倍頻光分別轉換成對應的第一電氣訊號及第二電氣訊號；處理該第一電氣訊號及第二電氣訊號，以同時形成觀察樣本的複數三倍頻影像或複數三倍頻光譜。
- 如申請專利範圍第12項所述之複數三倍頻顯微方法，其中，該三倍頻光束另包含有一第三波長或更多種波長的三倍頻光，以分別轉換成對應的第三電氣訊號或更多種的電氣訊號。
- 如申請專利範圍第12項所述之複數三倍頻顯微方法，其中，該雷射裝置是單一台雷射，用於產生一個寬頻的短脈衝雷射光源。
- 如申請專利範圍第12項所述之複數三倍頻顯微方法，其中，該雷射裝置是一台短脈衝雷射，打入光纖或非線性材料，以產生 寬頻或複數不同波長的雷射光束。
- 如申請專利範圍第12項所述之複數三倍頻顯微方法，其中，該雷射裝置包含有複數台不同中心波長之短脈衝雷射。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW99139177A TWI429897B (zh) | 2010-11-15 | 2010-11-15 | 複數三倍頻顯微鏡系統及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW99139177A TWI429897B (zh) | 2010-11-15 | 2010-11-15 | 複數三倍頻顯微鏡系統及方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201219774A TW201219774A (en) | 2012-05-16 |
| TWI429897B true TWI429897B (zh) | 2014-03-11 |
Family
ID=46552963
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW99139177A TWI429897B (zh) | 2010-11-15 | 2010-11-15 | 複數三倍頻顯微鏡系統及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI429897B (zh) |
-
2010
- 2010-11-15 TW TW99139177A patent/TWI429897B/zh active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201219774A (en) | 2012-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9835840B2 (en) | Methods for optical amplified imaging using a two-dimensional spectral brush | |
| US8553209B2 (en) | Three-dimensional optical coherence tomography confocal imaging apparatus | |
| US8565861B2 (en) | Optical inspection device, electromagnetic wave detection method, electromagnetic wave detection device, organism observation method, microscope, endoscope, and optical tomographic image generation device | |
| EP2304411B1 (en) | Method and device for optically examining the interior of turbid media | |
| US5293872A (en) | Method for distinguishing between calcified atherosclerotic tissue and fibrous atherosclerotic tissue or normal cardiovascular tissue using Raman spectroscopy | |
| KR100962522B1 (ko) | 3색 광원을 이용하는 멀티플렉스 ｃａｒｓ 분광장치 | |
| US6879394B2 (en) | Multi-photon imaging installation | |
| KR100352689B1 (ko) | 동기 발광 시스템 | |
| US7817267B2 (en) | System and method for confocal multispectral scanning | |
| US8190242B2 (en) | Portable laser synthesizer for high-speed multi-dimensional spectroscopy | |
| CN106092986B (zh) | 脑组织的无标记高分辨成像系统 | |
| Zhou et al. | Multispectral fluorescence lifetime imaging device with a silicon avalanche photodetector | |
| US8941087B2 (en) | Plural third harmonic generation microscopic system and method | |
| JP2015006437A (ja) | メチレンブルーに基づいた、ファイバーによる蛍光顕微鏡法 | |
| TWI429897B (zh) | 複數三倍頻顯微鏡系統及方法 | |
| KR101603726B1 (ko) | 멀티모달 현미경 | |
| Weinigel et al. | A novel flexible clinical multiphoton tomograph for early melanoma detection, skin analysis, testing of anti-age products, and in situ nanoparticle tracking | |
| JPWO2009133734A1 (ja) | 光学的検査装置、電磁波検出方法、電磁波検出装置、生態観察方法、顕微鏡、および、内視鏡並びに光断層画像生成装置 | |
| CN212514263U (zh) | 高光谱成像显微镜 | |
| JP2019090767A (ja) | 光測定装置 | |
| Ly et al. | Time-gated single photon counting enables separation of CARS microscopy data from multiphoton-excited tissue autofluorescence | |
| WO2022224489A1 (ja) | 試料観察装置及び試料観察方法 | |
| US20240142375A1 (en) | Sample observation device and sample observation method | |
| Huttunen et al. | Fast tissue investigation using label-free point-and angle-scanning widefield multiphoton microscopies | |
| Strupler et al. | Spectrally encoded fluorescence imaging based on a wavelength-swept source |