RU2423520C1 - Hemorrhagic fever and renal syndrome causal virus strain for preparing vaccine preparations (versions) - Google Patents
Hemorrhagic fever and renal syndrome causal virus strain for preparing vaccine preparations (versions) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2423520C1 RU2423520C1 RU2009149041/10A RU2009149041A RU2423520C1 RU 2423520 C1 RU2423520 C1 RU 2423520C1 RU 2009149041/10 A RU2009149041/10 A RU 2009149041/10A RU 2009149041 A RU2009149041 A RU 2009149041A RU 2423520 C1 RU2423520 C1 RU 2423520C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vero
- virus
- strains
- cells
- tkd
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к области вирусологии, в частности к получению штаммов-продуцентов, предназначенных для вакцинопрофилактики вирусных инфекций, а именно инфекции геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Возбудителями ГЛПС являются 4 вируса, из которых 2 вируса "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА" циркулируют среди диких мышевидных грызунов и могут заражать людей, вызывая у них тяжелое заболевание, только на территории европейской части России и других европейских стран. В то же время два других вируса "ХАНТААН" и "СЕУЛ" существуют и заражают людей, как правило, только в азиатских странах, главным образом в Китае. Образцы вирусов, полученные в результате выделения вирусологическими методами из крови больных ГЛПС и органов погибших от ГЛПС людей или инфицированных животных, называются "ШТАММАМИ" вышеперечисленных вирусов-возбудителей ГЛПС. После детального изучения молекулярно-биологических характеристик штаммы могут быть использованы для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.The present invention relates to the field of virology, in particular to producing producer strains intended for the vaccination of viral infections, namely, hemorrhagic fever infection with renal syndrome (HFRS). The causative agents of HFRS are 4 viruses, of which 2 PUMALA and GOOD viruses circulate among wild mouse-like rodents and can infect people, causing them a serious illness, only in the European part of Russia and other European countries. At the same time, two other viruses, HANTAAN and SEOUL, exist and infect humans, usually only in Asian countries, mainly in China. Virus samples obtained by virological isolation from the blood of HFRS patients and organs of people who died from HFRS or infected animals are called "STRAINS" of the above HFRS viruses. After a detailed study of the molecular biological characteristics, the strains can be used to make diagnostic and vaccine preparations.
В настоящее время коммерческие вакцины против ГЛПС производятся только в Китае, однако ни одна из этих вакцин не может применяться в европейских регионах России и других странах Европы, поскольку они производятся на основе вирусов "ХАНТААН" и "СЕУЛ", которые не обладают защитным действием против вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА".Currently, commercial HFRS vaccines are produced only in China, however, none of these vaccines can be used in the European regions of Russia and other European countries, because they are made on the basis of the HANTAAN and CEUL viruses, which do not have a protective effect against of viruses "FUMED" and "GOOD".
Известно, что трудности, связанные с разработкой вакцинных препаратов против вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА", обусловлены особенностями репродукции штаммов этих вирусов в чувствительных клеточных системах. Для них характерен довольно длительный цикл размножения, низкий уровень продукции и отсутствие цитопатогенного действия. В связи с этим основное затруднение состоит в адаптации штаммов к разрешенной для вакцинного производства перевиваемой культуре клеток VERO. В настоящий момент в мировой практике не известно о существовании штаммов вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА" с уровнем продукции вирусных частиц, достаточным для разработки профилактических препаратов.It is known that the difficulties associated with the development of vaccines against the viruses "PUMUMALA" and "GOOD" are due to the peculiarities of the reproduction of strains of these viruses in sensitive cell systems. They are characterized by a rather long breeding cycle, a low level of production and the absence of a cytopathogenic effect. In this regard, the main difficulty consists in adapting the strains to the VERO transplantable cell culture that is allowed for vaccine production. At present, in world practice it is not known about the existence of the PUMALA and GOOD strains of viruses with the level of production of viral particles sufficient to develop prophylactic drugs.
Целью предлагаемого изобретения является получение впервые в мире штаммов вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА", способных к размножению в разрешенной для вакцинного производства перевиваемой культуре клеток VERO с накоплением вирусной массы в количествах, достаточных для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики ГЛПС.The aim of the invention is to obtain for the first time in the world strains of viruses "PUMALA" and "GOOD", capable of propagating in a VERO cell culture permitted for vaccine production with the accumulation of viral mass in quantities sufficient for the manufacture of vaccines for the specific prevention of HFRS.
В предлагаемом изобретении описаны вакцинные штаммы ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO, способные к размножению в перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки, линии VERO (ATCC CCL-81) и используемые для накопления вирусной массы с целью изготовления профилактической вакцины против ГЛПС.The present invention describes vaccine strains PUU-TKD / VERO and DOB-EAT / VERO, capable of propagating in a transplanted culture of green monkey kidney cells, the VERO line (ATCC CCL-81) and used to accumulate viral mass for the manufacture of a prophylactic vaccine against HFRS .
Методика выделения вирусных штаммов.The method of isolation of viral strains.
Клетки VERO-E6 выращивают на среде 2МЕМ с 5% телячьей сыворотки и по достижении 80-90% монослоя клеток используют для заражения штаммами ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА". Штаммы исходно были выделены в культуре клеток почек зеленой мартышки, линии VERO-E6 (ATCC CRL-13001): первый - из ткани легкого от погибшего больного ГЛПС во время вспышки ГЛПС в Башкирии в 1997 г., а второй из крови больного ГЛПС во время вспышки ГЛПС в Липецкой области в 2006 г.VERO-E6 cells are grown on 2MEM medium with 5% calf serum and, after reaching 80-90% of the cell monolayer, they are used to infect the PUMALA and GOOD viruses with the TKD / Ufa-97 and EAT / Lipetsk-06 strains. The strains were initially isolated in the green monkey kidney cell culture, line VERO-E6 (ATCC CRL-13001): the first was from lung tissue from a dead patient with HFRS during an HFRS outbreak in Bashkiria in 1997, and the second from the blood of a patient with HFRS during HFRS outbreaks in the Lipetsk region in 2006
В качестве поддерживающей рост клеток (после заражения) применяют ту же среду с 1% телячьей сыворотки. Для заражения клеток VERO-E6 используют 10% суспензию, приготовленную на среде 2МЕМ с 1% телячьей сыворотки из секционного материала легочной ткани погибшего больного, и цельную кровь, взятую в остром периоде болезни от больного ГЛПС. Через 10-12 дней культивирования при 37°С зараженные клетки снимают со стекла для выявления вирусспецифического антигена, после чего ими заражают свежие клетки. Выявление вирусного антигена осуществляют с помощью непрямого метода флюоресцирующих антител (МФА). Для приготовления препаратов для исследования в МФА клетки снимают со стекла смесью 0,02% версена и 2,5% трипсина, готовят суспензию инфицированных клеток (450-550 тыс кл/мл) и вносят ее по 0,005 мл в лунки предметных стекол для иммунофлюоресценции. После высушивания стекла помещают на 20 минут в охлажденный ацетон для фиксации клеток и затем высушивают при комнатной температуре. На готовые препараты наносят соответственно референт сыворотки от больных ГЛПС с антителами к известным вирусам-возбудителям ГЛПС в разведениях, начиная с 1:64 и заканчивая разведением, соответствующим титру сыворотки, а также нормальную сыворотку, не содержащую антител к возбудителям ГЛПС, в разведениях с 1:16 до 1:64. Препараты помещают во влажную камеру и инкубируют при 37±1°С в течение 30 мин (или при 6±2°С в течение 18 час). После окончания экспозиции препараты 3-кратно отмывают физиологическим раствором (0,85% NaCl), промывают дистиллированной водой, высушивают и наносят на них ФИТЦ-конъюгат против иммуноглобулинов человека. Препараты помещают во влажную камеру и инкубируют при 37±1°С в течение 30 мин. После чего их 3-х кратно промывают физиологическим раствором и 1-кратно дистиллированной водой, высушивают и исследуют с помощью люминесцентного микроскопа, используя водно-иммерсионный объектив ×65. Аналогичные процедуры исследования клеток на присутствие вирусспецифического антигена повторяют с той же периодичностью после каждого из 5-6 пассажей инфицированных клеток. В случае обнаружения специфического антигена в клетках проводят сбор культурального вируса, который затем помещают на хранение в дъюар с жидким азотом.As supporting the growth of cells (after infection), the same medium with 1% calf serum is used. To infect VERO-E6 cells, a 10% suspension prepared on 2MEM medium with 1% calf serum from sectional material of the lung tissue of the deceased patient and whole blood taken in the acute period of the disease from a patient with HFRS are used. After 10-12 days of cultivation at 37 ° C, infected cells are removed from the glass to detect a virus-specific antigen, after which fresh cells are infected. Detection of viral antigen is carried out using the indirect method of fluorescent antibodies (MFA). To prepare preparations for the study in MFAs, the cells were removed from the glass with a mixture of 0.02% versene and 2.5% trypsin, a suspension of infected cells (450-550 thousand cells / ml) was prepared and 0.005 ml of it was added to the wells of the slide for immunofluorescence. After drying, the glass is placed for 20 minutes in chilled acetone to fix the cells and then dried at room temperature. Serum referent from HFRS patients with antibodies to known HFRS viruses is diluted, respectively, starting from 1:64 and ending with a dilution corresponding to the titer of the serum, as well as normal serum that does not contain antibodies to HFRS causative agents, in dilutions from 1 : 16 to 1:64. The preparations are placed in a humid chamber and incubated at 37 ± 1 ° C for 30 minutes (or at 6 ± 2 ° C for 18 hours). After exposure, the preparations are washed 3 times with physiological saline (0.85% NaCl), washed with distilled water, dried and applied to them with a FITC conjugate against human immunoglobulins. The preparations are placed in a humid chamber and incubated at 37 ± 1 ° C for 30 minutes. Then they are washed 3 times with physiological saline and 1 times with distilled water, dried and examined using a luminescent microscope using a water-immersion lens × 65. Similar procedures for examining cells for the presence of a virus-specific antigen are repeated with the same frequency after each of 5-6 passages of infected cells. If a specific antigen is detected in the cells, the culture virus is harvested, which is then stored in a liquid nitrogen nitrogen storage tank.
После выделения и закрепления в 10 пассажах в культуре клеток VERO-E6 штаммы подвергают адаптированию к размножению в культуре клеток линии VERO.After isolation and fixing in 10 passages in the VERO-E6 cell culture, the strains are adapted to propagate in the VERO cell line culture.
Методика адаптации штаммов заключается в следующем.The method of adaptation of the strains is as follows.
Для первичного заражения клеток VERO используют вируссодержащую суспензию клеток VERO-E6, инфицированных штаммами ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06. Вирус (в ампулах или пробирках) извлекают из жидкого азота, оттаивают при комнатной температуре или в водяной бане (18±1)°С и разводят средой Игла MEM с двойным содержанием аминокислот и витаминов до концентрации, обеспечивающей множественность заражения 0,1-0,5 ФОЕ/клетку. Культуру клеток VERO перед заражением дважды отмывают рабочим раствором Хенкса, после чего в 1 л роллерную бутыль с монослоем клеток вносят 15 мл инокулята вируса. Для адсорбции вируса на клетки зараженные бутыли помещают в роллерную установку и инкубируют 1 час при температуре (37±1)°С. По истечении указанного времени в каждую бутыль вносят 100 мл поддерживающей среды Игла MEM с двойным содержанием аминокислот и витаминов (без добавления сыворотки крови плодов коров) и снова помещают в роллерную установку в термостатную комнату с температурой (37±1)°С. Сбор вируса осуществляют на 8-10 день с момента заражения клеток. Перед сбором вируса бутыли с зараженной культурой просматривают под микроскопом. Выбраковывают флаконы с признаками дегенерации клеток и бактериальной контаминацией. После удаления поддерживающей среды в зараженные флаконы вносят по 25-30 мл диспергента 0,02%-ный раствор версена, подогретого в термостате до температуры (36±1)°С. Поворачивая флакон, обмывают этим раствором весь монослой клеток, затем диспергент стерильно удаляют и обеззараживают автоклавированием. Культуру клеток оставляют при температуре (18±2)°С до тех пор, пока клетки не начнут отслаиваться от стекла. Отслоившиеся зараженные клетки ресуспендируют в минимальном объеме вируссодержащей культуральной жидкости, предварительно отобранной из флакона с зараженной культурой (15 мл на 1 литровый роллерный флакон). Клеточную взвесь из всех зараженных флаконов объединяют, 3-кратно замораживают при температуре минус (70±1)°С, оттаивают при температуре (18±2)°С и стерильно разливают по (1,5±0,1) мл в криогенные пробирки, маркируют и хранят при температуре минус (70±2)°С. Аналогичные процедуры применяют при последующих пассажах, при этом материалы каждого пассажа исследуют на содержание инфекционного вируса с помощью метода фокусобразующих единиц (ФОЕ). Монослой клеток VERO-E6, выращенных в 24-луночных панелях (фирма Costar), заражают 10-кратными разведениями вируссодержащей культуральной жидкости. После контакта с клетками при 37±1°С в течение 1 часа инокулят удаляют и вносят 0,6% метилцеллюлозное покрытие (800 мкл на лунку). После инкубации при 37±1°С в течение 6-8 суток полужидкое покрытие удаляют, клетки однократно отмывают 0,85% раствором NaCl. Для фиксации монослоя клеток вносят в лунки панели по 400 мкл 96° спирта и после 20 минутной экспозиции при комнатной температуре спирт удаляют, клетки 3-кратно по 10 мин отмывают 0,85% раствором NaCl и вносят в каждую лунку по 200 мкл специфической анти-"ПУУМАЛА" или анти-"ДОБРАВА" сыворотки в дозе 16-32 ед. После контакта при 37±1°С в течение 60 мин клетки 3-кратно по 5 мин отмывают 0,85% раствором NaCl, вносят в лунки по 200 мкл меченные пероксидазой антивидовые антитела или белок «А». После контакта в течение 60 мин при 37±1°С или 18 час при 6±2°С клетки 3-кратно по 10 мин отмывают 0,85% раствором NaCl и вносят индикатор пероксидазы хрена. В качестве субстрат-индикаторной системы применяют 0,05% диаминобензидин тетрахлорид с добавлением 0,02% NiCl2 и 0,01% Н2О2, после чего через 15-20 мин проводят учет опыта. Количество инфицированных колоний клеток в виде темно-серых пятен определяют визуально и титр вируса выражают в виде lg ФОЕ в 1 мл вносимого для инфицирования клеток образца.For primary infection of VERO cells, a virus-containing suspension of VERO-E6 cells infected with TKD / Ufa-97 and EAT / Lipetsk-06 strains is used. The virus (in ampoules or test tubes) is removed from liquid nitrogen, thawed at room temperature or in a water bath (18 ± 1) ° С and diluted with Medium Needle MEM with a double content of amino acids and vitamins to a concentration ensuring a multiplicity of infection of 0.1-0, 5 CFU / cell. Before infection, the VERO cell culture is washed twice with Hanks' working solution, after which 15 ml of the virus inoculum are introduced into a 1 liter roller bottle with a monolayer of cells. To adsorb the virus onto the cells, the infected bottles are placed in a roller unit and incubated for 1 hour at a temperature of (37 ± 1) ° С. After this time, 100 ml of the supporting medium MEM Needle with a double content of amino acids and vitamins (without the addition of blood serum of the fruits of cows) is introduced into each bottle and again placed in a roller unit in a thermostatic room with a temperature of (37 ± 1) ° С. The virus is harvested on days 8-10 from the moment of infection of the cells. Before collecting the virus, the infected culture bottles are examined under a microscope. Discard vials with signs of cell degeneration and bacterial contamination. After removing the support medium, 25-30 ml of dispersant is added to the infected vials with a 0.02% solution of versene, heated in a thermostat to a temperature of (36 ± 1) ° С. Turning the vial, wash the entire monolayer of cells with this solution, then the dispersant is sterilely removed and disinfected by autoclaving. The cell culture is left at a temperature of (18 ± 2) ° C until the cells begin to exfoliate from the glass. Exfoliated infected cells are resuspended in a minimal volume of virus-containing culture fluid previously selected from the infected culture vial (15 ml per 1 liter roller vial). Cell suspension from all infected vials is pooled, 3 times frozen at minus (70 ± 1) ° C, thawed at (18 ± 2) ° C and poured sterilely into (1.5 ± 0.1) ml into cryogenic tubes , labeled and stored at a temperature of minus (70 ± 2) ° С. Similar procedures are used in subsequent passages, while the materials of each passage are examined for the content of the infectious virus using the method of focus-forming units (FOE). A monolayer of VERO-E6 cells grown in 24-well panels (Costar) is infected with 10-fold dilutions of virus-containing culture fluid. After contact with the cells at 37 ± 1 ° C for 1 hour, the inoculum is removed and a 0.6% methylcellulose coating (800 μl per well) is applied. After incubation at 37 ± 1 ° C for 6-8 days, the semi-liquid coating is removed, the cells are washed once with a 0.85% NaCl solution. To fix the monolayer of cells, 400 μl of 96 ° alcohol are added to the panel wells and after 20 minutes of exposure at room temperature the alcohol is removed, the cells are washed 3 times with 105 minutes of a 0.85% NaCl solution and 200 μl of specific anti "FUMED" or anti- "GOOD" serum in a dose of 16-32 units. After contact at 37 ± 1 ° C for 60 min, cells are washed 3 times with 5 min each with a 0.85% NaCl solution, 200 μl peroxidase-labeled antispecies antibodies or protein “A” are added to the wells. After contact for 60 minutes at 37 ± 1 ° C or 18 hours at 6 ± 2 ° C, the cells are washed 3 times with 10 minutes of 0.85% NaCl solution and the horseradish peroxidase indicator is introduced. As a substrate-indicator system, 0.05% diaminobenzidine tetrachloride with the addition of 0.02% NiCl 2 and 0.01% H 2 O 2 is used , after which the experiment is recorded after 15-20 minutes. The number of infected cell colonies in the form of dark gray spots is determined visually and the virus titer is expressed as lg FOE in 1 ml of the sample introduced for infection of the cells.
На уровне 7-го пассажа в клетках VERO штаммы ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 очищают от клеточной ДНК путем обработки дезоксирибонуклеазой в концентрации 0,3 мкг/мл в оптимальных для этого фермента условиях. При этом по данным метода молекулярной гибридизации концентрация клеточной ДНК снижается до уровня менее 10 пг/мл. Далее, вирус концентрируют осаждением 7,5%-ным ПЭГ-6000 при (6±2)°С в течение (18±2) час и очищают зональным центрифугированием (25.000 об/мин, 3,5 час, 5°С) в градиенте плотности сахарозы (5-20%) с последующей фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.At the level of the 7th passage in VERO cells, TKD / Ufa-97 and EAT / Lipetsk-06 strains are purified from cellular DNA by treatment with deoxyribonuclease at a concentration of 0.3 μg / ml under optimal conditions for this enzyme. Moreover, according to the method of molecular hybridization, the concentration of cellular DNA decreases to less than 10 pg / ml. Next, the virus is concentrated by precipitation with 7.5% PEG-6000 at (6 ± 2) ° C for (18 ± 2) hours and purified by zone centrifugation (25,000 rpm, 3.5 hours, 5 ° C) in sucrose density gradient (5-20%), followed by filtration through a membrane filter with a pore diameter of 0.22 μm.
Полученными материалами штаммов ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 заражают культуру клеток VERO. После достижения стабильного размножения вирусов с титрами не менее 5,5 lg ФОЕ/мл, штаммы ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 исследуют на видовую специфичность (с использованием непрямого МФА с моновалентными антигенами и реакции нейтрализации) и специфическую активность (иммуногенность) на мышах Balb/c.The obtained materials of strains TKD / Ufa-97 and EAT / Lipetsk-06 infect the cell culture of VERO. After achieving stable propagation of viruses with titers of at least 5.5 lg IU / ml, the TKD / Ufa-97 and EAT / Lipetsk-06 strains are examined for species specificity (using indirect MPA with monovalent antigens and neutralization reactions) and specific activity (immunogenicity ) on Balb / c mice.
Методика определения вируснейтрализующих антител.Method for the determination of virus-neutralizing antibodies.
Для определения вируснейтрализующих антител исследуемые сыворотки в 2-кратных разведениях смешивают с 50-100 ФОЕ каждого из взятых для идентификации вирусов "ПУУМАЛА" и ДОБРАВА" и инкубируют при 6±2°С в течение 18-20 часов. На монослой клеток VERO-E6, выращенных в 24 луночных панелях (Costar), вносят по 0,2 мл вируссывороточной смеси и инкубируют при 37±1°С в течение 1 часа. Затем добавляют метилцеллюлозное покрытие и через 6-7 дней инкубации при 37±1°С монослой фиксируют 96° спиртом. Образовавшиеся в культуре клеток фокусы выявляют с помощью твердофазного иммуноферментного метода, используя специфические анти-"ПУУМАЛА" и анти-"ДОБРАВА" сыворотки и меченный пероксидазой белок "А". В качестве индикаторной системы применяют 0,05% диаминобензидин тетрахлорид с добавлением 0,02% NiCl2 и 0,01% H2O2, после чего через 15-20 мин проводят учет опыта. Титр вируснейтрализующих антител определяют по 80% подавлению числа фокусобразующих единиц (ФОБ).To determine the neutralizing antibodies, the studied sera in 2-fold dilutions are mixed with 50-100 FOU of each of the PUMALA and ADDITIVE viruses identified and incubated at 6 ± 2 ° C for 18-20 hours. On the VERO-E6 cell monolayer grown in 24 well panels (Costar), add 0.2 ml of the serum mixture and incubate at 37 ± 1 ° C for 1 hour, then add methylcellulose coating and after 6-7 days of incubation at 37 ± 1 ° C, the monolayer is fixed 96 ° alcohol. The foci formed in the cell culture are detected using solid-phase imm. nofermentnogo method using specific anti- "Puumala" and anti- "Dobrava" serum and peroxidase-labeled protein "A". As the indicator system employed 0.05% diaminobenzidine tetrachloride supplemented with 0,02% NiCl 2 and 0,01% H 2 O 2 , after which the experiment is monitored after 15-20 minutes. The titer of virus-neutralizing antibodies is determined by 80% inhibition of the number of focus-forming units (FOB).
Методика определения специфической активности.Method for determining specific activity.
Предварительно из вируссодержащих жидкостей клеток VERO, инфицированных штаммами ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06, готовят инактивированные, концентрированные, очищенные и адсорбированные на гидроокиси алюминия препараты. Для иммунизации используют мышей линии Balb/c 9-10 недельного возраста, весом 18-20 г, которым вводят исследуемые препараты в объеме 0,5 мл подкожно 3-кратно с 2-недельным интервалом. В качестве контрольных используют мышей Balb/c, которым в те же сроки вводят адсорбент гидроокиси алюминия. Через 2 недели после последней инъекции у животных берут из орбитальной вены кровь и готовят из нее сыворотку. В полученных сыворотках крови определяют титр вируснейтрализующих антител к вирусам "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА", используя вышеописанный метод определения вируснейтрализующих антител.Previously, inactivated, concentrated, purified, and adsorbed onto aluminum hydroxide preparations are prepared from virus-containing fluids of VERO cells infected with TKD / Ufa-97 and EAT / Lipetsk-06 strains. For immunization, mice of the Balb / c line of 9-10 week olds weighing 18-20 g are used, to which the test drugs are administered in a volume of 0.5 ml subcutaneously 3 times with a 2-week interval. As control, Balb / c mice were used, which were injected with an aluminum hydroxide adsorbent at the same time. 2 weeks after the last injection, blood is taken from the orbital vein in animals and serum is prepared from it. In the obtained blood sera, the titer of virus-neutralizing antibodies to the viruses “PUMALA” and “GOOD” is determined using the above method for the determination of virus-neutralizing antibodies.
При исследовании штаммов ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 в перекрестных опытах МФА и РН с прототипными штаммами вирусов "ПУУМАЛА", "ДОБРАВА", "СЕУЛ" и "ХАНТААН" подтверждена их видоспецифичность, а в опытах на мышах линии Balb/c - иммуногенная активность. Помимо результатов иммунологических исследований видоспецифичность штаммов подтверждена данными молекулярно-генетических исследований. Следовательно, по антигенным и молекулярно-биологическим свойствам штаммы ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 не отличаются от естественно циркулирующих в природе прототипных штаммов вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА".When studying strains of TKD / Ufa-97 and EAT / Lipetsk-06 in cross-sectional experiments with MFA and PH with prototype virus strains PUMUMALA, ADVANCE, SEUL and HANTAAN, their species specificity was confirmed, and in experiments on mice of the Balb line / c - immunogenic activity. In addition to the results of immunological studies, the species-specificity of the strains was confirmed by molecular genetic studies. Therefore, according to the antigenic and molecular biological properties, the TKD / Ufa-97 and EAT / Lipetsk-06 strains do not differ from the prototype strains of the viruses PUMALA and GOOD that naturally circulate in nature.
Адаптированные к культуре клеток VERO вирусные штаммы ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 получили название вакцинных штаммов ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO. Штамм ПУУ-ТКД/VERO (PUU-TKD/VERO) вируса "ПУУМАЛА" (Puumala, род Hantavirus, семейство Bunyaviridae) депонирован 24 ноября 2009 г. под №1026 в Государственной коллекции вирусов (НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН). Штамм ДОБ-EAT/VERO (DOB-TEA/VERO) вируса "ДОБРАВА" (Dobrava, род Hantavirus, семейство Bunyaviridae) депонирован 24 ноября 2009 г. под №1027 в Государственной коллекции вирусов (НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН).TKD / Ufa-97 and EAT / Lipetsk-06 viral strains adapted to VERO cell culture were named vaccine strains PUU-TKD / VERO and DOB-EAT / VERO. The strain PUU-TKD / VERO (PUU-TKD / VERO) of the virus "PUMALA" (Puumala, genus Hantavirus, family Bunyaviridae) was deposited on November 24, 2009 under No. 1026 in the State virus collection (Virology Research Institute named after D.I. Ivanovsky RAMS ) The strain DOB-EAT / VERO (DOB-TEA / VERO) of the virus "DOBRAVA" (Dobrava, genus Hantavirus, family Bunyaviridae) was deposited on November 24, 2009 under No. 1027 in the State Virus Collection (D.I. Ivanovsky Research Institute of RAMS )
Морфологические характеристики варианта №1 - штамм ПУУ-ТКД/VERO и варианта №2 - штамм ДОБ-EAT/VERO «Штамма вируса - возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом для изготовления вакцинных препаратов».The morphological characteristics of option No. 1 is the PUU-TKD / VERO strain and option No. 2 is the DOB-EAT / VERO strain “Virus strain - causative agent of hemorrhagic fever with renal syndrome for the manufacture of vaccines."
Вирионы имеют округлую форму с размером в диаметре от 90 до 120 нм. Липидосодержащая оболочка имеет выступы - пепломеры, длиной до 10 нм, сформированные вирионными гликопротеинами; вирусные частицы морфологически однородны. Вирионы располагаются в цитоплазме клетки, наибольшее их скопление наблюдается в цитоплазмитической сети и везикулах аппарата Гольджи. Плавучие плотности вирусных частиц в растворах сахарозы и хлорида цезия составляют 1.16-1.17 и 1,2-1,21 г/мл соответственно. Хантавирусы инактивируются растворителями липидов и термообработкой при температуре 50°С; стабильны в нейтральной среде при значениях рН от 5,5 до 8. Вирион проникает в клетку, прикрепляясь к ее поверхности участками одного или обоих наружных белков (G1 и G2), с последующим эндоцитозом. Предполагается, что необходимым условием проникновения вируса в клетку является закисление эндосом, что приводит к изменению конформации G1:G2 гетеродимеров и способствует слиянию клеточной и вирусной мембран.Virions are round in shape with a diameter in the range of 90 to 120 nm. The lipid-containing membrane has protrusions - peplomeres, up to 10 nm long, formed by virion glycoproteins; viral particles are morphologically homogeneous. Virions are located in the cytoplasm of the cell, their greatest accumulation is observed in the cytoplasmic network and Golgi apparatus vesicles. The floating densities of viral particles in sucrose and cesium chloride solutions are 1.16-1.17 and 1.2-1.21 g / ml, respectively. Hantaviruses are inactivated by lipid solvents and heat treated at a temperature of 50 ° C; stable in a neutral environment at pH values from 5.5 to 8. The virion penetrates the cell, attaching to its surface with sections of one or both of the outer proteins (G1 and G2), followed by endocytosis. It is assumed that the necessary condition for the penetration of the virus into the cell is acidification of the endosomes, which leads to a change in the conformation of G1: G2 heterodimers and promotes the fusion of cell and viral membranes.
Биотехнологические характеристики варианта №1 - штамм ПУУ-ТКД/VERO и варианта №2 - штамм ДОБ-EAT/VERO «Штамма вируса - возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом для изготовления вакцинных препаратов».Biotechnological characteristics of option No. 1 - strain PUU-TKD / VERO and option No. 2 - strain ADD-EAT / VERO "Strain of the virus - causative agent of hemorrhagic fever with renal syndrome for the manufacture of vaccines."
Как известно, хантавирусы плохо размножаются даже в пермиссивных клеточных культурах. После заражения полученными в результате адаптации штаммами монослойной культуры клеток Vero получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей биомассы со средним титром 5,5 lg ФОЕ/мл, которая может быть использована для вакцинопрофилактики ГЛПС. Заявленные штаммовые варианты, получив в результате адаптации к размножению в клетках VERO способность накапливаться в высоких титрах в культуральной жидкости, сохранили свои основные характеристики, включая их иммуногенность. Иммуногенные свойства штаммовых вариантов определяли в опытах на мышах линии Balb/c по образованию вируснейтрализующих антител в ответ на введение подкожно 3-кратно с 2-недельным интервалом препаратов, приготовленных по схеме производства инактивированной цельновирионной вакцины, описанных в примерах 1 и 2. Методика определения вируснейтрализующих антител по подавлению фокусобразующих единиц (ФОЕ) была приведена в представленном описании (стр.4-5). Как видно из таблицы 1, заявленные штаммы обладают достаточно высокой иммуногенной активностью.As you know, hantaviruses do not reproduce well even in permissive cell cultures. After infection with the adaptive strains of a monolayer culture of Vero cells, 3 to 5 collections of virus-containing biomass with an average titer of 5.5 lg CFU / ml are obtained, which can be used for vaccination of HFRS. The claimed strain variants, having obtained as a result of adaptation to reproduction in VERO cells the ability to accumulate in high titers in the culture fluid, retained their basic characteristics, including their immunogenicity. The immunogenic properties of the strain variants were determined in experiments on Balb / c mice by the formation of virus-neutralizing antibodies in response to subcutaneous administration 3 times with a 2-week interval of preparations prepared according to the production schedule of the inactivated whole-virion vaccine described in examples 1 and 2. The method of determining the neutralizing antibodies for the suppression of focus-forming units (FOE) was described in the description (p. 4-5). As can be seen from table 1, the claimed strains have a fairly high immunogenic activity.
Молекулярно-генетические характеристики варианта №1 - штамм ПУУ-ТКД/VERO и варианта №2 - штамм ДОБ-EAT/VERO «Штамма вируса - возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом для изготовления вакцинных препаратов».Molecular genetic characteristics of option No. 1 - strain PUU-TKD / VERO and option No. 2 - strain DOB-EAT / VERO "Strain of the virus - causative agent of hemorrhagic fever with renal syndrome for the manufacture of vaccines."
Геном вирусов представляет собой сегментированную одноцепочечную негативную РНК. Три сегмента генома - большой (L), средний (М) и малый (S) - кодируют вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу RdRp, поверхностные гликопротеины G1 и G2 и нуклеокапсидный белок N, соответственно. Каждый из геномных сегментов имеет единственную функционирующую открытую рамку считывания (ОРС). Вирусные белки - RdRp, G1, G2 и N - имеют молекулярные массы 200, 72, 56 и 45 кД соответственно. Все три сегмента хантавирусной РНК имеют на 3'-концах одну и ту же характерную короткую последовательность 3'-AUCAUCAUCUG-…-5', отличающую их от других буньявирусов.The viral genome is a segmented single-stranded negative RNA. Three segments of the genome - large (L), medium (M) and small (S) - encode the viral RNA-dependent RNA polymerase RdRp, surface glycoproteins G1 and G2, and nucleocapsid protein N, respectively. Each of the genomic segments has a single functioning open reading frame (OPC). Viral proteins — RdRp, G1, G2, and N — have molecular weights of 200, 72, 56, and 45 kD, respectively. All three segments of hantavirus RNA have at the 3'-ends the same characteristic short sequence of 3'-AUCAUCAUCUG- ... -5 ', which distinguishes them from other bunyaviruses.
Подготовка образцов для сиквенирования включает: выделение тотальной РНК из лизата зараженных клеток VERO с помощью реагента Trizol(GibcoBRL), обратной транскрипции с использованием статистического гексануклеотида в качестве праймера, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в стандартных условиях с применением родоспецифических праймеров генома хантавирусов, комбинирование праймеров, комплементарных различным участкам малого и среднего сегментов генома, клонирование ПЦР-фрагментов с использованием вектора pCR 2.0 (ТА cloning kit; Invitrogen). Для каждого из образцов были приготовлены 3 клона, источником которых являлись различные колонии. Секвенирование проводили с использованием Sequenase version 2.0 (United States Biochemicals) в обоих направлениях.Preparation of samples for sequencing includes: isolation of total RNA from the lysate of infected VERO cells using Trizol reagent (GibcoBRL), reverse transcription using statistical hexanucleotide as a primer, polymerase chain reaction (PCR) under standard conditions using genus-specific primers of the hantavirus genome, combination complementary to different regions of the small and medium segments of the genome, cloning of PCR fragments using the pCR 2.0 vector (TA cloning kit; Invitrogen). For each of the samples, 3 clones were prepared, the source of which were various colonies. Sequencing was performed using Sequenase version 2.0 (United States Biochemicals) in both directions.
В результате были получены следующие сиквенсы:As a result, the following sequences were obtained:
1) S сегмент генома варианта №1 - штамм ПУУ-ТКД/VERO1) S segment of the genome of option No. 1 - strain PUU-TKD / VERO
2) М сегмент генома варианта №1 - штамм ПУУ-ТКД/VERO2) M segment of the genome of option No. 1 - strain PUU-TKD / VERO
3) S сегмент генома варианта №2 - штамм ДОБ-EAT/VERO3) S segment of the genome of option No. 2 - strain ADD-EAT / VERO
4) М сегмент генома варианта №2 - штамм ДОБ-EAT/VERO4) M segment of the genome of option No. 2 - strain ADD-EAT / VERO
Полученные штаммы ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO при размножении в разрешенной для вакцинного производства культуре клеток VERO могут быть использованы в качестве продуцентов вирусной массы при производстве инактивированной вакцины против ГЛПС.The obtained PUU-TKD / VERO and DOB-EAT / VERO strains, when propagated in a VERO cell culture approved for vaccine production, can be used as producers of the viral mass in the production of an inactivated HFRS vaccine.
Для лучшего понимания приведены следующие примеры.The following examples are provided for a better understanding.
Пример 1Example 1
Вируссодержащую культруральную жидкость получают путем репродуцирования штамма ПУУ-ТКД/VERO вируса "ПУУМАЛА" в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (VERO). Монослой клеток получают в роллерных бутылях объемом 1 л в среде Игла MEM с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. После заражения монослойных культур для поддержки вирусного размножения используется среда, не содержащая компонентов сыворотки крови. Сбор вируссодержащей жидкости начинают на 6 день. С одного монослоя клеток получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей жидкости. Полученную вируссодержащую жидкость со средним титром 5,5 lg ФОЕ/мл осветляют с помощью ультрафильтрационных кассет (Millipore) с молекулярным весом проходимых частиц 100000 Дальтон и площадью 0,2 м2, инактивируют формалином в концентрации 1:4000 при 6°С в течение 30 суток и концентрируют в 70-200 раз. Инактивированный концентрат очищают на колонке 2,6/70 с Сефарозой 6 Фаст Флоу со скоростью 7 мл/мин. Концентрация общего белка в очищенном концентрате составляет 200±50 мкг/мл. Очищенный инактивированный концентрат фильтруют через фильтр 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной на гидроокись алюминия моновалентной вакцины.Virus-containing cultural fluid is obtained by reproducing the PUUM-TKD / VERO strain of the PUMALA virus in a monolayer transplanted green monkey kidney cell culture (VERO). A monolayer of cells is obtained in 1 liter roller bottles in a MEM Eagle medium with a double set of vitamins and amino acids and 5% of the blood serum of cow fruits. After infection of monolayer cultures, a medium containing no serum components is used to support viral reproduction. Virus-containing fluid collection begins on day 6. From one monolayer of cells receive from 3 to 5 collections of virus-containing fluid. The resulting virus-containing liquid with an average titer of 5.5 lg CFU / ml is clarified using ultrafiltration cassettes (Millipore) with a molecular weight of passable particles of 100,000 Daltons and an area of 0.2 m 2 , inactivated with formalin at a concentration of 1: 4000 at 6 ° C for 30 days and concentrate 70-200 times. The inactivated concentrate is purified on a 2.6 / 70 column with Sepharose 6 Fast Flow at a rate of 7 ml / min. The concentration of total protein in the purified concentrate is 200 ± 50 μg / ml. The purified inactivated concentrate is filtered through a 0.22 μm filter and used to prepare a monovalent vaccine adsorbed onto aluminum hydroxide.
Пример 2Example 2
Вируссодержащую культруральную жидкость получают путем репродуцирования штамма ДОБ-EAT/VERO вируса "ДОБРАВА" в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (VERO). Монослой клеток получают в роллерных бутылях объемом 1 л в среде Игла MEM с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. После заражения монослойных культур для поддержки вирусного размножения используется среда, не содержащая компонентов сыворотки крови. Сбор вируссодержащей жидкости начинают на 6 день. С одного монослоя клеток получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей жидкости. Полученную вируссодержащую жидкость со средним титром 5,5 lg ФОЕ/мл осветляют с помощью ультрафильтрационных кассет (Millipore) с молекулярным весом проходимых частиц 100000 Дальтон и площадью 0,2 м2, инактивируют формалином в концентрации 1:4000 при 6°С в течение 30 суток и концентрируют в 70-200 раз. Инактивированный концентрат очищают на колонке 2,6/70 с Сефарозой 6 Фаст Флоу со скоростью 7 мл/мин. Концентрация общего белка в очищенном концентрате составляет 200±50 мкг/мл. Очищенный инактивированный концентрат фильтруют через фильтр 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной на гидроокись алюминия моновалентной вакцины.Virus-containing culture fluid is obtained by reproducing the strain ADV-EAT / VERO of the virus "GOOD" in a monolayer transplanted culture of green monkey kidney cells (VERO). A monolayer of cells is obtained in 1 liter roller bottles in a MEM Eagle medium with a double set of vitamins and amino acids and 5% of the blood serum of cow fruits. After infection of monolayer cultures, a medium containing no serum components is used to support viral reproduction. Virus-containing fluid collection begins on day 6. From one monolayer of cells receive from 3 to 5 collections of virus-containing fluid. The resulting virus-containing liquid with an average titer of 5.5 lg CFU / ml is clarified using ultrafiltration cassettes (Millipore) with a molecular weight of passable particles of 100,000 Daltons and an area of 0.2 m 2 , inactivated with formalin at a concentration of 1: 4000 at 6 ° C for 30 days and concentrate 70-200 times. The inactivated concentrate is purified on a 2.6 / 70 column with Sepharose 6 Fast Flow at a rate of 7 ml / min. The concentration of total protein in the purified concentrate is 200 ± 50 μg / ml. The purified inactivated concentrate is filtered through a 0.22 μm filter and used to prepare a monovalent vaccine adsorbed onto aluminum hydroxide.
Вакцинные препараты, приготовленные по описанному выше способу, содержат допустимые количества балластных компонентов, таких как клеточный белок и дезоксирибонуклеиновая кислота, обладают иммуногенной активностью: сыворотки, полученные при 3-кратной иммунизации мышей Balb/c с интервалом 14 дней содержат антивирусные, в том числе вируснейтрализующие, антитела.Vaccine preparations prepared according to the method described above contain acceptable amounts of ballast components, such as cellular protein and deoxyribonucleic acid, have immunogenic activity: sera obtained by 3-fold immunization of Balb / c mice with an interval of 14 days contain antiviral, including neutralizing antibodies.
Штаммы ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO являются первыми в мире штаммами-продуцентами, которые могут быть применены для изготовления профилактических вакцин против вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА".The PUU-TKD / VERO and ADD-EAT / VERO strains are the first producer strains in the world that can be used for the manufacture of preventive vaccines against the viruses PUMUMALA and ADVANCES.
В результате адаптации штаммов ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO к размножению в перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки VERO впервые получена система вирус/клетка-хозяин, используемая как источник вирусной массы для изготовления инактивированной вакцины против ГЛПС.As a result of the adaptation of the PUU-TKD / VERO and DOB-EAT / VERO strains to propagation in the transplanted culture of the VERO green monkey kidney cells, the virus / host system was first used, which is used as a source of virus mass for the manufacture of an inactivated HFRS vaccine.
Штаммы ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO антигенно идентичны циркулирующим в природе прототипным штаммам вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА" и вследствие этого пригодны для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики ГЛПС.The PUU-TKD / VERO and DOB-EAT / VERO strains are antigenically identical to the prototype strains of the PUMALA and WELL viruses circulating in nature and are therefore suitable for the manufacture of vaccines for the specific prophylaxis of HFRS.
Штаммы ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO не теряют своих антигенных и инфекционных свойств при хранении в течение двух лет (срок наблюдения) при температуре минус 70°С. Создан значительный запас этих штаммов, которые могут быть использованы в качестве производственных штаммов вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА" для изготовления вакцинных препаратов против ГЛПС.Strains PUU-TKD / VERO and DOB-EAT / VERO do not lose their antigenic and infectious properties when stored for two years (observation period) at a temperature of minus 70 ° С. A significant stock of these strains has been created, which can be used as production strains of the PUMALA and DOBRAVA viruses for the manufacture of vaccines against HFRS.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009149041/10A RU2423520C1 (en) | 2009-12-30 | 2009-12-30 | Hemorrhagic fever and renal syndrome causal virus strain for preparing vaccine preparations (versions) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009149041/10A RU2423520C1 (en) | 2009-12-30 | 2009-12-30 | Hemorrhagic fever and renal syndrome causal virus strain for preparing vaccine preparations (versions) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2423520C1 true RU2423520C1 (en) | 2011-07-10 |
Family
ID=44740354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009149041/10A RU2423520C1 (en) | 2009-12-30 | 2009-12-30 | Hemorrhagic fever and renal syndrome causal virus strain for preparing vaccine preparations (versions) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2423520C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2683508C1 (en) * | 2018-05-23 | 2019-03-28 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН" | Virus strain for producing vaccine drugs against hemorrhagic fever with renal syndrome (options) |
-
2009
- 2009-12-30 RU RU2009149041/10A patent/RU2423520C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2683508C1 (en) * | 2018-05-23 | 2019-03-28 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН" | Virus strain for producing vaccine drugs against hemorrhagic fever with renal syndrome (options) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI445715B (en) | Novel avian astrovirus | |
| CN104099301B (en) | Coxsackie virus A16 type virus strain, application, vaccine and preparation method thereof | |
| JP2004331673A (en) | Animal cell and process for replication of influenza virus | |
| AU2014273183B2 (en) | Scale drop disease (SDD) causative virus and derivatives thereof | |
| CN113564133B (en) | Coxsackie virus A16 type strain and immunogenic composition and application thereof | |
| RU2603003C1 (en) | Inactivated sorptive vaccine to fmd types a, o, asia-1 | |
| RU2451745C2 (en) | A 2045/KYRGYZSTAN/ 2007 STRAIN OF FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS Aphtae epizooticae TYPE A FOR ANTIGENIC AND IMMUNOGENIC PERFORMANCE CONTROL OF FOOT-AND-MOUTH DISEASE VACCINES AND FOR PRODUCTION OF BIOPREPARATIONS FOR DIAGNOSIS AND SPECIFIC PREVENTION OF FOOT-AND-MOUTH DISEASE TYPE A | |
| RU2423520C1 (en) | Hemorrhagic fever and renal syndrome causal virus strain for preparing vaccine preparations (versions) | |
| RU2665849C1 (en) | Inactivated emulsion vaccine against foot-and-mouth disease type o | |
| RU2683508C1 (en) | Virus strain for producing vaccine drugs against hemorrhagic fever with renal syndrome (options) | |
| RU2563522C1 (en) | STRAIN O №2102/Zabaikalsky/2010 FMD VIRUS Aphtae epizooticae OF TYPE O FOR CONTROL OF ANTIGENIC AND IMMUNOGENIC ACTIVITY OF FMD VACCINES AND FOR PRODUCTION OF BIOLOGICAL PRODUCTS FOR DIAGNOSTICS AND SPECIFIC PROPHYLAXIS OF FMD OF TYPE O | |
| KR101092977B1 (en) | Avian Infectious Bronchitis Virus and Vaccine for Avian Infectious Bronchitis Comprising the Same | |
| RU2682876C1 (en) | Inactivated emulsion vaccine for o-type aphthous fever | |
| RU2242513C1 (en) | Foot and mouth disease virus strain a(georgia)1999/ 1721 type a for preparing diagnostic and vaccine preparations | |
| RU2294760C2 (en) | Sorbed inactivated vaccine against foot-and-mouth disease of type a | |
| JP2681063B2 (en) | Method for producing renal symptomatic hemorrhagic fever virus antigen, vaccine containing the antigen, and diagnostic agent for renal symptomatic hemorrhagic fever | |
| RU2603255C9 (en) | Strain a №2155/baikal/2013 of murrain virus aphtae epizooticae type a for control of antigenic and immunogenic activity and to produce biopreparations for diagnostics and specific prevention of murrain type a | |
| RU2526570C2 (en) | Inactivated sorbent type a foot-and-mouth disease vaccine | |
| RU2563345C1 (en) | Inactivated sorbed vaccine against fmd of type a | |
| RU2297452C2 (en) | Asia-1-type foot-and-mouth disease virus strain for producing of diagnostic and/or vaccine preparations | |
| RU2204599C1 (en) | Foot-and-mouth virus strain "primorsky-2000" 1734 of type o1 for diagnostic and vaccine preparation preparing | |
| CN117070476B (en) | Bovine herpesvirus 4 strain and application thereof in preparation of inactivated vaccine | |
| RU2708326C1 (en) | Strain n2344/mongolia/2017 virus of foot-and-mouth disease of aphtae epizooticae o type for making biopreparations for diagnosis and specific prevention of foot-and-mouth disease of o type | |
| RU2294759C2 (en) | Inactivated emulsion vaccine against foot-and-mouth disease of type a | |
| RU2451073C2 (en) | Method of primary isolation of bovine respiratory syncytial virus strains, bovine respiratory syncitial virus strain for preparing diagnostic products |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201231 |