RU2376868C2

RU2376868C2 - Method

Info

Publication number: RU2376868C2
Application number: RU2005126046/13A
Authority: RU
Inventors: Арно Де КРЭИЙ (DK); Арно Де КРЭИЙ; Сусан Мампуста МАДРИД (DK); Сусан Мампуста МАДРИД; Йерн Дальгор МИККЕЛЬСЕН (DK); Йерн Дальгор МИККЕЛЬСЕН; Йерн Борх СЕЭ (DK); Йерн Борх Сеэ
Original assignee: Даниско А/С
Priority date: 2003-01-17
Filing date: 2004-01-15
Publication date: 2009-12-27
Also published as: RU2005126046A; RU2005126047A; RU2371474C2

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: invention is related to biotechnology and represents method of in situ production in food product of emulsifier, in which lipid-acyltransferase is added to food product. At the same time lipid-acyltransferase is such that is able to transfer acyl group from lipid to one or several acceptors of acyl and includes fragment of aminoacids sequence GDSX, where X represents one or several of aminoacid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M or S.

EFFECT: invention makes it possible to produce emulsifier without increase of free fatty acid content in food product.

24 cl, 73 dwg, 35 tbl, 22 ex

Description

Ссылки на родственные заявкиLinks to related applications

Ссылки сделаны на следующие родственные заявки: заявка США серийный номер 09/750990, поданная 20 июля 1999 года, и заявка США серийный номер 10/409391. Каждая из этих заявок и каждый из документов, цитированных в этих заявках ("цитированных в заявках документов"), и каждый документ, упомянутый или цитированный в цитированных в заявках документах, или в тексте, или во время рассмотрения дела по этим заявкам, а также все аргументы в поддержку патентоспособности, выдвинутые во время такого рассмотрения, настоящим включены сюда путем ссылки. Различные документы цитируются также в данном тексте ("цитированные здесь документы"). Каждый из цитированных здесь документов и каждый документ, цитированный или упомянутый в цитированных здесь документах, настоящим включен сюда путем ссылки.References are made to the following related applications: US Application Serial Number 09/750990, filed July 20, 1999, and US Application Serial Number 10/409391. Each of these applications and each of the documents cited in these applications ("documents cited in applications"), and each document mentioned or cited in documents cited in applications, or in the text, or during the consideration of the case for these applications, as well as all arguments in support of patentability made during such a review are hereby incorporated by reference. Various documents are also cited in this text ("documents cited here"). Each of the documents cited here and each document cited or referred to in the documents cited here are hereby incorporated by reference.

Область изобретенияField of Invention

Настоящее изобретение относится к способу получения in situ эмульгатора внутри пищевого продукта посредством использования липид-ацилтрансферазы.The present invention relates to a method for producing an in situ emulsifier inside a food product using lipid acyltransferase.

Настоящее изобретение относится также к способу получения in situ эмульгатора внутри пищевого продукта с применением липид-ацилтрансферазы, где способ является таким, что эмульгатор образуется без увеличения или без существенного увеличения содержания жирных кислот в пищевом продукте.The present invention also relates to a method for producing an in situ emulsifier inside a food product using lipid acyltransferase, wherein the method is such that the emulsifier is formed without or without a substantial increase in the fatty acid content of the food product.

Настоящее изобретение относится также к способу получения in situ по меньшей мере двух эмульгаторов внутри пищевого продукта посредством использования липид-ациллтрансферазы.The present invention also relates to a method for in situ preparation of at least two emulsifiers inside a food product using lipid acyltransferase.

Настоящее изобретение относится также к способу получения in situ эфира углевода, и/или эфира стерола, и/или эфира станола, и/или эфира протеина, и/или эфира глицерина, и/или эфира гидроксикислоты внутри пищевого продукта посредством использования липид-ацилтрансферазы.The present invention also relates to a method for producing an in situ carbohydrate ester and / or sterol ester and / or stanol ester and / or protein ester and / or glycerol ester and / or hydroxy acid ester inside a food product by using lipid acyltransferase.

Настоящее изобретение относится к пищевой ферментной композиции и/или к кормовой ферментной композиции, которая содержит липид-ацилтрансферазу, и к применению такой композиции в способах по настоящему изобретению.The present invention relates to a food enzyme composition and / or to a feed enzyme composition that contains a lipid acyltransferase, and to the use of such a composition in the methods of the present invention.

Настоящее изобретение относится также к способу выявления подходящих липид-ацилтрансфераз в соответствии с настоящим изобретением и к выявленным таким образом липид-ацилтрансферазам.The present invention also relates to a method for detecting suitable lipid acyltransferases in accordance with the present invention and to lipid acyltransferases thus identified.

Настоящее изобретение относится также к иммобилизированной липид-ацилтрансферазе.The present invention also relates to immobilized lipid acyltransferase.

Состояние области техникиState of the art

Польза применения фосфолипаз и липаз (называемых липолитическими ферментами (ЕС.3,1.1.х), используемых в пищевых и/или кормовых промышленных приложениях, известна многие годы.The benefits of phospholipases and lipases (called lipolytic enzymes (EC.3,1.1.x) used in food and / or feed industrial applications have been known for many years.

Например, в ЕР 0585988 заявлено, что добавление липазы в тесто приводит к улучшению эффекта устойчивости к зачерствеванию. Предполагается, что липаза, полученная из Rhizopus arrhizus, добавленная в тесто, может улучшить качество получаемого хлеба, когда используется в сочетании с кулинарным жиром/жиром. WO 94/04035 указывает, что улучшенная мягкость может быть достигнута при добавлении липазы к тесту без добавления в тесто какого-либо дополнительного жира/масла. Castello, P. ESEGP 89-10 Dec. 1999, Helsinki показывает, что экзогенные липазы могут модифицировать объем хлеба.For example, in EP 0585988 it is stated that the addition of lipase to the dough leads to an improvement in the effect of resistance to solidification. It is believed that lipase derived from Rhizopus arrhizus added to the dough can improve the quality of the resulting bread when used in combination with cooking oil / fat. WO 94/04035 indicates that improved softness can be achieved by adding lipase to the dough without adding any additional fat / oil to the dough. Castello, P. ESEGP 89-10 Dec. 1999, Helsinki shows that exogenous lipases can modify the volume of bread.

Липолитические ферменты гидролизуют одну или несколько жирных кислот из липидов, присутствующих в пищевом продукте, что может привести к образованию молекул сильных эмульгаторов внутри пищевого продукта, которое обеспечивает коммерчески ценные функции. Молекулы, которые содействуют наиболее важным характеристикам эмульгатора, являются продуктами частичного гидролиза, такими как лизофосфолипиды, лизогликолипиды и моноглицеридные молекулы. Полярные продукты гидролиза липидов, такие как лизофосфолипиды и лизогликолипиды, являются особо полезными. При изготовлении хлеба такие образованные in situ эмульгаторы могут дать функциональные возможности, эквивалентные таким эмульгаторам, как DATEM.Lipolytic enzymes hydrolyze one or more fatty acids from lipids present in the food product, which can lead to the formation of strong emulsifier molecules inside the food product, which provides commercially valuable functions. The molecules that contribute to the most important characteristics of the emulsifier are products of partial hydrolysis, such as lysophospholipids, lysoglycolipids and monoglyceride molecules. Polar lipid hydrolysis products, such as lysophospholipids and lysoglycolipids, are particularly useful. In the manufacture of bread, such in situ formed emulsifiers can provide equivalent functionality to emulsifiers such as DATEM.

Однако активность липолитических ферментов дает в результате также накопление жирных кислот, которое приводит к вредной функциональности в пищевом продукте. Такая врожденная активность липолитических ферментов ограничивает их действенность.However, the activity of lipolytic enzymes also results in the accumulation of fatty acids, which leads to harmful functionality in the food product. Such an innate activity of lipolytic enzymes limits their effectiveness.

В практике были предприняты многочисленные попытки разрешить эту проблему. Однако они приводили в результате к значительному увеличению содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте, включая, в частности, но не ограничиваясь этим, хлебное тесто и яичный желток.In practice, numerous attempts have been made to solve this problem. However, they resulted in a significant increase in the content of free fatty acids in the food product, including, in particular, but not limited to, bread dough and egg yolk.

Фосфолипазы, в особенности фосфолипаза А2 (Е.С. 3.1.1.4), использовались в течение многих лет для обработки яиц или продуктов на основе яиц (см., например, US 4034124 и Dutihl & Grogert, 1981, J.Sci.Food Agric. 32, 451-458). Активность фосфолипазы во время обработки яиц или продуктов на основе яиц приводит в результате к накоплению полярного лизолецитина, который может действовать как эмульгатор. Обработка фосфолипазой яиц или продуктов на основе яиц может улучшить стабильность, термическую стабильность при тепловой обработке, такой как пастеризация, и привести в результате к значительному загущению. Продукты на основе яиц могут включать, но не ограничиваться этим, кекс, майонез, заправки для салата, соусы, мороженое и т.п. Применение фосфолипаз приводит в результате к накоплению свободных жирных кислот. Накопление свободных жирных кислот может привести к значительной потере вкуса. К тому же накопление свободных жирных кислот может привести к увеличенной восприимчивости к окислению и, следовательно, приводит к плохой сохранности, обесцвечиванию продукта и изменению других критических характеристик пищевого продукта, таких как вкус и текстура. В последнее время липолитические ферменты с более широкой специфичностью субстрата были предложены на рынок для обработки яичного желтка и связанных с ним пищевых продуктов. Они имеют преимущество в том, что в отличие от большинства фосфолипаз А2 они не произведены из сырья, полученного из млекопитающих. Однако они приводят к значительному накоплению свободных жирных кислот в результате гидролиза не только фосфолипидов, но и триглицеридов.Phospholipases, especially phospholipase A2 (E.C. 3.1.1.4), have been used for many years to process eggs or egg-based products (see, for example, US 4034124 and Dutihl & Grogert, 1981, J.Sci. Food Agric 32, 451-458). The activity of phospholipase during the processing of eggs or egg-based products results in the accumulation of polar lysolecithin, which can act as an emulsifier. Phospholipase treatment of eggs or egg-based products can improve stability, thermal stability during heat treatment, such as pasteurization, and result in significant thickening. Egg-based foods may include, but are not limited to, muffins, mayonnaise, salad dressings, sauces, ice creams, and the like. The use of phospholipases results in the accumulation of free fatty acids. The accumulation of free fatty acids can lead to a significant loss of taste. In addition, the accumulation of free fatty acids can lead to an increased susceptibility to oxidation and, consequently, leads to poor preservation, discoloration of the product and a change in other critical characteristics of the food product, such as taste and texture. Recently, lipolytic enzymes with a broader substrate specificity have been put on the market for processing egg yolk and related food products. They have the advantage that, unlike most phospholipases A2, they are not produced from raw materials derived from mammals. However, they lead to a significant accumulation of free fatty acids as a result of hydrolysis of not only phospholipids, but also triglycerides.

Как упоминалось выше, другой областью, в которой широко использовались липазы, является хлебопечение. Применение фосфолипаз в хлебопекарном производстве относится к началу 1980-х годов.As mentioned above, another area in which lipases are widely used is baking. The use of phospholipases in the baking industry dates back to the early 1980s.

Субстратом для липаз в пшеничной муке являются 1,5-3% эндогенные пшеничные липиды, которые представляют собой сложную смесь полярных и неполярных липидов. Полярные липиды могут быть разделены на гликолипиды и фосфолипиды. Такие липиды образованы глицерином, этерифицированным двумя жирными кислотами, и полярной группой. Полярная группа придает таким липидам поверхностную активность. Ферментативное отщепление одной из жирных кислот в таких липидах приводит к липидам с намного большей поверхностной активностью. Хорошо известно, что эмульгаторы с высокой поверхностной активностью, такие как DATEM, являются весьма функциональными, когда добавлены в тесто.The substrate for lipases in wheat flour is 1.5-3% endogenous wheat lipids, which are a complex mixture of polar and non-polar lipids. Polar lipids can be divided into glycolipids and phospholipids. Such lipids are formed by glycerol esterified with two fatty acids and a polar group. The polar group imparts surface activity to such lipids. Enzymatic cleavage of one of the fatty acids in such lipids results in lipids with much greater surface activity. It is well known that emulsifiers with high surface activity, such as DATEM, are very functional when added to the dough.

Однако применение липаз (Е.С. 3.1.1.Х) в продуктах из теста может иметь вредное воздействие на активность дрожжей и/или отрицательно повлиять на объем хлеба. Отрицательное влияние на объем хлеба часто объясняют передозировкой. Передозировка может привести к снижению эластичности клейковины с получением теста, которое становится слишком жестким, что в результате приводит к пониженному объему хлеба. В дополнение или альтернативно такие липазы могут разлагать кулинарный жир, масло или молочный жир, добавленные в тесто, приводя к потере вкуса теста и выпеченного продукта. Передозировка и потеря вкуса приписываются накоплению жирных кислот в тесте.However, the use of lipases (EC 3.1.1.X) in dough products can have a harmful effect on yeast activity and / or adversely affect the volume of bread. A negative effect on the volume of bread is often explained by an overdose. An overdose can lead to a decrease in gluten elasticity to produce a dough that becomes too hard, resulting in a reduced volume of bread. In addition or alternatively, such lipases can decompose cooking oil, butter or milk fat added to the dough, resulting in a loss of taste of the dough and the baked product. Overdose and loss of taste are attributed to the accumulation of fatty acids in the test.

В ЕР 1193314, ЕР 0977869, а также в WO 01/39602 сообщалось, что использование липолитических ферментов, активных в отношении гликолипидов, оказывалось особо выгодным при использовании в хлебопечении, поскольку было обнаружено, что продукты частичного гидролиза, лизогликолипиды обладают очень высокой эмульгирующей функциональностью, явно приводящей к более высокой пропорции положительной эмульгирующей функциональности по сравнению с вредным накоплением свободных жирных кислот. Однако было также обнаружено, что ферменты имеют значительную неселективную активность по отношению к триглицериду, что приводит к ненужному высокому содержанию свободной жирной кислоты.In EP 1193314, EP 0977869, as well as in WO 01/39602 it was reported that the use of lipolytic enzymes active against glycolipids proved to be especially advantageous when used in bread baking, since it was found that the products of partial hydrolysis, lysoglycolipids have very high emulsifying functionality, clearly leading to a higher proportion of positive emulsifying functionality compared to the harmful accumulation of free fatty acids. However, it was also found that the enzymes have significant non-selective activity with respect to triglyceride, which leads to an unnecessarily high content of free fatty acid.

О таких же наблюдениях сообщается в WO 00/32758, где описаны варианты липолитических ферментов с улучшенной активностью по отношению к фосфолипидам и/или гликолипидам в дополнение к вариантам, которые оказывают предпочтение жирным кислотам с длинной цепью, а не с короткой цепью. Эту последнюю особенность, описанную также в WO 01/39602, считали особенно важной для предотвращения потери вкуса, связанной с накоплением свободных жирных кислот с короткой цепью. Однако образовывалось значительное количество свободных жирных кислот.The same observations are reported in WO 00/32758, which describes lipolytic enzyme variants with improved activity against phospholipids and / or glycolipids in addition to variants that favor long chain fatty acids rather than short chain ones. This latter feature, also described in WO 01/39602, was considered particularly important for preventing loss of taste associated with the accumulation of short chain free fatty acids. However, a significant amount of free fatty acids was formed.

Проблема высокой активности по отношению к триглицериду рассматривалась в WO 02/094123, где предложено применение липолитических ферментов, активных к полярным липидам (т.е. к гликолипидам и фосфолипидам) в тесте, но практически неактивных по отношению к триглицеридам или 1-моноглицеридам. Однако образовывалось значительное количество свободных жирных кислот.The problem of high activity with respect to triglyceride was considered in WO 02/094123, which proposes the use of lipolytic enzymes that are active against polar lipids (i.e. glycolipids and phospholipids) in the test, but are practically inactive with respect to triglycerides or 1-monoglycerides. However, a significant amount of free fatty acids was formed.

Некоторые липолитические ферменты имеют низкую активность или отсутствие активности к лизо-формам полярных липидов (т.е. гликолипидов/фосфолипидов). Применение таких ферментов считалось предпочтительным, поскольку они гарантируют накопление высоко полярных лизолипидов, дающих в результате оптимальную функциональность. Однако свободные жирные кислоты накапливаются. Такая селективная функциональность является характерной для ферментов фосфолипазы А2 и гликолипаз, описанных в EP 0977869, EP 1193314 и WO 01/39602. Был получен вариант ферментов с менее селективными липолитическими ферментами, которые имеют более низкую активность по отношению к лизо-полярным липидам по сравнению с родительским ферментом (WO 03/060112). Однако образовывалось значительное количество свободных жирных кислот.Some lipolytic enzymes have low activity or lack of activity for the lysoforms of polar lipids (i.e. glycolipids / phospholipids). The use of such enzymes was considered preferable because they guarantee the accumulation of highly polar lysolipids, resulting in optimal functionality. However, free fatty acids accumulate. Such selective functionality is characteristic of the phospholipase A2 and glycolipase enzymes described in EP 0977869, EP 1193314 and WO 01/39602. An enzyme variant was obtained with less selective lipolytic enzymes that have lower activity with respect to lysolar polar lipids compared to the parent enzyme (WO 03/060112). However, a significant amount of free fatty acids was formed.

В WO 00/05396 описан способ получения пищевого продукта, содержащего эмульгатор, где пищевой материал вводят в контакт с таким ферментом, что эмульгатор образуется ферментом из эфира жирной кислоты, а второй функциональный ингредиент образуется из второго составляющего. В WO 00/05396 описано применение, в частности, фермента липазы или эстеразы. Нигде в WO 00/05396 нет указаний на конкретное применение ацилтрансферазы. Кроме того, в пищевых продуктах с высоким содержанием воды применение эстераз и липаз, предложенное в WO 00/05396, должно приводить к значительному накоплению свободных жирных кислот.WO 00/05396 describes a method for producing a food product containing an emulsifier, where the food material is contacted with an enzyme such that the emulsifier is formed by an enzyme from a fatty acid ester, and the second functional ingredient is formed from a second moiety. WO 00/05396 describes the use, in particular, of a lipase or esterase enzyme. Nowhere in WO 00/05396 there is no indication of the specific use of acyltransferase. In addition, in foods with a high water content, the use of esterases and lipases, as proposed in WO 00/05396, should lead to a significant accumulation of free fatty acids.

Недостаток, связанный с применением липаз, включая фосфолипазы и гликолипазы, может быть обусловлен образованием свободных жирных кислот, высвободившихся из липидов. В течение последней пары десятилетий применение липолитических ферментов в пищевых продуктах было ограничено балансом между вредным накоплением свободных жирных кислот и образованием лизолипидов, которое обеспечивает положительную функциональность. Хотя в этой области были предложены многочисленные стратегии, некоторые из которых обеспечили значительное улучшение функциональности, ни одна из них не решила полностью фундаментальную проблему, т.е. значительное накопление свободных жирных кислот в пищевом продукте, приготовленном с использованием in situ липолитических ферментов.A disadvantage associated with the use of lipases, including phospholipases and glycolipases, may be due to the formation of free fatty acids released from lipids. Over the past couple of decades, the use of lipolytic enzymes in foods has been limited by the balance between the harmful accumulation of free fatty acids and the formation of lysolipids, which provides positive functionality. Although numerous strategies have been proposed in this area, some of which have provided significant improvements in functionality, none of them have solved the completely fundamental problem, i.e. significant accumulation of free fatty acids in a food product prepared using in situ lipolytic enzymes.

Присутствие высоких концентраций свободных жирных кислот (СЖК) в исходных материалах или пищевых продуктах обычно считают дефектом качества, и производители пищевых продуктов и покупатели должны обычно включать максимальное содержание СЖК в пищевые спецификации. Эффекты, получаемые при избыточных уровнях СЖК, могут быть органолептическими и/или функциональными дефектами.The presence of high concentrations of free fatty acids (FFAs) in raw materials or food products is usually considered a quality defect, and food manufacturers and customers should usually include the maximum content of FFAs in food specifications. The effects obtained with excessive levels of FFA can be organoleptic and / or functional defects.

Результатом липолиза является гидролитическая прогорклость с образованием характерного "мыльного" привкуса. Такой "мыльный" вкус является особенно острым при жирных кислотах с промежуточной длиной цепи (С8-С12), которые, хотя и не присутствуют в высоких концентрациях, могут быть важными составляющими, например, молочных продуктов или растительных масел. Более распространенный органолептический дефект обусловлен совместным действием липолитических ферментов и процессов окисления. Ненасыщенные жирные кислоты являются более подверженными окислению, когда они неэтерифицированы, чем когда они этерифицированы в ацильные липиды.The result of lipolysis is hydrolytic rancidity with the formation of a characteristic "soapy" taste. This “soapy” taste is especially acute with intermediate chain length fatty acids (C8-C12), which, although not present in high concentrations, can be important constituents, for example, dairy products or vegetable oils. A more common organoleptic defect is due to the combined action of lipolytic enzymes and oxidation processes. Unsaturated fatty acids are more susceptible to oxidation when they are unesterified than when they are esterified into acyl lipids.

Функциональные дефекты пищевого продукта, вызванные высокими концентрациями СЖК, являются обнаруживаемыми, но не так легко объясняемыми. Не желая быть связанными теорией, гидролиз неизмененных липидов в карбоновые кислоты будет увеличивать [H⁺] и давать карбонильные группы, которые могут соединяться с другими соединениями или с ионами металлов. Свободные жирные кислоты также присоединяют протеины за счет гидрофобных взаимодействий и могут образовывать комплексы с крахмалом во время готовки. СЖК могут также мешать действию поверхностно-активных агентов, таких как полярные липиды и эмульгаторы (Lipid in Cereal Technology, P.J. Barnes, Academic Press 1983).Functional defects of the food product caused by high concentrations of FFA are detectable, but not so easily explained. Not wanting to be bound by theory, hydrolysis of unchanged lipids into carboxylic acids will increase [H ⁺ ] and give carbonyl groups that can combine with other compounds or with metal ions. Free fatty acids also attach proteins through hydrophobic interactions and can form complexes with starch during cooking. FFAs may also interfere with the action of surface active agents such as polar lipids and emulsifiers (Lipid in Cereal Technology, PJ Barnes, Academic Press 1983).

WO 03/100044 описывает класс ацилтрансфераз, известных как PDAT (или ATWAX). Такие ферменты используют моноглицерид или диглицерид как молекулу-акцептор и фосфатидилхолин (ФХ) как молекулу-донор для образования следующих продуктов: лизофосфатидилхолина и триацилглицерина и/или диацетилглицерина.WO 03/100044 describes a class of acyltransferases known as PDAT (or ATWAX). Such enzymes use a monoglyceride or diglyceride as an acceptor molecule and phosphatidylcholine (PF) as a donor molecule to form the following products: lysophosphatidylcholine and triacylglycerol and / or diacetylglycerol.

В одном варианте осуществления представленное изобретение относится к улучшениям при вводе протеинов сыворотки в пищевой продукт, обеспечивающих повышенные выходы без ухудшения качества - такого как текстура - пищевых продуктов.In one embodiment, the present invention relates to improvements in the incorporation of whey proteins into a food product, providing improved yields without compromising the quality - such as texture - of food products.

Сырные композиции обычно готовят из молочных жидкостей способом, который включает обработку жидкости коагулирующим или свертывающим агентом. Коагулирующим агентом может быть энзим створаживания, кислота или подходящая бактериальная культура, или он может включать такую культуру. Получаемый творог обычно включает трансформированный казеин, жиры, включая натуральный масляный жир, и вкусовые вещества, которые появляются особенно, когда используют бактериальную культуру. Творог может быть сепарирован от жидкой сыворотки, которая содержит растворимые протеины, не затронутые коагуляцией и которые поэтому не вошли в творог.Cheese compositions are usually prepared from milk liquids in a manner that includes treating the liquid with a coagulating or coagulating agent. The coagulating agent may be a curdling enzyme, an acid, or a suitable bacterial culture, or it may include such a culture. The resulting cottage cheese usually includes transformed casein, fats, including natural oil fat, and flavors that appear especially when using a bacterial culture. Cottage cheese can be separated from liquid whey, which contains soluble proteins that are not affected by coagulation and which therefore are not included in the cottage cheese.

Таким образом, сыворотка является побочным продуктом производства в промышленных способах получения пищевых продуктов, таких как сыры. Традиционно сыворотку выводят как отход, или используют как удобрение или как корм для скота, или перерабатывают в пищевые ингредиенты.Thus, whey is a byproduct of production in industrial processes for the production of food products, such as cheeses. Traditionally, whey is removed as waste, or used as fertilizer or as livestock feed, or processed into food ingredients.

Неспособность протеинов сыворотки существенно удерживаться в твороге является существенным фактором, вносящим вклад в недостаточную эффективность обычного производства молочных продуктов, таких как сырные твороги, и в снижение общего выхода, относящегося к включению всех твердых протеинов, которые присутствуют в исходных молочных жидкостях, в получаемые сырные твороги.The inability of whey proteins to be substantially retained in cottage cheese is a significant factor contributing to the insufficient efficiency of conventional production of dairy products, such as cheese curds, and to reducing the overall yield related to the inclusion of all solid proteins that are present in the original milk liquids in the resulting cheese curds .

Имелись многочисленные попытки включить протеины сыворотки в сыр, например тепловой обработкой молока, тепловой обработкой сыворотки или фильтрацией, такой как ультрафильтрация.There have been numerous attempts to incorporate whey proteins into cheese, for example by heat treatment of milk, heat treatment of whey or filtration, such as ultrafiltration.

Имеется также несколько описаний применения специфических протеиназ для того, чтобы индуцировать агрегацию протеинов сыворотки. Было показано, что сериновая протеиназа, полученная из Bacillus licheniformis, имеет способность индуцировать агрегацию протеинов сыворотки (US 5523237).There are also several descriptions of the use of specific proteinases in order to induce the aggregation of serum proteins. Serine proteinase derived from Bacillus licheniformis has been shown to have the ability to induce the aggregation of serum proteins (US 5523237).

Однако остается много трудностей, связанных с вводом протеинов сыворотки в такие процессы, как производство сыров. Например, введение протеина сыворотки в сыры связано с ухудшением вкуса продукта и ощущения во рту и, кроме того, имеет тенденцию мешать створаживанию и последующей переработке продукта. Протеиназы, о которых ранее сообщалось, что они могут быть добавлены в сырное молоко для гидролиза протеинов сыворотки, приводят к значительному гидролизу казеинов, как описано у Madsen, J.S. & Qvist, K.B. (1997) Hydrolysis of milk protein by a Bacillus licheniformis protease specific for acidic amino acid residues. J. Food Sci. 62, 579-582. However, there remain many difficulties associated with the incorporation of whey proteins into processes such as cheese production. For example, the introduction of whey protein into cheeses is associated with a deterioration in the taste of the product and the sensation in the mouth and, in addition, tends to interfere with the curd and subsequent processing of the product. Proteinases previously reported to be added to cheese milk for hydrolysis of whey proteins result in significant hydrolysis of caseins, as described by Madsen, JS & Qvist, KB (1997) Hydrolysis of milk protein by a Bacillus licheniformis protease specific for acidic amino acid residues. J. Food Sci. 62, 579-582.

Таким образом, имеется потребность в способах и композициях, которые предназначены для улучшенного введения протеина сыворотки в пищевые продукты, с сохранением в то же время органолептических и других желаемых свойств. Такая оптимизация должна привести в результате к повышенной эффективности, более высоким выходам пищевых продуктов и к снижению общих материальных затрат.Thus, there is a need for methods and compositions that are intended for improved incorporation of whey protein into food products, while maintaining organoleptic and other desirable properties. Such optimization should result in increased efficiency, higher food yields, and a reduction in overall material costs.

Липаза:холестерин-ацилтрансферазы известны в течение некоторого времени (см., например, Buckley - Biochemistry, 1983, 22, 5490-5493). В частности, были найдены глицерофосфолипид: холестерин-ацилтрансферазы (GCAT), которые подобно лецитин:холестерин-ацилтрансферазам (LCAT) растительного и животного происхождения могут катализировать перенос жирной кислоты между фосфатидилхолином и холестерином.Lipase: cholesterol acyltransferases have been known for some time (see, for example, Buckley - Biochemistry, 1983, 22, 5490-5493). In particular, glycerophospholipid: cholesterol acyltransferase (GCAT) was found, which, like lecithin: cholesterol acyltransferase (LCAT) of plant and animal origin, can catalyze the transfer of fatty acid between phosphatidylcholine and cholesterol.

Upton and Buckley (TIBS 20, May 1975 p. 178-179) и Brumlik and Buckley (J. of Bacteriology Apr. 1996 p. 2060-2064) сообщают о липаза/ацилтрансферазе из Aeromonas hydrophila, которая обладает способностью ацильного переноса к спиртовым акцепторам в водной среде.Upton and Buckley (TIBS 20, May 1975 p. 178-179) and Brumlik and Buckley (J. of Bacteriology Apr. 1996 p. 2060-2064) report a lipase / acyltransferase from Aeromonas hydrophila , which has the ability of acyl transfer to alcohol acceptors in the aquatic environment.

Сущность и аспекты настоящего изобретенияThe essence and aspects of the present invention

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения in situ эмульгатора в пищевом продукте, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы, как она определена здесь.According to a first aspect of the present invention, there is provided a method for producing an in situ emulsifier in a food product, wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product as defined herein.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения in situ эмульгатора в пищевом продукте, где способ является таким, что эмульгатор образуется без увеличения или без существенного увеличения содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте, и где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In a further aspect, the present invention relates to a method for producing an in situ emulsifier in a food product, wherein the method is such that the emulsifier is formed without or without a substantial increase in the content of free fatty acids in the food product, and where the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product .

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения в пищевом продукте in situ эмульгатора, и/или эфира стерола, и/или эфира станола, где способ является таким, что эмульгатор образуется без увеличения или без существенного увеличения содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте, и где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to a method for producing an in situ emulsifier and / or sterol ester and / or stanol ester in a food product, wherein the method is such that the emulsifier is formed without or without a substantial increase in the content of free fatty acids in the food product, and where the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения в пищевом продукте in situ эмульгатора, и/или эфира стерола, и/или эфира станола, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to a method for producing an in situ emulsifier and / or sterol ester and / or stanol ester in a food product, wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения в пищевом продукте in situ по меньшей мере двух эмульгаторов, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing at least two emulsifiers in a food product in situ , wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложен способ получения в пищевом продукте in situ по меньшей мере двух эмульгаторов, и/или эфира стерола, и/или эфира станола, где способ является таким, что эмульгатор образуется без увеличения или без существенного увеличения содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте, и где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.According to a further aspect of the present invention, there is provided a method for producing at least two emulsifiers and / or sterol ester and / or stanol ester in a food product in situ , wherein the method is such that the emulsifier is formed without or without a substantial increase in the content of free fatty acids in food product, and where the method includes the step of adding to the food product lipid acyltransferase.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложен способ получения в пищевом продукте in situ по меньшей мере двух эмульгаторов, и/или эфира стерола, и/или эфира станола, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.According to a further aspect of the present invention, there is provided a method for producing at least two emulsifiers and / or sterol ester and / or stanol ester in a food product in situ , wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения в пищевом продукте in situ эфира углевода, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In a further aspect, the present invention relates to a method for producing an in situ carbohydrate ester in a food product, the method comprising the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения в пищевом продукте in situ эфира углевода вместе с эмульгатором, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to a method for producing an in situ carbohydrate ester in a food product together with an emulsifier, wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения в пищевом продукте in situ эмульгатора и одного или нескольких соединений из эфира углевода, эфира стерола, эфира станола, эфира протеина, моноглицерида или диглицерида, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to a method for producing an in situ emulsifier and one or more compounds of a carbohydrate ester, sterol ester, stanol ester, protein ester, monoglyceride or diglyceride in a food product, the method comprising the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложен способ получения пищевого продукта, включающего эмульгатор, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы, как определено здесь.According to a further aspect of the present invention, there is provided a method for preparing a food product comprising an emulsifier, wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product as defined herein.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта, включающего эмульгатор, где способ является таким, что эмульгатор образуется без увеличения или без существенного увеличения содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте, и где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In a further aspect, the present invention relates to a method for producing a food product comprising an emulsifier, where the method is such that the emulsifier is formed without or without a substantial increase in the content of free fatty acids in the food product, and where the method comprises the step of adding lipid acyltransferase to the food product.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта, включающего эмульгатор, и/или эфир стерола, и/или эфир станола, где способ является таким, что эмульгатор образуется без увеличения или без существенного увеличения содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте, и где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to a method for producing a food product comprising an emulsifier and / or sterol ether and / or stanol ether, wherein the method is such that the emulsifier is formed without or without a substantial increase in the content of free fatty acids in the food product, and where the method includes the step of adding to the food product lipid acyltransferase.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта, включающего эмульгатор, и/или эфир стерола, и/или эфир станола, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to a method for producing a food product comprising an emulsifier and / or sterol ether and / or stanol ether, wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложен способ получения пищевого продукта, включающего по меньшей мере два эмульгатора, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.According to a further aspect of the present invention, there is provided a method for producing a food product comprising at least two emulsifiers, wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложен способ получения пищевого продукта, включающего по меньшей мере два эмульгатора, и/или эфир стерола, и/или эфир станола, где способ является таким, что эмульгатор образуется без увеличения или без существенного увеличения содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте, и где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.According to a further aspect of the present invention, there is provided a method for producing a food product comprising at least two emulsifiers and / or sterol ether and / or stanol ether, wherein the method is such that the emulsifier is formed without or without a substantial increase in the content of free fatty acids in the food a product, and wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложен способ получения пищевого продукта, включающего по меньшей мере два эмульгатора, и/или эфир стерола, и/или эфир станола, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.According to a further aspect of the present invention, there is provided a method for producing a food product comprising at least two emulsifiers and / or sterol ether and / or stanol ether, wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта, включающего эфир углевода, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In a further aspect, the present invention relates to a method for producing a food product comprising a carbohydrate ester, wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта, включающего эфир углевода и эмульгатор, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In a further aspect, the present invention relates to a method for producing a food product comprising a carbohydrate ester and an emulsifier, wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта, включающего эмульгатор и одно или несколько соединений из эфира углевода, эфира стерола, эфира станола, эфира протеина, моноглицерида или диглицерида, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to a method for producing a food product comprising an emulsifier and one or more compounds of a carbohydrate ester, sterol ester, stanol ester, protein ester, monoglyceride or diglyceride, wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липид-ацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, включающего эмульгатор, где эмульгатор образуется из составляющих пищевого материала с помощью липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to the use of a lipid acyltransferase for the preparation of a food product from an edible material, including an emulsifier, wherein the emulsifier is formed from constituents of the edible material using lipid acyltransferase.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению липид-ацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, включающего эмульгатор, где эмульгатор образуется без увеличения или без существенного увеличения содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте и где эмульгатор образуется из составляющих пищевого материала с помощью липид-ацилтрансферазы.In a further aspect, the present invention relates to the use of a lipid acyltransferase for the preparation of a food product from an edible material, including an emulsifier, wherein the emulsifier is formed without or without a substantial increase in the content of free fatty acids in the food product and where the emulsifier is formed from the constituents of the food material using lipid acyltransferases.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липид-ацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, включающего эмульгатор, и/или эфир стерола, и/или эфир станола, где эмульгатор образуется без увеличения или без существенного увеличения содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте и где эмульгатор, и/или эфир стерола, и/или эфир станола образуется из составляющих пищевого материала с помощью липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to the use of a lipid acyltransferase for the preparation of a food product from an edible material, including an emulsifier and / or sterol ester and / or stanol ester, where the emulsifier is formed without or without a significant increase in the content of free fatty acids in the food product and where the emulsifier and / or sterol ester and / or stanol ester is formed from the constituents of the food material using lipid acyltransferase.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липид-ацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, включающего эмульгатор, и/или эфир стерола, и/или эфир станола, где эмульгатор, и/или эфир стерола, и/или эфир станола образуется из составляющих пищевого материала с помощью липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to the use of a lipid acyltransferase for the preparation of a food product from an edible material comprising an emulsifier and / or sterol ester and / or stanol ether, where the emulsifier and / or sterol ester and / or stanol ester is formed from constituents of food material using lipid acyltransferase.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липид-ацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, включающего по меньшей мере два эмульгатора, где два эмульгатора образуются из составляющих пищевого материала с помощью липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to the use of a lipid acyltransferase to produce a food product from a food material comprising at least two emulsifiers, where two emulsifiers are formed from constituents of the food material using lipid acyltransferase.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложено применение липид-ацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, включающего по меньшей мере два эмульгатора, и/или эфир стерола, и/или эфир станола, где эмульгаторы образуются без увеличения или без существенного увеличения содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте и где один или оба из эмульгаторов и/или эфир стерола, и/или эфир станола образуются из составляющих пищевого материала с помощью липид-ацилтрансферазы.According to a further aspect of the present invention, there is provided the use of a lipid acyltransferase for preparing a food product from a food material comprising at least two emulsifiers and / or sterol ether and / or stanol ether, where emulsifiers are formed without or without a significant increase in the content of free fatty acids in a food product and where one or both of the emulsifiers and / or sterol ether and / or stanol ether are formed from the constituents of the food material using lipid acyltransferase.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложено применение липид-ацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, включающего по меньшей мере два эмульгатора, и/или эфир стерола, и/или эфир станола, где один или оба из эмульгаторов, и/или эфир стерола, и/или эфир станола образуются из составляющих пищевого материала с помощью липид-ацилтрансферазы.According to a further aspect of the present invention, there is provided the use of a lipid acyltransferase for preparing a food product from a food material comprising at least two emulsifiers and / or sterol ether and / or stanol ether, where one or both of emulsifiers and / or sterol ether, and / or stanol ether is formed from the constituents of the food material using lipid acyltransferase.

В следующем аспекте изобретение относится к применению липид-ацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, включающего эфир углевода, где эфир углевода образуется из составляющих пищевого материала с помощью липид-ацилтрансферазы.In a further aspect, the invention relates to the use of a lipid acyltransferase for preparing a food product from a food material, including a carbohydrate ester, wherein the carbohydrate ester is formed from the constituents of the food material using lipid acyltransferase.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липид-ацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, включающего по меньшей мере эфир углевода и дополнительный эмульгатор, где эфир углевода и эмульгатор образуются из составляющих пищевого материала с помощью липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to the use of a lipid acyltransferase to produce a food product from a food material comprising at least a carbohydrate ester and an additional emulsifier, wherein the carbohydrate ester and emulsifier are formed from the constituents of the food material using lipid acyltransferase.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липид-ацилтрансферазы для получения из пищевого материала пищевого продукта, включающего эмульгатор и одно или несколько соединений из эфира углевода, эфира стерола, эфира станола, эфира протеина, моноглицерида или диглицерида, где эмульгатор, и/или эфир углевода, и/или эфир стерола, и/или эфир станола, и/или эфир протеина, и/или моноглицерид, и/или диглицерид образуются из составляющих пищевого материала с помощью липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to the use of a lipid acyltransferase for the preparation of a food product from an edible material, comprising an emulsifier and one or more compounds of a carbohydrate ester, sterol ester, stanol ester, protein ester, monoglyceride or diglyceride, where the emulsifier and / or ester carbohydrate, and / or sterol ether, and / or stanol ether, and / or protein ester, and / or monoglyceride, and / or diglyceride are formed from the constituents of the food material using lipid acyltransferase.

В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения предложен способ получения in situ эмульгатора, предпочтительно, лизолецитина и эфира стерола в пищевом продукте на основе яиц, где способ является таким, что эмульгатор образуется без увеличения или без существенного увеличения содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте, и где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.According to a further aspect of the present invention, there is provided a method for producing an in situ emulsifier, preferably lysolecithin and sterol ester, in an egg-based food product, wherein the method is such that the emulsifier is formed without or without a substantial increase in the content of free fatty acids in the food product, and where the method includes the step of adding to the food product lipid acyltransferase.

В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения предложен способ получения in situ эмульгатора, предпочтительно, лизолецитина и эфира стерола в пищевом продукте на основе яиц, где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.According to a further aspect of the present invention, there is provided a method for producing an in situ emulsifier, preferably lysolecithin and sterol ester, in an egg-based food product, wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта на основе яиц, включающего эмульгатор, предпочтительно, лизолецитин и эфир стерола в пищевом продукте на основе яиц, где эмульгатор образуется без увеличения или без существенного увеличения содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте и где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to a method for producing an egg-based food product comprising an emulsifier, preferably lysolecithin and sterol ester in an egg-based food product, wherein the emulsifier is formed without or without a substantial increase in the content of free fatty acids in the food product and where includes the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта на основе яиц, включающего эмульгатор, предпочтительно, лизолецитин и эфир стерола в пищевом продукте на основе яиц и где способ включает стадию добавления к пищевому продукту липид-ацилтрансферазы.In another aspect, the present invention relates to a method for producing an egg-based food product comprising an emulsifier, preferably lysolecithin and sterol ester in an egg-based food product, and wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к пищевому продукту, который может быть получен, и предпочтительно, который получен способом согласно настоящему изобретению.In a further aspect, the present invention relates to a food product that can be obtained, and preferably, which is obtained by the method according to the present invention.

В другом аспекте настоящее изобретение дополнительно относится к пищевой ферментной композиции и/или к кормовой ферментной композиции, которая содержит липид-ацилтрансферазу, и к применению такой композиции в способах по настоящему изобретению.In another aspect, the present invention further relates to a food enzyme composition and / or to a feed enzyme composition that contains a lipid acyltransferase, and to the use of such a composition in the methods of the present invention.

В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения предложен способ идентификации подходящей липид-ацилтрансферазы для применения в соответствии с настоящим изобретением, включающий стадии тестирования целевого фермента одним или несколькими способами из "Анализа трансферазы в низководной среде", "Анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке" или "Анализа трансферазы в забуференном субстрате" и выбора липид-ацилтрансферазы, если она является такой, которая имеет одну или несколько из следующих характеристик:In accordance with a further aspect of the present invention, there is provided a method for identifying a suitable lipid acyltransferase for use in accordance with the present invention, comprising the steps of testing the target enzyme in one or more of the “Transferase Assay in a Low-Water Medium”, “Transferase Assay in a Highly Irrigated Egg Yolk” or "Analysis of transferase in a buffered substrate" and the choice of lipid acyltransferase, if it is one that has one or more of the following characteristics:

(а) при тестировании с использованием "Анализа трансферазы в низководной среде" при замерах после периода времени, выбранного из 30, 20 или 120 минут, имеет относительную трансферазную активность по меньшей мере 1%; (b) при тестировании с использованием "Анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке" с 54% воды имеет относительную трансферазную активность до 100% или (c) при тестировании с использованием "Анализа трансферазы в забуференном субстрате" имеет по меньшей мере 2% ацилтрансферазную активность.(a) when tested using a “Transferase Assay in a Low-Water Medium”, when measured after a period of time selected from 30, 20 or 120 minutes, has a relative transferase activity of at least 1%; (b) when tested using the “Highly watered egg yolk transferase assay” with 54% water, has a relative transferase activity of up to 100%; or (c) when tested using the “Transferase assay in buffered substrate” test, it has at least 2% acyltransferase activity .

Настоящее изобретение также относится к липид-ацилтрансферазе, идентифицированной с использованием способа согласно настоящему изобретению.The present invention also relates to lipid acyltransferase identified using the method of the present invention.

В соответствии со следующим аспектом настоящее изобретение относится к иммобилизованному ферменту липид-ацилтрансферазы, как он определен здесь.In accordance with a further aspect, the present invention relates to an immobilized lipid acyltransferase enzyme as defined herein.

Подробные аспекты настоящего изобретенияDetailed aspects of the present invention

Термин "липид-ацилтрансфераза", как он использован здесь, означает фермент, который проявляет как липазную активность (обычно классифицируемую как Е.С. 3.1.1.х в соответствии с Рекомендациями по номенклатуре ферментов (1992) Номенклатурной комиссии Международного Союза по биохимии и молекулярной биологии), так и ацилтрансферазную активность (обычно классифицируемую как Е.С. 2.3.1.х), благодаря чему фермент способен переносить ацильную группу от липида к одному или нескольким акцепторным субстратам, таким как один или несколько из следующих: стерол, станол, углевод, протеин, субъединица протеина, глицерин.The term "lipid acyltransferase", as used here, means an enzyme that exhibits lipase activity (usually classified as E.C. 3.1.1.x in accordance with the Recommendations on the Enzyme Nomenclature (1992) of the Nomenclature Commission of the International Union for Biochemistry and molecular biology) and acyltransferase activity (usually classified as E.C. 2.3.1.x), due to which the enzyme is able to transfer the acyl group from a lipid to one or more acceptor substrates, such as one or more of the following: ol, stanol, carbohydrate, protein, protein subunit, glycerin.

Предпочтительно, липид-ацилтрансфераза для использования в способах и/или для применений по настоящему изобретению способна переносить ацильную группу от липида (как он определен здесь) к одному или нескольким из следующих акцепторных субстратов: стеролу, станолу, углеводу, протеину или его субъединице или глицерину.Preferably, the lipid acyltransferase for use in the methods and / or applications of the present invention is capable of transferring an acyl group from a lipid (as defined herein) to one or more of the following acceptor substrates: sterol, stanol, carbohydrate, protein, or its subunit or glycerin .

Для некоторых аспектов "акцептором ацила" согласно настоящему изобретению может быть любое соединение, включающее гидроксильную группу (-ОН), такое как, например, многоатомные спирты, включая глицерин, стерол, станолы, углеводы, гидроксикислоты, включая фруктовые кислоты, лимонную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту и аскорбиновую кислоту, протеины или их субъединицы, такие как, например, аминокислоты, гидролизаты протеинов и пептиды (частично гидролизованные протеины) и их смеси и производные. Предпочтительно, "акцептор ацила" согласно настоящему изобретению не является водой.For some aspects, the “acyl acceptor” according to the present invention can be any compound comprising a hydroxyl group (—OH), such as, for example, polyhydric alcohols, including glycerol, sterol, stanols, carbohydrates, hydroxy acids, including fruit acids, citric acid, tartaric acid acid, lactic acid and ascorbic acid, proteins or their subunits, such as, for example, amino acids, protein hydrolysates and peptides (partially hydrolyzed proteins), and mixtures and derivatives thereof. Preferably, the “acyl acceptor” according to the present invention is not water.

В одном варианте осуществления акцептор ацила, предпочтительно, не является моноглицеридом и/или диглицеридом.In one embodiment, the acyl acceptor is preferably not a monoglyceride and / or diglyceride.

В одном аспекте фермент, предпочтительно, способен переносить ацильную группу от липида к стеролу и/или станолу.In one aspect, the enzyme is preferably capable of transferring an acyl group from a lipid to sterol and / or stanol.

В одном аспекте фермент, предпочтительно, способен переносить ацильную группу от липида к углеводу.In one aspect, the enzyme is preferably capable of transferring an acyl group from lipid to carbohydrate.

В одном аспекте фермент, предпочтительно, способен переносить ацильную группу от липида к протеину или к его субъединице. Подходящими субъединицами протеина могут быть один или несколько из следующих: аминокислота, гидролизат протеина, пептид, дипептид, олигопептид, полипептид.In one aspect, the enzyme is preferably capable of transferring an acyl group from a lipid to a protein or to its subunit. Suitable protein subunits may be one or more of the following: amino acid, protein hydrolyzate, peptide, dipeptide, oligopeptide, polypeptide.

Предпочтительно, в протеине или субъединице протеина акцептором ацила могут быть один или несколько из следующих составляющих протеина или субъединицы протеина: серина, треонина, тирозина или цистеина.Preferably, in the protein or protein subunit, the acyl acceptor may be one or more of the following components of the protein or protein subunit: serine, threonine, tyrosine or cysteine.

Когда субъединицей протеина является аминокислота, обычно аминокислота может быть любой подходящей аминокислотой. Подходящей аминокислотой может быть одна или несколько из числа серина, треонина, тирозина или цистеина.When the protein subunit is an amino acid, typically the amino acid may be any suitable amino acid. A suitable amino acid may be one or more of serine, threonine, tyrosine or cysteine.

В одном аспекте фермент, предпочтительно, способен переносить ацильную группу от липида к глицерину.In one aspect, the enzyme is preferably capable of transferring an acyl group from lipid to glycerin.

В одном аспекте фермент, предпочтительно, способен переносить ацильную группу от липида к гидроксикислоте.In one aspect, the enzyme is preferably capable of transferring an acyl group from a lipid to a hydroxy acid.

В одном аспекте фермент, предпочтительно, способен переносить ацильную группу от липида к многоатомному спирту.In one aspect, the enzyme is preferably capable of transferring an acyl group from a lipid to a polyhydric alcohol.

В одном аспекте липид-ацилтрансфераза может как переносить ацильную группу от липида к стеролу и/или станолу, так и переносить ацильную группу к одному или нескольким из следующих соединений: углевод, протеин, субъединица протеина, глицерин.In one aspect, a lipid acyltransferase can both transfer an acyl group from lipid to sterol and / or stanol, and transfer an acyl group to one or more of the following compounds: carbohydrate, protein, protein subunit, glycerol.

Предпочтительно, липидным субстратом, на котором действует липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению, является один или несколько из следующих липидов: фосфолипид, такой как лецитин, например фосфатидилхолин, триглицерид, кардиолипин, диглицерид или гликолипид, такой как, например, дигалактозилдиглицерид (DGDG). Такой липидный субстрат может быть назван здесь "липидным донором ацила". Термин "лецитин", как он использован здесь, охватывает фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин и фосфатидилглицерин.Preferably, the lipid substrate on which the lipid acyltransferase according to the present invention acts is one or more of the following lipids: a phospholipid, such as lecithin, for example phosphatidylcholine, triglyceride, cardiolipin, diglyceride or glycolipid, such as, for example, digalactosyldigly digly Such a lipid substrate may be referred to herein as an “acyl lipid donor". The term "lecithin", as used here, encompasses phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine and phosphatidylglycerol.

Для некоторых аспектов, предпочтительно, липидным субстратом, на котором действует липид-ацилтрансфераза, является фосфолипид, такой как лецитин, например фосфатидилхолин.For some aspects, preferably, the lipid substrate on which the lipid acyltransferase acts is a phospholipid, such as lecithin, for example phosphatidylcholine.

Для некоторых аспектов, предпочтительно, липидным субстратом является гликолипид, такой как, например, DGDG.For some aspects, the lipid substrate is preferably a glycolipid, such as, for example, DGDG.

Предпочтительно, липидным субстратом является пищевой липид, иначе говоря, липидный компонент пищевого продукта.Preferably, the lipid substrate is a food lipid, in other words, the lipid component of the food product.

Для некоторых аспектов, предпочтительно, липид-ацилтрансфераза согласно нестоящему изобретению является неспособной или практически неспособной воздействовать на триглицерид, и/или 1-моноглицерид, и/или на 2-моноглицерид.For some aspects, preferably, the lipid acyltransferase according to the present invention is incapable or practically incapable of acting on a triglyceride and / or 1-monoglyceride and / or 2-monoglyceride.

Обычно липидный субстрат или липидный донор ацила может быть одним или несколькими липидами, присутствующими в одном или нескольких субстратах: жирах, включая лярд, талловое и сливочное масло, маслах, включая масла, экстрагированные из или производные пальмового масла, подсолнечного масла, масла бобов сои, сафлорового масла, масла хлопковых семян, масла земляного ореха, кукурузного масла, оливкового масла, арахисового масла, кокосового масла и рапсового масла. Лецитин из сои, рапсового масла или яичного желтка также является подходящим липидным субстратом. Липидный субстрат может быть липидом овса или другим материалом на растительной основе, содержащим галактолипиды.Typically, the lipid substrate or the acyl lipid donor may be one or more lipids present in one or more substrates: fats, including lard, tall and butter, oils, including oils extracted from or derivatives of palm oil, sunflower oil, soybean oil, safflower oil, cottonseed oil, peanut oil, corn oil, olive oil, peanut oil, coconut oil and rapeseed oil. Lecithin from soy, canola oil or egg yolk is also a suitable lipid substrate. The lipid substrate may be oat lipid or other plant-based material containing galactolipids.

В одном аспекте липидным донором ацила, предпочтительно, является лецитин (такой как фосфатидилхолин) яичного желтка.In one aspect, the acyl lipid donor is preferably egg yolk lecithin (such as phosphatidylcholine).

Для некоторых аспектов настоящего изобретения липид может быть выбран из липидов, имеющих цепь жирной кислоты длиной от 8 до 22 атомов углерода.For some aspects of the present invention, the lipid may be selected from lipids having a fatty acid chain of 8 to 22 carbon atoms in length.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения липид может быть выбран из липидов, имеющих цепь жирной кислоты длиной от 16 до 22 атомов углерода, более предпочтительно, от 16 до 20 атомов углерода.For some aspects of the present invention, the lipid may be selected from lipids having a fatty acid chain of 16 to 22 carbon atoms in length, more preferably 16 to 20 carbon atoms.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения липид может быть выбран из липидов, имеющих цепь жирной кислоты длиной не более 14 атомов углерода, обычно из липидов, имеющих цепь жирной кислоты длиной от 4 до 14 атомов углерода, предпочтительно, от 4 до 10 атомов углерода, обычно от 4 до 8 атомов углерода.For some aspects of the present invention, the lipid may be selected from lipids having a fatty acid chain of no more than 14 carbon atoms, usually from lipids having a fatty acid chain of 4 to 14 carbon atoms, preferably from 4 to 10 carbon atoms, usually from 4 to 8 carbon atoms.

Обычно липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению может проявлять одну или несколько из следующих липазных активностей: гликолипазную активность (Е.С. 3.1.1.26), триацилглицеринлипазную активность (Е.С. 3.1.1.3), фосфолипазную А2 активность (Е.С. 3.1.1.4) или фосфолипазную А1 активность (Е.С. 3.1.1.32). Термин "гликолипазная активность", как он использован здесь, охватывает галактолипазную активность.Typically, the lipid acyltransferase according to the present invention may exhibit one or more of the following lipase activities: glycolipase activity (ES 3.1.1.26), triacylglycerol lipase activity (ES 3.1.1.3), phospholipase A2 activity (ES 3.1 .1.4) or phospholipase A1 activity (E.C. 3.1.1.32). The term "glycolipase activity," as used herein, encompasses galactolipase activity.

Обычно липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению может иметь по меньшей мере одну или несколько из следующих липазных активностей: гликолипазную активность (Е.С. 3.1.1.26), и/или фосфолипазную А1 активность (Е.С. 3.1.1.32), и/или фосфолипазную А2 активность (Е.С. 3.1.1.4).Typically, the lipid acyltransferase according to the present invention may have at least one or more of the following lipase activities: glycolipase activity (E.C. 3.1.1.26), and / or phospholipase A1 activity (E.C. 3.1.1.32), and / or phospholipase A2 activity (E.C. 3.1.1.4).

Для некоторых аспектов липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению может иметь по меньшей мере гликолипазную активность (Е.С. 3.1.1.26).For some aspects, the lipid acyltransferase according to the present invention may have at least glycolipase activity (EC 3.1.1.26).

Для некоторых аспектов, предпочтительно, липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению является способной переносить ацильную группу от гликолипида и/или фосфолипида к стеролу и/или станолу, образуя по меньшей мере эфир стерола и/или эфир станола.For some aspects, preferably, the lipid acyltransferase according to the present invention is capable of transferring an acyl group from a glycolipid and / or phospholipid to sterol and / or stanol, forming at least a sterol ester and / or stanol ester.

Для некоторых аспектов, предпочтительно, липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению является способной переносить ацильную группу от гликолипида и/или фосфолипида к углеводу, образуя по меньшей мере эфир углевода.For some aspects, preferably, the lipid acyltransferase according to the present invention is capable of transferring an acyl group from a glycolipid and / or phospholipid to a carbohydrate, forming at least a carbohydrate ester.

Для некоторых аспектов, предпочтительно, липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению является способной переносить ацильную группу от гликолипида и/или фосфолипида к протеину, образуя по меньшей мере эфир протеина (или конденсат протеина и жирной кислоты).For some aspects, preferably, the lipid acyltransferase according to the present invention is capable of transferring an acyl group from a glycolipid and / or phospholipid to a protein, forming at least a protein ester (or a protein and fatty acid condensate).

Для некоторых аспектов, предпочтительно, липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению является способной переносить ацильную группу от гликолипида и/или фосфолипида к глицерину, образуя по меньшей мере диглицерид и/или моноглицерид.For some aspects, preferably, the lipid acyltransferase according to the present invention is capable of transferring an acyl group from a glycolipid and / or phospholipid to glycerol, forming at least diglyceride and / or monoglyceride.

Для некоторых аспектов, предпочтительно, липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению не проявляет триацетилглицеридной липазной активности (Е.С. 3.1.1.3).For some aspects, preferably, the lipid acyltransferase according to the present invention does not exhibit triacetylglyceride lipase activity (EC 3.1.1.3).

В некоторых аспектах липид-ацилтрансфераза может быть способна переносить ацильную группу от липида к стеролу и/или станолу. Так, в одном варианте осуществления "акцептором ацила" согласно настоящему изобретению может быть или стерол, или станол, или сочетание и стерола, и станола.In some aspects, a lipid acyltransferase may be capable of transferring an acyl group from a lipid to sterol and / or stanol. Thus, in one embodiment, the “acyl acceptor” according to the present invention can be either sterol or stanol, or a combination of both sterol and stanol.

В одном варианте осуществления подходящий стерол и/или станол может включать одну или несколько из следующих структурных элементов:In one embodiment, a suitable sterol and / or stanol may include one or more of the following structural elements:

i) 3-бета-гидроксигруппа или 3-альфа-гидроксигруппа; и/илиi) a 3-beta hydroxy group or a 3-alpha hydroxy group; and / or

ii) А:В кольцо в цис-положении, или А:В кольцо в транс-положении, или С₅-С₆ является ненасыщенным.ii) A: The ring in the cis position, or A: The ring in the trans position, or C ₅ -C ₆ is unsaturated.

Подходящие стерольные акцепторы ацила включают холестерин и фитостеролы, например альфа-ситостерол, бета-ситостерол, стигмастерол, эргостерол, кампестрол, 5,6-дигидростерол, брассикастерол, альфа-спинастерол, бета-спинастерол, гамма-спинастерол, дельта-спинастерол, фукостерол, димостерол, аскостерол, серебистерол, эпистерол, анастерол, гипостерол, хондрилластерол, десмостерол, халиностерол, пориферастерол, клионастерол, глткозиды стерола и другие натуральные или синтетические изомерные формы и производные.Suitable sterile acyl acceptors include cholesterol and phytosterols, for example alpha-sitosterol, beta-sitosterol, stigmasterol, ergosterol, campestrol, 5,6-dihydrosterol, brassicasterol, alpha-spinasterol, beta-spinasterol, gamma-spinasterol, gamma-spinasterol, gamma-spinasterol, gamma-spinsterol, dimosterol, ascosterol, silver polystyrene, episterol, anasterol, hyposterol, chondrylasterol, desmosterol, chalinosterol, poriferrasterol, clionasterol, sterol gltcosides and other natural or synthetic isomeric forms and derivatives.

В одном аспекте настоящего изобретения, предпочтительно, более чем один стерол и/или станол может действовать как акцептор ацила, обычно более чем два стерола и/или станола могут действовать как акцептор ацила. Другими словами, в одном аспекте настоящего изобретения приемлемо может образоваться более чем один эфир стерола и/или эфир станола. Соответственно, когда акцептором ацила является холестерин, один или несколько дополнительных стеролов могут также действовать как акцепторы ацила. Так, в одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ получения in situ и эфира холестерина, и по меньшей мере одного эфира стерола или станола в сочетании. Другими словами, липид-ацилтрансфераза для некоторых аспектов настоящего изобретения может переносить ацильную группу от липида и к холестерину, и к по меньшей мере одному дополнительному стеролу и/или по меньшей мере одному станолу.In one aspect of the present invention, preferably more than one sterol and / or stanol can act as an acyl acceptor, typically more than two sterols and / or stanol can act as an acyl acceptor. In other words, in one aspect of the present invention, more than one sterol ester and / or stanol ester can suitably be formed. Accordingly, when cholesterol is an acyl acceptor, one or more additional sterols can also act as acyl acceptors. Thus, in one aspect, the present invention provides a method for producing in situ and cholesterol ester, and at least one sterol or stanol ester in combination. In other words, the lipid acyltransferase for some aspects of the present invention can transfer the acyl group from lipid to cholesterol, and to at least one additional sterol and / or at least one stanol.

В одном аспекте, предпочтительно, стерольным акцептором ацила является один или несколько из следующих соединений: альфа-ситостерол, бета-ситостерол, стигмастерол, эргостерол и кампестрол.In one aspect, a sterile acyl acceptor is preferably one or more of the following compounds: alpha-sitosterol, beta-sitosterol, stigmasterol, ergosterol and campestrol.

В одном аспекте, предпочтительно, стерольным акцептором ацила является холестерин. В том случае, когда холестерин является акцептором ацила для липид-ацилтрансферазы, количество холестерина в пищевом продукте уменьшается по сравнению с пищевым продуктом до того, как он подвергнут воздействию липид-ацилтрансферазы и/или по сравнению с эквивалентным пищевым продуктом, который не был обработан липид-ацилтрансферазой.In one aspect, preferably, the acyl sterol acceptor is cholesterol. When cholesterol is an acyl acceptor for lipid acyltransferase, the amount of cholesterol in the food product is reduced compared to the food product before it is exposed to lipid acyltransferase and / or compared to an equivalent food product that has not been processed lipid acyltransferase.

Подходящие станольные акцепторы ацила включают фитостанолы, например бета-ситостанол или ss-ситостанол.Suitable stanol acyl acceptors include phytostanols, for example beta-sitostanol or ss-sitostanol.

В одном аспекте, предпочтительно, стерольным и/или станольным акцептором ацила являются стерол и/или станол, отличные от холестерина.In one aspect, preferably, the sterol and / or stanolic acyl acceptor are sterol and / or stanol other than cholesterol.

В некоторых аспектах пищевой продукт, приготовленный в соответствии с настоящим изобретением, может быть использован для снижения холестерина сыворотки крови и/или для снижения липопротеина низкой плотности. И холестерин сыворотки крови, и липопротеин низкой плотности связывают с некоторыми заболеваниями человека, такими, например, как атеросклероз и/или заболевания сердца. Таким образом, можно предполагать, что пищевые продукты, приготовленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы для снижения риска таких заболеваний.In some aspects, a food product prepared in accordance with the present invention can be used to lower serum cholesterol and / or to lower low density lipoprotein. Both serum cholesterol and low density lipoprotein are associated with certain human diseases, such as, for example, atherosclerosis and / or heart disease. Thus, it can be assumed that food products prepared in accordance with the present invention can be used to reduce the risk of such diseases.

Так, в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению пищевого продукта согласно настоящему изобретению для использования при лечении и/или профилактике атеросклероза и/или заболеваний сердца.Thus, in one aspect, the present invention relates to the use of a food product according to the present invention for use in the treatment and / or prevention of atherosclerosis and / or heart disease.

В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает медикамент, включающий пищевой продукт согласно настоящему изобретению.In a further aspect, the present invention provides a medicament comprising a food product according to the present invention.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболеваний человека или животного, где способ включает введение пациенту эффективного количества пищевого продукта согласно настоящему изобретению.In a further aspect, the present invention relates to a method for treating and / or preventing a human or animal disease, wherein the method comprises administering to a patient an effective amount of a food product according to the present invention.

Стерольный и/или станольный акцептор ацила могут естественным образом содержаться в пищевом продукте. Альтернативно, стерол и/или станол могут быть добавлены в пищевой продукт. В том случае, когда стерол и/или станол добавляют в пищевой продукт, стерол и/или стенол могут быть добавлены до, одновременно и/или после добавления липид-ацилтрансферазы согласно настоящему изобретению. Соответственно, настоящее изобретение может охватывать добавление экзогенных стеролов/станолов, в частности фитостеролов/фитостанолов, к пищевому продукту до или одновременно с добавлением фермента согласно настоящему изобретению.The sterile and / or stanolic acyl acceptor may naturally be contained in the food product. Alternatively, sterol and / or stanol can be added to the food product. When sterol and / or stanol are added to the food product, sterol and / or stenol can be added before, simultaneously and / or after the addition of the lipid acyltransferase according to the present invention. Accordingly, the present invention may cover the addition of exogenous sterols / stanols, in particular phytosterols / phytostanols, to a food product before or simultaneously with the addition of the enzyme according to the present invention.

Для некоторых аспектов один или несколько станолов, присутствующих в пищевом продукте, могут быть превращены в один или несколько станолов перед тем или одновременно с тем, как добавляют липид-ацилтрансферазу согласно настоящему изобретению. Может быть применен любой подходящий способ превращения стеролов в станолы. Например, конверсия может быть осуществлена химическим гидрированием. Конверсию можно проводить перед добавлением липид-ацилтрансферазы согласно настоящему изобретению или одновременно с добавлением липид-ацилтрансферазы согласно настоящему изобретению. Подходящие для конверсии стеролов в станолы ферменты описаны в WO 00/061771.For some aspects, one or more stanols present in the food product can be converted to one or more stanols before or simultaneously with the addition of the lipid acyltransferase according to the present invention. Any suitable method of converting sterols to stanols may be used. For example, conversion may be carried out by chemical hydrogenation. The conversion can be carried out before the addition of the lipid acyltransferase according to the present invention or simultaneously with the addition of the lipid acyltransferase according to the present invention. Enzymes suitable for the conversion of sterols to stanols are described in WO 00/061771.

Соответственно, настоящее изобретение может быть использовано для получения эфиров фитостанолов in situ в пищевом продукте. Эфиры фитостанолов имеют повышенную растворимость в липидных мембранах, биодоступность и увеличенную полезность для здоровья (см., например, WO 92/99640).Accordingly, the present invention can be used to obtain phytostanol esters in situ in a food product. Phytostanol esters have increased solubility in lipid membranes, bioavailability and increased health benefits (see, for example, WO 92/99640).

В некоторых осуществлениях настоящего изобретения эфир станола и/или эфир стерола может быть вкусовым агентом и/или текстуризатором. В таких случаях настоящее изобретение охватывает получение in situ вкусовых агентов и/или текстуризаторов.In some implementations of the present invention, the stanol ester and / or sterol ester may be a flavoring agent and / or texturizer. In such cases, the present invention encompasses the preparation of in situ flavoring agents and / or texturizers.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению может использовать в качестве акцептора ацила углевод. Углеводным акцептором ацила могут быть один или несколько из следующих соединений: моносахарид, дисахарид, олигосахарид или полисахарид. Предпочтительно, углеводом является один или несколько из следующих соединений: глюкоза, фруктоза, ангидрофруктоза, мальтоза, лактоза, сахароза, галактоза, ксилоза, ксилоолигосахариды, арабиноза, мальтоолигосахариды, тагатоза, микротецин, аскопирон Р, аскопирон Т, кортальцерон.For some aspects of the present invention, the lipid acyltransferase according to the present invention can use a carbohydrate as an acyl acceptor. The carbohydrate acyl acceptor may be one or more of the following compounds: a monosaccharide, disaccharide, oligosaccharide or polysaccharide. Preferably, the carbohydrate is one or more of the following compounds: glucose, fructose, anhydrofructose, maltose, lactose, sucrose, galactose, xylose, xylo-oligosaccharides, arabinose, maltooligosaccharides, tagatose, microthecin, ascopyron P, ascopyrone T, cortalcer.

Углеводный акцептор ацила может естественным образом содержаться в пищевом продукте. Альтернативно, углевод может быть добавлен в пищевой продукт. В том случае, когда углевод добавляют в пищевой продукт, углевод может быть добавлен до, одновременно и/или после добавления липид-ацилтрансферазы согласно настоящему изобретению.The acyl carbohydrate acceptor may naturally be present in the food product. Alternatively, a carbohydrate may be added to the food product. When the carbohydrate is added to the food product, the carbohydrate may be added before, simultaneously and / or after the addition of the lipid acyltransferase according to the present invention.

Эфиры углеводов могут работать как ценные эмульгаторы в пищевом продукте. Так, в том случае, когда фермент работает на перенос ацильной группы к сахару, изобретение охватывает образование in situ второго эмульгатора в пищевом продукте.Carbohydrate esters can work as valuable emulsifiers in a food product. So, in the case where the enzyme works to transfer the acyl group to sugar, the invention encompasses the in situ formation of a second emulsifier in a food product.

В некоторых осуществлениях липид-ацилтрансфераза может использовать в качестве акцептора ацила и стерол и/или станол, и углевод.In some embodiments, the lipid acyltransferase may use aster and / or stanol and carbohydrate as the acyl acceptor.

Применение липид-ацилтрансферазы, которая может переносить ацильную группу как к углеводу, так и к стеролу и/или станолу, является особо выгодным для пищевых продуктов, включающих яйца. В частности, присутствие сахаров, в особенности глюкозы, в яйцах и яичных продуктах часто рассматривается как нежелательное. Яичный желток может включать до 1% глюкозы. Обычно яйца или продукты на основе яиц могут быть обработаны оксидазой глюкозы для удаления части глюкозы или всей глюкозы. Однако в соответствии с настоящим изобретением такой нежелательный сахар может быть легко удален "этерификацией" сахара с образованием эфира сахара.The use of lipid acyltransferase, which can transfer the acyl group to both carbohydrate and sterol and / or stanol, is particularly beneficial for foods including eggs. In particular, the presence of sugars, especially glucose, in eggs and egg products is often considered undesirable. Egg yolk may include up to 1% glucose. Typically, eggs or egg-based products can be treated with glucose oxidase to remove part of the glucose or all of the glucose. However, in accordance with the present invention, such unwanted sugar can be easily removed by "esterifying" the sugar to form a sugar ester.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению может использовать в качестве акцептора ацила протеин. Обычно протеин может быть одним или несколькими из протеинов, находимых в пищевом продукте, например в молочном продукте или в мясном продукте. Только в качестве примера подходящими протеинами могут быть протеины, находимые в твороге или в сыворотке, такие как лактоглобулин. Другие подходящие протеины включают овальбумин из яиц, глиадин, глютенин, пуроиндолинпротеины переноса липидов из зерна и миозин из мяса.For some aspects of the present invention, the lipid acyltransferase according to the present invention can use a protein as an acyl acceptor. Typically, a protein may be one or more of the proteins found in a food product, for example, a dairy product or a meat product. By way of example only, proteins found in cottage cheese or whey, such as lactoglobulin, may be suitable. Other suitable proteins include ovalbumin from eggs, gliadin, glutenin, puroindoline protein transfer of lipids from grain and myosin from meat.

Так, в соответствии с настоящим изобретением можно достичь одного или нескольких из следующих положительных качеств: образование in situ эмульгатора без увеличения свободных жирных кислот; уменьшение накопления свободных жирных кислот в пищевом продукте; снижение уровней свободного холестерина в пищевом продукте; увеличение эфиров стерола и/или эфиров стенола; снижение холестерина сыворотки крови и/или липопротеинов низкой плотности; увеличение эфиров углеводов; снижение нежелательных свободных сахаров.Thus, in accordance with the present invention, one or more of the following positive qualities can be achieved: in situ formation of an emulsifier without an increase in free fatty acids; reduction in the accumulation of free fatty acids in a food product; lower levels of free cholesterol in a food product; an increase in sterol esters and / or stenol ethers; lowering serum cholesterol and / or low density lipoproteins; increase in carbohydrate esters; reduction of unwanted free sugars.

Преимуществом настоящего изобретения является то, что эмульгатор (эмульгаторы) образуются in situ в пищевом продукте без увеличения или без существенного увеличения содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте. Образование свободных жирных кислот может быть вредным для пищевого продукта. В частности, свободные жирные кислоты были связаны с потерей запахов и потерей вкуса пищевых продуктов, а также другими вредными эффектами, включая, например, мыльный вкус сыра. Предпочтительно, способ согласно настоящему изобретению дает в результате образование in situ эмульгатора (эмульгаторов), где накопление свободных жирных кислот уменьшено и/или устранено. Не желая быть связанными теорией, в соответствии с настоящим изобретением жирные кислоты, которые выделены из липидов, переносятся липид-ацилтрансферазой к акцептору ацила, например стеролу и/или станолу. Таким образом, общий уровень свободных жирных кислот в пищевом продукте не увеличивается или увеличивается лишь в незначительной степени. Это резко отличается от ситуации, когда для образования эмульгаторов in situ используют липазы (Е.С. 3.1.1.х). В частности, применение липаз может привести к увеличению количества свободных жирных кислот в пищевом продукте, которое может быть вредным. В соответствии с настоящим изобретением накопление свободных жирных кислот уменьшено или устранено по сравнению с количеством свободных жирных кислот, которое должно было накопится, если бы фермент липаза, в частности фермент фосфолипаза А, был использован вместо липид-ацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением.An advantage of the present invention is that emulsifier (s) are formed in situ in a food product without or without a substantial increase in the content of free fatty acids in the food product. The formation of free fatty acids can be harmful to the food product. In particular, free fatty acids were associated with loss of odors and loss of taste of food products, as well as other harmful effects, including, for example, the soapy taste of cheese. Preferably, the method according to the present invention results in the formation of in situ emulsifier (s), where the accumulation of free fatty acids is reduced and / or eliminated. Without wishing to be bound by theory, in accordance with the present invention, fatty acids that are isolated from lipids are transferred by a lipid acyltransferase to an acyl acceptor, for example, sterol and / or stanol. Thus, the total level of free fatty acids in a food product does not increase or increases only slightly. This is very different from the situation when lipases are used for the formation of emulsifiers in situ (E.C. 3.1.1.x). In particular, the use of lipases can lead to an increase in the amount of free fatty acids in a food product, which can be harmful. In accordance with the present invention, the accumulation of free fatty acids is reduced or eliminated compared to the amount of free fatty acids that would have accumulated if the lipase enzyme, in particular the phospholipase A enzyme, were used instead of the lipid acyltransferase in accordance with the present invention.

Применение липид-ацилтрансферазы, которая может переносить ацильную группу к стеролу и/или станолу, может быть особенно полезным для пищевых продуктов, включающих яйца. В частности, было найдено, что после обработки липид-ацилтрансферазой, как она определена здесь, может быть получен продукт на основе яиц со значительно лучшими свойствами по сравнению с продуктами на основе яиц, обработанными обычными фосфолипазами, такими как, например, LipopanF® (Novozymes A/S, Denmark), Lecitase Ultra® (Novozymes A/S, Denmark), или Lipomod 22 L от Biocatalysts.The use of lipid acyltransferase, which can transfer the acyl group to sterol and / or stanol, can be particularly useful for foods including eggs. In particular, it was found that after treatment with lipid acyltransferase as defined here, an egg-based product with significantly better properties can be obtained compared to egg-based products treated with conventional phospholipases, such as, for example, LipopanF® (Novozymes A / S, Denmark), Lecitase Ultra® (Novozymes A / S, Denmark), or Lipomod 22 L from Biocatalysts.

Предпочтительно, фермент липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению может быть характеризован следующими критериями:Preferably, the lipid acyltransferase enzyme according to the present invention can be characterized by the following criteria:

(i) фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которая может быть определена как активность переноса эфира, в результате чего ацильная часть первоначальной эфирной связи липидного донора ацила переносится к акцептору ацила, образуя новый эфир, и(i) the enzyme has an acyltransferase activity, which can be defined as the activity of ether transfer, as a result of which the acyl part of the initial ether linkage of the acyl lipid donor is transferred to the acyl acceptor, forming a new ether, and

(ii) фермент включает фрагмент аминокислотной последовательности GDSX, где X представляет один или несколько из следующих аминокислотных радикалов: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M или S.(ii) the enzyme comprises a fragment of the GDSX amino acid sequence, where X represents one or more of the following amino acid radicals: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M, or S.

Предпочтительно, X фрагмента GDSX представляет L. Таким образом, предпочтительно, фермент согласно настоящему изобретению включает фрагмент последовательности аминокислот GSDL.Preferably, the X of the GDSX fragment is L. Thus, preferably, the enzyme of the present invention includes a GSDL amino acid sequence fragment.

Фрагмент GSDL состоит из четырех сохраненных аминокислот. Предпочтительно, серин внутри фрагмента представляет каталитический серин фермента липид-ацилтрансферазы. Предпочтительно, серин фрагмента GSDX может быть в положении, соответствующем Ser-16 в липолитическом ферменте Aeromonas hydrophilla, описанном Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p. 2060-2064).The GSDL fragment consists of four stored amino acids. Preferably, the serine within the fragment is a catalytic serine of a lipid acyltransferase enzyme. Preferably, the serine of the GSDX fragment can be at the Ser-16 position in the Aeromonas hydrophilla lipolytic enzyme described by Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p. 2060-2064).

Для того чтобы определить, имеет ли протеин фрагмент GSDX согласно настоящему изобретению, последовательность, предпочтительно, сравнивают с профилями скрытой марковской модели (профилями HMM) базы данных Pfam.In order to determine whether a protein has a GSDX fragment according to the present invention, the sequence is preferably compared with the hidden Markov model profiles (HMM profiles) of the Pfam database.

Pfam представляет собой базу данных по семействам доменов протеинов. Pfam содержит выверенные выравнивания кратных последовательностей для каждого семейства, а также профиль скрытой марковской модели (профиль НММ) для идентификации таких доменов в новых последовательностях. Введение в Pfam можно найти в Bateman A. et al. (2002) Nucleic Acid Res. 30; 276-280. Скрытые марковские модели используются в ряде баз данных, нацеленных на идентификацию протеинов, для обзора см. Bateman A. and Haft DH (2002) Brief Bioinform 3; 236-245.Pfam is a database of protein domain families. Pfam contains verified alignments of multiple sequences for each family, as well as a hidden Markov model profile (HMM profile) to identify such domains in new sequences. An introduction to Pfam can be found in Bateman A. et al. (2002) Nucleic Acid Res. 30 ; 276-280. Hidden Markov models are used in a number of protein identification databases; for review, see Bateman A. and Haft DH (2002) Brief Bioinform 3 ; 236-245.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12230032&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12230032&dopt=Abstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=11752314&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=11752314&dopt=Abstract

Для подробного объяснения скрытых марковских моделей и того, как они использованы в базе данных Pfam, см. Durbin R., Eddy S. and Krogh A. (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4. Пакет программ Hammer может быть получен из Washington University, St. Louis, USA.For a detailed explanation of hidden Markov models and how they are used in the Pfam database, see Durbin R., Eddy S. and Krogh A. (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4. The Hammer software package can be obtained from Washington University, St. Louis, USA.

Альтернативно, фрагмент GDSX может быть идентифицирован с использованием пакета программ Hammer, инструкции представлены в Durbin R., Eddy S. and Krogh A. (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4 и в имеющихся там ссылках, и в профиле HMMER2, представленном в настоящей заявке.Alternatively, a GDSX fragment can be identified using the Hammer software package; instructions are provided in Durbin R., Eddy S. and Krogh A. (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4 both in the references therein and in the HMMER2 profile presented in this application.

Доступ к базе данных Pfam может быть осуществлен, например, через несколько серверов, которые в настоящее время размещены на следующих веб-сайтах:The Pfam database can be accessed, for example, through several servers that are currently hosted on the following websites:

http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtmlhttp://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml

http://pfam.wustl.edu/http://pfam.wustl.edu/

http://pfam.jouy.inra.fr/http://pfam.jouy.inra.fr/

http://pfam.cgb.ki.se/http://pfam.cgb.ki.se/

Эта база данных предлагает возможность поиска, куда можно ввести белковую последовательность. Используя параметры по умолчанию базы данных, белковая последовательность будет затем анализироваться на присутствие доменов Pfam. Домен GDSX является признанным доменом в базе данных, и раз так, то его присутствие в любой запрашиваемой последовательности должно быть распознано. База данных должна вернуть выравнивание Pfam00657 консенсусной последовательности в запрашиваемую последовательность.This database offers the ability to search where a protein sequence can be entered. Using the default settings of the database, the protein sequence will then be analyzed for the presence of Pfam domains. The GDSX domain is a recognized domain in the database, and if so, then its presence in any requested sequence should be recognized. The database should return the alignment of the Pfam00657 consensus sequence to the requested sequence.

Множественное выравнивание, включающее Aeromonas salmonicida или Aeromonas hydrophila, может быть получено:Multiple alignment, including Aeromonas salmonicida or Aeromonas hydrophila , can be obtained:

а) вручнуюa) manually

получить выравнивание целевого протеина к консенсусной последовательности Pfam00657 и получить выравнивание P10480 к консенсусной последовательности Pfam00657 после описанной выше процедуры;obtain alignment of the target protein to the consensus sequence of Pfam00657 and obtain alignment of P10480 to the consensus sequence of Pfam00657 after the above procedure;

илиor

b) из базы данныхb) from the database

После идентификации консенсусной последовательности Pfam00657 база данных предлагает показать выравнивание запрашиваемой последовательности к начальному выравниванию консенсусной последовательности Pfam00657. P10480 является частью этого начального выравнивания и указывается с помощью GCAT-AERHY. И запрашиваемая последовательность, и P10480 будут показаны на дисплее в одном и том же окне.After identifying the consensus sequence of Pfam00657, the database offers to show the alignment of the requested sequence to the initial alignment of the consensus sequence of Pfam00657. P10480 is part of this initial alignment and is indicated by GCAT-AERHY. Both the requested sequence and P10480 will be shown on the display in the same window.

Референтная последовательность Aeromonas hydrophila:Reference sequence Aeromonas hydrophila :

Радикалы липазы Aeromonas hydrophila GDSX нумеруются в NCBI файле Р10480, номера в данном тексте относятся к номерам, приведенным в том файле, который используют в настоящем изобретении для определения специфических аминокислотных остатков, которые в предпочтительном варианте осуществления присутствуют в ферментах липид-ацилтрансферазы по изобретению. Aeromonas hydrophila GDSX lipase radicals are numbered in the P10480 NCBI file, the numbers in this text refer to the numbers in the file used in the present invention to determine the specific amino acid residues that, in a preferred embodiment, are present in the lipid acyltransferase enzymes of the invention.

Выравнивание Pfam представлено на фиг.33 и 34.Pfam alignment is shown in FIGS. 33 and 34.

Следующие сохраненные радикалы могут быть распознаны и в предпочтительном варианте осуществления могут присутствовать в ферментах для применения в композициях и способах по изобретению.The following stored radicals may be recognized and, in a preferred embodiment, may be present in enzymes for use in the compositions and methods of the invention.

Блок 1 - блок GDSXBlock 1 - GDSX Block

hidhid hidhid hidhid hidhid GlyGly AspAsp SerSer hidhid 2828 2929th 30thirty 3131 3232 3333 3434 3535

Блок 2 - блок GANDYBlock 2 - GANDY Block

hidhid GlyGly hidhid AsnAsn AspAsp hidhid 130130 131131 132132 133133 134134 135135

Блок 3 - блок HPTBlock 3 - HPT Block

HisHis 309309

где "hid" означает гидрофильный остаток, выбранный из Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr, Phe.where "hid" means a hydrophilic residue selected from Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr, Phe.

Предпочтительно, фермент липид-ацилтрансфераза для применения в композициях/способах по изобретению может быть выровнен с использованием консенсусной последовательности Pfam00657.Preferably, the lipid acyltransferase enzyme for use in the compositions / methods of the invention can be aligned using the Pfam00657 consensus sequence.

Предпочтительно, положительная совместимость с профилем скрытой марковской модели (профилем НММ) семейства доменов pfam00657 показывает присутствие домена GDSX или GDSL согласно настоящему изобретению.Preferably, positive compatibility with the hidden Markov model profile (HMM profile) of the pfam00657 domain family indicates the presence of the GDSX or GDSL domain of the present invention.

Предпочтительно, липид-ацилирансфераза для применения в композициях/способах по изобретению, когда она выравнена к консенсусной последовательности Pfam00657, имеет по меньшей мере больше одного, предпочтительно, больше двух из следующих блоков: блок GDSX, блок GANDY, блок HTP. Допустимо, когда липид-ацилтрансфераза имеет блок GDSX и блок GANDY. Альтернативно, фермент может иметь блок GDSX и блок HTP. Предпочтительно, фермент включает по меньшей мере блок GDSX.Preferably, the lipid acyl transferase for use in the compositions / methods of the invention, when it is aligned with the consensus sequence Pfam00657, has at least more than one, preferably more than two of the following blocks: GDSX block, GANDY block, HTP block. Valid when the lipid acyltransferase has a GDSX block and a GANDY block. Alternatively, the enzyme may have a GDSX block and an HTP block. Preferably, the enzyme comprises at least a GDSX unit.

Предпочтительно, фермент для применения в композициях/способах по изобретению, когда он выравнен к консенсусной последовательности Pfam00657, когда его сравнивают с референтной полипептидной последовательностью A.hydrophila, а именно SEQ ID No. 32, имеет по меньшей мере один, предпочтительно, больше одного, предпочтительно, больше двух, предпочтительно, больше трех, предпочтительно, больше четырех, предпочтительно, больше пяти, предпочтительно, больше шести, предпочтительно, больше семи, предпочтительно, больше восьми, предпочтительно, больше девяти, предпочтительно, больше десяти, предпочтительно, больше одиннадцати, предпочтительно, больше двенадцати, предпочтительно, больше тринадцати, предпочтительно, больше четырнадцати следующих остатков аминокислот: 28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132Hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His.Preferably, the enzyme for use in the compositions / methods of the invention when it is aligned with the consensus sequence of Pfam00657, when it is compared with the reference polypeptide sequence of A.hydrophila , namely SEQ ID No. 32, has at least one, preferably more than one, preferably more than two, preferably more than three, preferably more than four, preferably more than five, preferably more than six, preferably more than seven, preferably more than eight, preferably more than nine, preferably more than ten, preferably more than eleven, preferably more than twelve, preferably more than thirteen, preferably more than fourteen of the following amino acid residues: 28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33As p, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132Hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His.

Домен pfam00657 GDSX является уникальным идентификатором, который отличает протеины, обладающие указанным доменом, от других ферментов.The pfam00657 GDSX domain is a unique identifier that distinguishes proteins that have the specified domain from other enzymes.

Консенсусная последовательность pfam00657 представлена на фиг.1 как SEQ ID No. 1. Она получена идентификацией семейства pfam00657 версии 6 базы данных, которая может также называться здесь как pfam00657.6.The consensus sequence pfam00657 is shown in FIG. 1 as SEQ ID No. 1. It is obtained by identifying the family pfam00657 version 6 of the database, which may also be referred to as pfam00657.6 here.

Консенсусная последовательность может быть усовершенствована при использовании следующих версий базы данных Pfam.Consensus consistency can be improved by using the following versions of the Pfam database.

Например, фиг.33 и 34 показывают pfam выравнивание семейства 00657 из версии 11 базы данных, которая может также называться здесь как pfam00657.11.For example, FIGS. 33 and 34 show pfam alignment of the 00657 family of database version 11, which may also be referred to as pfam00657.11 here.

Присутствие блоков GDSX, GANDY и НРТ обнаружено в семействе pfam00657 обеих версий базы данных. Последующие версии базы данных Pfam могут быть использованы для идентификации семейства pfam00657.The presence of GDSX, GANDY, and HPT blocks was detected in the pfam00657 family of both versions of the database. Subsequent versions of the Pfam database can be used to identify the pfam00657 family.

Предпочтительно, фермент липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению может быть характеризован с использованием следующих критериев:Preferably, the lipid acyltransferase enzyme according to the present invention can be characterized using the following criteria:

(i) фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которая может быть определена как активность переноса эфира, в результате чего ацильная часть первоначальной эфирной связи липидного донора ацила переносится к акцептору ацила, образуя новый эфир;(i) the enzyme has acyltransferase activity, which can be defined as ether transfer activity, as a result of which the acyl portion of the initial ether linkage of the acyl lipid donor is transferred to the acyl acceptor, forming a new ether;

(ii) фермент включает фрагмент последовательности аминокислот GDSX, где X представляет собой один или несколько из следующих аминокислотных радикалов: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M или S;(ii) the enzyme includes a fragment of the GDSX amino acid sequence, where X represents one or more of the following amino acid radicals: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M, or S;

(iii) фермент включает His-309 или включает гистидиновый радикал в положении His-309 в липолитическом ферменте Aeromonas hydrophila, показанном на фиг.2 (SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 32).(iii) the enzyme includes His-309 or comprises a histidine radical at the His-309 position in the lipolytic enzyme Aeromonas hydrophila shown in FIG. 2 (SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 32).

Предпочтительно, аминокислотным радикалом фрагмента GDSX является L.Preferably, the amino acid radical of the GDSX fragment is L.

В SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 32 первые 18 аминокислотных радикалов образуют сигнальную последовательность. His-309 последовательности полной длины, т.е. протеин, включающий сигнальную последовательность, приравнивается к His-291 зрелой части протеина, т.е. последовательности без сигнальной последовательности.In SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. The 32 first 18 amino acid radicals form a signal sequence. His-309 sequences of full length, i.e. a protein comprising a signal sequence is equated to the His-291 mature portion of the protein, i.e. sequences without signal sequence.

Предпочтительно, фермент липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению включает следующую каталитическую триаду: Ser-34, Asp-134 и His-309 или включает сериновый остаток, остаток аспарагиновой кислоты и остаток гистидина соответственно в положениях, соответствующих Ser-34, Asp-134 и His-309, в липолитическом ферменте Aeromonas hydrophila, показанном на фиг.2 (SEQ ID No. 2) или фиг.28 (SEQ ID No. 32). Как заявлено выше, в последовательности, показанной в SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 32, первые 18 аминокислотных радикалов образуют сигнальную последовательность. Ser-34, Asp-134 и His-309 последовательности полной длины, т.е. протеина, включающего сигнальную последовательность, приравниваются к Ser-16, Asp-116 и His-291 зрелой части протеина, т.е. последовательности без сигнальной последовательности. В консенсусной последовательности pfam00657, которая приведена на фиг.1 (SEQ ID No. 1), остатки активного сайта соответствуют Ser-7, Asp-157 и His-348.Preferably, the lipid acyltransferase enzyme according to the present invention includes the following catalytic triad: Ser-34, Asp-134 and His-309 or includes a serine residue, an aspartic acid residue and a histidine residue, respectively, at the positions corresponding to Ser-34, Asp-134 and His -309, in the lipolytic enzyme Aeromonas hydrophila shown in FIG. 2 (SEQ ID No. 2) or FIG. 28 (SEQ ID No. 32). As stated above, in the sequence shown in SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 32, the first 18 amino acid radicals form a signal sequence. Ser-34, Asp-134, and His-309 sequences of full length, i.e. a protein including a signal sequence is equated with the Ser-16, Asp-116 and His-291 mature portion of the protein, i.e. sequences without signal sequence. In the consensus sequence pfam00657, which is shown in figure 1 (SEQ ID No. 1), the remains of the active site correspond to Ser-7, Asp-157 and His-348.

(i) фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которая может быть определена как активность переноса эфира, в результате чего ацильная часть первоначальной эфирной связи первого липидного донора ацила переносится к акцептору ацила, образуя новый эфир;(i) the enzyme has acyltransferase activity, which can be defined as the activity of ether transfer, as a result of which the acyl part of the initial ether linkage of the first lipid acyl donor is transferred to the acyl acceptor, forming a new ether;

(ii) фермент включает по меньшей мере Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 и His-309 или включает остатки глицина, аспарагиновой кислоты, серина, аспарагиновой кислоты и гистидина в положениях, соответствующих Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 и His-309 в липолитическом ферменте Aeromonas hydrophila, показанном на фиг.2 (SEQ ID No. 2) или фиг.28 (SEQ ID No. 32).(ii) the enzyme comprises at least Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134, and His-309, or includes residues of glycine, aspartic acid, serine, aspartic acid, and histidine at positions corresponding to Gly-32, Asp -33, Ser-34, Asp-134, and His-309 in the Aeromonas hydrophila lipolytic enzyme shown in FIG. 2 (SEQ ID No. 2) or FIG. 28 (SEQ ID No. 32).

Предпочтительно, фермент липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению может быть получен, еще более предпочтительно, фермент получен из организмов из одного или нескольких из следующих родов: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mezorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas и Candida.Preferably, the lipid acyltransferase enzyme according to the present invention can be obtained, even more preferably, the enzyme is obtained from organisms from one or more of the following genera: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Campulfobacterium, Campulfobacterium, Campulfobacterium, Campulfibacterae, Campulfibacterae, Campulfus , Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mezorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas and Candida .

Предпочтительно, фермент липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению может быть получен, еще более предпочтительно, фермент получен из одного или нескольких из следующих организмов: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streptococcus pyogenes, Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans, Bacillus sp., Campylobacter jejuni, Vibrionaceae, Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cervisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocitrogenes, Neisseria meningitides, Mezorhizobium loti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris и Candida parapsilosis.Preferably, the lipid acyltransferase enzyme according to the present invention can be obtained, even more preferably, the enzyme is obtained from one or more of the following organisms: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streptococcus pyogenes, Lactococcus lactococcus pycococcus lactococcus lactococcus pyogenococcus Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans , Bacillus sp., Campylobacter jejuni, Vibrionaceae, Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cervisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocitrogenes, Neisseria meningitides, Mezorhizobium loti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris and Candida parapsilosis .

В одном аспекте, предпочтительно, фермент липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению является получаемым и, предпочтительно, полученным из одного или более из Aeromonas hydrophila или Aeromonas salmonicida. In one aspect, preferably, the lipid acyltransferase enzyme according to the present invention is obtainable and preferably derived from one or more of Aeromonas hydrophila or Aeromonas salmonicida.

Предпочтительно, фермент липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению включает одну или несколько из следующих последовательностей аминокислот:Preferably, the lipid acyltransferase enzyme according to the present invention includes one or more of the following amino acid sequences:

(i) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 2 (см. фиг.2);(i) the amino acid sequence shown as SEQ ID No. 2 (see figure 2);

(ii) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 3 (см. фиг.3);(ii) the amino acid sequence shown as SEQ ID No. 3 (see FIG. 3);

(iii) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 4 (см. фиг.4);(iii) the amino acid sequence shown as SEQ ID No. 4 (see FIG. 4);

(iv) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 5 (см. фиг.5);(iv) the amino acid sequence shown as SEQ ID No. 5 (see FIG. 5);

(v) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 6 (см. фиг.6);(v) the amino acid sequence shown as SEQ ID No. 6 (see FIG. 6);

(vi) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 12 (см. фиг.14);(vi) the amino acid sequence shown as SEQ ID No. 12 (see Fig. 14);

(vii) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 20 (см. фиг.16);(vii) the amino acid sequence shown as SEQ ID No. 20 (see FIG. 16);

(viii) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 22 (см. фиг.18);(viii) amino acid sequence shown as SEQ ID No. 22 (see Fig. 18);

(ix) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 24 (см. фиг.20);(ix) amino acid sequence shown as SEQ ID No. 24 (see FIG. 20);

(x) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 26 (см. фиг.22);(x) amino acid sequence shown as SEQ ID No. 26 (see FIG. 22);

(xi) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 28 (см. фиг.24);(xi) amino acid sequence shown as SEQ ID No. 28 (see FIG. 24);

(xii) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 30 (см. фиг.26);(xii) amino acid sequence shown as SEQ ID No. 30 (see Fig. 26);

(xiii) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 32 (см. фиг.28);(xiii) amino acid sequence shown as SEQ ID No. 32 (see Fig. 28);

(xiv) последовательность аминокислот, показанная как SEQ ID No. 34 (см. фиг.30), или последовательность аминогрупп, которая имеет 75% или более идентичности с любой одной из последовательностей, показанных как SEQ ID No. 2; SEQ ID No. 3; SEQ ID No. 4; SEQ ID No. 5; SEQ ID No. 6; SEQ ID No. 12; SEQ ID No. 20; SEQ ID No. 22; SEQ ID No. 24; SEQ ID No. 26; SEQ ID No. 28; SEQ ID No. 30; SEQ ID No. 32; SEQ ID No. 34.(xiv) amino acid sequence shown as SEQ ID No. 34 (see FIG. 30), or an amino group sequence that has 75% or more identity with any one of the sequences shown as SEQ ID No. 2; SEQ ID No. 3; SEQ ID No. four; SEQ ID No. 5; SEQ ID No. 6; SEQ ID No. 12; SEQ ID No. twenty; SEQ ID No. 22; SEQ ID No. 24; SEQ ID No. 26; SEQ ID No. 28; SEQ ID No. thirty; SEQ ID No. 32; SEQ ID No. 34.

Предпочтительно, фермент липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению включает или последовательность аминокислот, показанную как SEQ ID No. 2, или SEQ ID No. 3, или SEQ ID No. 4, или SEQ ID No. 32, или SEQ ID No. 34, или включает последовательность аминокислот, которая имеет 75% или более, предпочтительно, 80% или более, предпочтительно, 85% или более, предпочтительно, 90% или более, предпочтительно, 95% или более идентичности с последовательностью аминокислот, показанной как SEQ ID No. 2, или с последовательностью аминокислот, показанной как SEQ ID No. 3, или с последовательностью аминокислот, показанной как SEQ ID No. 4, или с последовательностью аминокислот, показанной как SEQ ID No. 32, или с последовательностью аминокислот, показанной как SEQ ID No. 34.Preferably, the lipid acyltransferase enzyme of the present invention includes either the amino acid sequence shown as SEQ ID No. 2, or SEQ ID No. 3, or SEQ ID No. 4, or SEQ ID No. 32, or SEQ ID No. 34, or includes an amino acid sequence that has 75% or more, preferably 80% or more, preferably 85% or more, preferably 90% or more, preferably 95% or more of the identity with the amino acid sequence shown as SEQ ID No. 2, or with the amino acid sequence shown as SEQ ID No. 3, or with the amino acid sequence shown as SEQ ID No. 4, or with the amino acid sequence shown as SEQ ID No. 32, or with the amino acid sequence shown as SEQ ID No. 34.

Для целей настоящего изобретения степень идентичности основывается на числе элементов последовательности, которые являются одинаковыми. Степень идентичности в соответствии с настоящим изобретением может быть определена посредством компьютерных программ, известных в практике, таких как GAP GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711) (Needleman & Wunsch (1970), J. of Molecular Biology 48, 443-45), с использованием следующих установок для сравнения полипептидных последовательностей: погрешность создания GAP3,0 и погрешность расширения GAP 0,1.For the purposes of the present invention, the degree of identity is based on the number of sequence elements that are the same. The degree of identity in accordance with the present invention can be determined by computer programs known in practice such as the GAP GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711) (Needleman & Wunsch (1970), J. of Molecular Biology 48, 443-45), using the following settings for comparing polypeptide sequences: GAP3.0 generation error and GAP expansion error 0.1.

Предпочтительно, фермент липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению включает 80% или более, предпочтительно, 85% или более, более предпочтительно, 90% или более, и еще более предпочтительно, 95% или более идентичности с любой одной из следующих последовательностей, показанных как SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32 или SEQ ID No. 34.Preferably, the lipid acyltransferase enzyme of the present invention comprises 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more identity with any one of the following sequences shown as SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32 or SEQ ID No. 34.

(a) последовательность аминокислот, показанная как остатки аминокислот 1-100 от SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 32;(a) an amino acid sequence shown as amino acid residues 1-100 of SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 32;

(b) последовательность аминокислот, показанная как остатки аминокислот 101-200 от SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 32;(b) an amino acid sequence shown as amino acid residues 101-200 from SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 32;

(c) последовательность аминокислот, показанная как остатки аминокислот 201-300 от SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 32; или(c) an amino acid sequence shown as amino acid residues 201-300 from SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 32; or

(d) последовательность аминокислот, которая имеет 75% или более, предпочтительно, 85% или более, более предпочтительно, 90% или более, и еще более предпочтительно, 95% или более идентичности с любой одной из последовательностей, определенных выше в (a) - (c).(d) an amino acid sequence that has 75% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more identity with any one of the sequences defined above in (a) - (c).

(a) последовательность аминокислот, показанная как остатки аминокислот 28-39 от SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 32;(a) an amino acid sequence shown as amino acid residues 28-39 from SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 32;

(b) последовательность аминокислот, показанная как остатки аминокислот 77-88 от SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 32;(b) an amino acid sequence shown as amino acid residues 77-88 from SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 32;

(c) последовательность аминокислот, показанная как остатки аминокислот 126-136 от SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 32;(c) an amino acid sequence shown as amino acid residues 126-136 from SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 32;

(d) последовательность аминокислот, показанная как остатки аминокислот 163-175 от SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 32;(d) an amino acid sequence shown as amino acid residues 163-175 from SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 32;

(e) последовательность аминокислот, показанная как остатки аминокислот 304-311 от SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 32;(e) an amino acid sequence shown as amino acid residues 304-311 from SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 32;

(f) последовательность аминокислот, которая имеет 75% или более, предпочтительно, 85% или более, более предпочтительно, 90% или более, и еще более предпочтительно, 95% или более идентичности с любой одной из последовательностей, определенных выше в (a) - (e).(f) an amino acid sequence that has 75% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more identity with any one of the sequences defined above in (a) - (e).

Предпочтительно, фермент липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению включает последовательность аминокислот, полученную экспрессией или одну или несколько из следующих нуклеотидных последовательностей:Preferably, the lipid acyltransferase enzyme according to the present invention includes an amino acid sequence obtained by expression or one or more of the following nucleotide sequences:

(a) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 7 (см. фиг.9);(a) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 7 (see Fig. 9);

(b) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 8 (см. фиг.10);(b) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 8 (see FIG. 10);

(c) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 9 (см. фиг.11);(c) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 9 (see Fig. 11);

(d) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 10 (см. фиг.12);(d) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 10 (see Fig. 12);

(e) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 11 (см. фиг.13);(e) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 11 (see FIG. 13);

(f) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 13 (см. фиг.15);(f) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 13 (see FIG. 15);

(g) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 21 (см. фиг.17);(g) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 21 (see FIG. 17);

(h) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 23 (см. фиг.19);(h) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 23 (see Fig. 19);

(i) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 25 (см. фиг.21);(i) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 25 (see FIG. 21);

(j) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 27 (см. фиг.23);(j) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 27 (see FIG. 23);

(k) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 29 (см. фиг.25);(k) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 29 (see FIG. 25);

(l) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 31 (см. фиг.27);(l) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 31 (see Fig. 27);

(m) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 33 (см. фиг.29);(m) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 33 (see Fig. 29);

(n) нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 35 (см. фиг.31); или(n) the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 35 (see Fig. 31); or

(o) нуклеотидную последовательность, которая имеет 75% или более идентичности с любой одной из последовательностей, показанных как SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 или SEQ ID No. 35.(o) a nucleotide sequence that has 75% or more identity with any one of the sequences shown as SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 or SEQ ID No. 35.

Предпочтительно, нуклеотидная последовательность может иметь 80% или более, предпочтительно, 85% или более, более предпочтительно, 90% или более и еще более предпочтительно, 95% или более идентичности с любой одной из последовательностей, показанных как SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 или SEQ ID No. 35.Preferably, the nucleotide sequence may have 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more and even more preferably 95% or more identical to any one of the sequences shown as SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 or SEQ ID No. 35.

В одном аспекте липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению может быть лецитин:холестерин ацилтрансферазами (LCAT) или их вариантом (например, вариантом, полученным молекулярной эволюцией).In one aspect, the lipid acyltransferase according to the present invention may be lecithin: cholesterol acyltransferases (LCAT) or a variant thereof (e.g., a variant obtained by molecular evolution).

Подходящие LCAT известны в практике и могут быть получены из одного или нескольких из следующих организмов, например из млекопитающих, мышей, крыс, цыплят, Drosophila melanogaster, Arabidospis и Oryza sativa, нематод, грибов и дрожжей.Suitable LCATs are known in the art and can be obtained from one or more of the following organisms, for example, mammals, mice, rats, chickens, Drosophila melanogaster , Arabidospis and Oryza sativa , nematodes, fungi and yeast.

В одном варианте осуществления фермент липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению может быть липид-ацилтрансферазой, которая может быть получена, предпочтительно, которая получена из штаммов E. coli ТОР 10 хранилище pPet12Aahydro и pPet12aASalmo, депонированных Danisco A/S of Langebrodgade 1, DK-1001 Copenhagen K, Denmark согласно Будапештскому договору о международном признании Депозитария микроорганизмов для целей процедуры патентования за National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GB от 23 декабря 2003 под инвентарными номерами NICMB 41204 и NICMB 41205 соответственно.In one embodiment, the lipid acyltransferase enzyme according to the present invention can be a lipid acyltransferase, which can be obtained, preferably, obtained from E. coli strains TOP 10 storage pPet12Aahydro and pPet12aASalmo deposited Danisco A / S of Langebrodgade 1, DK-100 Copenhagen K, Denmark under the Budapest Treaty on the International Recognition of the Microorganism Depository for the purposes of the patenting procedure for the National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GB dated December 23, 2003 under inventory numbers NICMB 41204 and NICMB 41205, respectively.

Предпочтительно, когда осуществляют способ согласно настоящему изобретению, продукт получают без увеличения или существенного увеличения свободных жирных кислот в пищевом продукте.Preferably, when the method of the present invention is carried out, the product is obtained without increasing or substantially increasing the free fatty acids in the food product.

Термин "трансфераза", как он использован здесь, является взаимозаменяемым с термином "липид-трансфераза".The term "transferase", as used here, is used interchangeably with the term "lipid transferase".

Соответственно, липид-трансфераза, как она определена здесь, катализирует одну или несколько из следующих реакций: интерэтерификацию, трансэтерификацию, алкоголиз, гидролиз.Accordingly, lipid transferase, as defined here, catalyzes one or more of the following reactions: interesterification, transesterification, alcoholysis, hydrolysis.

Термин "интерэтерификация" относится к ферментативно катализируемому переносу ацильных групп между липидом-донором и липидом-акцептором, где липид-донор не является свободной ацильной группой.The term “interesterification” refers to an enzymatically catalyzed transfer of acyl groups between a donor lipid and an acceptor lipid, where the donor lipid is not a free acyl group.

Термин "трансэтерификация", как он использован здесь, означает ферментативно катализируемый перенос ацильной группы от липида-донора (отличного от свободной жирной кислоты) к акцептору ацила (отличному от воды).The term “transesterification,” as used herein, means an enzymatically catalyzed transfer of an acyl group from a lipid donor (other than free fatty acid) to an acyl acceptor (other than water).

Термин "алкоголиз", как он использован здесь, относится к ферментативному разложению ковалентной связи производных кислот реакцией со спиртом ROH так, что один из продуктов соединяется с Н спирта, а другой продукт соединяется с группой ОН спирта.The term "alcoholysis", as used here, refers to the enzymatic decomposition of the covalent bond of acid derivatives by reaction with ROH alcohol so that one of the products combines with H of the alcohol, and the other product combines with the OH group of the alcohol.

Термин "спирт", как он использован здесь, относится к алкильному соединению, содержащему гидроксильную группу.The term “alcohol,” as used herein, refers to an alkyl compound containing a hydroxyl group.

Термин "гидролиз", как он использован здесь, относится к ферментативно катализируемому переносу ацильной группы от липида к ОН-группе молекулы воды. Перенос ацила, который является результатом гидролиза, требует отделения молекулы воды.The term "hydrolysis", as used here, refers to the enzymatically catalyzed transfer of an acyl group from a lipid to an OH group of a water molecule. Acyl transfer, which is the result of hydrolysis, requires the separation of a water molecule.

Термин "без увеличения или существенного увеличения свободных жирных кислот", как он использован здесь, означает, что, предпочтительно, липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению имеет 100% трансферазную активность (т.е. переносит 100% ацильных групп от донора ацила на акцептор ацила, без гидролитической активности), однако фермент может перенести меньше чем 100% ацильных групп, присутствующих в доноре ацила, к акцептору ацила. В таком случае, предпочтительно, ацилтрансферазная активность насчитывает по меньшей мере 5%, более предпочтительно, по меньшей мере 10%, более предпочтительно, по меньшей мере 20%, более предпочтительно, по меньшей мере 30%, более предпочтительно, по меньшей мере 40%, более предпочтительно, по меньшей мере 50%, более предпочтительно, по меньшей мере 60%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 98% от общей ферментной активности. Процент трансферазной активности (т.е. трансферазная активность в процентах от общей ферментной активности) может быть определен по следующему протоколу.The term “without increasing or substantially increasing free fatty acids,” as used herein, means that preferably the lipid acyltransferase according to the present invention has 100% transferase activity (i.e. transfers 100% acyl groups from the acyl donor to the acyl acceptor , without hydrolytic activity), however, the enzyme can transfer less than 100% of the acyl groups present in the acyl donor to the acyl acceptor. In such a case, preferably, the acyltransferase activity is at least 5%, more preferably at least 10%, more preferably at least 20%, more preferably at least 30%, more preferably at least 40% more preferably at least 50%, more preferably at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at least 80%, more preferably at least 90%, more preferably at least 98% of total enzyme activity. The percentage of transferase activity (i.e., transferase activity as a percentage of total enzyme activity) can be determined by the following protocol.

Протокол определения % трансферазной активностиProtocol for the determination of% transferase activity

Пищевой продукт, к которому была добавлена липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению, может быть экстрагирован после ферментативной реакции смесью CHCl₃:CH₃OH 2:1, и органическую фазу, содержащую липидный материал, выделяют и анализируют методами ГЖХ и ЖХВД согласно методике, подробно описанной здесь ниже. По анализам определяли количество свободных жирных кислот и одного или нескольких из эфиров стеролов/станолов, эфиров углеводов, эфиров протеинов, диглицеридов или моноглицеридов. Контрольный пищевой продукт, к которому не добавляли фермент согласно настоящему изобретению, анализировали подобным образом.The food product to which the lipid acyltransferase according to the present invention was added can be extracted after the enzymatic reaction with a mixture of CHCl ₃ : CH ₃ OH 2: 1, and the organic phase containing the lipid material is isolated and analyzed by GLC and HPLC according to the procedure, in detail described here below. The analyzes determined the amount of free fatty acids and one or more of sterol / stanol esters, carbohydrate esters, protein esters, diglycerides or monoglycerides. A control food product to which the enzyme of the present invention was not added was analyzed in a similar manner.

РасчетPayment

Из результатов анализов ГЖХ и ЖХВД может быть рассчитано увеличение содержания свободных жирных кислот и одного или нескольких из эфиров стеролов/станолов, эфиров углеводов, эфиров протеинов, диглицеридов или моноглицеридов.From the results of GLC and HPLC analyzes, an increase in the content of free fatty acids and one or more of sterol / stanol esters, carbohydrate esters, protein esters, diglycerides or monoglycerides can be calculated.

Δ % жирной кислоты = % жирной кислоты (фермент) - % жирной кислоты (контроль); Mv жирной кислоты = средний молекулярный вес жирной кислоты;Δ% fatty acid =% fatty acid (enzyme) -% fatty acid (control); Mv fatty acid = average molecular weight of the fatty acid;

А = Δ % стерольного эфира/Mv стерольного эфира (где Δ % стерольного эфира = % эфира стерола/станола (фермент) - % эфира стерола/станола (контроль) и Mv стерольного эфира = средний молекулярный вес эфиров стерола/станола) - применимо, когда акцептором ацила является стерол и/или станол;A = Δ% sterol ether / Mv sterol ether (where Δ% sterol ether =% sterol / stanol ether (enzyme) -% sterol / stanol ether (control) and Mv sterol ether = average molecular weight of sterol / stanol esters) - applicable, when the acyl acceptor is sterol and / or stanol;

В = Δ % эфира углевода/Mv эфира углевода (где Δ % эфира углевода = % эфира углевода (фермент) - % эфира углевода (контроль) и Mv эфира углевода = средний молекулярный вес эфира углевода) - применимо, когда акцептором ацила является углевод;B = Δ% carbohydrate ether / Mv carbohydrate ester (where Δ% carbohydrate ester =% carbohydrate ester (enzyme) -% carbohydrate ester (control) and Mv carbohydrate ester = average molecular weight of carbohydrate ester) - applicable when the acyl acceptor is a carbohydrate;

С = Δ % эфира протеина/Mv эфира протеина (где Δ % эфира протеина = % эфира протеина (фермент) - % эфира протеина (контроль) и Mv эфира протеина = средний молекулярный вес эфира протеина) - применимо, когда акцептором ацила является протеин; иC = Δ% of protein ester / Mv of protein ester (where Δ% of protein ester =% of protein ester (enzyme) -% of protein ester (control) and Mv of protein ester = average molecular weight of protein ester) - applicable when the acyl acceptor is protein; and

D = абсолютная величина диглицерида и/или моноглицерида/Mv ди/моноглицерида (где Δ % диглицерида и/или моноглицерида = % диглицерида и/или моноглицерида (фермент) - % диглицерида и/или моноглицерида (контроль) и Mv ди/моноглицерида = средний молекулярный вес диглицерида и/или моноглицерида) - применимо, когда акцептором ацила является глицерин.D = absolute diglyceride and / or monoglyceride / Mv di / monoglyceride (where Δ% diglyceride and / or monoglyceride =% diglyceride and / or monoglyceride (enzyme) -% diglyceride and / or monoglyceride (average) and Mv di / molecular weight of diglyceride and / or monoglyceride) - applicable when the acyl acceptor is glycerol.

Трансферазную активность рассчитывают как процент от общей ферментативной активности.Transferase activity is calculated as a percentage of the total enzymatic activity.

* - исключить, если требуется.

* - delete if required.

Если содержание свободных жирных кислот в пищевом продукте возросло, то оно, предпочтительно, не возросло существенно, т.е. в значительной степени. Под этим подразумевается, что увеличение содержания свободных жирных кислот не повлияет отрицательно на качество пищевого продукта.If the content of free fatty acids in the food product has increased, then it, preferably, has not increased significantly, i.e. to a large extent. This implies that an increase in the content of free fatty acids will not adversely affect the quality of the food product.

В некоторых аспектах настоящего изобретения термин "без существенного увеличения свободных жирных кислот", как он использован здесь, означает, что количество свободных жирных кислот в пищевом продукте или композиции, обработанных липид-ацилтрансферазой согласно настоящему изобретению, меньше, чем количество свободных жирных кислот в пищевом продукте или композиции, когда был использован фермент, отличный от липид-ацилтрансферазы согласно настоящему изобретению, так, как, например, при сравнении с количеством свободной жирной кислоты, образовавшимся, когда был использован обычный фосфолипазный энзим, например Lipofan® (Novozymes A/S, Denmark).In some aspects of the present invention, the term “without a substantial increase in free fatty acids,” as used herein, means that the amount of free fatty acids in a food product or composition treated with a lipid acyltransferase according to the present invention is less than the amount of free fatty acids in a food a product or composition when an enzyme other than the lipid acyltransferase according to the present invention has been used, such as, for example, when compared with the amount of free fatty acid, formed when a conventional phospholipase enzyme was used, for example Lipofan® (Novozymes A / S, Denmark).

Термин "in situ", как он использован здесь, означает, что эмульгатор (эмульгаторы), и/или эфиры стерола/станола, и/или эфиры углеводов, и/или эфиры протеинов, и/или моно- или диглицериды образуются внутри пищевого продукта или части пищевого продукта. Это отличается от ситуации, где эмульгатор (эмульгаторы), и/или эфиры стерола/станола, и/или эфиры углеводов, и/или эфиры протеинов, и/или моно- или диглицериды образуются отдельно от пищевого продукта и добавляются как сформировавшиеся продукты к пищевому продукту во время его приготовления. Другими словами, термин "in situ", как он использован здесь, означает, что путем добавления липид-ацилтрансферазы согласно настоящему изобретению к пищевому продукту или к пищевым ингредиентам/материалам, образующим пищевой продукт, эмульгатор (эмульгаторы), и/или эфиры стерола/станола, и/или эфиры углеводов, и/или эфиры протеинов, и/или моно- или диглицериды могут образоваться из компонентов пищевого продукта. Соответственно, компоненты пищевого продукта могут быть субстратом (субстратами) для фермента. Если необходимо, компоненты пищевого продукта могут быть дополнены одним или несколькими дополнительными компонентами, которые могут быть теми же компонентами, которые присутствуют в пищевом продукте, или могут быть дополнительными по отношению к компонентам, которые уже присутствуют в пищевом продукте. Во избежание сомнений в одном варианте осуществления способ согласно настоящему изобретению может быть способом образования эмульгатора, и/или эфира стерола, и/или эфира станола, и/или эфира углевода, и/или эфира протеина, и/или моно- или диглицерида in situ в пищевом продукте, а не являться способом приготовления эмульгатора, и/или эфира стерола, и/или эфира станола (например, в выделенной и очищенной форме) для последующего добавления к пищевому продукту.The term “ in situ ” as used herein means that emulsifier (s) and / or sterol / stanol esters and / or carbohydrate esters and / or protein esters and / or mono- or diglycerides are formed inside the food product or parts of a food product. This differs from the situation where the emulsifier (s) and / or sterol / stanol esters and / or carbohydrate esters and / or protein esters and / or mono- or diglycerides are formed separately from the food product and added as formed products to the food product during its preparation. In other words, the term " in situ ", as used here, means that by adding the lipid acyltransferase according to the present invention to a food product or to food ingredients / materials forming a food product, emulsifier (s), and / or sterol esters / stanol and / or carbohydrate esters and / or protein esters and / or mono- or diglycerides can be formed from food components. Accordingly, the components of the food product can be a substrate (s) for the enzyme. If necessary, the components of the food product may be supplemented with one or more additional components, which may be the same components that are present in the food product, or may be complementary to components that are already present in the food product. For the avoidance of doubt in one embodiment, the method according to the present invention may be a method of forming an emulsifier and / or sterol ester and / or stanol ester and / or carbohydrate ester and / or protein ester and / or mono- or diglyceride in situ in a food product, and not be a method of preparing an emulsifier and / or sterol ether and / or stanol ether (for example, in isolated and purified form) for subsequent addition to the food product.

В другом варианте осуществления липаза ацилтрансфераза может быть использована во время приготовления пищи, но не оставаться в пищевом продукте. Например, липаза ацилтрансфераза может быть иммобилизована, что позволяет ее повторное использование.In another embodiment, the lipase acyltransferase can be used during cooking, but not remain in the food product. For example, lipase acyltransferase can be immobilized, which allows its reuse.

Предпочтительно, липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению способна переносить ацильную группу от липида к стеролу, и/или станолу, и/или углеводу, и/или протеину, и/или глицерину, когда присутствует в полярной среде, предпочтительно, в водной среде, предпочтительно, в содержащем воду пищевом продукте. Соответственно, водной средой может быть водный буфер или может быть водная фаза пищевого продукта. Термин "водная среда", как он использован здесь, предпочтительно, означает среду, в которой отсутствует органический растворитель, предпочтительно, отсутствует полярный органический растворитель, более предпочтительно, отсутствует непищевой органический растворитель. В частности, термин "водная среда" может относиться к среде, в которую не были добавлены экзогенные органические растворители, предпочтительно, не были добавлены полярные растворители. Термин "органический растворитель", как он использован здесь, не охватывает пищевые масла, предпочтительно, не охватывает пищевые масла, которые богаты неполярными липидами. В одном варианте осуществления термин "органический растворитель" может исключать пищевые органические растворители, такие как этанол, пропиленгликоль и/или глицерин. Подходящая водная среда согласно настоящему изобретению может включать менее 80% об. органических растворителей, меньше 70% об. органических растворителей, меньше 50% об. органических растворителей, меньше 30% об. органических растворителей, более предпочтительно, меньше 15% об. органических растворителей, более предпочтительно, меньше 5% об. органических растворителей. Предпочтительно, пищевой продукт может включать между 1% и 5% органического растворителя, например этанола. Однако, когда пищевой продукт включает такой органический растворитель, предпочтительно, он образуется эндогенно внутри пищевого продукта. Иначе говоря, когда пищевой продукт включает такой органический растворитель, предпочтительно, органический растворитель не является экзогенным органическим растворителем.Preferably, the lipid acyltransferase according to the present invention is capable of transferring an acyl group from lipid to sterol and / or stanol and / or carbohydrate and / or protein and / or glycerol when present in a polar medium, preferably in an aqueous medium, preferably in a water-containing food product. Accordingly, the aqueous medium may be an aqueous buffer, or may be the aqueous phase of a food product. The term "aqueous medium", as used here, preferably means a medium in which there is no organic solvent, preferably there is no polar organic solvent, more preferably there is no non-food organic solvent. In particular, the term "aqueous medium" may refer to a medium into which exogenous organic solvents have not been added, preferably polar solvents have not been added. The term "organic solvent", as used here, does not cover edible oils, preferably does not cover edible oils that are rich in non-polar lipids. In one embodiment, the term “organic solvent” may exclude edible organic solvents such as ethanol, propylene glycol and / or glycerol. A suitable aqueous medium according to the present invention may include less than 80% vol. organic solvents, less than 70% vol. organic solvents, less than 50% vol. organic solvents, less than 30% vol. organic solvents, more preferably less than 15% vol. organic solvents, more preferably less than 5% vol. organic solvents. Preferably, the food product may include between 1% and 5% of an organic solvent, for example ethanol. However, when the food product includes such an organic solvent, it is preferably formed endogenously within the food product. In other words, when the food product includes such an organic solvent, preferably, the organic solvent is not an exogenous organic solvent.

Предпочтительно, пищевой продукт согласно настоящему изобретению может быть "легкой пищей", включающей кексы, пасты, кондитерские изделия, шоколад, молочные конфеты и т.п.Preferably, the food product of the present invention may be a “light food” including muffins, pastes, confectionery, chocolate, milk sweets, and the like.

В одном аспекте пищевым продуктом согласно настоящему изобретению могут быть продукт из теста или выпеченный продукт, такой как хлеб, жареный продукт, легкая закуска, пирожные, пироги, шоколадные пирожные, булочки, лапша, предметы легкой закуски, такие как крекеры, грехемовские крекеры, соленые крендельки, картофельные чипсы и паста.In one aspect, the food product of the present invention can be a dough product or a baked product, such as bread, a fried product, a snack, cakes, pies, chocolate cakes, buns, noodles, snacks, such as crackers, Graham crackers, salted pretzels, potato chips and pasta.

В следующем аспекте пищевым продуктом согласно настоящему изобретению может быть пищевой продукт растительного происхождения, такой как крупы, премиксы, масла, жиры, кокосовое масло, забеливатель кофе, заправки для салата, маргарин, пастообразные продукты, арахисовое масло, кулинарный жир, мороженое, кулинарные масла.In a further aspect, the food product of the present invention can be a vegetable food product such as cereals, premixes, oils, fats, coconut oil, coffee whitener, salad dressings, margarine, pasty products, peanut butter, cooking oil, ice cream, cooking oils .

В другом аспекте пищевым продуктом согласно настоящему изобретению может быть молочный продукт, включая сливочное масло, молоко, сливки, сыр, такой как натуральный, переработанный сыр и имитационные сыры в различных формах (включая измельченные, в блоках, ломтиках или тертые), сливочный сыр, мороженое, замороженные десерты, йогурт, напитки из йогурта, жир масла, безводный молочный жир, другие молочные продукты. Фермент согласно настоящему изобретению может улучшить стабильность жира в молочных продуктах.In another aspect, the food product of the present invention may be a dairy product, including butter, milk, cream, cheese, such as natural, processed cheese and simulated cheeses in various forms (including crushed, in blocks, slices or grated), cream cheese, ice cream, frozen desserts, yogurt, yogurt drinks, butter fat, anhydrous milk fat, other dairy products. The enzyme according to the present invention can improve the stability of fat in dairy products.

Особо предпочтительно, использование настоящего изобретения в сырах, поскольку образование свободных жирных кислот в сыре связано с "мыльным" вкусом. Так, использование липид-ацилтрансферазы согласно настоящему изобретению преимущественно дает сыр без "мыльного" вкуса.Particularly preferred is the use of the present invention in cheeses, since the formation of free fatty acids in cheese is associated with a “soapy” taste. Thus, the use of the lipid acyltransferase according to the present invention advantageously produces cheese without a “soapy” taste.

В другом аспекте пищевым продуктом СЕИ может быть пищевой продукт, содержащий ингредиенты животного происхождения, такие как переработанный мясопродукт, кулинарные масла, кулинарные жиры.In another aspect, the CEI food product may be a food product containing animal ingredients such as processed meat products, cooking oils, cooking fats.

В следующем аспекте пищевым продуктом согласно настоящему изобретению может быть напиток, фруктовый, смешанный фруктовый, овощной или вино. В некоторых случаях напиток может содержать до 20 г/л добавленных фитостеролов.In a further aspect, the food product of the present invention may be a beverage, fruit, mixed fruit, vegetable or wine. In some cases, the drink may contain up to 20 g / l of added phytosterols.

В другом аспекте пищевым продуктом согласно настоящему изобретению может быть корм для животных. Корм для животных может быть обогащен фитостеролом и/или фитостанолами, предпочтительно, бета-ситостеролом/станолом. Предпочтительно, корм для животных может быть кормом для домашней птицы. Если кормом для животных является корм для домашней птицы, настоящее изобретение может быть использовано для того, чтобы уменьшить содержание холестерина в яйцах, производимых домашней птицей, которую кормят пищевым продуктом согласно настоящему изобретению.In another aspect, the food product of the present invention may be animal feed. Animal feed can be enriched with phytosterol and / or phytostanols, preferably beta-sitosterol / stanol. Preferably, the animal feed may be a poultry feed. If the animal feed is poultry, the present invention can be used to reduce the cholesterol in eggs produced by poultry fed with the food product of the present invention.

В одном аспекте, предпочтительно, пищевой продукт выбирают из одного или нескольких следующих пищевых продуктов: яиц, продуктов на основе яиц, включая майонез, заправку для салата, соусы, мороженое, яичный порошок, модифицированный яичный желток и изготовленные из них продукты.In one aspect, preferably, the food product is selected from one or more of the following food products: eggs, egg-based products, including mayonnaise, salad dressing, sauces, ice cream, egg powder, modified egg yolk, and products made from them.

Предпочтительно, пищевой продукт согласно настоящему изобретению является содержащим воду пищевым продуктом. Соответственно, пищевой продукт может содержать 10-98% воды, обычно 14-98%, предпочтительно, 18-98% воды, предпочтительно, 20-98% воды, предпочтительно, 40-98% воды, предпочтительно, 50-98% воды, предпочтительно, 70-98% воды, предпочтительно, 75-98% воды.Preferably, the food product of the present invention is a water-containing food product. Accordingly, the food product may contain 10-98% water, usually 14-98%, preferably 18-98% water, preferably 20-98% water, preferably 40-98% water, preferably 50-98% water, preferably 70-98% water, preferably 75-98% water.

Для некоторых аспектов, предпочтительно, пищевой продукт согласно настоящему изобретению является не чистым полученным из растений маслом, таким как, например, оливковое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло, рапсовое масло. Во избежание сомнений в некоторых аспектах настоящего изобретения пищевой продукт согласно настоящему изобретению может включать масло, но предпочтительно, пищевой продукт не состоит главным образом из масла или смеси масел. Для некоторых аспектов, предпочтительно, пищевой продукт включает меньше 95% липидов, предпочтительно, меньше 90% липидов, предпочтительно, меньше 85% липидов, предпочтительно, меньше 80% липидов. Таким образом, для некоторых аспектов настоящего изобретения масло может быть компонентом пищевого продукта, но предпочтительно, пищевой продукт не является маслом per se.For some aspects, preferably, the food product of the present invention is not pure plant derived oil, such as, for example, olive oil, sunflower oil, peanut oil, rapeseed oil. For the avoidance of doubt in some aspects of the present invention, the food product of the present invention may include oil, but preferably, the food product does not consist primarily of oil or a mixture of oils. For some aspects, preferably, the food product comprises less than 95% lipids, preferably less than 90% lipids, preferably less than 85% lipids, preferably less than 80% lipids. Thus, for some aspects of the present invention, the oil may be a component of the food product, but preferably, the food product is not oil per se .

Формула настоящего изобретения должна истолковываться так, чтобы включать каждый из перечисленных выше пищевых продуктов.The claims of the present invention should be construed to include each of the above foods.

В случае, когда образуется эфир углевода согласно настоящему изобретению, эфир углевода, предпочтительно, является эфиром олигосахарида, эфиром моносахарида или эфиром дисахарида.In the case where a carbohydrate ester of the present invention is formed, the carbohydrate ester is preferably an oligosaccharide ester, a monosaccharide ester or a disaccharide ester.

Соответственно, эфир углевода, когда он образуется согласно настоящему изобретению, может быть одним или несколькими из следующих: эфир глюкозы, эфир фруктозы, эфир ангидрофруктозы, эфир мальтозы, эфир лактозы, эфир галактозы, эфир ксилозы, эфир ксилоолигосахарида, эфир арабинозы, эфир мальтоолигосахарида, эфир тагатозы, эфир сахарозы, эфир микротецина, эфир аскопирона Р, эфир аскопирона Т или эфир кортальцерона.Accordingly, the carbohydrate ester, when formed according to the present invention, can be one or more of the following: glucose ether, fructose ether, anhydrofructose ether, maltose ether, lactose ether, galactose ether, xylose ether, xyloligosaccharide ether, arabinose ether, maltooligosaccharide ether, tagatose ester, sucrose ester, microtecin ester, ascopyron P ester, ascopyrone T ester or cortalcerone ester.

Предпочтительно, эфир углевода, когда он образуется согласно настоящему изобретению, является одним или несколькими из следующих: моноэфир углевода, моноэфир сахара, моноэфир олигосахарида, моноэфир трисахарида, моноэфир дисахарида, моноэфир моносахарида, моноэфир глюкозы, моноэфир фруктозы, моноэфир ангидрофруктозы, моноэфир мальтозы, моноэфир лактозы, моноэфир галактозы, моноэфир ксилозы, моноэфир ксилоолигосахарида, моноэфир арабинозы, моноэфир мальтоолигосахарида, моноэфир тагатозы, моноэфир сахарозы, моноэфир микротецина, моноэфир аскопирона Р, моноэфир аскопирона Т или моноэфир кортальцерона.Preferably, the carbohydrate ester, when formed according to the present invention, is one or more of the following: carbohydrate monoester, sugar monoester, oligosaccharide monoester, disaccharide monoester, monosaccharide monoester, glucose monoester, fructose monoester, fructose monoester, fructose monoester, lactose, galactose monoester, xylose monoester, xyloligosaccharide monoester, arabinose monoester, maltooligosaccharide monoester, tagatose monoester, sucrose monoester, microtecin monoester, monoester firm of ascopyron P, monoester of ascopyrone T or monoester of cortalcerone.

В одном варианте осуществления эфир микротецина, эфир аскопирона Р, эфир аскопирона Т и/или эфир кортальцерона могут действовать в качестве антимикробного агента. Альтернативно или в дополнение к этому эфир микротецина, эфир аскопирона Р, эфир аскопирона Т и/или эфир кортальцерона могут действовать в качестве одного или обоих из антиоксиданта и/или эмульгатора.In one embodiment, the microtecin ester, ascopyron P ester, ascopyrone T ester and / or cortalcerone ester can act as an antimicrobial agent. Alternatively or in addition to this, microtecin ester, ascopyron P ester, ascopyrone T ester and / or cortalcerone ester can act as one or both of an antioxidant and / or emulsifier.

Предпочтительно, образование эфира углевода (если происходит) согласно настоящему изобретению является независимым от UDP-глюкозы.Preferably, the formation of a carbohydrate ester (if occurring) according to the present invention is independent of UDP glucose.

Предпочтительно, пищевой продукт согласно настоящему изобретению не включает UDP-глюкозу или включает UDP-глюкозу лишь в незначительных количествах.Preferably, the food product of the present invention does not include UDP glucose or includes only minor amounts of UDP glucose.

Подходящий эмульгатор согласно настоящему изобретению может быть, например, одним или несколькими из следующих: диглицерид, моноглицерид, такой как 1-моноглицерид или лизолецитин, например, такой как лизофосфатидилхолин, дигалактозил моноглицерид (DGMG). Эмульгатор, предпочтительно, образуется из липидного донора ацила вслед за удалением от указанного липидного донора ацила одной или нескольких ацильных групп. Термин "лизолецитин", как он использован здесь, охватывает лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилинозитол, лизофосфатидилсерин и лизофосфатидилглицерин.A suitable emulsifier according to the present invention can be, for example, one or more of the following: diglyceride, monoglyceride, such as 1-monoglyceride or lysolecithin, such as lysophosphatidylcholine, digalactosyl monoglyceride (DGMG). The emulsifier is preferably formed from the acyl lipid donor following the removal of one or more acyl groups from the acyl lipid donor. The term “lysolecithin,” as used herein, encompasses lysophosphatidylcholine, lysophosphatidyl ethanolamine, lysophosphatidylinositol, lysophosphatidylserine and lysophosphatidylglycerol.

Когда одним из эмульгаторов является эфир углевода, вторым эмульгатором может быть, например, один или несколько из следующих: диглицерид, моноглицерид, такой как 1-моноглицерид, лизофосфатидилхолин или дигалактозилмоноглицерид (DGMG). Второй эмульгатор, предпочтительно, образуется из липидного донора ацила вслед за удалением от указанного липидного донора ацила одной или нескольких ацильных групп. Термин "лизофосфатидилхолин", как он использован здесь, является синонимом термина "лизолецитин", и эти термины могут использоваться здесь взаимозаменяемо.When one of the emulsifiers is a carbohydrate ester, the second emulsifier may be, for example, one or more of the following: diglyceride, monoglyceride, such as 1-monoglyceride, lysophosphatidylcholine or digalactosyl monoglyceride (DGMG). The second emulsifier is preferably formed from the acyl lipid donor following the removal of one or more acyl groups from the acyl lipid donor. The term “lysophosphatidylcholine,” as used herein, is synonymous with the term “lysolecithin,” and these terms may be used interchangeably herein.

Предпочтительно, вторым эмульгатором является DGMG. Обычно DGMG образуется "in situ" удалением ацильной группы от DGDG с переносом удаленной ацильной группы на углевод с образованием эфира углевода.Preferably, the second emulsifier is DGMG. Typically, DGMG is formed " in situ " by the removal of the acyl group from DGDG with the transfer of the removed acyl group to a carbohydrate to form a carbohydrate ester.

Когда одним из эмульгаторов является эфир протеина, и/или диглицерид, и/или моноглицерид, вторым эмульгатором может быть, например, один или несколько из следующих: диглицерид, моноглицерид, такой как 1-моноглицерид или лизолецитин, например, такой как лизофосфатидилхолин, дигалактозил моноглицерид (DGMG). Второй эмульгатор, предпочтительно, образуется из липидного донора ацила вслед за удалением от указанного липидного донора ацила одной или нескольких ацильных групп. Термин "лизофосфатидилхолин", как он использован здесь, является синонимом термина "лизолецитин", и эти термины могут использоваться здесь взаимозаменяемо.When one of the emulsifiers is a protein ester and / or diglyceride and / or monoglyceride, the second emulsifier may be, for example, one or more of the following: diglyceride, monoglyceride, such as 1-monoglyceride or lysolecithin, such as lysophosphatidylcholine, digalacto monoglyceride (DGMG). The second emulsifier is preferably formed from the acyl lipid donor following the removal of one or more acyl groups from the acyl lipid donor. The term “lysophosphatidylcholine,” as used herein, is synonymous with the term “lysolecithin,” and these terms may be used interchangeably herein.

В одном варианте осуществления липид-ацилтрансфераза может быть использована в способе получения пищевого продукта, такого как кулинарное масло, маргарин или паста для намазывания, благодаря тому что пищевой продукт содержит натуральный или введенный дополнительно глицерин, по меньшей мере один фосфолипид (например, лецитин) и/или гликолипид (например, дигалактозил-моноглицерид) и, необязательно, фитостерол или фитостанол.In one embodiment, lipid acyltransferase can be used in a method for producing a food product, such as cooking oil, margarine or spreading paste, due to the fact that the food product contains natural or added glycerin, at least one phospholipid (e.g. lecithin) and / or glycolipid (e.g., digalactosyl monoglyceride) and, optionally, phytosterol or phytostanol.

Пищевой продукт, когда он используется как кулинарное масло или маргарин, может иметь улучшенные антипригарные свойства. В дополнение или альтернативно пищевой продукт может иметь одно или несколько из выгодных технических свойств, например улучшенную окислительную стабильность, улучшенные эмульгирующие свойства или быть полезным для здоровья.A food product, when used as cooking oil or margarine, may have improved non-stick properties. In addition or alternatively, the food product may have one or more of the advantageous technical properties, for example, improved oxidative stability, improved emulsifying properties, or health benefits.

В одном варианте осуществления липид-ацилтрансфераза по изобретению может быть использована при приготовлении маложирных пищевых продуктов, таких как маложирные пасты для намазывания, маложирные заправки для салатов, маложирный майонез, маложирные маргарины жира и т.д. В таких пищевых продуктах с низким содержанием жира содержание жира обычно понижено по сравнению с высокожирными эквивалентами путем добавления эмульгаторов и воды.In one embodiment, the lipid acyltransferase of the invention can be used in the preparation of low-fat food products, such as low-fat spreading pastes, low-fat salad dressings, low-fat mayonnaise, low-fat fat margarines, etc. In such low fat foods, the fat content is usually reduced compared to high fat equivalents by the addition of emulsifiers and water.

Было обнаружено, что липид-ацилтрансфераза, используемая в композициях и способах по изобретению, имеет уникальные свойства по сравнению с липолитическими ферментами в том, что она имеет явное предпочтение к переносу ацильных групп от липидов к акцепторам, отличным от воды, даже в присутствии значительного количества воды. Было обнаружено, что по сравнению с ранее использовавшимися ферментами липид-ацилтрансфераза, используемая по изобретению, имеет высокую относительную трансферазную активность в присутствии 6% воды, 54% воды, 73% воды, 89% воды и приблизительно 95% воды. Испытанные липолитические ферменты практически не имели значительной трансферазной активности при таких концентрациях воды.It has been found that the lipid acyltransferase used in the compositions and methods of the invention has unique properties compared to lipolytic enzymes in that it has a clear preference for transferring acyl groups from lipids to acceptors other than water, even in the presence of a significant amount water. Compared to previously used enzymes, the lipid acyltransferase used according to the invention was found to have a high relative transferase activity in the presence of 6% water, 54% water, 73% water, 89% water and approximately 95% water. The tested lipolytic enzymes had practically no significant transferase activity at such concentrations of water.

Липазная и ацилтрансферазная активность фермента может быть оценена с использованием следующих анализов. Таким путем липид-ацилтрансфераза, имеющая определенные здесь ферментные характеристики, может быть получена/ идентифицирована.The lipase and acyltransferase activity of the enzyme can be evaluated using the following assays. In this way, a lipid acyltransferase having the enzymatic characteristics defined herein can be obtained / identified.

Анализ трансферазы в забуференном субстрате (см. пример 12)Analysis of transferase in a buffered substrate (see example 12)

Ферменты, которые функционируют как липид-ацилтрансферазы, для применения в композициях и способах по изобретению могут быть рутинно идентифицированы с применением анализа, описанного здесь в примере 12. Этот анализ будет называться здесь далее "Анализ трансферазы в забуференном субстрате". В примере 12 фермент липид-ацилтрансфераза из Aeromonas salmonicida в соответствии с настоящим изобретением анализировали и сравнивали с рядом липолитических ферментов, не охватываемых настоящим изобретением. Как можно видеть, было обнаружено, что из липолитических ферментов только LIPOPAN® F (Novozymes, Denmark) имел некоторую трансферазную активность, и то на очень низком уровне (1,3%).Enzymes that function as lipid acyltransferases for use in the compositions and methods of the invention can be routinely identified using the assay described here in Example 12. This assay will be referred to hereinafter as “Transferase Assay in Buffered Substrate”. In example 12, the lipid acyltransferase enzyme from Aeromonas salmonicida in accordance with the present invention was analyzed and compared with a number of lipolytic enzymes not covered by the present invention. As you can see, it was found that of the lipolytic enzymes only LIPOPAN® F (Novozymes, Denmark) had some transferase activity, and then at a very low level (1.3%).

Ферменты, пригодные для использования в композициях и способах по изобретению, могут быть рутинно идентифицированы при использовании "Анализ трансферазы в забуференном субстрате". При использовании этого анализа, при котором имеется очень высокое содержание воды, приблизительно 95%, липид-ацилтрансферазами в соответствии с настоящим изобретением являются такие, которые имеют по меньшей мере 2% ацилтрансферазной активности (относительной трансферазной активности), предпочтительно, по меньшей мере 5% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 10% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 26%, 28%, 30%, 40%, 50%, 60% или 75% относительной трансферазной активности. Подходящая липид-ацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может иметь менее 28%, менее 30%, предпочтительно, менее 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% ацилтрансферазной активности.Enzymes suitable for use in the compositions and methods of the invention can be routinely identified using the “Transferase Assay in Buffered Substrate”. Using this assay, in which there is a very high water content of approximately 95%, the lipid acyltransferases according to the present invention are those which have at least 2% acyltransferase activity (relative transferase activity), preferably at least 5% relative transferase activity, preferably at least 10% of the relative transferase activity, preferably at least 15%, 20%, 25%, 26%, 28%, 30%, 40%, 50%, 60% or 75% relative transferase activity and. Suitable lipid acyltransferase in accordance with the present invention may have less than 28%, less than 30%, preferably less than 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100% acyltransferase activity.

Анализ трансферазы в сильно обводненном яичном желтке (см. пример 11)Analysis of transferase in highly flooded egg yolk (see example 11)

Как альтернатива (или как дополнение) использованию "Анализа трансферазы в забуференном субстрате" (см. выше) липид-ацилтрансфераза для использования в соответствии с настоящим изобретением может быть идентифицирована с использованием "анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке", описанного здесь в примере 11.As an alternative (or as an adjunct) to the use of the “Transferase Assay in Buffered Substrate” (see above), lipid acyltransferase for use in accordance with the present invention can be identified using the “Highly Watered Egg Yolk Transferase Assay” described herein in Example 11 .

В одном варианте осуществления липид-ацилтрансфераза, пригодная для применения в способах и композициях согласно настоящему изобретению, является той, которая при испытаниях с использованием "Анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке" в яичном желтке с 54% воды имела до 100% относительной трансферазной активности. В действительности эксперименты с сильно обводненным яичным желтком показали, что в начале опыта начальная скорость трансферазы была рассчитана как соответствующая 100% трансферазной активности, т.е. гидролитическая активность не наблюдалась. Напротив, липолитические ферменты, использованные как контроль, т.е. LIPOPAN® F и фосфолипаза А2, не показали обнаруживаемой трансферазной активности в яичном желтке с 54% воды или в яичном желтке с обогащенным содержанием воды (а именно, яичном желтке с 73% воды или 89% воды). Предпочтительно, увеличение содержания воды не понижает значительно процент трансферазной активности липид-ацилтрансферазы для использования в способах или композициях согласно настоящему изобретению.In one embodiment, a lipid acyltransferase suitable for use in the methods and compositions of the present invention is one which, when tested using a highly transfused egg yolk transferase assay in an egg yolk with 54% water, had up to 100% relative transferase activity . In fact, experiments with heavily flooded egg yolk showed that at the beginning of the experiment, the initial transferase rate was calculated as corresponding to 100% transferase activity, i.e. hydrolytic activity was not observed. In contrast, lipolytic enzymes used as a control, i.e. LIPOPAN® F and phospholipase A2 showed no detectable transferase activity in egg yolk with 54% water or in egg yolk with an enriched water content (namely, egg yolk with 73% water or 89% water). Preferably, increasing the water content does not significantly reduce the percentage transferase activity of lipid acyltransferase for use in the methods or compositions of the present invention.

В предпочтительном варианте осуществления по результатам анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке с содержанием воды 54% липид-ацилтрансфераза для использования в настоящем изобретении должна иметь начальный процент трансферазной активности (начальной относительной трансферазной активности), измеренный после расходования 10% молекулы-донора (т.е. фосфолипида) по меньшей мере 0,1% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 1% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 5% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 10% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 20% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 30% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 40% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 50% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 60% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 70% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 80% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 90% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 95% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 99% относительной трансферазной активности, предпочтительно, около 100% относительной трансферазной активности.In a preferred embodiment, according to the results of transferase analysis in heavily flooded egg yolk with a water content of 54%, lipid acyltransferase for use in the present invention should have an initial percentage of transferase activity (initial relative transferase activity), measured after spending 10% of the donor molecule (i.e. e. phospholipid) at least 0.1% relative transferase activity, preferably at least 1% relative transferase activity, preferably at least Hereafter, 5% relative transferase activity, preferably at least 10% relative transferase activity, preferably at least 20% relative transferase activity, preferably at least 30% relative transferase activity, preferably at least 40% relative transferase activity preferably at least 50% relative transferase activity, preferably at least 60% relative transferase activity, preferably at least 70% o relative transferase activity, preferably at least 80% relative transferase activity, preferably at least 90% relative transferase activity, preferably at least 95% relative transferase activity, preferably at least 99% relative transferase activity, preferably about 100% relative transferase activity.

В предпочтительном варианте осуществления на основании анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке с содержанием воды 54% и измерения после расходования 10% молекулы-донора (т.е. фосфолипида) липид-ацилтрансфераза для использования в композициях и способах по изобретению имеет обнаруживаемую трансферазную активность, т.е. относительную трансферазную активность между 0,1 и 100%, предпочтительно, по меньшей мере 1% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 5% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 10% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 20% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 20% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 30% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 40% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 45%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% относительной трансферазной активности. Подходящая липид-ацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может иметь при использовании анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке с содержанием воды 54% и измерении после расходования 10% молекулы-донора (т.е. фосфолипида) процент ацилтрансферазной активности (относительную трансферазную активность) меньше 45%, 47%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%.In a preferred embodiment, based on the analysis of transferase in heavily flooded egg yolk with a water content of 54% and measurement, after spending 10% of the donor molecule (i.e. phospholipid), lipid acyltransferase for use in the compositions and methods of the invention has detectable transferase activity, those. relative transferase activity between 0.1 and 100%, preferably at least 1% relative transferase activity, preferably at least 5% relative transferase activity, preferably at least 10% relative transferase activity, preferably at least 20 % relative transferase activity, preferably at least 20% relative transferase activity, preferably at least 30% relative transferase activity, preferably at least e 40% relative transferase activity, preferably at least 45%, 50%, 60%, 70%, 80% or 90% relative transferase activity. A suitable lipid acyltransferase in accordance with the present invention may have, when using transferase analysis in heavily flooded egg yolk with a water content of 54% and measuring after spending 10% of the donor molecule (i.e. phospholipid), the percentage of acyltransferase activity (relative transferase activity) is less 45%, 47%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100%.

В предпочтительном варианте осуществления на основании анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке с содержанием воды 73% и измерения после расходования 10% молекулы-донора (т.е. фосфолипида) липид-ацилтрансфераза для использования в композициях и способах по изобретению имеет обнаруживаемую трансферазную активность, т.е. относительную трансферазную активность между 0,1 и 100%, предпочтительно, по меньшей мере 1% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 5% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 10% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 20% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 20% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 30% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 40% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 45%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% относительной трансферазной активности. Подходящая липид-ацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может иметь при использовании анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке с содержанием воды 73% и измерении после расходования 10% молекулы-донора (т.е. фосфолипида) процент ацилтрансферазной активности (относительную трансферазную активность) меньше 45%, 47%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%.In a preferred embodiment, based on the analysis of transferase in heavily flooded egg yolk with a water content of 73% and the measurement, after spending 10% of the donor molecule (i.e. phospholipid), lipid acyltransferase for use in the compositions and methods of the invention has detectable transferase activity, those. relative transferase activity between 0.1 and 100%, preferably at least 1% relative transferase activity, preferably at least 5% relative transferase activity, preferably at least 10% relative transferase activity, preferably at least 20 % relative transferase activity, preferably at least 20% relative transferase activity, preferably at least 30% relative transferase activity, preferably at least e 40% relative transferase activity, preferably at least 45%, 50%, 60%, 70%, 80% or 90% relative transferase activity. A suitable lipid acyltransferase in accordance with the present invention may have, when using transferase analysis in heavily flooded egg yolk with a water content of 73% and measuring after spending 10% of the donor molecule (i.e. phospholipid), the percentage of acyltransferase activity (relative transferase activity) is less 45%, 47%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100%.

В предпочтительном варианте осуществления на основании анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке с содержанием воды 89% и измерения после расходования 10% молекулы-донора (т.е. фосфолипида) липид-ацилтрансфераза для использования в композициях и способах по изобретению имеет обнаруживаемую трансферазную активность, т.е. относительную трансферазную активность от 0,1 до 100%, предпочтительно, по меньшей мере 1% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 5% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 10% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 20% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 20% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 30% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 40% относительной трансферазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 45%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% относительной трансферазной активности. Подходящая липид-ацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может иметь при использовании анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке с содержанием воды 89% и измерении после расходования 10% молекулы-донора (т.е. фосфолипида) процент ацилтрансферазной активности (относительную трансферазную активность) меньше 45%, 47%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%.In a preferred embodiment, based on a transferase assay in a heavily flooded egg yolk with 89% water content and measuring, after spending 10% of the donor molecule (i.e. phospholipid), lipid acyltransferase for use in the compositions and methods of the invention has detectable transferase activity, those. relative transferase activity from 0.1 to 100%, preferably at least 1% of the relative transferase activity, preferably at least 5% of the relative transferase activity, preferably at least 10% of the relative transferase activity, preferably at least 20 % relative transferase activity, preferably at least 20% relative transferase activity, preferably at least 30% relative transferase activity, preferably at least 40% relative transferase activity, preferably at least 45%, 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the relative transferase activity. A suitable lipid acyltransferase in accordance with the present invention may have, when using transferase analysis in heavily flooded egg yolk with a water content of 89% and measuring after spending 10% of the donor molecule (i.e. phospholipid), the percentage of acyltransferase activity (relative transferase activity) is less 45%, 47%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100%.

В предпочтительном варианте осуществления на основании анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке липид-ацилтрансфераза для использования в композициях и способах по изобретению имеет значительную трансферазную активность (т.е. по меньшей мере 0,1% при обоих содержаниях воды) и имеет эквивалентную относительную трансферазную активность как в яичном желтке с содержанием воды 54%, так и в яичном желтке с содержанием воды 73%, измеренную после расходования 10% молекулы-донора (т.е. фосфолипида).In a preferred embodiment, based on a transferase assay in heavily flooded egg yolk, lipid acyltransferase for use in the compositions and methods of the invention has significant transferase activity (i.e., at least 0.1% at both water contents) and has an equivalent relative transferase activity in both egg yolk with a water content of 54% and egg yolk with a water content of 73%, measured after spending 10% of the donor molecule (i.e., phospholipid).

В предпочтительном варианте осуществления на основании анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке липид-ацилтрансфераза для использования в композициях и способах по изобретению имеет значительную трансферазную активность (т.е. по меньшей мере 0,1% при обоих содержаниях воды) и имеет эквивалентную относительную трансферазную активность как в яичном желтке с содержанием воды 54%, так в яичном желтке с содержанием воды 89%, измеренную после расходования 10% молекулы-донора (т.е. фосфолипида).In a preferred embodiment, based on a transferase assay in heavily flooded egg yolk, lipid acyltransferase for use in the compositions and methods of the invention has significant transferase activity (i.e., at least 0.1% at both water contents) and has an equivalent relative transferase activity in both egg yolk with a water content of 54% and egg yolk with a water content of 89%, measured after spending 10% of the donor molecule (i.e., phospholipid).

В предпочтительном варианте осуществления на основании анализа трансферазы в сильно обводненном яичном желтке липид-ацилтрансфераза для использования в композициях и способах по изобретению имеет значительную трансферазную активность (т.е. по меньшей мере 0,1% при обоих содержаниях воды) и имеет эквивалентную относительную трансферазную активность как в яичном желтке с содержанием воды 73%, так в яичном желтке с содержанием воды 89%, измеренную после расходования 10% молекулы-донора (т.е. фосфолипида).In a preferred embodiment, based on a transferase assay in heavily flooded egg yolk, lipid acyltransferase for use in the compositions and methods of the invention has significant transferase activity (i.e., at least 0.1% at both water contents) and has an equivalent relative transferase activity in both egg yolk with a water content of 73% and egg yolk with a water content of 89%, measured after spending 10% of the donor molecule (i.e., phospholipid).

Термин "эквивалентная относительная трансферазная активность", как он использован здесь, означает, что фермент имеет относительную трансферазную активность (% ацилтрансферазной активности), который по меньшей мере на 2% ниже, предпочтительно, по меньшей мере на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% ниже в высокообводненном яичном желтке по сравнению с низкообводненным яичным желтком.The term "equivalent relative transferase activity", as used here, means that the enzyme has a relative transferase activity (% acyltransferase activity), which is at least 2% lower, preferably at least 5%, 10%, 20% , 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90% lower in a high-flooded egg yolk compared to a low-flooded egg yolk.

Анализ трансферазы в низководной средеAnalysis of transferase in low-water environment

Как альтернатива (или как дополнение) анализу трансферазы в сильно обводненном яичном желтке и/или анализу трансферазы в забуференном растворе липид-ацилтрансфераза для применения в соответствии с настоящим изобретением может быть идентифицирована с использованием анализа трансферазы в низководной среде.As an alternative (or as an adjunct) to transferase analysis in heavily flooded egg yolk and / or transferase assay in a buffered lipid acyltransferase solution for use in accordance with the present invention, can be identified using a transferase assay in a low-water environment.

Для того чтобы определить, является ли фермент липид-ацилтрансферазой согласно настоящему изобретению, можно провести анализ трансферазы в низководной среде, а именно в масляной среде с 6% воды, как описано в примере 22. Этот пример иллюстрирует, что в масляной среде с содержанием воды 6% липид-ацилтрансфераза по изобретению имеет высокую относительную трансферазную активность, тогда как ранее известные липолитические ферменты имеют гидролитическую активность.In order to determine whether the enzyme is a lipid acyltransferase according to the present invention, it is possible to analyze the transferase in a low-water medium, namely in an oil medium with 6% water, as described in Example 22. This example illustrates that in an oil medium with water content 6% of the lipid acyltransferase according to the invention has a high relative transferase activity, while previously known lipolytic enzymes have hydrolytic activity.

В одном варианте осуществления липид-ацилтрансферазой, пригодной для применения в способах и композициях согласно настоящему изобретению, является та, которая при испытании с использованием анализа трансферазы в низководной среде с замером в периоды времени, выбранные из 30, 20 или 120 минут, имеет относительную трансферазную активность по меньшей мере 1%, предпочтительно, по меньшей мере 2%, предпочтительно, по меньшей мере 5%, предпочтительно, по меньшей мере 10%, предпочтительно, по меньшей мере 20%, предпочтительно, по меньшей мере 30%, предпочтительно, по меньшей мере 40%, предпочтительно, по меньшей мере 50%, предпочтительно, по меньшей мере 60%, предпочтительно, по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%. Подходящая липид-ацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может иметь меньше чем 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% активности, измеренной после периода времени в 10, 20, 30 или 120 минут, используя анализ трансферазы в низководной среде.In one embodiment, a lipid acyltransferase suitable for use in the methods and compositions of the present invention is one which, when tested using a transferase assay in a low-water medium, measured in periods of time selected from 30, 20 or 120 minutes, has a relative transferase activity of at least 1%, preferably at least 2%, preferably at least 5%, preferably at least 10%, preferably at least 20%, preferably at least 30%, preferably at least 40%, preferably at least 50%, preferably at least 60%, preferably at least 70%, preferably at least 75%. A suitable lipid acyltransferase in accordance with the present invention may have less than 30%, 40%, 50%, 60%, 70% or 80% of the activity measured after a period of 10, 20, 30 or 120 minutes using a transferase assay low water environment.

Как описано выше, липаза ацилтрансфераза по изобретению может быть идентифицирована с использованием или анализа трансферазы в забуференном субстрате, или анализа трансферазы в низководной среде, с использованием холестерина в качестве акцептора ацила. Конечно, специалист должен понимать, что при очевидных изменениях в аналитических методиках анализ трансферазы в забуференном субстрате или анализ трансферазы в низководной среде могут быть использованы для определения липид-ацилтрансферазной активности для любого липидного донора ацила, или любого акцептора ацила, или любой их комбинации. Специалист должен, если необходимо, просто заменить субстрат донора ацила (например, фосфолипид) альтернативным субстратом донора ацила (например, гликолипида, триглицерида) и/или заменить акцептор ацила (например, холестерин) альтернативным субстратом акцептора ацила (например, углевода, протеина, другого стерола, станола или глицерина).As described above, the lipase acyltransferase according to the invention can be identified using either a transferase assay in a buffered substrate, or a transferase assay in a low-water medium, using cholesterol as an acyl acceptor. Of course, the specialist should understand that, with obvious changes in analytical methods, transferase analysis in a buffered substrate or transferase analysis in a low-water medium can be used to determine lipid acyltransferase activity for any lipid acyl donor, or any acyl acceptor, or any combination thereof. The specialist should, if necessary, simply replace the acyl donor substrate (e.g. phospholipid) with an alternative acyl donor substrate (e.g. glycolipid, triglyceride) and / or replace the acyl acceptor (e.g. cholesterol) with an alternative acyl acceptor substrate (e.g. carbohydrate, protein, other sterol, stanol or glycerol).

Термин "высоководный", как он использован здесь, означает любой субстрат или пищевой продукт с содержанием воды больше 2%, предпочтительно, больше 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%.The term "high water", as used here, means any substrate or food product with a water content of more than 2%, preferably more than 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% or 90%.

Термин "низководный", как он использован здесь, означает любой субстрат или пищевой продукт с содержанием воды меньше 6%, предпочтительно, меньше 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или 0,5%.The term "low-water", as used here, means any substrate or food product with a water content of less than 6%, preferably less than 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or 0.5%.

Предпочтительно, способ и/или применение согласно настоящему изобретению могут быть осуществлены, например, в пищевом продукте при температуре 15-60°С, предпочтительно, при температуре 20-60°С, предпочтительно, 20-50°С, предпочтительно, 20-45°С, предпочтительно, 20-40°С. Для некоторых аспектов, например для теста, температура пищевого продукта в течение времени, в которое протекает реакция ацилтрансферазы, предпочтительно, находится между 20 и 40°С. Для других аспектов, например, относящихся к молочным продуктам, таким как сыр, подходящая температура пищевого продукта может быть между 30°С и 60°С. В еще других аспектах, например, относящихся к майонезу, подходящая температура пищевого продукта может быть между 20°С и 40°С, более предпочтительно, между 25°С и 30°С.Preferably, the method and / or use according to the present invention can be carried out, for example, in a food product at a temperature of 15-60 ° C, preferably at a temperature of 20-60 ° C, preferably 20-50 ° C, preferably 20-45 ° C, preferably 20-40 ° C. For some aspects, for example for dough, the temperature of the food product during the time during which the acyltransferase reaction proceeds is preferably between 20 and 40 ° C. For other aspects, for example, related to dairy products, such as cheese, a suitable food temperature may be between 30 ° C and 60 ° C. In still other aspects, for example, relating to mayonnaise, a suitable food product temperature may be between 20 ° C and 40 ° C, more preferably between 25 ° C and 30 ° C.

Предпочтительно, эмульгатор, образованный согласно настоящему изобретению, составляет меньше 5% мас. пищевого продукта.Preferably, the emulsifier formed according to the present invention is less than 5% wt. food product.

Предпочтительно, эмульгатор, образованный согласно настоящему изобретению, составляет от 0,01 до 4% мас. пищевого продукта.Preferably, the emulsifier formed according to the present invention is from 0.01 to 4% wt. food product.

Предпочтительно, эмульгатор, образованный согласно настоящему изобретению, составляет от 0,01 до 2% мас. пищевого продукта.Preferably, the emulsifier formed according to the present invention is from 0.01 to 2% wt. food product.

Предпочтительно, эмульгатор, образованный согласно настоящему изобретению, составляет от 0,01 до 1% мас. пищевого продукта.Preferably, the emulsifier formed according to the present invention is from 0.01 to 1% wt. food product.

Предпочтительно, эмульгатор, образованный согласно настоящему изобретению, составляет от 0,01 до 0,5% мас. пищевого продукта.Preferably, the emulsifier formed according to the present invention is from 0.01 to 0.5% wt. food product.

Предпочтительно, эмульгатор, образованный согласно настоящему изобретению, составляет от 0,01 до 0,3% мас. пищевого продукта.Preferably, the emulsifier formed according to the present invention is from 0.01 to 0.3% wt. food product.

Способ согласно настоящему изобретению может включать инактивированный или дезактивированный фермент, чтобы получить пищевой продукт, включающий фермент в инактивированной или денатурированной форме. Обычно фермент может быть денатурирован или выпечкой, или пастеризацией.The method according to the present invention may include an inactivated or deactivated enzyme to obtain a food product comprising the enzyme in inactivated or denatured form. Typically, the enzyme can be denatured either by baking or by pasteurization.

Настоящее изобретение может дополнительно охватывать применение липид-ацилтрансферазы, как определено здесь, в пищевых и/или кормовых ферментных композициях и может охватывать пищевые и/или кормовые композиции, включающие липид-ацилтрансферазу, как она определена здесь. Такие композиции могут содержать один или несколько дополнительных ферментов, таких как перечисленные здесь. Альтернативно, ферментная композиция по изобретению может быть использована в сочетании с другими пищевыми ингредиентами/добавками, такими как перечисленные здесь, включая другие ферментные композиции. Путем ввода липид-ацилтрансферазы по изобретению в рецептуру пищевой и/или кормовой композиции фермент может быть стабилизирован, чтобы сделать возможным его длительное хранение (при подходящих условиях) перед применением в производстве пищевых и/или кормовых продуктов. Дополнительно ферментная композиция по настоящему изобретению содержит фермент в подходящей форме для безопасного использования "in situ" при приготовлении пищевых и/или кормовых продуктов или ингредиентов для применения при приготовлении пищи и корма. Такие композиции могут быть в жидкой, или полужидкой, или в твердой/гранулированной форме.The present invention may further encompass the use of lipid acyltransferase, as defined herein, in food and / or feed enzyme compositions and may include food and / or feed compositions including lipid acyltransferase as defined herein. Such compositions may contain one or more additional enzymes, such as those listed here. Alternatively, the enzyme composition of the invention can be used in combination with other food ingredients / additives, such as those listed here, including other enzyme compositions. By incorporating the lipid acyltransferase according to the invention into the formulation of a food and / or feed composition, the enzyme can be stabilized to allow long-term storage (under suitable conditions) before use in the manufacture of food and / or feed products. Additionally, the enzyme composition of the present invention contains the enzyme in a suitable form for safe use " in situ " in the preparation of food and / or feed products or ingredients for use in the preparation of food and feed. Such compositions may be in liquid or semi-liquid, or in solid / granular form.

В одном варианте осуществления пищевая ферментная композиция может быть улучшающей тесто композицией. Улучшающая тесто композиция может включать другие полезные компоненты, такие как эмульгатор и/или другие ферменты, какие перечислены здесь.In one embodiment, the food enzyme composition may be a dough-improving composition. The dough-improving composition may include other useful components, such as an emulsifier and / or other enzymes, which are listed here.

Пищевые ферменты продаются как жидкие концентраты или как измельченные твердые вещества. Ввод в пищевую ферментную композицию минимизирует потери ферментативной активности во время транспортировки, хранения и использования. Ферменты часто подвергают воздействию влажной, горячей или окислительной среды в процессе производства пищи или напитка. Рецептуры улучшают стабильность путем противодействия основным силам дезактивации: денатурированию, дезактивации каталитическими сайтами и протеолизу. Денатурирование происходит путем физического свертывания третичной протеиновой структуры фермента под термическим или химическим напряжением. Как только фермент начинает свертываться, он становится значительно более уязвимым для деактивации и протеолиза. Для того чтобы минимизировать свертывание, составитель рецептуры может изменить окружение протеина так, чтобы привести к компактной структуре протеина, что наиболее эффективно делается путем "предпочтительного исключения" воды с поверхности протеина добавлением связывающих воду соединений, таких как сахара, многоатомные спирты и лиотропные соли. Наилучшими способами борьбы с активными сайтами являются обеспечение достаточных концентраций любых требуемых кофакторов, добавление обратимых ингибиторов и исключение окисляющих или реакционно-способных веществ из рецептуры.Food enzymes are sold as liquid concentrates or as ground solids. Entering the food enzyme composition minimizes the loss of enzymatic activity during transportation, storage and use. Enzymes are often exposed to a moist, hot or oxidizing environment during the production of food or drink. The formulations improve stability by counteracting the basic forces of deactivation: denaturation, deactivation by catalytic sites and proteolysis. Denaturation occurs by physically coagulating the tertiary protein structure of the enzyme under thermal or chemical stress. Once the enzyme begins to coagulate, it becomes significantly more vulnerable to deactivation and proteolysis. In order to minimize clotting, the compiler can change the environment of the protein so as to result in a compact protein structure, which is most effectively done by “preferentially eliminating” water from the surface of the protein by adding water-binding compounds such as sugars, polyols and lyotropic salts. The best ways to deal with active sites are to provide sufficient concentrations of any desired cofactors, add reversible inhibitors, and eliminate oxidizing or reactive substances from the formulation.

Кроме стабильности ферментов, рецептура должна отвечать нескольким ключевым вторичным требованиям, включающим защиту от микробного загрязнения, избежание физического образования осадка или образования мути, минимизацию образования чувствительных пылей или аэрозолей и оптимизацию эстетического критерия, такого как цвет и запах. Многие из этих проблем в наибольшей степени рассматриваются, фокусируясь настолько далеко "вверх по течению", насколько возможно, включая выбор сырьевых материалов при ферментации или процессе извлечения фермента.In addition to enzyme stability, the formulation must meet several key secondary requirements, including protection against microbial contamination, avoiding physical sedimentation or turbidity, minimizing the formation of sensitive dusts or aerosols, and optimizing aesthetic criteria such as color and smell. Many of these issues are most addressed, focusing as far upstream as possible, including the choice of raw materials in the fermentation or enzyme extraction process.

Операции выделения продукта, такие как диафильтрация, адсорбция, хроматография, кристаллизация и экстракция, могут быть использованы для удаления загрязнений, ответственных за цвет, запах и выпадение осадка. Риск физического осаждения минимизируется путем составления композиции вблизи изоэлектрической точки фермента с гидрофильным растворителем, таким как глицерин или пропиленгликоль. Можно также эффективно добавить умеренные количества сольватирующих солей, чтобы избежать или высаливания, или "обратного всаливания". Чтобы предотвратить микробное загрязнение, можно использовать сочетание фильтрации, подкисления и минимизации свободной воды; эффективными могут быть биоциды, но интервал приемлемых химикатов для борьбы с микробами или уничтожения микробов является ограниченным правилами здравоохранения и безопасности.Product isolation operations, such as diafiltration, adsorption, chromatography, crystallization, and extraction, can be used to remove contaminants responsible for color, odor, and precipitation. The risk of physical deposition is minimized by formulating a composition near the isoelectric point of the enzyme with a hydrophilic solvent such as glycerol or propylene glycol. Moderate amounts of solvating salts can also be effectively added to avoid either salting out or “back salting”. To prevent microbial contamination, a combination of filtration, acidification and minimization of free water can be used; biocides may be effective, but the range of acceptable chemicals for controlling microbes or killing microbes is limited by health and safety regulations.

Двумя способами получения наиболее устойчивых к истиранию гранул на сегодня являются гранулирование при сильном сдвиге и нанесение покрытия распылением в псевдоожиженном слое, см., например, T. Becker: "Separation and Purification Processes for Recovery of Industrial Enzymes" in R.K. Singh, S.S.H. Rivzi (eds): Bioseparation Processes in Foods, Marcel-Decker, New York, pp. 427-445. Эти способы используют различные связующие, покрытия и морфологии частиц для получения некрошащихся частиц, которые хотя и защищают ферменты во время хранения, но дают возможность их легкого высвобождения в раствор во время использования.Two methods for producing the most abrasion resistant pellets today are shear granulation and spray coating in a fluidized bed, see, for example, T. Becker: "Separation and Purification Processes for Recovery of Industrial Enzymes" in RK Singh, SSH Rivzi ( eds): Bioseparation Processes in Foods , Marcel-Decker, New York, pp. 427-445. These methods use various binders, coatings, and particle morphologies to produce non-crumbling particles, which although they protect the enzymes during storage, but allow them to be easily released into solution during use.

Пищевые ферментные композиции, содержащие липид-ацилтрансферазу по изобретению, могут быть изготовлены с использованием стандартных методов приготовления форм, таких как распылительная сушка или приготовление жидких форм.The food enzyme compositions containing the lipid acyltransferase according to the invention can be prepared using standard form preparation methods, such as spray drying or liquid form preparation.

Липид-ацилтрансфераза по изобретению может быть экспрессирована в любой подходящий носитель. Например, липид-ацилтрансфераза по изобретению может быть экспрессирована в Bacillus subtilis и может быть очищена ультрафильтрацией и/или осаждением в этаноле, и/или центрифугированием и может быть впоследствии высушена распылительной сушкой с использованием крахмала (мальтодекстрина) в качестве носителя для фермента. Фермент распылительной сушки может быть стандартизирован к заданной PLU активности добавлением дополнительного носителя в форме порошка. Используемые методы являются хорошо известными и рутинными в практике.The lipid acyltransferase according to the invention can be expressed in any suitable carrier. For example, the lipid acyltransferase of the invention can be expressed in Bacillus subtilis and can be purified by ultrafiltration and / or precipitation in ethanol and / or centrifugation and can subsequently be spray dried using starch (maltodextrin) as the carrier for the enzyme. The spray drying enzyme can be standardized for a given PLU activity by adding an additional carrier in powder form. The methods used are well known and routine in practice.

Альтернативно, липид-ацилтрансфераза для использования в соответствии с настоящим изобретением, например полученная гетерологически липид-ацилтрансфераза по изобретению, будучи очищенной, может быть стабилизирована в подходящей жидкой форме, такой как формы на основе глицерина. Другие методы приготовления стабилизированных ферментных форм описаны в EР 0770037 и ЕР 0702712.Alternatively, a lipid acyltransferase for use in accordance with the present invention, for example, the heterologically obtained lipid acyltransferase according to the invention, when purified, can be stabilized in a suitable liquid form, such as glycerol based forms. Other methods for preparing stabilized enzyme forms are described in EP 0770037 and EP 0702712.

Ацилтрансфераза в форме порошка также может быть использована в сочетании с другими ферментами, какие перечислены здесь, для получения ферментных композиций с активностью, определенной спецификацией на продукт.Powdered acyltransferase can also be used in combination with other enzymes, which are listed here, to obtain enzyme compositions with activity defined by the product specification.

Обычно дозировка пищевых ферментных композиций составляет от 10 до 1000 г на 1000 кг пищевого продукта, предпочтительно, 50-200 г на 1000 кг пищевого продукта, предпочтительно, 75-125 г на 1000 кг пищевого продукта.Typically, the dosage of food enzyme compositions is from 10 to 1000 g per 1000 kg of food product, preferably 50-200 g per 1000 kg of food product, preferably 75-125 g per 1000 kg of food product.

Предпочтительно, фермент согласно настоящему изобретению присутствует в пищевом продукте в неактивной форме или в денатурированной форме.Preferably, the enzyme according to the present invention is present in the inactive form or in denatured form in the food product.

В одном варианте осуществления фермент согласно настоящему изобретению является, предпочтительно, не иммобилизованным, в частности, он не иммобилизован на твердом носителе.In one embodiment, the enzyme according to the present invention is preferably not immobilized, in particular, it is not immobilized on a solid support.

В альтернативном варианте осуществления фермент может быть иммобилизованным.In an alternative embodiment, the enzyme may be immobilized.

Иммобилизованная липид-ацилтрансфераза может быть получена с использованием известных в практике методов иммобилизации. Таковыми являются различные способы получения иммобилизованных ферментов, которые должны быть ясны специалисту (например, методы, указанные в ЕР 0746608 или в Balcao V.M., Paiva A.L., Malcata F.X., Enzyme Microb. Technol. 1996 May 1: 18 (6): 392-416, или в Reetz M.T., Jaeger K.E., Chem. Phys. Lipids 1998 Jun: 93(1-2): 3-14, или в Bornscheuer U.T., Bessler C., Srinivas R., Krishna S.H. Trends Biotechnol. 2002 Oct; 20(10): 433-7, каждая из которых введена сюда ссылкой).Immobilized lipid acyltransferase can be obtained using immobilization methods known in the art. These are various methods for producing immobilized enzymes that should be clear to a person skilled in the art (for example, methods described in EP 0746608 or in Balcao VM, Paiva AL, Malcata FX, Enzyme Microb. Technol. 1996 May 1: 18 (6): 392-416 or Reetz MT, Jaeger KE, Chem. Phys. Lipids 1998 Jun: 93 (1-2): 3-14, or Bornscheuer UT, Bessler C., Srinivas R., Krishna SH Trends Biotechnol. 2002 Oct; 20 (10): 433-7, each of which is introduced here by reference).

В одном варианте осуществления пищевой продукт по изобретению содержит пищевые ингредиенты, которые были получены с использованием иммобилизованной липид-ацилтрансферазы, но не содержат липид-ацилтрансферазу в пищевом ингредиенте или пищевом продукте. Например, пищевой продукт может содержать один или несколько из следующего: эмульгатор, более чем один эмульгатор, один или несколько вкусовых агентов, один или несколько улучшающих текстуру агентов и/или один или несколько эфиров стерола, таких как эфиры фитостерола или эфиры фитостанола.In one embodiment, the food product of the invention comprises food ingredients that have been prepared using immobilized lipid acyltransferase but do not contain lipid acyltransferase in the food ingredient or food product. For example, a food product may contain one or more of the following: an emulsifier, more than one emulsifier, one or more flavoring agents, one or more texture improvers, and / or one or more sterol esters, such as phytosterol esters or phytostanol esters.

Фермент согласно настоящему изобретению может быть использован с одним или несколькими обычными эмульгаторами, включая, например, моноглицериды, эфиры диацетилвинной кислоты, моно- и диглицериды жирных кислот и лецитины, например, полученные из сои.The enzyme according to the present invention can be used with one or more conventional emulsifiers, including, for example, monoglycerides, diacetyl tartaric acid esters, fatty acid mono- and diglycerides and lecithins, for example, derived from soy.

Фермент согласно настоящему изобретению может быть использован с одним или несколькими из других подходящих ферментов пищевого качества. Так, в рамках настоящего изобретения в дополнение к ферменту по изобретению к пищевому продукту добавляют по меньшей мере один дополнительный фермент. Такие дополнительные ферменты включают разлагающие крахмал ферменты, такие как эндо- или экзомилазы, пуллуназазы, отщепляющие боковые ветви ферменты, гемицеллюлазы, включая ксиланазы, целлюлазы, липазы, фосфолипазы и протеазы.The enzyme according to the present invention can be used with one or more of the other suitable food grade enzymes. Thus, in the framework of the present invention, in addition to the enzyme of the invention, at least one additional enzyme is added to the food product. Such additional enzymes include starch-degrading enzymes such as endo- or exomilases, pullunazases, side-branching enzymes, hemicellulases, including xylanases, cellulases, lipases, phospholipases and proteases.

Фермент согласно настоящему изобретению может быть использован с одним или несколькими из других подходящих ферментов пищевого качества. Так, в рамках настоящего изобретения в дополнение к ферменту по изобретению к пищевому продукту добавляют по меньшей мере один дополнительный фермент. Такие дополнительные ферменты включают разлагающие крахмал ферменты, такие как эндо- или экзомилазы, пуллуназазы, отщепляющие боковые ветви ферменты, гемицеллюлазы, включая ксиланазы, целлюлазы, оксидоредуктазы, например оксидазу глюкозы, оксидазу пиранозы, сульфгидрилоксидазу или карбогидратоксидазу, такую как окисляющая мальтозу, например оксидаза гексозы (НОХ), липазы, фосфолипазы и гексозоксидазы и протеазы.The enzyme according to the present invention can be used with one or more of the other suitable food grade enzymes. Thus, in the framework of the present invention, in addition to the enzyme of the invention, at least one additional enzyme is added to the food product. Such additional enzymes include starch-degrading enzymes, such as endo- or exomilases, pullunazases, side-branching enzymes, hemicellulases, including xylanases, cellulases, oxidoreductases, for example, glucose oxidase, pyranose oxidase, such as malic acid oxidase, for example (HOX), lipases, phospholipases and hexosoxidases and proteases.

В одном предпочтительном варианте осуществления липид-ацилтрансферазу используют в сочетании с липазами, имеющими одну или несколько из следующих липазных активностей: гликолипазную активность (Е.С. 3.1.1.26), триацилглицеринлипазную активность (Е.С. 3.1.1.3), фосфолипазную А2 активность (Е.С. 3.1.1.4) или фосфолипазную А1 активность (Е.С. 3.1.1.32). Подходящие липазные ферменты хорошо известны в практике и включают в качестве примера следующие липазы: LIPOPAN® F и/или LECITASE® ULTRA (Novozymes A/S, Denmark), фосфолипазу А2 (например, фосфолипазу А2 от LIPOMOD™ 22L от Biocatalysts, LIPOMAX™ от Genecor), LIPOLASE® (Novozymes A/S, Denmark), липазу, описанную в WO 03/97835, EP 0977869 или EР 1193314. Эта комбинация липид-ацилтрансферазы, как она определена здесь, и липазы может быть особенно предпочтительной в продуктах из теста или выпечке или в тонких пищевых продуктах, таких как пирожные и конфеты.In one preferred embodiment, lipid acyltransferase is used in combination with lipases having one or more of the following lipase activities: glycolipase activity (E.C. 3.1.1.26), triacylglycerol lipase activity (E.C. 3.1.1.3), phospholipase A2 activity (ES 3.1.1.4) or phospholipase A1 activity (ES 3.1.1.32). Suitable lipase enzymes are well known in the art and include, as an example, the following lipases: LIPOPAN® F and / or LECITASE® ULTRA (Novozymes A / S, Denmark), phospholipase A2 (e.g., phospholipase A2 from LIPOMOD ™ 22L from Biocatalysts, LIPOMAX ™ from Genecor), LIPOLASE® (Novozymes A / S, Denmark), the lipase described in WO 03/97835, EP 0977869 or EP 1193314. This combination of lipid acyltransferase as defined herein and lipase may be particularly preferred in dough products or baked goods or in delicate foods such as cakes and sweets.

Применение липаз в сочетании с ферментом по изобретению может быть особенно выигрышным в случаях, когда может быть желательно некоторое накопление жирных кислот, например в сыре, где свободные жирные кислоты могут придать желаемый вкус, или при приготовлении тонких пищевых продуктов. Специалист должен быть способен комбинировать пропорции липолитических ферментов, например LIPOPAN® F, LECITASE® ULTRA (Novozymes A/S, Denmark), фосфолипазы А2 (например, фосфолипазы А2 от LIPOMOD™ 22L от Biocatalysts, LIPOMAX™ от Genecor), LIPOLASE® (Novozymes A/S, Denmark), липазы, описанной в WO 03/97835, EP 0977869 или EР 1193314, и липид-ацилтрансферазы по настоящему изобретению, чтобы обеспечить желаемые соотношение гидролитической и трансферазной активности, которое даст в результате предпочтительный технический эффект или сочетание технических эффектов в пищевом продукте (такие, как перечисленные здесь в разделе "Технические эффекты").The use of lipases in combination with the enzyme according to the invention can be particularly advantageous in cases where some accumulation of fatty acids may be desirable, for example in cheese, where free fatty acids can give the desired taste, or in the preparation of delicate foods. The person skilled in the art should be able to combine proportions of lipolytic enzymes, e.g. LIPOPAN® F, LECITASE® ULTRA (Novozymes A / S, Denmark), phospholipase A2 (e.g. phospholipase A2 from LIPOMOD ™ 22L from Biocatalysts, LIPOMAX ™ from Genecor), LIPOLASE® (Novozymes A / S, Denmark), the lipase described in WO 03/97835, EP 0977869 or EP 1193314, and the lipid acyltransferase of the present invention to provide the desired ratio of hydrolytic and transferase activity, which will result in a preferred technical effect or combination of technical effects in a food product (such as those listed in here in the section "Technical Effects").

Обычно изготовители тортов используют улучшители тортов для изготовления тортов и обеспечения высокого качества тортов в отношении вкуса, структуры, потребительского качества и внешнего вида. Такие улучшители тортов обычно основываются на эмульгаторах, нанесенных распылением на носитель типа крахмала и мальтодекстрина. Некоторые улучшители представлены также в гелевой форме, основанной на эмульгаторах, сахарах и воде. Такие улучшители тортов очень важны для производства тортов для приготовления продукции высокого качества. Однако улучшители тортов содержат эмульгаторы и другие "ненатуральные" ингредиенты с Е-номерами. Из-за требований потребителей уменьшить число Е-номеров производство тортов нуждается в альтернативных способах изготовления тортов высокого качества без применения эмульгаторов.Typically, cake manufacturers use cake improvers to make cakes and provide high quality cakes in terms of taste, texture, consumer quality and appearance. Such cake improvers are usually based on emulsifiers sprayed onto a carrier such as starch and maltodextrin. Some improvers are also presented in gel form based on emulsifiers, sugars and water. Such cake improvers are very important for the production of cakes for the preparation of high quality products. However, cake improvers contain emulsifiers and other "unnatural" ingredients with E-numbers. Due to the demands of consumers, reducing the number of E-numbers, cake production needs alternative methods of making high-quality cakes without the use of emulsifiers.

Альтернативным путем изготовления тортов является применение фермента, т.е. липид-ацилтрансферазы, определенной здесь, или ферментной композиции согласно настоящему изобретению.An alternative way of making cakes is to use an enzyme, i.e. a lipid acyltransferase as defined herein or an enzyme composition according to the present invention.

Липид-ацилтрансфераза, как она определена здесь, и/или пищевая ферментная композиция по настоящему изобретению может быть использована при приготовлении "тонких" пищевых продуктов, таких как торты. В таких случаях в пищевом продукте могут быть образованы следующие составляющие:The lipid acyltransferase as defined herein and / or the food enzyme composition of the present invention can be used in the preparation of "thin" food products, such as cakes. In such cases, the following components may be formed in the food product:

i) эфиры сахаров и лизолецитин (из углевода в рецепте торта и лецитина в яйцах, которые также составляют часть рецепта торта) и/илиi) sugar esters and lysolecithin (from carbohydrate in the cake recipe and egg lecithin, which also form part of the cake recipe) and / or

ii) ацилированные пептиды и лизолецитин (путем переноса жирной кислоты от лецитина к протеину или пептиду во время образования конденсатов протеин-жирная кислота, которые известны как высоко эффективные эмульгаторы (Herstellung und Anvendungmöglichkeiten von Eiweiss-Fettsaürekondensaten. Andreas Sander, Eberhard Eilers, Andrea Heilemann, Edith von Kreis. Fett/lipid 99 (1997) Nr. 4, 115-120).ii) acylated peptides and lysolecithin (by transferring a fatty acid from lecithin to a protein or peptide during the formation of protein-fatty acid condensates, which are known as highly effective emulsifiers (Herstellung und Anvendungmöglichkeiten von Eiweiss-Fettsaürekondensaten. Andreas Sander, Eberhard Eilershards, Andreas Sanders, Eberhard Eilers Edith von Kreis. Fett / lipid 99 (1997) Nr. 4, 115-120).

Считается, что при изготовлении некоторых "тонких" пищевых изделий, в особенности сильно жирных тонких пищевых изделий, таких как торты, может быть желательно иметь некоторое накопление жирных кислот. Поэтому комбинация применения липолитических ферментов и липид-ацилтрансферазы, как она определена здесь, может быть особо благоприятным для изготовления высокожирных тонких пищевых изделий. Альтернативно, дополнительные свободные жирные кислоты или жирнокислотное мыло (Е470а) могут быть выбраны и использованы в сочетании с липид-ацилтрансферазой.It is believed that in the manufacture of certain “thin” food products, especially highly fatty thin food products, such as cakes, it may be desirable to have some accumulation of fatty acids. Therefore, the combination of the use of lipolytic enzymes and lipid acyltransferase, as defined here, can be especially favorable for the manufacture of high-fat thin food products. Alternatively, additional free fatty acids or fatty acid soap (E470a) can be selected and used in combination with lipid acyltransferase.

Пищевой продукт согласно настоящему изобретению может подходяще включать одну или несколько из следующих добавок:The food product of the present invention may suitably include one or more of the following additives:

соевый протеиновый материал, каротиноиды, флавоноиды, антиоксидант и фитохимикалии (в особенности антоцианид, каротиноид, биофлавоноид, глютанион, катехин, изофлавон, ликопен, гинсенозид, пикногенол, алкалоид, пигеум фитостерол, сульфорафон, резвератол, экстракт виноградных косточек или пищевые содержащие станол эфиры), витамин (особенно витамин С, витамин А, витамин В3, витамин D, витамин Е, тиамин, рибофлавин, ниацин, пиридоксин, цианокабаламин, фолиевая кислота, биотин, пантотеновая кислота или витамин К), минералы (в особенности кальций, йод, магний, цинк, железо, селен, марганец, хром, медь, кобальт, молибден или фосфор), жирная кислота (в особенности гамма-линоленовая кислота, укоспентатеновая кислота или декозагексаеновая кислота), масло (в особенности масло бурачника, масло канолы с высоким содержанием каротиноидов или масло семян льна), аминокислота (в особенности триптофан, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, валин, лейцин, изолейцин, аланин, аргинин, аспартамовая кислота, цистин, цистеин, глутаминовая кислота, глютамин, глицин, гистидин, пролин, гидроксипролин, серин, таурин или тирозин), фермент (в особенности бромелаин, папаин, амилаза, целлюлаза или кофермент Q), лигнин, эфир станола или дружественные бактерии (в особенности Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus plantarum или Streptococcus faecium), фолиевая кислота и растворимое волокно.soy protein material, carotenoids, flavonoids, antioxidant and phytochemicals (in particular anthocyanide, carotenoid, bioflavonoid, glutanion, catechin, isoflavone, lycopene, ginsenoside, pycnogenol, alkaloid, pyheum phytosterol, sulfoferol ether, resverol ether, resverol ether, resverol , vitamin (especially vitamin C, vitamin A, vitamin B3, vitamin D, vitamin E, thiamine, riboflavin, niacin, pyridoxine, cyanocabalamine, folic acid, biotin, pantothenic acid or vitamin K), minerals (especially calcium, e, magnesium, zinc, iron, selenium, manganese, chromium, copper, cobalt, molybdenum or phosphorus), fatty acid (in particular gamma-linolenic acid, ukospentatenovy acid or decosehexaenoic acid), oil (in particular borage oil, canola oil with high carotenoids or flax seed oil), an amino acid (especially tryptophan, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, valine, leucine, isoleucine, alanine, arginine, aspartic acid, cystine, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, proline , hydroxyproline, serine, ta rin or tyrosine), enzyme (especially bromelain, papain, amylase, cellulase or coenzyme Q), lignin, stanol ester or friendly bacteria (especially Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus bifidus , Lactobacillus plantarum or Streptococcus faecium), folic acid and soluble fiber.

ТЕХНИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТTECHNICAL EFFECT

Неожиданно липид-ацилтрансфераза имеет значительную ацилтрансферазную активность в пищевых продуктах. Эта активность имеет неожиданно благоприятное применение в способах приготовления пищевых продуктов.Surprisingly, lipid acyltransferase has significant acyltransferase activity in foods. This activity has unexpectedly beneficial uses in food preparation methods.

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению может осуществить этерификацию углевода путем алкоголиза, т.е. перенос ацила от липида в пищевом продукте со значительным содержанием воды. Ранее предполагалось, что такие ферменты если и будут работать таким образом, то только в среде растворителя (т.е. в среде с низким содержанием или с отсутствием воды).The present invention is based on the unexpected discovery that the lipid acyltransferase according to the present invention can carry out the esterification of carbohydrate by alcoholysis, i.e. acyl transfer from lipid in a food product with a significant water content. It was previously assumed that such enzymes, if they work in this way, then only in a solvent medium (i.e., in an environment with a low content or lack of water).

Настоящее изобретение может обеспечить один или несколько из следующих неожиданных технических эффектов для яичных продуктов, в частности майонеза: улучшенная тепловая стабильность во время пастеризации, улучшенные органолептические свойства и улучшенная консистенция.The present invention can provide one or more of the following unexpected technical effects for egg products, in particular mayonnaise: improved thermal stability during pasteurization, improved organoleptic properties and improved texture.

Настоящее изобретение может обеспечить один или несколько из следующих неожиданных технических эффектов для продуктов из теста и/или выпечки: улучшенный удельный объем или теста, или выпеченных продуктов (например, хлеба и/или торта), улучшенная стабильность теста, улучшенная балльная оценка корки (например, более тонкая и/или хрустящая корка хлеба), улучшенная балльная оценка мякиша (например, более однородное распределение мякиша, и/или более тонкая структура мякиша, и/или более мягкий мякиш), улучшенный внешний вид (например, гладкая поверхность без вздутий на поверхности или дырок или практически без вздутий на поверхности или дырок), пониженное очерствение, улучшенная мягкость, улучшенный запах, улучшенный вкус.The present invention can provide one or more of the following unexpected technical effects for dough and / or baked products: improved specific volume of either dough or baked products (e.g., bread and / or cake), improved dough stability, improved crust scoring (e.g. finer and / or crisp bread crust), improved crumb score (e.g., more uniform crumb distribution, and / or finer crumb structure, and / or softer crumb), improved appearance (e.g., smoother erhnost without blisters or holes on the surface, or substantially without blisters or holes on the surface), reduced staling, improved softness, improved odor, improved flavor.

Настоящее изобретение может обеспечить благоприятный эффект от образования сильно поверхностно-активных веществ в пищевом продукте без образования существенного количества свободных жирных кислот, которые снижают способность пищевого продукта окисляться при хранении, поскольку свободные жирные кислоты более склонны к окислению, чем соответствующие эфиры жирных кислот.The present invention can provide a beneficial effect from the formation of highly surfactants in the food product without the formation of a significant amount of free fatty acids, which reduce the ability of the food product to oxidize during storage, since free fatty acids are more prone to oxidation than the corresponding fatty acid esters.

Соответственно, настоящее изобретение может обеспечить один или несколько из следующих неожиданных эффектов в пищевом продукте: улучшенный внешний вид, улучшенное ощущение во рту, улучшенная стабильность, в особенности улучшенная термическая стабильность, улучшенный вкус, улучшенная мягкость, улучшенная упругость, улучшенное эмульгирование.Accordingly, the present invention can provide one or more of the following unexpected effects in a food product: improved appearance, improved mouth feel, improved stability, in particular improved thermal stability, improved taste, improved softness, improved elasticity, improved emulsification.

Соответственно, настоящее изобретение может обеспечить один или несколько из следующих неожиданных эффектов в молочных продуктах, таких как, например, мороженое: улучшенное ощущение во рту (предпочтительно, более выраженное ощущение сливок во рту), улучшенный вкус, улучшенный расплав.Accordingly, the present invention can provide one or more of the following unexpected effects in dairy products, such as, for example, ice cream: improved mouthfeel (preferably a more pronounced creamy mouthfeel), improved taste, improved melt.

Соответственно, настоящее изобретение может обеспечить один или несколько из следующих неожиданных эффектов в яйцах или в яичных продуктах: улучшенная стабильность эмульсии, термическая стабильность эмульсии, улучшенный вкус, уменьшенный плохой запах, улучшенные загущающие свойства, улучшенная консистенция.Accordingly, the present invention can provide one or more of the following unexpected effects in eggs or egg products: improved emulsion stability, thermal stability of the emulsion, improved taste, reduced bad smell, improved thickening properties, improved consistency.

Специфические технические эффекты, связанные с использованием липид-ацилтрансферазы, как она определена здесь, при приготовлении пищевого продукта перечислены в таблице ниже.Specific technical effects associated with the use of lipid acyltransferase, as defined here, when preparing a food product are listed in the table below.

Пищевой продуктFood product ЭффектEffect 1one Хлеб, пышки и пончикиBread, donuts and donuts Усиливает тесто повышает механическую прочность и увеличивает способность поглощать воду. Увеличивает объем выпеченных продуктов и поддерживает мягкость мякиша.Enhances the dough increases mechanical strength and increases the ability to absorb water. Increases the volume of baked products and maintains the softness of the crumb. 22 Замороженное тестоFrozen dough Предотвращает порчу при замораживании.Prevents damage during freezing. 33 БисквитBiscuit Дает хороший объем кекса и однородную мягкую текстуру.Gives a good cupcake volume and a uniform soft texture. 4four Бисквит, крекеры и печеньеSponge cake, crackers and cookies Дает стабильную эмульсию жира и предотвращает прилипание к машине. Предотвращает жировое поседение сильно жирных продуктов.It gives a stable emulsion of fat and prevents sticking to the machine. Prevents greasy graying of highly fatty foods. 55 Болтушка и панировкаChatterbox and breading Улучшает текстуру жареных продуктов.Improves the texture of fried foods. 66 ЛапшаNoodles Предотвращает прилипание теста к машине. Увеличивает содержание воды и уменьшает потери при готовке.Prevents sticking of dough to the machine. Increases water content and reduces cooking losses. 77 Лапша быстрого приготовленияInstant noodles Предотвращает прилипание лапши друг к другу.Prevents noodles from sticking to each other. 88 ПастаPaste Кондиционер теста предотвращает адгезию при готовке.Dough conditioner prevents adhesion during cooking. 99 Крем драченыCream pummeled Дает крахмальную пасту с гладкой и кремовой текстурой и предотвращает обезвоживание.Gives a starchy paste with a smooth and creamy texture and prevents dehydration. 1010 Забеливатель кофеCoffee whitener Предотвращает разделение масла и воды.Prevents the separation of oil and water. 11eleven Взбитый кремWhipped cream Обеспечивает стабильную эмульсию.Provides a stable emulsion. 1212 ШоколадChocolate Предотвращает замедленное поседение.Prevents delayed graying. 1313 Карамель, конфеты и нугаCaramel, sweets and nougat Улучшает эмульгирование расплавленного сахара и масла. Предотвращает отделение масла.Improves emulsification of molten sugar and butter. Prevents oil separation. 14fourteen Переработанное мясо, сосискиProcessed meat, sausages Улучшает способность сосисок и прессованной ветчины удерживать воду и предотвращает отделение масляной фазы из паст и пате.Improves the ability of sausages and pressed ham to retain water and prevents the separation of the oil phase from pastes and patas.

Соответственно, настоящее изобретение может обеспечить один или несколько из следующих неожиданных эффектов в сырах: уменьшение эффекта выделения масла из сыра, увеличение выхода сыра, улучшение вкуса, ослабленный плохой запах, ослабленный "мыльный" вкус.Accordingly, the present invention can provide one or more of the following unexpected effects in cheeses: reducing the effect of oil separation from cheese, increasing the yield of cheese, improving the taste, the weakened bad smell, the weakened “soapy” taste.

При производстве пищевых продуктов, в частности при производстве сыров, применение липид-ацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением дает значительное преимущество в способности извлекать растворимые протеины из молочных продуктов. Например, при производстве сыра почти 20% всего молочного протеина удаляются в сыворотку (т.е. водную часть молока, которая остается после образования творогов). Сыворотка содержит растворимые молочные протеины, тогда как гидрофобные протеины удерживаются в твороге. При использовании липид-ацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением возможно перенести ацильную группу от липида (предпочтительно, от гликолипида или фосфолипида) к протеину (в частности, к протеину сыворотки, такому как лактоглобулин), чтобы образовать конденсат протеина и жирной кислоты. Таким образом, образуется продукт, который является более гидрофобным и который должен остаться в твороге, а не быть вымытым в сыворотку. Таким путем больше молочного протеина может быть удержано в конечном пищевом продукте, т.е. в конечном молочном продукте, таком как сыр.In the manufacture of food products, in particular in the production of cheese, the use of lipid acyltransferase in accordance with the present invention gives a significant advantage in the ability to extract soluble proteins from dairy products. For example, in the production of cheese, almost 20% of all milk protein is removed in whey (i.e. the aqueous portion of the milk that remains after the formation of cottage cheese). Whey contains soluble milk proteins, while hydrophobic proteins are held in cottage cheese. When using the lipid acyltransferase in accordance with the present invention, it is possible to transfer the acyl group from a lipid (preferably from a glycolipid or phospholipid) to a protein (in particular to a whey protein such as lactoglobulin) to form a condensate of the protein and fatty acid. Thus, a product is formed which is more hydrophobic and which should remain in the curd and not be washed in the whey. In this way, more milk protein can be retained in the final food product, i.e. in a final dairy product such as cheese.

В одном аспекте настоящее изобретение основывается частично на реализации того, что выход пищевых продуктов, таких как сыр, может быть улучшен путем использования липид-ацилтрансферазы. В дополнение или альтернативно, вкус, текстура, окислительная стабильность и/или срок хранения пищевого продукта могут быть улучшены. В дополнение или альтернативно, пищевой продукт может иметь пониженное содержание холестерина или улучшенное содержание эфиров стерола/станола.In one aspect, the present invention is based in part on the realization that the yield of food products, such as cheese, can be improved by using lipid acyltransferase. In addition or alternatively, the taste, texture, oxidative stability and / or shelf life of the food product can be improved. In addition or alternatively, the food product may have a reduced cholesterol content or an improved content of sterol / stanol esters.

Без желания быть связанными конкретной теорией считается, что увеличение выхода может быть результатом трансэтерификации протеинов сыворотки и пептидов, приводящей к значительному повышению гидрофобности протеинов сыворотки и осаждению ацилированных протеинов сыворотки в сырный творог.Without the desire to be bound by a specific theory, it is believed that an increase in yield may result from transesterification of whey proteins and peptides, resulting in a significant increase in the hydrophobicity of whey proteins and precipitation of acylated whey proteins in cheese curd.

В биологических системах, например, осаждение мембраносвязанных протеинов и ферментов достигается по двум разным механизмам. Мембраносвязанные протеины или обладают рядом стягивающих мембрану или гидрофобных доменов, или они, альтернативно, имеют жирную кислоту, прикрепленную к полипептидной смеси. Жирные кислоты имеют обычно цепь длиной в 14 или 16 атомов углерода. Жирные кислоты являются ковалентно прикрепленными к полипептидной цепи в 3 разных положениях: к N-концу аминокислоты - как амидная связь, к остатку цистеина - как тиоэфирная связь, или к аминокислоте серину или треонину - как эфирная связь. Только одна жирная кислота на молекулу полипептида необходима для ввода протеина в мембрану клетки.In biological systems, for example, the deposition of membrane-bound proteins and enzymes is achieved by two different mechanisms. Membrane-bound proteins either have a number of tightening membranes or hydrophobic domains, or they alternatively have a fatty acid attached to the polypeptide mixture. Fatty acids usually have a chain length of 14 or 16 carbon atoms. Fatty acids are covalently attached to the polypeptide chain in 3 different positions: to the N-terminus of an amino acid as an amide bond, to a cysteine residue as a thioether bond, or to an amino acid serine or threonine as an ether bond. Only one fatty acid per polypeptide molecule is needed to introduce the protein into the cell membrane.

Когда жирная кислота ковалентно прикреплена к немембранному протеину, физические и функциональные свойства будут меняться радикально. WO 97/14713 описывает протеины сои и глютена, трансформированные в ацилпроизводные обработкой липазой из Mucor miehet (Lipozyme™, Novozymes) и жирной кислотой в органическом растворителе. Липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению может быть использована при получении ацилированных протеинов в низководной или высоководной среде.When a fatty acid is covalently attached to a non-membrane protein, physical and functional properties will change radically. WO 97/14713 describes soy and gluten proteins transformed into acyl derivatives by treatment with lipase from Mucor miehet (Lipozyme ™, Novozymes) and a fatty acid in an organic solvent. The lipid acyltransferase according to the present invention can be used in the preparation of acylated proteins in a low or high water environment.

Авторы отмечают, что ацилированные протеины образуют амфифильные комплексы, которые могут быть использованы для ряда косметических продуктов. Ацилированный протеин может образовывать гели, связывать воду остаточной влагой, иметь эмульгирующие свойства и быть очень активным на разделе фаз между водой и липидом.The authors note that acylated proteins form amphiphilic complexes that can be used for a number of cosmetic products. The acylated protein can form gels, bind water with residual moisture, have emulsifying properties and be very active in the phase separation between water and lipid.

Так, настоящее изобретение может в одном аспекте относиться к косметической композиции, включающей липид-ацилтрансферазу, как она определена здесь.Thus, the present invention may, in one aspect, relate to a cosmetic composition comprising a lipid acyltransferase as defined herein.

В добавление, настоящее изобретение может относиться к применению ацилтрансферазы, как она определена здесь, для получения косметической композиции.In addition, the present invention may relate to the use of acyltransferase, as defined here, to obtain a cosmetic composition.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения in situ эфира протеина в косметической композиции, где способ включает стадию добавления в косметическую композицию (или в ее компоненты) липид-ацилтрансферазы, как она определена здесь.In a further aspect, the present invention relates to a method for producing an in situ protein ester in a cosmetic composition, the method comprising the step of adding a lipid acyltransferase as defined herein to the cosmetic composition (or its components).

Многие пищевые продукты являются растворимыми в водных растворах и потому подходят для модификации in situ липазой ацилтрансферазой. При производстве сыра β-лактоглобулин теряется с фракцией сыворотки. После ацилирования липазой ацилтрансферазой или вариантом липазы ацилтрансферазы начальные результаты показывают, что β-лактоглобулин может, однако, быть осажден на поверхность мицеллы казеина во время коагуляции сычугом. β-лактоглобулин имеет три потенциально ацилируемых сайта (остатки серина) на трех поверхностных петлях. Молоко содержит достаточные количества лецитина, подходящего субстрата для того, чтобы фермент липид-ацилтрансфераза ацилировала β-лактоглобулин. Образовавшийся лизолецитин может оказать дополнительный эмульгирующий эффект.Many foods are soluble in aqueous solutions and are therefore suitable for in situ modification with lipase acyltransferase. In cheese production, β-lactoglobulin is lost with the whey fraction. After acylation with a lipase acyltransferase or variant acyltransferase lipase, initial results show that β-lactoglobulin can, however, be deposited on the surface of casein micelles during coagulation with abomasum. β-lactoglobulin has three potentially acylated sites (serine residues) on three surface loops. The milk contains sufficient amounts of lecithin, a suitable substrate, so that the lipid acyltransferase enzyme acylates β-lactoglobulin. The resulting lysolecithin may have an additional emulsifying effect.

Улучшения, наблюдаемые с липид-ацилтрансферазой согласно настоящему изобретению, проявляются в сравнении с тем, когда используются липолитические ферменты без ацилтрансферазной активности, такие как триацилглицеринлипазы и фосфолипазы.The improvements observed with the lipid acyltransferase according to the present invention are manifested in comparison with when lipolytic enzymes without acyltransferase activity, such as triacylglycerol lipases and phospholipases, are used.

ПРЕИМУЩЕСТВАADVANTAGES

Образование эмульгатора и эфира стерола/станола in situ из по меньшей мере одного составляющего пищевого материала означает, что пищевой материал будет содержать по меньшей мере одно дополнительное вещество. Это является преимуществом благодаря улучшению в облегчении производства. Например, может не требоваться дополнительная переработка, или добавление ингредиентов, или добавление эмульгаторов. Более того, пищевой продукт может содержать меньше добавок. Уменьшение или устранение добавок является желательным для покупателей и исключение добавок часто может объявляться покупателю при перечислении ингредиентов пищевого продукта. Таким образом, настоящее изобретение имеет дополнительные преимущества.The formation of an emulsifier and sterol / stanol ester in situ from at least one constituent food material means that the food material will contain at least one additional substance. This is an advantage due to an improvement in facilitating production. For example, additional processing or the addition of ingredients or the addition of emulsifiers may not be required. Moreover, a food product may contain fewer additives. Reducing or eliminating additives is desirable for buyers and the exclusion of additives can often be announced to the buyer when listing the ingredients of a food product. Thus, the present invention has additional advantages.

Преимуществом настоящего изобретения может быть образование in situ эмульгатора в пищевом продукте без вредного увеличения содержания свободных жирных кислот пищевого продукта.An advantage of the present invention may be the formation of an in situ emulsifier in the food product without adversely increasing the free fatty acid content of the food product.

Образование двух эмульгаторов и/или эфира углевода in situ из по меньшей мере одного составляющего пищевого материала означает, что пищевой материал будет содержать по меньшей мере два дополнительных вещества.The formation of two emulsifiers and / or carbohydrate ester in situ from at least one constituent food material means that the food material will contain at least two additional substances.

Кроме того, когда липид-ацилтрансфераза воздействует на гликолипид, она может благоприятно продуцировать эмульгатор DGMG in situ без вредного увеличения содержания свободных жирных кислот пищевого продукта. Так, ослабление вредных эффектов, приписываемых увеличению содержания свободных жирных кислот, включает, но не ограничивается этим, ослабление "мыльного" вкуса в сыре, предотвращение передозировки в тесто и улучшение пекарских свойств теста.In addition, when lipid acyltransferase acts on glycolipid, it can favorably produce DGMG emulsifier in situ without adversely increasing the free fatty acid content of the food product. Thus, the weakening of the harmful effects attributed to the increase in the content of free fatty acids includes, but is not limited to, weakening the “soapy” taste in cheese, preventing overdosing in the dough and improving the baking properties of the dough.

Для некоторых аспектов преимуществом настоящего изобретения является снижение уровней холестерина в пищевом продукте.For some aspects, an advantage of the present invention is to lower cholesterol levels in a food product.

Для других аспектов увеличение содержания эфиров станола и/или стерола в пищевом продукте. Некоторые эфиры стерола/станола могут быть эффективными вкусовыми агентами и/или агентами, улучшающими текстуру. Известно, что некоторые эфиры стерола/станола снижают содержание холестерина и/или липопротеинов низкой плотности в сыворотке крови, когда потребляются с пищевым продуктом. Таким образом, настоящее изобретение может быть использовано для получения пищевого продукта с повышенными концентрациями эфиров стерола и/или эфиров станола.For other aspects, increasing the content of stanol and / or sterol esters in the food product. Some sterol / stanol esters may be effective flavoring agents and / or texture enhancers. It is known that some sterol / stanol esters lower cholesterol and / or low density lipoproteins in serum when consumed with a food product. Thus, the present invention can be used to obtain a food product with increased concentrations of sterol esters and / or stanol esters.

Для некоторых аспектов, в особенности когда фермент согласно настоящему изобретению используют в продуктах на основе яиц, преимуществом является удаление нежелательных свободных углеводов.For some aspects, especially when the enzyme of the present invention is used in egg-based products, the advantage is the removal of undesired free carbohydrates.

Выгодным является также то, что улучшены эмульсионные свойства пищевого продукта, приводя к улучшению внешнего вида, и/или перерабатываемости, и/или структуры, и/или консистенции, и/или тепловой стабильности без отрицательного влияния на вкус.It is also advantageous that the emulsion properties of the food product are improved, leading to an improvement in the appearance and / or workability and / or structure and / or texture and / or thermal stability without negatively affecting the taste.

В добавление, для некоторых осуществлений выгодно то, что эффект "передозировки", наблюдаемый при применении липаз как таковых, успешно преодолевается путем добавления фермента в соответствии с настоящим изобретением. Это обусловлено, по меньшей мере частично, тем фактом, что свободные жирные кислоты не образуются или образуются только в незначительной степени при использовании фермента согласно настоящему изобретению.In addition, for some embodiments, it is advantageous that the “overdose” effect observed with the use of lipases per se is successfully overcome by adding an enzyme in accordance with the present invention. This is due, at least in part, to the fact that free fatty acids do not form or only to a small extent when using the enzyme according to the present invention.

ВЫДЕЛЕННЫЙALLOCATED

В одном аспекте, предпочтительно, полипептид или протеин для применения в настоящем изобретении находится в выделенной форме. Термин "выделенный" означает, что последовательность является по меньшей мере существенно свободной от по меньшей мере одного другого компонента, с которым последовательность естественно связана в природе и находится в природе.In one aspect, preferably, the polypeptide or protein for use in the present invention is in isolated form. The term "isolated" means that the sequence is at least substantially free of at least one other component with which the sequence is naturally associated in nature and is in nature.

ОЧИЩЕННЫЙPURIFIED

В одном аспекте, предпочтительно, полипептид или протеин для применения в настоящем изобретении находится в очищенной форме. Термин "очищенный" означает, что последовательность находится в сравнительно чистом состоянии, например, по меньшей мере 51% чистоты, или по меньшей мере около 75%, или по меньшей мере около 80%, или по меньшей мере около 90%, или по меньшей мере около 95%, или по меньшей мере около 98% чистоты.In one aspect, preferably, the polypeptide or protein for use in the present invention is in purified form. The term "purified" means that the sequence is in a relatively pure state, for example, at least 51% purity, or at least about 75%, or at least about 80%, or at least about 90%, or at least at least about 95%, or at least about 98% purity.

КЛОНИРОВАНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, КОДИРУЮЩЕЙ ПОЛИПЕПТИД СОГЛАСНО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮCloning of a nucleotide sequence encoding a polypeptide according to the present invention

Нуклеотидная последовательность, кодирующая или полипептид, который имеет специфические свойства, как определено здесь, или полипептид, который является подходящим для модификации, может быть изолирована из любой клетки или организма, производящих указанный полипептид. Различные способы выделения нуклеотидных последовательностей хорошо известны в этой области.A nucleotide sequence encoding either a polypeptide that has specific properties, as defined here, or a polypeptide that is suitable for modification, can be isolated from any cell or organism that produces the specified polypeptide. Various methods for isolating nucleotide sequences are well known in the art.

Например, библиотека геномной ДНК и/или кДНК может быть создана с использованием хромосомной ДНК или информационной РНК из организма, продуцирующего полипептид. Если последовательность аминокислот полипептида известна, маркированные олигонуклеотидные зонды могут быть синтезированы и использованы для идентификации кодирующих нуклеотид клонов из библиотеки генов, подготовленной из организма. Альтернативно, маркированный олигонуклеотидный зонд, содержащий последовательности, гомологичные другому известному гену полипептида, могут быть использованы для идентификации кодирующих нуклеотид клонов. В последнем случае используют гибридизацию и условия промывки более низкой строгости.For example, a library of genomic DNA and / or cDNA can be created using chromosomal DNA or messenger RNA from an organism producing a polypeptide. If the amino acid sequence of the polypeptide is known, labeled oligonucleotide probes can be synthesized and used to identify nucleotide-encoding clones from a gene library prepared from the body. Alternatively, a labeled oligonucleotide probe containing sequences homologous to another known polypeptide gene can be used to identify nucleotide-encoding clones. In the latter case, hybridization and washing conditions of lower stringency are used.

Альтернативно, кодирующие полипептид клоны могут быть идентифицированы вставкой фрагментов геномной ДНК в вектор экспрессии, такой как плазмида, трансформирующий фермент-негативные бактерии полученной библиотекой геномной ДНК, и последующим посевом трансформированных бактерий на агар, содержащий фермент, ингибированный полипептидом, тем самым давая возможность клонам экспрессировать полипептид, который должен быть идентифицирован.Alternatively, clones encoding the polypeptide can be identified by inserting genomic DNA fragments into an expression vector, such as a plasmid transforming the enzyme negative bacteria with the resulting genomic DNA library, and then plating the transformed bacteria on agar containing the enzyme inhibited by the polypeptide, thereby allowing clones to express the polypeptide to be identified.

В следующей альтернативе нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, может быть получена синтетически принятыми стандартными методами, например фосфорамидитиновым методом, описанным Beucage S.L. et al. (1981) Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869, или способом, описанным Matthes et al. (1984) EMBO J. 3, p. 801-806. В фосфорамидитиновом методе олигонуклеотиды синтезируют, например, в автоматическом синтетизаторе ДНК, очищают, прокаливают, сшивают и клонируют в подходящие векторы.In a further alternative, the nucleotide sequence encoding the polypeptide can be obtained synthetically by standard methods, for example, the phosphoramiditine method described by Beucage S.L. et al. (1981) Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869, or by the method described by Matthes et al. (1984) EMBO J. 3, p. 801-806. In the phosphoramiditine method, oligonucleotides are synthesized, for example, in an automatic DNA synthesizer, purified, calcined, stitched and cloned into suitable vectors.

Нуклеотидная последовательность может быть смешанного геномного и синтетического происхождения, смешанного синтетического и кДНК происхождения или смешанного геномного и кДНК происхождения, полученной сшиванием фрагментов синтетического, геномного или кДНК происхождения (как требуется) в соответствии с стандартными методиками. Каждый сшитый фрагмент соответствует различным частям полной нуклеотидной последовательности. Последовательность ДНК может быть также получена реакцией полимеразы цепи (PRC), используя специфические праймеры, описанные, например, в USP 4683202 или в Saiki R.K. et al. (Science (1988) 239, pp. 487-491).The nucleotide sequence may be of mixed genomic and synthetic origin, mixed synthetic and cDNA origin, or mixed genomic and cDNA origin obtained by crosslinking fragments of synthetic, genomic or cDNA origin (as required) in accordance with standard techniques. Each crosslinked fragment corresponds to different parts of the complete nucleotide sequence. The DNA sequence can also be obtained by reaction of the polymerase chain (PRC) using specific primers described, for example, in USP 4683202 or Saiki R.K. et al. (Science (1988) 239, pp. 487-491).

НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИNUCLEOTIDE SEQUENCES

Настоящее изобретение охватывает также нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, имеющие специфические свойства, какие определены здесь. Термин "нуклеотидная последовательность", как он используется здесь, относится к олигонуклеотидной последовательности или к полинуклеотидной последовательности и к их вариантам, гомологам фрагментам и производным (таким как их части). Нуклеотидная последовательность может быть геномного, или синтетического, или рекомбинантного происхождения, которые могут быть двунитевыми или однонитевыми, представляя как смысловую, так и антисмысловую нить.The present invention also encompasses nucleotide sequences encoding polypeptides having specific properties as defined herein. The term "nucleotide sequence", as used here, refers to an oligonucleotide sequence or polynucleotide sequence and their variants, homologues of fragments and derivatives (such as parts thereof). The nucleotide sequence can be of genomic, or synthetic, or recombinant origin, which can be double-stranded or single-stranded, representing both semantic and antisense strands.

Термин "нуклеотидная последовательность" относительно настоящего изобретения включает геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и РНК. Предпочтительно, он означает ДНК, более предпочтительно, кДНК для кодирующей последовательности.The term "nucleotide sequence" relative to the present invention includes genomic DNA, cDNA, synthetic DNA and RNA. Preferably, it means DNA, more preferably cDNA, for the coding sequence.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеотидная последовательность как таковая, кодирующая полипептид, имеющий специфические свойства, как определено здесь, не охватывает нативную нуклеотидную последовательность в ее естественном окружении, когда она прикреплена к естественно связанной с ней последовательности (последовательностям), которая (которые) также находится (находятся) в своем естественном окружении. Для удобства упоминания будем называть такое предпочтительное осуществление "ненативная нуклеотидная последовательность". В этом отношении термин "нативная нуклеотидная последовательность" означает полную нуклеотидную последовательность, которая находится в своем нативном окружении и когда она оперативно прикреплена к полному промотору, с которым естественно связана, каковой промотор также находится в своем нативном окружении. Таким образом, полипептид по настоящему изобретению может быть экспрессирован нуклеотидной последовательностью в свой нативный организм, но где нуклеотидная последовательность не находится под контролем промотора, с которым она естественно связана внутри данного организма.In a preferred embodiment, the nucleotide sequence, as such, encoding a polypeptide having specific properties, as defined herein, does not encompass the native nucleotide sequence in its natural environment when it is attached to the naturally associated sequence (s) that also ( are) in their natural surroundings. For convenience of reference, we will call such a preferred embodiment "non-native nucleotide sequence." In this regard, the term "native nucleotide sequence" means a complete nucleotide sequence that is in its native environment and when it is operatively attached to a full promoter, with which it is naturally associated, which promoter is also in its native environment. Thus, the polypeptide of the present invention can be expressed by a nucleotide sequence in its native organism, but where the nucleotide sequence is not under the control of a promoter with which it is naturally linked within a given organism.

Предпочтительно, полипептид не является нативным полипептидом. В данном отношении термин "нативный полипептид" означает полный полипептид, который находится в своем естественном окружении и когда он был экспрессирован своей нативной нуклеотидной последовательностью.Preferably, the polypeptide is not a native polypeptide. In this regard, the term "native polypeptide" means a complete polypeptide that is in its natural environment and when it was expressed by its native nucleotide sequence.

Обычно нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды, имеющие специфические свойства, как определено здесь, получают, используя методы рекомбинантной ДНК (т.е. рекомбинантную ДНК). Однако в альтернативном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность может быть синтезирована полностью или частично с использованием химических методов, хорошо известных специалистам (см. Caruthers M.H. et al. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 и Horn T. et al. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).Typically, a nucleotide sequence encoding polypeptides having specific properties as defined herein is prepared using recombinant DNA methods (i.e., recombinant DNA). However, in an alternative embodiment of the invention, the nucleotide sequence can be synthesized in whole or in part using chemical methods well known in the art (see Caruthers MH et al. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T. et al. (1980 ) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯMOLECULAR EVOLUTION

Когда кодирующая фермент нуклеотидная последовательность выделена или предполагаемая кодирующая фермент нуклеотидная последовательность идентифицирована, может быть желательно модифицировать выбранную нуклеотидную последовательность, например, может быть желательно мутировать последовательность для того, чтобы получить фермент в соответствии с настоящим изобретением.When the enzyme coding nucleotide sequence is isolated or the putative enzyme coding nucleotide sequence is identified, it may be desirable to modify the selected nucleotide sequence, for example, it may be desirable to mutate the sequence in order to obtain the enzyme in accordance with the present invention.

Мутации могут быть введены, используя синтетические олигонуклеотиды. Такие олгонуклеотиды содержат нуклеотидные последовательности, фланкирующие желаемые сайты мутации.Mutations can be introduced using synthetic oligonucleotides. Such oligonucleotides contain nucleotide sequences flanking the desired mutation sites.

Подходящий метод описан в Morinaga et al. (Biotechnology (1984) 2, p. 646-649). Другой метод введения мутаций в кодирующую фермент нуклеотидную последовательность описан Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p. 147-151).A suitable method is described in Morinaga et al. (Biotechnology (1984) 2, p. 646-649). Another method for introducing mutations into an enzyme coding nucleotide sequence is described by Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p. 147-151).

Вместо направленного на сайт мутагенеза, такого как описанный выше, можно ввести мутации случайным образом, например, используя имеющийся в продаже набор реактивов, такой как набор для мутагенеза GeneMorph PCR от Stratagene, или набор для случайного мутагенеза Diversify PCR от Clontech. EP 0583265 ссылается на способы оптимизации мутагенеза на основе ПЦР, которые могут также сочетаться с применением мутагенных аналогов ДНК, таких как описанные в ЕР 0866796. Подверженные ошибкам технологии PRC являются пригодными для получения вариантов липид-ацилтрансфераз с предпочтительными характеристиками. WO 02/06457 ссылается на молекулярную эволюцию липаз.Instead of site-directed mutagenesis, such as the one described above, mutations can be randomly introduced, for example, using a commercially available reagent kit, such as the Stratagene GeneMorph PCR mutagenesis kit, or the Cliverset Diversify PCR random mutagenesis kit. EP 0583265 refers to methods for optimizing PCR-based mutagenesis that can also be combined with the use of mutagenic DNA analogues, such as those described in EP 0866796. Erroneous PRC technologies are suitable for preparing lipid acyltransferase variants with preferred characteristics. WO 02/06457 refers to the molecular evolution of lipases.

Третьим методом получения новых последовательностей является фрагментирование неидентичных нуклеотидных последовательностей с использованием или любого числа рестрикционных ферментов, или такого фермента, как Дназа I, и повторной сборки полных нуклеотидных последовательностей кодирования для функциональных протеинов. Альтернативно, можно использовать одну или кратные неидентичные нуклеотидные последовательности и ввести мутации во время сборки полной нуклеотидной последовательности. Тасование ДНК и технологии тасовки семейств являются подходящими для получения вариантов липид-ацилтрансфераз с предпочтительными характеристиками. Подходящие методы для осуществления тасовки можно найти в ЕР 0752008, ЕР 1138763, ЕР 1103606. Тасовка может также сочетаться с другими формами мутагенеза ДНК, как описано в US 6180406 и WO 01/34835.A third method for generating new sequences is to fragment non-identical nucleotide sequences using either any number of restriction enzymes or an enzyme such as DNA I and reassemble the complete nucleotide coding sequences for functional proteins. Alternatively, one or multiple non-identical nucleotide sequences can be used and mutations introduced during assembly of the complete nucleotide sequence. DNA shuffling and family shuffling techniques are suitable for preparing lipid acyltransferase variants with preferred characteristics. Suitable methods for performing shuffling can be found in EP 0752008, EP 1138763, EP 1103606. Shuffling can also be combined with other forms of DNA mutagenesis, as described in US 6180406 and WO 01/34835.

Таким образом, можно получить многочисленные направленные на сайт или случайные мутации в нуклеотидной последовательности или in vivo, или in vitro и затем провести поиск улучшенной функциональности кодирующего полипептида различными способами. Используя, например, силико- и экзоопосредованные рекомбинантные методы (см. WO 00/58517, US 6344328, US 6361974), можно осуществить молекулярную эволюцию, где полученный вариант сохранит очень слабую гомологию с известными ферментами или протеинами. Такие варианты, полученные таким образом, могут иметь значительную структурную аналогию с известными трансферазными ферментами, но иметь очень низкую гомологию последовательности аминокислот.Thus, it is possible to obtain numerous site-directed or random mutations in the nucleotide sequence either in vivo or in vitro and then search for improved functionality of the coding polypeptide in various ways. Using, for example, silico- and exo-mediated recombinant methods (see WO 00/58517, US 6344328, US 6361974), molecular evolution can be carried out where the resulting variant retains very weak homology with known enzymes or proteins. Such variants thus obtained can have a significant structural analogy with known transferase enzymes, but have very low amino acid sequence homology.

В качестве неограничительного примера дополнительно мутации или природные варианты полинуклеотидной последовательности могут быть рекомбинированы или с диким типом, или с другими мутациями, или с природными вариантами для получения новых вариантов. Такие новые варианты также могут быть скринированы для поиска улучшенной функциональности кодирующего полипептида.As a non-limiting example, additional mutations or natural variants of the polynucleotide sequence can be recombined with either the wild type, or other mutations, or with natural variants to obtain new variants. Such new variants can also be screened to look for improved coding polypeptide functionality.

Применение вышеупомянутых и подобных методов молекулярной эволюции делает возможными идентификацию и выбор вариантов ферментов по настоящему изобретению, которые имеют предпочтительные характеристики, без какого-либо предварительного знания структуры или функции протеина и делает возможным получение непредсказуемых, но благоприятных мутаций или вариантов. Имеются многочисленные примеры применения молекулярной эволюции на практике для оптимизации или изменения активности фермента; такие примеры включают, но не ограничиваются этим, одно или несколько из следующего: оптимизированная экспрессия и/или активность в клетке-носителе или in vitro, повышенная ферментная активность, измененная специфичность субстрата и/или продукта, повышенная или пониженная ферментная или структурная стабильность, измененная ферментная активность/специфичность в предпочтительных окружающих условиях, например температуре, рН, субстрате.The use of the above and similar molecular evolutionary methods makes it possible to identify and select enzyme variants of the present invention that have preferred characteristics, without any prior knowledge of the structure or function of the protein, and makes it possible to obtain unpredictable but favorable mutations or variants. There are numerous examples of the application of molecular evolution in practice to optimize or change the activity of an enzyme; such examples include, but are not limited to, one or more of the following: optimized expression and / or activity in a carrier cell or in vitro , increased enzyme activity, altered specificity of the substrate and / or product, increased or decreased enzymatic or structural stability, altered enzyme activity / specificity in preferred environmental conditions, for example temperature, pH, substrate.

Как должно быть ясно опытному специалисту, используя инструмент молекулярной эволюции, можно изменить фермент, чтобы улучшить функциональность фермента.As should be clear to an experienced person, using an molecular evolution tool, the enzyme can be modified to improve the functionality of the enzyme.

Соответственно, липид-ацилтрансфераза, используемая в изобретении, может быть вариантом, т.е. может содержать по меньшей мере одно замещение, исключение или добавление аминокислоты по сравнению с родительским ферментом. Вариантные ферменты сохраняют по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% гомологию с родительским ферментом. Подходящие родительские ферменты могут включать любой фермент с эстеразной или липазной активностью. Предпочтительно, родительский фермент выравнивают к консенсусной последовательности pfam00657.Accordingly, the lipid acyltransferase used in the invention may be an option, i.e. may contain at least one substitution, exclusion or addition of an amino acid compared to the parent enzyme. Variant enzymes retain at least 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% , 97%, 99% homology with the parent enzyme. Suitable parent enzymes may include any enzyme with esterase or lipase activity. Preferably, the parent enzyme is aligned with the consensus sequence pfam00657.

В предпочтительном варианте осуществления вариантный фермент липид-ацилтрансфераза сохраняет или включает по меньшей мере один или несколько из остатков аминокислот консенсусной последовательности pfam00657, найденных в блоках GDSX, GANDY и HPT.In a preferred embodiment, the variant lipid acyltransferase enzyme stores or comprises at least one or more of the amino acid residues of the pfam00657 consensus sequence found in the GDSX, GANDY, and HPT blocks.

Ферменты, такие как липазы с низкой или отсутствующей липид-ацилтрансферазной активностью в водной среде, могут быть мутированы с использованием инструментов молекулярной эволюции для того, чтобы ввести или улучшить трансферазную активность, получив тем самым фермент липид-ацилтрансфераза со значительной трансферазной активностью, пригодный для применения в композициях и способах по настоящему изобретению.Enzymes, such as lipases with low or no lipid acyltransferase activity in an aqueous medium, can be mutated using molecular evolution tools in order to introduce or improve transferase activity, thereby obtaining a lipid acyltransferase enzyme with significant transferase activity, suitable for use in the compositions and methods of the present invention.

Соответственно, липид-ацилтрансфераза для применения в изобретении может быть вариантом с улучшенной ферментной активностью по отношению к полярным липидам, предпочтительно, фосфолипидам и/или гликолипидам по сравнению с родительским ферментом. Предпочтительно, такие варианты имеют также низкую или отсутствующую активность по отношению к полярным лизолипидам. Улучшенная ферментная активность по отношению к полярным липидам, фосфолипидам и/или гликолипидам может быть результатом гидролизной и/или трансферазной активности или комбинацией обеих.Accordingly, a lipid acyltransferase for use in the invention may be an option with improved enzymatic activity against polar lipids, preferably phospholipids and / or glycolipids, as compared to the parent enzyme. Preferably, such variants also have low or absent activity with respect to polar lysolipids. Improved enzymatic activity towards polar lipids, phospholipids and / or glycolipids may result from hydrolysis and / or transferase activity, or a combination of both.

Вариантные липид-ацилтрансферазы для применения в изобретении могут иметь пониженную активность по отношению к триглицеридам, и/или моноглицеридам, и/или диглицеридам по сравнению с родительским ферментом.Variant lipid acyltransferases for use in the invention may have reduced activity with respect to triglycerides and / or monoglycerides and / or diglycerides compared to the parent enzyme.

Подходящий вариантный фермент может не иметь активности по отношению к триглицеридам, и/или моноглицеридам, и/или диглицеридам.A suitable variant enzyme may not have activity with respect to triglycerides and / or monoglycerides and / or diglycerides.

Альтернативно, вариантный фермент для применения в изобретении может иметь повышенную активность к триглицеридам и может также иметь повышенную активность по отношению к одному или нескольким из следующих полярных липидов: фосфолипидам, лецитину, фосфатидилхолину, гликолипидам, дигалактозилмоно-глицериду, моногалактозилдиглицериду.Alternatively, the variant enzyme for use in the invention may have increased activity for triglycerides and may also have increased activity for one or more of the following polar lipids: phospholipids, lecithin, phosphatidylcholine, glycolipids, digalactosylmono-glyceride, monogalactosyl diglyceride.

Варианты липид-ацилтрансфераз являются известными, и один или несколько из таких вариантов могут быть пригодными для применения в способах и применениях согласно настоящему изобретению. В качестве примера только в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы варианты липид-ацилтрансфераз, описанные в Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan. 15: 266(2): 997-1000; Robertson et al. J Biol. Chem. 1994 Jan 21: 269(3): 2146-50; Brumlik et al. J Bacreriol 1996 Apr; 178(7): 2064-4; Peelman et al. Protein Sci. 1998 Mar; 7(3): 587-99.Variants of lipid acyltransferases are known, and one or more of these variants may be suitable for use in the methods and applications according to the present invention. By way of example only in accordance with the present invention, the lipid acyltransferase variants described in Hilton & Buckley J Biol can be used. Chem. 1991 Jan. 15: 266 (2): 997-1000; Robertson et al. J Biol. Chem. 1994 Jan 21: 269 (3): 2146-50; Brumlik et al. J Bacreriol 1996 Apr; 178 (7): 2064-4; Peelman et al. Protein Sci. 1998 Mar; 7 (3): 587-99.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТAMINO ACID SEQUENCES

Настоящее изобретение охватывает также последовательности аминокислот полипептидов, имеющих специфические свойства, как определено здесь.The present invention also encompasses amino acid sequences of polypeptides having specific properties as defined herein.

Термин "последовательность аминокислот", как он использован здесь, является синонимом термина "полипептид" и/или термина "протеин". В некоторых случаях термин "последовательность аминокислот" является синонимом термина "пептид".The term "amino acid sequence", as used here, is synonymous with the term "polypeptide" and / or the term "protein". In some cases, the term “amino acid sequence” is synonymous with the term “peptide”.

Последовательность аминокислот может быть получена/выделена из подходящего источника, или может быть изготовлена синтетически, или может быть получена использованием методов рекомбинантной ДНК.The amino acid sequence can be obtained / isolated from a suitable source, or can be made synthetically, or can be obtained using recombinant DNA methods.

Соответственно, последовательности аминокислот могут быть получены из изолированных полипептидов, изученных здесь стандартными методами.Accordingly, amino acid sequences can be obtained from isolated polypeptides studied here by standard methods.

Одним подходящим способом для определения последовательностей аминокислот из изолированных полипептидов является следующий.One suitable method for determining amino acid sequences from isolated polypeptides is as follows.

Очищенный полипептид может быть высушен замораживанием и 100 мкг высушенного замораживанием материала может быть растворено в 50 мкл смеси из 8 М мочевины и 0,4 М кислого карбоната аммония, рН 8,4. Растворенный протеин может быть денатурирован и восстановлен в течение 15 минут при 50°С после покрытия азотом и добавления 5 мкл 45 мМ дитиотретиола. После охлаждения до комнатной температуры может быть добавлено 5 мкг 100 мМ йодацетамида для дериватизации остатка цистеина в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте под азотом.The purified polypeptide can be freeze dried and 100 μg of freeze dried material can be dissolved in 50 μl of a mixture of 8 M urea and 0.4 M ammonium hydrogen carbonate, pH 8.4. The dissolved protein can be denatured and reduced for 15 minutes at 50 ° C after being coated with nitrogen and adding 5 μl of 45 mM dithiotretiol. After cooling to room temperature, 5 μg of 100 mM iodoacetamide can be added to derivatize the cysteine residue for 15 minutes at room temperature in the dark under nitrogen.

135 мкл воды и 5 мкг эндопротеиназы Lys-C в 5 мкл воды могут быть добавлены к вышеуказанной реакционной смеси, и расщепление может быть проведено при 37°С под азотом в течение 24 часов.135 μl of water and 5 μg of Lys-C endoproteinase in 5 μl of water can be added to the above reaction mixture, and cleavage can be carried out at 37 ° C. under nitrogen for 24 hours.

Полученные пептиды могут быть разделены ЖХВД с обратной фазой на колонке VYDAC C18 (0,46×15 см; 10 мкм; The Separation Group, Califirnia, USA) с использованием растворителя А: 0,1% TFA в воде и растворителя В: 0,1% TFA в ацетонитриле. Выбранные полипептиды могут быть заново хроматографированы на колонке Devosil C18 с использованием такой же системы растворителей перед N-концевым упорядочением. Упорядочение может быть выполнено с использованием секвенатора Applied Biosystems 476A, с применением быстрых циклов пульсации жидкости согласно инструкции производителя (Applied Biosystems, California, USA).The resulting peptides can be separated by reverse phase HPLC on a VYDAC C18 column (0.46 × 15 cm; 10 μm; The Separation Group, Califirnia, USA) using solvent A: 0.1% TFA in water and solvent B: 0, 1% TFA in acetonitrile. Selected polypeptides can be rechromatographed on a Devosil C18 column using the same solvent system prior to N-termination. Ordering can be performed using an Applied Biosystems 476A sequencer, using fast pulsating cycles of fluid according to manufacturer's instructions (Applied Biosystems, California, USA).

ИДЕНТИЧНОСТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ИЛИ ГОМОЛОГИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИSEQUENCE IDENTITY OR SEQUENCE HOMOLOGY

Настоящее изобретение охватывает также применение последовательностей, имеющих степень идентичности или степень гомологии с последовательностью (последовательностями) полипептида, имеющими специфические свойства, определенные здесь, или любой нуклеотидной последовательностью, кодирующей такой полипептид (называемые здесь далее как "гомологичная последовательность" ("гомологичные последовательности")). Здесь термин "гомологичный" означает объект, имеющий явную гомологию с рассматриваемыми последовательностями аминокислот и рассматриваемыми нуклеотидными последовательностями. Здесь термин "гомология" может быть приравнен к термину "идентичность".The present invention also encompasses the use of sequences having a degree of identity or homology with a sequence (s) of a polypeptide having the specific properties defined herein, or any nucleotide sequence encoding such a polypeptide (hereinafter referred to as "homologous sequence" ("homologous sequences") ) As used herein, the term “homologous” means an entity having explicit homology with the amino acid sequences in question and the nucleotide sequences in question. Here, the term "homology" can be equated with the term "identity".

Гомологичная последовательность аминокислот и/или нуклеотидная последовательность должна обеспечить и/или кодировать полипептид, который сохраняет функциональную активность и/или улучшает активность фермента.A homologous amino acid sequence and / or nucleotide sequence should provide and / or encode a polypeptide that retains functional activity and / or improves enzyme activity.

В данном контексте гомологичная последовательность использована для того, чтобы включить последовательность аминокислот, которая может быть по меньшей мере на 75, 85 или 90% идентичной, предпочтительно, по меньшей мере на 95 или 98% идентичной последовательности, являющейся предметом рассмотрения. Обычно гомологи должны включать такие же активные сайты и т.п., что и рассматриваемая последовательность аминокислот. Хотя гомология может также рассматриваться в отношении сходства (т.е. аминокислотные остатки, имеющие сходные химические свойства/функции), в контексте настоящего изобретения предпочтительно выражать гомологию в отношении идентичности последовательности.In this context, a homologous sequence is used to include an amino acid sequence that may be at least 75, 85 or 90% identical, preferably at least 95 or 98% identical, to be considered. Typically, homologues should include the same active sites and the like as the amino acid sequence in question. Although homology can also be considered with respect to similarity (i.e., amino acid residues having similar chemical properties / functions), in the context of the present invention, it is preferable to express homology with respect to sequence identity.

В данном контексте гомологичная последовательность использована для того, чтобы включить нуклеотидную последовательность, которая может быть по меньшей мере на 75, 85 или 90% идентичной, предпочтительно, по меньшей мере на 95 или 98% идентичной нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид по настоящему изобретению (последовательности, являющейся предметом рассмотрения). Обычно гомологи должны включать такие же последовательности, какие кодируют активные сайты и т.п., что и рассматриваемая последовательность. Хотя гомология может также рассматриваться в отношении сходства (т.е. аминокислотные остатки, имеющие сходные химические свойства/функции), в контексте настоящего изобретения предпочтительно выражать гомологию в отношении идентичности последовательности.In this context, a homologous sequence is used to include a nucleotide sequence that may be at least 75, 85 or 90% identical, preferably at least 95 or 98% identical to the nucleotide sequence encoding the polypeptide of the present invention (sequence subject to review). Typically, homologues should include the same sequences that encode active sites and the like as the sequence in question. Although homology can also be considered with respect to similarity (i.e., amino acid residues having similar chemical properties / functions), in the context of the present invention, it is preferable to express homology with respect to sequence identity.

Сравнения гомологии могут быть проведены на глаз или, удобнее, с помощью легко доступных программ сравнения последовательностей. Такие имеющиеся в продаже компьютерные программы могут рассчитывать % гомологии между двумя или несколькими последовательностями.Homology comparisons can be made by eye or, more conveniently, using readily available sequence comparison programs. Such commercially available computer programs can calculate% homology between two or more sequences.

% гомологии может быть рассчитан между смежными последовательностями, т.е. одна последовательность является выровненной по другой последовательности, и каждая аминокислота в одной последовательности напрямую сравнивается с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, по одному остатку за раз. Это называют "выравниванием без пробелов". Обычно такие выравнивания проводят только на относительно малом числе остатков.% homology can be calculated between adjacent sequences, i.e. one sequence is aligned with another sequence, and each amino acid in one sequence is directly compared with the corresponding amino acid in another sequence, one residue at a time. This is called "alignment without spaces". Typically, such alignments are carried out only on a relatively small number of residues.

Хотя это является очень простым и логичным методом, он не учитывает, что, например, в идентичной в целом паре последовательностей одна вставка или одна делеция будет заставлять следующие остатки аминокислот выпадать из выравнивания, что потенциально приводит к большому снижению % гомологии, когда осуществляют глобальное выравнивание. Следовательно, большинство методов сравнения последовательностей разработаны для получения оптимальных выравниваний, которые принимают во внимание возможные вставки и делеции без чрезмерного штрафа на оценку общей гомологии. Это достигается вставкой "пробелов" в выравниваемую последовательность, чтобы постараться максимизировать локальную гомологию.Although this is a very simple and logical method, it does not take into account that, for example, in an identical pair of sequences, one insert or one deletion will cause the following amino acid residues to drop out of alignment, which potentially leads to a large decrease in% homology when performing global alignment . Therefore, most sequence comparison methods are designed to obtain optimal alignments that take into account possible insertions and deletions without undue penalty on the assessment of overall homology. This is achieved by inserting “spaces” in the alignment sequence to try to maximize local homology.

Однако такие более сложные методы устанавливают "штрафы за пробел" для каждого пробела, который появляется при выравнивании последовательности, так что для одинакового числа идентичных аминокислот выравнивание последовательности с настолько малым числом пробелов, насколько возможно, что отражает более высокую связанность между двумя сравниваемыми последовательностями, получит более высокую оценку, чем последовательность со многими пробелами. Обычно используют "аффинную цену пробела", которая начисляет относительно высокую цену за существование каждого пробела и более низкий штраф за каждый последующий остаток в пробеле. Это является наиболее широко используемой системой оценки пробелов. Высокий штраф за пробел должен, конечно, давать оптимизированные выравнивания с меньшими пробелами. Большинство программ выравнивания позволяют модифицировать штрафы за пробел. Однако при использовании такого программного продукта для сравнений последовательностей предпочтительно применять значения по умолчанию. Например, при использовании пакета GCG Wisconsin Bestfit штраф за пробел по умолчанию для последовательностей аминокислот составляет -12 за пробел и -4 за расширение.However, such more sophisticated methods set “fines for a space” for each space that appears during sequence alignment, so that for the same number of identical amino acids, sequence alignment with as few spaces as possible, reflecting a higher connection between the two compared sequences, will higher score than sequence with many spaces. Usually they use the “affine space price”, which charges a relatively high price for the existence of each space and a lower penalty for each subsequent remainder in the space. This is the most widely used gap rating system. A high penalty for a space should, of course, give optimized alignments with smaller spaces. Most alignment programs allow you to modify fines for a space. However, when using such a software product for sequence comparisons, it is preferable to use the default values. For example, when using the GCG Wisconsin Bestfit package, the default space penalty for amino acid sequences is -12 per space and -4 per extension.

Расчет максимального % гомологии поэтому прежде всего требует получения оптимального выравнивания, принимая во внимание штрафы за пробел. Подходящей компьютерной программой для осуществления такого выравнивания является пакет GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al. 1984 Nuc. Acids Research 12 p. 387). Примеры других программ, которые могут проводить сравнение последовательностей, включают, но не ограничиваются этим, пакет BLAST (см. Ausbel et al. 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4^th Ed. - Chapter 18), FASTA (Altschut et al. 1990 J.Mol.Biol. 403-410) и набор инструментов для сравнения GENEWORKS. И BLAST, и FASTA доступны для автономного и онлайнового поиска (см. Ausbel et al. 1999, рр. от 7-58 до 7-60). Однако для некоторых приложений предпочтительно использовать программу GCG Bestfit. Новый инструмент, называемый BLAST 2 Sequences, также доступен для сравнения белковых и нуклеотидных последовательностей (см. FEMS Micribiol. Lett 1999 174(2), 247-50; FEMS Micribiol. Lett 1999 177(1), 187-8 и tatiana@ncbi.nml.gov).The calculation of the maximum% homology therefore, first of all, requires optimal alignment, taking into account the fines for the gap. A suitable computer program for performing such alignment is the GCG Wisconsin Bestfit package (Devereux et al. 1984 Nuc. Acids Research 12 p. 387). Examples of other programs that can perform sequence comparisons include, but are not limited to, the BLAST package (see Ausbel et al. 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4 ^th Ed. - Chapter 18), FASTA (Altschut et al. 1990 J .Mol.Biol. 403-410) and a set of tools for comparing GENEWORKS. Both BLAST and FASTA are available for offline and online searches (see Ausbel et al. 1999, pp. 7-58 to 7-60). However, for some applications, it is preferable to use the GCG Bestfit program. A new tool, called BLAST 2 Sequences, is also available for comparison of protein and nucleotide sequences (see FEMS Micribiol. Lett 1999 174 (2), 247-50; FEMS Micribiol. Lett 1999 177 (1), 187-8 and tatiana @ ncbi .nml.gov).

Хотя конечный % гомологии может быть определен в отношении идентичности, сам процесс выравнивания обычно не основывается на сравнении пар по принципу "все или ничего". Вместо этого обычно используют матрицу масштабных оценок подобия, которая устанавливает оценки каждому парному сравнению, основываясь на химическом подобии или эволюционном расстоянии. Широко используемым примером такой матрицы является матрица BLOSUM62 - матрица умолчаний для пакета программ BLAST. Программы GCG Wisconsin обычно используют или общедоступные величины по умолчанию, или сделанную специально таблицу сравнения символов, если доступно (см. руководство пользователя для дальнейших подробностей). Для некоторых применений предпочтительно использовать общедоступные величины по умолчанию для пакета GCG или, в случае использования других программ, матрицу умолчаний, такую как BLOSUM62.Although the final% homology can be determined with respect to identity, the alignment process itself is usually not based on a comparison of pairs on an all-or-nothing basis. Instead, a matrix of scale similarity scores is usually used, which sets the scores for each pairwise comparison based on chemical similarity or evolutionary distance. A widely used example of such a matrix is the BLOSUM62 matrix, the default matrix for the BLAST software package. GCG Wisconsin programs typically use either public default values, or a custom character comparison table, if available (see the user manual for further details). For some applications, it is preferable to use the public default values for the GCG package or, in the case of other programs, a default matrix such as BLOSUM62.

Альтернативно, процент гомологии может быть рассчитан с использованием признака кратного выравнивания в DNASIS™ (Hitachi Software), основанного на алгоритме, аналогичном CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).Alternatively, the percent homology can be calculated using the multiple alignment feature in DNASIS ™ (Hitachi Software), based on an algorithm similar to CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244).

Как только программа произвела оптимальное выравнивание, становится возможно рассчитать % гомологии, предпочтительно % идентичности последовательностей. Программа обычно делает это как часть сравнения последовательностей и генерирует численный результат.Once the program has made the optimal alignment, it becomes possible to calculate% homology, preferably% sequence identity. A program usually does this as part of a sequence comparison and generates a numerical result.

Последовательности могут также иметь делеции, вставки или замещения остатков аминокислот, которые продуцируют необъявленное изменение и приводят к функционально эквивалентному веществу. Могут быть сделаны преднамеренные замещения аминокислот на основе подобия полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков, поскольку сохраняется вторичная связующая активность вещества. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин, и аминокислоты с незаряженными полярными головными группами, имеющие подобные значения гидрофильности, включают лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глютамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин.The sequences may also have deletions, insertions, or substitutions of amino acid residues that produce an undeclared change and result in a functionally equivalent substance. Intentional amino acid substitutions can be made based on the similarity of polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and / or amphipathic nature of the residues, since the secondary binding activity of the substance is maintained. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid, positively charged amino acids include lysine and arginine, and amino acids with uncharged polar head groups having similar hydrophilicity values include leucine, isoleucine, valine, glycine, alanine, asparagine, glutamine, serine, threonine, phenylalanine and tyrosine.

Могут быть сделаны консервативные замещения, например, согласно приведенной ниже таблице. Аминокислоты в одном и том же блоке во втором столбце и, предпочтительно, в одной и той же строке в третьем столбце могут замещать друг друга.Conservative substitutions can be made, for example, according to the table below. Amino acids in the same block in the second column, and preferably in the same row in the third column, can replace each other.

АЛИФАТИЧЕСКИЕALIPHATIC НеполярныеNon-polar G A PG a p I L VI L V Полярные - незаряженныеPolar - Uncharged C S T MC S T M N QN Q Полярные - заряженныеPolar - charged D ED e K RK r АРОМАТИЧЕСКИЕAROMATIC H F W VH F W V

Настоящее изобретение охватывает также гомологичное замещение (и замещение и замена использованы здесь для того, чтобы обозначить взаимозаменяемость существующего остатка аминокислоты и альтернативного остатка), которое может происходить, т.е. замещение подобного подобным, такое как основного основным, кислотного кислотным, полярного полярным и т.д. Может происходить также негомологичное замещение, т.е. одного класса остатка другим, или, альтернативно, вовлекающее включение ненатуральных аминокислот, таких как орнитин (называемый здесь далее Z), орнитиндиаминомасляная кислота (называемая здесь далее В), норлейцинорнитин (называемый здесь далее О), пирилаланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин.The present invention also encompasses homologous substitution (and substitution and substitution are used here to indicate the interchangeability of an existing amino acid residue and an alternative residue) that may occur, i.e. substitution similar to similar, such as basic basic, acidic acid, polar polar, etc. Non-homologous substitution may also occur, i.e. one class of residue to another, or alternatively involving the incorporation of unnatural amino acids such as ornithine (hereinafter referred to as Z), ornithindiaminobutyric acid (hereinafter referred to as B), norleucinornithine (hereinafter referred to as O), pyrilalanine, thienylalanine, naphthylalanine and phenylglycine.

Замещения также могут быть сделаны ненатуральными аминокислотами.Substitutions can also be made by unnatural amino acids.

Вариантные последовательности аминокислот могут включать подходящие спейсерные группы, которые могут быть вставлены между любыми двумя аминокислотными остатками последовательности, включающие метильные, этильные или пропильные группы в добавление к аминокислотным спейсерам, таким как остатки глицина или β-аланина. Следующая форма вариации включает присутствие одного или нескольких аминокислотных остатков в пептоидной форме и должна быть хорошо понятна специалистам. Во избежание сомнений выражение "пептоидная форма" использовано для обозначения варианта аминокислотного остатка, в котором группа-заместитель α-углерода находится на атоме азота остатка, а не на α-углероде. Способы получения пептидов в пептоидной форме известны в литературе, например Simon R.J. et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 и Horwell D.C., Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.Variant amino acid sequences may include suitable spacer groups that can be inserted between any two amino acid residues of the sequence, including methyl, ethyl or propyl groups in addition to amino acid spacers, such as glycine or β-alanine residues. The following form of variation involves the presence of one or more amino acid residues in peptoid form and should be well understood by those skilled in the art. For the avoidance of doubt, the expression "peptoid form" is used to denote an amino acid residue variant in which the α-carbon substituent group is on the nitrogen atom of the residue, and not on the α-carbon. Methods for producing peptides in peptoid form are known in the literature, for example, Simon R.J. et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 and Horwell D.C., Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132-134.

Нуклеотидные зависимости для использования в настоящем изобретении для кодирования полипептида, имеющего определенные здесь специфические свойства, могут включать в себя синтетические или модифицированные нуклеотиды. Многие различные типы модификаций олигонуклеотидов известны в этой области. Они включают метилфосфонатные и фосфортиоатные скелеты и/или добавление акридиновых или полилизиновых цепей к концам 3' или 5' молекулы.The nucleotide dependencies for use in the present invention for encoding a polypeptide having the specific properties defined herein may include synthetic or modified nucleotides. Many different types of oligonucleotide modifications are known in the art. These include methylphosphonate and phosphorothioate skeletons and / or the addition of acridine or polylysine chains to the ends of a 3 'or 5' molecule.

Для целей настоящего изобретения должно быть понятно, что описанные здесь нуклеотидные последовательности могут быть модифицированы любым способом, доступным из практики. Такие модификации могут быть осуществлены для того, чтобы улучшить активность in vivo или продолжительность жизни нуклеотидных последовательностей.For the purposes of the present invention, it should be understood that the nucleotide sequences described herein can be modified by any method available from practice. Such modifications can be made in order to improve the in vivo activity or the life span of the nucleotide sequences.

Настоящее изобретение охватывает также применение нуклеотидных последовательностей, которые являются комплементарными к обсуждаемым здесь последовательностям, или любые производные, фрагменты или их производные. Если последовательность является комплементарной к их фрагменту, тогда такая последовательность может быть использована как зонд для идентификации подобных кодирующих последовательностей в других организмах и т.д.The present invention also encompasses the use of nucleotide sequences that are complementary to the sequences discussed herein, or any derivatives, fragments or derivatives thereof. If the sequence is complementary to their fragment, then such a sequence can be used as a probe to identify similar coding sequences in other organisms, etc.

Полинуклеотиды, которые не являются на 100% гомологичными последовательностям по настоящему изобретению, но входят в область изобретения, могут быть получены многими путями. Другие варианты описанных здесь последовательностей могут быть получены, например, зондированием библиотек ДНК, изготовленных из особей, например особей из различных популяций. Кроме того, другие вирусные/бактериальные или клеточные гомологи, в особенности клеточные гомологи, обнаруживаемые в клетках млекопитающих (например, крыс, мышей, бычьих клетках и клетках приматов), могут быть получены, и такие гомологи и их фрагменты в принципе будут способны селективно гибридизировать последовательности, показанные здесь в перечне последовательностей. Такие последовательности могут быть получены зондированием библиотек кДНК, составленных из библиотек геномных ДНК от других видов животных, и зондированием таких библиотек зондами, включающими всю или часть любой одной из последовательностей в списках присоединенных последовательностей в условиях от умеренной до высокой жесткости. Подобные соображения применимы к получению видов гомологов и аллельных вариантов полипептидных или нуклеотидных последовательностей по изобретению.Polynucleotides that are not 100% homologous to the sequences of the present invention but are within the scope of the invention can be obtained in many ways. Other variants of the sequences described here can be obtained, for example, by probing libraries of DNA made from individuals, for example, individuals from different populations. In addition, other viral / bacterial or cellular homologs, especially cellular homologs found in mammalian cells (e.g., rats, mice, bovine cells and primate cells) can be obtained, and such homologs and fragments thereof will in principle be able to selectively hybridize the sequences shown here in the sequence listing. Such sequences can be obtained by probing cDNA libraries composed of genomic DNA libraries from other animal species, and probing such libraries with probes that include all or part of any one of the sequences in the lists of attached sequences under moderate to high stringency conditions. Similar considerations apply to the preparation of homologous species and allelic variants of the polypeptide or nucleotide sequences of the invention.

Варианты и штаммы/виды гомологи могут также быть получены с использованием вырожденной ПЦР, в которой используют праймеры, нацеленные в мишень последовательности среди вариантов и гомологов, кодирующих консервативные последовательности аминокислот среди последовательностей по настоящему изобретению. Консервативные последовательности могут быть предсказаны, например, выравниванием последовательностей аминокислот из нескольких вариантов/гомологов. Выравнивание последовательностей может быть осуществлено с использованием компьютерных программ, известных в этой области. Например, широко используется программа GCG Wisconsin PileUp.Variants and strains / species homologues can also be obtained using degenerate PCR, which uses primers that target the sequence among the variants and homologues encoding conserved amino acid sequences among the sequences of the present invention. Conservative sequences can be predicted, for example, by aligning amino acid sequences from several variants / homologs. Sequence alignment can be accomplished using computer programs known in the art. For example, the GCG Wisconsin PileUp program is widely used.

Праймеры, используемые в вырожденной ПЦР, должны содержать одну или несколько вырожденных позиций и должны быть использованы при жесткости условий, более низкой, чем условия, используемые для клонирования последовательностей единым праймером последовательности против известных последовательностей.The primers used in degenerate PCR must contain one or more degenerate positions and should be used under stringent conditions lower than the conditions used to clone sequences with a single sequence primer against known sequences.

Альтернативно, такие полинуклеотиды могут быть получены направленным на сайт мутагенезом характеризованных последовательностей. Это может быть полезным, когда, например, требуются бессимптомные изменения последовательности кодонов, чтобы оптимизировать предпочтение кодонов для конкретной клетки-реципиента, в которую была экспрессирована нуклеотидная последовательность. Другие изменения последовательности могут быть желательны для того, чтобы ввести сайты распознавания рестрикционного полипептида или изменить свойство или функцию полипептидов, кодируемых полинуклеотидами.Alternatively, such polynucleotides can be obtained by site directed mutagenesis of the characterized sequences. This can be useful when, for example, asymptomatic changes in the codon sequence are required in order to optimize the codon preference for the particular recipient cell into which the nucleotide sequence has been expressed. Other sequence changes may be desirable in order to introduce restriction polypeptide recognition sites or to alter the property or function of polypeptides encoded by polynucleotides.

Полинуклеотиды (полинуклеотидные последовательности) по изобретению могут быть использованы для получения праймера, например праймера ПЦР, праймера для альтернативной реакции амплификации, зонда, например, меченного отличительной меткой, обычными способами, использующими радиоактивные или нерадиоактивные метки, или полинеулеотиды могут быть клонированы в векторы. Такие праймеры, зонды и другие фрагменты должны быть в по меньшей мере 15, предпочтительно, по меньшей мере 20, например, по меньшей мере 25, 30 или 40 нуклеотидов длиной, и также охватываются термином "нуклеотиды по изобретению", как он использован здесь.The polynucleotides (polynucleotide sequences) of the invention can be used to prepare a primer, for example, a PCR primer, a primer for an alternative amplification reaction, a probe, for example, labeled with a distinctive label, by conventional methods using radioactive or non-radioactive tags, or polynuleotides can be cloned into vectors. Such primers, probes, and other fragments must be at least 15, preferably at least 20, for example at least 25, 30, or 40 nucleotides long, and are also encompassed by the term “nucleotides of the invention” as used herein.

Полинуклеотиды, такие как полинуклеотиды ДНК и зонды согласно изобретению, могут быть получены рекомбинантно, синтетически или любыми другими методами, доступными специалистам. Они могут также быть клонированы стандартными методиками.Polynucleotides, such as DNA polynucleotides and probes according to the invention, can be obtained recombinantly, synthetically or by any other methods available to specialists. They can also be cloned by standard techniques.

В принципе, праймеры могут быть получены синтетическими способами, включая ступенчатое получение желаемой последовательности нуклеиновых кислот, по одному нуклеотиду за раз. Методики для осуществления этого с использованием автоматизированных технологий легко доступны в практике.In principle, primers can be obtained by synthetic methods, including the stepwise preparation of the desired nucleic acid sequence, one nucleotide at a time. Techniques for implementing this using automated technologies are readily available in practice.

Более длинные полинуклеотиды будут, как правило, получаться при использовании рекомбинантных средств, например при использовании методик клонирования ПЦР (реакция полимеразы цепи). Это должно включать изготовление пары праймеров (например, от примерно 15 до 30 нуклеотидов), фланкирующих область нацеливающей на липид последовательности, которую желательно клонировать, ввод праймеров в контакт с мРНК или кДНК, полученными из животных или растительных клеток, осуществление реакции полимеразы цепи при условиях, которые вызывают амплификацию желаемой области, изолирование амплифицированного фрагмента (например, очисткой реакционной смеси на геле агарозы) и извлечение амплифицированной ДНК. Праймеры могут быть разработаны так, чтобы содержать подходящие сайты распознавания рестрикционного фермента, так чтобы амплифицированная ДНК могла быть клонирована в подходящий клонирующий вектор.Longer polynucleotides will typically be obtained using recombinant agents, for example, using PCR cloning techniques (chain polymerase reaction). This should include the manufacture of a pair of primers (for example, from about 15 to 30 nucleotides) flanking the region of the lipid-targeting sequence that it is desired to clone, contacting the primers with mRNA or cDNA derived from animal or plant cells, and carrying out the polymerase chain reaction that cause amplification of the desired region, isolating the amplified fragment (for example, purifying the reaction mixture on agarose gel) and extracting the amplified DNA. Primers can be designed to contain suitable restriction enzyme recognition sites so that the amplified DNA can be cloned into a suitable cloning vector.

ГИБРИДИЗАЦИЯHYBRIDIZATION

Настоящее изобретение охватывает также последовательности, которые являются комплементарными к последовательностям по настоящему изобретению, или последовательности, которые способны гибридизировать, или последовательности по настоящему изобретению, или комплементарные им последовательности.The present invention also encompasses sequences that are complementary to sequences of the present invention, or sequences that are capable of hybridization, or sequences of the present invention, or sequences complementary to them.

Термин "гибридизация", как он использован здесь, должен включать "процесс, с помощью которого нить нуклеиновой кислоты соединяется с комплементарной нитью путем спаривания оснований нуклеиновых кислот", а также процесс амплификации, как он осуществляется в технологиях реакции полимеразы цепи (ПЦР).The term "hybridization", as used here, should include "the process by which a nucleic acid strand is connected to a complementary strand by pairing of nucleic acid bases", as well as the amplification process, as it is carried out in the technology of polymerase chain reaction (PCR).

Настоящее изобретение также охватывает применение нуклеотидных последовательностей, которые способны гибридизироваться с последовательностями, являющимися комплементарными к обсуждаемым здесь аспектным последовательностям или к любым их производным, фрагментам или их производным.The present invention also encompasses the use of nucleotide sequences that are capable of hybridizing with sequences that are complementary to the aspect sequences discussed herein or to any derivatives, fragments or derivatives thereof.

Настоящее изобретение также охватывает последовательности, которые способны гибридизироваться с обсуждаемыми здесь нуклеотидными последовательностями.The present invention also encompasses sequences that are capable of hybridizing to the nucleotide sequences discussed herein.

Условия гибридизации основываются на температуре плавления (Т_пл) связующего комплекса, как указано в Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA), и предполагают определенную "жесткость", как объяснено ниже.Hybridization conditions are based on the melting temperature ( _Tm ) of the binder complex, as described in Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA), and suggest a certain “stiffness” as explained below.

Максимальная жесткость обычно появляется при температуре примерно Т_пл-5°С (на 5°С ниже Т_пл зонда); высокая жесткость при температуре примерно на 5-10°С ниже Т_пл; средняя жесткость при температуре примерно на 10-20°С ниже Т_пл и низкая жесткость при температуре примерно на 20-25°С ниже Т_пл. Как должно быть понятно специалистам, максимальная жесткость гибридизации может быть использована для идентификации или определения подобных или родственных полинуклеотидных последовательностей.Maximum stiffness usually appears at a temperature of approximately T _pl -5 ° C (5 ° C lower than T _pl probe); high rigidity at a temperature of about 5-10 ° C below T _pl ; average stiffness at a temperature of about 10-20 ° C below T _pl and low stiffness at a temperature of about 20-25 ° C below T _pl . As should be understood by those skilled in the art, maximum hybridization stiffness can be used to identify or determine similar or related polynucleotide sequences.

Предпочтительно, настоящее изобретение охватывает также последовательности, которые являются комплементарными к последовательностям, способным к гибридизации при условиях высокой жесткости или условиях средней жесткости с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептиды, имеющие специфические свойства, как они определены здесь.Preferably, the present invention also encompasses sequences that are complementary to sequences capable of hybridization under high stringency conditions or medium stringency conditions with nucleotide sequences encoding polypeptides having specific properties as defined herein.

Более предпочтительно, настоящее изобретение охватывает последовательности, которые являются комплементарными к последовательностям, способным гибридизировать при высоко жестких условиях (например, 65°С и 0,1×SSC {1×SSC = 0,15 M Na-цитрат, рН 7,01} с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептиды, имеющие специфические свойства, как они определены здесь.More preferably, the present invention encompasses sequences that are complementary to sequences capable of hybridizing under highly stringent conditions (eg, 65 ° C. and 0.1 × SSC {1 × SSC = 0.15 M Na-citrate, pH 7.01} with nucleotide sequences encoding polypeptides having specific properties as defined herein.

Настоящее изобретение относится также к нуклеотидным последовательностям, которые могут гибридизироваться с обсужденными здесь нуклеотидными последовательностями (включая комплементарные последовательности обсужденных здесь последовательностей).The present invention also relates to nucleotide sequences that can hybridize to the nucleotide sequences discussed herein (including complementary sequences of the sequences discussed herein).

Настоящее изобретение относится также к нуклеотидным последовательностям, которые являются комплементарными к последовательностям, которые могут гибридизироваться с обсужденными здесь нуклеотидными последовательностями (включая комплементарные последовательности обсужденных здесь последовательностей).The present invention also relates to nucleotide sequences that are complementary to sequences that can hybridize to the nucleotide sequences discussed herein (including complementary sequences of the sequences discussed herein).

В область настоящего изобретения включены также полинуклеотидные последовательности, которые способны гибридизироваться с обсужденными здесь нуклеотидными последовательностями при условиях от средней до максимальной жесткости.Polynucleotide sequences that are capable of hybridizing to the nucleotide sequences discussed herein under conditions of medium to maximum stringency are also included within the scope of the present invention.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям, которые могут гибридизироваться с обсуждаемыми здесь нуклеотидными последовательностями или их комплементами при условиях высокой жесткости (например, 50°С и 0,2×SSC).In a preferred aspect, the present invention relates to nucleotide sequences that can hybridize to the nucleotide sequences discussed here or their complements under high stringency conditions (e.g., 50 ° C and 0.2 × SSC).

В более предпочтительном аспекте настоящее изобретение защищает нуклеотидные последовательности, которые могут гибридизироваться с обсужденными здесь нуклеотидными последовательностями или их комплементами при условиях высокой жесткости (например, 65°С и 0,1×SSC).In a more preferred aspect, the present invention protects nucleotide sequences that can hybridize to the nucleotide sequences or their complements discussed herein under high stringency conditions (e.g., 65 ° C and 0.1 × SSC).

ЭКСПРЕССИЯ ПОЛИПЕПТИДОВEXPRESSION OF POLYPEPTIDES

Нуклеотидная последовательность для применения в настоящем изобретении для кодирования полипептида, имеющего специфические свойства, как они определены здесь, может быть введена в рекомбинантный реплицируемый вектор. Вектор может быть использован для того, чтобы реплицировать и экспрессировать нуклеотидную последовательность в полипептидной форме в совместимую клетку-реципиент и/или из нее. Экспрессия может быть контролируемой при использовании контрольных последовательностей, включающих промоторы/энхансеры и другие сигналы регуляции экспрессии. Могут быть использованы прокариотические промоторы и промоторы, функциональные в эукариотических клетках. Специфические ткани или стимулирующие специфические промоторы могут быть использованы. Могут также быть использованы химерные промоторы, включающие элементы последовательностей из двух или более различных промоторов, описанных выше.The nucleotide sequence for use in the present invention for encoding a polypeptide having specific properties as defined herein can be introduced into a recombinant replicable vector. The vector can be used to replicate and express the nucleotide sequence in a polypeptide form to and from or from a compatible recipient cell. Expression can be controlled using control sequences, including promoters / enhancers and other expression regulation signals. Prokaryotic promoters and promoters functional in eukaryotic cells can be used. Specific tissues or stimulating specific promoters may be used. Chimeric promoters may also be used, including sequence elements from two or more different promoters described above.

Полипептиды, образованные рекомбинантной клеткой-реципиентом путем экспрессии нуклеотидной последовательности могут быть секретированными или могут быть содержащимися внутриклеточно в зависимости от использованных последовательности и/или вектора. Кодирующие последовательности могут быть изготовлены с сигнальной последовательностью, которая направляет секрецию вещества кодирующих последовательностей через конкретные мембраны прокариотических или эукариотических клеток.Polypeptides formed by a recombinant recipient cell by expression of a nucleotide sequence may be secreted or may be contained intracellularly depending on the sequence and / or vector used. Coding sequences can be made with a signal sequence that directs the secretion of the substance of coding sequences through specific membranes of prokaryotic or eukaryotic cells.

ВЕКТОР ЭКСПРЕССИИEXPRESSION VECTOR

Термин "вектор экспрессии" означает конструкт, способный к экспрессии in vivo или in vitro.The term "expression vector" means a construct capable of expression in vivo or in vitro .

Предпочтительно, вектор экспрессии является введенным в геном организма. Термин "введенный", предпочтительно, покрывает стабильный ввод в геном.Preferably, the expression vector is introduced into the body's genome. The term "introduced" preferably covers stable entry into the genome.

Нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению или кодирующая полипептид, имеющий специфические свойства, как они определены здесь, может находиться в составе вектора, в котором нуклеотидная последовательность функционально связана с регуляторными последовательностями так, что регуляторные последовательности способны обеспечить экспрессию нуклеотидной последовательности подходящим организмом-хозяином, т.е. вектор является вектором экспрессии.The nucleotide sequence of the present invention or the coding polypeptide having specific properties as defined herein may be part of a vector in which the nucleotide sequence is operably linked to regulatory sequences so that the regulatory sequences are capable of providing expression of the nucleotide sequence with a suitable host organism, i.e. e. the vector is an expression vector.

Векторы по настоящему изобретению могут быть трансформированы в подходящую клетку-хозяин, как описано ниже, для того, чтобы обеспечить экспрессию полипептида, имеющего специфические свойства, как они определены здесь.The vectors of the present invention can be transformed into a suitable host cell, as described below, in order to ensure the expression of a polypeptide having specific properties, as defined here.

Выбор вектора, например плазмиды, космиды, вируса или фага, часто будет зависеть от клетки-хозяина, в которую он должен быть введен.The choice of a vector, for example a plasmid, cosmid, virus or phage, will often depend on the host cell into which it is to be introduced.

Векторы могут содержать один или несколько генов селектируемых маркеров, таких как ген, который придает резистентность к антибиотикам, например резистентность к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Альтернативно, селекция может быть осуществлена путем совместной трансформации (как описано в WO 91/17243).The vectors may contain one or more selectable marker genes, such as a gene that confers antibiotic resistance, for example, resistance to ampicillin, kanamycin, chloramphenicol or tetracycline. Alternatively, selection can be carried out by co-transformation (as described in WO 91/17243).

Векторы могут быть использованы in vitro, например, для получения РНК или использованы для трансфекции или трансформации клетки-хозяина.Vectors can be used in vitro , for example, to obtain RNA, or used to transfect or transform a host cell.

Так, в следующем варианте осуществления изобретение относится к способу получения нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению или нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды, имеющие специфические свойства, как они определены здесь, путем ввода нуклеотидной последовательности в реплицируемый вектор, ввода вектора в совместимую клетку-хозяин и культивирования клетки-хозяина в условиях, которые благоприятны для репликации вектора.Thus, in a further embodiment, the invention relates to a method for producing nucleotide sequences of the present invention or nucleotide sequences encoding polypeptides having specific properties as defined herein by introducing a nucleotide sequence into a replicable vector, introducing the vector into a compatible host cell and culturing the cell -host in conditions that are favorable for vector replication.

Вектор может дополнительно включать нуклеотидную последовательность, обеспечивающую репликацию вектора в рассматриваемой клетке-хозяине. Примерами таких последовательностей являются сайты начала репликации плазмид pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 и pIJ702.The vector may further include a nucleotide sequence enabling replication of the vector in the host cell in question. Examples of such sequences are the replication start sites of plasmids pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 and pIJ702.

РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИREGULATORY SEQUENCES

В некоторых областях использования нуклеотидная последовательность для применения в настоящем изобретении или нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий специфические свойства, как определено здесь, могут быть функционально связаны с регуляторной последовательностью, которая способна обеспечить экспрессию нуклеотидной последовательности, такую как экспрессия, выбранная клеткой-хозяином. В качестве примера, настоящее изобретение относится к вектору, включающему нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, функционально связанную с такой регуляторной последовательностью, т.е. вектор является вектором экспрессии.In some applications, the nucleotide sequence for use in the present invention or the nucleotide sequence encoding a polypeptide having specific properties as defined herein may be operably linked to a regulatory sequence that is capable of expressing a nucleotide sequence, such as expression selected by a host cell. By way of example, the present invention relates to a vector comprising a nucleotide sequence of the present invention operably linked to such a regulatory sequence, i.e. the vector is an expression vector.

Термин "функционально связан" относится к соседнему положению, при котором описанные компоненты находятся во взаимоотношении, обеспечивающем их функционирование предписанным им образом. Регуляторная последовательность, функционально связанная с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условиях, совместимых с контрольными последовательностями.The term "functionally linked" refers to an adjacent position in which the described components are in a relationship that ensures their functioning in the manner prescribed by him. A regulatory sequence operably linked to a coding sequence is ligated in such a way that expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.

Термин "регуляторные последовательности" включают промоторы и энхансеры и другие сигналы регулирования экспрессии.The term "regulatory sequences" includes promoters and enhancers and other expression regulation signals.

Термин "промотор" использован в обычном смысле для этой области, т.е. как, например, связывающий полимеразу сайт РНК.The term "promoter" is used in the usual sense for this area, i.e. such as the RNA polymerase binding site.

Улучшенная экспрессия нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, имеющий специфические свойства, определенные здесь, может быть также достигнута путем использования селекции гетерологичных регуляторных зон, например зон промотора, лидера секреции и терминатора.Improved expression of the nucleotide sequence encoding an enzyme having the specific properties defined herein can also be achieved by using the selection of heterologous regulatory zones, for example, promoter zones, secretion leader and terminator.

Предпочтительно, нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению может быть функционально связана по меньшей мере с промотором.Preferably, the nucleotide sequence of the present invention may be operably linked to at least a promoter.

Примеры подходящих промоторов для направления транскрипции нуклеотидной последовательности в бактериальных, грибных или дрожжевых хозяевах хорошо известны из уровня техники.Examples of suitable promoters for directing transcription of the nucleotide sequence in bacterial, fungal, or yeast hosts are well known in the art.

КОНСТРУКТЫCONSTRUCTS

Термин "конструкт", который является синонимом таких терминов, как "конъюгат", "кассета" и "гибрид", включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий специфические свойства, как определено здесь, для применения согласно настоящему изобретению, прямо или косвенно присоединенную к промотору. Примером косвенного присоединения является подходящая спейсерная группа, такая как интронная последовательность, такая как Sh1-интрон или ADH-интрон, между промотором и нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению. То же справедливо и для термина "слитый" в связи с настоящим изобретением, который включает прямое или непрямое присоединение. В некоторых случаях термины не покрывают естественную комбинацию нуклеотидной последовательности, колирующей протеин, обычно связанный с промотором гена дикого типа и где они оба находятся в своем естественном окружении.The term "construct", which is synonymous with terms such as "conjugate", "cassette" and "hybrid", includes a nucleotide sequence encoding a polypeptide having specific properties, as defined here, for use according to the present invention, directly or indirectly attached to to the promoter. An example of indirect attachment is a suitable spacer group, such as an intron sequence, such as a Sh1 intron or an ADH intron, between the promoter and the nucleotide sequence of the present invention. The same is true for the term "fused" in connection with the present invention, which includes direct or indirect connection. In some cases, the terms do not cover the natural combination of the nucleotide sequence that encodes a protein, usually associated with the promoter of the wild-type gene and where they are both in their natural environment.

Конструкт может даже содержать или экспрессировать маркер, который делает возможной селекцию генетического конструкта.The construct may even contain or express a marker that allows selection of the genetic construct.

Для некоторых областей применения, предпочтительно, конструкт включает по меньшей мере нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий специфические свойства, как определено здесь, функционально связанную с промотором.For some applications, preferably, the construct includes at least a nucleotide sequence of the present invention or a nucleotide sequence encoding a polypeptide having specific properties, as defined herein, operably linked to a promoter.

КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВАHOUSING CELLS

Термин "клетка-хозяин" по отношению к настоящему изобретению включает любую клетку, содержащую или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий специфические свойства, как определено здесь, или вектор экспрессии, как он описан выше, который используют при рекомбинантном получении полипептида, имеющего специфические свойства, как определено здесь.The term "host cell" in relation to the present invention includes any cell containing either a nucleotide sequence encoding a polypeptide having specific properties, as defined here, or an expression vector, as described above, which is used in the recombinant production of a polypeptide having specific properties as defined here.

Так, следующий вариант осуществления настоящего изобретения относится к клеткам-хозяевам, трансформированным или трансфецированным нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению или нуклеотидной последовательностью, которая экспрессирует полипептид, имеющий специфические свойства, как определено здесь. Клетки должны быть выбраны так, чтобы быть совместимыми с указанным вектором, и могут, например, быть прокариотическими (например, бактериальными), грибковыми, дрожжевыми или растительными клетками. Предпочтительно, клетки-хозяева не являются клетками человека.Thus, a further embodiment of the present invention relates to host cells transformed or transfected with a nucleotide sequence of the present invention or a nucleotide sequence that expresses a polypeptide having specific properties as defined herein. Cells must be selected to be compatible with the specified vector, and may, for example, be prokaryotic (e.g. bacterial), fungal, yeast, or plant cells. Preferably, the host cells are not human cells.

Примерами подходящих бактериальных организмов-хозяев являются грамм-отрицательные или грамм-положительные бактерии.Examples of suitable bacterial host organisms are gram negative or gram positive bacteria.

В зависимости от природы нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий специфические свойства, как определено здесь, и/или желательности дальнейшей переработки экспрессированного протеина могут быть предпочтительны эукариотические хозяева, такие как дрожжи или другие грибы. В общем случае клетки дрожжей являются предпочтительными перед грибковыми клетками, потому что с ними легче манипулировать. Однако некоторые протеины или плохо секретируются из дрожжевой клетки, или в некоторых случаях не перерабатываются должным образом (например, гипергликозилирование в дрожжах). В таких случаях должны быть выбраны различные грибковые клетки.Depending on the nature of the nucleotide sequence encoding the polypeptide having the specific properties as defined herein and / or the desirability of further processing the expressed protein, eukaryotic hosts such as yeast or other fungi may be preferred. In general, yeast cells are preferred over fungal cells because they are easier to manipulate. However, some proteins are either poorly secreted from the yeast cell, or in some cases are not processed properly (for example, hyperglycosylation in yeast). In such cases, various fungal cells should be selected.

Использование подходящих клеток-хозяев, таких как дрожжевые, грибковые и растительные клетки-хозяева, может обеспечить посттрансляционную модификацию (например, миристоилирование, гликозилирование, усечение, окаменение и фосфорилирование серина или треонина), если может потребоваться для обеспечения оптимальной биологической активности рекомбинантных продуктов экспрессии по настоящему изобретению.The use of suitable host cells, such as yeast, fungal, and plant host cells, can provide post-translational modification (e.g., myristoylation, glycosylation, truncation, fossilization, and phosphorylation of serine or threonine) if necessary to ensure optimal biological activity of recombinant expression products by the present invention.

Клетка-хозяин может быть протеолитически недостаточным или протеолитическим минус штаммом.The host cell may be proteolytically deficient or proteolytic minus strain.

ОРГАНИЗМORGANISM

Термин "организм" в связи с настоящим изобретением включает любой организм, который может включать нуклеотидную последовательность согласно настоящему изобретению или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий специфические свойства, как определено здесь, и/или полученные из них продукты.The term "organism" in connection with the present invention includes any organism that may include a nucleotide sequence according to the present invention or a nucleotide sequence encoding a polypeptide having specific properties as defined herein and / or products derived therefrom.

Подходящие организмы могут включать прокариоты, грибы, дрожжи или растения.Suitable organisms may include prokaryotes, fungi, yeast, or plants.

Термин "трансгенный организм" в связи с настоящим изобретением включает любой организм, который включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий специфические свойства, как определено здесь, и/или полученные из него продукты, и/или в котором промотор может сделать возможной экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий специфические свойства, как определено здесь, внутри организма.The term "transgenic organism" in connection with the present invention includes any organism that includes a nucleotide sequence encoding a polypeptide having specific properties as defined herein and / or products derived therefrom, and / or in which a promoter can allow expression of a nucleotide sequence encoding a polypeptide having specific properties, as defined herein, within an organism.

Термин "трансгенный организм" не охватывает нативные нуклеотидные кодирующие последовательности в их естественном окружении, когда они находятся под контролем их естественного промотора, который также находится в своем естественном окружении.The term "transgenic organism" does not encompass native nucleotide coding sequences in their natural environment when they are under the control of their natural promoter, which is also in its natural environment.

Поэтому трансгенный организм по настоящему изобретению включает любую одну из или комбинацию из нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий специфические свойства, как определено здесь, конструктов, как они определены здесь, векторов, как они определены здесь, плазмид, как они определены здесь, клеток, как они определены здесь, или их продуктов. Например, трансгенный организм может также включать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий специфические свойства, как определено здесь, под контролем гетерологичного промотора.Therefore, the transgenic organism of the present invention includes any one or combination of a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the specific properties of, as defined here, constructs, as defined here, vectors, as defined here, plasmids, as defined here, cells, as defined here, or their products. For example, a transgenic organism may also include a nucleotide sequence encoding a polypeptide having specific properties, as defined herein, under the control of a heterologous promoter.

ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК/ОРГАНИЗМОВ-ХОЗЯЕВTRANSFORMATION OF CELLS / HOSPITAL ORGANISMS

Как указано выше, организм-хозяин может быть прокариотическим или эукариотическим организмом. Примеры подходящих прокариотических хозяев включают E. coli и Bacillus subtilis.As indicated above, the host organism may be a prokaryotic or eukaryotic organism. Examples of suitable prokaryotic hosts include E. coli and Bacillus subtilis .

Указания по трансформации прокариотических хозяев хорошо изложены в литературе (см., например, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Если используется прокариотический хозяин, то нуклеотидную последовательность может быть необходимо подходящим образом модифицировать перед трансформацией, например, удалением интронов.Guidelines for transforming prokaryotic hosts are well documented (see, for example, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ^nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). If a prokaryotic host is used, the nucleotide sequence may be must be suitably modified before transformation, for example, by removing introns.

В другом осуществлении трансгенным организмом могут быть дрожжи.In another embodiment, the transgenic organism may be yeast.

Клетки мицелиальных грибов могут быть трансформированы с использованием различных методов, известных из уровня техники, таких как процесс, включающий образование фитопластов и трансформацию фитопластов с последующей регенерацией клеточных стенок известным образом. Использование Aspergillus в качестве микроорганизма-хозяина описано в ЕР 0238023.Mycelial fungal cells can be transformed using various methods known in the art, such as a process involving the formation of phytoplasts and the transformation of phytoplasts followed by regeneration of cell walls in a known manner. The use of Aspergillus as a host microorganism is described in EP 0238023.

Другим организмом-хозяином может быть растение. Обзор общих методик, используемых для трансформации растений, можно найти в статье Potrykus (Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225 и Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27). Дополнительные указания по трансформации растений можно найти в ЕР-А-0449375.Another host organism may be a plant. An overview of common techniques used to transform plants can be found in Potrykus ( Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225 and Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March / April 1994 17-27). Further guidance on plant transformation can be found in EP-A-0449375.

Общие указания по трансформации грибов, дрожжей и растений представлены в следующих разделах.General guidelines for the transformation of fungi, yeast, and plants are presented in the following sections.

ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ ГРИБЫTRANSFORMED MUSHROOMS

Организмом-хозяином могут быть грибы, такие как мицелиальные грибы. Примеры таких подходящих хозяев включают любой член, принадлежащий к родам Thermomyces, Acremonium, Aspergillis, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma и т.п.The host organism may be fungi, such as mycelial fungi. Examples of such suitable hosts include any member of the Thermomyces , Acremonium , Aspergillis , Penicillium , Mucor , Neurospora , Trichoderma, and the like genera.

Обзор указаний по трансформации мицелиальных грибов дан в US-A-5741665, где указано, что стандартные методики для трансформации мицелиальных грибов и культивирования грибов хорошо известны в практике. Расширенный обзор методик в применении к N. crassa можно найти, например, у Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.A review of guidelines for the transformation of mycelial fungi is given in US-A-5741665, where it is indicated that standard techniques for transforming mycelial fungi and cultivating fungi are well known in the art. An extended review of the techniques applied to N. crassa can be found, for example, in Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A : 79-143.

Дополнительные указания по трансформации мицелиальных грибов даны в US-A-5674707.Additional guidance on the transformation of mycelial fungi is given in US-A-5674707.

В одном аспекте организм-хозяин может принадлежать роду Aspergillus, такому как Aspergillus niger.In one aspect, the host organism may belong to the genus Aspergillu s, such as Aspergillus niger .

Трансгенный Aspergillus согласно настоящему изобретению может также быть получен, следуя, например, указаниям Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology, vol. 29. Elsevier Amsterdam 1994, pp. 641-666).The transgenic Aspergillus according to the present invention can also be obtained following, for example, Roter G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In Martinelli SD, Kinghorn JR (Editors) Aspergillus : 50 years on. Progress in industrial microbiology, vol. 29. Elsevier Amsterdam 1994, pp. 641-666).

Экспрессия гена в мицелиальные грибы была рассмотрена в обзоре Punti et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May; 20(5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4):273-306.Gene expression in mycelial fungi was reviewed by Punti et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May; 20 (5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17 (4): 273-306.

ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ ДРОЖЖИTRANSFORMED YEAST

Обзор принципов гетерологичной экспрессии гена в дрожжах представлен, например, в Methods Mol. Biol. (1995), 49: 341-54 и Curr Opin Biotechnol (1997) Oct; 8(5): 554-60.A review of the principles of heterologous gene expression in yeast is provided, for example, in Methods Mol. Biol. (1995), 49: 341-54 and Curr Opin Biotechnol (1997) Oct; 8 (5): 554-60.

В этом отношении дрожжи, такие как виды Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris (см. FEMS Microbiol Rev (2000 24(1): 45-66), могут быть использованы как носитель для гетерологичной экспрессии гена.In this regard, yeast, such as species of Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris (see FEMS Microbiol Rev (2000 24 (1): 45-66), can be used as a carrier for heterologous gene expression.

Обзор принципов гетерологичной экспрессии в Saccharomyces cerevisiae и секреции генных продуктов дан в E. Hinchcliffe и E. Kenny (1993), "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol. 5, Anthony H. Rose and J. Stuart Harrison, eds.A review of the principles of heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae and the secretion of gene products is given in E. Hinchcliffe and E. Kenny (1993), "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts , Vol. 5, Anthony H. Rose and J. Stuart Harrison, eds.

2^nd edition, Academic Press Ltd.).2 ^nd edition, Academic Press Ltd.).

Для трансформации дрожжей было разработано несколько протоколов трансформации. Например, трансгенный Saccharomyces согласно настоящему изобретению может быть получен в соответствии с указаниями Hinnen et al., (1978), Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs J.D. (1978), Nature, London, 275, 104); и Ito H. et al. (1983, J Bacteriology 153, 163-168).Several transformation protocols have been developed for yeast transformation. For example, the transgenic Saccharomyces according to the present invention can be obtained in accordance with the instructions of Hinnen et al., (1978), Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75 , 1929); Beggs JD (1978), Nature , London, 275 , 104); and Ito H. et al. (1983, J Bacteriology 153, 163-168).

Трансформированные клетки дрожжей могут быть подвергнуты селекции с использованием различных селекционных маркеров, таких как ауксотрофные маркеры с доминантной устойчивостью к антибиотикам.Transformed yeast cells can be selected using various selection markers, such as auxotrophic markers with dominant antibiotic resistance.

Подходящий дрожжевой организм-хозяин может быть выбран из биотехнологически релевантных видов дрожжей, таких как, но не ограниченных этим, виды дрожжей, выбранные из Pichia spp., Hansenula spp., Kluyveromyces spp., Yarrowinia spp., Saccharomyces spp., включая S.cerevisiae, или Schizosaccharomyces spp., включая Schizosaccharomyces pombe.A suitable host yeast may be selected from biotechnologically relevant yeast species such as, but not limited to, yeast species selected from Pichia spp., Hansenula spp., Kluyveromyces spp., Yarrowinia spp., Saccharomyces spp., Including S. cerevisiae , or Schizosaccharomyces spp., including Schizosaccharomyces pombe .

В качестве организма-хозяина может быть использован штамм метилотрофных дрожжей вида Pichia pastoris.A strain of methylotrophic yeast of the species Pichia pastoris can be used as the host organism.

В одном варианте осуществления организмом-хозяином может быть вид Hansenula, такой как H. polymorpha (как описано в WO 01/39544).In one embodiment, the host organism may be a species of Hansenula , such as H. polymorpha (as described in WO 01/39544).

ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ РАСТЕНИЯ/КЛЕТКИ РАСТЕНИЙTRANSFORMED PLANTS / PLANT CELLS

Организмом-хозяином, пригодным для настоящего изобретения, может быть растение. Обзор общих методик можно найти в статьях Potrykus (Ann Rev Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) и Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27) или в WO 01/16308. Трансгенное растение может продуцировать более высокие уровни, например, эфиров фитостеролов и эфиров фитостанолов.A host organism suitable for the present invention may be a plant. An overview of general techniques can be found in Potrykus ( Ann Rev Plant Mol Biol [1991] 42 : 205-225) and Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March / April 1994 17-27) or in WO 01/16308. A transgenic plant can produce higher levels of, for example, phytosterol esters and phytostanol esters.

Поэтому настоящее изобретение относится также к способу получения трансгенного растения с улучшенными уровнями эфиров фитостеролов и эфиров фитостанолов, включающему стадии трансформации растительной клетки липид-ацилтрансферазой, как определено здесь (в частности, вектором экспрессии или конструктом, включающим липид-ацилтрансферазу, как определено здесь), и выращивания растения из трансформированной растительной клетки.Therefore, the present invention also relates to a method for producing a transgenic plant with improved levels of phytosterol esters and phytostanol esters, comprising the steps of transforming a plant cell with a lipid acyltransferase as defined herein (in particular, an expression vector or construct including a lipid acyltransferase as defined here), and growing a plant from a transformed plant cell.

СЕКРЕЦИЯSECRETION

Часто желательно, чтобы полипептид был секретирован из осуществляющего экспрессию хозяина в культуральную среду, из которой фермент может быть более легко извлечен. Согласно настоящему изобретению последовательность-лидер секреции может быть выбрана в зависимости от используемого для экспрессии хозяина. Гибридные сигнальные последовательности также могут быть использованы в контексте настоящего изобретения.It is often desirable that the polypeptide be secreted from an expression-carrying host into a culture medium from which the enzyme can be more easily recovered. According to the present invention, the secretion leader sequence may be selected depending on the host used for expression. Hybrid signal sequences may also be used in the context of the present invention.

Типичными примерами гетерологичных последовательностей-лидеров секреции являются последовательности, которые происходят из грибной амилоглюкозидазы (AG), ген (glaA - обе аминокислотные версии, и 18, и 24, например, из Aspergillus), ген а-фактора (дрожжи Saccharomyces, Kluyveromyces и Hansenula) или ген α-амилазы (Bacillus).Typical examples of heterologous secretion leader sequences are those derived from fungal amyloglucosidase (AG), the gene (glaA are both amino acid versions, and 18 and 24, for example, from Aspergillus ), the a-factor gene (yeast Saccharomyces , Kluyveromyces and Hansenula ) or the gene for α-amylase ( Bacillus ).

ДЕТЕКЦИЯDETECTION

В этой области известны различные протоколы для детекции и измерения экспрессии аминокислотной последовательности. Примеры включают анализ фермент-прикрепленным иммуносорбентом (ELISA), радиоиммунный анализ (RIA) и флюоресцентную сортировку активированных клеток (FACS).Various protocols are known in the art for detecting and measuring the expression of an amino acid sequence. Examples include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmune assay (RIA), and fluorescence sorting of activated cells (FACS).

Широкое разнообразие меток и методик конъюгации известно специалистам и может быть использовано в различных анализах нуклеиновых кислот и аминокислот.A wide variety of labels and conjugation techniques are known to those skilled in the art and can be used in various nucleic acid and amino acid analyzes.

Ряд компаний, таких как Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) и US Biochemical Corp (Cleveland, OH), поставляет наборы и протоколы для таких процедур.A number of companies, such as Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) and US Biochemical Corp (Cleveland, OH), supply kits and protocols for such procedures.

Подходящие молекулы-репортеры или метки включают радионуклиды, ферменты, флюоресцирующие, хемолюминисцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п. Патенты, в которых описано применение таких меток, включают US-A-3817837, US-A-3850752, US-A-3939350, US-A-3996345, US-A-4277437, US-A-4275149 и US-A-4366241.Suitable reporter molecules or labels include radionuclides, enzymes, fluorescent, chemiluminescent or chromogenic agents, as well as substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles and the like. Patents describing the use of such labels include US-A-3817837, US-A-3850752, US-A-3939350, US-A-3996345, US-A-4277437, US-A-4275149 and US-A- 4,366,241.

Кроме того, могут быть получены рекомбинантные иммуноглобулины, как показано в US-A-4816567.In addition, recombinant immunoglobulins can be prepared as shown in US-A-4816567.

СЛИТЫЕ ПРОТЕИНЫFused Proteins

Полипептид, имеющий специфические свойства, как они определены здесь, может быть получен как слитый протеин, чтобы, например, облегчить его экстракцию и очистку. Примеры партнеров слитого протеина включают глутатион-S-трансферазу (GST), 6xHis, GAL4 (домены, связывающие ДНК и/или активирующие транскрипцию) и β-галактозидазу. Может быть также удобно включить сайт протеолитического расщепления между партнером слитого протеина и целевой белковой последовательностью, чтобы сделать возможным удаление белковой последовательности. Предпочтительно, слитый протеин не препятствует активности протеиновой последовательности.A polypeptide having specific properties, as defined here, can be obtained as a fused protein, for example, to facilitate its extraction and purification. Examples of fusion protein partners include glutathione S-transferase (GST), 6xHis, GAL4 (DNA binding and / or transcription activating domains) and β-galactosidase. It may also be convenient to include a proteolytic cleavage site between the fusion protein partner and the target protein sequence to allow removal of the protein sequence. Preferably, the fusion protein does not interfere with the activity of the protein sequence.

Системы экспрессии слитых генов в E. coli были рассмотрены в Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6(5): 501-6.Fusion gene expression systems in E. coli were reviewed by Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6 (5): 501-6.

В другом варианте осуществления изобретения последовательности аминокислот полипептида, имеющего специфические свойства, как определено здесь, могут быть лигированы к гетерологичной последовательности, чтобы кодировать слитый протеин. Например, для скрининга библиотек пептидов на агенты, способные влиять на активность вещества, может быть полезно кодировать химерное вещество, экспрессирующее гетерологичный эпитоп, который распознается доступным в продаже антителом.In another embodiment, the amino acid sequences of a polypeptide having specific properties as defined herein can be ligated to a heterologous sequence to encode a fusion protein. For example, to screen peptide libraries for agents capable of influencing the activity of a substance, it may be useful to code a chimeric substance expressing a heterologous epitope that is recognized by a commercially available antibody.

Изобретение будет теперь описано только для примера со ссылками на следующие фигуры и примеры.The invention will now be described by way of example only with reference to the following figures and examples.

Фиг.1 показывает консенсусную последовательность pfam00657 из базы данных, версия 6 (SEQ ID No. 1).Figure 1 shows the consensus sequence pfam00657 from the database, version 6 (SEQ ID No. 1).

Фиг.2 показывает последовательность аминокислот (SEQ ID No. 2), полученную из организма Aeromonas hydrophila (P10480; GI: 121051).Figure 2 shows the amino acid sequence (SEQ ID No. 2) obtained from the organism of Aeromonas hydrophila (P10480; GI: 121051).

Фиг.3 показывает последовательность аминокислот (SEQ ID No. 3), полученную из организма Aeromonas salmonicida (AAG098404; GI: 964017).Figure 3 shows the amino acid sequence (SEQ ID No. 3) obtained from Aeromonas salmonicida (AAG098404; GI: 964017).

Фиг.4 показывает последовательность аминокислот (SEQ ID No. 4), полученную из организма Streptomyces coelicolor A3(2) (Genbank accession number NP-6321558).Figure 4 shows the amino acid sequence (SEQ ID No. 4) obtained from Streptomyces coelicolor A3 (2) (Genbank accession number NP-6321558).

Фиг.5 показывает последовательность аминокислот (SEQ ID No. 5), полученную из организма Streptomyces coelicolor A3(2) (Genbank accession number CAC42140).Figure 5 shows the amino acid sequence (SEQ ID No. 5) obtained from Streptomyces coelicolor A3 (2) (Genbank accession number CAC42140).

Фиг.6 показывает последовательность аминокислот (SEQ ID No. 6), полученную из организма Saccharomyces cerevisiae A3(2) (Genbank accession number P41734).6 shows the amino acid sequence (SEQ ID No. 6) obtained from the organism Saccharomyces cerevisiae A3 (2) (Genbank accession number P41734).

Фиг.7 показывает выравнивание выбранной последовательности к консенсусной последовательности pfam00657.7 shows the alignment of the selected sequence with the consensus sequence pfam00657.

Фиг.8 показывает парное выравнивание SEQ ID No. 3 c SEQ ID No. 2, показывающее 93% идентичность последовательности аминокислот. Сигнальная последовательность подчеркнута + обозначены различия. Фрагмент GDSX, содержащий активный сайт серина 16 и активные сайты аспарагиновой кислоты 116 и гистидина 291 выделены яркостью (см. затененные области). Числа после аминокислоты представляют минус сигнальную последовательность.Fig. 8 shows a pair alignment of SEQ ID No. 3 c SEQ ID No. 2, showing 93% amino acid sequence identity. The signal sequence is underlined + differences are indicated. The GDSX fragment containing the active site of serine 16 and the active sites of aspartic acid 116 and histidine 291 are highlighted (see shaded areas). The numbers after the amino acid represent the minus the signal sequence.

Фиг.9 показывает нуклеотидную последовательность (SEQ ID No. 7), кодирующую липид-ацилтрансферазу согласно настоящему изобретению, полученную из организма Aeromonas hydrophila. Figure 9 shows the nucleotide sequence (SEQ ID No. 7) encoding a lipid acyltransferase according to the present invention, obtained from Aeromonas hydrophila.

Фиг.10 показывает нуклеотидную последовательность (SEQ ID No. 8), кодирующую липид-ацилтрансферазу согласно настоящему изобретению, полученную из организма Aeromonas salmonicida. Ig.10 F shows the nucleotide sequence (SEQ ID No. 8) encoding a lipid acyl transferase according to the present invention obtained from the organism Aeromonas salmonicida.

Фиг.11 показывает нуклеотидную последовательность (SEQ ID No. 9), кодирующую липид-ацилтрансферазу согласно настоящему изобретению, полученную из организма Streptomyces coelicolor A3(2) (Genbank accession number NC-003888.1:8327480..8328367).Ig.11 F shows the nucleotide sequence (SEQ ID No. 9) encoding a lipid acyl transferase according to the present invention obtained from the organism Streptomyces coelicolor A3 (2) (Genbank accession number NC-003888.1 : 8327480..8328367).

Фиг.12 показывает нуклеотидную последовательность (SEQ ID No. 10), кодирующую липид-ацилтрансферазу согласно настоящему изобретению, полученную из организма Streptomyces coelicolor A3(2) (Genbank accession number AL939131.1:265480..266367).12 shows a nucleotide sequence (SEQ ID No. 10) encoding a lipid acyltransferase according to the present invention, obtained from Streptomyces coelicolor A3 (2) (Genbank accession number AL939131.1: 265480..266367).

Фиг.13 показывает нуклеотидную последовательность (SEQ ID No. 11), кодирующую липид-ацилтрансферазу согласно настоящему изобретению, полученную из организма Saccharomyces cerevisiae (Genbank accession number Z75034).FIG. 13 shows a nucleotide sequence (SEQ ID No. 11) encoding a lipid acyltransferase according to the present invention, obtained from Saccharomyces cerevisiae (Genbank accession number Z75034).

Фиг.14 показывает последовательность аминокислот (SEQ ID No. 12), полученную из организма Ralstonia (Genbank accession number: AL646052).Fig. 14 shows an amino acid sequence (SEQ ID No. 12) obtained from the organism of Ralstonia (Genbank accession number: AL646052).

Фиг.15 показывает нуклеотидную последовательность (SEQ ID No. 13), кодирующую липид-ацилтрансферазу согласно настоящему изобретению, полученную из организма Ralstonia.Fig. 15 shows a nucleotide sequence (SEQ ID No. 13) encoding a lipid acyltransferase according to the present invention, obtained from Ralstonia .

Фиг.16 показывает SEQ ID No. 20. Scoe1 NCBI протеин, код доступа CAB39707.1 GI:4539178 консервативный гипотетический протеин [Streptomyces coelocolor A3(2)].16 shows SEQ ID No. 20. Scoe1 NCBI protein, access code CAB39707.1 GI: 4539178 conservative hypothetical protein [Streptomyces coelocolor A3 (2)].

Фиг.17 показывает нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 21, кодирующую NCBI протеин, код доступа CAB39707.1 GI:4539178 консервативный гипотетический протеин [Streptomyces coelocolor A3(2)].17 shows the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 21, encoding an NCBI protein, access code CAB39707.1 GI: 4539178 conservative hypothetical protein [Streptomyces coelocolor A3 (2)].

Фиг.18 показывает аминокислоту, показанную как SEQ ID No. 22. Scoe2 NCBI протеин, код доступа CAС01477.1 GI:9716139 консервативный гипотетический протеин [Streptomyces coelocolor A3(2)].Fig. 18 shows the amino acid shown as SEQ ID No. 22. Scoe2 NCBI protein, access code CAC01477.1 GI: 9716139 conservative hypothetical protein [Streptomyces coelocolor A3 (2)].

Фиг.19 показывает нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 23, кодирующую Scoe2 NCBI протеин, код доступа CAС01477.1 GI:9716139 консервативный гипотетический протеин [Streptomyces coelocolor A3(2)].Fig.19 shows the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 23, encoding Scoe2 NCBI protein, access code CAC01477.1 GI: 9716139 conservative hypothetical protein [Streptomyces coelocolor A3 (2)].

Фиг.20 показывает последовательность аминокислот (SEQ ID No. 24). Scoe3 NCBI протеин, код доступа CAВ88833.1 GI:7536996 предполагаемый протеин [Streptomyces coelocolor A3(2)].20 shows an amino acid sequence (SEQ ID No. 24). Scoe3 NCBI protein, access code CAB88833.1 GI: 7536996 putative protein [Streptomyces coelocolor A3 (2)].

Фиг.21 показывает нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 25, кодирующую Scoe3 NCBI протеин, код доступа CAВ88833.1 GI:7536996 предполагаемый секретированный протеин [Streptomyces coelocolor A3(2)].Fig.21 shows the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 25 encoding a Scoe3 NCBI protein, access code CAB88833.1 GI: 7536996 putative secreted protein [Streptomyces coelocolor A3 (2)].

Фиг.22 показывает последовательность аминокислот (SEQ ID No. 26). Scoe4 NCBI протеин, код доступа CAВ89450.1 GI:7672261 предполагаемый секретированный протеин [Streptomyces coelocolor A3(2)].22 shows an amino acid sequence (SEQ ID No. 26). Scoe4 NCBI protein, access code CAB89450.1 GI: 7672261 putative secreted protein [Streptomyces coelocolor A3 (2)].

Фиг.23 показывает нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 27, кодирующую Scoe4 NCBI протеин, код доступа CAВ89450.1 GI:7672261 предполагаемый секретированный протеин [Streptomyces coelocolor A3(2)].23 shows the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 27 encoding a Scoe4 NCBI protein, access code CAB89450.1 GI: 7672261 putative secreted protein [Streptomyces coelocolor A3 (2)].

Фиг.24 показывает последовательность аминокислот (SEQ ID No. 28). Scoe5 NCBI протеин, код доступа CAВ62724.1 GI:6562793 предполагаемый липопротеин [Streptomyces coelocolor A3(2)].24 shows an amino acid sequence (SEQ ID No. 28). Scoe5 NCBI protein, access code CAB62724.1 GI: 6562793 putative lipoprotein [Streptomyces coelocolor A3 (2)].

Фиг.25 показывает нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 29, кодирующую Scoe5 NCBI протеин, код доступа CAВ62724.1 GI:6562793 предполагаемый липопротеин [Streptomyces coelocolor A3(2)].25 shows the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 29, encoding Scoe5 NCBI protein, access code CAB62724.1 GI: 6562793 putative lipoprotein [Streptomyces coelocolor A3 (2)].

Фиг.26 показывает последовательность аминокислот (SEQ ID No. 30). Srim1 NCBI протеин, код доступа AAK84028.1 GI:15082088 GDSL-липаза [Streptomyces rimosus].26 shows an amino acid sequence (SEQ ID No. 30). Srim1 NCBI protein, access code AAK84028.1 GI: 15082088 GDSL lipase [Streptomyces rimosus].

Фиг.27 показывает нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 31, кодирующую Srim1 NCBI протеин, код доступа AAK84028.1 GI:15082088 GDSL-липаза [Streptomyces rimosus].Fig. 27 shows the nucleotide sequence shown as SEQ ID No. 31, encoding Srim1 NCBI protein, access code AAK84028.1 GI: 15082088 GDSL lipase [Streptomyces rimosus].

Фиг.28 показывает последовательность аминокислот (SEQ ID No. 32). липид-ацилтрансферазы из Aeromonas hydrophila (ATCC#7965).28 shows an amino acid sequence (SEQ ID No. 32). lipid acyltransferase from Aeromonas hydrophila (ATCC # 7965).

Фиг.29 показывает нуклеотидную последовательность (SEQ ID No. 33), кодирующую липид-ацилтрансферазу из Aeromonas hydrophila (ATCC#7965).Fig. 29 shows a nucleotide sequence (SEQ ID No. 33) encoding a lipid acyltransferase from Aeromonas hydrophila (ATCC # 7965).

Фиг.30 показывает последовательность аминокислот (SEQ ID No. 34). липид-ацилтрансферазы из Aeromonas salmonicida, подвид Salmonicida (ATCC#14174).30 shows an amino acid sequence (SEQ ID No. 34). lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicida, subspecies Salmonicida (ATCC # 14174).

Фиг.31 показывает нуклеотидную последовательность (SEQ ID No. 35), кодирующую липид-ацилтрансферазу из Aeromonas salmonicida, подвид Salmonicida (ATCC#14174).Fig. 31 shows a nucleotide sequence (SEQ ID No. 35) encoding a lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicida, a subspecies of Salmonicida (ATCC # 14174).

Фиг.32 показывает, что гомологи генов Aeromonas могут быть идентифицированы с использованием системы поиска базового локального выравнивания в National Center for Biotechnology Information, NTH, MD, USA и пополненные геномные базы данных. Фрагмент GDSX был использован при поиске в базе данных и был идентифицирован ряд последовательностей/генов, потенциально кодирующих ферменты с липолитической активностью. Гены были идентифицированы из генов Streptomyces, Xanthomonas и Ralstonia. В качестве примера ниже Ralstonia solanacearum был выровнен к гену Aeromonas salmonicida (satA). Парное выравнивание показало 23% идентичности. Активный сайт серина присутствует на аминовых концах, и могут быть идентифицированы каталитические остатки гистидина и аспартамовой кислоты.Fig. 32 shows that Aeromonas gene homologues can be identified using a basic local alignment search system in National Center for Biotechnology Information, NTH, MD, USA and updated genomic databases. The GDSX fragment was used in a database search and a number of sequences / genes were identified that potentially encoded enzymes with lipolytic activity. Genes have been identified from the genes Streptomyces, Xanthomonas and Ralstonia . As an example below, Ralstonia solanacearum was aligned with the Aeromonas salmonicida (satA) gene. Pair alignment showed 23% identity. The active site of serine is present at the amine ends and catalytic residues of histidine and aspartic acid can be identified.

Фиг.33 показывает консенсусную последовательность Pfam00657.11 [семейство 00657, версия 11 базы данных], называемую здесь далее Pfam консенсус, и выравнивание различных последовательностей к консенсусной последовательности Pfam. Стрелки показывают остатки активных сайтов, подчеркнутые боксы показывают три из гомологичных боксов, указанных Upton C and Buckley J.T. (1995) Trends Biochem. Sci 20; 179-179. Заглавные буквы в Pfam консенсусе показывают консервативные остатки во многих членах семейства. Символ - обозначает положение, где скрытая марковская модель консенсуса Pfam ожидала найти остаток, но не нашла, так что вставлен пробел. Символ . обозначает остаток без соответствующего остатка в Pfam консенсусе. Последовательности являются последовательностями аминокислот, перечисленными на фиг.16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 и 30.Fig. 33 shows the consensus sequence Pfam00657.11 [family 00657, version 11 of the database], hereinafter referred to as Pfam consensus, and the alignment of various sequences to the consensus Pfam sequence. Arrows indicate the remains of active sites; underlined boxes show three of the homologous boxes indicated by Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem. Sci 20 ; 179-179. Capital letters in the Pfam consensus indicate conservative residues in many members of the family. Symbol - indicates the position where the hidden Markov model of consensus Pfam expected to find the remainder, but did not find, so a space is inserted. Symbol. denotes a residue without a corresponding residue in the Pfam consensus. The sequences are the amino acid sequences listed in FIGS. 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, and 30.

Фиг.34 показывает консенсусную последовательность Pfam00657.11 [семейство 00657, версия 11 базы данных], называемую здесь далее Pfam консенсус, и выравнивание различных последовательностей к консенсусной последовательности Pfam. Стрелки показывают остатки активных сайтов, подчеркнутые боксы показывают три из гомологичных боксов, указанных Upton C and Buckley J.T. (1995) Trends Biochem. Sci 20; 179-179. Заглавные буквы в Pfam консенсусе показывают консервативные остатки во многих членах семейства. Символ - обозначает положение, где скрытая марковская модель консенсуса Pfam ожидала найти остаток, но не нашла, так что вставлен пробел. Символ . обозначает остаток без соответствующего остатка в Pfam консенсусе. Последовательности являются последовательностями аминокислот, перечисленными на фиг.2, 16, 18, 20, 26, 28 и 30. Было найдено, что все данные протеины являются активными против липидных субстратов.Fig. 34 shows the consensus sequence Pfam00657.11 [family 00657, version 11 of the database], hereinafter referred to as Pfam consensus, and the alignment of various sequences to the Pfam consensus sequence. Arrows indicate the remains of active sites; underlined boxes show three of the homologous boxes indicated by Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem. Sci 20 ; 179-179. Capital letters in the Pfam consensus indicate conservative residues in many members of the family. Symbol - indicates the position where the hidden Markov model of consensus Pfam expected to find the remainder, but did not find, so a space is inserted. Symbol. denotes a residue without a corresponding residue in the Pfam consensus. The sequences are the amino acid sequences listed in FIGS. 2, 16, 18, 20, 26, 28, and 30. It has been found that all of these proteins are active against lipid substrates.

Фиг.35 показывает вектор экспрессии pet12-AsalGCAT=pSM, содержащий С-терминальный His-меченный ген липид-ацилтрансферазы Aeromonas salmonicida.Fig. 35 shows an expression vector pet12-AsalGCAT = pSM containing the C-terminal His-labeled Aeromonas salmonicida lipid acyltransferase gene.

Фиг.36 и фиг.37 показывает результаты испытаний клеточных экстрактов в тесте NEFA A Kit Assay, который описывает активность рекомбинантной липид-ацилтрансферазы A. salmonicida по отношению к лецитину. Клеточные экстракты были испытаны на фосфолипазную активность, используя тест NEFA Kit Assay. Лунки слева направо: положительный, контроль, отрицательный, контроль; 20°С, 30°С.Fig. 36 and Fig. 37 shows the results of testing cell extracts in the NEFA A Kit Assay test, which describes the activity of the recombinant A. salmonicida lipid acyltransferase against lecithin. Cell extracts were tested for phospholipase activity using the NEFA Kit Assay test. Wells from left to right: positive, control, negative, control; 20 ° C, 30 ° C.

Фиг.38 показывает сырые клеточные экстракты из BL21(DE3)pLysS экспрессированной активной липид-ацилтрансферазы, инкубированной с субстратом лецитином, и реакционная смесь была проанализирована с использованием тонкослойной хроматографии, показавшей присутствие продуктов разложения. Дорожки: 1 - нет фермента; 2 - + A.sal. - 10 мкл, 37°C; 3. + A.sal - 20 мкл, 37°C; 4. + A.sal. - 10 мкл, 24°C; 5. + A.sal. - 20 мкл, 24°C.Fig. 38 shows crude cell extracts from BL21 (DE3) pLysS expressed active lipid acyltransferase incubated with lecithin substrate, and the reaction mixture was analyzed using thin layer chromatography showing the presence of decomposition products. Lanes: 1 - no enzyme; 2 - + A.sal. - 10 μl, 37 ° C; 3. + A.sal - 20 μl, 37 ° C; 4. + A.sal. - 10 μl, 24 ° C; 5. + A.sal. - 20 μl, 24 ° C.

Фиг.39 показывает частичную очистку ацилтрансферазы Aeromonas salmonicida, проявляющей фосфолипазную активность, связанную с очищенным His-меченным протеином. SE = обработанные ультразвуком экстракты, His = очищен Ni-NTA спин-набором от Qiagen.Fig. 39 shows a partial purification of the Aeromonas salmonicida acyltransferase exhibiting phospholipase activity associated with purified His-labeled protein. SE = sonicated extracts; His = purified by Ni-NTA spin kit from Qiagen.

Фиг.40 показывает вектор экспрессии pet12-A.h. GCAT = hSMa, содержавший С-терминальный His-меченный ген глицеролипид-ацилтрансферазы Aeromonas hydrophila был использован для трансформации E. coli, штамм BL21(DE3)pLysS.Fig. 40 shows the expression vector pet12-Ah GCAT = hSMa containing the C-terminal His-labeled Aeromonas hydrophila glycerolipid acyltransferase gene was used to transform E. coli strain BL21 (DE3) pLysS.

Фиг.41 показывает активность сырых экстрактов (5 & 10 мкл), содержащих рекомбинантный фермент Aeromonas hydrophila GCAT. Фермент был испытан по отношению к лецитину с использованием набора неэтерифицируемой жирной кислоты (NEFA) (Roche, Switzerland), показав присутствие фермента, активного против фосфолипида лецитина.Fig. 41 shows the activity of crude extracts (5 & 10 μl) containing the recombinant Aeromonas hydrophila GCAT enzyme. The enzyme was tested for lecithin using a non-esterifiable fatty acid (NEFA) kit (Roche, Switzerland), showing the presence of an enzyme active against lecithin phospholipid.

Фиг.42 показывает оптимизацию роста BL21(DE30pLysS прибежища вектора экспрессии pet12-AsalGCAT = pSM, показывающий культивацию при 30°С, приводящую к продукции фермента с высокой активностью по отношению к лецитину. Клеточные экстракты испытывали на фосфолипазную активность, используя набор анализа NEFA.Fig. 42 shows growth optimization of BL21 (DE30pLysS refuge of the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM showing cultivation at 30 ° C leading to the production of an enzyme with high activity against lecithin. Cell extracts were tested for phospholipase activity using an NEFA assay kit.

Фиг.43 показывает частичную очистку ацилтрансферазы Aeromonas hydrophila & A. salmonicida, проявляющей фосфолипазную активность, связанную с очищенным His-меченным протеином. SE = обработанные ультразвуком экстракты, His = очищен Ni-NTA спин-набором от Qiagen.Fig. 43 shows a partial purification of the Aeromonas hydrophila & A. salmonicida acyltransferase exhibiting phospholipase activity associated with purified His-tagged protein. SE = sonicated extracts; His = purified by Ni-NTA spin kit from Qiagen.

Фиг.44 показывает экспрессию генов Aeromones в Bacillus subtilis 163, показывая продуцирование секретированного фермента с активностью по отношению и к лецитину, и к DGDG. Конструкт pUB-AH=, содержащий ген A. hydrophila, и конструкт pUB-AS, содержащий ген A. salmonicida. Культуральный фильтрат инкубировали с субстратом в течение 60 минут.Fig. 44 shows the expression of Aeromones genes in Bacillus subtilis 163, showing the production of a secreted enzyme with activity against both lecithin and DGDG. The construct pUB-AH = containing the A. hydrophila gene and the construct pUB-AS containing the A. salmonicida gene. The culture filtrate was incubated with the substrate for 60 minutes.

Фиг.45 и фиг.46 показывают планшет ТСХ в проявляющем растворителе IV (хлороформ:метанол:вода (65:24:4)); дорожка 1: 40 мг ситостерола, 30 мин; дорожка 2: трансфераза + 40 мг ситостерола, 30 мин; дорожка 3: трансфераза + 80 мг ситостерола, 30 мин; дорожка 4: трансфераза + 40 мг ситостерола, 120 мин; дорожка 5: трансфераза + 80 мг ситостерола, 120 мин; дорожка 6: трансфераза + 40 мг ситостерола, 300 мин; дорожка 7: 40 мг ситостерола, 300 мин; дорожка 8: холестерин; дорожка 9: ситостерол.Fig. 45 and Fig. 46 show a TLC plate in a developing solvent IV (chloroform: methanol: water (65: 24: 4)); lane 1: 40 mg sitosterol, 30 min; lane 2: transferase + 40 mg sitosterol, 30 min; lane 3: transferase + 80 mg sitosterol, 30 min; lane 4: transferase + 40 mg sitosterol, 120 min; lane 5: transferase + 80 mg sitosterol, 120 min; lane 6: transferase + 40 mg sitosterol, 300 min; lane 7: 40 mg sitosterol, 300 min; lane 8: cholesterol; lane 9: sitosterol.

Фиг.47 изображает реакцию между фосфатидилхолином и холестерином, которая катализирована ацилтрансферазой.Fig. 47 depicts the reaction between phosphatidylcholine and cholesterol, which is catalyzed by acyltransferase.

Фиг.48 показывает анализ ТСХ липидов, экстрагированных из обработанного ферментом или необработанного яичного желтка: 6) 0,31 PLU/г трансфераза #179, 7) 1,25 PLU/г трансфераза #178-9, 8) 23,25 PLU/г фосфолипаза #3108, 9) контроль.Fig. 48 shows a TLC analysis of lipids extracted from an enzyme-treated or untreated egg yolk: 6) 0.31 PLU / g transferase # 179, 7) 1.25 PLU / g transferase # 178-9, 8) 23.25 PLU / g phospholipase # 3108, 9) control.

Фиг.49 показывает испытуемые образцы майонеза, полученные из обработанного ферментом или необработанного яичного желтка: 5) трансфераза #179, 0,31 PLU/г, 6) трансфераза #178-9, 1,25 PLU/г, 7) фосфолипаза #3108, 23,3 PLU/г, 8) контроль, вода.Fig. 49 shows test samples of mayonnaise obtained from an enzyme-treated or untreated egg yolk: 5) transferase # 179, 0.31 PLU / g, 6) transferase # 178-9, 1.25 PLU / g, 7) phospholipase # 3108 , 23.3 PLU / g, 8) control, water.

Фиг.50 показывает ТХС (в растворителе I) липида яичного желтка, обработанного липид-ацилтрансферазой из A. hydrophila.Fig. 50 shows TLC (in solvent I) of an egg yolk lipid treated with a lipid acyltransferase from A. hydrophila .

Фиг.51 показывает ТХС (в растворителе IV) липида яичного желтка, обработанного липид-ацилтрансферазой из A. hydrophila.Fig. 51 shows a TCS (in solvent IV) of an egg yolk lipid treated with a lipid acyltransferase from A. hydrophila .

Фиг.52 показывает анализ ТСХ обработанного трансферазой липида из яичного желтка в течение времени.52 shows TLC analysis of transferase-treated lipid from egg yolk over time.

Фиг.53 показывает количество образовавшихся жирной кислоты и эфира холестерина как функцию времени при использовании липид-ацилтрансферазы (Tranf # 178-9) в сравнении с использованием контрольного липолитического фермента Thermomyces lanuginosus.Fig. 53 shows the amount of cholesterol fatty acid and ester formed as a function of time using lipid acyltransferase (Tranf # 178-9) in comparison with the control lipolytic enzyme Thermomyces lanuginosus .

Фиг.54 показывает относительную трансферазную активность как % от трансферазной и липолитической активности при ферментативной реакции в яичном желтке с высоким содержанием воды, контрольными фосфолипазами являются #1991 (фосфолипаза А2) и #2427 (фосфолипаза А1), липид-ацилтрансферазой является #178.Fig. 54 shows the relative transferase activity as% of the transferase and lipolytic activity during the enzymatic reaction in a high water egg yolk, the control phospholipases are # 1991 (phospholipase A2) and # 2427 (phospholipase A1), lipid acyltransferase is # 178.

Фиг.55 показывает влияние содержания воды при анализе трансферазной активности трансферазы #178 при реакции в яичном желтке с высоким содержанием воды.55 shows the effect of water content in the analysis of the transferase activity of transferase # 178 in a reaction in egg yolk with a high water content.

Фиг.56 показывает трансферазную активность для липид-ацилтрансферазы (#178) как функцию времени реакции при трансферазных реакциях в яичном желтке с высоким содержанием воды.Fig. 56 shows the transferase activity for lipid acyltransferase (# 178) as a function of reaction time during transferase reactions in egg yolk with a high water content.

Фиг.57 и фиг.58 показывают графики, отражающие количество жирной кислоты и холестерина как функцию времени. Графики отражают результаты, полученные анализом ГЖХ в опыте для измерения ацилтрансферазной активности при использовании лецитина и холестерина в буфере в качестве субстрата.Fig. 57 and Fig. 58 show graphs showing the amount of fatty acid and cholesterol as a function of time. The graphs reflect the results obtained by GLC analysis in an experiment for measuring acyltransferase activity using lecithin and cholesterol in a buffer as a substrate.

Фиг.59 показывает ТСХ в растворителе I. Яичный желток, обработанный липид-ацилтрансферазой #138 из Aeromonas salmonicida (дорожка 1 и 2) или фосфолипазой #2938 (LIPOPAN™ F) (дорожка 3); необработанный яичный желток (дорожка 4).Figure 59 shows TLC in solvent I. Egg yolk treated with lipid acyltransferase # 138 from Aeromonas salmonicida (lanes 1 and 2) or phospholipase # 2938 (LIPOPAN ™ F) (lane 3); untreated egg yolk (lane 4).

Фиг.60 показывает ТСХ в растворителе IV. Яичный желток, обработанный липид-ацилтрансферазой #138 (дорожка 1 и 2) или фосфолипазой #2938 (дорожка 3); необработанный яичный желток (дорожка 4).Fig. 60 shows TLC in solvent IV. Egg yolk treated with lipid acyltransferase # 138 (lanes 1 and 2) or phospholipase # 2938 (lane 3); untreated egg yolk (lane 4).

Фиг.61 показывает яичный желток, обработанный липид-ацилтрансферазой #138 (образцы 1 и 2) или фосфолипазой #2938 (образец 3); необработанный яичный желток (образец 4).61 shows an egg yolk treated with lipid acyltransferase # 138 (samples 1 and 2) or phospholipase # 2938 (sample 3); untreated egg yolk (sample 4).

Фиг.62 показывает пищевую эмульсию после 2 часов при 100°С. 0) необработанный яичный желток, 1) яичный желток, обработанный липид-ацилтрансферазой #138 в течение 210 минут, 3) яичный желток, обработанный контрольной фосфолипазой #2938 в течение 210 минут.Fig. 62 shows a food emulsion after 2 hours at 100 ° C. 0) untreated egg yolk, 1) egg yolk treated with lipid acyltransferase # 138 for 210 minutes, 3) egg yolk treated with control phospholipase # 2938 for 210 minutes.

Фиг.63 показывает планшеты ТСХ, показывающие скрининг трансферазной активности на растительный стерол и глицерин. PC = фосфатидилхолин, LPC = лизофосфатидилхолин, PE = фосфатидилэтаноламин, monogl = моноглицерид.63 shows TLC plates showing screening for transferase activity for plant sterol and glycerol. PC = phosphatidylcholine, LPC = lysophosphatidylcholine, PE = phosphatidylethanolamine, monogl = monoglyceride.

Фиг.64 показывает планшет ТСХ в растворителе I, образцы 1-6 после 24 часов и образцы 1-4 после 4 часов времени реакции. Анализ ТСХ подтверждает образование эфира стерола в образцах 1, 2, 5 и 6.64 shows a TLC plate in solvent I, samples 1-6 after 24 hours and samples 1-4 after 4 hours of reaction time. TLC analysis confirms the formation of sterol ester in samples 1, 2, 5 and 6.

Фиг.65 показывает планшет ТСХ в растворителе IV, где трансферазную активность иммобилизованной ацилтрансферазы из Aeromonas salmonicida испытывали в масляной смеси с отбором проб в 0,5, 1, 3, 6 и 24 ч.Fig. 65 shows a TLC plate in solvent IV, where the transferase activity of immobilized acyltransferase from Aeromonas salmonicida was tested in an oil mixture with sampling at 0.5, 1, 3, 6 and 24 hours.

Фиг.66 и 67 показывают планшеты ТСХ в растворителе I и IV. Дорожка 1 = лецитин; дорожка 2 = контроль - 10 мин; дорожка 3 = 0,75 PLU, 10 мин; дорожка 4 = 0,75 PLU, 60 мин; дорожка 5 = 0,75 PLU, 220 мин; дорожка 6 = контроль, 20 ч; дорожка 7 = 0,75 PLU, 20 ч; и дорожка 8) эфир холестерина.Figures 66 and 67 show TLC plates in solvent I and IV. Lane 1 = lecithin; lane 2 = control - 10 min; lane 3 = 0.75 PLU, 10 min; lane 4 = 0.75 PLU, 60 min; lane 5 = 0.75 PLU, 220 min; lane 6 = control, 20 hours; lane 7 = 0.75 PLU, 20 hours; and lane 8) cholesterol ester.

Фиг.68 и 69 показывают планшеты ТСХ в растворителе IV. Дорожка 1 = лецитин; дорожка 2 = контроль - 10 мин; дорожка 3 = 1 PLU, 10 мин; дорожка 4 = 1 PLU, 60 мин; дорожка 5 = 1 PLU, 180 мин; дорожка 6 = 1 PLU, 220 мин, дорожка 7 = 1 PLU, 1200 мин; дорожка 8) = контроль, 1200 мин; дорожка 9) = эфир глюкозы; дорожка 19) = холестерин и дорожка 11) = глюкоза.Figures 68 and 69 show TLC plates in solvent IV. Lane 1 = lecithin; lane 2 = control - 10 min; lane 3 = 1 PLU, 10 min; lane 4 = 1 PLU, 60 min; lane 5 = 1 PLU, 180 min; lane 6 = 1 PLU, 220 min; lane 7 = 1 PLU, 1200 min; lane 8) = control, 1200 min; lane 9) = glucose ester; lane 19) = cholesterol and lane 11) = glucose.

Фиг.70 показывает реакцию между DGDG и глюкозой, катализируемую липид-ацилтрансферазой.70 shows the reaction between DGDG and glucose catalyzed by lipid acyltransferase.

Фиг.71 показывает последовательность аминокислот (SEQ ID No. 36) конструкта слияния, использованного для мутагенеза гена липид-ацилтрансферазы Aeromonas hydrophila в примере 17. Подчеркнутые аминокислоты представляют сигнальный пептид ксиланазы.Fig. 71 shows the amino acid sequence (SEQ ID No. 36) of the fusion construct used for mutagenesis of the Aeromonas hydrophila lipid acyltransferase gene in Example 17. The underlined amino acids represent the xylanase signal peptide.

Фиг.72 показывает нуклеотидную последовательность (SEQ ID No. 45), кодирующую фермент из Aeromonas hydrophila, включая сигнальный пептид ксиланазы; иFig. 72 shows a nucleotide sequence (SEQ ID No. 45) encoding an enzyme from Aeromonas hydrophila , including the xylanase signal peptide; and

фиг.73 показывает планшет ТСХ, ясно показывающий образование эфира растительного стерола и моноглицерида. Дорожка 1 - после 1 часа времени реакции, дорожка 2 - после 2 часов времени реакции, дорожка 3 - после 24 часов времени реакции, и дорожка 4 представляет растительный стерол.FIG. 73 shows a TLC plate clearly showing the formation of plant sterol ether and monoglyceride. Lane 1 after 1 hour of reaction time, lane 2 after 2 hours of reaction time, lane 3 after 24 hours of reaction time, and lane 4 represents plant sterol.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

За исключением того, где заявлено, анализ ТСХ проводили, как описано в примере 6, и анализ ГЖХ проводили, как описано в примере 1.Except where stated, TLC analysis was performed as described in example 6, and GLC analysis was performed as described in example 1.

Пример 1. Клонирование, секвенирование и гетерологическая экспрессия трансферазы из Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida Example 1. Cloning, sequencing and heterologous expression of transferase from Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida

Используемые штаммыUsed strains

Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (ATCC 14174) получили от АТСС и культивировали в течение ночи при 30°С в среде Luria-Bertani (LB). Клетки центрифугировали и выделяли геномную ДНК, используя методику изоляции геномной кислоты из Qiagen Ltd. Genomic DNA buffer set (кaт. 19060), протеазу К (кaт. 19131) и РНКазу А (кат. 19101), все от Qiagen Ltd. (Boundary court, Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX). Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (ATCC 14174) was obtained from ATCC and cultured overnight at 30 ° C. in Luria-Bertani (LB) medium. Cells were centrifuged and genomic DNA was isolated using a genomic acid isolation technique from Qiagen Ltd. Genomic DNA buffer set (cat. 19060), protease K (cat. 19131) and RNase A (cat. 19101), all from Qiagen Ltd. (Boundary court, Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX).

Для получения рекомбинантных ферментов Aeromonas использовали бактериальный штамм-хозяин BL21(DE3)pLysS (Novagen). Компетентные клетки BL21(DE3)pLysS использовали в качестве хозяев для трансформации вектором экспрессии pet12-AsalGCAT=pSM. Трансформанты, содержащие соответствующую плазмиду, культивировали при 37°С в агаровой LB среде, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина.To obtain recombinant Aeromonas enzymes, the bacterial host strain BL21 (DE3) pLysS (Novagen) was used. Competent BL21 (DE3) pLysS cells were used as hosts for transformation with the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM . Transformants containing the corresponding plasmid were cultured at 37 ° C in LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin.

Конструирование вектора экспрессии pet12-AsalGCAT=pSMConstruction of the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM

Для всех амплификаций ДНК генов трансферазы из Aeromonas использовали геномную ДНК (0,2-1 мкл) в качестве матрицы и pfu ДНК полимеразу (2,5 единиц) использовали с 10 мкл 10×pfu буфера, 1 мкл каждого праймера (50 пмоль/мкл), 200 uMdNTP в общем реакционном объеме 100 мкл. Реакции ПЦР проводили в программируемом термическом циклере, используя следующие условия: 95°С в течение 30 секунд, 30 циклов при 95°С в течение 30 секунд, 60°С в течение 1 минуты и 68°С в течение 2 минут. Использовали дополнительное продление в 5 минут при 72°С.For all amplifications of the DNA transferase genes from Aeromonas , genomic DNA (0.2-1 μl) was used as template and pfu DNA polymerase (2.5 units) was used with 10 μl of 10 × pfu buffer, 1 μl of each primer (50 pmol / μl ), 200 uMdNTP in a total reaction volume of 100 μl. PCR reactions were carried out in a programmable thermal cycler using the following conditions: 95 ° C for 30 seconds, 30 cycles at 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 1 minute, and 68 ° C for 2 minutes. Used an additional extension of 5 minutes at 72 ° C.

ПЦР амплификацию гена трансферазы из A. salmonicida проводили за 2 отдельные ПЦР реакции. ПЦР реакцию 1 проводили, используя пару праймеров, as1USNEW (5'AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3' [SEQ ID No. 36]) и as1s950new (5' GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC GTA CTG3' [SEQ ID No. 37]). Вторую ПЦР реакцию проводили для того, чтобы ввести С-терминальную метку гистидина, используя ПЦР продукт первой реакции и праймеры: as1USNEW (5'AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3' [SEQ ID No. 38]) и AHLS1001 (5'TTGGATCC GAATTCAT CAATG GTG ATG GTG ATG GTG GGC3' [SEQ ID No. 39]). Продукт ПЦР второй реакции очищали и расщепляли рестрикционными ферментами Ndel и BamHL. 2 мкг вектора ДНК pET 12a также расщепляли рестрикционными ферментами Ndel и BamHL и обрабатывали фосфатазой. Обработанные рестрикционными ферментами pET 12a и продукт ПЦР реакции 2 очищали и лигировали, используя Rapid Ligation Kit (Roche, Switzerland). Смесь лигирования использовали для трансформации клеток E. coli TOP 10. Трансформанты высеивали на агаровую LB среду, содержавшую 100 мкг/мл ампициллина.PCR amplification of the transferase gene from A. salmonicida was performed for 2 separate PCR reactions. PCR reaction 1 was performed using a pair of primers, as1USNEW (5'AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3 '[SEQ ID No. 36]) and as1s950new (5' GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC GTA CTG3 '[SEQ ID No.] . A second PCR reaction was performed to introduce a C-terminal histidine tag using the PCR product of the first reaction and primers: as1USNEW (5'AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3 '[SEQ ID No. 38]) and AHLS1001 (5'TTTGGGATCC GA ATG GTG ATG GTG GGC3 '[SEQ ID No. 39]). The PCR product of the second reaction was purified and digested with restriction enzymes Ndel and BamHL. 2 μg of the pET 12a DNA vector was also digested with restriction enzymes Ndel and BamHL and treated with phosphatase. The restriction enzyme treated pET 12a and the PCR product of reaction 2 were purified and ligated using the Rapid Ligation Kit (Roche, Switzerland). The ligation mixture was used to transform E. coli TOP 10 cells. Transformants were plated on LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin.

Промотор-праймер Т7 (5'TAATACGACTCACTATAG3' [SEQ ID No.40]) и терминатор-праймер Т7 (5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3' [SEQ ID No.41]) использовали для верификации последовательностей и ориентации клонированных генов трансферазы в векторе рЕТ12а. Секвенирование ДНК проводили, используя набор для секвенирования ABI Prism® BigDye™ Terminators Cycle с 500 нг плазмиды ДНК в качестве матрицы и 3 пмоль промотор- и терминатор-праймеров.The T7 promoter primer (5'TAATACGACTCACTATAG3 '[SEQ ID No.40]) and the T7 terminator primer (5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3' [SEQ ID No.41]) were used to verify the sequences and orientation of the cloned transferase genes in the pET12a vector. DNA sequencing was performed using an ABI Prism® BigDye ™ Terminators Cycle sequencing kit with 500 ng DNA plasmid as template and 3 pmol of promoter and terminator primers.

Конструкт, показанный на фиг.35, был использован для трансформации компетентного бактериального штамма-хозяина BL21(DE3)pLysS (Novagen), и устойчивые к ампициллину трансформанты собирали и использовали для анализа экспрессии.The construct shown in FIG. 35 was used to transform the competent bacterial host strain BL21 (DE3) pLysS (Novagen), and ampicillin-resistant transformants were collected and used for expression analysis.

Экспрессия рекомбинантной липид-ацилтрансферазы Aeromonas salmonicida Expression of the recombinant lipid acyltransferase Aeromonas salmonicida

Количественное определение ферментной активности по отношению к лецитину проводили, используя набор Non-Esterified Fatty Acid (NEFA) (Roche, Switzerland).The quantitative determination of enzyme activity with respect to lecithin was carried out using the Non-Esterified Fatty Acid (NEFA) kit (Roche, Switzerland).

На фиг.36 BL21(DE3)pLysS, содержащий вектор экспрессии pet12-AsalGCAT=pSM, культивировали в среде LB + 100 нг/мл ампициллина и инкубировали при встряхивании при 37°С до достижения OD₆₀₀ = 0,6-1,0. Культуры затем индуцировали, используя IPTG (0,4 мМ), и инкубацию продолжали в течение следующих 3 часов. Пробы отбирали через 0, 1, 2 и 3 ч после ввода IPTG. Ферментативную активность определяли, используя набор NEFA и лецитин в качестве субстрата.In FIG. 36, BL21 (DE3) pLysS containing the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM were cultured in LB + 100 ng / ml ampicillin and incubated with shaking at 37 ° C. until OD ₆₀₀ = 0.6-1.0 was reached. The cultures were then induced using IPTG (0.4 mM), and incubation was continued for the next 3 hours. Samples were taken at 0, 1, 2, and 3 hours after IPTG administration. Enzymatic activity was determined using a set of NEFA and lecithin as a substrate.

Оптимизация культивирования для получения более активных ферментовCultivation optimization for more active enzymes

BL21(DE3)pLysS, содержащий вектор экспрессии pet12-Asal GCAT=pSM, культивировали в среде LB + 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали со встряхиванием при различных температурах (37°С, 30°С и 20°С). Оптимальным условием для образования активного фермента липид-ацилтрансферазы являлось культивирование культуры при 30°С, как показано на фиг.37.BL21 (DE3) pLysS containing the expression vector pet12-Asal GCAT = pSM was cultured in LB medium + 100 μg / ml ampicillin and incubated with shaking at different temperatures (37 ° C, 30 ° C and 20 ° C). The optimal condition for the formation of the active lipid acyltransferase enzyme was culture at 30 ° C, as shown in Fig. 37.

Частичная очистка рекомбинантной трансферазы Aeromonas salmonicida Partial Purification of Recombinant Aeromonas salmonicida Transferase

Штамм BL21(DE3)pLysS, содержащий вектор экспрессии pet12-AsalGCAT=pSM, культивировали при 37°С, и сырые клеточные экстракты готовили обработкой ультразвуком. Рекомбинантный фермент далее очищали из обработанных ультразвуком сырых клеточных экстрактов, используя Ni-NTA спин-набор от Qiagen. Для фосфолипазной активности использовали набор NEFA и лецитин в качестве субстрата. Сырые клеточные экстракты из BL21(DE3)pLysS, экспрессированной активной трансферазы инкубировали с субстратом лецитина и реакционную смесь анализировали, используя тонкослойную хроматографию, показавшую присутствие продуктов разложения (см. фиг.38).Strain BL21 (DE3) pLysS containing the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM was cultured at 37 ° C, and the crude cell extracts were prepared by sonication. The recombinant enzyme was further purified from sonicated crude cell extracts using a Ni-NTA spin kit from Qiagen. For phospholipase activity, a NEFA kit and lecithin as a substrate were used. Raw cell extracts from BL21 (DE3) pLysS expressed by active transferase were incubated with a lecithin substrate and the reaction mixture was analyzed using thin layer chromatography showing the presence of decomposition products (see FIG. 38).

Частичная очистка рекомбинантной трансферазы Aeromonas salmonicidae Partial Purification of Recombinant Aeromonas salmonicidae Transferase

Штамм BL21(DE3)pLysS, содержащий вектор экспрессии pet12-AsalGCAT=pSM, культивировали при 37°С и сырые клеточные экстракты готовили обработкой ультразвуком. Рекомбинантный фермент далее очищали из обработанных ультразвуком сырых клеточных экстрактов, используя Ni-NTA спин-набор от Qiagen. Фосфолипазную активность определяли, используя набор NEFA и лецитин в качестве субстрата.Strain BL21 (DE3) pLysS containing the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM was cultured at 37 ° C and the crude cell extracts were prepared by sonication. The recombinant enzyme was further purified from sonicated crude cell extracts using a Ni-NTA spin kit from Qiagen. Phospholipase activity was determined using a set of NEFA and lecithin as a substrate.

Пример 2. Клонирование и экспрессия трансферазы Aeromonas hydrophila в E. coli Example 2. Cloning and expression of Aeromonas hydrophila transferase in E. coli

Aeromonas hydrophila (ATCC # 7965) получили от АТСС и культивировали в течение ночи при 30°С в среде Luria-Bertani (LB). Клетки центрифугировали и выделяли геномную ДНК, используя методику изоляции геномной кислоты из Qiagen Ltd. Genomic DNA buffer set (кaт. 19060), протеазу К (кaт. 19131) и РНКазу А (кат. 19101), все от Qiagen Ltd. (Boundary court, Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX). Aeromonas hydrophila (ATCC # 7965) was obtained from ATCC and cultured overnight at 30 ° C in Luria-Bertani (LB) medium. Cells were centrifuged and genomic DNA was isolated using a genomic acid isolation technique from Qiagen Ltd. Genomic DNA buffer set (cat. 19060), protease K (cat. 19131) and RNase A (cat. 19101), all from Qiagen Ltd. (Boundary court, Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX).

Для получения рекомбинантных ферментов Aeromonas использовали бактериальный штамм-хозяин BL21(DE3)pLysS (Novagen). Компетентные клетки BL21(DE3)pLysS использовали в качестве хозяев для трансформации вектором экспрессии pet12-A.h.GCAT=pSMa. Трансформанты, содержащие соответствующую плазмиду, культивировали при 37°С в агаровой LB среде, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина.To obtain recombinant Aeromonas enzymes, the bacterial host strain BL21 (DE3) pLysS (Novagen) was used. Competent BL21 (DE3) pLysS cells were used as hosts for transformation with the expression vector pet12-AhGCAT = pSMa . Transformants containing the corresponding plasmid were cultured at 37 ° C in LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin.

Конструирование вектора экспрессии pet12-A.h.GCAT=pSMaConstruction of the expression vector pet12-A.h.GCAT = pSMa

Для всех амплификаций ДНК генов трансферазы из Aeromonas использовали геномную ДНК (0,2-1 мкл) в качестве матрицы и pfu ДНК полимеразу (2,5 единиц) использовали с 10 мкл 10×pfu буфера, 1 мкл каждого праймера (50 пмоль/мкл), 200 uMdNTP в общем реакционном объеме 100 мкл. Реакции ПЦР проводили в программируемом термическом циклере, используя следующие условия: 95°С в течение 30 секунд, 30 циклов при 95°С в течение 30 секунд, 60°С в течение 1 минуты и 68°С в течение 2 минут. Применяли дополнительное продление в 5 минут при 72°С.For all amplifications of the DNA transferase genes from Aeromonas , genomic DNA (0.2-1 μl) was used as template and pfu DNA polymerase (2.5 units) was used with 10 μl of 10 × pfu buffer, 1 μl of each primer (50 pmol / μl ), 200 uMdNTP in a total reaction volume of 100 μl. PCR reactions were carried out in a programmable thermal cycler using the following conditions: 95 ° C for 30 seconds, 30 cycles at 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 1 minute, and 68 ° C for 2 minutes. An additional extension of 5 minutes was used at 72 ° C.

ПЦР-амплификацию гена трансферазы из A. hydrophila проводили за 2 отдельные ПЦР-реакции.PCR amplification of the transferase gene from A. hydrophila was performed for 2 separate PCR reactions.

ПЦР-реакцию 1 проводили, используя пару праймеров, AHUS1 (5' GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3', SEQ ID No. 42) и as1s950 (5' ATGGTGATGGTGATGGTGGGCGAGGAACTCGTACTG3', SEQ ID No. 43).PCR reaction 1 was carried out using a pair of primers, AHUS1 (5 'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTTTTGGGATTGGTC3', SEQ ID No. 42) and as1s950 (5 'ATGGTGATGGTGATGGTGGGCGAGGACTCGT, No. 43).

Вторую ПЦР-реакцию проводили для того, чтобы ввести С-терминальную метку гистидина, используя ПЦР-продукт первой реакции и пару праймеров: AHUS1 (5'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3', SEQ ID No. 44) и AHLS1001 (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3', SEQ ID No. 45).A second PCR reaction was performed to introduce a C-terminal Histidine tag using the PCR product of the first reaction and the primer pair: AHUS1 (5'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3 ', SEQ ID No. 44) and AHLS1001 (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3', SEQ ID No . 45).

Продукт ПЦР второй реакции очищали и расщепляли рестрикционными ферментами Ndel и BamHL. 2 мкг вектора ДНК pET 12a также расщепляли рестрикционными ферментами Ndel и BamHL и обрабатывали фосфатазой. Обработанные рестрикционными ферментами pET 12a и продукт ПЦР реакции 2 очищали и лигировали, используя Rapid Ligation Kit (Roche, Switzerland). Смесь лигирования использовали для трансформации клеток E. coli TOP10. Трансформанты высеивали на агаровую LB среду, содержавшую 100 мкг/мл ампициллина.The PCR product of the second reaction was purified and digested with restriction enzymes Ndel and BamHL. 2 μg of the pET 12a DNA vector was also digested with restriction enzymes Ndel and BamHL and treated with phosphatase. The restriction enzyme treated pET 12a and the PCR product of reaction 2 were purified and ligated using the Rapid Ligation Kit (Roche, Switzerland). The ligation mixture was used to transform E. coli TOP10 cells. Transformants were plated on LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin.

Промотор-праймер Т7 (5'TAATACGACTCACTATAG3') и терминатор-праймер Т7 (5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3') использовали для верификации последовательностей и ориентации клонированных генов GCAT в векторе рЕТ12а. Секвенирование ДНК проводили, используя набор для секвенирования ABI Prism® BigDye™ Terminators Cycle с 500 нг плазмиды ДНК в качестве матрицы и 3 пмоль промотор- и терминатор-праймеров.The T7 promoter primer (5'TAATACGACTCACTATAG3 ') and the T7 terminator primer (5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3') were used to verify the sequences and orientation of the cloned GCAT genes in the pET12a vector. DNA sequencing was performed using an ABI Prism® BigDye ™ Terminators Cycle sequencing kit with 500 ng DNA plasmid as template and 3 pmol of promoter and terminator primers.

Конструкт, показанный на фиг.40, был использован для трансформации компетентного бактериального штамма-хозяина BL21(DE3)pLysS (Novagen), и устойчивые к ампициллину трансформанты собирали и использовали для анализа экспрессии.The construct shown in FIG. 40 was used to transform the competent bacterial host strain BL21 (DE3) pLysS (Novagen), and ampicillin-resistant transformants were collected and used for expression analysis.

Экспрессия трансферазы Aeromonas hydrophila в BL21(DE3)pLysS Aeromonas hydrophila transferase expression in BL21 (DE3) pLysS

Штамм E. coli BL21(DE3)pLysS, содержащий вектор экспрессии pet12a-A.h.GCAT=pSMa, культивировали в среде LB + 100 нг/мл ампициллина и инкубировали при встряхивании при 37°С до достижения OD₆₀₀ = 0,6-1,0. Культуры затем индуцировали, используя IPTG (0,4 мМ), и инкубацию продолжали в течение следующих 3 часов. Пробы отбирали через 0, 1, 2 и 3 ч после ввода IPTG. Ферментативную активность определяли, используя набор NEFA и лецитин в качестве субстрата (фиг.41).The E. coli strain BL21 (DE3) pLysS containing the expression vector pet12a-AhGCAT = pSMa was cultured in LB medium + 100 ng / ml ampicillin and incubated with shaking at 37 ° C until reaching OD ₆₀₀ = 0.6-1.0. The cultures were then induced using IPTG (0.4 mM), and incubation was continued for the next 3 hours. Samples were taken at 0, 1, 2, and 3 hours after IPTG administration. Enzymatic activity was determined using a set of NEFA and lecithin as a substrate (Fig. 41).

Оптимизация выращивания для получения более активных ферментовGrowth optimization for more active enzymes

BL21(DE3)pLysS, содержащий вектор экспрессии pet12a-A.h.GCAT=pSMa, культивировали в среде LB + 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали со встряхиванием при различных температурах (37°С, 30°С и 20°С). Оптимальным условием для образования активного фермента GCAT являлось культивирование культуры при 30°С, как показано на фиг.42.BL21 (DE3) pLysS containing the expression vector pet12a-A.h.GCAT = pSMa was cultured in LB medium + 100 μg / ml ampicillin and incubated with shaking at different temperatures (37 ° C, 30 ° C and 20 ° C). The optimal condition for the formation of the active GCAT enzyme was culture at 30 ° C, as shown in Fig. 42.

Частичная очистка рекомбинантной трансферазы Aeromonas hydrophila (GCAT)Partial Purification of Recombinant Aeromonas hydrophila Transferase (GCAT)

Штамм BL21(DE3)pLysS, содержащий вектор экспрессии pet12a-A.h.GCAT=pSMa, культивировали при 37°С и сырые клеточные экстракты готовили обработкой ультразвуком. Рекомбинантный фермент дополнительно очищали из обработанных ультразвуком сырых клеточных экстрактов, используя Ni-NTA спин-набор от Qiagen. Фосфолипазную активность определяли, используя набор NEFA и лецитин в качестве субстрата (фиг.43).Strain BL21 (DE3) pLysS containing the expression vector pet12a-A.h. GCAT = pSMa was cultured at 37 ° C and the crude cell extracts were prepared by sonication. The recombinant enzyme was further purified from sonicated crude cell extracts using a Ni-NTA spin kit from Qiagen. Phospholipase activity was determined using a set of NEFA and lecithin as a substrate (Fig. 43).

Пример 3. Экспрессия трансфераз Aeromonas в Bacillus subtilis 163Example 3. Expression of Aeromonas transferases in Bacillus subtilis 163

Конструирование плазмидыConstruction of plasmids

Два различных вектора экспрессии Bacillus subtilis (pUB110 & pBE5) использовали для гетерологической экспрессии генов Aeromonas в Bacillus subtilis. Вектор pUB110 содержит промотор альфаамилазы, тогда как вектор рВЕ содержит промотор P32 как регуляторную область для экспрессии гибридных генов Aeromonas. В векторе pUB110 первая аминокислота зрелых генов GCAT Bacillus subtilis была слита в рамке с последней аминокислотой сигнальной пептидной последовательности ксиланазы от Bacillus subtilis путем рестрикции сайта Nhe 1, что создает 2 дополнительные аминокислоты впереди зрелых протеинов. Вектор pBE5 содержит слияние сигнальной последовательности cg-тазы на сайте Nco1 для выделения рекомбинантных протеинов в культуральный фильтрат.Two different expression vectors of Bacillus subtilis (pUB110 & pBE5) were used for heterologous expression of the Aeromonas genes in Bacillus subtilis . The pUB110 vector contains the alpha-amylase promoter, while the pBE vector contains the P32 promoter as a regulatory region for the expression of Aeromonas hybrid genes. In vector pUB110, the first amino acid of the mature Bacillus subtilis GCAT genes was fused in frame with the last amino acid of the Bacillus subtilis xylanase signal peptide sequence by restriction of the Nhe 1 site, which creates 2 additional amino acids ahead of the mature proteins. The pBE5 vector contains the fusion of the signal sequence of the cg-basin at the Nco1 site to isolate recombinant proteins in the culture filtrate.

Реакции ПЦР проводили для того, чтобы получить гены Aeromonas, слитые в рамке с сигнальными последовательностями векторов pUB 110 и pBE5. Реакции ПЦР осуществляли, используя следующие пары праймеров для гена A.hydrophila:PCR reactions were performed to obtain Aeromonas genes fused in frame with the signal sequences of the vectors pUB 110 and pBE5. PCR reactions were carried out using the following primer pairs for the A.hydrophila gene:

Реакция ПЦР 1: usAHncol (5'ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3', SEQ. ID No. 46) и 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATC3', SEQ. ID No. 47).PCR Reaction 1: usAHncol (5'ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3 ', SEQ. ID No. 46) and 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATC3', SEQ. ID No. 47).

Реакция ПЦР 2: US-AhnheI (5'TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3', SEQ ID No. 48) и 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3, SEQ ID No. 49).PCR Reaction 2: US-AhnheI (5'TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3 ', SEQ ID No. 48) and 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3, SEQ ID No. 49).

Реакции ПЦР осуществляли, используя следующие пары праймеров для гена A. salmonicida:PCR reactions were performed using the following primer pairs for the A. salmonicida gene:

Реакция ПЦР 3: US-Asncol (5'TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC3', SEQ ID No. 50) и 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTCATG3', SEQ ID No. 51).PCR Reaction 3: US-Asncol (5'TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC3 ', SEQ ID No. 50) and 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTCATG3', SEQ ID No. 51).

Реакция ПЦР 4: US-ASnhe1 (5'TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3', SEQ ID No. 52) и 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG#', SEQ ID No. 53).PCR Reaction 4: US-ASnhe1 (5'TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3 ', SEQ ID No. 52) and 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG #', SEQ ID No. 53).

Все продукты ПЦР клонировали в реакции ПЦР II "затупления концов" (вектор TOPO) и секвенировали обратным и прямым секвенирующими праймерами.All PCR products were cloned into a blunt end PCR II reaction (TOPO vector) and sequenced with reverse and direct sequencing primers.

Клоны реакций ПЦР 1 и 3 обрезали с помощью Nco1 и Bam HI и использовали в качестве вставок для лигации в вектор рВЕ5, обрезанный с помощью Nco1/Bam HI/фосфатазы. Клоны реакций ПЦР 2 и 4 обрезали с помощью Nco1 и Bam HI и использовали в качестве вставок для лигации в вектор рUB, обрезанный с помощью Nco1/Bam HI/фосфатазы.Clones of PCR reactions 1 and 3 were trimmed with Nco1 and Bam HI and used as ligation inserts in the pBE5 vector trimmed with Nco1 / Bam HI / phosphatase. Clones of PCR reactions 2 and 4 were trimmed with Nco1 and Bam HI and used as ligation inserts in the pUB vector trimmed with Nco1 / Bam HI / phosphatase.

Экспрессия генов трансферазы Aeromonas в Bacillus subtilis и характеристика ферментной активности Aeromonas transferase gene expression in Bacillus subtilis and enzyme activity characterization

Ацилтрансферазы из двух видов Aeromonas были успешно экспрессированы в E. coli (результаты приведены выше). Конструкты слияния генов Bacillus pUB110 & pBE5 были использованы для трансформации Bacillus subtilis, и трансформанты были подвергнуты селекции посевом на чашки с канамицином. Выделенные и выращенные в 2×YT устойчивые к канамицину трансформанты были способны к гетерологической экспрессии генов Aeromonas в Bacillus. Культуральные фильтраты имели дигалактолизилдиацилглицерин (DGDG) галактолипазную активность в дополнение к ацилтрансферазной и фосфолипазной активностям. Активность по отношению к дигалактолизилдиацилглицерину (DGDG) измеряли после 60 минут инкубации культурального супернатанта с субстратом, DGDG из пшеничной муки (получаемым от Sigma) так же, как и активность по отношению к лецитину, что показано на фиг.44. Bacillus продуцирует фермент в виде секретированного протеина после культивации в культуральной среде от оставления на ночь (20-24 часа) до 48 часов. В некоторых случаях было показано, что экспрессия генов Aeromonas мешает жизнеспособности клеток и росту в Bacillus & E. coli, поэтому необходимо тщательно выбирать штаммы экспрессии и оптимизировать условия культивирования, чтобы гарантировать экспрессию. Например, некоторые штаммы-хозяева Bacillus (B.s 163, DB104 и OS 21) трансформировали векторами экспрессии для сравнения условий культивирования. B.s 163 оказался трансформируемым 2 генами Aeromonas и был способен экспрессировать активный протеин. DB104 оказался способен к трансформации всеми конструктами, но способным экспрессировать только трансферазу A.salmonicida.Acyltransferases from two Aeromonas species were successfully expressed in E. coli (results are given above). The Bacillus pUB110 & pBE5 gene fusion constructs were used to transform Bacillus subtilis , and the transformants were selected by plating on kanamycin plates. Isolated and grown in 2 × YT, kanamycin-resistant transformants were capable of heterologous expression of Aeromonas genes in Bacillus . The culture filtrates had digalactolysyldiacylglycerol (DGDG) galactolipase activity in addition to acyltransferase and phospholipase activities. The activity with respect to digalactolysyldiacylglycerol (DGDG) was measured after 60 minutes of incubation of the culture supernatant with the substrate, DGDG from wheat flour (obtained from Sigma) as well as the activity with respect to lecithin, as shown in Fig. 44. Bacillus produces an enzyme in the form of a secreted protein after cultivation in a culture medium from overnight (20-24 hours) to 48 hours. In some cases, it has been shown that the expression of Aeromonas genes interferes with cell viability and growth in Bacillus & E. coli , therefore it is necessary to carefully select expression strains and optimize culture conditions to ensure expression. For example, some Bacillus host strains (Bs 163, DB104, and OS 21) were transformed with expression vectors to compare culture conditions. Bs 163 was transformed by 2 Aeromonas genes and was able to express the active protein. DB104 turned out to be capable of transformation by all constructs, but capable of expressing only A. salmonicida transferase.

Пример 4: Ферментация и очистка липид-ацилтрансферазы Aeromonas, продуцированной в E. coli Example 4: Fermentation and Purification of Aeromonas Lipid Acyltransferase Produced in E. coli

Ферментации E. coli Fermentation of E. coli

МикроорганизмыMicroorganisms

В этом исследовании использовали два штамма Eschericia coli, один, содержащий липид-ацилтрансферазу Aeromonas hydrophila (пример 2), и два, содержавшие липид-ацилтрансферазы Aeromonas salmonicida (пример 1).Two strains of Eschericia coli were used in this study, one containing Aeromonas hydrophila lipid acyltransferase (Example 2) and two containing Aeromonas salmonicida lipid acyltransferase (Example 1).

Штамм E. coli, содержащий ген A. hydrophila, был назван DIDK0124, и штамм E. coli, содержащий A. salmonicida, был назван DIDK0125. Ферментация DIDK0124 была названа HYDRO0303, и ферментация DIDK0125 была названа SAL0302. Очищенный протеин от HYDRO025 был назван REF#138, и очищенный протеин от HYDRO0303 был назван REF#135.The E. coli strain containing the A. hydrophila gene was named DIDK0124, and the E. coli strain containing A. salmonicida was named DIDK0125. Fermentation DIDK0124 was named HYDRO0303, and fermentation DIDK0125 was named SAL0302. The purified protein from HYDRO025 was named REF # 138, and the purified protein from HYDRO0303 was named REF # 135.

Культуральная среда и условия культивированияCulture medium and cultivation conditions

Агар LBAgar LB

Чашки с LB-агаром, использованные для поддержания штаммов, содержали 10 г/л триптона, 5 г/л экстракта дрожжей, 5 г/л NaCl, 15 г/л агара, 100 мг/л ампициллина и 35 мг/л хлорамфеникола. Чашки с агаром инкубировали при 30°С.The LB agar plates used to maintain the strains contained 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 5 g / L NaCl, 15 g / L agar, 100 mg / L ampicillin and 35 mg / L chloramphenicol. Agar plates were incubated at 30 ° C.

Встряхиваемая колба с LBShake flask with LB

Среда LB (50 мл на встряхиваемую колбу), использованная для продуцирования высевного материала для культиваций в биореакторе, содержала 10 г/л триптона, 5 г/л экстракта дрожжей, 5 г/л NaCl, 100 мг/л ампициллина и 35 мг/л хлорамфеникола. Встряхиваемые колбы засеивали из чашек с агаром LB и инкубировали при 30°С и 200 об/мин.LB medium (50 ml per shake flask) used to produce seed for cultivation in a bioreactor contained 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 5 g / L NaCl, 100 mg / L ampicillin and 35 mg / L chloramphenicol. Shake flasks were seeded from LB agar plates and incubated at 30 ° C. and 200 rpm.

Культивация в биореактореCultivation in a bioreactor

Культивации в биореакторе проводили в 6 л самодельных биореакторах, заполненных 4 л среды, содержащей 10 г/л триптона, 5 г/л экстракта дрожжей, 5 г/л NaCl, 8 г/л KH₂PO₄, 0,9 г/л MgSO₄·7H₂O, 40 г/л моногидрата глюкозы, 0,4 мл/л ADD APT® Foamstop Sin 260 (ADD APT Chemicals AG, Helmond, The Netherlands), 10 мг/л (NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O, 0,7 мг/л CuSO₄·5H₂O, 3 мг/л ZnSO₄·7H₂O, 3 мг/л MnSO₄·H₂O, 10 мг/л EDTA, 0,1 мг/л NiSO₄·6H₂O, 0,1 мг/л CoCl₂, 0,1 мг/л H₃BO₄, 0,1 мг/л KI, 0,1 мг/л Na₂MoO₄·2H₂O, 1 г/л ампициллина и 35 мг/л хлорамфеникола.Cultivation in the bioreactor was carried out in 6 l of homemade bioreactors filled with 4 l of medium containing 10 g / l of tryptone, 5 g / l of yeast extract, 5 g / l of NaCl, 8 g / l of KH ₂ PO ₄ , 0.9 g / l MgSO ₄ · 7H ₂ O, 40 g / L glucose monohydrate, 0.4 ml / L ADD APT® Foamstop Sin 260 (ADD APT Chemicals AG, Helmond, The Netherlands), 10 mg / L (NH ₄ ) ₂ Fe (SO ₄ ) ₂ · 6H ₂ O, 0.7 mg / L CuSO ₄ · 5H ₂ O, 3 mg / L ZnSO ₄ · 7H ₂ O, 3 mg / L MnSO ₄ · H ₂ O, 10 mg / L EDTA, 0 , 1 mg / L NiSO ₄ · 6H ₂ O, 0.1 mg / L CoCl ₂ , 0.1 mg / L H ₃ BO ₄ , 0.1 mg / L KI, 0.1 mg / L Na ₂ MoO ₄ · 2H ₂ O, 1 g / l ampicillin and 35 mg / l chloramphenicol.

Биореакторы осеменяли количеством LB-культуры, гарантирующим окончание выращивания после приблизительно 20 часов культивирования (рассчитанным из максимальной удельной скорости роста 0,6 ч^-1, ОD₆₀₀ в встряхиваемой колбе с LB и конечной OD₆₀₀ в биореакторе приблизительно 20).The bioreactors were seeded with an amount of LB culture to guarantee completion of cultivation after approximately 20 hours of cultivation (calculated from a maximum specific growth rate of 0.6 h ^-1 , OD ₆₀₀ in a shake flask with LB and a final OD ₆₀₀ in the bioreactor of approximately 20).

SAL0302 инокулировали 10 мл LB-культуры и HYDRO0303 инокулировали 4 мл LB-культуры.SAL0302 was inoculated with 10 ml of LB culture and HYDRO0303 was inoculated with 4 ml of LB culture.

Биореакторы работали при следующих условиях: температура 30°С, перемешивание 800-1000 об/мин (в зависимости от опыта), аэрация 5 л/мин, рН 6,9, регулирование рН 8,75% (мас./об.) NH₃-вода и 2 М H₂SO₄. Индуцирование достигалось добавлением изопропил-β-D-тиогалактозида до конечной концентрации 0,6 мМ, когда, соответственно, продуцировалось 0,4 моля (HYDRO0303) и 0,7 молей СО₂.Bioreactors worked under the following conditions: temperature 30 ° C, stirring 800-1000 rpm (depending on experience), aeration 5 l / min, pH 6.9, regulation of pH 8.75% (w / v) NH _3- water and 2 M H ₂ SO ₄ . Induction was achieved by adding isopropyl-β-D-thiogalactoside to a final concentration of 0.6 mM when, respectively, 0.4 moles (HYDRO0303) and 0.7 moles of CO _{2 were} produced.

Сбор клеток с культурыCollection of cells from the culture

Для сбора клеток и гомогенизации биомассы использовали следующую процедуру:The following procedure was used to collect cells and homogenize biomass:

1) Ферментационный бульон после ферментаций центрифугировали при 5000 g и 4°С в течение 10 минут и супернатант выгружали. Биомассу хранили при -20°С до использования. Биомассу размораживали и повторно суспендировали в 500 мл 20 мМ NaH₂PO₄, pH 7,4, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и ингибиторе протеазы (не содержащем EDTA) Complete (Roche, Germany).1) The fermentation broth after fermentation was centrifuged at 5000 g and 4 ° C for 10 minutes and the supernatant was unloaded. Biomass was stored at -20 ° C until use. The biomass was thawed and resuspended in 500 ml of 20 mM NaH ₂ PO ₄ , pH 7.4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole and a protease inhibitor (not containing EDTA) Complete (Roche, Germany).

2) Суспендированную биомассу гомогенизировали при 2 кбар и 4°С в разрушителе клеток от Constant Systems Ltd (Warwick, UK).2) Suspended biomass was homogenized at 2 kbar and 4 ° C in a cell destroyer from Constant Systems Ltd (Warwick, UK).

3) Остатки клеток удаляли центрифугированием при 10000 g и 4°С в течение 30 минут с последующим сбором супернатанта.3) Cell debris was removed by centrifugation at 10,000 g and 4 ° C for 30 minutes, followed by collection of the supernatant.

4) Супернатант осветляли центрифугированием при 13700 g и 4°С в течение 60 минут с последующим сбором супернатанта.4) The supernatant was clarified by centrifugation at 13700 g and 4 ° C for 60 minutes, followed by collection of the supernatant.

5) Супернатант фильтровали через фильтры 0,2 мкм Vacu Cap (Pall Life Sciences, UK) и фильтрат собирали для немедленной хроматографической очистки.5) The supernatant was filtered through 0.2 μm Vacu Cap filters (Pall Life Sciences, UK) and the filtrate was collected for immediate chromatographic purification.

Хроматографическая очистка трансферазChromatographic purification of transferases

Колонка (2,5×10 см) была заполнена 50 мл геля Chelating Sepharose ff. и загружена сульфатом Ni (согласно методике, описанной производителем, Amersham Biosciences). Колонку доводили до равновесия 200 мл 20 мМ Na₂HPO₄, pH 7,4, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола. 400 мл сырого продукта наносили на колонку со скоростью потока 5 мл/мин. Затем колонку промывали 20 мМ Na₂HPO₄, pH 7,4, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола до тех пор, пока UV₂₈₀ не достигало базовой линии. Затем GCAT элюировали 40 мл 20 мМ Na₂HPO₄, pH 7,4, 500 мМ NaCl и 500 мМ имидазола.The column (2.5 × 10 cm) was filled with 50 ml of Chelating Sepharose ff gel. and loaded with Ni sulfate (according to the procedure described by the manufacturer, Amersham Biosciences). The column was equilibrated with 200 ml of 20 mM Na ₂ HPO ₄ , pH 7.4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole. 400 ml of the crude product was applied to the column at a flow rate of 5 ml / min. The column was then washed with 20 mM Na ₂ HPO ₄ , pH 7.4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole until UV ₂₈₀ reached the baseline. Then GCAT was suirable 40 ml of 20 mm Na ₂ HPO ₄ , pH 7.4, 500 mm NaCl and 500 mm imidazole.

Пример 5: Ферментация и очистка липид-ацилтрансфераз Aeromonas, продуцированных в Bacillus subtilis Example 5: Fermentation and Purification of Aeromonas Lipid Acyltransferases Produced in Bacillus subtilis

ФерментацииFermentation

ВАС0318-19, ВАС0323-24BAC0318-19, BAC0323-24

МикроорганизмMicroorganism

Микроорганизмы, использованные в этом исследовании, получают путем трансформации штамма-реципиента Bacillus subtilis #163 плазмидой, содержащей ген, кодирующий трансферазу Aeromonas salmonicida, встроенный в вектор pUB110OIS. Экспрессию гена контролировали промотором альфа-амилазы и секрецию трансферазы медиировали сигнальной последовательностью ксиланазы B. subtilis (пример 3). Штаммы были названы DIDK0138 (ферментация BAC0318-19) и DIDK0153 (ферментация BAC0323-24).The microorganisms used in this study are obtained by transforming the Bacillus subtilis # 163 recipient strain with a plasmid containing the gene encoding the Aeromonas salmonicida transferase integrated into the pUB110OIS vector. Gene expression was monitored by the alpha-amylase promoter and transferase secretion was mediated by the B. subtilis xylanase signal sequence (Example 3). The strains were named DIDK0138 (fermentation BAC0318-19) and DIDK0153 (fermentation BAC0323-24).

Среда для предкультурыEnvironment for preculture

Встряхиваемую колбу (общий объем 500 мл, с разделительными перегородками) заполняли 100 мл среды, содержавшей:The shaken flask (total volume 500 ml, with dividing baffles) was filled with 100 ml of medium containing:

NaClNaCl 5 г/л5 g / l K₂HPO₄ K ₂ HPO ₄ 10 г/л10 g / l Соевая мукаSoya flour 20 г/л20 g / l Экстракт дрожжей, BioSpringer 106Yeast Extract, BioSpringer 106 20 г/л20 g / l Антивспениватель SIN260Antifoam SIN260 5 мл/л5 ml / l

Величину рН доводили до 7,0 перед обработкой в автоклаве.The pH was adjusted to 7.0 before autoclaving.

После обработки в автоклаве добавляли 6 мл 50% (мас.) Nutriose на колбу. Добавляли канамицин при концентрации 50 мг/л после обработки в автоклаве.After autoclaving, 6 ml of 50% (wt.) Nutriose was added to the flask. Kanamycin was added at a concentration of 50 mg / L after autoclaving.

ИнокуляцияInoculation

Встряхиваемую колбу для предкультуры инокулировали замороженной культурой непосредственно из 25% (мас./об.) глицеринового исходного раствора. Встряхиваемую колбу инкубировали при 33°С и 175 об/мин в течение примерно 16 часов, после чего 50 мл использовали для инокуляции ферментера.The shaken flask for preculture was inoculated with a frozen culture directly from 25% (w / v) glycerol stock solution. The shaken flask was incubated at 33 ° C and 175 rpm for about 16 hours, after which 50 ml was used to inoculate the fermenter.

ФерментацииFermentation

Ферментации проводили в 6 л самодельных ферментерах. Разовая загрузка среды (3 л) содержала:Fermentations were carried out in 6 l of homemade fermenters. A one-time loading medium (3 l) contained:

Кукурузный экстракт (50% dw)Corn Extract (50% dw) 40 г/л40 g / l Экстракт дрожжей, BioSpringer 153 (50% dw)Yeast Extract, BioSpringer 153 (50% dw) 10 г/л10 g / l NaClNaCl 5 г/л5 g / l CaCl₂·2H₂OCaCl ₂ · 2H ₂ O 0,25 г/л0.25 g / l Mn(NO₃)₂·H₂OMn (NO ₃ ) ₂ · H ₂ O 0,2 г/л0.2 g / l Антивспениватель SIN260Antifoam SIN260 1 мл/л1 ml / l Канамицин (стерилизован фильтрацией в ферментер после автоклавирования)Kanamycin (sterilized by filtration into a fermenter after autoclaving) 50 мг/л50 mg / l

Сырье содержало:Raw materials contained:

Моногидрат глюкозыGlucose monohydrate 540 г/кг540 g / kg MnSO₄·7H₂OMnSO ₄ · 7H ₂ O 4,8 г/кг4.8 g / kg Антивспениватель SIN260Antifoam SIN260 4 мл/кг4 ml / kg Экстракт дрожжей, BioSpringer 153 (50% dw) (автоклавирован отдельно)Yeast Extract, BioSpringer 153 (50% dw) (autoclaved separately) 150 г/кг150 g / kg

Подачу питания при ферментации ВАС0318 и ВАС0323 начинали, основываясь на накоплении СО₂ согласно приведенным ниже уравнениям:The fermentation feed BAC0318 and BAC0323 was started based on the accumulation of CO ₂ according to the equations below:

Питание-поток [г/час] = 0, Ак.СО₂ < 0,15Power flow [g / h] = 0, Ac.CO ₂ <0.15

Питание-поток [г/час] = 2,85+t×1,54, Ак.СО₂ ≥ 0,15 и t < 12Power flow [g / h] = 2.85 + t × 1.54, Ac.CO ₂ ≥ 0.15 and t <12

Питание-поток [г/час] = 21,3, t > 12Power flow [g / h] = 21.3, t> 12

t - время (часы) с того момента, когда накопление СО₂ (Ак.СО₂) достигло 0,15 молейt - time (hours) from the moment when the accumulation of CO ₂ (Ac.CO ₂ ) reached 0.15 moles

Подачу питания при ферментации ВАС0319 и ВАС0324 начинали, основываясь на накоплении СО₂ согласно приведенным ниже уравнениям:The fermentation feed BAC0319 and BAC0324 was started based on the accumulation of CO ₂ according to the equations below:

Питание-поток [г/час] = 2,0+t×1,08, Ак.СО₂ ≥ 0,15 и t < 12Power flow [g / h] = 2.0 + t × 1.08, Ac.CO ₂ ≥ 0.15 and t <12

Питание-поток [г/час] = 15, t > 12Power flow [g / h] = 15, t> 12

Величину рН поддерживали при 7,0 добавлением 12,5% (мас./об.) NH₃-вода или 2 М фосфорной кислоты.The pH was maintained at 7.0 by the addition of 12.5% (w / v) NH ₃ water or 2 M phosphoric acid.

Аэрация составляла 3 л/мин, соответствуя 1 vvm.Aeration was 3 l / min, corresponding to 1 vvm.

Температура была 33°С.The temperature was 33 ° C.

Ферментер был оборудован двумя 8 см ⌀ крыльчатками Раштона, размещенными на расстоянии 10 см.The fermenter was equipped with two 8 cm ⌀ Rushton impellers placed at a distance of 10 cm.

Биомассу удаляли центрифугированием при 16000 g в течение 10 минут при комнатной температуре. Супернатант стерилизовали фильтрацией и фильтрат использовали для очистки и опытов по применению.Biomass was removed by centrifugation at 16,000 g for 10 minutes at room temperature. The supernatant was sterilized by filtration and the filtrate was used for purification and application experiments.

Пример 6: Тесты по применению для яичного желткаExample 6: Application Tests for Egg Yolk

В следующих опытах выделенную трансферазу из Aeromonas salmonicida, экспрессированной в E. coli, испытывали на одном яичном желтке и на яичном желтке, куда был добавлен растительный стерол.In the following experiments, isolated transferase from Aeromonas salmonicida expressed in E. coli was tested on one egg yolk and on egg yolk, to which plant sterol was added.

МатериалMaterial

Трансфераза из Aeromonas salmonicida REF#138Transferase from Aeromonas salmonicida REF # 138

Яичный желток из свежих яиц (куриные яйца)Egg yolk from fresh eggs (chicken eggs)

Растительный стерол: β-ситостерол, Sigma S 5753Plant Sterol: β-sitosterol, Sigma S 5753

Пластины ТСХ: пластины из диоксида кремния, Merck № 1.05715.0001TLC plates: silica plates, Merck No. 1.05715.0001

Анализ ТСХTLC analysis

Пластины ТСХ активировали в нагретом шкафу (110°С) в течение 1/2 часа.TLC plates were activated in a heated cabinet (110 ° C) for 1/2 hour.

100 мл проявляющего растворителя выливали в хроматографическую камеру с крышкой. Стенки камеры были покрыты фильтровальной бумагой (Whatman 2) для того, чтобы насытить камеру парами растворителя.100 ml of developing solvent was poured into a chromatographic chamber with a lid. The walls of the chamber were covered with filter paper (Whatman 2) in order to saturate the chamber with solvent vapor.

Пластины ТСХ помещали в рамку и пробу наносили на 2 см пластину ТСХ со дна. Затем пластину ТСХ помещали в камеру ТСХ с проявляющим растворителем. Когда проявляющий растворитель достигал отметки 14 см от дна пластины, пластину вынимали и сушили в вытяжном шкафу и затем помещали в сушильный шкаф при 110°С на 10 минут.TLC plates were framed and the sample was applied to a 2 cm TLC plate from the bottom. Then, a TLC plate was placed in a TLC chamber with a developing solvent. When the developing solvent reached 14 cm from the bottom of the plate, the plate was removed and dried in a fume hood and then placed in an oven at 110 ° C. for 10 minutes.

Затем пластину ТСХ погружали в проявляющий реагент и сушили в сушильном шкафу при 110°С в течение 15 минут.The TLC plate was then immersed in a developing reagent and dried in an oven at 110 ° C. for 15 minutes.

Проявляющий растворительDeveloping solvent

№ IV: хлороформ:метанол:Н₂О (65:25:4)No. IV: chloroform: methanol: H ₂ O (65: 25: 4)

№ I: Ph-эфир:МТБЭ:уксусная кислота (60:40:1)No. I: Ph-ether: MTBE: acetic acid (60: 40: 1)

Проявляющий буфер (ванадатный буфер)Developing buffer (vanadate buffer)

32 г Na₂CO₃ и 300 мл Н₂О (1 М)32 g of Na ₂ CO ₃ and 300 ml of H ₂ O (1 M)

Добавляли 18,2 г пентоксида ванадия (V₂O₅) и растворяли при мягком нагреве.18.2 g of vanadium pentoxide (V ₂ O ₅ ) were added and dissolved by gentle heating.

Раствор охлаждали до комнатной температуры.The solution was cooled to room temperature.

Осторожно добавляли 460 мл 2,5М H₂SO₄ (460 мл Н₂О + 61 мл H₂SO₄).460 ml of 2.5M H ₂ SO ₄ (460 ml of H ₂ O + 61 ml of H ₂ SO ₄ ) were carefully added.

Добавляли воду до 1000 мл.Water was added to 1000 ml.

Фосфолипазная активностьPhospholipase activity

СубстратSubstrate

0,6% 95% растительного L-α-фосфатидилхолина (Avanti # 441601) + 0,4% Triton-X 100 (Sigma X-100) + 5 мМ CaCl₂ растворяли в 0,05 М буфере HEPES pH 7,0.0.6% 95% plant L-α-phosphatidylcholine (Avanti # 441601) + 0.4% Triton-X 100 (Sigma X-100) + 5 mM CaCl _{2 was} dissolved in 0.05 M HEPES pH 7.0 buffer.

ПроцедураProcedure

400 мкл субстрата добавляли в пробирку Эппендорфа и помещали в термомиксер Эппендорфа при 30°С на 5 минут.400 μl of substrate was added to an Eppendorf tube and placed in an Eppendorf thermomixer at 30 ° C for 5 minutes.

В момент Т=0 добавляли 50 мкл раствора фермента. Анализировали также контроль с водой вместо фермента.At T = 0, 50 μl of enzyme solution was added. Also analyzed the control with water instead of the enzyme.

Пробу смешивали при 1000 об/мин в термомиксере Эппендорфа при 30°С в течение 10 минут. В момент Т=10 мин пробирку Эппендорфа помещали в другой термомиксер при 99°С на 10 минут для того, чтобы остановить реакцию.The sample was mixed at 1000 rpm in an Eppendorf thermomixer at 30 ° C for 10 minutes. At T = 10 min, the Eppendorf tube was placed in another thermomixer at 99 ° C for 10 minutes in order to stop the reaction.

Свободную жирную кислоту в пробе анализировали, используя набор NEFA от Wako Gmbh.Free fatty acid in the sample was analyzed using a Wako Gmbh NEFA kit.

Ферментную активность PLU-7 рассчитывали как количество микромолей жирной кислоты, продуцированное в минуту при условиях анализа.The enzymatic activity of PLU-7 was calculated as the number of micromoles of fatty acid produced per minute under assay conditions.

Экстракция липидаLipid extraction

1 г яичного желтка и 7,5 мл смеси хлороформ:метанол 2:1 смешивали в смесителе Whirley и центрифугировали при 7,5 g в течение 10 минут.1 g of egg yolk and 7.5 ml of a chloroform: methanol 2: 1 mixture were mixed in a Whirley mixer and centrifuged at 7.5 g for 10 minutes.

Выделяли 3 мл хлороформовой фазы и использовали для последующего анализа липида.3 ml of the chloroform phase was isolated and used for subsequent lipid analysis.

Результатыresults

Трансферазу (REF#138) из Aeromonas salmonicida, экспрессированную в E. coli, анализировали на фосфолипазную активность, как описано выше, и анализировали также в яичном желтке с β-ситостеролом и без него. Пробу перемешивали магнитной мешалкой во время реакции. Картина эксперимента показана в таблице 1.The transferase (REF # 138) from Aeromonas salmonicida expressed in E. coli was analyzed for phospholipase activity, as described above, and also analyzed in egg yolk with and without β-sitosterol. The sample was stirred with a magnetic stirrer during the reaction. The picture of the experiment is shown in table 1.

Таблица 1Table 1 ОпытExperience Время реакции при 37°СReaction time at 37 ° C Яичный желтокEgg yolk СитостеролSitosterol Трансфераза #138Transferase # 138 №No. минутыminutes гg мгmg единицыunits 1one 30thirty 1one 4040 22 30thirty 1one 4040 0,75 PLU0.75 PLU 33 30thirty 1one 8080 0,75 PLU0.75 PLU 4four 120120 1one 4040 0,75 PLU0.75 PLU 55 120120 1one 8080 0,75 PLU0.75 PLU 66 300300 1one 4040 0,75 PLU0.75 PLU 77 300300 1one 4040 0,75 PLU0.75 PLU 88 300300 1one

Реакцию останавливали, добавляя 7,5 мл смеси хлороформ:метанол (2:1), и перемешивали в смесителе Whirley в течение 30 секунд. Хлороформовую фазу выделяли центрифугированием и 2 мкл хлороформовой фазы переносили на предварительно активированную кремнеземную пластину ТСХ и элюировали проявляющим растворителем № I, а другую пластину ТСХ - проявляющим растворителем № IV.The reaction was stopped by adding 7.5 ml of a mixture of chloroform: methanol (2: 1), and stirred in a Whirley mixer for 30 seconds. The chloroform phase was isolated by centrifugation and 2 μl of the chloroform phase was transferred to a preactivated silica TLC plate and eluted with a developing solvent No. I, and another TLC plate with a developing solvent No. IV.

Результаты анализа ТСХ показаны на фиг.45 и 46.TLC analysis results are shown in FIGS. 45 and 46.

Реакция трансферазы для трансферазы из Aeromonas salmonicida в яичном желтке, куда был добавлен растительный стерол, показала, что фермент переносит жирную кислоту от лецитина в яичном желтке к холестерину во время образования эфира холестерина. Хроматограмма ТСХ также показывает, что часть добавленного к яичному желтку стерола была переведена в эфир холестерина.The transferase reaction for transferase from Aeromonas salmonicida in egg yolk, to which plant sterol was added, showed that the enzyme transfers fatty acid from lecithin in egg yolk to cholesterol during the formation of cholesterol ester. The TLC chromatogram also shows that part of the sterol added to the egg yolk was transferred to cholesterol ether.

Количество эфира стерола относительно количества эфира холестерина, образовавшегося во время реакции, может быть проанализировано ЖХВР или ГЖХ.The amount of sterol ester relative to the amount of cholesterol ester formed during the reaction can be analyzed by HPLC or GLC.

Известно, что эфиры растительных стеролов уменьшают поглощение холестерина в кишечнике. Когда к яичному желтку добавляют трансферазу и растительный стерол, получают продукт, вызывающий уменьшенное поглощение холестерина, и в то же время получают лизолецитин, который улучшает эмульгационные свойства яичного желтка. Дополнительным преимуществом добавления трансферазы и растительного стерола к яичному желтку является то, что эфир растительного стерола поглощается вместе с естественно доступным холестерином, что, как ожидается, должно оказать более сильный эффект в снижении абсорбции холестерина.Plant sterol esters are known to reduce intestinal cholesterol absorption. When transferase and plant sterol are added to the egg yolk, a product is produced that causes reduced cholesterol absorption, and at the same time, lysolecithin is obtained, which improves the emulsification properties of the egg yolk. An additional advantage of adding transferase and plant sterol to egg yolk is that plant sterol ether is absorbed along with naturally available cholesterol, which is expected to have a stronger effect in lowering cholesterol absorption.

Пример 7: Модификация яичного желтка липид-ацилтрансферазой из Aeromonas salmonicida Example 7: Modification of Egg Yolk by Lipid Acyltransferase from Aeromonas salmonicida

В соответствии с настоящим изобретением теперь было показано, что возможно получить лизолецитин из яичного желтка без существенного образования свободной жирной кислоты при применении трансферазы.In accordance with the present invention, it has now been shown that it is possible to obtain lysolecithin from egg yolk without significant formation of free fatty acid when using transferase.

Лецитин, содержащийся в яичном желтке, является важным эмульгатором при приготовлении майонеза с тем ограничением, что майонез не является стабильным при нагревании. Поэтому в течение нескольких лет было известно применение фосфолипазы из поджелудочной железы для модификации лецитина яичного желтка в лизолецитин, который является более эффективным эмульгатором. Применение ферментативно модифицированного яичного желтка при приготовлении майонеза приводит к лучшей термической стабильности майонеза во время пастеризации. Ограничением применения поджелудочной фосфолипазы для яичного желтка является то, что количество свободной жирной кислоты также увеличивается, что приводит к пониженной окислительной стабильности, так как свободные жирные кислоты являются более подверженными окислению, чем соответствующие эфиры. Свободная жирная кислота может также вызывать мыльный привкус.The lecithin contained in egg yolk is an important emulsifier in the preparation of mayonnaise with the limitation that mayonnaise is not stable when heated. Therefore, for several years it was known to use phospholipase from the pancreas to modify egg yolk lecithin into lysolecithin, which is a more effective emulsifier. The use of enzymatically modified egg yolk in the preparation of mayonnaise leads to better thermal stability of mayonnaise during pasteurization. A limitation of the use of pancreatic phospholipase for egg yolk is that the amount of free fatty acid also increases, which leads to reduced oxidative stability, since free fatty acids are more susceptible to oxidation than the corresponding esters. Free fatty acid can also cause a soapy taste.

Трансфераза из Aeromonas salmonicida была успешно экспрессирована в B. subtilis и ферментирована в лабораторном масштабе, как описано в примере 5, очищена жидкостной хроматографией и использована для модификации липидов яичного желтка. Ферментативно модифицированный яичный желток был использован для приготовления термически стабильного майонеза.The transferase from Aeromonas salmonicida was successfully expressed in B. subtilis and fermented on a laboratory scale as described in Example 5, purified by liquid chromatography and used to modify egg yolk lipids. An enzymatically modified egg yolk was used to make the thermally stable mayonnaise.

Трансфераза из A. salmonicida может быть использована для получения лизолецитина и эфира холестерина в яичном желтке без образования значительных количеств свободных жирных кислот, иначе говоря, без увеличения или без существенного увеличения содержания свободных жирных кислот в пищевом продукте.Transferase from A. salmonicida can be used to produce lysolecithin and cholesterol ester in egg yolk without the formation of significant amounts of free fatty acids, in other words, without or without a significant increase in the content of free fatty acids in the food product.

Ферментативно модифицированный яичный желток, полученный с трансферазой, показал улучшенные эмульгационные свойства и может быть применен для термически стабильного майонеза.The enzymatically modified egg yolk obtained with transferase showed improved emulsification properties and can be used for thermally stable mayonnaise.

Этот фермент является высоко функциональным при модификации яичного желтка, катализируя реакцию переноса липида между лецитином и холестерином (фиг.47).This enzyme is highly functional in the modification of egg yolk, catalyzing the lipid transfer reaction between lecithin and cholesterol (Fig. 47).

В этом исследовании дополнительно изучали применение трансферазы для модификации яичного желтка и применение модифицированного яичного желтка при приготовлении термически стабильного майонеза.This study further examined the use of transferase to modify egg yolk and the use of modified egg yolk in the preparation of thermally stable mayonnaise.

Этот пример описывает ферментацию, выделение и ввод трансферазы в яичные желтки, а также ввод ферментативно модифицированного яичного желтка в майонез. Пример подразделяется на две части:This example describes the fermentation, isolation and introduction of transferase into egg yolks, as well as the introduction of enzymatically modified egg yolk into mayonnaise. The example is divided into two parts:

А. Ввод трансферазы в яичный желтокA. Enter transferase into egg yolk

В. Испытание ферментативно модифицированного яичного желтка в майонезеB. Test enzymatically modified egg yolk in mayonnaise

Экспериментальная частьexperimental part

А. ВводA. Entry

Фермент и субстратEnzyme and substrate

Трансфераза # 178-9 из A. salmonicida, очистка 2554-100 С73, 15 PLU-7/мл.Transferase # 178-9 from A. salmonicida , purification 2554-100 C73, 15 PLU-7 / ml.

Трансфераза # 179 из A. salmonicida, 18,5 PLU-7/мл.Transferase # 179 from A. salmonicida , 18.5 PLU-7 / ml.

Фосфолипаза А1 LECITASE™ Ultra (Novozymes A/S, Denmark).Phospholipase A1 LECITASE ™ Ultra (Novozymes A / S, Denmark).

Яичный желток: жидкий яичный желток с 8% соли, SANOVA FOODS, DK.Egg yolk: liquid egg yolk with 8% salt, SANOVA FOODS, DK.

Анализ ТСХ проводили, как описано ранее (см. выше пример 6).TLC analysis was performed as described previously (see Example 6 above).

Фосфолипазная активность: см. предыдущие примеры.Phospholipase activity: see previous examples.

Экстракция липидовLipid extraction

4 мл хлороформовой фазы выделяли и использовали для последующего анализа липида.4 ml of the chloroform phase was isolated and used for subsequent lipid analysis.

Испытание окислительной стабильностиOxidative Stability Test

Окислительную стабильность майонеза определяли в установке ML OXYPRESS, где образец подвергали окислительному стрессу посредством нагревания под давлением в атмосфере кислорода.The oxidative stability of mayonnaise was determined in a ML OXYPRESS apparatus, where the sample was subjected to oxidative stress by heating under pressure in an oxygen atmosphere.

Спустя некоторое время, называемое периодом индукции (ПИ), окисление образца вызывает определенное расходование кислорода, что регистрируется как изменение давления по датчику давления. Более длительный период индукции указывает на лучшую окислительную стабильность.After some time, called the induction period (PI), the oxidation of the sample causes a certain consumption of oxygen, which is recorded as a change in pressure by the pressure sensor. A longer induction period indicates better oxidative stability.

ПроцедураProcedure

5 г майонеза помещали в стеклянный сосуд и стеклянный сосуд закрывали датчиком давления. Сосуд заполняли кислородом под давлением 5 бар. Вентиль открывали, чтобы опорожнить сосуд. Данную процедуру повторяли дважды и образец с 5 бар атмосферы кислорода помещали в температуру 80°С. Измеряли давление кислорода как функцию времени и рассчитывали период индукции в часах.5 g of mayonnaise was placed in a glass vessel and the glass vessel was closed with a pressure sensor. The vessel was filled with oxygen at a pressure of 5 bar. The valve was opened to empty the vessel. This procedure was repeated twice and a sample with 5 bar of oxygen atmosphere was placed at a temperature of 80 ° C. The oxygen pressure was measured as a function of time and the induction period in hours was calculated.

Результатыresults

Образцы очищенной трансферазы от Aeromonas salmonicide # 179 и 178-9 использовали для обработки яичного желтка, как представлено в таблице 2. Начальное испытание показало, что трансфераза GCAT должна быть введена с намного более низкой фосфолипазной (PLU) активностью, чем у продажной фосфолипазы. Это объясняется тем фактом, что GCAT является трансферазой и потому имеет намного более низкую гидролитическую активность, чем обычная фосфолипаза.Samples of purified transferase from Aeromonas salmonicide # 179 and 178-9 were used to treat egg yolk as shown in Table 2. An initial test showed that GCAT transferase should be administered with much lower phospholipase (PLU) activity than commercial phospholipase. This is due to the fact that GCAT is a transferase and therefore has a much lower hydrolytic activity than regular phospholipase.

Таблица 2table 2 Яичный желток Sanofo, 8% солиSanofo Egg Yolk, 8% Salt 2344-44 С89 18,5 PLU-7/мл2344-44 C89 18.5 PLU-7 / ml Трансфераза #178-9Transferase # 178-9 #3108 Lecitase Ultra# 3108 Lecitase Ultra ВодаWater №No. Яичный желтокEgg yolk Трансфераза #179Transferase # 179 18,5PLU-7/мл18.5PLU-7 / ml 1500 PLU-7/мл1500 PLU-7 / ml гg гg гg млml гg PLU-7/млPLU-7 / ml 66 120120 2,002.00 8,008.00 0,310.31 77 120120 1010 00 1,251.25 88 120120 1,861.86 8,148.14 23,2523.25 99 120120 1010 00

Ферментативные реакции проводили отвешиванием яичного желтка и фермента в мензурку. Образцы помещали в нагревательную камеру при 37°С во время медленного перемешивания. После 1, 2 и 4 часов времени реакции пробы отбирали для анализа ТСХ. После 4 часов времени реакции продукт хранили при 5°С и использовали для опытов с майонезом.Enzymatic reactions were carried out by weighing the egg yolk and the enzyme into a beaker. Samples were placed in a heating chamber at 37 ° C during slow stirring. After 1, 2, and 4 hours of reaction time, samples were taken for TLC analysis. After 4 hours of reaction time, the product was stored at 5 ° C and used for experiments with mayonnaise.

Анализ ТСХ липидов, экстрагированных из обработанного ферментом яичного желтка, показан на фиг.48.TLC analysis of lipids extracted from the enzyme-treated egg yolk is shown in FIG.

Анализ ТСХ на фиг.48 показывает явное гидролитическое действие фосфолипазы #3108 на триглицерид во время образования свободных жирных кислот, а также некоторое количество моно- и диглицерида. Как кажется, фосфолипаза #3108 не оказывает влияния на холестерин. Оба образца трансферазы явно участвуют в образовании эфира холестерина одновременно со снижением содержания холестерина.The TLC analysis of FIG. 48 shows the apparent hydrolytic effect of phospholipase # 3108 on triglyceride during the formation of free fatty acids, as well as some mono- and diglyceride. It seems that phospholipase # 3108 has no effect on cholesterol. Both transferase samples are clearly involved in the formation of cholesterol ester simultaneously with a decrease in cholesterol.

D. Ферментативно модифицированный яичный желток в майонезеD. Enzyme-modified egg yolk in mayonnaise

Для того чтобы исследовать эффект модификации образцов яичного желтка, упомянутых в таблице 2, были проведены испытания по их применению в майонезе с содержанием жира 50%. Был приготовлен также майонез, содержащий необработанный яичный желток.In order to study the effect of the modification of the egg yolk samples mentioned in table 2, tests were carried out on their use in mayonnaise with a fat content of 50%. Mayonnaise was also prepared containing unprocessed egg yolk.

Целью исследования было определить влияние ферментативно модифицированных яичных желтков на эмульсионные свойства и влияние на термическую стабильность. Все образцы майонеза содержали одинаковое количество масла и эмульгировались только яичным желтком. Все образцы майонеза готовили с применением миксера Koruna (Disho V60/10) и нагревались во время приготовления до 95°С в течение 5 минут.The aim of the study was to determine the effect of enzymatically modified egg yolks on emulsion properties and the effect on thermal stability. All samples of mayonnaise contained the same amount of oil and were emulsified only with egg yolk. All samples of mayonnaise were prepared using a Koruna mixer (Disho V60 / 10) and heated during preparation to 95 ° C for 5 minutes.

Образцы майонеза (фиг.49), приготовленные с обработанным ферментом яичным желтком, были удачными и гомогенными без отделения масла. Контрольный образец разделялся на масляную и водную фазу.Samples of mayonnaise (Fig. 49), prepared with the enzyme-treated egg yolk, were successful and homogeneous without oil separation. The control sample was separated into an oil and water phase.

Размер частиц капелек масла в образцах майонеза с обработанным ферментом яичным желтком измеряли на Malvern Mastersizer. Образец смешивали с 0,1% SDS в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7, перед измерением. Показанием являлся средний размер частиц всех частиц, как показано в таблице 3.The particle size of oil droplets in mayonnaise samples with enzyme-treated egg yolk was measured on a Malvern Mastersizer. The sample was mixed with 0.1% SDS in 0.1 M phosphate buffer, pH 7, before measurement. The indication was the average particle size of all particles, as shown in table 3.

Таблица 3Table 3 ОпытExperience ФерментEnzyme Средний размер частиц, мкмThe average particle size, microns 66 Трансфераза #179, 0,31 PLU-7/гTransferase # 179, 0.31 PLU-7 / g 12,912.9 77 Трансфераза #178-9, 1,25 PLU-7/гTransferase # 178-9, 1.25 PLU-7 / g 7,27.2 88 #3108, Lecitase Ultra, 23 PLU-7/г# 3108, Lecitase Ultra, 23 PLU-7 / g 5,25.2

Результаты измерения размеров частиц ясно показывают эффект повышения дозировки трансферазы от A. salmonicida. При высокой дозе трансферазы размер частиц близок к майонезу, приготовленному с Lecitase Ultra. Надо, однако, учитывать, что Lecitase Ultra продуцирует много жирных кислот, что может привести к более тонкому распределению частиц.Particle size results clearly show the effect of increasing the transferase dosage from A. salmonicida . At a high dose of transferase, the particle size is close to mayonnaise prepared with Lecitase Ultra. However, keep in mind that Lecitase Ultra produces a lot of fatty acids, which can lead to a finer particle distribution.

Размер капелек масла в майонезе, приготовленном с ферментом, значительно мельче, чем размер капелек масла майонеза, приготовленного без фермента (т.е. контрольного майонеза).The droplet size of the mayonnaise prepared with the enzyme is much smaller than the droplet size of the mayonnaise made without the enzyme (i.e. the control mayonnaise).

Окислительная стабильностьOxidative Stability

Окислительную стабильность образцов майонеза 7 и 8 определяли на ML OXYPRESS с результатами, приведенными в таблице 4.The oxidative stability of samples of mayonnaise 7 and 8 was determined on ML OXYPRESS with the results shown in table 4.

Таблица 4Table 4 ОбразецSample Индукционный периодInduction period Индукционный периодInduction period Определение 1, часыDefinition 1, hours Определение 2, часыDefinition 2, hours 77 37,4437.44 38,0838.08 88 35,6835.68 35,5235.52

Измерение окислительной стабильности дало явную значительную разницу окислительной стабильности. Майонез с яичным желтком, обработанным трансферазой 178-9, имеет значительно лучшую окислительную стабильность, чем майонез с яичным желтком, обработанным Lecitase Ultra. Это может быть объяснено тем фактом, что Lecitase Ultra продуцирует больше свободных жирных кислот, которые более подвержены окислению, чем соответствующие эфиры жирных кислот.Measurement of oxidative stability gave a clear significant difference in oxidative stability. Mayonnaise with egg yolk treated with transferase 178-9 has significantly better oxidative stability than mayonnaise with egg yolk treated with Lecitase Ultra. This can be explained by the fact that Lecitase Ultra produces more free fatty acids, which are more prone to oxidation than the corresponding fatty acid esters.

Образцы яичных желтков, использованных для приготовления майонеза, экстрагировали хлороформом, и липиды из яичных желтков анализировали методом ГЖХ с результатами, показанными в таблице 5.Samples of egg yolks used to make mayonnaise were extracted with chloroform, and lipids from egg yolks were analyzed by GLC with the results shown in Table 5.

Таблица 5Table 5 ОпытExperience ФерментEnzyme Жирная кислотаFatty acid ХолестеринCholesterol Эфир холестеринаCholesterol ester ТриглицеридTriglyceride 66 Трансфераза #179Transferase # 179 0,960.96 0,940.94 0,490.49 23,9523.95 77 Трансфераза #178-9Transferase # 178-9 1,841.84 0,600.60 1,061.06 24,5424.54 88 #3108, Lecitase Ultra# 3108, Lecitase Ultra 14,0514.05 1,161.16 0,120.12 2,452.45 99 КонтрольThe control 0,480.48 1,161.16 0,130.13 22,8722.87

Результаты ГЖХ в таблице 5 подтверждают результаты анализа ТСХ, что Lecitase Ultra продуцирует очень большое количество свободных жирных кислот, и большая часть триглицерида гидролизуется. С другой стороны, трансфераза продуцирует лишь умеренное количество свободных жирных кислот, и триглицериды не гидролизуются. Это также ясно показывает, что трансфераза продуцирует эфир холестерина из холестерина.The GLC results in table 5 confirm the results of TLC analysis, that Lecitase Ultra produces a very large amount of free fatty acids, and most of the triglyceride is hydrolyzed. On the other hand, transferase produces only a moderate amount of free fatty acids, and triglycerides do not hydrolyze. It also clearly shows that transferase produces cholesterol ester from cholesterol.

Результаты показывают, что количество РС в "обработанном ферментом" майонезе понижено по сравнению с контрольным майонезом, тогда как количество LPC повышено в обработанном ферментом майонезе по сравнению с контрольным майонезом. Увеличение LPC может хорошо объяснить улучшенные эмульгационные свойства обработанного ферментом майонеза по сравнению с контрольным майонезом возможно благодаря тому, что холестерин был использован как молекула-акцептор в трансферазной реакции, приводящей в результате к увеличению количества эфиров холестерина в обработанном ферментом майонезе по сравнению с контрольным майонезом. Вдобавок, результаты показывают, что количество свободных жирных кислот не увеличивается значительно, когда яичный желток обрабатывают трансферазой. Результаты далее показывают, что количество свободных жирных кислот, образовавшихся в пищевом продукте, обработанном липид-ацилтрансферазой, значительно ниже, чем в пищевом продукте, обработанном контрольной фосфолипазой, и это справедливо, даже когда количество лизолецитина, образовавшегося в пищевых продуктах, одинаково.The results show that the amount of MS in the “enzyme-treated” mayonnaise is reduced compared to the control mayonnaise, while the amount of LPC is increased in the enzyme-treated mayonnaise compared to the control mayonnaise. An increase in LPC may well explain the improved emulsification properties of enzyme-treated mayonnaise compared to control mayonnaise, possibly because cholesterol was used as an acceptor molecule in the transferase reaction, resulting in an increase in the amount of cholesterol esters in enzyme-treated mayonnaise compared to control mayonnaise. In addition, the results show that the amount of free fatty acids does not increase significantly when the egg yolk is treated with transferase. The results further show that the amount of free fatty acids formed in a food product treated with lipid acyltransferase is significantly lower than in a food product treated with a control phospholipase, and this is true even when the amount of lysolecithin formed in food products is the same.

Пример 8: Действие трансферазы Aeromonas salmonicida в кексахExample 8: Effect of Aeromonas salmonicida transferase in cupcakes

Действие ацилтрансферазы GCAT из Aeromonas salmonicida испытывали на рецепте кекса. Фермент испытывали индивидуально и в сочетании с другими липолитическими ферментами. Ферменты добавляли к некоторым из ингредиентов кекса или добавляли вместе с другими ингредиентами перед замешиванием кекса.The effect of the GCAT acyltransferase from Aeromonas salmonicida was tested on a cupcake recipe. The enzyme was tested individually and in combination with other lipolytic enzymes. Enzymes were added to some of the cupcake ingredients or added together with other ingredients before kneading the cupcake.

Предварительные результаты показали, что ацилтрансфераза, соединенная с гидролизующим триглицерид ферментом, улучшает объем кекса и структуру мякиша по сравнению с контролем.Preliminary results showed that acyltransferase, coupled with a triglyceride hydrolyzing enzyme, improves cake volume and crumb structure compared to control.

В последующих экспериментах испытывали трансферазу из A. salmonicida и варианты поодиночке и в комбинации с гидролизующими триглицерид ферментами. Такие ферменты являются активными по отношению к липидным компонентам яйца и шортенинга, а также к углеводам, протеину, глицерину и холестерину (в яйце), которые образуют часть рецептуры кекса.In subsequent experiments, transferase from A. salmonicida and variants were tested individually and in combination with triglyceride hydrolyzing enzymes. Such enzymes are active against the lipid components of eggs and shortening, as well as to carbohydrates, protein, glycerin and cholesterol (in the egg), which form part of the cake formulation.

Материалы и методMaterials and Method

ФерментEnzyme

Ацилтрансфераза #179 из Aeromonas salmonicida Acyltransferase # 179 from Aeromonas salmonicida

Grindamyl EXEL 16, липаза из Thermomyces lanuginosus Grindamyl EXEL 16, Lipase from Thermomyces lanuginosus

Рецепт кексаCupcake Recipe

ИнгредиентIngredient %% гg Сахар 35/20Sugar 35/20 20,3720.37 204204 Мука для кондитерских изделий, AlbatrosPastry Flour, Albatros 18,1118.11 181181 Пшеничный крахмалWheat starch 5,215.21 5252 Пекарский порошокbaking powder 0,360.36 4four Пастеризованное жидкое целое яйцоPasteurized Liquid Whole Egg 22,6322.63 226226 Шортенинг Vegao (Aarhus United)Shortening Vegao (Aarhus United) 18,1118.11 181181 Сухая молочная сывороткаDry whey 0,680.68 77 Глюкозный сироп, 75% 42 DEGlucose Syrup, 75% 42 DE 4,534,53 4545 ГлицеринGlycerol 1,361.36 14fourteen СольSalt 0,320.32 33 Масло семян рапсаRapeseed Oil 6,346.34 6363 Сорбат калияPotassium sorbate 0,180.18 1,81.8

ОборудованиеEquipment

Миксер: Hobart N50 со шпателемMixer: Hobart N50 with spatula

Печь: хлебопечка SimonOven: Simon bread machine

ПроцедураProcedure

Все ингредиенты должны быть доведены до комнатной температуры.All ingredients should be brought to room temperature.

1. Взбить сахар и шортенинг в течение 3 минут - начало на 2-й скорости и переход на 3-ю скорость в течение 30 секунд.1. Beat sugar and shortening for 3 minutes - start at 2nd speed and switch to 3rd speed for 30 seconds.

2. Добавить оставшиеся ингредиенты - начало на 1-й скорости и переход на 2-ю скорость в течение 30 секунд - смешивать суммарно 5 минут.2. Add the remaining ingredients - start at 1st speed and switch to 2nd speed within 30 seconds - mix for a total of 5 minutes.

3. Отмерить объем болтушки в 1 дл чашку.3. Measure the volume of the talker into 1 dl cup.

4. Фунтовые формы для кекса обмазать масляной пастой "Babette" и покрыть бумагой.4. Spread pound cake molds with Babette butter paste and cover with paper.

5. Отвесить 2×350 г в фунтовые формы для кекса.5. Weigh 2 × 350 g into pound cake molds.

6. Равномерно размазать массу шпателем.6. Spread the mass evenly with a spatula.

7. Перед тем как поставить в печь, добавить струйку масла на верх кекса (по длине в середине для того, чтобы заставить кекс разломаться в середине).7. Before putting it into the oven, add a trickle of oil to the top of the cake (along the length in the middle in order to make the cake break in the middle).

8. Печь в течение 50 мин при 180°С.8. The furnace for 50 minutes at 180 ° C.

8. После выпекания вынуть формы из печи и "уронить" их на стол перед тем, как вынуть кекс из форм.8. After baking, remove the molds from the oven and “drop” them on the table before removing the cake from the molds.

10. Убрать бумагу с кексов и повернуть правильной стороной вверх.10. Remove the paper from the cupcakes and rotate the correct side up.

11. Охладить кексы на решетке в течение 60 мин перед взвешиванием и измерением объема.11. Cool the cupcakes on the wire rack for 60 minutes before weighing and measuring volume.

ПримечанияNotes

Используемый фермент (используемые ферменты) добавляют в начале смешения или добавляют к некоторым из ингредиентов кекса перед их добавлением к другим ингредиентам кекса.The enzyme used (enzymes used) is added at the beginning of mixing or added to some of the cake ingredients before being added to the other cake ingredients.

Ферменты являются активными только во время смешения или реакции компонентов кекса, и ферменты инактивируются во время выпекания кекса.Enzymes are active only during mixing or reaction of the cake components, and the enzymes are inactivated during cake baking.

Результатыresults

Следующие эксперименты были проведены так, как показано в следующей таблицеThe following experiments were performed as shown in the following table.

1one 22 33 4four Целое яйцоWhole egg гg 250250 250250 250250 250250 Глюкозный сироп, 75% DE 42Glucose Syrup, 75% DE 42 гg 1010 1010 1010 1010 Ацилтрансфераза #179, 26 PLU/млAcyltransferase # 179, 26 PLU / ml млml 2525 2525 Grindamyl EXEL 16Grindamyl EXEL 16 мгmg 37,537.5 37,537.5 ВодаWater 2525

Яйца, глюкозный сироп и фермент взаимодействовали в течение 30 минут при 37°С, и вскоре после этого яйца использовали для приготовления кекса согласно указанному выше рецепту.The eggs, glucose syrup and enzyme interacted for 30 minutes at 37 ° C, and shortly afterwards, the eggs were used to make the cake according to the above recipe.

Предварительные результаты показали, что комбинация ацилтрансферазы и гидролизующей триглицериды липазы из Thermomyces lanuginosus улучшает объем кекса, а также структура мякиша, пищевые качества и внешний вид улучшаются по сравнению с водным контролем. Предварительные результаты показывают, что для кекса может быть предпочтительно использовать комбинацию липид-ацилтрансферазы и липазы.Preliminary results showed that the combination of acyltransferase and hydrolyzing lipase triglycerides from Thermomyces lanuginosus improves the volume of the cake, as well as the crumb structure, nutritional quality and appearance are improved compared to the water control. Preliminary results indicate that for a cake, a combination of lipid acyltransferase and lipase may be preferable.

Пример 9: Целью этих опытов являлось испытание трансферазы из A. hydrophila, экспрессированной в E. coli Example 9: The purpose of these experiments was to test the transferase from A. hydrophila expressed in E. coli

Трансферазную реакцию A. hydrophila #135 (0,5 NEFA-PLU/мл) испытывали на яичном желтке. Параметры эксперимента представлены в таблице 6.The transferase reaction of A. hydrophila # 135 (0.5 NEFA-PLU / ml) was tested on egg yolk. The experimental parameters are presented in table 6.

Таблица 6Table 6 Время реакцииReaction time Яичный желтокEgg yolk Концентрация #135Concentration # 135 №No. минутыminutes гg единицы PLU-NEFAunits PLU-NEFA 1one 30thirty 1one 0,0000,000 22 30thirty 22 0,1000,100 33 6060 22 0,1000,100 4four 150150 22 0,1000,100 55 240240 22 0,1000,100 66 15601560 22 0,1000,100 77 15601560 1one 0,0000,000

Яичный желток нагревали до 37°С и добавляли фермент. По истечении времени реакции добавляли 7 мл смеси CHCl₃:метанол 2:1 и перемешивали в миксере Whirley в течение 30 сек.The egg yolk was heated to 37 ° C and an enzyme was added. After the reaction time, 7 ml of a mixture of CHCl ₃ : methanol 2: 1 was added and stirred in a Whirley mixer for 30 sec.

Образец центрифугировали при 800 g в течение 10 минут и отделяли нижнюю фазу растворителя. 2 мкл этой пробы наносили на кремнеземную пластину ТСХ и элюировали элюирующим растворителем IV. Результаты анализа ТСХ показаны на фиг.50 и 51.The sample was centrifuged at 800 g for 10 minutes and the lower solvent phase was separated. 2 μl of this sample was applied to a TLC silica wafer and eluted with an eluting solvent IV. TLC analysis results are shown in FIGS. 50 and 51.

Методики и материалы, упомянутые в этом примере, являются теми, которые подробно описаны в приведенных выше примерах.The techniques and materials mentioned in this example are those that are described in detail in the above examples.

Пробы от этого эксперимента анализировали также методом ГЖХ в виде TMS-производных. Результаты анализа ГЖХ показаны в таблице 7.Samples from this experiment were also analyzed by GLC in the form of TMS derivatives. The results of the GLC analysis are shown in table 7.

Таблица 7Table 7
ГЖХ анализ липидов из яичного желткаGLC analysis of egg yolk lipids №No. Время реакцииReaction time Концентрация трансферазы #135Transferase Concentration # 135 единиц/г яичного желткаunits / g egg yolk Свободная жирная кислотаFree fatty acid ХолестеринCholesterol Эфир холестеринаCholesterol ester минmin %% %% %% 77 контрольthe control 00 0,250.25 2,882.88 0,340.34 33 6060 0,0250,025 0,250.25 2,682.68 0,560.56 4four 150150 0,0250,025 0,290.29 1,851.85 1,721.72 55 240240 0,0250,025 0,530.53 1,421.42 3,543,54 66 15601560 0,0250,025 0,950.95 0,30.3 4,434.43

Из ГЖХ анализа свободной жирной кислоты, холестерина и эфира холестерина можно рассчитать молярную концентрацию каждого компонента и рассчитать % трансферазной активности, который показан в таблице 7.From the GLC analysis of free fatty acid, cholesterol and cholesterol ester, you can calculate the molar concentration of each component and calculate the% transferase activity, which is shown in table 7.

Расчет % трансферазной активностиCalculation of% Transferase Activity

Из результатов увеличения содержания свободной жирной кислоты, эфира стерола рассчитывают:From the results of an increase in the content of free fatty acid, sterol ester, the following are calculated:

Δ % жирной кислоты = % жирной кислоты (фермент) - % жирной кислоты (контроль),Δ% fatty acid =% fatty acid (enzyme) -% fatty acid (control),

Δ % эфира стерола = % эфира стерола (фермент) - % эфира стерола (контроль).Δ% sterol ether =% sterol ether (enzyme) -% sterol ether (control).

Трансферазную активность рассчитывают как % от общей ферментативной активности:Transferase activity is calculated as% of total enzymatic activity:

% трансферазной активности =% transferase activity =

где:Where:

Mv эфира стерола = средний молекулярный вес эфиров стерола;Mv of sterol ester = average molecular weight of sterol esters;

Mv жирной кислоты = средний молекулярный вес жирных кислот.Mv fatty acid = average molecular weight of fatty acids.

Таблица 8Table 8
Трансферазная активность A. hydrophila #135 в яичном желткеTransferase activity of A. hydrophila # 135 in egg yolk №No. Время реакцииReaction time Концентрация трансферазы #135Transferase Concentration # 135 единиц/г яичного желткаunits / g egg yolk Свободная жирная кислотаFree fatty acid ХолестеринCholesterol Эфир холестеринаCholesterol ester Транс феразная активностьTransferase activity минmin мМmm мМmm мМmm %% 77 контрольthe control 00 8,98.9 74,574.5 5,35.3 -- 33 6060 0,050.05 8,98.9 69,369.3 8,78.7 100one hundred 4four 150150 0,050.05 10,410,4 47,847.8 26,526.5 9393 55 240240 0/0505/05 18,918.9 36,736.7 54,654.6 7777 66 15601560 0,050.05 33,933.9 7,87.8 68,468,4 4848

И анализ ТСХ, и анализ ГЖХ подтверждают, что первоначально трансферазная реакция A. hydrophila #135 является доминирующей реакцией. Спустя 150 минут времени реакции появляется некоторая гидролитическая активность. Спустя 1560 минут трансферазная реакция и гидролитическая реакция почти достигают одинакового уровня. Результаты также показывают, что до тех пор, пока молекула-акцептор холестерин является доступной, трансферазная реакция является доминирующей реакцией. Когда концентрация холестерина понижается, гидролитическая активность становится более доминирующей.Both TLC analysis and GLC analysis confirm that the initial transferase reaction of A. hydrophila # 135 is the dominant reaction. After 150 minutes of reaction time, some hydrolytic activity appears. After 1560 minutes, the transferase reaction and the hydrolytic reaction almost reach the same level. The results also show that as long as the cholesterol acceptor molecule is available, the transferase reaction is the dominant reaction. When cholesterol concentration decreases, hydrolytic activity becomes more dominant.

Пример 10: Анализ для измерения трансферазной активности с использованием яичного желтка в качестве субстрата (называемый здесь далее "проба яичного желтка")Example 10: Assay for measuring transferase activity using egg yolk as a substrate (hereinafter referred to as “egg yolk sample”)

Липид-ацилтрансферазу выделяли из Aeromonas salmonicida и экспрессировали в Bacillus subtilis. Целью этого исследования является разработка аналитического метода, с помощью которого можно было бы измерить и трансферазную, и гидролитическую активность ферментов, и из таких анализов было бы возможно определить и трансферазную, и гидролитическую активность ферментов, используя субстрат, который содержит лецитин и холестерин.Lipid acyltransferase was isolated from Aeromonas salmonicida and expressed in Bacillus subtilis . The aim of this study is to develop an analytical method with which it would be possible to measure both the transferase and hydrolytic activity of enzymes, and from such analyzes it would be possible to determine both the transferase and hydrolytic activity of enzymes using a substrate that contains lecithin and cholesterol.

В этой работе в качестве субстрата для анализа фермента использовали яичный желток, поскольку яичный желток содержит и лецитин, и холестерин, и известно, что трансферазы и фосфолипазы очень хорошо работают в этом субстрате.In this work, egg yolk was used as a substrate for enzyme analysis, since egg yolk contains both lecithin and cholesterol, and it is known that transferases and phospholipases work very well in this substrate.

Препятствием для использования яичного желтка является то, что этот субстрат является сложной смесью воды, липидов и протеинов. Липидные компоненты включают глицериды 66,2%, фосфолипиды 29,6% и холестерин 4,2%. Фосфолипиды состоят из 73% лецитина, 15% цефалина и 12% других фосфолипидов. Из жирных кислот 33% являются насыщенными и 67% являются ненасыщенными, включая 42% олеиновой кислоты и 7% линолевой кислоты (см. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, Inc.).An obstacle to using egg yolk is that this substrate is a complex mixture of water, lipids and proteins. Lipid components include glycerides 66.2%, phospholipids 29.6% and cholesterol 4.2%. Phospholipids are composed of 73% lecithin, 15% cephalin and 12% other phospholipids. Of the fatty acids, 33% are saturated and 67% are unsaturated, including 42% oleic acid and 7% linoleic acid (see Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, Inc.).

Можно ожидать некоторых вариаций в составе яичного желтка. Однако в литературе (Biochimica et Biophysica Acta, 1124 (1992) 205-222) упоминается, что: "зрелый яичный желток домашних кур обладает замечательно постоянным составом липидов и липопротеинов несмотря на многочисленные вариации в условиях кормления и окружающей среды", и далее указывается: "В результате яичный желток является пищевым продуктом почти постоянного состава, который служит поддержанию его химических и физико-химических свойств для надежного применения в хлебопекарной, косметической и фармацевтической промышленности".You can expect some variations in the composition of the egg yolk. However, in the literature (Biochimica et Biophysica Acta, 1124 (1992) 205-222), it is mentioned that: "the mature egg yolk of domestic chickens has a remarkably constant composition of lipids and lipoproteins despite numerous variations in feeding and environmental conditions", and further indicates: "As a result, egg yolk is an almost constant food product that serves to maintain its chemical and physico-chemical properties for reliable use in the bakery, cosmetic and pharmaceutical industries."

Эта ссылка указывает, что состав яичного желтка очень постоянен, и поэтому было решено использовать желток куриного яйца в качестве субстрата для пробы яичного желтка.This reference indicates that the composition of the egg yolk is very constant, and therefore it was decided to use the chicken yolk as a substrate for the egg yolk sample.

Количественное определение продуктов реакции липидов от ферментативной обработки яичного желтка проводили путем экстракции липидов из субстрата с последующим анализом ГЖХ липидных компонентов.Quantification of the reaction products of lipids from the enzymatic treatment of egg yolk was carried out by extraction of lipids from the substrate, followed by GLC analysis of lipid components.

ПроцедураProcedure

МатериалыMaterials

Яичный желток: пастеризованный жидкий яичный желток от Danæg Products A/S, DK-4000 Roskilde.Egg yolk: pasteurized liquid egg yolk from Danæg Products A / S, DK-4000 Roskilde.

Буфер HEPES Sigma, кат. номер Н 3375.HEPES Sigma buffer, cat. number H 3375.

Хлороформ, чда.Chloroform, chd.

ФерментыEnzymes

Очищенная липид-ацилтрансфераза из A. salmonicida #178-9Purified lipid acyltransferase from A. salmonicida # 178-9

Липаза Thermomyces languginosus. Grindamyl EXEL 16, там же, номер 147060 (контроль) Thermomyces languginosus lipase . Grindamyl EXEL 16, ibid., Number 147060 (control)

Анализ фермента с субстратом яичного желткаEnzyme analysis with egg yolk substrate

5 г жидкого яичного желтка отвешивали в 20 мл стакан Витона и нагревали до 35°С. Добавляли 0,25 мл раствора фермента и запускали секундомер.5 g of a liquid egg yolk was weighed into a 20 ml glass of Viton and heated to 35 ° C. 0.25 ml of the enzyme solution was added and the stopwatch started.

Через регулярные промежутки времени пробы по 0,5 г переносили в 10 мл стакан Драма. Добавляли 20 мкл 4 М HCl, чтобы остановить ферментативную реакцию и подкислить мыло жирной кислоты.At regular intervals, 0.5 g samples were transferred to a 10 ml glass Dram. 20 μl of 4 M HCl was added to stop the enzymatic reaction and acidify the fatty acid soap.

Добавляли 3 мл хлороформа и пробу перемешивали в миксере Whirley в течение 30 сек.3 ml of chloroform was added and the sample was stirred in a Whirley mixer for 30 sec.

Пробу центрифугировали при 3000g в течение 10 мин и 0,8 мл хлороформовой фазы переносили в тарированный стакан Драма. Хлороформ выпаривали при 60°С под парами азота. Стакан Драма вновь взвешивали.The sample was centrifuged at 3000g for 10 min and 0.8 ml of the chloroform phase was transferred into a calibrated Dram glass. Chloroform was evaporated at 60 ° C under nitrogen vapor. The glass of Drama was weighed again.

Выделенные липиды анализировали методами ГЖХ и ТСХ.The isolated lipids were analyzed by GLC and TLC.

Анализ ТСХ - как описано здесь.TLC analysis - as described here.

Анализ ГЖХ - как описано здесь.GLC analysis - as described here.

Результатыresults

Для пробы яичного желтка и использованием яичного желтка в качестве субстрата были проведены опыты, представленные в таблице 9.For samples of egg yolk and using egg yolk as a substrate, the experiments were performed, are presented in table 9.

Таблица 9Table 9 1one 22 33 Яичный желток, жидкийLiquid egg yolk гg 55 55 55 Трансфераза #178-9, PLU-7/мл*Transferase # 178-9, PLU-7 / ml * млml 0,250.25 Липаза T. lanuginosus, 200 LIPU/мл Lipase T. lanuginosus , 200 LIPU / ml млml 0,250.25 ВодаWater млml 0,250.25

0,5 г пробы отбирали спустя 15, 30, 60, 120 и 1080 минут и липиды выделяли экстракцией растворителем. Липиды анализировали методом ТСХ, используя соответственно растворители I и IV. Картина пластины ТСХ показана на фиг.52.0.5 g of the sample was taken after 15, 30, 60, 120 and 1080 minutes and the lipids were isolated by solvent extraction. Lipids were analyzed by TLC using solvents I and IV, respectively. The TLC plate pattern is shown in FIG.

Анализ ТСХ ясно показывает активность трансферазы #178-9 из A. salmonicida (проба 3). Это можно видеть по уменьшению количества фосфолипидов РС и РЕ. Результаты также показывают, что количество лизолецитина LPC не так высоко, как ожидалось. Это может указывать на гидролитическую активность по отношению к лизолецитину или может быть также обусловлено недостаточной экстракцией, так как лизолецитин сильно полярен и поэтому может частично распределяться в водную фазу.TLC analysis clearly shows the activity of transferase # 178-9 from A. salmonicida (sample 3). This can be seen by a decrease in the amount of phospholipids of RS and PE. The results also show that the amount of lysolecithin LPC is not as high as expected. This may indicate hydrolytic activity with respect to lysolecithin or may also be due to insufficient extraction, since lysolecithin is highly polar and therefore may partially be distributed into the aqueous phase.

Липиды, выделенные экстракцией растворителем, анализировали также методом ГЖХ для того, чтобы определить количество свободной жирной кислоты, холестерина и эфира холестерина. Результаты ГЖХ показаны в таблице 10.The lipids isolated by solvent extraction were also analyzed by GLC in order to determine the amount of free fatty acid, cholesterol and cholesterol ester. GLC results are shown in table 10.

Таблица 10
Анализ ГЖХ липидов из обработанного ферментом яичного желтка.
Результаты даны в % в расчете на содержание липидов. Table 10
GLC analysis of lipids from enzyme-treated egg yolk.
The results are given in% based on the lipid content. 15fifteen 30thirty 6060 120120 10801080 минmin минmin минmin минmin минmin Свободные жирные кислотыFree fatty acids КонтрольThe control 1one 0,3280.328 0,3040,304 0,3220.322 0,3330.333 0,3690.369 T. lanuginosusT. lanuginosus 22 0,3910.391 0,3760.376 0,4590.459 0,6270.627 22,90922,909 A. salmonicida #178-9 A. salmonicida # 178-9 33 1,0071.007 1,6681,668 4,0134,013 6,7616,761 15,09815,098 ХолестеринCholesterol КонтрольThe control 1one 3,0753,075 2,9682,968 3,1033,103 3,0563,056 3,0993,099 T. lanuginosusT. lanuginosus 22 3,1303,130 3,0323,032 3,0453,045 3,0263,026 3,2253,225 A. salmonicida #178-9 A. salmonicida # 178-9 33 2,8352,835 1,9121,912 0,3560.356 0,2200.220 0,2060.206 Эфир холестеринаCholesterol ester КонтрольThe control 1one 0,4160.416 0,3970.397 0,4220.422 0,4080.408 0,4370.437 T. lanuginosusT. lanuginosus 22 0,4360.436 0,4000.400 0,4250.425 0,4190.419 0,4160.416 A. salmonicida #178-9 A. salmonicida # 178-9 33 1,4141,414 2,9882,988 6,1076,107 6,6946,694 5,7605,760 ТриглицеридTriglyceride КонтрольThe control 1one 76,15376,153 73,50573,505 75,56575,565 79,34479,344 77,38277,382 T. lanuginosusT. lanuginosus 22 74,09974,099 74,41374,413 77,07977,079 74,28474,284 21,78121,781 A. salmonicida #178-9 A. salmonicida # 178-9 33 73,78173,781 73,34273,342 77,85777,857 82,04082,040 72,11772,117

Из результатов можно видеть, что почти весь холестерин был этерифицирован спустя 60 минут в пробе 3. Было сделано заключение, что в первые 30 минут имелся избыток субстрата для реакции. Результаты от проб, отобранных спустя 15 и 30 минут, были поэтому использованы для расчета активностей ферментов.From the results it can be seen that almost all of the cholesterol was esterified after 60 minutes in sample 3. It was concluded that in the first 30 minutes there was an excess of substrate for the reaction. Results from samples taken after 15 and 30 minutes were therefore used to calculate enzyme activities.

Основываясь на информации таблицы 10 и том факте, что яичный желток содержит 27% липида, было рассчитано количество микромолей жирной кислоты и эфира холестерина, продуцируемое на 1 мл фермента, и результаты приведены в таблице 11.Based on the information in table 10 and the fact that the egg yolk contains 27% lipid, the number of micromoles of fatty acid and cholesterol ester produced per 1 ml of the enzyme was calculated, and the results are shown in table 11.

Результаты в таблице 11 были получены следующими расчетами из результатов по жирным кислотам в пробе 3 (A. salmonicida, 15 мин):The results in table 11 were obtained by the following calculations from the results for fatty acids in sample 3 ( A. salmonicida , 15 min):

Липид в 5 г яичного желтка = 5×0,27 = 1,35 г.Lipid in 5 g of egg yolk = 5 × 0.27 = 1.35 g.

1,35 г липида содержат 1,007% жирных кислот = 1,35×1,007/100 = 0,01359 г.1.35 g of lipid contain 1.007% fatty acids = 1.35 × 1.007 / 100 = 0.01359 g.

Средний молекулярный вес жирных кислот составляет 272.The average molecular weight of fatty acids is 272.

0,01359 г = 0,01359×1000000/272 = 49,9798 мкмоль.0.01359 g = 0.01359 × 1,000,000 / 272 = 49.9798 μmol.

Добавляли 0,25 мл фермента.0.25 ml of the enzyme was added.

мкмоль жирной кислоты/мл фермента = 49,9798/0,25 = 199,9.μmol of fatty acid / ml of enzyme = 49.9798 / 0.25 = 199.9.

Таблица 11Table 11 Фермент, мкмоль/млEnzyme, μmol / ml 0 мин0 min 15 мин15 minutes 30 мин30 minutes Свободные жирные кислотыFree fatty acids КонтрольThe control 65,0165.01 60,3760.37 T. lanuginosusT. lanuginosus 77,6177.61 74,7174.71 Трансфераза #178-9Transferase # 178-9 199,86199.86 331,06331.06 Эфир холестеринаCholesterol ester КонтрольThe control 35,0935.09 33,5033,50 T. lanuginosusT. lanuginosus 36,7736.77 33,7333.73 Трансфераза #178-9Transferase # 178-9 119,29119.29 252,15252.15

Из результатов таблицы 11 можно рассчитать изменение количеств жирной кислоты и эфира холестерина, вызванное ферментом, относительно контроля, что показано в таблице 12From the results of table 11, it is possible to calculate the change in the amounts of fatty acid and cholesterol ester caused by the enzyme relative to the control, as shown in table 12

Таблица 12Table 12 Фермент, ∆ мкмоль/млEnzyme, ∆ µmol / ml 0 мин0 min 15 мин15 minutes 30 мин30 minutes Свободная жирная кислотаFree fatty acid T. lanuginosusT. lanuginosus 00 12,59312,593 14,34014,340 Трансфераза #178-9Transferase # 178-9 00 134,843134,843 270,691270,691 Эфир холестеринаCholesterol ester T. lanuginosusT. lanuginosus 00 1,6771,677 0,2350.235 Трансфераза #178-9Transferase # 178-9 00 84,19684,196 218,652218,652

Количество продуцированных жирной кислоты или эфира холестерина как функция времени показано на фиг.53.The amount of cholesterol fatty acid or ester produced as a function of time is shown in FIG.

Из наклона кривой были рассчитаны гидролитическая активность (образование СЖК) и липид-ацилтрансферазная активность (образование эфира холестерина) как функции времени. Затем были рассчитаны относительная трансферазная активность (% ацилтрансферазной активности) и относительная гидролитическая активность, которые приведены в таблице 13. Относительную трансферазную активность определяли, используя протокол для определения % ацилтрансферазной активности, описанный здесь ранее. Например, расчет относительной активности для #178-9:Hydrolytic activity (FFA formation) and lipid acyltransferase activity (cholesterol ester formation) as a function of time were calculated from the slope of the curve. Then, the relative transferase activity (% acyltransferase activity) and the relative hydrolytic activity were calculated, which are shown in Table 13. The relative transferase activity was determined using the protocol for determining the% acyltransferase activity described earlier here. For example, calculating relative activity for # 178-9:

Общая активность есть активность СЖК + трансферазная активность = 9,023+7,2884 = 16,311 мкмоль/мин/мл.Total activity is FFA activity + transferase activity = 9.023 + 7.2884 = 16.311 μmol / min / ml.

Относительная трансферазная активность = 7,2884×100/16,311 = 44,7.Relative transferase activity = 7.2884 × 100 / 16.311 = 44.7.

Относительная гидролитическая активность = 9,023×100/16,311 = 55,3.Relative hydrolytic activity = 9.023 × 100 / 16.311 = 55.3.

Таблица 13Table 13 T. lanuginosusT. lanuginosus Активность СЖКFFA activity 0,47800.4780 мкмоль/мин/млμmol / min / ml A. salmonicida #178-9 A. salmonicida # 178-9 Активность СЖКFFA activity 9,02309.0230 мкмоль/мин/млμmol / min / ml T. lanuginosusT. lanuginosus Активность по эфиру холестеринаCholesterol ester activity 0,00780.0078 мкмоль/мин/млμmol / min / ml A. salmonicida #178-9 A. salmonicida # 178-9 7,28847,2884 мкмоль/мин/млμmol / min / ml T. lanuginosusT. lanuginosus Относительная трансферазная активностьRelative transferase activity 1,61,6 A. salmonicida #178-9 A. salmonicida # 178-9 44,744.7 T. lanuginosusT. lanuginosus Относительная гидролитическая активностьRelative hydrolytic activity 98,498.4 A. salmonicida #178-9 A. salmonicida # 178-9 55,355.3

Результаты в таблице 13 подтверждают, что фермент трансферазы из A. salmonicida имеет значительную трансферазную активность, но результаты также подтверждают, что этот фермент имеет значительную гидролитическую активность.The results in table 13 confirm that the transferase enzyme from A. salmonicida has significant transferase activity, but the results also confirm that this enzyme has significant hydrolytic activity.

Липаза из T. lanuginosus имеет гидролитическую активность, и относительная трансферазная активность 1,6 не является доказательством какой-либо трансферазной активности, а объясняется неточностью анализа.The lipase from T. lanuginosus has hydrolytic activity, and the relative transferase activity of 1.6 is not evidence of any transferase activity, but is due to inaccurate analysis.

ЗаключениеConclusion

Яичный желток был использован в качестве субстрата для определения трансферазной и гидролазной активности липид-ацилтрансферазы из Aeromonas salmonicida и липазы из Thermomyces lanuginosus.Egg yolk was used as a substrate to determine the transferase and hydrolase activity of lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicid a and lipase from Thermomyces lanuginosus .

При условиях анализа первоначально имелась линейная взаимосвязь между образованием эфира холестерина и свободной жирной кислоты и временем для фермента липид-ацилтрансферазы. Исходя из этой линейной зависимости можно рассчитать гидролитическую активность (образование СЖК) и трансферазную активность (образование эфира холестерина). Была рассчитана также относительная гидролитическая и трансферазная активность. Липид-ацилтрансфераза (в данном случае GCAT) из Aeromonas salmonicida показала почти равные гидролитическую активность и трансферазную активность при данных условиях испытания. Липаза из Thermomyces lanuginosus показала очень низкую гидролитическую активность, и трансферазная активность не была значительной.Under the assay conditions, there was initially a linear relationship between the formation of cholesterol ester and free fatty acid and the time for the lipid acyltransferase enzyme. Based on this linear relationship, hydrolytic activity (formation of FFA) and transferase activity (formation of cholesterol ester) can be calculated. The relative hydrolytic and transferase activity was also calculated. Lipid acyltransferase (in this case GCAT) from Aeromonas salmonicid a showed almost equal hydrolytic activity and transferase activity under these test conditions. Thermomyces lanuginosus lipase showed very low hydrolytic activity, and the transferase activity was not significant.

Пример 11: Анализ трансферазы в яичном желтке с высоким содержанием водыExample 11: Analysis of transferase in egg yolk with a high water content

ВведениеIntroduction

Липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению была выделена из Aeromonas salmonicida и экспрессирована в Bacillus subtilis. Начальные эксперименты показали, что этот фермент является весьма эффективным при переносе жирной кислоты от лецитина к холестерину при использовании яичного желтка в качестве субстрата.The lipid acyltransferase according to the present invention was isolated from Aeromonas salmonicida and expressed in Bacillus subtilis . Initial experiments showed that this enzyme is very effective in transferring fatty acids from lecithin to cholesterol when using egg yolk as a substrate.

В последующих экспериментах трансферазную реакцию изучали более детально, используя в качестве субстрата яичный желток и концентрируя особое внимание на концентрации воды в субстрате.In subsequent experiments, the transferase reaction was studied in more detail, using egg yolk as a substrate and focusing on the concentration of water in the substrate.

ПроцедураProcedure

МатериалыMaterials

Хлороформ, чдаChloroform, chda

Сквалан, чдаSqualane

ФерментыEnzymes

#178-9 липид-ацилтрансфераза согласно настоящему изобретению из A. salmonicida.# 178-9 lipid acyltransferase according to the present invention from A. salmonicida .

#2427 фосфолипаза А1 из Fusarium oxysporum, LIPOPAN® F от Novozymes, DK (сравнительный липолитический фермент).# 2427 phospholipase A1 from Fusarium oxysporum , LIPOPAN® F from Novozymes, DK (comparative lipolytic enzyme).

#1991 Фосфолипаза А2 из поджелудочной железы, LIPOMOD 221 от Biocatalysts, UK (сравнительный липолитический фермент).# 1991 Phospholipase A2 from the pancreas, LIPOMOD 221 from Biocatalysts, UK (comparative lipolytic enzyme).

5 г жидкого яичного желтка отвешивали в 20 мл стакан Витона и нагревали до 35°С. Добавляли воду и фермент и запускали секундомер.5 g of a liquid egg yolk was weighed into a 20 ml glass of Viton and heated to 35 ° C. Water and enzyme were added and a stopwatch started.

Выделенные липиды анализировали методом ГЖХ.The isolated lipids were analyzed by GLC.

Анализ ГЖХGLC analysis

Капиллярный газовый хроматограф Perkin Elmer Autosystem 900, снабженный колонкой из плавленой двуокиси кремния WCOT 12,5 м × 0,25 мм внутр.диаметр × 0,1 мкм толщина пленки 5% фенилметилсиликона (CR Sil 8 GB от Chromopack).A Perkin Elmer Autosystem 900 capillary gas chromatograph equipped with a 12.5 m × 0.25 mm WCOT fused silica column internal diameter × 0.1 μm film thickness 5% phenylmethyl silicone (CR Sil 8 GB from Chromopack).

Газ-носитель: гелийCarrier gas: helium

Ввод: холодный щелевой инжектор PSSI (начальная температура 50°С, нагрев до 385°С), объем 1,0 мклInlet: PSSI cold slotted injector (initial temperature 50 ° С, heating up to 385 ° С), volume 1.0 μl

Детектор ПИД: 395°СPID detector: 395 ° C

Программа термостата:Thermostat program:

Температура термостата, °СThermostat temperature, ° С 9090 280280 350350 Изотермическое время, минIsothermal time, min 1one 00 1010 Скорость подъема температуры, °С/минThe rate of temperature rise, ° C / min 15fifteen 4four

Приготовление пробы: 30 мг образца растворяли в 9 мл смеси гептан:пиридин 2:1, содержащей внутренний стандарт гептадекан, 0,5 мг/мл. 300 мкл раствора образца переносили в изогнутую пробирку, добавляли 300 мкл MSTFA (N-метил-N-триметилсилилтрифторацетамид) и давали прореагировать в течение 20 мин при 60°С.Sample preparation: 30 mg of sample was dissolved in 9 ml of a heptane: pyridine 2: 1 mixture containing an internal standard of heptadecane, 0.5 mg / ml. 300 μl of the sample solution was transferred into a curved tube, 300 μl of MSTFA (N-methyl-N-trimethylsilyl trifluoroacetamide) was added and allowed to react for 20 min at 60 ° C.

Расчет: коэффициенты отклика для моно-, ди- и триглицеридов и свободной жирной кислоты определяли по стандарту 2 (моно-ди-триглицерид), для холестерина, холестерилпальмитата и холестерилстеарата. Коэффициенты отклика определяли по чистому контрольному веществу (навеска чистого вещества 10 мкг).Calculation: response coefficients for mono-, di- and triglycerides and free fatty acid were determined according to standard 2 (mono-di-triglyceride), for cholesterol, cholesteryl palmitate and cholesteryl stearate. Response coefficients were determined by the pure control substance (10 μg sample of pure substance).

Результатыresults

Яичный желток, содержащий 2% сквалана, использовали в качестве субстрата для реакций. Сквалан добавляли как внутренний стандарт для анализа ГЖХ, чтобы количественно определить липидные компоненты в яичном желтке.An egg yolk containing 2% squalane was used as a substrate for the reactions. Squalane was added as an internal standard for GLC analysis to quantify the lipid components in egg yolk.

Эксперименты проводили так, как показано в таблице 14.The experiments were carried out as shown in table 14.

Таблица 14Table 14 1one 22 33 4four 55 66 77 88 Субстрат, яичный желток с 2% скваланаSubstrate, egg yolk with 2% squalane гg 55 55 55 55 55 55 2,52.5 2,52.5 Трансфераза #178-9, 14 PLU-7/млTransferase # 178-9, 14 PLU-7 / ml млml 0,250.25 0,250.25 0,130.13 LIPOPAN® F, раствор, 200 PLU-7/млLIPOPAN® F, solution, 200 PLU-7 / ml млml 0,250.25 0,250.25 0,130.13 #1991 фосфолипаза А2, 6300 PLU/мл# 1991 phospholipase A2, 6300 PLU / ml млml 0,250.25 ВодаWater млml 0,250.25 3,83.8 3,83.8 8,758.75 8,758.75

Пробы отбирали после 30, 60 и 120 минут и анализировали согласно методике, описанной выше. Отбирали пробы 0,5 мл (опыты 1-4), 0,86 мл (опыты 5-6) и 2,2 мл (опыты 7-8).Samples were taken after 30, 60 and 120 minutes and analyzed according to the procedure described above. Samples of 0.5 ml (experiments 1-4), 0.86 ml (experiments 5-6) and 2.2 ml (experiments 7-8) were taken.

Результаты анализа ГЖХ показаны в таблице 15. Результаты ГЖХ выражены в процентах от субстрата (яичный желток). Таблица показывает также время реакции и общее количество воды в реакционной смеси.GLC analysis results are shown in Table 15. GLC results are expressed as a percentage of the substrate (egg yolk). The table also shows the reaction time and the total amount of water in the reaction mixture.

Таблица 15Table 15 ФерментEnzyme Время реакцииReaction time % воды% water ГЖХGLC ГЖХGLC ГЖХGLC минутыminutes в реакцииin reaction % жирной кислоты% fatty acid % холестерина% cholesterol % эфира холестерина% cholesterol ester КонтрольThe control 120120 5454 0,2470.247 0,8630.863 0,0830,083 #178# 178 30thirty 5454 0,4220.422 0,6690.669 0,4450.445 #178# 178 6060 5454 0,5150.515 0,5490.549 0,6720.672 #178# 178 120120 5454 0,7110.711 0,3640.364 1,0291,029 #2427# 2427 30thirty 5454 2,3662,366 0,8480.848 0,0900,090 #2427# 2427 6060 5454 3,1753,175 0,8370.837 0,0880,088 #2427# 2427 120120 5454 3,9263,926 0,8330.833 0,0820,082 #1991# 1991 30thirty 5454 1,6061,606 0,9110.911 0,0830,083 #1991# 1991 6060 5454 1,7011,701 0,8380.838 0,0800,080 #1991# 1991 120120 5454 1,7811,781 0,8730.873 0,0530,053 #178# 178 30thirty 7373 0,3770.377 0,8740.874 0,4950.495 #178# 178 6060 7373 0,4880.488 0,6650.665 0,7190.719 #178# 178 120120 7373 0,6260.626 0,4260.426 0,9310.931 #2427# 2427 30thirty 7373 2,4712,471 0,8530.853 0,0920,092 #2427# 2427 6060 7373 3,2843,284 0,8580.858 0,0870,087 #2427# 2427 120120 7373 4,1764,176 0,8370.837 0,0810,081 #178# 178 30thirty 8989 0,3440.344 0,7200.720 0,3080,308 #178# 178 6060 8989 0,4430.443 0,7250.725 0,4460.446 #178# 178 120120 8989 0,6100.610 0,5970.597 0,6070,607 #2427# 2427 30thirty 8989 0,5100.510 0,1670.167 0,0100.010 #2427# 2427 6060 8989 0,6020.602 0,1330.133 0,0100.010 #2427# 2427 120120 8989 0,8670.867 0,1470.147 0,0090.009

Основываясь на анализах жирной кислоты, холестерина и эфира холестерина, можно рассчитать количество образовавшихся свободной жирной кислоты и эфира холестерина как функцию времени реакции и содержания воды. Основываясь на этих результатах, можно затем рассчитать суммарную ферментативную активность как сумму образования жирной кислоты и образования эфира холестерина. Относительная гидролитическая активность и относительная трансферазная активность (т.е. % ацилтрансферазной активности) были затем рассчитаны, и результаты показаны в таблице 16.Based on analyzes of fatty acid, cholesterol and cholesterol ester, the amount of free fatty acid and cholesterol ester formed can be calculated as a function of reaction time and water content. Based on these results, the total enzymatic activity can then be calculated as the sum of the formation of fatty acid and the formation of cholesterol ester. Relative hydrolytic activity and relative transferase activity (i.e.,% acyltransferase activity) were then calculated and the results are shown in Table 16.

Результаты в таблице 16 были также проанализированы статистически, с использованием Statigraphic Multifactor ANOVA. Статистические результаты на фиг.54 подтверждают, что фосфолипаза А1, #2427 и фосфолипаза А2 #1991 не имеют трансферазной активности, тогда как трансфераза #178-9 показывает почти 50% трансферазной активности при данных условиях испытаний.The results in table 16 were also analyzed statistically using Statigraphic Multifactor ANOVA. The statistical results in Fig. 54 confirm that phospholipase A1, # 2427 and phospholipase A2 # 1991 do not have transferase activity, whereas transferase # 178-9 shows almost 50% transferase activity under these test conditions.

Эффект содержания воды в испытании на трансферазную активность трансферазы #178-9 также анализировали статистически, что показано на фиг.55. Эти результаты показывают, что в интервале от 54 до 89% воды при испытаниях не было сильного влияния содержания воды на относительную трансферазную активность.The effect of water content in the test on the transferase activity of transferase # 178-9 was also analyzed statistically, as shown in Fig. 55. These results show that in the range from 54 to 89% of the water during the tests there was no strong effect of the water content on the relative transferase activity.

Влияние времени реакции на трансферазную активность для трансферазы #178-9 оценивали с результатами, показанными в таблице 16 и на фиг.56. Результаты на фиг.56 показывают, что относительная трансферазная активность снижается как функция времени реакции. Это может быть объяснено тем фактом, что расходуется большинство молекул акцептора холестерина и поэтому относительная гидролитическая активность возрастает. Отрицательные величины трансферазной реакции для #2427 показывают только, что в рамках погрешности аналитического метода трансферазная активность отсутствует.The effect of reaction time on transferase activity for transferase # 178-9 was evaluated with the results shown in table 16 and Fig. 56. The results in FIG. 56 show that the relative transferase activity decreases as a function of reaction time. This can be explained by the fact that most of the molecules of the cholesterol acceptor are consumed and therefore the relative hydrolytic activity increases. Negative values of the transferase reaction for # 2427 only show that, within the framework of the error of the analytical method, transferase activity is absent.

Таблица 16Table 16 ФерментEnzyme Время реакции, минутыReaction time, minutes % воды в реакционной смеси% water in the reaction mixture Образование жирной кислотыFatty acid formation Потребление холестеринаCholesterol intake Образование эфира холестеринаCholesterol ester formation Гидролитическая актив ность, %Hydrolytic activity,% Трансферазная активность, %Transferase activity,% #178# 178 30thirty 5454 0,1750.175 0,1940.194 0,3620.362 5353 4747 #178# 178 6060 5454 0,2680.268 0,3140.314 0,5890.589 5252 4848 #178# 178 120120 5454 0,4640.464 0,4990.499 0,9460.946 5353 4747 #2427# 2427 30thirty 5454 2,1192,119 0,0150.015 0,0070.007 100one hundred 00 #2427# 2427 120120 5454 2,9282,928 0,0260,026 0,0050.005 100one hundred 00 #2427# 2427 6060 5454 3,6793,679 0,0300,030 -0,001-0.001 100one hundred 00 #1991# 1991 30thirty 5454 1,3591.359 -0,048-0.048 0,0000,000 100one hundred 00 #1991# 1991 6060 5454 1,4541,454 0,0250,025 -0,003-0.003 100one hundred 00 #1991# 1991 120120 5454 1,5341,534 0,1000,100 -0,030-0.030 101101 -1-one #178# 178 30thirty 7373 0,1300.130 0,0990,099 0,4120.412 4242 5858 #178# 178 6060 7373 0,2410.241 0,1980.198 0,6360.636 4747 5353 #178# 178 120120 7373 0,3790.379 0,4370.437 0,8480.848 5151 4949 #2427# 2427 30thirty 7373 2,2242,224 0,0100.010 0,0090.009 100one hundred 00 #2427# 2427 6060 7373 3,0373,037 0,0050.005 0,0040.004 100one hundred 00 #2427# 2427 120120 7373 3,9293,929 0,0260,026 -0,002-0.002 100one hundred 00 #178# 178 30thirty 8989 0,0970,097 0,1430.143 0,2250.225 50fifty 50fifty #178# 178 6060 8989 0,1960.196 0,1380.138 0,3630.363 5656 4444 #178# 178 120120 8989 0,3630.363 0,2660.266 0,5240.524 6262 3838 #2427# 2427 30thirty 8989 0,2630.263 0,6060.606 -0,073-0.073 113113 -13-13 #2427# 2427 6060 8989 0,3550.355 0,7300.730 -0,073-0.073 110110 -10-10 #2427# 2427 120120 8989 0,6200.620 0,7160.716 -0,074-0.074 105105 -5-5

ЗаключениеConclusion

Липид-ацилтрансферазу из Aeromonas salmonicida испытывали в яичном желтке в качестве субстрата и с различными уровнями содержания воды. Этот фермент сравнивали с контрольными липолитическими ферментами, а именно с фосфолипазой А1 из Fusarium oxysporum и фосфолипазой А2 из поджелудочной железы.Lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicida was tested in egg yolk as a substrate and with different levels of water content. This enzyme was compared with control lipolytic enzymes, namely, phospholipase A1 from Fusarium oxysporum and phospholipase A2 from the pancreas.

Результаты доказывают, что только трансфераза катализировала трансферазную реакцию между лецитином и холестерином во время образования эфира холестерина. Результаты показали, что в интервале от 54% до 89% воды в субстрате относительная трансферазная активность была почти одинаковой для трансферазы из Aeromonas salmonicida.The results prove that only transferase catalyzed the transferase reaction between lecithin and cholesterol during the formation of cholesterol ester. The results showed that in the range from 54% to 89% of the water in the substrate, the relative transferase activity was almost the same for the transferase from Aeromonas salmonicida .

Пример 12: Анализ трансферазы в забуференном субстрате для измерения ацилтрансферазной активности (например, для применения в пищевом продукте, использующем лецитин и холестерин)Example 12: Analysis of transferase in a buffered substrate for measuring acyltransferase activity (for example, for use in a food product using lecithin and cholesterol)

Липид-ацилтрансфераза была выделена из Aeromonas salmonicida и экспрессирована в Bacillus subtilis. Этот фермент является весьма эффективным в переносе жирной кислоты от лецитина к холестерину во время образования эфиров холестерина. Было также показано, что фермент имеет некоторую гидролитическую активность, которая наблюдается по образованию свободной жирной кислоты. Традиционные фосфолипазы (АС3.1.1.4 и ЕС3.1.1.32) имеют способность гидролизовать лецитин во время образования свободных жирных кислот и лизолецитина, и не сообщалось о трансферазной активности для этих ферментов.Lipid acyltransferase was isolated from Aeromonas salmonicida and expressed in Bacillus subtilis . This enzyme is very effective in transferring fatty acids from lecithin to cholesterol during the formation of cholesterol esters. It was also shown that the enzyme has some hydrolytic activity, which is observed by the formation of free fatty acid. Traditional phospholipases (AC3.1.1.4 and EC3.1.1.32) have the ability to hydrolyze lecithin during the formation of free fatty acids and lysolecithin, and no transferase activity has been reported for these enzymes.

Здесь детализируется тест, который способен оценить и трансферазную, и гидролитическую активность ферментов и таким образом идентифицировать липид-ацилтрансферазы согласно настоящему изобретению; тест использует субстрат, который содержит лецитин и холестерин. В этой работе использовали субстрат на основе фосфатидилхолина и холестерина, диспергированный в буфере. Количественное определение продуктов реакции проводили путем экстракции липидов из субстрата с последующим ГЖХ анализом липидных компонентов.Here, a test is detailed that is able to evaluate both the transferase and hydrolytic activity of enzymes and thus identify the lipid acyltransferases according to the present invention; the test uses a substrate that contains lecithin and cholesterol. In this work, a substrate based on phosphatidylcholine and cholesterol dispersed in a buffer was used. Quantification of the reaction products was carried out by extraction of lipids from the substrate, followed by GLC analysis of lipid components.

ПроцедураProcedure

МатериалыMaterials

L-альфа-фосфатидилхолин 95% (растительный) Avanti No. 441601L-alpha-phosphatidylcholine 95% (plant) Avanti No. 441601

Холестерин: Sigma кат. C 8503Cholesterol: Sigma Cat. C 8503

Холестеринпальмитат: Sigma С 6072Cholesterol palmitate: Sigma C 6072

Холестеринстеарат: Sigma C 3459Cholesterol stearate: Sigma C 3459

Буфер HEPES Sigma cat. No. H 3375HEPES Sigma cat buffer. No. H 3375

Хлороформ, чдаChloroform, chda

ФерментыEnzymes

Очищенная GCAT из A. salmonicida # 178-9Purified GCAT from A. salmonicida # 178-9

Анализ ТСХ проводили, как описано в примере 6.TLC analysis was performed as described in example 6.

Анализ ГЖХ проводили, как описано в примере 11.GLC analysis was performed as described in example 11.

Результаты: Анализ трансферазы на основе фосфатидилхолина и холестерина в качестве субстрата. Results: Analysis of transferase based on phosphatidylcholine and cholesterol as a substrate.

В нижеследующем трансферазную активность трансферазы испытывали в субстрате на основе фосфатидилхолина и холестерина в соответствии со следующей процедурой.In the following, the transferase activity of the transferase was tested in a substrate based on phosphatidylcholine and cholesterol in accordance with the following procedure.

450 мг фосфатидилхолина (>95% PC Avanti, п. № 441601) и 50 мг холестерина растворяли в хлороформе и выпаривали до сухого остатка под вакуумом. 300 мг смеси холестерин/ фосфатидилхолин переносили в стакан Витона и добавляли 15 мл буфера HEPES, pH 7,0. Липид диспергировали в буфере во время перемешивания.450 mg of phosphatidylcholine (> 95% PC Avanti, paragraph No. 441601) and 50 mg of cholesterol were dissolved in chloroform and evaporated to dryness in vacuo. 300 mg of a cholesterol / phosphatidylcholine mixture was transferred to a Viton glass and 15 ml of HEPES buffer, pH 7.0, was added. The lipid was dispersed in buffer while stirring.

Субстрат нагревали до 35°С при перемешивании магнитной мешалкой и добавляли 0,25 мл раствора фермента. Это является сильно обводненной средой с содержанием воды примерно 95%.The substrate was heated to 35 ° C with stirring with a magnetic stirrer and 0.25 ml of the enzyme solution was added. It is a heavily flooded environment with a water content of approximately 95%.

Пробы в 2 мл отбирали спустя 0, 5, 10, 15, 25, 40 и 60 минут реакционного времени. Немедленно добавляли 25 мкл 4 М HCl, чтобы подкислить свободную жирную кислоту и остановить ферментативную реакцию. Добавляли 3,00 мл хлороформа и пробу интенсивно встряхивали на Whirley в течение 30 сек. Пробу центрифугировали и 2 мл хлороформовой фазы выделяли и фильтровали через 0,45 мкм фильтры в 10 мл тарированный стакан Драма. Хлороформ выпаривали потоком азота при 60°С и пробы вновь взвешивали. Экстрагированный липид анализировали методом ГЖХ.Samples in 2 ml were taken after 0, 5, 10, 15, 25, 40 and 60 minutes of reaction time. 25 μl of 4 M HCl was immediately added to acidify the free fatty acid and stop the enzymatic reaction. 3.00 ml of chloroform was added and the sample was vigorously shaken on Whirley for 30 sec. The sample was centrifuged and 2 ml of the chloroform phase was isolated and filtered through 0.45 μm filters in a 10 ml calibrated Dram glass. Chloroform was evaporated by a stream of nitrogen at 60 ° C and the samples were weighed again. The extracted lipid was analyzed by GLC.

Результаты анализов ГЖХ показаны в таблице 17. Результаты выражены в %, рассчитанных на экстрагированный липид. Количество образовавшихся свободной жирной кислоты и эфира холестерина как функция времени показано на фиг.57. Из фиг.57 можно придти к заключению, что ферментативная реакция не является линейной функцией времени, так как вначале наблюдается сильная и гидролитическая, и трансферазная активность. Спустя приблизительно 10 минут и до примерно 60 минут реакция показывает почти линейный характер образования жирной кислоты и эфира холестерина как функции времени. Поэтому было решено рассматривать ферментативную реакцию в данном интервале времени.The results of GLC analyzes are shown in table 17. The results are expressed in%, calculated on the extracted lipid. The amount of free fatty acid and cholesterol ester formed as a function of time is shown in FIG. 57. From Fig. 57, it can be concluded that the enzymatic reaction is not a linear function of time, since initially strong and hydrolytic and transferase activity are observed. After about 10 minutes and up to about 60 minutes, the reaction shows an almost linear pattern of formation of fatty acid and cholesterol ester as a function of time. Therefore, it was decided to consider the enzymatic reaction in this time interval.

Таблица 17Table 17 МинутыMinutes 00 55 1010 15fifteen 2525 4040 6060 Холестерин, %Cholesterol% 10,06410,064 8,9488,948 8,5778.577 8,6568,656 8,1028,102 7,8567,856 7,8097,809 Эфир холестерина, %Cholesterol ester,% 0,0000,000 1,5711,571 2,0302,030 2,0582,058 2,2822,282 2,6592,659 3,0813,081 СЖК суммарно, %FFA total,% 0,2600.260 1,1971,197 1,2391,239 1,4661,466 2,4452,445 2,9432,943 3,9403,940

Зная количество липида в реакционной смеси и количество добавленного фермента, можно рассчитать образование жирной кислоты и эфира холестерина, выраженное в мкмоль/мл фермента (таблица 18 и фиг.58).Knowing the amount of lipid in the reaction mixture and the amount of enzyme added, it is possible to calculate the formation of fatty acid and cholesterol ester, expressed in μmol / ml enzyme (table 18 and Fig. 58).

Таблица 18Table 18 МинутыMinutes 1010 15fifteen 2525 4040 6060 мкм/млμm / ml мкм/млμm / ml мкм/млμm / ml мкм/млμm / ml мкм/млμm / ml СЖК суммарноFFA in total 58,158.1 68,768.7 114,6114.6 138,0138.0 184,7184.7 Эфир холестеринаCholesterol ester 88,988.9 90,090.0 99,399.3 115,6115.6 133,8133.8

Из результатов в таблице 18 и наклона кривых на фиг.58 можно рассчитать количество жирной кислоты и эфира холестерина как функцию времени, выраженное в мкмоль/мин на мл фермента.From the results in table 18 and the slope of the curves in FIG. 58, the amount of fatty acid and cholesterol ester can be calculated as a function of time, expressed in μmol / min per ml of enzyme.

Расчет гидролитической активности и трансферазной активности показан в таблице 19. Относительную трансферазную активность определяли, используя протокол для определения % ацилтрансферазной активности, описанный здесь ранее.The calculation of hydrolytic activity and transferase activity is shown in Table 19. Relative transferase activity was determined using the protocol for determining% acyltransferase activity described earlier here.

Таблица 19Table 19 Гидролитическая активность (жирная кислота)Hydrolytic activity (fatty acid) 2,522,52 мкмоль/мин на мл ферментаμmol / min per ml of enzyme Трансферазная активность (эфир холестерина)Transferase activity (cholesterol ester) 0,940.94 мкмоль/мин на мл ферментаμmol / min per ml of enzyme Общая активностьTotal activity 3,453.45 мкмоль/мин на мл ферментаμmol / min per ml of enzyme Относительная трансферазная активностьRelative transferase activity 27,127.1 %% Относительная гидролитическая активностьRelative hydrolytic activity 72,972.9 %%

Поиск других ферментов с трансферазной активностьюSearch for other enzymes with transferase activity

Описанный выше метод был использован для оценки различных липолитических ферментов на трансферазную и гидролитическую активность. Ферменты испытывали, как показано в таблице 20.The method described above was used to evaluate various lipolytic enzymes for transferase and hydrolytic activity. Enzymes were tested as shown in table 20.

Таблица 20Table 20 1one 22 33 4four 55 СубстратSubstrate млml 1,51,5 1,51,5 1,51,5 1,51,5 1,51,5 #178-9 Трансфераза A. salmonicida 32 PLU-7/мл# 178-9 Transferase A. salmonicida 32 PLU-7 / ml млml 0,250.25 5% #3016 LIPOPAN® F (F. oxysporum)5% # 3016 LIPOPAN® F ( F. oxysporum ) млml 0,250.25 5% Thermomyces lanuginosus 5% Thermomyces lanuginosus млml 0,250.25 5% Candida rugosa #29835% Candida rugosa # 2983 млml 0,250.25 5% Candida cylindracea #30765% Candida cylindracea # 3076 млml 0,250.25

Субстрат, содержащий 300 мг фосфатидилхолина/холестерина, диспергированные в 50 мМ буфере HEPES, рН 7,0, нагревали до 35°С при перемешивании. Добавляли раствор фермента и образец выдерживали при 35°С при перемешивании. Пробы отбирали с регулярным промежутком времени и экстрагировали хлороформом. Выделенные липиды анализировали методом ГЖХ, результаты показаны в таблице 21.A substrate containing 300 mg of phosphatidylcholine / cholesterol dispersed in 50 mM HEPES buffer, pH 7.0, was heated to 35 ° C. with stirring. An enzyme solution was added and the sample was kept at 35 ° C with stirring. Samples were taken at regular intervals and extracted with chloroform. The isolated lipids were analyzed by GLC, the results are shown in table 21.

Таблица 21Table 21 ПробаTry 1one Трансфераза 178-9Transferase 178-9 МинутыMinutes 00 55 1010 15fifteen 2525 4040 6060 СЖКSJK 1,2161,216 2,5162,516 2,9832,983 2,622.62 2,8942,894 3,4483,448 3,9113,911 ХолестеринCholesterol 7,5477,547 6,4386,438 6,3656,365 6,156.15 6,1366,136 5,9365,936 5,6625,662 Эфир холестеринаCholesterol ester 00 1,8351,835 2,1772,177 2,442.44 2,582,58 2,8512,851 3,3313,331 22 Fusarium oxysporum (LIPOPAN® F) Fusarium oxysporum (LIPOPAN® F) МинутыMinutes 00 55 1010 15fifteen 2525 4040 6060 СЖКSJK 1,2161,216 1,3451,345 1,7961,796 1,951.95 2,4872,487 2,4242,424 2,9772,977 ХолестеринCholesterol 7,5477,547 7,3097,309 7,3667,366 7,337.33 7,4297,429 7,3417,341 7,3267,326 Эфир холестеринаCholesterol ester 00 0,260.26 0,3860.386 0,350.35 0,2670.267 0,360.36 0,3940.394 33 Thermomyces lanuginosusThermomyces lanuginosus МинутыMinutes 00 55 1010 15fifteen 2525 4040 6060 СЖКSJK 1,2161,216 0,8530.853 0,8750.875 1one 0,8960.896 1,1051.105 1,0091.009 ХолестеринCholesterol 7,5477,547 7,3847,384 7,6397,639 7,637.63 7,6757,675 7,6037,603 7,5297,529 Эфир холестеринаCholesterol ester 00 00 00 00 00 00 00 4four Candida rugosa (#2938) Candida rugosa (# 2938) МинутыMinutes 00 55 1010 15fifteen 2525 4040 6060 СЖКSJK 1,2161,216 0,9820.982 0,9870.987 1,021,02 1.1351.135 1,1311,131 1,151.15 ХолестеринCholesterol 7,5477,547 7,4387.438 7,6567,656 7,667.66 7,6387,638 7,5757,575 7,5857,585 Эфир холестеринаCholesterol ester 00 00 00 00 00 00 00 55 Candida cylindricea (#3076) Candida cylindricea (# 3076) МинутыMinutes 00 55 1010 15fifteen 2525 4040 6060 СЖКSJK 1,2161,216 1,0321,032 1,0971,097 1,071,07 1,2031,203 1,1311,131 1,431.43 ХолестеринCholesterol 7,5477,547 7,5027,502 7,4257,425 7,657.65 7,6197,619 7,5027,502 7,4117,411 Эфир холестеринаCholesterol ester 00 00 00 00 00 00 00

Из анализов ГЖХ видно, что только липид-ацилтрансфераза (178-9) продуцирует значительное количество эфира холестерина и жирных кислот. Фосфолипаза из Fusarium oxysporum также дает стабильное увеличение свободной жирной кислоты, но происходило только начальное образование небольшого количества эфира холестерина, и увеличение количества эфира холестерина в зависимости от времени не наблюдалось.GLC analyzes show that only lipid acyltransferase (178-9) produces a significant amount of cholesterol ester and fatty acids. The phospholipase from Fusarium oxysporum also gives a stable increase in free fatty acid, but only a small amount of cholesterol ester was initially formed, and no increase in cholesterol ester depending on time was observed.

Зная количество липидного субстрата и анализы ГЖХ, можно рассчитать относительную трансферазную активность и относительную гидролитическую активность, основываясь на результатах за время реакции от 10 до 60 минут. Результаты для трансферазы 178-9 и липазы Fusarium oxysporum показаны в таблице 21. Другие испытанные ферменты не проявили активности.Knowing the amount of lipid substrate and GLC analyzes, the relative transferase activity and relative hydrolytic activity can be calculated based on the results for the reaction time from 10 to 60 minutes. The results for transferase 178-9 and Fusarium oxysporum lipase are shown in Table 21. Other enzymes tested did not show activity.

Таблица 21АTable 21A Транс фераза 178-9Trans Ferase 178-9 Fusarium oxysporumFusarium oxysporum Гидролитическая активность, микромоль/мин на мл ферментаHydrolytic activity, micromol / min per ml of enzyme 1,031,03 0,960.96 Трансферазная активность, микромоль/мин на мл ферментаTransferase activity, micromol / min per ml of enzyme 0,400.40 0,010.01 Общая ферментная активность, микромоль/мин на мл ферментаTotal enzyme activity, micromol / min per ml of enzyme 1,431.43 0,980.98 Относительная гидролитическая вктивностьRelative hydrolytic activity 71,871.8 98,798.7 Относительная трансферазная активностьRelative transferase activity 28,228,2 1,31.3

Результат, показанный в таблице 21А, подтверждает значительную трансферазную активность липид-ацилтрансферазы (образец 178-9). Наблюдалось также, что относительная трансферазная активность хорошо согласуется с экспериментом, упомянутым в таблице 19.The result, shown in table 21A, confirms the significant transferase activity of lipid acyltransferase (sample 178-9). It was also observed that the relative transferase activity is in good agreement with the experiment mentioned in table 19.

Наблюдается, однако, очень низкая трансферазная активность фосфолипазы Fusarium oxysporum. Этот трансферазный уровень настолько низок, что он попадает в погрешность анализа. Как и ожидалось, фосфолипаза Fusarium oxysporum имеет значительную гидролитическую активность.However, a very low transferase activity of Fusarium oxysporum phospholipase is observed. This transferase level is so low that it falls into the analysis error. As expected, Fusarium oxysporum phospholipase has significant hydrolytic activity.

ЗаключениеConclusion

Вместо яичного желтка (показанного в примере 11) в качестве субстрата был использован искусственный субстрат на основе очищенного фосфатидилхолина и холестерина для того, чтобы измерить активность трансферазы из Aeromonas salmonicida. Между 10 мин и 60 мин времени реакции анализ дал почти линейное образование свободных жирных кислот и эфира холестерина как функцию времени. Исходя из активности между 10 мин и 60 мин времени реакции были рассчитаны гидролитическая активность и трансферазная активность.Instead of the egg yolk (shown in Example 11), an artificial substrate based on purified phosphatidylcholine and cholesterol was used as a substrate in order to measure the transferase activity from Aeromonas salmonicida . Between 10 minutes and 60 minutes of reaction time, the analysis gave an almost linear formation of free fatty acids and cholesterol ester as a function of time. Based on the activity between 10 minutes and 60 minutes of the reaction time, hydrolytic activity and transferase activity were calculated.

Концентрация субстрата в этом тесте была относительно более низкой, чем в яичном желтке, а количество воды было относительно более высоким.The substrate concentration in this test was relatively lower than in egg yolk, and the amount of water was relatively higher.

Исходя из результатов анализа липид-ацилтрансферазы (в данном случае GCAT) из Aeromonas salmonicida в искусственном субстрате их фосфатидилхолина/холестерина в буфере можно придти к заключению, что этот фермент имеет очень хорошую трансферазную активность также и в системе с очень высоким содержанием воды.Based on the results of the analysis of lipid acyltransferase (in this case GCAT) from Aeromonas salmonicida in an artificial substrate of their phosphatidylcholine / cholesterol in a buffer, it can be concluded that this enzyme also has a very good transferase activity in a system with a very high water content.

И анализ на основе яичного желтка (см. пример 11), и анализ на фосфатидилхолине/холестерине в буфере (пример 12) могут быть использованы для измерения трансферазной и гидролитической активности ферментов. Яичный желток является предпочтительным с той точки зрения, что гидролитическая и трансферазная активность является линейной зависимостью от времени, а фосфатидилхолин/холестерин в буфере является линейным только в определенном интервале времени.Both egg yolk-based analysis (see Example 11) and phosphatidylcholine / cholesterol analysis in buffer (Example 12) can be used to measure the transferase and hydrolytic activity of enzymes. Egg yolk is preferred in that the hydrolytic and transferase activity is a linear time dependence, and the phosphatidylcholine / cholesterol in the buffer is linear only in a certain time interval.

Пример 13: Пищевые эмульсииExample 13: Food Emulsions

Эффект модифицированного ферментом яичного желтка испытывали на стандартной рецептуре пищевой эмульсии с 60% масла.The effect of the enzyme modified egg yolk was tested on a standard formulation of a food emulsion with 60% oil.

Стандартные методы и материалы являются такими, которые были подробно рассмотрены в предшествующих примерах.Standard methods and materials are those that have been discussed in detail in the previous examples.

Яичный желток был обработан липид-ацилтрансферазой из Aeromonas salmonicida (#138) или фосфолипазой, а именно имеющимся в продаже ферментом Lipopan F® (Novozymes A/S, Denmark) (#2938), как показано в таблице 22.The egg yolk was treated with a lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicida (# 138) or phospholipase, namely the commercially available Lipopan F® enzyme (Novozymes A / S, Denmark) (# 2938), as shown in table 22.

Таблица 22Table 22
Ферментная обработка яичного желткаEnzymatic processing of egg yolk 1one 22 33 4four Яичный желток, продукт Sanofo № 1123P2Egg Yolk, Sanofo Product No. 1123P2 гg 1010 1010 1010 1010 #138, 10 PLU/мл# 138, 10 PLU / ml млml 1one 1one #2938, 200 PLU/мл# 2938, 200 PLU / ml млml 1one ВодаWater млml 1one Время реакцииReaction time минmin 210210 360360 210210 360360

Анализ ТСХ липидов яичного желтка из обработанного ферментом яичного желтка (таблица 9) показан на фиг.59 и 60.TLC analysis of egg yolk lipids from an enzyme treated egg yolk (table 9) is shown in FIGS. 59 and 60.

В этом опыте доза #2938 была увеличена в 10 раз, и это оказало весьма явное воздействие на яичный желток. Количество свободной жирной кислоты значительно возросло, и лецитин (РС) был гидролизован до лизолецитина (LPC). Трансфераза #138 дала явную трансферазную реакцию, так как свободный холестерин был превращен в эфир холестерина и часть лецитина была превращена в лизолецитин.In this experiment, dose # 2938 was increased 10-fold, and this had a very clear effect on the egg yolk. The amount of free fatty acid increased significantly, and lecithin (MS) was hydrolyzed to lysolecithin (LPC). Transferase # 138 gave a clear transferase reaction, since free cholesterol was converted to cholesterol ether and part of the lecithin was converted to lysolecithin.

Другим интересным аспектом ферментативной модификации была консистенция продукта. Образец, обработанный фосфолипазой #2938, стал очень твердым, тогда как образцы, обработанные липид-ацилтрансферазой #138, сохраняли такую же жидкую консистенцию, как контрольный образец (см. фиг.61).Another interesting aspect of the enzymatic modification was the consistency of the product. The sample treated with phospholipase # 2938 became very solid, while the samples treated with lipid acyltransferase # 138 retained the same liquid consistency as the control sample (see FIG. 61).

Эти модифицированные яичные желтки испытывали в рецептуре пищевой эмульсии, показанной в таблице 23.These modified egg yolks were tested in the food emulsion formulation shown in table 23.

Таблица 23Table 23
Майонез с ферментативно модифицированным яичным желткомEnzyme-modified egg yolk mayonnaise 00 1а1a 2а2a 3а3a 4а4a %% %% %% %% %% Рапсовое маслоRapeseed oil 6060 6060 6060 6060 6060 Яичный желток, продукт Sanofo № 1123Р2Egg Yolk, Sanofo Product No. 1123P2 2,82,8 Ферм. модифицированный яичный желток № 1Farms. modified egg yolk No. 1 2,82,8 Ферм. модифицированный яичный желток № 2Farms. modified egg yolk No. 2 2,82,8 Ферм. модифицированный яичный желток № 3Farms. modified egg yolk No. 3 2,82,8 Контроль (необработанный яичный желток) № 4Control (untreated egg yolk) No. 4 2,82,8 ВодаWater 3939 36,236,2 36,236,2 36,236,2 36,236,2 Уксус, 10% уксусной кислотыVinegar, 10% Acetic Acid 1one 1one 1one 1one 1one

Модифицированные яичные желтки 1 и 2 были обработаны липид-ацилтрансферазой, а модифицированный яичный желток 3 был обработан имеющейся в продаже фосфолипазой.Modified egg yolks 1 and 2 were treated with lipid acyltransferase, and modified egg yolk 3 was treated with a commercially available phospholipase.

Пищевую эмульсию готовили как эмульсию масло в воде согласно следующей методике: яичный желток и воду отвешивали в стакан. Масло отвешивали отдельно.A food emulsion was prepared as an oil in water emulsion according to the following procedure: an egg yolk and water were weighed into a glass. The oil was weighed separately.

В водную фазу погружали миксер Turrax (20000 об/мин). Масло закачивали в водную фазу с постоянной скоростью в течение 2 минут. Перемешивание продолжали дополнительно в течение 1 минуты. Затем добавляли уксус и перемешивали в течение 5 секунд.A Turrax mixer (20,000 rpm) was immersed in the aqueous phase. Oil was pumped into the aqueous phase at a constant rate for 2 minutes. Stirring was continued for an additional 1 minute. Then vinegar was added and mixed for 5 seconds.

Стабильность эмульсии испытывали в нагревательной камере при 100°С. После 2 часов при 100°С оценивали эмульсию (см. фиг.62).The stability of the emulsion was tested in a heating chamber at 100 ° C. After 2 hours at 100 ° C., the emulsion was evaluated (see FIG. 62).

Стабильность эмульсии необработанного яичного желтка в этом опыте была вполне удовлетворительной. Однако обработка яичного желтка липид-ацилтрансферазой #138 улучшила стабильность, так как количество отделяющейся воды снизилось. Яичный желток, обработанный фосфолипазой #2938, дал очень нестабильную эмульсию с почти полным разделением масляной и водной фазы при 100°С.The stability of the raw egg yolk emulsion in this experiment was quite satisfactory. However, treating the egg yolk with lipid acyltransferase # 138 improved stability as the amount of water that separated was reduced. An egg yolk treated with phospholipase # 2938 gave a very unstable emulsion with an almost complete separation of the oil and water phases at 100 ° C.

Авторы считают, что в некоторых областях использование композиций и способов по изобретению может обеспечить улучшенную термическую стабильность эмульсий, таких как заправки для салатов масло в воде и т.п. Это является особенно важным для пищевых эмульсий, которые пастеризуют, чтобы обеспечить длительную сохраняемость, и/или нагревают перед подачей, например, в предварительно приготовленных блюдах, которые повторно разогревают перед подачей (например, в блюдах для микроволновой печи). Хотя и не желая быть связанными какой-либо определенной теорией, предполагается, что при некоторых применениях накопление свободных жирных кислот может быть вредным для термической стабильности таких эмульсий. Следует признать, что улучшенная термическая стабильность пищевых эмульсий, полученных с использованием способов по изобретению, может не проявляться или даже может оказаться нежелательной в некоторых пищевых применениях. Специалистам должно быть ясно, в каких применениях такие характеристики являются желательными, и стабильность эмульсий может быть легко определена при использовании простых тепловых тестов, эквивалентных, например, пастеризации и/или повторному нагреву в микроволновой печи. Авторы изобретения установили, что в предпочтительном варианте осуществления пищевая эмульсия, полученная с применением ферментов по изобретению, имеет улучшенную термическую стабильность.The authors believe that in some areas the use of the compositions and methods of the invention can provide improved thermal stability of emulsions, such as oil-in-water salad dressings and the like. This is especially important for food emulsions that are pasteurized to provide long shelf life and / or heated before serving, for example, in pre-cooked dishes that are reheated before serving (for example, in microwave ovens). Although not wanting to be bound by any particular theory, it is suggested that, in some applications, the accumulation of free fatty acids can be detrimental to the thermal stability of such emulsions. It should be recognized that improved thermal stability of food emulsions prepared using the methods of the invention may not occur or may even be undesirable in some food applications. It will be apparent to those skilled in the art in which applications such characteristics are desired, and the stability of the emulsions can be easily determined using simple thermal tests equivalent to, for example, pasteurization and / or reheating in a microwave oven. The inventors have found that in a preferred embodiment, the food emulsion obtained using the enzymes of the invention has improved thermal stability.

Пример 14: Трансферазная реакция в яичном желтке, обогащенном растительным стероломExample 14: Transferase reaction in egg yolk enriched with plant sterol

Трансфераза из Aeromonas salmonicida была способна катализировать образование лизолецитина, моноглицерида и эфиров стерола в яичном желтке, обогащенном растительным стеролом и глицерином. Тот же фермент был испытан в низководной системе, содержащей пальмовое масло, лецитин, растительный стерол и глицерин. Анализами ТСХ и ГЖХ было показано, что моноглицерид и эфиры растительного стерола продуцируются при данных условиях реакции.Transferase from Aeromonas salmonicida was able to catalyze the formation of lysolecithin, monoglyceride and sterol esters in egg yolk enriched with plant sterol and glycerol. The same enzyme was tested in a low-water system containing palm oil, lecithin, plant sterol and glycerin. TLC and GLC analyzes showed that plant sterol monoglycerides and esters are produced under these reaction conditions.

ВведениеIntroduction

Трансфераза из Aeromonas salmonicida была испытана на трансферазную активность в почти не содержащей воду системе из лецитина, жира, растительного стерола и глицерина.Transferase from Aeromonas salmonicida was tested for transferase activity in an almost water-free system of lecithin, fat, plant sterol and glycerol.

МатериалыMaterials

GCAT трансфераза очищенная #178-9, 32 PLU-7/мл (журнал 2254-100).GCAT transferase purified # 178-9, 32 PLU-7 / ml (journal 2254-100).

Соевый лецитин Yolkin от Aarhus United, Denmark.Yolkin Soy Lecithin from Aarhus United, Denmark.

Пальмовое масло 43, от Aarhus United, Denmark.Palm Oil 43, from Aarhus United, Denmark.

L-α-фосфатидилхолин 95% растительный (Avanti #441601).L-α-phosphatidylcholine 95% vegetable (Avanti # 441601).

Ситостерол, Sigma nr. S5753.Sitosterol, Sigma nr. S5753.

Растительный стерол: Generol N122 от Cognis, Germany.Plant Sterol: Generol N122 from Cognis, Germany.

Глицерин, п. 085915.Glycerin, p. 085915.

Результатыresults

Первоначальный скрининг трансферазной активности по отношению к растительному стеролу и глицерину был проведен в яичном желтке, как показано в таблице 24.Initial screening for transferase activity against plant sterol and glycerol was performed in egg yolk, as shown in table 24.

Таблица 24Table 24 1one 22 33 4four Яичный желтокEgg yolk гg 1one 1one 1one 1one ГлицеринGlycerol гg 0,10.1 0,10.1 Ситостерол:масло 3:7Sitosterol: oil 3: 7 гg 0,130.13 0,130.13 Трансфераза #178-9Transferase # 178-9 единицыunits 1one 1one ВодаWater **

* Вода, соответствующая количеству воды в растворе фермента = 83 мкл* Water corresponding to the amount of water in the enzyme solution = 83 μl

Ингредиенты смешивали и нагревали до 37°С и выдерживали при этой температуре при перемешивании магнитной мешалкой.The ingredients were mixed and heated to 37 ° C and kept at this temperature with stirring with a magnetic stirrer.

Пробы по 0,1 г отбирали спустя 3 и 23 часа и анализировали методом ТСХ. Результаты анализов ТСХ показаны на фиг.63.Samples of 0.1 g were taken after 3 and 23 hours and analyzed by TLC. TLC analysis results are shown in FIG.

Результат на фиг.63 показывает, что и холестерин, и растительные стеролы этерифицируются в результате трансферазной реакции одновременно с образованием лизолецитина (образцы 3 и 4), так как почти весь свободный стерол и холестерин были превращены в соответствующий эфир в образце 3.The result in FIG. 63 shows that both cholesterol and plant sterols are esterified as a result of the transferase reaction simultaneously with the formation of lysolecithin (samples 3 and 4), since almost all free sterol and cholesterol were converted to the corresponding ester in sample 3.

Результаты также показывают, что образец, содержащий только глицерин и яичный желток, продуцировал моноглицерид. Количество моноглицерида должно быть подтверждено анализом ГЖХ. Когда вместе с глицерином добавляли стерол (образец 2), количество моноглицерида было очень низким и не обнаруживаемым методом ТСХ. Это показывает, что до тех пор, пока имеется избыток стерола или холестерина, трансферазная реакция, использующая глицерин, является умеренной.The results also show that a sample containing only glycerin and egg yolk produced monoglyceride. The amount of monoglyceride should be confirmed by GLC analysis. When sterol was added together with glycerol (sample 2), the amount of monoglyceride was very low and not detectable by TLC. This shows that as long as there is an excess of sterol or cholesterol, the transferase reaction using glycerol is moderate.

В другом эксперименте трансферазный фермент 178-9 добавляли к смеси соевого лецитина, глицерина и растительного стерола для того, чтобы изучить каталитическую активность фермента в этой реакционной смеси.In another experiment, the transferase enzyme 178-9 was added to a mixture of soya lecithin, glycerol and plant sterol in order to study the catalytic activity of the enzyme in this reaction mixture.

Состав реакционных смесей в данных опытах показан в таблице 25.The composition of the reaction mixtures in these experiments is shown in table 25.

Таблица 25Table 25 1one 22 33 4four 55 66 Соевый лецитинSoya lecithin гg 1,8751,875 2,252.25 1,8751,875 2,52.5 3,53,5 3,53,5 Растительный стерол Generol N 122Plant Sterol Generol N 122 гg 0,2250.225 0,2250.225 00 00 0,2250.225 0,50.5 Пальмовое масло 43Palm oil 43 гg 2,6752,675 2,252.25 2,82,8 2,1252,125 1,0621,062 0,8310.831 ГлицеринGlycerol гg 0,2250.225 0,2750.275 0,3250.325 0,3750.375 0,2480.248 0,2380.238 Трансфераза #178-9, 32 PLU/млTransferase # 178-9, 32 PLU / ml млml 0,20.2 0,20.2 0,20.2 0,20.2 0,20.2 0,20.2

Опыт проводили смешением липидных компонентов при перемешивании при 46°С. Добавляли фермент и пробы отбирали спустя 4 и 24 часа.The experiment was carried out by mixing the lipid components with stirring at 46 ° C. The enzyme was added and samples were taken after 4 and 24 hours.

Пробы анализировали методом ТСХ, как показано на фиг.64.Samples were analyzed by TLC, as shown in Fig.64.

Пробы от опытов 2, 4 и 5 спустя 24 часа времени реакции анализировали также методом ГЖХ, и результаты показаны в таблице 26.Samples from experiments 2, 4 and 5 after 24 hours of reaction time were also analyzed by GLC, and the results are shown in table 26.

Таблица 26Table 26 22 4four 55 ГлицеринGlycerol %% 3,163.16 5,715.71 4,174.17 Жирные кислотыFatty acid %% 4,234.23 5,365.36 6,676.67 МоноMono %% 2,242.24 3,873.87 3,923.92 СтеролSterol %% 2,132.13 2,622.62 Эфир стеролаSterol Ether %% 2,892.89 2,142.14

Результаты подтвердили, что трансфераза 178-9 способна катализировать образование эфиров растительных стеролов и моноглицерида из реакционной смеси, содержащей соевый лецитин, глицерин и растительный стерол. Такая реакционная смесь могла бы представлять интерес для применения в производстве маргарина, где моноглицериды являются желательными из-за их эмульгирующих свойств, а эфиры растительных стеролов желательны из-за их эффекта снижения холестерина.The results confirmed that transferase 178-9 is capable of catalyzing the formation of plant sterol esters and monoglyceride from a reaction mixture containing soya lecithin, glycerin and plant sterol. Such a reaction mixture could be of interest for use in the production of margarine, where monoglycerides are desirable because of their emulsifying properties, and plant sterol esters are desirable because of their cholesterol lowering effect.

ЗаключениеConclusion

Трансфераза GCAT из Aeromonas salmonicida способна катализировать образование эфиров растительных стеролов и моноглицерида в яичном желтке, когда добавлены растительный стерол и глицерин. Тот же фермент катализирует образование эфиров растительных стеролов и моноглицерида в смеси пальмового масла, лецитина, растительного стерола и глицерина. Поэтому фермент представляет интерес для применения в маргарине и других маслосодержащих пищевых продуктах, где моноглицерид и лизолецитин необходимы для улучшения эмульгирования, а эфиры растительных стеролов желательны из-за их эффекта снижения холестерина.GCAT transferase from Aeromonas salmonicida is able to catalyze the formation of plant sterol esters and monoglyceride in egg yolk when plant sterol and glycerin are added. The same enzyme catalyzes the formation of plant sterol esters and monoglyceride in a mixture of palm oil, lecithin, plant sterol and glycerol. Therefore, the enzyme is of interest for use in margarine and other oil-containing foods, where monoglyceride and lysolecithin are necessary to improve emulsification, and plant sterol esters are desirable because of their cholesterol lowering effect.

Пример 15: Иммобилизация липид-ацилтрансферазы из Aeromonas salmonicida и применение в синтезе эфиров стеролаExample 15: Immobilization of lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicida and use in the synthesis of sterol esters

Липид-ацилтрансферазу (в данном случае GCAT) из A. salmonicida иммобилизовали на целит осаждением ацетоном. 10 мл раствора фермента в 20 мМ буфера ТЕА, рН 7, медленно перемешивали с 0,1 г целита 535 535 (от Fluka) в течение 2 часов при комнатной температуре.Lipid acyltransferase (in this case GCAT) from A. salmonicida was immobilized on celite by precipitation with acetone. 10 ml of an enzyme solution in 20 mM TEM buffer, pH 7, was slowly mixed with 0.1 g of Celite 535 535 (from Fluka) for 2 hours at room temperature.

50 мл холодного ацетона добавляли при продолжающемся перемешивании. Осадок выделяли центрифугированием при 5000 g в течение 1 минуты. Осадок промывали 2 раза 20 мл холодного ацетона. Целит сушили при комнатной температуре в течение примерно 1 часа.50 ml of cold acetone was added with continued stirring. The precipitate was isolated by centrifugation at 5000 g for 1 minute. The precipitate was washed 2 times with 20 ml of cold acetone. Celite was dried at room temperature for about 1 hour.

Иммобилизованную трансферазу испытывали в масляной смеси, содержащей 13% фосфатидилхолина и 7% растительного стерола (таблица 27).Immobilized transferase was tested in an oil mixture containing 13% phosphatidylcholine and 7% plant sterol (table 27).

Таблица 27Table 27 %% Лецитин Avanti Avanti Lecithin 12,012.0 Растительный стерол Generol 122NPlant Sterol Generol 122N 6,66.6 Пальмовое масло 43Palm oil 43 71,471,4 ГлицеринGlycerol 5,05,0 Иммобилизованная трансфераза #178, 45 U/гImmobilized Transferase # 178, 45 U / g 2,02.0 ВодаWater 3,03.0

Лецитин, растительный стерол и соевое масло нагревали до 46°С и растительный стерол растворяли. Добавляли иммобилизованную трансферазу.Lecithin, vegetable sterol and soybean oil were heated to 46 ° C and vegetable sterol was dissolved. Immobilized transferase was added.

Трансферазная реакция продолжалась при 46°С при мягком перемешивании магнитной мешалкой. Пробы для анализа отбирали спустя 1/2, 1, 3, 6 и 24 ч и анализировали методом ТСХ. Реакцию останавливали спустя 24 часа реакционного времени и иммобилизованную трансферазу отфильтровывали.The transferase reaction continued at 46 ° C with gentle stirring with a magnetic stirrer. Samples for analysis were taken after 1/2, 1, 3, 6 and 24 hours and analyzed by TLC. The reaction was stopped after 24 hours of reaction time and the immobilized transferase was filtered.

Пробы анализировали методом ТСХ, и результаты показаны на фиг.65.Samples were analyzed by TLC, and the results are shown in Fig. 65.

Анализ ТСХ ясно показал эффект иммобилизованной трансферазы из A. salmonicida в превращении холестерина в эфир холестерина. Наблюдалось также, что образовалось небольшое количество моноглицерида. Было также показано, что фермент имеет высокую активность в средах с высоким содержанием воды (6-89% воды), поэтому трансфераза и другие трансферазы для использования по изобретению могут быть также использованы в приложениях с иммобилизованным ферментом со значительным содержанием воды. Это делает возможным замещение растворителей, используемых в современных иммобилизованных липазах при биоконверсии липидов с использованием трансфераз.TLC analysis clearly showed the effect of immobilized transferase from A. salmonicida in the conversion of cholesterol to cholesterol ester. It was also observed that a small amount of monoglyceride was formed. It was also shown that the enzyme has high activity in environments with a high water content (6-89% water), therefore, transferase and other transferases for use according to the invention can also be used in applications with an immobilized enzyme with a significant water content. This makes it possible to replace the solvents used in modern immobilized lipases during lipid bioconversion using transferases.

Пример 16: Трансфераза Aeromonas salmonicida может осуществлять перенос от фосфолипида к стеролу, образуя эфир стерола, и/или к молекуле сахара, образуя эфир сахараExample 16: Transferase Aeromonas salmonicida can transfer from phospholipid to sterol to form a sterol ester and / or to a sugar molecule to form a sugar ester

Липид-ацилтрансфераза из Aeromonas salmonicida экспрессированная в E. coli (Hydro 0303), обозначенная как #139, была очищена на колонке HR 2,5/10 c Chelating Sepharose FF и проанализирована на фосфолипазную активность. Трансферазную активность оценивали в яичном желтке на ферментативную активность и функциональность в яичном желтке. Фермент был также испытан в яичном желтке, содержащем глюкозу.The lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicida expressed in E. coli (Hydro 0303), designated as # 139, was purified on an HR 2.5 / 10 column with Chelating Sepharose FF and assayed for phospholipase activity. Transferase activity was evaluated in egg yolk for enzymatic activity and functionality in egg yolk. The enzyme was also tested in egg yolk containing glucose.

Фосфолипазная активностьPhospholipase activity

Трансферазу #139, выделенную из колонки HR 2,5/10 c Chelating Sepharose FF, анализировали с NEFA-PLU (pH 7). Активность составила 1,15 единиц NEFA-PLU/мл.Transferase # 139 isolated from a 2.5 / 10 HR column with Chelating Sepharose FF was analyzed with NEFA-PLU (pH 7). Activity was 1.15 units of NEFA-PLU / ml.

Яичный желтокEgg yolk

В начальном тесте на применимость трансферазу #139 испытывали в яичном желтке согласно следующей процедуре.In the initial applicability test, transferase # 139 was tested in egg yolk according to the following procedure.

1 г свежего яичного желтка отвешивали в 10 мл колбу с завинчивающейся крышкой. Добавляли препарат фермента и перемешивали на мешалке Vortex. Образец помешали при температуре 37°С и перемешивали магнитной мешалкой.1 g of fresh egg yolk was weighed into a 10 ml screw-top flask. An enzyme preparation was added and mixed on a Vortex mixer. The sample was stirred at 37 ° C and stirred with a magnetic stirrer.

Реакцию останавливали добавлением 7,5 мл смеси хлороформ:метанол (2:1) и перемешивали на мешалке Whirley в течение 30 секунд. Хлороформовую фазу отделяли центрифугированием и 2 мкл хлороформовой фазы переносили на предварительно активированную пластину ТСХ из диоксида кремния и элюировали текущим буфером I, а другую пластину - текущим буфером IV.The reaction was stopped by the addition of 7.5 ml of a mixture of chloroform: methanol (2: 1) and stirred on a Whirley stirrer for 30 seconds. The chloroform phase was separated by centrifugation, and 2 μl of the chloroform phase was transferred to a previously activated silicon dioxide TLC plate and eluted with current buffer I, and the other plate with current buffer IV.

Параметры опыта показаны в таблице 28.The experimental parameters are shown in table 28.

Таблица 28Table 28 ОпытExperience Время реакцииReaction time Яичный желтокEgg yolk Трансфераза #139Transferase # 139 №No. минmin гg единицыunits 1one 1010 1one 22 1010 1one 0,75 NEFA-PLU0.75 NEFA-PLU 33 6060 1one 0,75 NEFA-PLU0.75 NEFA-PLU 4four 300300 1one 0,75 NEFA-PLU0.75 NEFA-PLU 55 12001200 1one 66 12001200 1one 0,75 NEFA-PLU0.75 NEFA-PLU

Анализы ТСХ показаны на фиг.66 и 67. Анализ ТСХ ясно демонстрирует трансферазную реакцию трансферазы #139. Холестерин превращается в эфир холестерина, и количество лецитина уменьшается. Результат, однако, показывает также, что лизолецитин накапливается только в очень небольшом количестве из-за того, что трансфераза #139 является также активной по отношению к лизолецитину. Это наблюдение подтверждается образованием свободных жирных кислот (СЖК).TLC analyzes are shown in FIGS. 66 and 67. TLC analysis clearly demonstrates the transferase transferase reaction # 139. Cholesterol is converted to cholesterol ester, and the amount of lecithin decreases. The result, however, also shows that lysolecithin accumulates only in very small amounts due to the fact that transferase # 139 is also active against lysolecithin. This observation is confirmed by the formation of free fatty acids (FFA).

Яичный желток и глюкозаEgg yolk and glucose

Ранее было показано, что трансфераза из Aeromonas salmonicida (#138) способна использовать глюкозу в качестве молекулы-акцептора в трансферазной реакции. Было проверено также, может ли трансфераза #139 использовать глюкозу в качестве молекулы-акцептора. Параметры эксперимента представлены в таблице 29.It was previously shown that transferase from Aeromonas salmonicida (# 138) is able to use glucose as an acceptor molecule in the transferase reaction. It was also tested whether transferase # 139 can use glucose as an acceptor molecule. The parameters of the experiment are presented in table 29.

Таблица 29Table 29 ОпытExperience Время реакцииReaction time Яичный желтокEgg yolk Глюкоза, 70%Glucose, 70% Трансфераза #139Transferase # 139 №No. минутыminutes гg мгmg единицыunits 1one 1010 1one 500500 22 1010 1one 500500 1 NEFA-PLU1 NEFA-PLU 33 6060 1one 500500 1 NEFA-PLU1 NEFA-PLU 4four 180180 1one 500500 1 NEFA-PLU1 NEFA-PLU 55 300300 1one 500500 1 NEFA-PLU1 NEFA-PLU 66 12001200 1one 500500 1 NEFA-PLU1 NEFA-PLU 77 12001200 1one 500500

Продукты реакции анализировали методами ТСХ и ГЖХ.The reaction products were analyzed by TLC and GLC.

Анализ ТСХ показывает образование эфира глюкозы после 220 мин времени реакции (фиг.69, дорожка 6), но после 1200 мин времени реакции никакого эфира глюкозы не видно. Поэтому следует прийти к заключению, что трансфераза #139 обладает и трансферазной, и гидролитической активностью. Это подтверждается также тем фактом, что количество свободных жирных кислот постоянно возрастает по ходу времени реакции.TLC analysis showed the formation of a glucose ester after 220 minutes of reaction time (FIG. 69, lane 6), but after 1200 minutes of reaction time no glucose ester was seen. Therefore, it should be concluded that transferase # 139 has both transferase and hydrolytic activity. This is also confirmed by the fact that the amount of free fatty acids is constantly increasing during the reaction time.

Трансфераза из Aeromonas hydrophila была испытана в яичном желтке. Результат подтверждает, что этот фермент катализирует образование эфира холестерина одновременно с образованием лизолецитина. После длительного времени реакции, когда большая часть холестерина израсходована, образовывалась также свободная жирная кислота. Можно поэтому придти к заключению, что фермент имеет преимущественно трансферазную активность, но наблюдалась также и гидролитическая активность, когда только вода была доступна как молекула-донор.Transferase from Aeromonas hydrophila was tested in egg yolk. The result confirms that this enzyme catalyzes the formation of cholesterol ester simultaneously with the formation of lysolecithin. After a long reaction time, when most of the cholesterol was consumed, free fatty acid was also formed. We can therefore conclude that the enzyme has predominantly transferase activity, but hydrolytic activity was also observed when only water was available as a donor molecule.

В опыте с яичным желтком и глюкозой было обнаружено, что трансфераза из Aeromonas hydrophila способна катализировать образование эфира глюкозы in situ в пищевой среде с высоким содержанием воды (фиг.70).In an experiment with egg yolk and glucose, it was found that transferase from Aeromonas hydrophila is able to catalyze the formation of glucose ester in situ in a high-water food medium (Fig. 70).

Пример 17: Варианты липид-ацилтрансферазы из Aeromonas hydrophila (Ahyd2) (SEQ ID No.36, см. фиг.71)Example 17: Variants of lipid acyltransferase from Aeromonas hydrophila (Ahyd2) (SEQ ID No.36, see Fig. 71)

Были введены мутации с использованием набора реактивов QuikChange® Multi-Site Directed Mutagenesis kit Stratagene, La Jolla, CA 92037, USA, следуя инструкции, предоставленной Stratagene.Mutations were introduced using the QuikChange® Multi-Site Directed Mutagenesis kit Stratagene reagent kit, La Jolla, CA 92037, USA, following the instructions provided by Stratagene.

Варианты с Tyr256 показали повышенную активность по отношению к фосфолипидам.Options with Tyr256 showed increased activity against phospholipids.

Варианты с Tyr256 и Tyr260 показали повышенную активность по отношению к галактолипидам.Options with Tyr256 and Tyr260 showed increased activity against galactolipids.

Вариант с Tyr265 показал повышенную трансферазную активность с галактолипидами в качестве донора ацила.The Tyr265 variant showed increased transferase activity with galactolipids as an acyl donor.

Числа показывают положения на следующей последовательности: Фермент из Aeromonas hydrophila, аминокислотная последовательность которого показана как SEQ ID No.36 на фиг.71 (подчеркнутые аминокислоты показывают сигнальный пептид ксиланазы). Нуклеотидной последовательностью является последовательность, которая показана как SEQ ID No.54 на фиг.72.The numbers indicate the positions in the following sequence: An enzyme from Aeromonas hydrophila whose amino acid sequence is shown as SEQ ID No.36 in FIG. 71 (underlined amino acids indicate xylanase signal peptide). A nucleotide sequence is a sequence that is shown as SEQ ID No.54 in FIG.

Пример 18: Применение ацилтрансферазной реакции для продуцирования эфира растительного стерола и моноглицерида для приготовления маргаринаExample 18: Use of an acyltransferase reaction to produce plant sterol ester and monoglyceride for the preparation of margarine

Ацилтрансфераза из Aeromonas salmonicida, экспрессированная в Bacillus subtilis, была испытана в смеси пальмового масла, содержащей растительный лецитин, растительный стерол и глицерин. Ацилтрансфераза показала способность утилизировать и растительный стерол, и глицерин в качестве молекул-акцепторов во время продуцирования эфира растительного стерола и моноглицерида. Реакционную смесь использовали для приготовления столового маргарина хорошего качества, основанного на моноглицериде в реакционной смеси, и в то же время маргарин был обогащен эфиром растительного стерола, который, как было показано, обладает эффектом снижения холестерина. Aeromonas salmonicida acyltransferase expressed in Bacillus subtilis was tested in a mixture of palm oil containing plant lecithin, plant sterol and glycerin. Acyltransferase has shown the ability to utilize both plant sterol and glycerin as acceptor molecules during the production of plant sterol ester and monoglyceride. The reaction mixture was used to prepare good quality table margarine based on monoglyceride in the reaction mixture, and at the same time, margarine was enriched with plant sterol ether, which has been shown to have an effect on lowering cholesterol.

Целью этой работы было изучение возможности продуцировать моноглицерид и эфир растительного стерола путем ферментативной реакции лецитина, растительного стерола и глицерина, растворенных в растительном жире.The aim of this work was to study the possibility of producing plant sterol monoglyceride and ether by the enzymatic reaction of lecithin, plant sterol and glycerol dissolved in vegetable fat.

Начальные эксперименты показали, что возможно использовать ацилтрансферазу из Aeronmonas salmonicida для того, чтобы продуцировать моноглицерид и эфир растительного стерола из лецитина, глицерина и растительного стерола.Initial experiments showed that it is possible to use the acyltransferase from Aeronmonas salmonicida in order to produce plant sterol monoglyceride and ester from lecithin, glycerol and plant sterol.

В этом эксперименте такую реакционную смесь использовали для приготовления столового маргарина.In this experiment, such a reaction mixture was used to prepare table margarine.

МатериалыMaterials

Липид-ацилтрансфераза из Aeromonas salmonicida, #196 C101, 18,6 PLU/г (журнал 2254-104).Lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicida , # 196 C101, 18.6 PLU / g (Journal 2254-104).

Пальмовое масло 43 от Aarhus United, DK.Palm Oil 43 from Aarhus United, DK.

L-α-фосфатидилхолин 95% растительный (Avanti, #441601).L-α-phosphatidylcholine 95% vegetable (Avanti, # 441601).

Глицерин, п. 085915.Glycerin, p. 085915.

Дистиллированный моноглицерид, Dimodan HP от Danisco.Distilled monoglyceride, Dimodan HP from Danisco.

Приготовление маргаринаCooking margarine

1. Смешать ингредиенты водной фазы (если требуется, пастеризовать водную фазу нагреванием до примерно 80°С). Довести рН до 5,5.1. Mix the ingredients of the aqueous phase (if necessary, pasteurize the aqueous phase by heating to about 80 ° C). Bring the pH to 5.5.

2. Расплавить жировую фазу и довести температуру до примерно 40-45°С.2. Melt the fat phase and bring the temperature to about 40-45 ° C.

3. Нагреть эмульгатор с некоторым количеством масла в соотношении 1 часть эмульгатора на 5 частей масла до температуры (75-80°С), которая на 5-10°С выше температуры плавления эмульгатора. Когда смесь полностью расплавится и хорошо перемешается, добавить оставшееся нагретое масло, непрерывно перемешивая.3. Heat the emulsifier with a certain amount of oil in the ratio of 1 part emulsifier to 5 parts of oil to a temperature (75-80 ° C), which is 5-10 ° C higher than the melting temperature of the emulsifier. When the mixture has completely melted and mixed well, add the remaining heated oil, stirring continuously.

4. Добавить вкусовую добавку.4. Add flavoring.

5. Добавить водную фазу к жировой фазе, непрерывно перемешивая.5. Add the aqueous phase to the fat phase, mixing continuously.

6. Охладить в трубчатом холодильнике (обычная производительность, обычное охлаждение) до температуры на выходе 8-10°С.6. Cool in a tube refrigerator (normal capacity, normal cooling) to an outlet temperature of 8-10 ° C.

Результатыresults

Ацилтрансфераза из A. salmonicida была испытана в смеси пальмового масла, как показано в таблице 30. Лецитин, растительный стерол, глицерин и пальмовое масло нагревали до 60°С при перемешивании для солюбилизации растительного стерола и лецитина.The acyltransferase from A. salmonicida was tested in a mixture of palm oil, as shown in table 30. Lecithin, plant sterol, glycerin and palm oil were heated to 60 ° C with stirring to solubilize plant sterol and lecithin.

Таблица 30Table 30 СубстратSubstrate %% Лецитин Avanti Avanti Lecithin 12,012.0 Растительный стерол Generol 122NPlant Sterol Generol 122N 6,66.6 Пальмовое масло, температура плавления 43Palm oil, melting point 43 76,476,4 ГлицеринGlycerol 5,05,0

Субстрат охлаждали до 48°С и добавляли ацилтрансферазу #196 в количестве, указанном в таблице 31. Реакционную смесь выдерживали при 48°С в течение 24 часов при медленном перемешивании.The substrate was cooled to 48 ° C and acyltransferase # 196 was added in the amount indicated in Table 31. The reaction mixture was kept at 48 ° C for 24 hours with slow stirring.

Таблица 31Table 31 гg СубстратSubstrate 220220 Трансфераза #196 C101, 18,6 PLU/гTransferase # 196 C101, 18.6 PLU / g 15fifteen

Пробы реакционной смеси отбирали спустя 1, 4 и 24 часа времени реакции и анализировали методом ТСХ в растворителе I (фиг.73). Результаты анализа ТСХ ясно показывают образование эфира растительного стерола и моноглицерида. На фиг.73 первая дорожка представляет пробу после 1 часа времени реакции, дорожка 2 представляет 4 часа времени реакции, дорожка 3 представляет 24 часа времени реакции, и дорожка 4 представляет растительный стерол.Samples of the reaction mixture were taken after 1, 4 and 24 hours of reaction time and analyzed by TLC in solvent I (Fig. 73). TLC analysis clearly shows the formation of plant sterol ether and monoglyceride. In Fig. 73, the first lane represents the sample after 1 hour of reaction time, lane 2 represents 4 hours of reaction time, lane 3 represents 24 hours of reaction time, and lane 4 represents plant sterol.

Реакцию останавливали после 24 часов времени реакции и остатки нерастворенного растительного стерола удаляли, а прозрачный раствор использовали для получения маргарина.The reaction was stopped after 24 hours of reaction time and the residues of undissolved plant sterol were removed and a clear solution was used to obtain margarine.

МаргаринMargarine

Реакционную смесь, содержащую моноглицерид и эфир растительного стерола, использовали для получения столового маргарина согласно рецептуре, показанной в таблице 32.The reaction mixture containing monoglyceride and plant sterol ester was used to produce table margarine according to the formulation shown in table 32.

Таблица 32Table 32 Протокол № 3734Protocol No. 3734 1one 22 Водная фазаWater phase ВодаWater 1616 1616 СольSalt 0,50.5 0,50.5 Сухое обезжиренное молокоSkimmed milk powder 1one 1one Сорбат калия Potassium sorbate 0,10.1 0,10.1 EDTAEDTA 0,0150.015 0,0150.015 pHpH 5,55.5 5,55.5 Водная фаза, всегоWater phase total 16,616.6 16,616.6 Жировая фазаFat phase Пальмовое масло 43Palm oil 43 2525 2525 Рапсовое маслоRapeseed oil 7575 7575 Жировая фаза, всегоFat phase, total 83,283,2 78,478,4 Dimodan HPDimodan HP 0,20.2 Реакционная смесьReaction mixture 55

Маргарин, полученный из реакционной смеси, оценили как имеющий хорошее качество с хорошей способностью к намазыванию и хорошим ощущением во рту без какого-либо постороннего привкуса. Маргарин был сравним по уровню качества со стандартным маргарином, приготовленным с использованием дистиллированного моноглицерида Dimodan HP.Margarine obtained from the reaction mixture was rated as having good quality with good spreadability and good mouth feel without any extraneous taste. Margarine was comparable in quality to standard margarine prepared using distilled monoglyceride Dimodan HP.

Единственным наблюдавшимся различием было то, что маргарин, протокол 3734 №2 с реакционной смесью был немного более твердым, что объясняется тем фактом, что данная рецептура содержала больше пальмового масла, чем контрольный маргарин.The only difference observed was that margarine, protocol 3734 No. 2 with the reaction mixture was slightly harder, due to the fact that this formulation contained more palm oil than control margarine.

Пример 19: Применение липид-ацилтрансферазы при приготовлении хлебаExample 19: The use of lipid acyltransferase in the preparation of bread

Одним из ограничений применения липаз в хлебопечении является то, что во время липазной реакции образуется свободная жирная кислота. Хорошо известно, что образование слишком большого количества свободной жирной кислоты будет иметь негативное влияние на поведение муки при изготовлении хлеба, так как клейковина становится слишком жесткой и образуется упругое (т.е. менее эластичное) тесто, которое не может расширяться во время ферментации и выпечки.One of the limitations of the use of lipases in bakery is that free fatty acid is formed during the lipase reaction. It is well known that the formation of too much free fatty acid will have a negative effect on the behavior of flour in making bread, as gluten becomes too hard and forms an elastic (i.e. less elastic) dough that cannot expand during fermentation and baking .

Образования свободной жирной кислоты следует также избегать с точки зрения окислительной стабильности, поскольку свободные жирные кислоты более склонны к окислению липидов, чем соответствующие триглицериды.The formation of free fatty acids should also be avoided in terms of oxidative stability, since free fatty acids are more prone to lipid oxidation than the corresponding triglycerides.

В настоящем изобретении проблемы образования свободной жирной кислоты при добавлении в тесто липолитического фермента были преодолены за счет использования липид-ацилтрансферазы, которая вместо продуцирования свободных жирных кислот переносит одну или несколько жирных кислот от липидного донора ацила к неводной молекуле-акцептору, присутствующей в тесте, такой как углевод, протеин, или пептид, или, если используется в хлебе с молочным жиром, стерол. Альтернативно или в комбинации в тесто могут быть добавлены другие акцепторы, перечисленные выше, например, фитостеролы или фитостанолы. Предпочтительно, молекула-акцептор в тесте может быть одной или несколькими из глюкозы, сахарозы или мальтозы и/или других углеводов, обычно доступных в тесте.In the present invention, the problems of free fatty acid formation upon addition of a lipolytic enzyme to the dough were overcome by the use of lipid acyltransferase, which instead of producing free fatty acids transfers one or more fatty acids from the acyl lipid donor to the non-aqueous acceptor molecule present in the test, such like a carbohydrate, protein, or peptide, or, if used in bread with milk fat, sterol. Alternatively or in combination, other acceptors listed above, for example phytosterols or phytostanols, can be added to the dough. Preferably, the acceptor molecule in the test may be one or more of glucose, sucrose or maltose and / or other carbohydrates commonly available in the test.

В следующих экспериментах ацилтрансферазу испытывали в маломасштабных опытах по хлебопечению. Образовавшиеся продукты реакции и липидные компоненты в полностью расстоенном тесте экстрагировали водой, насыщенной бутанолом, и анализировали методами ЖХВД и ГЖХIn the following experiments, acyltransferase was tested in small-scale baking experiments. The resulting reaction products and lipid components in a fully spaced test were extracted with water saturated with butanol, and analyzed by HPLC and GLC

Материалы и методыMaterials and methods

ФерментыEnzymes

Ацилтрансфераза 550 PLU-7/мл.Acyltransferase 550 PLU-7 / ml.

Lipopan™ F BG, промышленная липаза от Novozymes. 12000 LIPU/г или Grindamyl Exel 16, 12000 LIPU/г.Lipopan ™ F BG, Industrial Lipase from Novozymes. 12000 LIPU / g or Grindamyl Exel 16; 12000 LIPU / g.

Лецитин порошок, 95% фосфолипид (доступен от Danisco A/S, Denmark).Lecithin powder, 95% phospholipid (available from Danisco A / S, Denmark).

Дигалакозилдиглицерид из цельной пшеничной муки (от Sigma D4651).Whole Wheat Digalacosyl Diglyceride (from Sigma D4651).

Мука: Sølvmel nr. 2001084 (датская пшеничная мука, полученная от Havnemøllerne, Odense, Denmark). Flour: Sølvmel nr. 2001084 (Danish wheat flour obtained from Havnemøllerne, Odense, Denmark).

Минипекарный тестMini baking test

Мука, 50 г, сухие дрожжи 10 г, глюкоза 0,8 г, соль 0,8 г, 70 ч/млн аскорбиновой кислоты и 400 единиц Брабендера воды замешивали в 50 г тестомесильной чаше Брабендера в течение 5 мин при 30°С.Flour, 50 g, dry yeast 10 g, glucose 0.8 g, salt 0.8 g, 70 ppm ascorbic acid and 400 units of Brabender water were kneaded in 50 g of a Brabender kneading bowl for 5 min at 30 ° C.

Время расстойки составляло 10 мин при 34°С. Тесто отвешивали по 15 г каждого теста, затем формовали на специальном устройстве, где тесто раскатывали между деревянной пластиной и плексигласовой рамкой. Образцы теста расстаивали в формах в течение 45 мин при 34°С и выпекали в домашней печи Voss 8 мин при 225°С.The proofing time was 10 min at 34 ° C. The dough was weighed 15 g of each dough, then molded on a special device, where the dough was rolled between a wooden plate and a plexiglass frame. Samples of the dough were placed in molds for 45 minutes at 34 ° C and baked in a Voss home oven for 8 minutes at 225 ° C.

После выпекания хлебцы охлаждали до комнатной температуры и спустя 20 мин хлебцы взвешивали и определяли объем методом смещения рапсового семени. Хлебцы также разрезали и оценивали мякиш и корку.After baking, the loaves were cooled to room temperature and after 20 minutes the loaves were weighed and the volume was determined by rape seed displacement. Crispbread was also cut and graded on the crumb and crust.

Результаты и заключениеResults and Conclusion

Предварительные результаты показывают, что липид-ацилтрансфераза явно демонстрирует положительный эффект и на объем хлеба, и на внешний вид хлеба. В частности, предварительные результаты показывают, что использование липид-ацилтрансферазы приводит к увеличение удельного объема хлеба по сравнению с хлебом, полученным с контролем (без фермента) и полученным с применением доступного в продаже протолитичнского фермента, а именно Grindamyl Exel или Lipopan F™.Preliminary results show that lipid acyltransferase clearly demonstrates a positive effect on both bread volume and bread appearance. In particular, preliminary results show that the use of lipid acyltransferase leads to an increase in the specific volume of bread compared to bread obtained with control (without enzyme) and obtained using a commercially available protolytic enzyme, namely Grindamyl Exel or Lipopan F ™.

Пример 20: Стандартное мороженое с молочным жиромExample 20: Standard ice cream with milk fat

Функцией эмульгаторов, используемых в мороженом, является осуществление контролируемой кристаллизации жира и мягкой дестабилизации в результате десорбции протеина во время старения мороженого. Это изменение улучшает качество мороженого. Для приготовления мороженого обычно используют моноглицериды, но известно также использование в производстве мороженого полярных эмульгаторов, подобных полисорбатам и эфирам сахаров в сочетании с моно- и диглицеридами, чтобы содействовать контролируемой дестабилизации жира и получить мороженое с очень хорошей кремовой и однородной при еде консистенцией.The function of emulsifiers used in ice cream is to effect controlled crystallization of fat and mild destabilization as a result of protein desorption during ice cream aging. This change improves the quality of ice cream. Monoglycerides are usually used to make ice cream, but polar emulsifiers like polysorbates and sugar esters in combination with mono- and diglycerides are also known in ice cream production to help control fat destabilization and get ice cream with a very good creamy and uniform consistency.

Эмульгаторы, используемые в мороженом, обычно добавляют в смесь для мороженого в виде порошка. Недавно было, однако, показано, что моно-диглицериды могут быть продуцированы ферментативной реакцией жира в рецептуре мороженого с использованием липаз. Проблемой для использования липаз, однако, является то, что липазы катализируют также образование свободных жирных кислот, когда вода является доступной в реакционной смеси.The emulsifiers used in ice cream are usually added to the ice cream mix in powder form. Recently, however, it has been shown that mono-diglycerides can be produced by the enzymatic reaction of fat in lipase ice cream formulations. A problem for the use of lipases, however, is that lipases also catalyze the formation of free fatty acids when water is available in the reaction mixture.

Было, однако, неожиданно показано, что липид-ацилтрансфераза преодолевает ограничения для липазы, так как ацилтрансфераза способна переносить жирную кислоту от лецитина и других липидов к молекулам-акцепторам, подобным стеролу, холестерину, глюкозе, глицерину и протеинам/пептидам без образования значительного количества свободных жирных кислот.However, it has been unexpectedly shown that lipid acyltransferase overcomes the limitations of lipase, since acyltransferase is able to transfer fatty acid from lecithin and other lipids to acceptor molecules like sterol, cholesterol, glucose, glycerin and proteins / peptides without the formation of a significant amount of free fatty acids.

Одним из главных ингредиентов мороженого являются молочные сливки, содержащие 38% молочного жира. Молочные сливки содержат также меньшее количество лецитина, который является молекулой-донором для ацилтрансферазы ("Комплекс молочных липидов составляет примерно 1% от общего молочного жира и состоит главным образом из фосфолипидов", Ref. Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry Copyright © 2003 by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA). Молочные сливки содержат также небольшое количество холестерина, который является молекулой-акцептором для ацилтрансферазы.One of the main ingredients of ice cream is milk cream containing 38% milk fat. Milk cream also contains less lecithin, which is a donor molecule for acyltransferase ("The milk lipid complex is about 1% of total milk fat and consists mainly of phospholipids," Ref. Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry Copyright © 2003 by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA). Milk cream also contains a small amount of cholesterol, which is an acyltransferase acceptor molecule.

Таким образом, из составляющих мороженого можно продуцировать и моноглицерид, и полярные эмульгаторы, подобные лизолецитину и эфиру сахара, которые известны как оказывающие благоприятный эффект при изготовлении мороженого.Thus, both monoglyceride and polar emulsifiers, such as lysolecithin and sugar ester, which are known to have a beneficial effect in the manufacture of ice cream, can be produced from the components of ice cream.

Дополнительным благоприятным эффектом реакции ацилтрансферазы в молочных сливках является образование эфира холестерина, который может замедлить поглощение холестерина в кишечнике.An additional beneficial effect of the acyltransferase reaction in milk cream is the formation of cholesterol ester, which can slow down the absorption of cholesterol in the intestine.

Рецепт мороженогоIce cream recipe с эмульгаторомwith emulsifier с ферментомwith enzyme Молочные сливки, 38%Milk Cream, 38% 23,6523.65 23,6523.65 Обезжиренное молокоSkimmed milk 53,3053.30 53,3053.30 Порошковое обезжиренное молокоSkimmed milk powder 4,904.90 11,3011.30 СахарSugar 12,0012.00 12,0012.00 Глюкозный сироп, DE 42, 75% TSGlucose Syrup, DE 42, 75% TS 4,254.25 4,254.25 ГлицеринGlycerol 1,01,0 1,01,0 Смесь стабилизаторовMixture of stabilizers 0,20.2 0,20.2 Cremodan SE 30Cremodan SE 30 0,60.6 Липид-ацилтрансфераза, 500 PLU/гLipid Acyltransferase, 500 PLU / g 0,10.1 Grinsted Flavouring 2976Grinsted flavoring 2976 0,10.1 0,10.1 КрасительDye ++ ++

Процесс приготовления мороженогоThe process of making ice cream

1. Нагреть молочные сливки, глюкозный сироп и глицерин до примерно 40°С. Добавить ацилтрансферазу и дать смеси реагировать в течение 30 минут. Пробу отбирали для анализа.1. Heat milk cream, glucose syrup and glycerin to about 40 ° C. Add acyltransferase and let the mixture react for 30 minutes. A sample was taken for analysis.

2. Нагреть все другие жидкие ингредиенты до примерно 40°С.2. Heat all other liquid ingredients to approximately 40 ° C.

3. Добавить другие сухие ингредиенты (смесь стабилизаторов смешивают с сахаром перед добавлением).3. Add other dry ingredients (a mixture of stabilizers is mixed with sugar before adding).

4. Когда сухие ингредиенты растворятся, добавить смесь молочных сливок и глюкозного сиропа.4. When the dry ingredients dissolve, add a mixture of milk cream and glucose syrup.

5. Пастеризовать при 80-85°С/20-40 секунд.5. Pasteurize at 80-85 ° C / 20-40 seconds.

6. Гомогенизировать при 80°С (190 бар для рецепта 1 и 175 бар для рецепта 2).6. Homogenize at 80 ° C (190 bar for recipe 1 and 175 bar for recipe 2).

7. Охладить до температуры состаривания 4°С.7. Cool to an aging temperature of 4 ° C.

8. Заморозить в замораживателе непрерывного действия до желаемой взбитости (рекомендуется 100%).8. Freeze in a continuous freezer to the desired overrun (100% recommended).

9. Закалить мороженое в туннельном закалочном аппарате при -40°С.9. Temper ice cream in a tunnel quenching apparatus at -40 ° C.

10. Хранить при температуре ниже -25°С.10. Store at temperatures below -25 ° C.

Результатыresults

Применение ацилтрансферазы при изготовлении мороженого содействует получению мороженого с очень хорошим вкусом и превосходным нежным ощущением во рту, сопоставимого с мороженым, изготовленным с использованием промышленного эмульгатора Cremodan SE 30. Расплав мороженого, изготовленного с липид-ацилтрансферазой, также оказался улучшенным.The use of acyltransferase in the manufacture of ice cream contributes to the production of ice cream with a very good taste and excellent delicate mouthfeel comparable to ice cream made using the Cremodan SE 30 industrial emulsifier. The melt of ice cream made with lipid acyltransferase has also been improved.

Пример 21: Ацилтрансфераза в сыреExample 21: Acyltransferase in Cheese

Сыр является свежим или зрелым твердым или полутвердым продуктом, полученным путем коагуляции молока, обезжиренного молока, частично обезжиренного молока, сливок, подсырных сливок, или пахты, или любой комбинации этих материалов через воздействие сычуга или других подходящих коагулирующих агентов и частичного дренирования сыворотки, которая является результатом такой коагуляции.Cheese is a fresh or mature solid or semi-solid product obtained by coagulation of milk, skim milk, partially skim milk, cream, cheese cream, or buttermilk, or any combination of these materials through rennet or other suitable coagulating agents and partial drainage of whey, which is the result of such coagulation.

Выход сыра зависит в первую очередь от содержания жира и протеина в молоке. Концентрации соли (в особенности солей кальция) и протеина, а также кислотность являются очень важными для коагуляции (Ref. Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry Copyright © 2003 by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA).The yield of cheese depends primarily on the content of fat and protein in milk. Concentrations of salt (especially calcium salts) and protein, as well as acidity are very important for coagulation (Ref. Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry Copyright © 2003 by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA).

Такая попытка была сделана для того, чтобы оптимизировать и повысить выход сыра путем оптимизации процедуры изготовления сыра (USP 4959229) или путем использования улучшенного способа створаживания (USP 2581240), которые повышали количество протеинов сыворотки в твороге.Such an attempt was made in order to optimize and increase the yield of cheese by optimizing the cheese production procedure (USP 4959229) or by using the improved curing method (USP 2581240), which increased the amount of whey protein in the cottage cheese.

В настоящем изобретении количество протеинов сыворотки в твороге повышено путем ферментативной модификации протеина сыворотки обработкой молока во время приготовления сыра липид-ацилтрансферазой.In the present invention, the amount of whey protein in the curd is increased by enzymatically modifying the whey protein by treating the milk during the preparation of the cheese with lipid acyltransferase.

Когда жирная кислота ковалентно присоединяется к немембранному протеину, подобному β-лактоглобулину, физические и функциональные свойства радикально изменяются.When a fatty acid covalently binds to a non-membrane protein like β-lactoglobulin, the physical and functional properties change radically.

Для приготовления сыра по настоящему изобретению ацилтрансферазу добавляют к молоку до того или в то же время, когда к молоку добавляют сычуг.To prepare the cheese of the present invention, an acyltransferase is added to milk before or at the same time that the abomasum is added to the milk.

Во время осаждения казеина ацилтрансфераза способна использовать лецитин и другие липиды молока в качестве донора, а пептиды или протеин - в качестве молекул-акцепторов во время образования ацилированного протеина или ацилированных пептидов.During the precipitation of casein, acyltransferase is able to use lecithin and other milk lipids as a donor, and peptides or protein as acceptor molecules during the formation of an acylated protein or acylated peptides.

Изменение гидрофобных свойств протеина молока приводит к увеличенному осаждению протеина в творог во время образования сыра.Changes in the hydrophobic properties of milk protein result in increased protein precipitation in cottage cheese during the formation of cheese.

Поскольку повышение выхода сыра, полученного по настоящему изобретению, берет начало от увеличенного удерживания в сырном коагулюме протеина, который обычно теряется с сывороткой, подходящий способ, непосредственно связанный с механизмом по изобретению, базируется на определении количества протеина, который остается в сыворотке. Меньше протеина в сыворотке неизбежно означает больше протеина в твороге и более высокий выход сыра.Since the increase in the yield of cheese obtained by the present invention originates from increased retention of protein in the cheese coagulum, which is usually lost with whey, a suitable method directly related to the mechanism of the invention is based on determining the amount of protein that remains in the whey. Less protein in whey inevitably means more protein in cottage cheese and a higher yield of cheese.

Тест на количество протеина в сыворотке может быть осуществлен следующим путем. Снятое или цельное молоко нагревают до температуры, подходящей для сычужной коагуляции, обычно 30-35°С в 100 мл стакане. Необязательно добавляют 1% сыпучей молочнокислой бактериальной закваски и добавляют стандартный сычуг в количестве, соответствующем, например, 0,03-0,05%. Когда молоко свертывалось в коагулюм, достаточно твердый для того, чтобы его можно было разрезать на кубики в боковой длиной около 0,5 см, такую нарезку проводили острым ножом. Тем самым инициировали синерезис и после 30 минут периода выдержки, что позволяло творогу осесть, выводили пробу сыворотки и центрифугировали ее в лабораторной центрифуге в течение 10 мин. Эту пробу анализировали на содержание протеина, используя, например, метод Кьельдаля. Альтернативно и/или как дополнение, пробу можно было анализировать методами, которые позволяют установить тип и количество индивидуальных протеиновых компонентов.A test for the amount of protein in serum can be carried out in the following way. Skimmed or whole milk is heated to a temperature suitable for rennet coagulation, usually 30-35 ° C in a 100 ml glass. Optionally, 1% of loose lactic acid bacterial starter culture is added and standard abomasum is added in an amount corresponding to, for example, 0.03-0.05%. When the milk coagulated into a coagulum, hard enough to be able to cut into cubes in a lateral length of about 0.5 cm, such cutting was carried out with a sharp knife. Thus, syneresis was initiated and after 30 minutes of the exposure period, which allowed the cottage cheese to settle, a serum sample was taken and centrifuged in a laboratory centrifuge for 10 minutes. This sample was analyzed for protein content using, for example, the Kjeldahl method. Alternatively and / or in addition, the sample could be analyzed by methods that allow the type and amount of individual protein components to be determined.

Пример 22: Анализ в низководной средеExample 22: Analysis in a low-water environment

Трансферазные реакции липолитических ферментов в низководной среде.Transferase reactions of lipolytic enzymes in a low-water environment.

ПроцедураProcedure

МатериалыMaterials

Холестерин Sigma cat. C 8503.Cholesterol Sigma cat. C 8503

L-альфа-фосфатидилхолин 95% (растительный) Avanti #441601.L-alpha-phosphatidylcholine 95% (plant) Avanti # 441601.

Соевое масло, Aarhus United, DK.Soybean Oil, Aarhus United, DK.

Хлороформ, чда.Chloroform, chd.

ФерментыEnzymes

#179, GCAT из A. salmonicida. # 179, GCAT from A. salmonicida.

#2427, фосфолипаза А1 из Fusarium oxysporum, LIPOPAN® F от Novozymes, Denmark.# 2427, phospholipase A1 from Fusarium oxysporum , LIPOPAN® F from Novozymes, Denmark.

#1991, фосфолипаза А2 из поджелудочной железы, LIPOMOD 22L от Biocatalysts, UK.# 1991, pancreatic phospholipase A2, LIPOMOD 22L from Biocatalysts, UK.

#2373, липаза Candida antarctica, Novozyme 525 L от Novozymes, Denmark.# 2373, Candida antarctica lipase, Novozyme 525 L from Novozymes, Denmark.

Испытания ферментаEnzyme tests

13,1% лецитина и 6,6% холестерина растворяли в соевом масле, нагретом до 60°С при перемешивании.13.1% lecithin and 6.6% cholesterol were dissolved in soybean oil heated to 60 ° C with stirring.

Субстрат отвешивали в 20 мл стакан Витона и нагревали до 46°С. Добавляли воду и раствор фермента и запускали секундомер.The substrate was weighed into a 20 ml glass of Viton and heated to 46 ° C. Water and an enzyme solution were added and a stopwatch started.

Через регулярные интервалы времени 50 мг пробы переносили в 10 мл стакан Драма и замораживали. Выделенный липид анализировали методом ГЖХ.At regular intervals, 50 mg of the sample was transferred to a 10 ml glass Dram and frozen. The isolated lipid was analyzed by GLC.

Анализ ГЖХGLC analysis

Результатыresults

Эксперимент проводили, как показано в таблице 33.The experiment was carried out as shown in table 33.

Субстрат на основе соевого масла, содержащий 13,1% лецитина и 6,6% холестерина, нагревали до 46°С. Добавляли раствор фермента и запускали секундомер. Спустя 30, 60 и 120 минут времени реакции отбирали пробы для ГЖХ анализа.A soybean oil based substrate containing 13.1% lecithin and 6.6% cholesterol was heated to 46 ° C. The enzyme solution was added and the stopwatch started. After 30, 60 and 120 minutes of reaction time, samples were taken for GLC analysis.

Таблица 33Table 33 1one 22 33 4four 55 СубстратSubstrate гg 55 55 55 55 55 Трансфераза #179-C72, 56 PLU-7/млTransferase # 179-C72, 56 PLU-7 / ml млml 0,30.3 #2427, 200 PLU-7/мл# 2427, 200 PLU-7 / ml млml 0,30.3 Поджелудочная PLA 2 #1991 6300 PLU/млPancreas PLA 2 # 1991 6300 PLU / ml млml 0,30.3 Novozyme 525 L, #2373, 200 LIPU/млNovozyme 525 L, # 2373, 200 LIPU / ml млml 0,30.3 ВодаWater млml 0,30.3 % воды% water 66 66 66 66 66

Результаты анализа ГЖХ показаны в таблице 34. Результаты выражены в процентах от общего состава пробы. Основываясь на результатах ГЖХ, можно рассчитать количество жирной кислоты и эфира холестерина, продуцированное ферментативной реакцией, относительно контрольного образца без добавления фермента. При данных условиях эксперимента была определена общая ферментативная активность как гидролитическая активность по образованию жирной кислоты и трансферазная активность, определенная по образованию эфира холестерина. Из этих результатов и информации о молекулярном весе жирной кислоты и эфира холестерина можно рассчитать относительную мольную гидролитическую активность и относительную мольную трансферазную активность, которые показаны в таблице 35.The results of the GLC analysis are shown in table 34. The results are expressed as a percentage of the total sample composition. Based on the results of GLC, the amount of fatty acid and cholesterol ester produced by the enzymatic reaction can be calculated relative to the control sample without the addition of the enzyme. Under these experimental conditions, the total enzymatic activity was determined as hydrolytic activity for the formation of fatty acids and transferase activity, determined by the formation of cholesterol ester. From these results and information on the molecular weight of the fatty acid and cholesterol ester, the relative molar hydrolytic activity and the relative molar transferase activity can be calculated, which are shown in Table 35.

Таблица 34Table 34 ФерментEnzyme Время реакции, Reaction time, Жирная кислота, Fatty acid, Холестерин, Cholesterol, Эфир холестерина, Cholesterol ester минутыminutes %% %% %% КонтрольThe control 120120 0,5330.533 7,0947,094 0,0000,000 #179# 179 30thirty 0,7700.770 5,7615,761 2,2292,229 #179# 179 6060 0,8520.852 5,3695,369 2,8832,883 #179# 179 120120 0,8760.876 4,9004,900 3,6673,667 #2427# 2427 30thirty 3,2693,269 7,0947,094 0,0000,000 #2427# 2427 6060 3,4203,420 7,0947,094 0,0000,000 #2427# 2427 120120 3,7103,710 7,0947,094 0,0000,000 #1991# 1991 30thirty 2,8712,871 7,0947,094 0,0000,000 #1991# 1991 6060 3,5783,578 7,0947,094 0,0000,000 #1991# 1991 120120 3,9283,928 7,0947,094 0,0000,000 #2373# 2373 30thirty 1,4181,418 7,0947,094 0,0000,000 #2373# 2373 6060 1,4211,421 7,0947,094 0,0000,000 #2373# 2373 120120 1,9151,915 7,0947,094 0,0000,000

Таблица 35Table 35 ФерментEnzyme Время реакции,Reaction time, Образование жирной кислотыFatty acid formation Расход холестерина Cholesterol consumption Образование эфира холестерина Cholesterol ester formation Гидролитическая активность,Hydrolytic activity Трансферазная активность,Transferase activity минmin %% %% #179# 179 30thirty 0,2380.238 1,3341,334 2,2292,229 20twenty 8080 #179# 179 6060 0,3190.319 1,7251,725 2,8832,883 2121 7979 #179# 179 120120 0,3430.343 2,1952,195 3,6673,667 18eighteen 8282 #2427# 2427 30thirty 2,7372,737 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #2427# 2427 6060 2,8872,887 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #2427# 2427 120120 3,1773,177 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #1991# 1991 30thirty 2,3382,338 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #1991# 1991 6060 3,0463,046 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #1991# 1991 120120 3,3953,395 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #2373# 2373 30thirty 0,8850.885 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #2373# 2373 6060 0,8880.888 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #2373# 2373 120120 1,3831,383 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00

ЗаключениеConclusion

В этих экспериментах наблюдалось, что все испытанные ферменты показали гидролитическую активность, поскольку количество жирной кислоты возрастало. Однако единственным ферментом, который показал трансферазную активность, был GCAT из A. salmonicida. Поэтому пришли к заключению, что в масляной системе с лецитином и холестерином, содержащей 6% воды, фосфолипаза А1 из Fusarium oxysporum, фосфолипаза А2 из поджелудочной железы и липаза из Candida antarctica проявляют только гидролитическую активность.In these experiments, it was observed that all tested enzymes showed hydrolytic activity as the amount of fatty acid increased. However, the only enzyme that showed transferase activity was GCAT from A. salmonicida . Therefore, they came to the conclusion that in an oil system with lecithin and cholesterol containing 6% water, phospholipase A1 from Fusarium oxysporum , phospholipase A2 from the pancreas and lipase from Candida antarctica show only hydrolytic activity.

Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании настоящим включены в качестве ссылки. Различные модификации и вариации описанных способов и систем по настоящему изобретению должны быть ясны для специалистов без отклонения от объема и духа настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными осуществлениями, должно быть понятно, что изобретение, как оно заявлено в формуле изобретения, не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными осуществлениями. Действительно, различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны для специалистов в биохимии и биотехнологии или в смежных областях, рассматриваются как находящиеся в рамках нижеследующей формулы изобретения.All publications mentioned in the above description are hereby incorporated by reference. Various modifications and variations of the described methods and systems of the present invention should be clear to specialists without deviating from the scope and spirit of the present invention. Although the present invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the invention, as claimed in the claims, should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described methods of carrying out the invention, which are obvious to experts in biochemistry and biotechnology or related fields, are considered to be within the scope of the following claims.

Claims

1. A method of producing an in situ emulsifier in a food product, wherein the method comprises the step of adding a lipid acyltransferase to the food product, wherein the lipid acyltransferase is characterized as an enzyme capable of transferring an acyl group from a lipid to one or more of acyl acceptors, and which includes a fragment of the GDSX amino acid sequence, where X represents one or more of the amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M, or S.

2. The method according to claim 1, where at least 2 emulsifiers are formed.

3. The method according to claim 1, where the emulsifier is formed without increasing or without significantly increasing the content of free fatty acids in the food product.

4. The method according to claim 1, where the acceptor of the acyl group is sterol, stanol, carbohydrate, protein or its subunit, glycerin.

5. The method according to claim 2, where at least one of the emulsifiers is a carbohydrate ester.

6. The method according to claim 2, where at least one of the emulsifiers is a protein ester.

7. The method according to claim 1, where one or more compounds from among the sterol ester, or stanol ester, or protein ester, or carbohydrate ester, or diglyceride, or monoglyceride are obtained in situ in a food product.

8. The method according to claim 7, where the sterol ester is one or more of the alpha-sitosterol ester, beta-sitosterol ester, stigmasterol ester, ergosterol ester, campesterol ester or cholesterol ester.

9. The method according to claim 7, where the stanol ether is one or more beta-sitostanol or ss-sitostanol ether compounds.

10. The method according to claim 1, where the lipid acyltransferase enzyme comprises H-309 or includes a histidine residue at the position corresponding to His-309 in the amino acid sequence of the aeromonas hydrophila lipolytic enzyme shown as SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 32.

11. The method according to claim 1, where the lipid acyltransferase can be obtained from an organism belonging to one or more of the following genera: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobella , Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mezorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas and Candida.

12. The method according to claim 1, where the lipid acyltransferase includes one or more of the following amino acid sequences:
(i) amino acid sequence of SEQ ID No. 2;
(ii) the amino acid sequence of SEQ ID No. 3;
(iii) the amino acid sequence of SEQ ID No. four;
(iv) amino acid sequence of SEQ ID No. 5;
(v) amino acid sequence of SEQ ID No. 6;
(vi) amino acid sequence of SEQ ID No. 12;
(vii) amino acid sequence of SEQ ID No. twenty;
(viii) amino acid sequence of SEQ ID No. 22;
(ix) amino acid sequence of SEQ ID No. 24;
(x) amino acid sequence of SEQ ID No. 26;
(xi) amino acid sequence of SEQ ID No. 28;
(xii) amino acid sequence of SEQ ID No. thirty;
(xiii) amino acid sequence of SEQ ID No. 32;
(xiv) amino acid sequence of SEQ ID No. 34;
or an amino acid sequence that has 75% or more identity with any of the sequences shown as SEQ ID No. 2; SEQ ID No. 3; SEQ ID No. four; SEQ ID No. 5; SEQ ID No. 6; SEQ ID No. 12; SEQ ID No. twenty; SEQ ID No. 22; SEQ ID No. 24; SEQ ID No. 26; SEQ ID No. 28; SEQ ID No. thirty; SEQ ID No. 32; or SEQ ID No. 34.

13. The method according to claim 1, where the emulsifier is one or more of the following compounds: monoglyceride, lysophosphatidylcholine, DGMG.

14. The use of lipid acyltransferase to obtain a food product from an edible material, including an emulsifier, where the emulsifier is obtained without or without a significant increase in the content of free fatty acids in the food product, and where the emulsifier is formed from constituents of the edible material by means of lipid acyltransferase, where the lipid acyltransferase is characterized as an enzyme capable of transferring an acyl group from a lipid to one or more of the following acceptors of an acyl group and including a fragment of a amino atelnosti GDSX, wherein X is one or more of the amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M or S.

15. The use of claim 14, wherein at least two emulsifiers are formed.

16. The application of clause 15, where at least one of the emulsifiers is a carbohydrate ester.

17. The application of clause 15, where at least one of the emulsifiers is a protein ester.

18. The use of claim 14, wherein one or more of the sterol ester or stanol ester, or protein ester, or carbohydrate ester, or diglyceride, or monoglyceride is also obtained in situ in a food product.

19. The use according to claim 18, wherein the sterol ester is one or more alpha-sitosterol ester, beta-sitosterol ester, stigmasterol ester, ergosterol ester, campesterol ester or cholesterol ester.

20. The application of claim 18, wherein the stanol ester is one or more beta-sitostanol or ss-sitostanol ester compounds.

21. The use of claim 14, wherein the lipid acyltransferase enzyme comprises H-309 or includes a histidine residue at the position corresponding to His-309 in the amino acid sequence of the Aeromonas hydrophila lipolytic enzyme shown as SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 32.

22. The application of clause 14, where the lipid acyltransferase can be obtained from an organism belonging to one or more of the following genera: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobactrium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobella , Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mezorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas and Candida.

23. The application of clause 15, where the lipid acyltransferase includes one or more of the following amino acid sequences:
(i) amino acid sequence of SEQ ID No. 2;
(ii) the amino acid sequence of SEQ ID No. 3;
(iii) the amino acid sequence of SEQ ID No. four;
(iv) amino acid sequence of SEQ ID No. 5;
(v) amino acid sequence of SEQ ID No. 6;
(vi) amino acid sequence of SEQ ID No. 12;
(vii) amino acid sequence of SEQ ID No. twenty;
(viii) amino acid sequence of SEQ ID No. 22;
(ix) amino acid sequence of SEQ ID No. 24;
(x) amino acid sequence of SEQ ID No. 26;
(xi) amino acid sequence of SEQ ID No. 28;
(xii) amino acid sequence of SEQ ID No. thirty;
(xiii) amino acid sequence of SEQ ID No. 32;
(xiv) amino acid sequence of SEQ ID No. 34;
or an amino acid sequence that has 75% or more identity with any of the sequences shown as SEQ ID No. 2; SEQ ID No. 3; SEQ ID No. four; SEQ ID No. 5; SEQ ID No. 6; SEQ ID No. 12; SEQ ID No. twenty; SEQ ID No. 22; SEQ ID No. 24; SEQ ID No. 26; SEQ ID No. 28; SEQ ID No. thirty; SEQ ID No. 32; or SEQ ID No. 34.

24. The use of claim 14, wherein the emulsifier is one or more of the following compounds: monoglyceride, lysophosphatidylcholine, DGMG.